CN101381695A - 鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株及其构建方法，该方法是将自杀性质粒pDS－132与鸭疫里默氏杆菌血清1型基因ΔAcOAT分别进行Sal I单酶切胶回收后，用T4DNA连接酶连接，得到pDS 132::ΔAcOAT自杀性质粒；然后通过电转化方法将pDS－132::ΔAcOAT转入鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株感受态细胞，氯霉素抗性平板筛选重组突变菌株即为鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株。经动物试验证明以10倍LD50剂量攻毒试验表明该减毒菌株毒力已明显下降，以基本无毒力，且该减毒菌株不会无毒力返强，具有制备弱毒活疫苗的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种鸭疫里默氏杆菌血清1型N-乙酰鸟氨酸氨基转移酶(N-acetylornithine aminotransferase，AcOAT)基因的核苷酸序列，同时还涉及利用该基因构建的鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株及其构建方法。
背景技术
鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)病是鸭、鹅、火鸡和其它鸟类的一种高致病性、接触性传染病，该病主要侵害1～8周龄(尤其2～3周龄)雏鸭、雏鹅及雏火鸡。鸭疫里默氏杆菌病呈急性或慢性败血症过程，主要以神经症状和纤维素性心包炎，肝周炎和气囊炎为特征。该病的发病率可达90％以上，致死率可高达75％以上，耐过病鸭常常长成残次鸭或僵鸭，饲料转化率降低，生长发育迟缓。此外，由该病所引起的输卵管炎也是影响鸭成年后产蛋率低下的最重要原因之一。该病在世界范围内广泛流行，是目前造成养鸭业经济损失的最主要和最为严重的传染病之一。给养鸭业造成了巨大的经济损失。
药物预防是我国目前控制该病的一项主要措施之一。但是目前对临床分离菌株的大量药敏试验表明RA己对兽医临床上使用的大多数抗菌药物均产生了耐药性，生产实际中的防治效果并不理想，而要达到比较好的防治效果，必须反复投药，这既增加了生产成本，又易产生耐药性。因此，药物防治该病存在很大的局限性。因而免疫接种则成为控制该病的更为有效的措施。但是，随着越来越多新血清型的出现，且各血清型之间缺乏交叉保护，这也给免疫预防带来了极大的困难。我国目前生产上应用较广的RA灭活疫苗的实际免疫保护效果并不理想、存在着免疫水平较低、免疫持续时间较短，需进行多次接种、血清型保护谱较窄、不能产生交叉保护等诸多缺点。因此，对RA新型候选疫苗的研究和开发已经成为RA防治的关键。
基因敲除(gene knockout)是在80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。基因敲除是指对一个已知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因敲除，或用其它基因取代，然后对敲除后的个体进行研究，通过其性状的变化而研究被敲除基因的功能。该技术已广泛应用于细菌突变株的构建，但在鸭疫里默氏杆菌中，目前还未见公开报道。
N-乙酰鸟氨酸氨基转移酶(N-acetylornithine aminotransferase，AcOAT)是精氨酸生物合成代谢的关键酶之一。在存在L-谷氨酸时，它催化N-乙酰谷氨酸半醛向N-乙酰鸟氨酸的转换。在大肠杆菌中，N-乙酰鸟氨酸氨基转移酶也参与赖氨酸的生物合成。在许多微生物中，L-精氨酸是其碳和氮的来源。而在一些包内寄生致病菌中，L-精氨酸的转运和代谢是它们在胞内生存的必需条件。Gordhan等(2002年)构建了结核分枝杆菌鸟氨酸氨甲酰转移酶基因缺失的突变株，结果表明突变株对免疫缺陷的SCID鼠毒力下降，而对免疫功能完整的DBA/2鼠则毒力明显下降。Namiki等(2001年)运用限制性内切酶介导的整合突变技术(REMI)筛选尖孢镰刀菌的致病因子，获得了13株致病力减弱的突变株，分析表明其中一突变株突变的基因可能编码参与精氨酸生物合成代谢的精氨基琥珀酸裂解酶基因。Klarsfeld等于1994年报道了编码精氨酸ABC转运载体转座插入突变的李斯特单核杆菌，结果显示突变体的LD50要比野生型高两倍。而在RA中N-乙酰鸟氨酸氨基转移酶基因及其与RA毒力之间相关性目前在国内外均未见报道。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种鸭疫里默氏杆菌血清1型(RA1)基因工程减毒菌株，该菌株使N-乙酰鸟氨酸氨基转移酶基因产生缺失突变，使鸭疫里默氏杆菌毒力下降。本发明的鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株可用于鸭疫里默氏杆菌基因工程活疫苗的研制。
本发明的另一目的在于提供上述鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株的构建方法。
