CN102417930B - 基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌的核酸检测方法 - Google Patents
基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌的核酸检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌的核酸检测方法。所述方法为：根据鸭疫里默氏杆菌gyrB基因设计特异性的引物序列，提取待测样品的DNA为模板，进行LAMP反应；对LAMP结果进行分析，若LAMP扩增结果为阳性，则待测样品含有鸭疫里默氏杆菌。本发明提供的针对鸭疫里默氏杆菌的检测方法，具有简便、快速、特异、灵敏和经济的优点，结果判断方法简便，适合于临床或者基层实验室使用，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种鸭疫里默氏杆菌的环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)的核酸检测方法。
背景技术
鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)病是一种主要侵害鸭、火鸡和其他禽类的接触性传染病。该病主要病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪样输卵管炎等，发病率高，病死率也高，耐过鸭多成僵鸭，生长迟缓，给养殖业造成极大的经济损失。
自从1904年Reiemer首次报道该病到现在，该病呈世界流行，发病率和死亡率一般为10-30％，但部分鸭场达95％以上。该病对养殖业的危害除直接引起动物发病、死亡外，感染耐过鸭因饲料转化率降低，生长发育迟缓而带来的间接经济损失也十分严重，以及导致抗菌药物的大量使用而引起食品安全。
传统鉴定鸭疫里默氏杆菌方法主要是通过细菌分离、血清型鉴定、生化鉴定等经典方法，但经典方法操作繁琐、耗时长、检出率低等，对该病的准确检测和及时治疗十分不利。针对鸭疫里默氏杆菌其他检测技术如ELLSA、免疫组化及免疫荧光等技术也有报道，但也不同程度地存在某些缺点。至上世纪80年代末聚合酶链反应技术诞生，极大的推动了分子生物学技术的发展，并促进了病原微生物核酸水平检测技术的长足发展，成为最重要的手段之一。而就鸭疫里默氏杆菌的检测而言，先后出现了重复序列PCR基因指纹分析(Repetitive element PCR genomic finger printing，REP-PCR)、随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)以及实时荧光定量聚合酶链反应(Real time fluorescent quantified PCR)等一系列的核酸扩增检测技术。这些方法对鸭疫里默氏杆菌检测，较经典的鉴定方法而言更加的敏感及快速。其中荧光定量PCR技术，不仅仅具备PCR技术中的Taq酶对靶基因进行高效的扩增，而且探针的加入大幅度的提高了其特异性与敏感性，充分体现了分子检测技术的优越性。但是由于荧光定量PCR技术需要昂贵的仪器以及繁琐的操作过程，使得该技术在基层实验室以及检疫机构推广使用受到了局限。
21世纪初，Notomi T等几位日本学者开发了一种新型的恒温扩增技术，即环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。其原理为采用能够特异性识别靶序列上8个区域设计的6个特异引物，利用一种具有链置换性Bst-DNA聚合酶在恒温条件(60℃-65℃)下作用几十分钟，即可完成核酸扩增反应。其扩增效率可达到109-1010个拷贝数的数量级，并且可以通过扩增副产物焦凝酸镁沉淀产生的浊度或者显色反应判断反应发生与否。
LAM技术与PCR技术相比具有相同的灵敏度，而且LAMP省去复杂的温度变化、长时间的温度循环、繁琐的电泳检测等。LAMP技术使得整个检测过程在恒温水浴锅中即可完成，大幅降低了仪器成本，并且简便，适合于基层医疗防疫、检验检疫机构使用，可用于大量的样本同时检测。
发明内容
本发明提供一种基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌的检测方法。
一种基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌的核酸检测方法，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术体系扩增靶基因的特定区域；所述特异性引物为：
