CN106190903A - 鸭疫里氏杆菌Cas9基因缺失突变株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鸭疫里氏杆菌Cas9基因缺失突变株及其应用，属于动物基因工程疫苗制备技术领域。所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M 2016247。该菌株缺失了CRISPR‑Cas系统Cas9基因的2070bp，导致该菌株毒力显著下降，但仍保留良好的免疫原性。本发明所得的Cas9基因缺失株与传统灭活苗相比，其培养方法简单，生产成本低，可通过滴鼻或喷雾等方式接种，其操作简单快速，能激发机体产生有效的粘膜免疫，同时也能激发机体的系统免疫。

Description

鸭疫里氏杆菌Cas9基因缺失突变株及其应用

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，涉及动物分子生物学、微生物学、免疫学等相关领域。具体涉及鸭疫里氏杆菌Cas9基因缺失突变株及其应用。

背景技术

鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的一种急性、接触性、败血性传染病，该病主要发生在1-8周龄的鸭，尤其是2-3周龄的雏鸭最易感。本病以纤维素性心包炎，肝周炎，气囊炎和脑膜炎为特征，是目前危害养鸭业最为严重的细菌性传染病之一。患病鸭因死亡率高、生长迟缓、品质下降、饲料报酬率低和治疗费用增加等，给养鸭业造成了巨大经济损失。RA血清型众多，目前国外已报道有21个血清型，在国内还发现了4个新的血清型，从我省分离鉴定的RA菌株中只发现了血清1型。现今关于鸭疫里氏杆菌的毒力因子报道很少，除了外膜蛋白(OmpA)和二肽肽酶Ⅳ(DPPⅣ)被报道是RA的毒力因子，还有一些推测与毒力相关的因子。对RA的研究虽然取得了一些进展，但其分子致病机理仍然不清楚。因此，利用分子生物学手段，探究鸭疫里氏杆菌致病机理显得尤为重要，对从根本上防止该病的发生具有重要的现实意义。

目前，国内外对鸭疫里氏杆菌病的防治主要是通过药物和疫苗。药物防治采用多种抗生素类和磺胺类药物，但是，通过各地学者研究发现，从不同地区分离的鸭疫里氏杆菌菌株对相同药物的敏感性却并不一致。当前国内外对抗生素类药物的使用较为谨慎，大量使用药物治疗极易产生耐药性，因此使用药物治疗之前需要分离鸭疫里氏杆菌菌株，通过药敏试验来针对性选择较为敏感的药物进行防治，并且，当使用同一种药物时间较长之后，还需要重新通过试验分析其耐药性是否发生改变。疫苗防治主要采用灭活苗，由于鸭疫里氏杆菌血清型众多，各个血清型之间的交叉保护力较低，灭活苗需要选择当地流行的菌株制备才能起到较好的保护效果。但是，无论是药物还是灭活苗，都无法给我们提供一个简单快速，安全高效的方法防治鸭疫里氏杆菌病，因此世界各国学者都致力于鸭疫里氏杆菌基因工程疫苗的研究，力求获得一种更加安全、高效的新型疫苗。

基因工程疫苗是于20世纪80年代随着现代生物学技术的兴起，特别是DNA重组技术出现后而制备出的一类新型疫苗的总称。细菌基因工程疫苗是现代疫苗的发展方向之一。缺失与毒力相关基因及细菌复制非必需基因是当前研制活疫苗的主要途径之一，缺失毒力相关基因可以降低细菌的致病性，但仍保持其免疫原性，而且缺失的基因及其编码产物可作为一种用于区别免疫与自然感染动物的鉴别诊断标志。使用安全性高、毒力弱的基因工程活疫苗，其生产成本低，可以通过口服或鼻内途径免疫，能诱导局部粘膜免疫和系统性的细胞和体液免疫应答。随着对鸭疫里氏杆菌分子生物学及分子致病机理的深入研究，利用现代分子生物学技术手段与基因工程方法，通过对与代谢相关的因子的失活，构建低毒力的菌株，研制成鸭疫里氏杆菌基因工程弱毒活疫苗，对预防和控制鸭疫里氏杆菌病具有十分重要的意义。