本发明所使用的自杀性质粒pDS132，带有氯霉素抗性基因、sacB基因，R6K复制起始位点和RP4基因、并切除了insert序列，具有如下特点：(1)氯霉素抗性基因用于筛选质粒转导成功的菌株；(2)R6K复制起始位点是依赖于π蛋白的起始位点，π蛋白是由pir基因所编码，因此自杀质粒pDS132只能在含有pir基因的菌株内复制，在不含pir基因的菌株内则会逐渐丢失。本发明所使用的自杀载体宿主菌是SM10pir，它携带有pir基因，能够提供反式π蛋白，因此自杀性质粒pDS132可以在SM10pir中复制；(3)来源于枯草芽胞杆菌(Bacillussub tills)的sacB基因编码果聚糖蔗糖酶，表达sacB基因的革兰氏阴性菌在含5％蔗糖的培养基上不能生长，也就是说在含蔗糖的培养基中，带有自杀性载体的菌株不能生长，只有丢失了质粒的菌株才能生长，这就提供了一种筛选质粒丢失菌株的方法；(4)RP4能够诱导细菌接合(conjugation)而发生质粒在细菌间直接转移。(5)insert序列的切除降低了随机重组生的发机率。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)pDS132::ΔAcOAT自杀性质粒的构建
将自杀性质粒pDS-132与鸭疫里默氏杆菌血清1型基因即△AcOAT分别进行SalI单酶切胶回收后，并将酶切的自杀性质粒pDS132用CIAP去磷酸化，以T4DNA连接酶连接，得到pDS132::ΔAcOAT自杀性质粒；转化大肠杆菌SM10pir，重组子用菌落PCR鉴定，阳性克隆提取质粒，用SalI酶切后，琼脂糖凝胶电泳鉴定。
所述鸭疫里默氏杆菌血清1型基因△AcOAT为左臂基因序列加右臂基因序列，所述左臂基因序列由319个核苷酸组成，5’端至3’端序列为：
1 GCGGTAAATA AGTAACTATG CCAATTTTCG TTATTACCGT TACAATAAAA AATTAGACCT
61 GTTTCAATTG CCTGATCATG CAACAAGATT TCTTTAAGTA TCAAGCTCAA ACCACACCTT
121 TTGCCTCAGG TTTTGAAGCC GAAAGAGCAG AAGGAAACTA TATTTACGGA AAAGATGGCA
181 AAGCCTATCT AGACTTTGTA GCAGGAGTAT CTGCCAATAC TTTGGGACAT TCGCACCCAA
241 AAATCATCAA TGCAATTAAG GAACAGGCAG ATAAATACCT TCATATAAGG TCTATGGAGA
301 GTATGCACAA GAGAAACCT。
所述右臂基因序列由240个核苷酸组成，5’端至3’端序列为：
1 TAACATTAGG CGTATAAGTA AATATTTGGG CGTGCCCCAA GCCGAGGCTA TTCCCTAAGC
61 TGATGGGTCG GTCTTCGGGC AGTCGCTCTT TTTTAGCCGA AGCTCTCCAG TAGCTAAGCC
121 CAGCTTTTCT CCACCTCCGA AAAAAAAGGA GCTCCAACAA TGCCCTCCGC CCTCACGCAG
181 TAAAGCTCTA AAAATCATAA GATTTGGTCT TTAAGATTTG CTAGAGTTTG TGTATATTTG。
所述鸭疫里默氏杆菌血清1型基因△AcOAT由559个核苷酸组成，鸭疫里默氏杆菌血清1型基因△AcOAT基因的核苷酸序列为：
1 GCGGTAAATA AGTAACTATG CCAATTTTCG TTATTACCGT TACAATAAAA AATTAGACCT
61 GTTTCAATTG CCTGATCATG CAACAAGATT TCTTTAAGTA TCAAGCTCAA ACCACACCTT
121 TTGCCTCAGG TTTTGAAGCCGAA AGAGCAG AAGGAAACTA TATTTACGGA AAAGATGGCA
181 AAGCCTATCTAGACTTTGTA GCAGGAGTATC TGCCAATACT TTGGGACAT TCGCACCCAA
241 AAATCATCAA TGCAATTAAG GAACAGGCAG ATAAATACCT TCATATAAGG TCTATGGAGA
301 GTATGCACAA GAGAAACCTT AACATTAGGC GTATAAGTAA ATATTTGGGC GTGCCCCAAG
361 CCGAGGCTAT TCCCTAAGCT GATGGGTCGG TCTTCGGGCA GTCGCTCTTT TTTAGCCGAA
421 GCTCTCCAGT AGCTAAGCCC AGCTTTTCTC CACCTCCGAA AAAAAAGGAG CTCCAACAAT
481 GCCCTCCGCC CTCACGCAGT AAAGCTCTAA AAATCATAAG ATTTGGTCTT TAAGATTTGC
541 TAGAGTTTGT GTATATTTG。