| 引物 | 类别 | 序列组成 |
| F3 | 外引物 | 5’-AGAGCGAGAAGAAAAAACCT-3’ |
| B3 | 外引物 | 5’-CTCCCATAAGCATAGAGAAGA-3’ |
| FIP | 内引物 | 5’-GGTTCATTTCCCCAAGACCTTTATA-TAGAAATGTCTGCCGATGG-3’ |
| BIP | 内引物 | 5’-CAGAACAACTTTGGGAAACTACACT-CTATCTGCTTCACCTGCA-3 |
LAMP检测的反应体系组成如下：
2xU-LAMP反应混合液(2xU-LAMP反应混合液是购买的试剂盒，其组成为：40mMTris-HCl(pH 8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、10mM MgSO4、0.2％Triton X-100、2.4mM dNTPs、1.6M甜菜碱；)10ul；
10x引物混合液1ul，其组成为：引物F3为2uM，引物B3为2uM，引物BIP为12uM，引物FIP为12uM；
模板DNA1ul、Bst聚合酶0.75ul、补水至20ul；
LAMP反应条件：63℃60min→80℃5min→-20℃保存。
检测过程同时设置阴性对照和阳性对照，所述的阳性对照为含有鸭疫里默氏杆菌gyrB目的基因的DNA(鸭疫里默氏杆菌基因组DNA或含鸭疫里默氏杆菌gyrB基因的重组质粒DNA)，所述阴性对照为不同于靶基因的DNA，并使用电泳分析或Sybrgreen I荧光染料紫外灯下显色同时检测阴阳对照扩增产物。
所述的检测方法，针对鸭疫里默氏杆菌中的Genbank登录号为CP002346.1的gyrB基因设计环介导等温扩增特异性引物。
LAMP检测技术的灵敏度高于其他常规分子检测法10-1000倍，有力的解决了传统的PCR检测方法的检出率低的问题，并且常规的聚合酶链反应(PCR)扩增技术对仪器设备要求较高(如PCR扩增仪，琼脂凝胶电泳系统等)、技术较为复杂，不利于其在基层医疗防疫、检验检疫机构的普遍应用，而LAMP检测技术只需要简单结构的恒温水浴锅，检测时间短(30-60分钟)、特异性高等特点，可以使用基因扩增技术在现场的监测中广泛应用。本发明的方法具有设备要求简单，相对于其他核酸检测技术而言，本发明不需要特定的反应和检测仪器，普通的恒温水浴锅即可进行，便于应用和推广。本发明的核酸检测技术灵敏度高，可在1小时内实现对样本106-109倍的扩增，灵敏度大大优于常规的PCR检测。由于发明中对BstDNA链置换聚合酶的采用，实现在相应反应体系下对待测靶基因的指数级增加。使得不仅仅提高了反应的效率，而且减少了反应中非特异性扩增产物的污染。相对于常规PCR或定量PCR而言，大大节省了时间，并且促环引物的加入进一步提高了反应的速度等优点，适合基层卫生机构、检验检疫机构查验的大规模使用。
附图说明
图1为鸭疫里默氏杆菌LAMP反应电泳图谱；图中：M：DL2000 DNA ladder；lane1为鸭疫里默氏杆菌，2-5分别是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌；lane6为水阴性对照；
图2为鸭疫里默氏杆菌LAMP反应敏感性电泳图谱；图中：laneM：DL2000 DNAladder；lane 1：4.0x 108CFU/mL；2：4.0x 107CFU/mL；3：4.0x 106CFU/mL；4：4.0x105CFU/mL；5：4.0x 104CFU/mL；6：4.0x 103CFU/mL；7：4.0x 102CFU/mL；lane8：为水阴性对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实例一
1.检测样品：鸭疫里默氏杆菌ATCC 11845株、大肠杆菌O46、金黄色葡萄球菌ATCC6538株、多杀性巴氏杆菌CVCC493株、沙门氏菌CMCC 50083株。
2.核酸提取：本发明中，所述样品DNA提取方法包括两种。
方法一：酚仿提取发法
(1)鸭疫里默氏杆菌以胰酶大豆肉汤37℃水浴震荡培养24h，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌以LB肉汤37℃水浴震荡培养24h；
(2)从上述的菌悬液中取500ul菌液于EP管中(咽喉拭子用500ul生理盐水浸洗后取浸洗液，病死鸭各种组织加500ul生理盐水匀浆后取匀浆液)1000rpm离心5min，弃上清；
