CN105316397A

CN105316397A - 牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量pcr的检测引物、探针及检测方法

Info

Publication number: CN105316397A
Application number: CN201410364435.4A
Authority: CN
Inventors: 康康; 苟德明; 钟嘉胜; 翟建新
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-07-28
Filing date: 2014-07-28
Publication date: 2016-02-10

Abstract

本发明公开了一种牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量PCR的检测引物、探针及检测方法，所述检测方法是将牛乳样本直接加至包括检测引物和探针的荧光定量PCR反应体系中进行PCR，结束后检测是否含有沙门氏菌。本发明方法实现了在一个PCR管中连续、自动进行细菌DNA的释放和荧光定量PCR检测；从得到牛乳样本到获得检测结果只需要1个小时；灵敏性、准确性可与传统PCR相媲美；克服了传统PCR需要提取DNA这一繁琐步骤的不足，减少操作步骤，提高检测速度，节省成本，有效避免交叉污染，能进行沙门氏菌的野外现场高通量检测，对快速发现牛乳中沙门氏菌疫情，及时制定防控措施具有重要的意义。

Description

牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量PCR的检测引物、探针及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量PCR的检测引物、探针及检测方法。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)是对人类和动物健康构成严重危害的一类致病菌，也是引起人类食物中毒最常见的病原菌。2012年卫生部发布最新食品安全标准规定，沙门氏菌在各类食品中的限量值均为0，即任何食品中都不得检出沙门氏菌。

据统计，在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，中国内陆地区也以沙门氏菌为首位。沙门氏菌广泛存在于自然界，对外界环境有一定的抵抗力，在水、牛奶、肉类和蛋类制品中可存活数周至数月，在粪便中可存活1～10个月。

关于沙门氏菌的检测方法，我国现行的国家和行业标准，从样本的制备、前增菌、增菌、选择性分离培养和生化鉴定等，需要4～7天才能完成。相比之下，酶联免疫吸附(ELISA)免疫学方法具有快速、简单等特点，但该类方法在灵敏性和特异性方面仍存在一定不足。聚合酶链式反应(PCR)技术由于灵敏性和特异性较高，已经成为沙门氏菌检测常用方法。常规PCR需要进行后续电泳鉴定，易发生交叉污染而产生假阳性，且操作耗时较长；相比之下，荧光定量PCR技术(real-timePCR)具有更高的灵敏性，且无需PCR后续处理，能有效避免交叉污染并提高检测效率。

然而，目前基于PCR检测沙门氏菌的方法都要进行细菌DNA提取，然后以DNA为模板进行检测；这一提取步骤无疑大大增加了检测工作量、时间和成本，也难以实现野外现场及高通量检测；牛乳易受细菌感染而变质，现有检测沙门氏菌的PCR方法，因为费时太长而不适于进行牛乳中沙门氏菌的检测。

因此，现有的基于PCR检测牛乳中沙门氏菌的方法还有待于改进和发展。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的沙门氏菌的检测方法，以及该检测方法所使用的引物和探针。本发明的方法是一种无需提取细菌DNA就能直接检测牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量PCR方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量PCR的检测引物，所述检测引物如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示。

一种牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量PCR的检测探针，所述检测探针如SEQIDNo:3所示。

一种牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量PCR的检测方法，使用上述检测引物和检测探针进行检测，包括以下步骤：

将牛乳样本直接加至荧光定量PCR反应体系中，进行荧光定量PCR；其中，所述荧光定量PCR反应体系为：

所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃反应2min；95℃变性5s，60±1℃退火/延伸40s，反应35～45个循环。

在其中一个实施例中，所述PCR反应体系为：

在其中一个实施例中，所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃反应2min；94℃变性5s，60℃退火/延伸40s，反应40个循环。

本发明提供了一种无需提取细菌DNA就能直接检测牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量PCR方法。该直接荧光定量PCR技术由于具有以下几点特别之处而实现了无需从牛乳中提取细菌DNA的目的，从而有效克服了传统PCR技术需要提取DNA而带来的耗时较长、操作繁琐、提取困难、交叉感染等诸多难题：

1、本发明使用了一种高耐受性DNA聚合酶(AlphaTaq)

