CN102586413A - 一种检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

一种检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量pcr试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN102586413A
CN102586413A CN2011102765663A CN201110276566A CN102586413A CN 102586413 A CN102586413 A CN 102586413A CN 2011102765663 A CN2011102765663 A CN 2011102765663A CN 201110276566 A CN201110276566 A CN 201110276566A CN 102586413 A CN102586413 A CN 102586413A
Authority
CN
China
Prior art keywords
listeria monocytogenes
seq
quantitative
reagent kit
fluorescent quantitative
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011102765663A
Other languages
English (en)
Inventor
朱丽萍
颜世敢
吕爱杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Institute of Light Industry
Original Assignee
Shandong Institute of Light Industry
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Institute of Light Industry filed Critical Shandong Institute of Light Industry
Priority to CN2011102765663A priority Critical patent/CN102586413A/zh
Publication of CN102586413A publication Critical patent/CN102586413A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR试剂盒，试剂盒包括一对引物、一个探针以及阳性定量模板，引物、探针的序列分别为SEQ ID No.1、2、3，阳性定量模板是含有序列为SEQ ID No.4的DNA片段的pMD18-T重组质粒；试剂盒可以进一步包括荧光定量聚合酶和参比染料；还提供了该试剂盒在检测临床样品里存在的单核细胞增生李斯特菌中的应用。实验结果表明，本发明提供的检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR试剂盒特异性强、灵敏度高、组成简单、操作方便，可以实现对单核细胞增生李斯特菌的快速检测。