(2)鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株的构建
将步骤(1)中构建的pDS132::ΔAcOAT自杀性质粒，通过电转化方法转入鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株感受态细胞，氯霉素抗性平板筛选重组突变菌株即为鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株。
所述鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株感受态细胞是按下述方法制备：(1)鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株在胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)固体培养基上划线并培养过夜；(2)将单个的菌落接种于3mL的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)液体培养基，37℃ 200rpm振荡培养4h；(3)将0.5mL振荡培养物接种于50mL的TSB液体培养基，在37℃ 200rpm振荡培养，当OD600达到0.4时收获细胞；所述TSB液体培养基预先37℃ 200rpm振荡0.5h，(4)将收获的细胞迅速置于冰浴中15～30min，振摇，使内容物充分冷却；(5)将细胞转移至冰冷的离心管中，4℃ 2600×g离心12min；(6)弃培养基上清，用80mL预冷的10％(V/V)甘油重悬菌体沉淀，4℃ 2800×g离心12min；(7)弃上清，用40mL预冷的10％(V/V)甘油重悬菌体沉淀，4℃ 2800×g离心12min；(8)弃上清，用1mL预冷的10％(V/V)甘油重悬菌体沉淀，即得到鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株感受态细胞。
所述通过电转化方法将pDS-132::△AcOAT转入鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株感受态细胞是按下述方法制备：(1)40μL鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株感受态细胞在冰上冷却；(2)将1μL的pDS132::ΔAcOAT自杀性质粒加入上述感受态细胞中，置冰上1min；(3)将鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株感受态细胞与pDS132::ΔAcOAT自杀性质粒的混合物放进电转化仪；调节电转化仪使电脉冲为25μF，电压为2.5kV，电阻为200Ω；脉冲结束后，室温下在上述混合物中加入1mL的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)；(4)然后转移至于37℃摇床，200rpm震荡培养1h；(5)将震荡培养物涂布于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板(含终浓度为50μg/mL的氯霉素)上，并置于37℃温箱培养过夜。
所述鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株(Riemerella anatipestifer，RA，血清1型GDGZ株)保藏号：CCTCC NO：M208070、保藏日期：2008年5月9日、保藏单位为中国典型培养物保藏中心(武汉)。菌种特征为革兰氏阴性杆菌、无运动性不形成芽孢。单个、成双，偶尔呈链状排列。
本发明的鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株，就是通过上述构建方法构建而成的。
本发明与现有技术相比具有如下优点和有益效果：通过缺失N-乙酰鸟氨酸氨基转移酶基因构建的鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株，经动物试验证明以10倍LD50剂量攻击试验动物未发生死亡，说表明构建的鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株毒力已明显下降，对雏鸭已基本无毒力，且利用基因工程技术构建的鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株毒力返强可能性小，具有制备弱毒活疫苗的潜力，为鸭疫里默氏杆菌的防治提供了一种新的候选疫苗。
附图说明
图1为△AcOAT基因左右臂片段的PCR扩增产物电泳图。
图2为△AcOAT基因左右臂片段重组子的PCR鉴定图。
图3为△AcOAT基因的PCR扩增产物电泳图。
图4为重组质粒pDS-132::△AcOAT的酶切鉴定图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实施例中的培养基和分子生物学操作方法为该领域技术人员所公知，参考Sambrook著“分子克隆”第二版(冷泉港，1989)及“精编分子生物学实验指南”(F/美奥斯伯等，颜子颖等译，北京，科学出版社，1998)。
