CN101948929A - 检测鸭疫里默氏杆菌的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于检测鸭疫里默氏杆菌的试剂盒，以及这种试剂盒的使用方法。本发明涉及的检测鸭疫里默氏杆菌的试剂盒中至少有两对用于进行环介导等温扩增的特异性引物F3、B3、FIP和BIP，为方便使用，本发明的试剂盒中还有甜菜碱、硫酸镁、dNTPs、ThermoPol反应缓冲液和Bst DNA聚合酶；或者还加有显色剂SYBR GREEN I。本发明具有便于在基层应用，检测耗时短，成本低，操作简单方便的优点。

Description

检测鸭疫里默氏杆菌的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种用于细菌检测的试剂盒，以及其制备和使用方法，特别是一种用于检测鸭疫里默氏杆菌的试剂盒，以及这种试剂盒的使用方法。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)可引起家鸭、鹅、火鸡和其它多种鸟类发病，导致的鸭的疾病称为鸭传染性浆膜炎(duck infectiousserositis)。该病呈急性或慢性败血症过程，剖检病变以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和干酪性输卵管炎为特征。1932年，美国纽约长岛的三个鸭场首次发生了该病，我国在1982年首次确诊此病，随后在全国多个地区发生和流行。目前，该病在养鸭业发达的世界各国都持续发生和存在，给养鸭业造成了重大危害和经济损失。

RA的血清型比较复杂，到目前为止，已报道的血清型有21个，各个血清型之间无交叉反应。我国存在15个血清型，其中血清1型、2型和10型是主要流行的血清型。鸭传染性浆膜炎长期存在，免疫预防难度很大，主要有两个原因：一是RA各血清型菌株间无交叉反应，每种血清型疫苗株制备的疫苗均不能提供交叉免疫保护，不能保护鸭抵抗其它血清型毒株的感染；二是RA的血清型极易变异，导致免疫失败。

RA感染在临床症状和剖检病变方面与大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌感染非常类似，仅靠临床诊断很难区分，必须依据血清学或分子生物学方法进行确诊，这对于我们及时采取正确的预防和治疗措施是必需的。目前为止，本病的实验室诊断方法已经建立了很多，包括检测抗体和检测病原两大类。检测RA抗体的有间接ELISA、间接血凝试验等；检测病原体RA的有细菌分离培养、玻板凝集试验、试管凝集试验、琼脂扩散试验、荧光抗体技术、间接免疫酶组织化学法、聚合酶链反应(PCR)等。本发明所涉及的试剂盒是检测病原体RA，所采用的方法是环介导等温扩增技术。与上述检测RA的其它方法相比，本发明所涉及的试剂盒更敏感、特异、操作简单、快速，并且在仅有简单设备的实验室和养殖场内即可使用，非常适用于临床快速诊断，这就为及时预防和治疗RA感染提供了依据。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足，便于在基层应用，检测耗时短，成本低，操作简单方便的检测RA的试剂盒，以及这种试剂盒的制备方法和使用方法。

本发明涉及的检测鸭疫里默氏杆菌的试剂盒中至少有两对用于进行环介导等温扩增的特异性引物F3、B3、FIP和BIP，其中F3为上游外引物，B3为下游外引物；FIP为上游内引物，BIP为下游内引物，各引物序列如下：

上游外引物F3：5’-tctttttggcaacgaagatgc-3’

下游外引物B3：5’-ccccttggataccaagacca-3’

上游内引物FIP：5’-agggaacgtaagacctgtatagtcggtttgacccttatgtaagagttgga-3’

下游内引物BIP：5’-accatacactcaaggaagagcggccaaatgtttgtacctaaacctgtt-3’。

为方便使用，本发明的试剂盒中还有甜菜碱、硫酸镁、dNTPs、ThermoPol反应缓冲液和Bst DNA聚合酶；或者还加有显色剂SYBR GREEN I。

本发明的试剂盒的使用方法是：

a.按5pM的引物F3/B3各1μl，20pM的引物FIP/BIP各2μl，25mM的dNTPs1μl，5M的甜菜碱5μl，100mM的硫酸镁1μl，10×ThermoPol reaction buffer2.5μl，双蒸水6.5μl配制出LAMP反应液；

b.从被检测样品中提取总DNA；

c.将2山的总DNA为模板与前述LAMP反应液配制成LAMP反应混合物；

d.将LAMP反应混合物加入Bst DNA聚合酶进行LAMP反应；

e.LAMP反应终止后进行电泳，根据反应产物电泳后能否呈现清晰的梯度条带判定被检样品的阳性和阴性。

当本发明的试剂盒中带有显色剂时，可在LAMP反应终止后，在反应产物中加入显色剂，根据反应产物是否呈现绿色判定被检样品的阳性和阴性。这样其检测过程将更为便捷。

对本发明中试剂盒的敏感性和特异性进行了验证。结果表明，试剂盒检测RA的敏感性比常规PCR方法高10倍；试剂盒对大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌的检测结果均为阴性，说明特异性高。

