CN101871005A - 基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒及方法，该试剂盒根据鸭疫里默氏杆菌16S rRNA保守区的六个特异区域设计了两条特异性内引物和两条特异性外引物，可以特异地区分鸭疫里默氏杆菌与其它血清型沙门氏菌，从而保证了环介导等温扩增的高度特异性和检测结果的可靠性；本发明基于环介导等温扩增技术检测鸭疫里默氏杆菌，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，扩增产物直接用荧光染料显色即可凭肉眼判断结果，检测成本低，特别适合中小型单位和现场检测应用。

Description

基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种生物检测试剂盒及方法，特别涉及一种基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒及方法。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)是一种革兰氏阴性、无鞭毛、无芽孢的棒状杆菌。由其引起的鸭疫里默氏杆菌病是危害鸭、鹅、火鸡等家禽和野禽的一种接触性传染病，又名鸭传染性浆膜炎、新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合症和鸭疫巴氏杆菌病等。该病发病率和死亡率通常在10～30％，但有的鸭场感染鸭疫里默氏杆菌的病鸭死亡率高达75％。一旦某地区的鸭群、鹅群发生鸭疫里默氏杆菌感染，该病就会成为地方性疾病，很难彻底根除，并且经常反复爆发，带来巨大的经济损失。鸭疫里默氏杆菌感染以全身渗出性浆膜炎为主要病理特征，在病理学上很难与禽巴氏杆菌感染、大肠杆菌感染、链球菌感染和沙门氏菌感染进行区别。

目前，鸭疫里默氏杆菌的检测方法主要有分离培养鉴定法、聚合酶链式反应(PCR)法和荧光定量PCR(FQ-PCR)法，但分离培养鉴定法操作繁琐、费时，PCR法和FQ-PCR法需要昂贵的仪器和试剂，检测成本高，不适合中小型单位和现场检测应用。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术与其它核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，成本低，已在病原微生物检测领域显示出广阔的发展前景。但至今尚未见基于环介导等温扩增技术专门检测鸭疫里默氏杆菌的报道。

发明内容

有鉴于此，为克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒；目的之二在于提供一种使用所述基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌的方法；灵敏度高，特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合中小型单位和现场检测应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒，含有以下5组特异性引物中的任意1组：

①上游内引物FIP：5’-caggcttccacccattgtccaa-tgagacacggaccagactc-3’；

下游内引物BIP：5’-cgtgaaggacgacggccctat-ctaccctcacgagagtaggt-3’；

上游外引物F3：5’-tttagggggcctgagagg-3’；

下游外引物B3：5’-ccggtgcttattcgtacagt-3’；

②上游内引物FIP：5’-tattcctcactgctgcctcccg-gtgatcccccacactggt-3’；

下游内引物BIP：5’-cgtgaaggacgacggccctat-ctaccctcacgagagtaggt-3’；

上游外引物F3：5’-tttagggggcctgagagg-3’；

下游外引物B3：5’-ccggtgcttattcgtacagt-3’；

③上游内引物FIP：5’-caggcttccacccattgtccaa-acactggtactgagacacgg-3’；

下游内引物BIP：5’-cgtgaaggacgacggccctat-ctaccctcacgagagtaggt-3’；

上游外引物F3：5’-tttagggggcctgagagg-3’；

下游外引物B3：5’-ccggtgcttattcgtacagt-3’；

④上游内引物FIP：5’-cgctttcgtccctcagcgtc-tactcagaacaccgattgcg-3’；

下游内引物BIP：5’-agataccctggtagtccacgcc-tcgcttagtctctgaaccct-3’；

上游外引物F3：5’-agtgtagcggtgaaatgca-3’；

下游外引物B3：5’-actccccaggtggctaac-3’；

⑤上游内引物FIP：5’-caacccatagggccgtcgtc-ttggacaatgggtggaagc-3’；

下游内引物BIP：5’-tctcgtgagggtagctgaaggt-accctccgtattaccgcg-3’；

上游外引物F3：5’-ggaggcagcagtgaggaa-3’；

下游外引物B3：5’-gcggaccctttaaacccaat-3’。

进一步，还含有以下试剂中的一种或多种：嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst)DNA聚合酶、10×热聚合反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物(dNTPs)、硫酸镁、甜菜碱和荧光染料赛博绿I(SYBR Green I)；所述10×热聚合反应缓冲液由浓度为250mmol/L、pH为8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、浓度为100mmol/L的氯化钾、浓度为100mmol/L的硫酸铵、浓度为20mmol/L的硫酸镁和质量分数为1％的曲拉通(Triton)X-100组成；所述dNTPs由三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)组成。上述试剂均为常规试剂，可直接从商业渠道购得，通常在相关实验室中为常备试剂，故本发明试剂盒中可以不放入上述试剂，或仅放入上述试剂中的一种或几种，当然也可全部放入，提供多种选择以方便使用者购买。