在原始生物样本中，往往含有大量抑制PCR的物质，比如牛奶中含有较多乳铁蛋白，全血(或血清、血浆)中含有大量免疫球蛋白、血红蛋白、亚铁血红素，土壤中含有较多腐殖酸等。这些物质会强烈抑制DNA聚合酶的活性，使PCR失效，这是传统PCR技术必须提取细菌DNA的重要原因。本发明直接荧光定量PCR方法使用高耐受DNA聚合酶(AlphaTaq)，该酶通过基因工程手段对DNA聚合酶的编码序列进行改造，将第708位的谷氨酸突变为赖氨酸(E708K)或谷氨酰胺(E708Q)，使得突变酶能够耐受高达2.6～5.2mM乳铁蛋白或20％的全血、0.2～0.4μg/ml腐殖酸等。

2、本发明使用了一种PCR增强剂(PCRenhancer,PEC)

该PCR增强剂由肉碱(L-carnitine)、海藻糖(D-(+)-trehalose)、非离子去污剂NP-40组成，既能提高含较高GC含量基因的扩增效率，又能增加反应体系对PCR抑制物质的耐受性。此外，某些抑制物质(如血红蛋白)会造成荧光定量PCR的荧光淬灭，这是传统PCR技术必须提取细菌DNA进行检测的另一重要原因。而PCR增强剂，能够有效降低抑制物质的荧光淬灭效应。因此，本发明的直接荧光定量PCR方法能使用染料法或探针法，进行细菌DNA的实时荧光定量PCR检测。

此外，要成功实现直接荧光定量PCR，细菌DNA的有效释放是又一重要影响因素。本发明发明人经过大量摸索，发现在95℃反应2min，可实现细菌DNA的有效释放。PCR增强剂中含有非离子去污剂NP-40，这有助于裂解细菌细胞壁来释放DNA。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明中的检测引物和探针，适用于沙门氏菌的直接荧光定量PCR检测，灵敏度高，特异性强；

2、本发明的检测方法直接将牛乳加入反应体系，在一个PCR管中连续、自动实现细菌DNA的释放和荧光定量PCR检测；实现了无需提取细菌DNA、直接从牛乳中检测沙门氏菌的目的，从得到牛乳样本到获得检测结果只需要1个小时；有效克服了传统PCR需要提取DNA的不足，能大大减少操作步骤，大幅度提高检测速度，节省成本，有效避免交叉污染，并能实现牛乳样本的野外现场检测；

3、本发明的检测方法的灵敏性不低于传统PCR；对于难以提取DNA的痕量样本的检测效果也很好；

4、本发明的检测方法能进行沙门氏菌的高通量检测，对于快速发现牛乳中沙门氏菌感染疫情，及时制定防控措施具有重要而深远的意义。

附图说明

图1为直接荧光定量PCR与传统荧光定量PCR方法的比较图。其中，从左至右的扩增曲线分别为扩增曲线1-4，扩增曲线1为2×10⁸cfu/ml浓度样品直接荧光定量PCR的扩增曲线，扩增曲线2为2×10⁸cfu/ml浓度样品传统荧光定量PCR的扩增曲线、扩增曲线3为2×10⁴cfu/ml浓度样品直接荧光定量PCR的扩增曲线，扩增曲线4为2×10⁴cfu/ml浓度样品传统荧光定量PCR的扩增曲线。

图2为本发明实施例2中用直接荧光定量PCR对牛乳中沙门氏菌检测灵敏度的分析图。图2A为不同浓度沙门氏菌的直接荧光定量PCR扩增曲线，从左至右的扩增曲线分别为扩增曲线1-11，扩增曲线1-11分别为表1中管号1-11样品的直接荧光定量PCR扩增曲线；图2B为沙门氏菌浓度与扩增循环数(Ct值)之间的相关系数。

图3为本发明实施例3中用直接荧光定量PCR对牛乳中沙门氏菌检测稳定性的分析图。

图4为本发明实施例4中使用的直接荧光定量PCR对牛乳浓度耐受性的分析图。图4A为不同牛乳浓度反应体系的浑浊程度图；图4B为不同牛乳浓度下直接荧光定量PCR检测沙门氏菌的Ct值。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，以下结合附图和具体实施例来作进一步详细说明。本发明中所述的直接荧光定量PCR方法是指无需提取细菌DNA就能直接检测的荧光定量PCR方法。