目前国内外已有学者开始对鸭疫里氏杆菌作为弱毒活疫苗进行研究，但迄今为止还没有一个较为成熟的产品问世。此外细菌性活疫苗主要以肌肉和皮下注射方式进行免疫接种，目前尚未见到商业化的弱毒活细菌疫苗通过滴鼻途径进行免疫接种的报道。

迄今为止，尚未见有关鸭疫里氏杆菌CRISPR-Cas系统的研究报道，通过对鸭疫里氏杆菌的基因组进行生物信息学分析，发现在鸭疫里氏杆菌云梦株(RA-YM)中存在II-C型CRISPR-Cas系统，其标志基因为Cas9。因此，我们首先克隆Cas9基因上下游同源臂基因，构建重组自杀性质粒，利用接合转移方法构建Cas9基因缺失株，并对其遗传稳定性、生化特性、生长特性及对雏鸭的致病性和免疫保护效果进行了研究。利用自行构建的基因工程菌株，研制具有我国知识产权的基因工程载体并应用于生产，将是我国应对当今畜牧业所面临的挑战，提高竞争力的有力措施。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一株鸭疫里氏杆菌基因缺失突变菌株。该菌株毒力显著降低，对雏鸭的致病性显著降低，同时提高了其免疫原性，该菌株已于2016年5月5日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer)YMΔCas9，保藏编号：CCTCC NO:M 2016247，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供鸭疫里氏杆菌基因缺失突变菌株在制备鸭疫里氏杆菌病疫苗中的应用，利用该菌株制备的疫苗，经滴鼻免疫对雏鸭能提供良好的免疫保护。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

本发明的原理是基因的同源重组，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源序列发生重组，从而改变其遗传特性。本实验采用结合转移的方法将自杀性质粒导入鸭疫里氏杆菌中。结合转移是在质粒转移的过程中，供体菌和受体菌通过结合作用紧密接触，质粒从供体菌向受体菌转移，同时进行质粒复制。转移质粒带有tra基因，能完整的编码转移酶，质粒能从一个细胞到另一个细胞自主地转移，如果质粒不含tra基因，转移质粒中应该含有质粒转移起始位点oriT，虽然不能够自主转移，但是能被其他一些含有完整的tra基因的质粒诱导转移。

鸭疫里氏杆菌基因缺失突变菌株的获得：

以鸭疫里氏杆菌血清1型湖北云梦分离株(RA-YM)为出发菌株，对其进行生物信息学分析，发现在鸭疫里氏杆菌云梦株(RA-YM)中存在II-C型CRISPR-Cas系统，其标志基因为Cas9。因此，首先克隆Cas9基因上下游同源臂基因，构建重组自杀性质粒，利用接合转移方法构建Cas9基因缺失株，将筛选得到的Cas9基因缺失突变株在含有Spc的TSB培养基中盲传，用引物对每一代都进行鉴定。鉴定结果显示连续传了5代都没有扩增出已缺失的Cas9基因片段。这说明已筛选到的Cas9基因缺失突变株可以稳定传代。该菌株已于2016年5月5日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：鸭疫里氏杆菌(Riemerellaanatipestifer)YMΔCas9，保藏编号：CCTCC NO:M 2016247，地址：中国武汉武汉大学。

鸭疫里氏杆菌YMΔCas9与亲本株RA-YM的生化特性一致，二者的生长速度无显著性差异，在TSA培养基上的菌落形态相似。

鸭疫里氏杆菌YMΔCas9在制备鸭疫里氏杆菌病疫苗中的应用，包括利用该菌株作为唯一有效成分，或与其他有效成分制备成鸭疫里氏杆菌病弱毒疫苗，优选的该疫苗免疫接种途径为滴鼻免疫，即该疫苗的优选剂型为滴鼻制剂。