由上述内容可知，本发明是利用环介导等温核酸扩增技术检测RA感染，其优点是：(1)与常规PCR方法相比，本发明中的试剂盒具有更高的敏感性；(2)本发明中的试剂盒具有高特异性；(3)不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩增，只需要简单的恒温装置，如水浴锅等即可；(4)与耗时2-5h的常规PCR相比，反应时间大大缩短，一般只需要1-2小时；(5)其检测结果可根据反应液的颜色变化肉眼判定结果，简单方便；(6)可在小型实验室和基层养殖场作快速诊断用。

附图说明

图1是试剂盒检测RA的LAMP产物的琼脂糖电泳结果。泳道M是DL2000Marker；泳道1是阴性结果；泳道2是阳性结果，LAMP产物呈现清晰的梯度条带。

图2是试剂盒与PCR方法的敏感性对比结果。泳道1-7是用PCR方法分别检测0.5，5，50，500，5×10³，5×10⁴，5×10⁵个拷贝RA DNA模板的电泳结果，该方法可检测到50个拷贝的RA DNA模板；泳道8-14是用试剂盒分别检测0.5，5，50，500，5×10³，5×10⁴，5×10⁵个拷贝RA DNA模板的电泳结果，该试剂盒可检测到5个拷贝的RA DNA模板；泳道M是DL2000Marker。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明不局限于实施例的内容。

(一)检测样品的准备

从山东农业大学姜世金教授处获赠RA参考株8株，包括2株血清1型，1株血清2型，5株血清10型。从山东济宁、枣庄、潍坊、临沂和河南信阳等地市的鸭场中采集了病死鸭的鸭头306个，采用细菌分离方法分离和纯化RA。具体方法是：无菌取鸭脑组织少许，涂布在巧克力平板上，置于5％CO₂培养箱内培养24-48h，挑取与RA菌落形态相似的单克隆菌落，放于含5％小牛血清的营养肉汤培养基内，在37℃摇床内过夜培养、增菌，获得的每一株菌都通过革兰氏阴性反应、麦康凯琼脂平板筛选、API 20E系统进行鉴定。最终从306个鸭头中的149个鸭头中分离到了149株RA。经玻板凝集和试管凝集反应鉴定，149株RA中包括52株血清1型，68株血清2型，18株血清10型和11株未定型。

从8株RA参考株、149株RA分离株、149个分离到了RA的鸭脑组织、157个未分离到RA的鸭脑组织中，分别提取总DNA，用本发明提供的引物和方法进行LAMP检测，同时也用普通PCR方法进行检测。其中普通PCR方法所用的引物为本发明中提供的引物F3和B3，扩增方法为：反应混合物首先在94℃预变性5min，接着进行35个循环(循环程序为94℃30s，52℃1min，72℃25s)，最后72℃延伸5min。扩增产物在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有特异性的目的DNA条带。

(二)建立检测RA的LAMP试剂盒，这一试剂盒可检测50份样品

1、提供两对特异引物F3、B3、FIP和BIP。其中F3为上游外引物，B3为下游外引物，FIP为上游内引物，BIP为下游内引物。引物序列如下：

上游外引物F3：5’-tctttttggcaacgaagatgc-3’

下游外引物B3：5’-ccccttggataccaagacca-3’

上游内引物FIP：5’-agggaacgtaagacctgtatagtcggtttgacccttatgtaagagttgga-3’

下游内引物BIP：5’-accatacactcaaggaagagcggccaaatgtttgtacctaaacctgtt-3’

2、试剂盒中还包括如下试剂

(1)50支0.5ml的离心管，每支离心管中装有22μl的LAMP反应液。LAMP反应液包括0.2μM F3和B3，1.6μM FIP和BIP，1M甜菜碱，4mM硫酸镁，1.0mMdNTPs，1×ThermoPol reaction buffer。以上各成分的浓度均为在反应液中的终浓度。LAMP反应液的具体配制方法如下：