实施例1
1、鸭疫里默氏杆菌血清1型基因(△AcOAT基因，RA1基因)左、右臂基因片段的扩增和克隆
(1)扩增引物合成
根据N-乙酰鸟氨酸氨基转移酶(N-acetylornithine aminotransferase，AcOAT)基因设计左、右臂基因片段的PCR寡核苷酸扩增引物。左臂基因片段：上游引物长30个核苷酸，含一个SalI酶切位点5-GGAGTCGACGCGGTAAATAAGTAACTATGC-3(下划线为酶切位点)；左臂延伸引物长51个核苷酸，重叠部分为39个核苷酸，5-CCCAAATATTTACTTATACGCCTAATGTTAAGGTTTCTCTTGTGCATAC TC-3(下划线为重叠序列)。右臂基因片段：上游引物长30个核苷酸，含一个Sal I酶切位点5-GGAGTCGACCAAATATACACAAACTCTAGC-3(下划线为酶切位点)；右臂延伸引物长51个核苷酸，重叠部分为39个核苷酸，5-GGTCTATGGAGAGTATGCACAAGAGAAACCTTAACATTAGGCGTATA AG-3(下划线为重叠序列)。引物由上海生物工程有限公司合成，经PAGE纯化。
引物设计合成如下(下划线显示酶切位点)
(2)RA1基因组DNA的提取
将冻干保存的鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株(保藏号：CCTCCNO：M208070；保藏日期：2008年5月9日；保藏单位为中国典型培养物保藏中心(武汉)。菌种特征为革兰氏阴性杆菌、无运动性不形成芽孢。单个、成双，偶尔呈链状排列。)粉末溶于胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)(含5％小牛血清)中，37℃振荡培养18h。接种环蘸取单个菌落过夜培养物划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板上，37℃温箱培养18h。挑选单菌落接种于TSB中，37℃振荡培养24h后，用快速革兰氏阴性菌基因组方法提取鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株基因组DNA。具体步骤如下：(1)取1.5mL 24h培养菌液于1.5mL EP管中，室温12000rpm离心3min，弃上清，可重复取样；(2)沉淀用200μL的裂解缓冲液重悬，并轻柔吹打3～5次；(3)在重悬液中加入66μL的5M NaCl溶液并充分混匀，4℃ 12000rpm离心10min；(4)上清转入一新的1.5mL EP管中，加入等体积的氯仿，上下轻柔地颠倒EP管，至少50次，直至溶液变成牛奶状，室温12000rpm离心3min；(5)上清转入一新的1.5mLEP管中，加入2倍体积的无水乙醇以沉淀基因DNA，70％无水乙醇洗涤两次；(6)充分除去乙醇残留后，加入50μL的双蒸水以溶解基因组DNA。将提取的基因组DNA存储于-20℃，备用。
(3)左、右臂基因片段的扩增
以提取的鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株基因组DNA为模板，用Left Upstream primer(左臂上游引物)和Leftelongation primer(左臂延伸引物)扩增左臂基因，Right Downstream(右臂上游引物)和primer Right elongationprimer(右臂延伸引物)扩增右臂基因，细菌基因组抽提方法按Chen报道的方法(Wen-ping Chen，Tsong-teh Kuol.A simple and rapid method for thepreparation of gram-negative bacterial genomic DNA.Nucleic AcidsResearch，1993，9(21):2260)进行。PCR扩增体系为：PreMix Taq 10μL(购自大连宝生物有限公司)，RA1基因组DNA 1μL，上下游引物各1μL，加灭菌水至50μL。
PCR反应程序：94℃预变性5min；(94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸2min)进行35个循环；72℃延伸10min；4℃+∞。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果产物，电泳结果如图1所示。
(4)目的基因片段的回收
按照E.N.Z.A DNA胶回收试剂盒说明书回收目的基因片段，其过程如下：(1)在手提紫外灯下迅速切下含目的DNA片段的凝胶置于1.5mL微量离心管中，称凝胶重量；(2)按凝胶1mL/g的比例加入4倍体积的结合缓冲液，置55～65℃水浴7min，让凝胶完全溶解；(3)将上述溶液转移至试剂盒专用的吸附柱离心管中，10000g离心1min；(4)用300μL Binding Buffer重新离心洗涤吸附柱；(5)加入750μL洗涤液，静置2min，10000g离心1min；(6)弃滤液，按步骤(5)重新洗涤1次；(7)将吸附柱子10000g离心2min，使柱中的Washing Buffer全部除尽；(8)加入50μL双蒸水于柱上，10000g离心1min，即得目的基因片段，存储于-20℃，备用。