与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：

1.本发明所涉及到的CRISPR-Cas系统是当下研究的热点，CRISPR-Cas9系统作为一个基因编辑工具允许分子生物学家以空前的精确度对基因进行编辑，这一功能得到了众多学者的高度重视；本研究主要涉及CRISPR-Cas系统与细菌毒力之间的关系，不仅为探讨鸭疫里氏杆菌致病机理提供理论依据，还为研究CRISPR-Cas系统功能提供了新的方向。

2.本发明所得到的鸭疫里氏杆菌Cas9基因缺失突变株的毒力显著降低，与亲本株相比，Cas9基因缺失株的毒力下降了约317倍。但其免疫原性较好，通过粘膜免疫后进行攻毒，Cas9基因缺失株对雏鸭的免疫保护率达80％，其保护效果要稍优于传统灭活疫苗(77.7％)，但显著高于同剂量皮下注射组的免疫保护率(30％)。

3.本发明所得的Cas9基因缺失株与传统灭活苗相比，其培养方法简单，生产成本低，可通过滴鼻或喷雾等方式接种，其操作简单快速，能激发机体产生有效的粘膜免疫，同时也能激发机体的系统免疫。

4.本发明所用到的亲本菌株为鸭疫里氏杆菌云梦株，该菌株是从湖北云梦某养鸭场分离所得一种血清1型菌株，血清1型为我国目前流行较广的血清型，因此以该致病菌构建的Cas9基因缺失菌株RA-YMΔCas9进一步研制弱毒疫苗针对湖北地区乃至全国养鸭业均有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明的总体技术路线图。

图2为鸭疫里氏杆菌RA-YM CRISPR-Cas系统结构模式图。

图3为Overlap连接Cas9基因的左右同源臂及Spc基因的目的产物凝胶电泳图。

其中：图3中A：PCR扩增Cas9左右同源臂、Spc基因；泳道1：Cas9基因左侧同源臂；泳道2：Spc基因；泳道3：Cas9基因右侧同源臂；M：DL2000DNA Marker。

图3中B：重叠PCR连接L、S、R；泳道1：连接后的LSR片段；M：DL15000DNA Marker。图4为本发明中重组自杀性质粒的鉴定示意图。

其中图4中A：重组自杀性质粒pRE-LSR的PCR鉴定，泳道1：Spc基因的PCR产物，M：DL2000DNA Marker。

图4中B：重组自杀性质粒pRE-LSR的酶切鉴定，泳道1：用Kpn I和Sac I双酶切pRE112-LSR；M：DL15000DNA Marker。

图5为本发明中的鸭疫里氏杆菌Cas9基因缺失株的PCR鉴定示意图。

泳道1：RA-YM 16S rRNA；泳道2：Cas9基因突变株16S rRNA；泳道3：RA-YM Cas9基因；泳道4：Cas9基因突变株Cas9基因；泳道5：RA-YM Spc基因；泳道6：Cas9基因突变株Spc基因；M：DL15000DNA Marker。

图6为鸭疫里氏杆菌Cas9基因缺失株的生长特性示意图。

图7为鸭疫里氏杆菌Cas9基因缺失株对雏鸭的免疫程序示意图。

图8为鸭疫里氏杆菌Cas9基因缺失株免疫雏鸭后血清中IgG(IgY)抗体效价测定示意图。

其中图8中A：免疫后7d ELISA检测鸭血清中IgG(IgY)抗体效价；图8中B：免疫后14d ELISA检测鸭血清中IgG(IgY)抗体效价。

具体实施方式

以下结合具体实施步骤对本发明进行详细地说明。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料如未特备说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

鸭疫里氏杆菌基因缺失突变菌株的获得：

1.RA-YM Cas9基因左右同源臂的扩增克隆

根据NCBI中提供的RA-YM基因组序列，利用premier 5.0设计两对引物(所有引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成)扩增其可用于Overlap PCR的左右臂。在Leftarm的上游引物L1 5’-端加入Kpn I酶切位点，在Rightarm的下游引物R2 5’-端引入Sac I酶切位点。所述引物序列如下：