5pM的引物F3/B3                 各1μl

20pM的引物FIP/BIP              各2μl

25mM的dNTPs                    1μl

5M的甜菜碱                     5μl

100mM的硫酸镁                  1μl

10×ThermoPol reaction buffer  2.5μl

双蒸水                         6.5μl

总计                           22μl

(2)50μl(400units)Bst DNA聚合酶(New England Biolabs，USA)。

(3)显色剂：125μl 10％的荧光染料SYBR GREEN I。

(三)LAMP检测方法

本发明所建立的检测RA的试剂盒的使用方法如下：

1、RA的DNA的提取

用QIAamp DNA提取试剂盒从RA参考株、细菌纯培养物和病料中提取总DNA，提取方法按说明书进行。也可采用其他厂家的商品化试剂盒提取DNA。

2、LAMP反应体系

LAMP反应液        22μl

模板RA DNA        2μl

Bst DNA聚合酶     1μl(8units)

总计              25μl

3、LAMP反应程序

先将22μl的LAMP反应液和2μl的模板DNA混合，在94℃反应5min，然后在冰上急冷，再加入1μl的Bst DNA聚合酶，在62℃恒温反应1h，然后将温度升至80℃维持2min终止反应。

4、LAMP反应结果判定

将2.5μl显色剂加入反应体系中，若反应液呈现绿色，可判定样品中含有RA；若反应液呈现橙色，则判定样品中不含RA。另外，取2μl反应液在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，在全自动凝胶成像分析仪内观察电泳结果，若反应产物电泳后呈现清晰的梯度条带判为阳性，否则判为阴性。

对本发明中试剂盒的敏感性与检测RA的常规PCR方法进行了比较。PCR方法所用的引物是本发明中提供的F3和B3，扩增程序为：94℃预变性5min，接着进行35个循环(94℃30s，52℃1min，72℃25s)，最后72℃延伸5min。所用的模板是系列稀释的RA DNA，包括0.5，5，50，500，5×10³，5×10⁴，5×10⁵个拷贝/管，共7个梯度。用本发明中的试剂盒对这些不同拷贝数的模板分别进行检测，同时也用PCR方法进行检测，比较两种方法的敏感性。结果表明，本发明中的试剂盒可检测到5个拷贝的RA DNA模板，而PCR可检测到的RADNA模板是50个拷贝，说明试剂盒比PCR具有更高的敏感性(如图2所示)。

用本发明中的试剂盒检测了50株大肠杆菌，34株沙门氏菌和26株巴氏杆菌，结果均为阴性，说明试剂盒具有高特异性。

Claims (5)

1.检测鸭疫里默氏杆菌的试剂盒，其特征在于检测试剂盒中至少有两对用于进行鸭疫里默氏杆菌环介导等温扩增的特异性引物F3、B3、FIP和BIP，其中F3为上游外引物，B3为下游外引物；FIP为上游内引物，BIP为下游内引物，各引物序列如下：

上游外引物F3：5’-tctttttggcaacgaagatgc-3’

下游外引物B3：5’-ccccttggataccaagacca-3’

上游内引物FIP：5’-agggaacgtaagacctgtatagtcggtttgacccttatgtaagagttgga-3’

下游内引物BIP：5’-accatacactcaaggaagagcggccaaatgtttgtacctaaacctgtt-3’。

2.权利要求1所述的检测鸭疫里默氏杆菌的试剂盒，其特征在于试剂盒内还有甜菜碱、硫酸镁、dNTPs、ThermoPol反应缓冲液和Bst DNA聚合酶。

3.权利要求1或2所述的检测鸭疫里默氏杆菌的试剂盒，其特征在于试剂盒内还有显色剂SYBR GREEN I。

4.权利要求1至2所述的试剂盒的使用方法，其特征是：

a.按5pM的引物F3/B3各1μl，20pM的引物FIP/BIP各2μl，25mM的dNTPs1μl，5M的甜菜碱5μl，100mM的硫酸镁1μl，10×ThermoPol reaction buffer2.5μl，双蒸水6.5μl配制出LAMP反应液；

b.从被检测样品中提取总DNA；

c.将2μl的总DNA为模板与前述LAMP反应液配制成LAMP反应混合物；

d.将LAMP反应混合物加入Bst DNA聚合酶进行LAMP反应；

e.LAMP反应终止后进行电泳，根据反应产物电泳后能否呈现清晰的梯度条带判定被检样品的阳性和阴性。

5.权利要求3所述的试剂盒的使用方法，其特征是：

a.按5pM的引物F3/B3各1μl，20pM的引物FIP/BIP各2μl，25mM的dNTPs1μl，5M的甜菜碱5μl，100mM的硫酸镁1μl，10×ThermoPol reaction buffer2.5μl，双蒸水6.5μl配制出LAMP反应液；

b.从被检测样品中提取总DNA；

c.将2μl的总DNA为模板与前述LAMP反应液配制成LAMP反应混合物；

d.将LAMP反应混合物加入Bst DNA聚合酶进行LAMP反应；

e.LAMP反应终止后，在反应产物中加入显色剂，根据反应产物是否呈现绿色判定被检样品的阳性和阴性。

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