(5)目的基因片段克隆入T载体
将目的基因片段克隆入pMD-18T载体，该载体购自大连宝生物有限公司。反应组分如下：溶液I 5μL，目的基因片段4μL，pMD-18T载体1μL，总体积为10μL，4℃连接过夜。
感受态细胞的制备：(1)取一新鲜培养的大肠杆菌JM109单菌落，接种于一含有10mL LB的液体培养基，37℃振荡培养过夜；(2)取过夜培养的菌液1mL接种于100mL的LB液体培养基中，37℃ 200rpm振荡培养，至OD600＝0.4～0.6；(3)将大肠杆菌JM109转移到预冷的50mL无菌离心管中，置于冰上10min，使培养物冷却至0℃；(4)4℃ 5000rpm离心10min，回收细胞；(5)弃掉培养液，将离心管于滤纸上倒置1min；(6)每50mL初始培养液用30mL用冰预冷的0.1M CaCl2-MgCl2溶液重悬每份细胞沉淀；(7)4℃以5000rpm离心10min，回收细胞；(8)弃掉培养液，将离心管于滤纸上倒置1min；(9)每50mL初始培养物用2mL预冷的0.1M CaCl2重悬每份细胞沉淀，得到感受态细胞悬液。分装后置于4℃备用。
连接产物的转化：(1)从用CaCl2制备的感受态细胞悬液中吸取200μL转移到1mL的离心管中，每管加入目的基因片段和pMD-18T载体的连接产物5μL，冰浴30min；(2)将离心管放入42℃水浴中，静置90s；(3)快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却2min；(4)每管加800μL SOC培养基，于37℃缓慢振摇培养温育45min；(5)将培养物涂布于LB琼脂平板(含终浓度为100μg/mL的AMP)，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平皿，37℃过夜培养。
重组子的菌落PCR鉴定：挑取转化后铺板的单菌落于含有10μLLB液体培养基(含终浓度为100μg/mL的AMP)的1.5mL EP管中反复吹打混匀，得到混匀的菌液。以混匀的菌液为模版进行转化子的菌落PCR鉴定，PCR扩增体系为：PreMix Taq(预混Taq酶)10μL(购自大连宝生物有限公司)，混匀的菌液1μL，目的基因的上下游引物各1μL，加灭菌水至20μL。PCR反应程序：94℃预变性5min；(94℃变性30s，55℃退火30sec，72℃延伸40sec)进行35个循环；72℃延伸10min；4℃+∞。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，电泳结果如图2所示。
(6)左、右臂基因片段的序列测定
提取质粒DNA双脱氧法测定核苷酸序列，序列测定由广州英俊生物有限公司完成，测序引物为M13启动子引物。
测定结果：左臂基因片段长319bp，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鸟嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分别为：A-115、C-62、G-58、T-84(表1)。右臂基因片段长240bp，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鸟嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分别为：A-62、C-59、G-51、T-68(表2)。
构建鸭疫里默氏杆菌N-乙酰鸟氨酸氨基转移酶(N-acetylornithineaminotransferase，AcOAT)基因的核苷酸序列，即构建鸭疫里默氏杆菌(ΔAcOAT)突变体的左右臂基因的核苷酸序列，该核苷酸序列是以鸭疫里默氏杆菌基因组DNA为模版，用特异性寡核苷酸引物，用PCR方法获得。该序列为左臂序列加右臂序列，所述左臂基因序列由319个核苷酸组成(表1)，所述右臂基因由240个核苷酸组成(表2)，5’端至3’端序列为：
表1 左臂基因序列
1 GCGGTAAATA AGTAACTATG CCAATTTTCG TTATTACCGT TACAATAAAA AATTAGACCT
61 GTTTCAATTG CCTGATCATG CAACAAGATT TCTTTAAGTA TCAAGCTCAA ACCACACCTT
121 TTGCCTCAGG TTTTGAAGCC GAAAGAGCAG AAGGAAACTA TATTTACGGA AAAGATGGCA
181 AAGCCTATCT AGACTTTGTA GCAGGAGTAT CTGCCAATAC TTTGGGACAT TCGCACCCAA
241 AAATCATCAA TGCAATTAAG GAACAGGCAG ATAAATACCT TCATATAAGG TCTATGGAGA