Leftarm L1：5’CTGGTACCTGTTTTTTAGCAACCTAACGGGAG 3’

Leftarm L2：5’GTTTTCGTTCCACTGCCTAAGTCTAATCCAAGTATGG 3’

引物L1/L2扩增上游同源臂987bp

Rightarm R1：5’GAAAATTTTGATGACGGCAAACCCGATGAAGTGCGT 3’

Rightarm R2：5’AGAGCTCTCTAAAGTTAGGCATTGGTGG 3’

引物R1/R2扩增下游同源臂987bp

将改良的TSA(即胰蛋白大豆琼脂培养基，购自Difco公司，以该培养基为基本成分，添加体积为10％的犊牛血清)称取4.0g，蒸馏水定容至100mL，121℃高压灭菌后冷却至50℃，倒于培养皿中。待冷却凝固后，将冻干的RA-YM接至固体培养基中过夜培养。次日挑取单菌落接种于改良TSB(即胰蛋白大豆培养基，购自Difco公司，以该培养基为基本成分，添加体积为10％的犊牛血清)培养基中，37℃200r/min培养5-6h。

取菌液为模板，扩增反应在50μL，反应体系如下：Hifi酶1μL，10×PCR Buffer 5μL，10mmol/L dNTPs 4μL，上游引物1μL，下游引物1μL，菌液2μL，GC enhancer 1μL，ddH₂O 35μL。

PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃30sec，58℃45sec，72℃1.5min，30个循环；72℃延伸10min；12℃保存。扩增条带经1％琼脂凝胶电泳分析，大小约为1000左右，与预期的目的片段987bp和987bp一致，将扩增产物回收纯化目的片段(图3中A)。

2.壮观霉素抗性基因(Spc)的扩增

选用壮观霉素作为筛选标记，参考pIC333质粒上的壮观霉素抗性基因序列，设计可用于Overlap PCR的引物扩增壮观霉素抗性基因(含启动子)。

Spc^R S1：5’ACCTAATCTGAATCCCAGTGGAACGAAAACTCACGTT 3’

Spc^R S2：5’TTCATCGGGTTTGCCCAGTAGTTTTAAAAGTAAGCACCTG 3’

以pIC333质粒为模板，扩增反应在50μL，反应体系如下：HiFi酶1μL，10×PCRBuffer 5μL，10mmol/L dNTPs 4μL，上游引物1μL，下游引物1μL，菌液2μL，GC enhancer 1μL，ddH₂O 35μL

PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃30sec，58℃45sec，72℃1.5min，30个循环；72℃延伸10min；12℃保存。扩增条带经1％琼脂凝胶电泳分析，大小约为1000bp左右，与预期的目的片段大小一致，将扩增产物回收纯化目的片段(图3中A)。

3.Overlap PCR

将纯化的Leftarm、Rightarm和Spc片段通过Overlap PCR连接，反应体系如下：HiFi酶0.5μL，10×PCR Buffer 2.5μL，10mmol/L dNTPs 2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，GC enhancer 1μL，模板各1μL，ddH₂O 14μL。

PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃30sec，58℃45sec，72℃3.5min，30个循环；72℃延伸10min；12℃保存。扩增条带经1％琼脂凝胶电泳分析，大小约为3000左右，与预期的目的片段3074bp一致，将扩增产物回收纯化目的片段(图3中B)。将纯化的PCR产物分别与克隆载体pMD18-T载体(购自宝公司工程(大连)有限公司)连接，得到目的片段的pT-LSR质粒。将酶切鉴定的阳性克隆送往北京擎科测序。