Description

一种检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域中细菌的分子生物学检测试剂盒，特别是涉及检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR试剂盒及其应用 
背景技术
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种重要的人畜共患病致病菌，在4℃能生长繁殖，能引起人和动物脑膜炎、败血症及孕妇流产等，死亡率极高，可达30％～70％。在公共卫生和食品卫生安全中越来越受到重视，已成为国家食源性疾病检测的菌种之一。长期以来对LM的检测方法主要是传统的国标培养法(GB4789.30-2010)，采用以表型特征为特点的生化反应和血清反应对LM进行鉴定，但鉴定能力有限，常因表型特征的变异给鉴定带来困难。对于这样依靠表型特征不能准确鉴定的LM，采用分子生物学的检测方法常能得到准确的鉴定结果，尤其是抗污染能力强、特异性高、灵敏度好、容易重复的荧光定量PCR检测方法。 
发明内容
为解决背景技术中的检测单核细胞增生李斯特菌的问题，本发明一方面提供了一种检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR试剂盒，试剂盒包括一对引物、一个探针以及阳性定量模板，所述引物、探针的序列为： 
上游引物H1  5’-gattcccattatgaacgaag-3’(SEQ ID No.1)， 
下游引物H2  5’-tcagttccttacagatgag-3’(SEQ ID No.2)， 
荧光探针P1  5’-FAM-acagccagtactagttcatcgca-TAMRA-3’(SEQ ID No.3)， 
其中FAM为5’端的荧光基团，TAMRA为3’端的荧光淬灭基团， 
所述阳性定量模板是含有序列为catggcaccaccagcatctataggagcactcgccgccacatcatcgaaaagaaacacgcggatg(SEQ ID No.4)的DNA片段的pMD18-T重组质粒。 
本发明提供的试剂盒可以进一步包括荧光定量聚合酶和参比染料，如Takara公司的Premix Ex TaqTM聚合酶和ROX Reference Dye II染料。 
本发明还提供了该试剂盒在检测临床样品里存在的单核细胞增生李斯特菌中的应用。 
本发明提供的试剂盒的使用方法为： 
(1)反应体系(25μL)为：模板DNA 2.0μL、10μM引物1.0μL、3μM探针1.0μL、 Premix Ex TaqTM(2×)荧光定量聚合酶12.5μL、ROX Reference Dye II(50×)染料0.5μL、无菌水8μL。 
反应程序为：95℃预变性30秒，随后进行40个循环，每个循环程序为95℃5秒、60℃20秒。 
(2)定量标准曲线制备：将定量阳性模板按10倍稀释法稀释成1010～104拷贝/ml的7个浓度梯度，按照上述反应体系和反应程序进行Real-time PCR，反应结束后计算机自动绘制标准曲线Y＝aX+b、R2、Eff，其中X表示起始模板拷贝数的对数，Y表示C(t)值。 
(3)样品检测：从待测样品中DNA，随后按照步骤(1)反应体系和反应程序进行扩增即可。 
(4)结果判断：设置阴性对照和空白对照，待测样品C(t)值小于35.0为阳性，大于35.0时为阴性。 
附图说明
图1是利用阳性质粒制作标准曲线时，不同稀释度的质粒荧光定量PCR扩增曲线，从左至右各条曲线代表1010、109、108、107、106、105、104个/ml拷贝数质粒扩增曲线。 
图2是荧光定量PCR标准曲线结果，标准曲线回归方程Y＝-3.410logX+45.10，相关系数R2＝0.999，扩增效率Eff＝96.5％。 
图3是灵敏度检测结果，不同质粒稀释度的结果，从左至右各条曲线代表104、103、102、101、1个/μl质粒。 
具体实施方式
实施例1：本发明所述的试剂盒的制备 
检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR试剂盒的组成包括： 
上游引物H1 5’-gattcccattatgaacgaag-3’(SEQ ID No.1)， 
下游引物H2 5’-tcagttccttacagatgag-3’(SEQ ID No.2)， 
荧光探针P1 5’-FAM-acagccagtactagttcatcgca-TAMRA-3’(SEQ ID No.3) 
阳性定量模板：含有序列为catggcaccaccagcatctataggagcactcgccgccacatcatcgaaaagaaacacgcggatg(SEQ ID No.4)的DNA片段的pMD18-T重组质粒。 
试剂盒还可以进一步包括荧光定量聚合酶和参比染料。 
其中，引物、探针是在Genbank中查找多种单核细胞增生李斯特菌的hly基因并分析其 保守区段的基础上，使用Bacon Designer 5.0软件设计的，并按照本领域常规的方法合成。 
阳性定量模板采用本领域常规的方法制备：提取单核细胞增生李斯特菌(ATCC 54001购自ATCC)DNA；使用序列为SEQ ID No.1、2的引物扩增出序列为SEQ ID No.4的片段；并通过连接、转化将该片段插入pMD18-T载体；最后进行鉴定。 
本申请实施例中实际使用的荧光定量聚合酶Premix Ex TaqTM和参比染料ROXReference Dye II均购自Takara公司。 
实施例2使用试剂盒检测单核细胞增生李斯特菌 
1.待测样品的处理 
从待测样品提取DNA。本申请实施例中实际使用的DNA提取试剂盒购自Takara公司。 
2.荧光定量PCR过程 
反应体系(25μL)为：模板DNA 2.0μL、10μM引物1.0μL、3μM探针1.0μL、Premix Ex TaqTM(2×)荧光定量聚合酶12.5μL、ROX Reference Dye II(50×)染料0.5μL、无菌水8μL。 
反应程序为：95℃预变性30秒，随后进行40个循环，每个循环程序为95℃5秒、60℃20秒。 
本申请实施例中实际使用Roche公司的480型荧光定量PCR仪记录结果。 
3.标准曲线制备 
将定量阳性模板线性化后10倍倍比稀释，依次从1010稀释到104拷贝/ml。各取2μl按照上面的步骤进行荧光定量PCR，制作标准曲线。结果见附图说明图1和图2。荧光定量PCR标准曲线相关系数R2＝0.999，扩增效率Eff＝96.5％，回归方程Y＝-3.410logX+45.10。从图2可以看出，用阳性质粒所作的标准曲线的C(t)值与初始浓度有较好的线性关系。 
4.特异性验证 
用建立的荧光定量RT-PCR方法对单核细胞增生李斯特菌(ATCC 54001购自ATCC)、格氏李斯特菌(ATCC 700545购自ATCC)、绵羊李斯特菌(ATCC 19119购自ATCC)、肠炎沙门氏菌(本实验室保存)、大肠埃希氏菌(本实验室保存)、空白对照进行检测。单核细胞增生李斯特菌C(t)值为15.28，而其他四种菌的样品检测结果均为阴性，表明建立的荧光定量RT-PCR方法不会受到这些类似菌株的干扰(特异性验证结果未显示)。 
5.灵敏度测试 
阳性质粒从1.0×105拷贝/μL10倍倍比稀释，荧光定量PCR检测。显示于图3的结果表明本发明提供的试剂盒灵敏度可达1拷贝/μL。 
上述实施例的实验结果表明，本发明提供的检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR试剂盒特异性强、灵敏度高、组成简单、操作方便，可以实现对单核细胞增生李斯特菌的快速检测。 
Figure ISA00000575780100011

Claims (3)

1.一种检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR试剂盒，包括一对引物、一个探针以及阳性定量模板，所述引物、探针的序列为：
上游引物H1 5’-gattcccattatgaacgaag-3’(SEQ ID No.1)，
下游引物H2 5’-tcagttccttacagatgag-3’(SEQ ID No.2)，
荧光探针P1 5’-FAM-acagccagtactagttcatcgca-TAMRA-3’(SEQ ID No.3)，
其中FAM为5’端的荧光基团，TAMRA为3’端的荧光淬灭基团，所述阳性定量模板是含有序列为catggcaccaccagcatctataggagcactcgccgccacatcatcgaaaagaaacacgcggatg(SEQ ID No.4)的DNA片段的pMD18-T重组质粒。
2.权利要求1所述的试剂盒，其进一步包括荧光定量聚合酶和参比染料。
3.权利要求2所述的试剂盒在检测临床样品里存在的单核细胞增生李斯特菌中的应用。
CN2011102765663A 2011-09-09 2011-09-09 一种检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量pcr试剂盒 Pending CN102586413A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011102765663A CN102586413A (zh) 2011-09-09 2011-09-09 一种检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量pcr试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011102765663A CN102586413A (zh) 2011-09-09 2011-09-09 一种检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量pcr试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102586413A true CN102586413A (zh) 2012-07-18