301 GTATGCACAA GAGAAACCT。
表2 右臂基因序列
1 TAACATTAGG CGTATAAGTA AATATTTGGG CGTGCCCCAA GCCGAGGCTA TTCCCTAAGC
61 TGATGGGTCG GTCTTCGGGC AGTCGCTCTT TTTTAGCCGA AGCTCTCCAG TAGCTAAGCC
121 CAGCTTTTCT CCACCTCCGA AAAAAAAGGA GCTCCAACAA TGCCCTCCGC CCTCACGCAG
181 TAAAGCTCTA AAAATCATAA GATTTGGTCT TTAAGATTTG CTAGAGTTTG TGTATATTTG。
所述鸭疫里默氏杆菌血清1型△AcOAT基因由559个核苷酸组成，△AcOAT基因的核苷酸序列如下：
1 GCGGTAAATA AGTAACTATG CCAATTTTCG TTATTACCGT TACAATAAAA AATTAGACCT
61 GTTTCAATTG CCTGATCATG CAACAAGATT TCTTTAAGTA TCAAGCTCAA ACCACACCTT
121 TTGCCTCAGG TTTTGAAGCC GAAAGAGCAG AAGGAAACTA TATTTACGGA AAAGATGGCA
181 AAGCCTATCT AGACTTTGTA GCAGGAGTATCTGCCAATACTTTGGGACAT TCGCACCCAA
241 AAATCATCAA TGCAATTAAG GAACAGGCAG ATAAATACCT TCATATAAGG TCTATGGAGA
301 GTATGCACAA GAGAAACCTT AACATTAGGC GTATAAGTAA ATATTTGGGC GTGCCCCAAG
361 CCGAGGCTAT TCCCTAAGCT GATGGGTCGG TCTTCGGGCA GTCGCTCTTT TTTAGCCGAA
421 GCTCTCCAGT AGCTAAGCCC AGCTTTTCTC CACCTCCGAA AAAAAAGGAG CTCCAACAAT
481 GCCCTCCGCC CTCACGCAGT AAAGCTCTAA AAATCATAAG ATTTGGTCTT TAAGATTTGC
541 TAGAGTTTGT GTATATTTG。
2、△AcOAT基因片段的扩增
左臂序列和右臂序列经测序正确后，以Left Upstream primer和RightDownstream primer用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将左臂基因和右臂基因串联，构建ΔAcOAT基因片段，即为缺失N-乙酰鸟氨酸氨基转移酶基因末端957bp的基因片段(△AcOAT))。SOE-PCR扩增体系为：PreMix Taq 10μL，Lfetupstream prime 1μL，Right Downstream primer 1μL，左臂基因片段1μL，右臂基因片段1μL，加灭菌水至50μL。PCR反应程序：94℃预变性5min；(94℃变性30s，55℃退火30sec，72℃延40sec)进行35个循环；72℃延伸10min；4℃+∞。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，电泳结果如图3所示。
3、pDS132::ΔAcOAT自杀性质粒的构建
将自杀性质粒pDS132和ΔAcOAT基因片段分别用SalI酶切，并将酶切的自杀性质粒pDS132用CIAP去磷酸化后，pDS1322μL，ΔAcOAT基因片段4μL，T4DNA连接酶1μL，酶连接酶缓冲液1μL，4℃连接16h，得到pDS132::ΔAcOAT自杀性质粒。转化大肠杆菌SM10pir，菌落PCR鉴定正确后，提取阳性克隆质粒酶切鉴定，用SalI酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果如图4所示。
4、鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株的构建
(1)、鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株(保藏号：CCTCCNO：M208070；保藏日期：2008年5月9日；保藏单位为中国典型培养物保藏中心(武汉)。)RA1电转化感受态细胞制备：(1)取-70℃甘油保存的RA1型菌在TSA固体培养基上划线并培养过夜；(2)取单个的菌落接种于3mL的TSB液体培养基，37℃200rpm振荡培养4h；(3)取0.5mL振荡培养物接种于50mL的TSB液体培养基(TSB液体培养基预先37℃200rpm振荡0.5h)，于37℃200rpm振荡培养，当OD600达到0.4时收获细胞；(4)将收获的细胞迅速置于冰浴中15～30min，不时缓慢摇动，以保证内容物充分冷却。同时将离心管置于冰上预冷；(5)将细胞转移至冰冷的离心管中，4℃ 2600×g离心12min；(6)弃培养基，用80mL预冷的10％甘油重悬菌体沉淀，4℃ 2800×g离心12min；(7)弃上清，用40mL预冷的10％甘油重悬菌体沉淀，4℃ 2800×g离心12min；(8)弃上清，用1mL预冷的10％甘油重悬菌体沉淀，分装40μL/管。