4.构建重组自杀性质粒pRE112-LSR

分别用Kpn I和Sac I将自杀性质粒pRE-112(购自Biovector NTCC Inc.)和已构建含有目的片段的pT-LSR质粒双酶切。目的片段回收，16℃水浴锅过夜连接，连接产物转化E.coli X7213(购自Biovector NTCC Inc.)。扩大培养阳性克隆，提取质粒，用Kpn I和SacI双酶切鉴定。双酶切电泳图显示有两条带，一条带大小约为3000bp，另一条带大小约为5000bp，与预期的3074bp目的片段和5760bp pRE112质粒相符(图4中B)。同时，Spc^R基因PCR鉴定也表明重组自杀性质粒pRE112-LSR已成功构建(图4中A)。

5.重组自杀性质粒转化E.coli X7213

将-80℃冰箱保存的E.coli X7213感受态细胞放置冰上15min让其融解，取连接后的重组质粒pRE112-LSR 10μL加入并混匀。冰浴30min后，42℃热激90s，立即转置冰浴2min。加入600μL无抗生素LB培养基，并同时加入1.2μL DAP(50μg/ml)，37℃180r/min振荡培养50min使其复苏。复苏后的菌液5000r/min离心3min，弃去约500μL上清，剩余的100μL重悬沉淀涂布于含氨苄(50μg/mL)抗性的LB琼脂平板。37℃正置30min，再将平板倒置37℃培养14h-16h至菌落出现。

6.RA-YMCas9基因缺失菌株的构建和鉴定

以含有待转化质粒的E.coli X7213菌株为供体菌，鸭疫里氏杆菌血清1型云梦株(RA-YM)为受体菌，采用接合转移的方法构建缺失株。供体菌和受体菌分别在适合的琼脂平板上培养过夜，受体菌接种于TSB培养基中，37℃200r/min振荡培养12h-16h。供体菌接种于含有适当抗生素的LB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养过夜。供体菌和受体菌分别复苏培养5h-6h，直至OD₆₀₀达到0.8左右。5000r/min离心3min，分别收集供体菌和受体菌。用1mL 10mmol/L的MgSO₄重悬，重复洗三次。各加入1mL 10mmol/L的MgSO₄重悬。各取100μL混合，将无菌硝酸纤维素膜贴于含DAP的TSA平板上，将混合菌液滴于滤膜上，37℃CO₂培养过夜。洗下滤膜上菌液，用新鲜的TSB培养基洗两遍，涂布含壮观霉素的TSA平板上37℃CO₂培养过夜。挑取单菌落接种到含壮观霉素的TSB培养基中，观察细菌克隆生长情况。

发生结合转移的阳性接合子表型为Spc^R，能够在在含Spc(50μg/mL)的TSA平板上生长，挑取抗性平板上的单菌落到含有Spc(50μg/mL)的TSB培养基中过夜培养。以Spc^R S1、Spc^R S2扩增壮观霉素抗性基因，得到1100bp左右的Spc^R基因片段，扩增结果显示Spc^R片段成功插入基因组中。以Cas9-1、Cas9-2为引物，以阳性结合子菌液为模版进行PCR扩增，以RA-YM株为对照，PCR电泳图显示16s rRNA在RA-YM和阳性结合子菌液中均能够扩增得到，而缺失的Cas9基因能在RA-YM株中扩增得到，在阳性结合子中不能扩增出来。此结果显示已经成功缺失了Cas9基因片段(图5)，该菌株缺失的部分Cas9基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

Cas9-1：5’GCGACTTGTTGATTAAACATCGGTTG 3’

Cas9-2：5’AGCTTGTGTTTCCCAAATTTGCTC 3’

7.RA-YM Cas9基因缺失菌株的生物学特性及鉴定

(1)RA-YM Cas9基因缺失菌株遗传稳定性分析：将筛选到的Cas9基因缺失株在含有Spc的TSB培养基中盲传，用引物Spc^R S1、Spc^R S2和Cas9-1、Cas9-2对每一代都进行鉴定。鉴定结果显示连续传5代都没有扩增出已缺失的Cas9基因片段。这说明筛选到的Cas9基因缺失株可以稳定的传代。

