CN105567864A - 食品中单核细胞增生李斯特氏菌lamp检测引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明名称为食品中单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测引物及方法。本发明涉及食品安全检测技术领域，针对单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素基因(hlyA)开发一套LAMP快速检测引物，其包含有如序列表SEQ？ID？NO：1，SEQ？ID？NO：2，SEQ？ID？NO：3和SEQ？ID？NO：4所示的核苷酸序列，并建立LAMP快速检测方法。本发明的突出优点在于：采用本发明中的引物及方法，能够实现食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测，本方法具有快速高效、操作简便、特异性高、灵敏性高的特点，可用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测，适于推广应用。

Description

食品中单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测引物及方法

技术领域

本发明属于食品安全的分子生物学检测方法领域，涉及食品中单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP检测专用引物及其检测方法。

背景技术

一直以来，食源性细菌中毒事件在我国乃至世界范围内频繁发生，对人类健康、社会经济发展造成很大的威胁。其中由单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)引起的食源性细菌中毒事件逐渐引起人们的重视。单核细胞增生性李斯特氏菌最早是Murray等人于1926年在英国从家兔和豚鼠体内分离得到的，因为接种此菌的家兔发生明显的单核细胞增多，故因此得名。单增李斯特菌在自然界中分布广泛，并可以寄生在生物体内，人畜感染后，主要表现为脑膜炎、败血症和血液中单核细胞增多等症状，死亡率高达20-30％，对畜牧业的发展造成了十分严重的危害，对人和动物的生命安全构成了严重的威胁，被世界卫生组织(WHO)列为20世纪90年代食品中四大致病菌之一。

目前对该菌的检测方法主要有传统分离鉴定方法、免疫学方法和PCR方法。三种方法各有优缺点，其中传统分离鉴定方法准确性较高，但检测周期长，不适用于现场快速检测需求；免疫学检测周期短，但灵敏度较差；PCR的方法检测时间短、灵敏性高，但对仪器设备要求较高。研究新的快速、准确，操作简便的单增李斯特氏菌检测方法，具有重要的现实意义。

环介导等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermalAmplification，简称LAMP)，是2000年由日本的荣研株式会的NotomiT等人开发出来的一种新的核酸扩增方法。LAMP法是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在恒温条件(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，具有高特异性和等温快速扩增的特点。本文通过优化LAMP反应条件，建立单增李斯特菌LAMP检测方法，并将其应用于冷鲜肉中单增李斯特菌快速检测。

单核细胞增生李斯特菌作为食品卫检验中一项重要的目的菌，提高其检出限、缩短检测时间，对保证食品的安全和消费者的身体健康有着重要的意义。但是，迄今为止，市场上还未见用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP的专用引物问世。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种特异性和灵敏度高的用于单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP检测专用引物。

本发明所提供的用于对单核细胞增生李斯特氏菌进行LAMP检测的专用引物，是根据如序列表中序列1所示的单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素基因(hlyA)靶基因设计的，用以定性检测待测样品中的单核细胞增生李斯特氏菌。

具体来讲，所述用于对单核细胞增生李斯特氏菌进行LAMP检测的专用引物为以下4条引物的组合，由序列表SEQIDNo.1至序列表SEQIDNo.4所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQIDNo.1为正向外引物，SEQIDNo.2为反向外引物，SEQIDNo.3为正向内引物，SEQIDNo.4为反向内引物。详见表1。

表1引物序列

本发明的第二个目的是提供一种食品中单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP检测方法。

本发明所提供的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP检测方法，具体包括以下步骤：

1)取待测的食品样品25g(液体食品25mL)，置于225mL灭菌水中，匀浆。取匀浆液1mL，置于9mL的Lis增菌液体培养基中，37℃培养6h。

2)取1mL菌悬液以10,000rpm离心1min，弃上清。加500μLTE(pH8.0)重悬菌液，加入50μLSDS(10％)混匀，加500μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，剧烈震荡，12,000rpm离心10min，取上清。加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，12,000rpm，离心1min，取上清。加25μL的乙酸钠和500μL的无水乙醇，混匀，冰浴10min。12,0000rpm离心5min，弃去溶液，自然干燥之后加50μL的TE溶液溶解，-20℃冷藏备用。