2、使用所述基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌的方法，包括以下步骤：

a、提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA，控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.6～2.0，浓度为10～100ng/μl；

b、鸭疫里默氏杆菌的环介导等温扩增：在反应管中配制总体积为25μl的环介导等温扩增反应体系，由以下组分组成：浓度各为0.2μmol/L的上游内引物FIP和下游内引物BIP，浓度各为0.8μmol/L的上游外引物F3和下游外引物B3，8U嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶，1×热聚合反应缓冲液，浓度各为1mmol/L的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸，浓度为3mmol/L的硫酸镁，浓度为1mol/L的甜菜碱，待检模板DNA水溶液1μl，余量为水；将反应管于60～65℃水浴中保温反应45～90分钟，再于80～95℃水浴中保温3～5分钟终止反应；

c、显色检测：在反应管中加入质量分数为10％的荧光染料赛博绿I水溶液1μl，用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品中不含有鸭疫里默氏杆菌；如果颜色变为绿色，说明待检样品中含有鸭疫里默氏杆菌。

本发明的有益效果在于：本发明建立了基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒及方法，该试剂盒根据鸭疫里默氏杆菌16S rRNA(GenbankAccession No.EU376364)保守区的六个特异区域设计了两条特异性内引物和两条特异性外引物，从而保证了检测结果的可靠性；本发明基于环介导等温扩增技术检测鸭疫里默氏杆菌，由四条引物对靶序列的六个特异区域进行识别，特异性强；在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间损失，耗时短，在1小时内即可将靶序列扩增至10⁹倍，而且受非靶序列的影响小，与PCR法相比灵敏度更高，检测限仅为几个拷贝；此外，该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂，扩增产物不需要进行凝胶电泳，直接用荧光染料显色即可凭肉眼判断结果，操作简便快速，检测成本低。本发明的试剂盒及方法特别适合中小型单位和现场检测应用。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

1、基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒，由以下试剂组成：

a、浓度各为5μmol/L的上游内引物FIP水溶液和下游内引物BIP水溶液，浓度各为20μmol/L的上游外引物F3水溶液和下游外引物B3水溶液：引物序列如下：

上游内引物FIP：5’-caggcttccacccattgtccaa-tgagacacggaccagactc-3’；

下游内引物BIP：5’-cgtgaaggacgacggccctat-ctaccctcacgagagtaggt-3’；

上游外引物F3：5’-tttagggggcctgagagg-3’；

下游外引物B3：5’-ccggtgcttattcgtacagt-3’；

b、浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶水溶液；

c、10×热聚合反应缓冲液：由浓度为250mmol/L、pH为8.8的Tris-HCl、浓度为100mmol/L的氯化钾、浓度为100mmol/L的硫酸铵、浓度为20mmol/L的硫酸镁和质量分数为1％的Triton X-100组成；

d、浓度为10mmol/L的dNTPs水溶液：由浓度各为10mmol/L的dATP、dGTP、dCTP和dTTP组成；

e、浓度为100mmol/L的硫酸镁水溶液；

f、浓度为2mol/L的甜菜碱水溶液；

g、质量分数为10％的荧光染料SYBR Green I水溶液。

2、使用所述基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌的方法，包括以下步骤：

a、提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA：本实施例同时设置实验组和空白对照组，其中实验组为鸭疫里默氏杆菌，来源于四川农业大学禽病研究中心；采用DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取各组细菌DNA，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.8，浓度为20ng/μl。

b、鸭疫里默氏杆菌的环介导等温扩增：在反应管中配制总体积为25μl的环介导等温扩增反应体系：加入浓度均为5μmol/L的上游内引物FIP水溶液和下游内引物BIP水溶液各1μl，浓度均为20μmol/L的上游外引物F3水溶液和下游外引物B3水溶液各1μl，浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶水溶液1μl，10×热聚合反应缓冲液2.5μl，浓度为10mmol/L的dNTPs水溶液2.5μl，浓度为100mmol/L的硫酸镁水溶液0.75μl，浓度为2mol/L的甜菜碱水溶液12.5μl，用无DNA酶的水稀释至24μl，再加入模板DNA水溶液1μl，混合均匀，即得；将反应管于60～65℃水浴中保温反应60分钟，再于80℃水浴中保温5分钟终止反应；

c、显色检测：在反应管中加入质量分数为10％的荧光染料赛博绿I水溶液1μl，振摇均匀，用肉眼观察颜色变化。

结果：空白对照组的颜色为黄色，说明不含有鸭疫里默氏杆菌；实验组的颜色变为绿色，说明含有鸭疫里默氏杆菌，与预期结果一致。

实施例2

1、基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒，与实施例1所述试剂盒的不同之处在于特异性引物序列不同，本试剂盒的引物序列如下：