(2)RA-YM Cas9基因缺失菌株生长曲线的测定：将过夜培养的RA-YM Cas9基因缺失株与亲本株RA-YM以1:100的比例转接至10mL TSB培养基中，37℃200r/min振荡培养，每小时取出100μL测定其OD₆₀₀，所得数值绘制生长曲线(图6)，结果显示，经统计分析，Cas9基因缺失株生长速度与亲本株相比无显著性差异。

(3)RA-YM Cas9基因缺失菌株生化特性鉴定：将过夜培养的RA-YM Cas9基因缺失株与亲本株RA-YM以1:100的比例转接至5mL TSB培养基中，37℃200r/min振荡培养，待其OD₆₀₀达到0.8时将菌液接种到生化管中。检测鸭疫里氏杆菌RA-YM Cas9基因缺失株与亲本株RA-YM的对碳源和氮源的利用情况。结果显示，缺失株与野生株的生化特性一致。

表1 RA-YM Cas9基因缺失株与RA-YM株生化特性比较

-:阴性；+:阳性

该菌株已于2016年5月5日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer)YMΔCas9，保藏编号：CCTCC NO:M 2016247，地址：中国武汉武汉大学。在本发明实施例中，该基因缺失株或称为RA-YMΔCas9、RA-YM Cas9基因缺失菌株或ΔCas9。

实施例2：

RA-YMCas9基因缺失菌株的LD₅₀测定

将本发明的RA-YM Cas9基因缺失菌株和对照亲本株RA-YM在TSA改良培养基上培养，挑单菌落在TSB改良培养基中37℃培养过夜，然后将过夜培养的RA-YM Cas9基因缺失株与野生株RA-YM株以1:100的比例转接至TSB培养基中，37℃200r/min振荡培养，待其OD₆₀₀达到0.8时，收集细菌，用灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，调其OD₆₀₀到1.0，通过平板法计数。然后按10倍等距离的从10⁵-10⁹CFU稀释后分别通过脚蹼注射法接种12日龄雏鸭，对照组同样方法注射等量灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)。每只接0.5mL，一般接毒后24h内雏鸭发病，以接毒后7d为一个观察周期，全程观察记录发病情况，统计各组雏鸭的死亡情况，根据改良寇氏(Korbor)法计算鸭疫里氏杆菌对雏鸭的LD₅₀。计算公式如下：

改良寇氏法公式：LgLD₅₀＝Xk-i[ΣP-(3-Pm-Pn)/4]

在以上公式中，Xk为最高剂量对数，i为相邻剂量比值对数，ΣP为各组死亡率的组合，Pm为组内最高死亡率，Pn为组内最低死亡率。

结果如表2所示，本次试验亲本株RA-YM LD₅₀为1.58×10⁵CFU，RA-YMCas9基因缺失株(ΔCas9)LD₅₀为5.01×10⁷CFU。与亲本株相比，Cas9基因缺失株的毒力下降了约317倍。

表2 RA-YM Cas9基因缺失株与RA-YM株接种雏鸭死亡情况(死亡数/总数)

实施例3：

RA-YM Cas9基因缺失突变株转录组测序分析

将RA-YMΔCas9菌株和野生株RA-YM在TSA培养基上培养，挑单菌落在TSB培养基中37℃培养过夜，然后以1:100的比例转接至TSB培养基中，37℃200r/min振荡培养，待其OD₆₀₀达到0.8时，收集菌体，提取RNA，然后将浓度合格的RA-YMΔCas9和RA-YM菌株的RNA样品送往恒创基因科技有限公司进行转录组测序。

通过转录组测序对RA-YMΔCas9菌株与亲本株RA-YM的差异表达基因进行分析。结果显示二者表达差异在2倍或2倍以上的基因共500个，其中缺失株表达上调的基因有336个。进一步分析发现在缺失株中有1个表达上调的脂蛋白基因(RAYM_RS04770)，已有研究报道该上调表达的脂蛋白能增强多种细菌的免疫原性。