(3)加入500μL等体积的TE悬浮；
(4)加入5μL溶菌酶，37℃，20min；
(5)加入1.5μL RNase，2.5μL 10％SDS，37℃，30min；
(6)加入2.5μL蛋白酶K，37℃，90min；
(7)分别使用苯酚：氯仿：异戊醇、氯仿各抽提1次，经乙醇沉淀后溶于20μLTE中，-20℃冰箱保存备用。
方法二：热裂解法
从37℃摇床培养过夜的菌悬液中吸取1mL菌液，1000rpm离心5min，弃上清；加同双蒸水1mL，放入煮沸中裂解10min；之后用台式离心机以12000g/min离心3min，上清液于-20℃保存备用。
3.鸭疫里默氏杆菌LAMP检测的反应体系组成如下：
2xU-LAMP反应混合液(2xU-LAMP反应混合液是购买的试剂盒，其组成为：40mMTris-HCl(pH 8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、10mM MgSO4、0.2％Triton X-100、2.4mM dNTPs、1.6M甜菜碱；)10ul；
10x引物混合液1ul，其组成为：引物F3为2uM，引物B3为2uM，引物BIP为12uM，引物FIP为12uM；
模板DNA1ul、Bst聚合酶0.75ul、补水至20ul；
本发明检测系统中的特异性扩增引物，是由引物合成公司(invetrogen)制备。所有引物按照LAMP引物设计原则，针对鸭疫里默氏杆菌中的Genbank登录号为CP002346.1的gyrB基因，选取特异性强保守性高的区域，利用PrimerExplorer V软件进行分析，设计出一套最佳的引物对。鸭疫里默氏杆菌的核酸特异性引物序列：
表1：针对编码鸭疫里默氏杆菌gyrB基因的LAMP反应引物序列组成
| 引物 | 类别 | 序列组成 |
| F3 | 外引物 | 5’-AGAGCGAGAAGAAAAAACCT-3’ |
| B3 | 外引物 | 5’-CTCCCATAAGCATAGAGAAGA-3’ |
| FIP | 内引物 | 5’-GGTTCATTTCCCCAAGACCTTTATA-TAGAAATGTCTGCCGATGG-3’ |
| BIP | 内引物 | 5’-CAGAACAACTTTGGGAAACTACACT-CTATCTGCTTCACCTGCA-3 |
4.LAMP反应条件：63℃60min→80℃5min→-20℃保存。
5.结果判断：琼脂糖凝胶电泳分析：取LAMP扩增产物5ul，在2％的琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色后，在紫外灯照射下出现典型的梯状条带，则说明该管扩增反应为阳性，未观察到梯状条带，则为阴性，见图1。
还可以肉眼直接观察反应管内溶液的浊度变化：在核酸的合成过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与Mg2+结合，产生焦磷酸镁沉淀，且随反应的进行沉淀量加大。在反应结束后，可直接通过肉眼判读。
或者，加入1/1000的Sybrgreen I染料观察反应液颜色变化或者紫外照射下检测荧光：如果含有扩增产物，反应混合液为绿色，否则保持Sybrgreen I的橙色不变；在紫外照射的条件下，能够检测到荧光则为阳性。
实例二
1.将过夜培养的鸭疫里默氏杆菌ATCC 11845菌液10倍倍比稀释至(101-108)，取各稀释度菌液各100ul平板计数。测出原液每毫升的菌落数为4.0x108CFU/mL，经过十倍的倍比稀释后，按上述方法二中热裂解法提取核酸，取1ul上清为模板进行LAMP扩增。
2.鸭疫里默氏杆菌LAMP检测的反应组成体系如下：
2xU-LAMP反应混合液(2xU-LAMP反应混合液是购买的试剂盒，其组成为：40mMTris-HCl(pH 8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、10mM MgSO4、0.2％Triton X-100、2.4mM dNTPs、1.6M甜菜碱；)10ul；
10x引物混合液1ul，其组成为：引物F3为2uM，引物B3为2uM，引物BIP为12uM，引物FIP为12uM；
模板DNA1ul、Bst聚合酶0.75ul、补水至20ul；
3.反应条件：63℃60min→80℃5min→-20℃保存。