(2)、pDS132::ΔAcOAT的电转化：(1)取40μL新鲜制备的鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株RA1感受态细胞与电转化仪的电击杯(0.2cm)一起放在冰上冷却；(2)取1μL的pDS132::ΔAcOAT自杀性质粒放入40μL新鲜制备的RA1感受态细胞中，置于冰上1min；(3)调节电转化仪使电脉冲为25μF，电压为2.5kV，电阻为200Ω；(4)将鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株RA1感受态细胞与pDS132::ΔAcOAT自杀性质粒的混合物加至冷的电击杯内，轻击液体以确保细菌与混合物位于电击杯底部。擦干电击槽外的冷凝水和雾气，将电击杯放进电转化仪；(5)按上述设定的参数，启动对细胞的电脉冲，脉冲结束后，尽可能快地取出电击杯，室温下加入1mL的TSB培养基；(6)将细胞转移至于37℃摇床，200rpm震荡培养1h；(7)将震荡培养物涂布于TSA平板(含终浓度为50μg/mL的氯霉素)上，并置于37℃温箱培养过夜。
(3)、重组菌株RA1(△AcOAT)的筛选：将RA1(pDS132::△AcOAT)划线于TSA(含终浓度为50μg/mL的氯霉素)琼脂平板上，挑取单个菌落接种于5ml TSA液体培养基中，于37℃振荡培养过夜。对过夜培养物进行倍数稀释后分别涂于含蔗糖的TSA(Sucrose 5％，NaCl free)琼脂平板，于37℃培养过夜。用牙签从过夜培养的TSA(Sucrose 5％，NaCl free)琼脂平板上挑取单个菌落接种于TSA(含终浓度为50μg/mL的氯霉素)平板。筛选对氯霉素敏感的克隆即鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株(重组菌株RA1(△AcOAT))。
(4)、重组菌株RA1(△AcOAT)的动物攻毒试验：试验动物为7日龄樱桃谷鸭。以亲本株GDGZ菌株为对照株，重组RA1(△AcOAT)菌株为试验株，对重组RA1(△AcOAT)菌株的毒力进行测定，其攻毒剂量为1×LD50(3×107CFU)，5×LD50和10×LD50。动物试验结果表明构建的RA1(ΔAcOAT)突变株毒力明显下降，以10LD50攻毒时，试验鸭仍然全部存活。动物攻毒试验初步表明△AcOAT基因可能与RA的毒力有一定的相关性。动物攻毒试验结果如表3所示。
表3 鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株(RA1(△AcOAT))动物攻毒试验
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110>广东省农业科学院兽医研究所
<120>鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株及其构建方法
<130>49
<160>3
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>319
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>左臂基因序列
<400>1
<210>2
<211>240
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>右臂基因序列
<400>2
<210>3
<211>559
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>鸭疫里默氏杆菌血清1型△AcOAT基因
<400>3
Claims (4)
1、一种鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)pDS132::ΔAcOAT自杀性质粒的构建
将自杀性质粒pDS-132与鸭疫里默氏杆菌血清1型基因△AcOAT分别进行Sal I单酶切胶回收后，并将酶切的自杀性质粒pDS132用CIAP去磷酸化后，用T4DNA连接酶连接，得到pDS132::ΔAcOAT自杀性质粒；
所述鸭疫里默氏杆菌血清1型基因△AcOAT由559个核苷酸组成，△AcOAT基因的核苷酸序列如下：
1 GCGGTAAATA AGTAACTATG CCAATTTTCG TTATTACCGT TACAATAAAA AATTAGACCT
61 GTTTCAATTG CCTGATCATG CAACAAGATT TCTTTAAGTA TCAAGCTCAA ACCACACCTT
121 TTGCCTCAGG TTTTGAAGCC GAAAGAGCAG AAGGAAACTA TATTTACGGA AAAGATGGCA
181 AAGCCTATCT AGACTTTGTA GCAGGAGTAT CTGCCAATAC TTTGGGACAT TCGCACCCAA