实施例4：

RA-YM Cas9基因缺失菌株免疫雏鸭的保护性试验

(1)免疫程序如图7所示，选择鸭疫里氏杆菌抗原，抗体阴性的7日龄雏鸭60只，随机分为6组，每组10只，免疫采用皮下注射和滴鼻两种方式；1-2组为基因缺失菌株皮下注射组(3.0×10⁵CFU/只，6.0×10⁴CFU/只)，3-4组为基因缺失菌株滴鼻组(3.0×10⁵CFU/只，6.0×10⁴CFU/只)，第5组为鸭疫里氏杆菌(血清1型)-大肠杆菌二联蜂胶灭活苗(华宏生物，兽药生字(2012)150102198)组，第6组为无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.2)对照组。

鸭疫里氏杆菌Cas9基因缺失菌株分别通过颈背部皮下注射(0.5mL/只)或滴鼻(0.1mL/只)免疫雏鸭，灭活苗组通过颈背部皮下注射0.5mL(每毫升疫苗中含灭活鸭大肠杆菌≧3.4×10⁹CFU，鸭疫里氏杆菌≧1×10¹⁰CFU)，PBS对照组通过颈背部皮下注射灭菌PBS(0.5mL/只)或滴鼻0.1mL(0.1mL/只)(各5只)。在免疫后7d、14d采血，用间接ELISA法检测雏鸭血清中抗鸭疫里氏杆菌的特异性IgG(IgY)的抗体水平。

(2)针对鸭疫里氏杆菌全菌的ELISA抗体水平检测，在免疫后7d、14d跖骨内侧静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法检测针对鸭疫里氏杆菌全菌的特异性IgG(IgY)抗体，PBS对照组均为阴性(图8)。

采用ELISA方法检测免疫鸭血清中IgG(IgY)抗体效价的结果如图8中A和图8中B所示：在免疫后7d，各组鸭血清中的抗体效价均达到了1:2⁷以上，其中接种菌量为3.0×10⁵CFU/只，经皮下注射方式免疫时，鸭血清中IgG(IgY)抗体效价达到了1:2^8.5(图8中A)，经统计分析，显著高于灭活苗组(效价为1:2^7.6)(P<0.05)，其他组与灭活苗相比无显著性差异；在免疫后14d，各组鸭血清中的抗体效价都达到了1:2⁸以上，其中接种菌量为3.0×10⁵CFU/只，经滴鼻途径免疫后，鸭血清中IgG(IgY)抗体效价达到了1:2^9.7(图8中B)，经统计分析，显著高于灭活苗组(效价为1:2^8.9)(P<0.05)，其它组与灭活苗相比差异不显著(P>0.05)。

(3)免疫雏鸭攻毒保护率试验，在各组免疫后14天，通过脚蹼注射4.2×10⁶CFU野生型鸭疫里氏杆菌YM株，攻毒后连续观察7d，观察临床症状并最后计算攻毒保护率。结果显示：在免疫菌量为3.0×10⁵CFU/只，经粘膜免疫后，Cas9基因缺失株对雏鸭免疫保护率达80％，略高于传统灭活疫苗(77.7％)，但显著高于同剂量皮下注射组的免疫保护率(30％)。

表3 RA-YM Cas9基因缺失株免疫雏鸭后攻毒保护力结果(存活数/总数)

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 鸭疫里氏杆菌Cas9基因缺失突变株及其应用

<130> 鸭疫里氏杆菌Cas9基因缺失突变株及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 2070

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaaccaactc tatcggttgg gcgttggtta aagaaacaga gaattcaaat gagaaatctg 60