3)建立LAMP反应体系如下：

将建立的LAMP体系放入等温扩增仪中，设定反应温度63℃，反应时间为45min。根据扩增曲线判定检测结果，如出现扩增曲线则为阳性检测，如无扩增曲线则为阴性样品。

本发明建立的快速检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测引物及方法，本发明与现有技术相比具有灵敏度高、特异性好，操作简单等优点，适用于食品安全快速检测。

附图说明

图1LAMP特异性分析

图2LAMP检测限分析

具体实施方式

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实验，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：LAMP检测引物设计

根据单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素基因(hlyA)为靶基因设计，利用LAMP在线设计软件PrimerExplorerV4(http://primerexplorer.jp/e/)针对相对保守序列区设计LAMP引物，序列如下：

F3：CGTTGTAAAAAATGCTACTAAATCG；即SEQIDNO：1

B3：CGCCGAAGTTTACATTCAAAC；即SEQIDNO：2

FIP：GCACTTACATTCGGATAAGCTTGAG-CAACGCAGTAAATACATTAGTGG；即SEQIDNO：3

BIP：ATGATGACGAAATGGCTTACAGT-AGCTTTAAATGCAGTACCAAAT；即SEQIDNO：4

实施例2：样品增菌及基因组DNA提取

取待测的食品样品25g(液体食品25mL)，置于225mL灭菌水中，匀浆。取匀浆液1mL，置于9mL的Lis增菌液体培养基中，37℃培养6h。取1mL菌悬液以10,000rpm离心1min，弃上清。加500μLTE(pH8.0)重悬菌液，加入50μLSDS(10％)混匀，加500μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，剧烈震荡，12,000rpm离心10min，取上清。加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，12,000rpm，离心1min，取上清。加25μL的乙酸钠和500μL的无水乙醇，混匀，冰浴10min。12,0000rpm离心5min，弃去溶液，自然干燥之后加50μL的TE溶液溶解，-20℃冷藏备用。

实施例3：LAMP检测体系建立

扩增体系如下：

将建立的LAMP体系放入等温扩增仪中，设定反应温度63℃，反应时间为45min。根据扩增曲线判定检测结果，如出现扩增曲线则为阳性检测，如无扩增曲线则为阴性样品。

实施例4：LAMP特异性分析

分别以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157、痢疾志贺氏菌、枯草芽孢杆菌、伤寒沙门氏菌为模板，以双蒸水为阴性对照，对本发明的LAMP法的特异性进行检测。检测结果如图1，5种致病菌均未出现阳性结果，表明本发明建立的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP方法特异性强。

实施例5：检测限分析

按照本方法提取单核细胞增生李斯特氏菌基因组DNA，对基因组DNA进行定量分析。然后将提取得到的基因组DNA(227ng/μl)进行10倍梯度，再以经梯度稀释的DNA为模板，分别用本发明建立的LAMP检测方法进行灵敏度检验。结果如图2所示，本方法建立的LAMP检测引物及方法能够检测到22.7fg的基因组DNA，经本方法能够检测到每克食品中10个以内的单核细胞增生李斯特氏菌污染。

Claims (3)

1.一种用于检测食品中单核细胞增生李斯特菌的LAMP引物组，其特征在于，由序列表SEQIDNo.1至序列表SEQIDNo.4所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQIDNo.1为正向外引物，SEQIDNo.2为反向外引物，SEQIDNo.3为正向内引物，SEQIDNo.4为反向内引物。

2.一种食品中单核细胞增生李斯特菌的LAMP检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)待测食品样品的取样、增菌及DNA提取；

(2)进行LAMP反应；反应条件为63℃恒温反应45min。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，进行LAMP反应时，使用的引物为序列表SEQIDNo.1所示的正向外引物，序列表SEQIDNo.2所示的反向外引物，序列表SEQIDNo.3所示的正向内引物，序列表SEQIDNo.4所示的反向内引物。