上游内引物FIP：5’-tattcctcactgctgcctcccg-gtgatcccccacactggt-3’；

下游内引物BIP：5’-cgtgaaggacgacggccctat-ctaccctcacgagagtaggt-3’；

上游外引物F3：5’-tttagggggcctgagagg-3’；

下游外引物B3：5’-ccggtgcttattcgtacagt-3’。

2、使用所述基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌的方法，与实施例1所述方法相同，结果发现：空白对照组的颜色为黄色，说明不含有鸭疫里默氏杆菌；实验组的颜色变为绿色，说明含有鸭疫里默氏杆菌，与预期结果一致。

实施例3

1、基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒，与实施例1所述试剂盒的不同之处在于特异性引物序列不同，本试剂盒的引物序列如下：

上游内引物FIP：5’-caggcttccacccattgtccaa-acactggtactgagacacgg-3’；

下游内引物BIP：5’-cgtgaaggacgacggccctat-ctaccctcacgagagtaggt-3’；

上游外引物F3：5’-tttagggggcctgagagg-3’；

下游外引物B3：5’-ccggtgcttattcgtacagt-3’。

2、使用所述基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌的方法，与实施例1所述方法相同，结果发现：空白对照组的颜色为黄色，说明不含有鸭疫里默氏杆菌；实验组的颜色变为绿色，说明含有鸭疫里默氏杆菌，与预期结果一致。

实施例4

1、基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒，与实施例1所述试剂盒的不同之处在于特异性引物序列不同，本试剂盒的引物序列如下：

上游内引物FIP：5’-cgctttcgtccctcagcgtc-tactcagaacaccgattgcg-3’；

下游内引物BIP：5’-agataccctggtagtccacgcc-tcgcttagtctctgaaccct-3’；

上游外引物F3：5’-agtgtagcggtgaaatgca-3’；

下游外引物B3：5’-actccccaggtggctaac-3’。

2、使用所述基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌的方法，与实施例1所述方法相同，结果发现：空白对照组的颜色为黄色，说明不含有鸭疫里默氏杆菌；实验组的颜色变为绿色，说明含有鸭疫里默氏杆菌，与预期结果一致。

实施例5

1、基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒，与实施例1所述试剂盒的不同之处在于特异性引物序列不同，本试剂盒的引物序列如下：

上游内引物FIP：5’-caacccatagggccgtcgtc-ttggacaatgggtggaagc-3’；

下游内引物BIP：5’-tctcgtgagggtagctgaaggt-accctccgtattaccgcg-3’；

上游外引物F3：5’-ggaggcagcagtgaggaa-3’；

下游外引物B3：5’-gcggaccctttaaacccaat-3’。

2、使用所述基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌的方法，与实施例1所述方法相同，结果发现：空白对照组的颜色为黄色，说明不含有鸭疫里默氏杆菌；实验组的颜色变为绿色，说明含有鸭疫里默氏杆菌，与预期结果一致。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>重庆市畜牧科学院、四川农业大学