Family

ID=46475636

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011102765663A Pending CN102586413A (zh) 2011-09-09 2011-09-09 一种检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量pcr试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102586413A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112725474A (zh) * 2020-12-30 2021-04-30 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 含有特异性分子靶标的单核细胞增生李斯特菌标准菌株及其检测和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101177714A (zh) * 2007-11-15 2008-05-14 上海交通大学 添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌pcr检测方法
CN101434992A (zh) * 2008-09-28 2009-05-20 中国计量学院 一种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量pcr检测方法
CN101805799A (zh) * 2010-04-17 2010-08-18 上海交通大学 单核细胞增生李斯特菌荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
CN102121051A (zh) * 2010-01-07 2011-07-13 中华人民共和国舟山出入境检验检疫局 水产品中主要病原菌的多重荧光定量pcr检测方法
CN102676647A (zh) * 2012-02-13 2012-09-19 东北农业大学 检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的试剂盒及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101177714A (zh) * 2007-11-15 2008-05-14 上海交通大学 添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌pcr检测方法
CN101434992A (zh) * 2008-09-28 2009-05-20 中国计量学院 一种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量pcr检测方法
CN102121051A (zh) * 2010-01-07 2011-07-13 中华人民共和国舟山出入境检验检疫局 水产品中主要病原菌的多重荧光定量pcr检测方法
CN101805799A (zh) * 2010-04-17 2010-08-18 上海交通大学 单核细胞增生李斯特菌荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
CN102676647A (zh) * 2012-02-13 2012-09-19 东北农业大学 检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的试剂盒及其应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112725474A (zh) * 2020-12-30 2021-04-30 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 含有特异性分子靶标的单核细胞增生李斯特菌标准菌株及其检测和应用
CN112725474B (zh) * 2020-12-30 2022-05-20 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 含有特异性分子靶标的单核细胞增生李斯特菌标准菌株及其检测和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chaban et al. Evaluation of a Campylobacter fetus subspecies venerealis real-time quantitative polymerase chain reaction for direct analysis of bovine preputial samples
CN104059977B (zh) 一种沙门氏菌血清型鉴定方法及其试剂盒
CN102010913B (zh) 一种甄别李斯特菌的实时荧光pcr检测试剂盒及检测方法
CN106893782A (zh) 一种检测并鉴定隐球菌的靶基因、引物和探针及试剂盒
CN104726567A (zh) 一种无乳链球菌环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN103468811A (zh) 小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重pcr检测引物组和试剂盒
CN104212901A (zh) 用于金黄色葡萄球菌耐药性检测的组合物
CN105936935B (zh) 一种快速鉴定特定血清型沙门菌的pcr检测试剂盒
CN102453762A (zh) 检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的试剂盒和方法
CN102747144B (zh) 三种菌的三重实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法
CN106755462A (zh) 一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物、检测盒及其应用
Li et al. Chip-based digital PCR for direct quantification dynamic bacterial load in target organs of tilapia infected with Streptococcus agalactiae, a pathogen causing meningoencephalitis in teleosts
CN102154487A (zh) 检测土拉弗朗西斯菌的试剂及复合探针荧光定量pcr检测土拉弗朗西斯菌的方法
CN105331677B (zh) 针对食品中的沙门氏菌和志贺氏菌的多重pcr检测用引物组、试剂盒及检测方法
CN105567864A (zh) 食品中单核细胞增生李斯特氏菌lamp检测引物及方法
CN102586413A (zh) 一种检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量pcr试剂盒
CN105154559A (zh) 对副溶血弧菌k36，k37，k68特异的核苷酸及其应用
CN104651518A (zh) 一种海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN102417930B (zh) 基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌的核酸检测方法
CN101712988B (zh) 益生菌乳制品中双岐杆菌的快速定性、定量测定方法
CN104404132B (zh) 一种猪链球菌2型的ss2-lamp检测试剂盒及应用
AU2019100071A4 (en) Pcr detection kit for rapidly identifying salmonella of specific serotypes
CN103740839B (zh) 荧光定量pcr检测肉毒杆菌的通用型试剂盒及非诊断性检测方法
CN103215344A (zh) 一种检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法和试剂盒
CN107287315B (zh) 用于志贺氏菌的检测试剂盒、检测方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20120718