4.结果判断：取LAMP扩增产物5ul进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在紫外灯照射下观察结果，见图2。由于细菌初始浓度为4.0x 108CFU/mL，经过十倍的稀释后，取1ul进行LAMP反应，因此LAMP可检测到4.0x 103CFU/mL鸭疫里默氏杆菌。
实例三
1.取10份鸭疫里默氏杆菌人工感染鸭的肝脏和从四川、重庆、山东、河南各省不同地区送检的20份疑似鸭疫里默氏杆菌的心脏、肝脏、脑组织，以实施例1中核酸提取方法一(酚仿提取发法)的方法提取核酸，同时以正常鸭肝脏组织相同处理作对照；
2.鸭疫里默氏杆菌LAMP检测的反应组成体系如下：
2xU-LAMP反应混合液(2xU-LAMP反应混合液是购买的试剂盒，其组成为：40mMTris-HCl(pH 8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、10mM MgSO4、0.2％Triton X-100、2.4mM dNTPs、1.6M甜菜碱；)10ul；
10x引物混合液1ul，其组成为：引物F3为2uM，引物B3为2uM，引物BIP为12uM，引物FIP为12uM；
模板DNA1ul、Bst聚合酶0.75ul、补水至20ul；
3.反应条件63℃60min→80℃5min→-20℃保存；
4.各取5ul进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在紫外灯照射下观察凝胶，其中10份鸭疫里默氏杆菌人工感染鸭的肝脏和3份疑似鸭疫里默氏杆菌病料组织可见梯状扩增条带，而正常鸭肝脏组织未见梯状扩增条带，说明LAMP方法能够用于临床样本鸭疫里默氏杆菌的检测。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (2)
1.一种基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌的非诊断性核酸检测方法，其特征在于，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术体系扩增靶基因的特定区域；所述特异性引物为：
LAMP检测的反应体系组成如下：
2xU-LAMP反应混合液10ul；所述2xU-LAMP反应混合液是购买的试剂盒，其组成为：pH8.8的40mM Tris-HCl、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、10mM MgSO4、0.2％Triton X-100、2.4mM dNTPs、1.6M甜菜碱；
10x引物混合液1ul，其组成为：引物F3为2uM，引物B3为2uM，引物BIP为12uM，引物FIP为12uM；
模板DNAlul、Bst聚合酶0.75ul、补水至20ul；
LAMP反应条件：63℃60min→80℃5min→-20℃保存；
检测过程同时设置阴性对照和阳性对照，所述的阳性对照为含有鸭疫里默氏杆菌gyrB目的基因的DNA，所述阴性对照为不同于靶基因的DNA，并使用电泳分析或Sybrgreen I荧光染料紫外灯下显色同时检测阴阳对照扩增产物；
所述模板DNA提取方法为：酚仿提取方法或热裂解法；
酚仿提取方法包括以下步骤：
(1)鸭疫里默氏杆菌以胰酶大豆肉汤37℃水浴震荡培养24h，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌以LB肉汤37℃水浴震荡培养24h；
(2)从(1)所述的菌悬液中取500ul菌液于EP管中1000rpm离心5min，弃上清；
(3)加入500μL等体积的TE悬浮；
(4)加入5μL溶菌酶，37℃，20min；
(5)加入1.5μLRNase，2.5μL10％SDS，37℃，30min；
(6)加入2.5μL蛋白酶K，37℃，90min；
(7)分别使用苯酚：氯仿：异戊醇、氯仿各抽提1次，经乙醇沉淀后溶于20μLTE中，-20℃冰箱保存备用；
热裂解法：从37℃摇床培养过夜的菌悬液中吸取1mL菌液，1000rpm离心5min，弃上清；加同双蒸水1mL，放入煮沸中裂解10min；之后用台式离心机以12000g／min离心3min，上清液于-20℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的非诊断性核酸检测方法，其特征在于，针对鸭疫里默氏杆菌中的Genbank登录号为CP002346.1的gyrB基因设计环介导等温扩增特异性引物。
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