<120>基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒及方法

<160>20

<210>1

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第①组上游内引物FIP

<400>1

caggcttcca cccattgtcc aatgagacac ggaccagact c              41

<210>2

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第①组下游内引物BIP

<400>2

cgtgaaggac gacggcccta tctaccctca cgagagtagg t              41

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第①组上游外引物F3

<400>3

tttagggggc ctgagagg                                        18

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第①组下游外引物B3

<400>4

ccggtgctta ttcgtacagt                              20

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第②组上游内引物FIP

<400>5

tattcctcac tgctgcctcc cggtgatccc ccacactggt        40

<210>6

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第②组下游内引物BIP

<400>6

cgtgaaggac gacggcccta tctaccctca cgagagtagg t      41

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第②组上游外引物F3

<400>7

tttagggggc ctgagagg                                18

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第②组下游外引物B3

<400>8

ccggtgctta ttcgtacagt                             20

<210>9

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第③组上游内引物FIP

<400>9

caggcttcca cccattgtcc aaacactggt actgagacac gg       42

<210>10

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第③组下游内引物BIP

<400>10

cgtgaaggac gacggcccta tctaccctca cgagagtagg t       41

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第③组上游外引物F3

<400>11

tttagggggc ctgagagg                                  18

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第③组下游外引物B3

<400>12

ccggtgctta ttcgtacagt                               20

<210>13

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第④组上游内引物FIP

<400>13

cgctttcgtc cctcagcg tctactcagaac accgattgcg            40

<210>14

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第④组下游内引物BIP

<400>14

agataccctg gtagtccacg cctcgcttag tctctgaacc ct        42

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第④组上游外引物F3

<400>15

agtgtagcgg tgaaatgca                                  19

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第④组下游外引物B3

<400>16

actccccagg tggctaac                                   18

<210>17

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第⑤组上游内引物FIP

<400>17

caacccatag ggccgtcgtc ttggacaatg ggtggaagc    39

<210>18

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第⑤组下游内引物BIP

<400>18

tctcgtgagg gtagctgaag gtaccctccg tattaccgcg    40

<210>19

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第⑤组上游外引物F3

<400>19

ggaggcagca gtgaggaa                            18

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>第⑤组下游外引物B3

<400>20

gcgg8ccctt taaacccaat                         20

Claims (3)

1.基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒，其特征在于：含有以下5组特异性引物中的任意1组：

①上游内引物FIP：5’-caggcttccacccattgtccaa-tgagacacggaccagactc-3’；

  下游内引物BIP：5’-cgtgaaggacgacggccctat-ctaccctcacgagagtaggt-3’；

  上游外引物F3：5’-tttagggggcctgagagg-3’；

  下游外引物B3：5’-ccggtgcttattcgtacagt-3’；

②上游内引物FIP：5’-tattcctcactgctgcctcccg-gtgatcccccacactggt-3’；

  下游内引物BIP：5’-cgtgaaggacgacggccctat-ctaccctcacgagagtaggt-3’；

  上游外引物F3：5’-tttagggggcctgagagg-3’；

  下游外引物B3：5’-ccggtgcttattcgtacagt-3’；

③上游内引物FIP：5’-caggcttccacccattgtccaa-acactggtactgagacacgg-3’；

  下游内引物BIP：5’-cgtgaaggacgacggccctat-ctaccctcacgagagtaggt-3’；

  上游外引物F3：5’-tttagggggcctgagagg-3’；

  下游外引物B3：5’-ccggtgcttattcgtacagt-3’；

④上游内引物FIP：5’-cgctttcgtccctcagcgtc-tactcagaacaccgattgcg-3’；

  下游内引物BIP：5’-agataccctggtagtccacgcc-tcgctta，ctctgaaccct-3’；

  上游外引物F3：5’-agtgtagcggtgaaatgca-3’；

  下游外引物B3：5’-actccccaggtggctaac-3’；

⑤上游内引物FIP：5’-caacccatagggccgtcgtc-ttggacaatgggtggaagc-3’；

  下游内引物BIP：5’-tctcgtgagggtagctgaaggt-accctccgtattaccgcg-3’；

  上游外引物F3：5’-ggaggcagcagtgaggaa-3’；

  下游外引物B3：5’-gcggaccctttaaacccaat-3’。

2.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒，其特征在于：还含有以下试剂中的一种或多种：嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶、10×热聚合反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物、硫酸镁、甜菜碱和荧光染料赛博绿I；所述10×热聚合反应缓冲液由浓度为250 mmol/L、pH为8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、浓度为100 mmol/L的氯化钾、浓度为100mmol/L的硫酸铵、浓度为20 mmol/L的硫酸镁和质量分数为1％的曲拉通X-100组成；所述三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物由三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸组成。

3.使用权利要求1所述的基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA，控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.6～2.0，浓度为10～100 ng/μl；

b、鸭疫里默氏杆菌的环介导等温扩增：在反应管中配制总体积为25μl的环介导等温扩增反应体系，由以下组分组成：浓度各为0.2 μmol/L的上游内引物FIP和下游内引物BIP，浓度各为0.8 μmol/L的上游外引物F3和下游外引物B3，8 U嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶，1×热聚合反应缓冲液，浓度各为1 mmol/L的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸，浓度为3 mmol/L的硫酸镁，浓度为1 mol/L的甜菜碱，待检模板DNA水溶液1μl，余量为水；将反应管于60～65℃水浴中保温反应45～90分钟，再于80～95℃水浴中保温3～5分钟终止反应；

c、显色检测：在反应管中加入质量分数为10％的荧光染料赛博绿I水溶液1μl，用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品中不含有鸭疫里默氏杆菌；如果颜色变为绿色，说明待检样品中含有鸭疫里默氏杆菌。