241 AAATCATCAA TGCAATTAAG GAACAGGCAG ATAAATACCT TCATATAAGG TCTATGGAGA
301 GTATGCACAA GAGAAACCTT AACATTAGGC GTATAAGTAA ATATTTGGGC GTGCCCCAAG
361 CCGAGGCTAT TCCCTAAGCT GATGGGTCGG TCTTCGGGCA GTCGCTCTTT TTTAGCCGAA
421 GCTCTCCAGT AGCTAAGCCC AGCTTTTCTC CACCTCCGAA AAAAAAGGAG CTCCAACAAT
481 GCCCTCCGCC CTCACGCAGT AAAGCTCTAA AAATCATAAG ATTTGGTCTT TAAGATTTGC
541 TAGAGTTTGT GTATATTTG；
(2)鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株的构建
将步骤(1)中构建的pDS132::ΔAcOAT自杀性质粒，通过电转化方法将pDS-132::△AcOAT转入鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株感受态细胞，氯霉素抗性平板筛选重组突变菌株即为鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株。
2、根据权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株的构建方法，其特征在于：所述鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株感受态细胞是按下述方法制备：(1)鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株在胰蛋白胨大豆琼脂固体培养基上划线并培养过夜；(2)将单个的菌落接种于3mL的胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基，37℃ 200rpm振荡培养4h；(3)将0.5mL振荡培养物接种于50mL的胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基，在37℃ 200rpm振荡培养，当OD600达到0.4时收获细胞；所述胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基预先37℃ 200rpm振荡0.5h；(4)将收获的细胞置于冰浴中15～30min，摇动，使内容物充分冷却；(5)将细胞转移至离心管中，4℃ 2600×g离心12min；(6)弃掉培养基，用80mL的10％甘油重悬菌体沉淀，4℃ 2800×g离心12min；(7)弃掉上清，用40mL的10％甘油重悬菌体沉淀，4℃ 2800×g离心12min；(8)弃掉上清，用1mL的10％甘油重悬菌体沉淀，即得到鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株感受态细胞；所述鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株的保藏号：CCTCC NO：M208070；保藏日期：2008年5月9日；保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
3、根据权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株的构建方法，其特征在于：所述通过电转化方法将pDS-132::△AcOAT转入鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株感受态细胞是按下述方法制备：(1)40μL鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株感受态细胞在冰上冷却；(2)将1μL的pDS132::ΔAcOAT自杀性质粒放入上述感受态细胞中，置于冰上1min；(3)将鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株感受态细胞与pDS132::ΔAcOAT自杀性质粒的混合物放进电转化仪；调节电转化仪使电脉冲为25μF，电压为2.5kV，电阻为200Ω；脉冲结束后，室温下在上述混合物中加入1mL的胰蛋白胨大豆肉汤培养基；(4)然后转移至于37℃摇床，200rpm震荡培养1h；(5)将震荡培养物培养涂布于胰蛋白胨大豆琼脂平板上，并置于37℃温箱培养过夜；所述胰蛋白胨大豆琼脂平板含终浓度为50μg/mL的氯霉素。
4、一种鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株，就是通过权利要求1所述的构建方法构建而成的。
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