aaattattaa gttaggcgtt cgtgtaaatc ctctaacggt ggatgaaaaa acaaattttg 120

aagcagggag acccttatcc accaatgccg atagaacagc taaaagaagt gcaagaagaa 180

atttacaacg ttataaactc agaagaaaaa atttaataga cttgttgatt aaacatcggt 240

tgattgataa agatacacca ctaaccgaaa ttggtaaaaa caccactcat caaacattag 300

agttaagagc caaggcagcg agagaacgaa tagaattaga agatttagcc cgtgtatttt 360

tagcgattaa caaaaagaga ggttacagaa gcagtagaaa agtaaataat gaagaagaag 420

gacaagtggt tgatggtatg gcagtagcca aaaagttgta tgacgaaaat ttaacaccag 480

ggcagtacgc ctatgaattg ctatcaaaag gtaaaaaata tgtgcctgat ttctaccgtt 540

cggatttgca agcggaattt gacagcattt gggaatatca aaagcagttt tatgcagata 600

tattagatga cgaattatat aatgccttaa aaggacaagg acaacaaaat agccgaaaaa 660

gatttcttgc cattaaaggg gtttatactg ccgaaaataa agggaaaaga gatgaagtaa 720

agctacaaca ttacaaatgg cgttccgagg ctattactca aaaactaagt atagaagaag 780

tagcgtatgt attagtagaa attaataatg acctcaataa atccagtggg tatttagggg 840

cgatttcaga tagaagcaag gaattgtatt ttaataaaga aaccgtaggt gaaaaccttt 900

ggaaacaaat acagaaaaat ccgcatactt cactaaagaa ccaagttttc tatcgtcaag 960

attatttaga tgaatttgag caaatttggg aaacacaagc tcaatttcac ccacaattaa 1020

cacttgcctt aaaggagcaa attcgtgatg tggtcatttt ttatcaacga aaattaaaat 1080

ctcaaaaagg cttattgagt ttctgccagt ttgaaagttg ggaaatagaa cgaaaagatg 1140

aaaatggcaa tgttattctc aataaaacta cccaactacc gaaaaggcag acggtaggta 1200

ggcgtgtcgc tcctaaatca tcacccttgt ttcaagagtt taaaatatgg cagaatatca 1260

ataatttaga gatagcaaaa attagcgatg ggaattcaaa aaacaaaaaa gaaacagagg 1320

ctttaagtga tgatgaacga aaattattgt ttgaagaatt aaaccttaga ggaaatctct 1380

cacaaaaaga ggtgttacaa attttaggtt taaaagataa agaatacaaa acgaattttc 1440

cagaaggttt ggaaggcaac cgaaccaatg ccgctttatt caatatctat cagcaaattg 1500

cagagaatga gggctatggt gattggacta aaaaatcagc tcaagagatt aaggaggaat 1560

taaaagcagt atttccacaa ataggtattc aggctgatat tttagacttt aatgcagagt 1620

tagacggaaa agaatttgaa aatcaagcct cttatcaatt gtggcatttg ttgtattctg 1680

ccgaggaaga tgataaaatc aacgaagaag accaaatcat ttacgggaac tctgcagtca 1740

gtttaaaaaa gaaactttgt gaaaaatttg gctttactcc cgaatatgcc aaatggatag 1800

cgaatgtatc cttacaagac gattacggaa atttatcaac caaagcgatg cgtaaaatca 1860

ttccgtatct tatagacgga aacgattatt cagaagcctg tgcattagca gggtataatc 1920

attctaatag tttgactaaa gaagaaaatg ataatagaga acgattgaat aaattagaac 1980

ttttacctaa aaacagttta cgcaatcctg tggtggaaaa aatacttaac caaatggtta 2040

atgtggttaa tcaagtgatt gaaacctatg 2070

Claims (5)

1.一种鸭疫里氏杆菌基因缺失突变株，所述的基因缺失株为鸭疫里氏杆菌RA-YM缺失SEQ ID NO.1所示序列得到。

2.根据权利要求1所述的基因缺失突变株，所述的基因缺失株为鸭疫里氏杆菌（Riemerella anatipestifer）YMΔCas9，保藏编号：CCTCC NO: M 2016247。

3.权利要求1所述的鸭疫里氏杆菌基因缺失株在制备鸭疫里氏杆菌病疫苗中的应用。

4.根据权利要求2所述的应用，所述的疫苗为活疫苗。

5.根据权利要求3所述的应用，所述的疫苗剂型为滴鼻制剂。