以下实施例中涉及的实验材料如下：

1.沙门氏菌纯菌(ATCC13312)，含沙门氏菌的牛乳，沙门氏菌阴性牛乳。

2.试剂：AlphaTaq(VitaNaviTechnology)，PEC(VitaNaviTechnology)。

3.仪器：荧光定量PCR仪(StepOnePlus,ABI)，冷冻离心机(5804R,Eppendorf)，核酸电泳仪(EPS-100,上海天能)，凝胶成像系统(Dolphin-Doc,WEALTEC)。

如无特殊说明，以下实施例中所采用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操作。

实施例1沙门氏菌的直接荧光定量PCR检测方法

1、特异引物和探针的设计

根据沙门氏菌型分泌系统蛋白INvA的序列来设计，如下：

上游引物(Sa-F)的序列为：

5’-GTCAATGTAGAACGACCCCAT-3’(SEQIDNo:1)，

下游引物(Sa-R)的序列为：

5’-TCATTTCTATGTTCGTCATTCCAT-3’(SEQIDNo:2)，

Taqman探针(Sa-pro)的序列为：5’-FAM-

TCGCCAGTACGATATTCAGTGCGATCAG-BHQ1-3’(SEQIDNo:3)。

2、直接荧光定量PCR反应体系的摸索

在25μl反应体系中包含10×Reactionbuffer(VitaNaviTechnology),AlphaTaq(VitaNaviTechnology)，上游引物(Sa-F，SEQIDNo:1)，下游引物(Sa-R，SEQIDNo:2)，Taqman探针(Sa-pro，SEQIDNo:3)，PEC，适量的牛乳样本。其中，10×Reactionbuffer包含dNTP、Mg²⁺等，AlphaTaq为高耐受性TaqDNA聚合酶。对一系列参数进行摸索，包括引物浓度(0.2～0.4μM)、探针浓度(0.2～0.4μM)，Taq酶用量(0.15～0.35μl/25μl)，PEC(10.5～14.5μl/25μl)；每种样本各3个重复。

经过摸索，确定了直接荧光定量PCR的反应体系。在25μl反应体系中包含2.5μl10×Reactionbuffer(VitaNaviTechnology),0.25±0.1μlAlphaTaq(VitaNaviTechnology)，0.3±0.1μM上游引物(Sa-F，SEQIDNo:1)，0.3±0.1μM下游引物(Sa-R，SEQIDNo:2)，0.2±0.1μMTaqman探针(Sa-pro，SEQIDNo:3)，1.25～5μl牛乳，PEC(10.5～14.5μl/25μl)，其余为去离子水。

最优的直接荧光定量PCR反应体系为：2.5μl10×Reactionbuffer(VitaNaviTechnology),0.25μlAlphaTaq(VitaNaviTechnology)，0.3μM上游引物(Sa-F，SEQIDNo:1)，0.3μM下游引物(Sa-R，SEQIDNo:2)，0.2μMTaqman探针(SEQIDNo:3)，12.5μlPEC，1.25～5μl牛乳，其余为去离子水。

3、直接荧光定量PCR反应条件的摸索

将步骤2中筛选出最优反应体系的反应管放入荧光定量PCR仪中，对系列反应条件进行摸索，包括：

(1)细菌DNA释放温度(94～96℃)

(2)退火/延伸温度(60～65℃)、退火/延伸时间(30～120s)、PCR循环数(35～45)。

在PCR过程中，在每个循环的退火/延伸阶段收集荧光信号。

经过摸索，确定了直接荧光定量PCR的反应程序：55±1℃反应30min，94～96℃反应2min；94℃变性5s，60±1℃退火/延伸40s，反应35～45个循环。最优的荧光定量直接荧光定量PCR反应条件为：95℃反应2min；94℃变性5s，60℃退火/延伸40s，反应40个循环；在每个循环的退火/延伸阶段收集荧光信号。

4、结果判定

采用步骤2的最优反应体系，步骤3的最优反应条件对牛乳样本进行直接荧光定量PCR。反应结束后检测PCR产物中是否含有沙门氏菌。从荧光定量PCR上获取各反应管的扩增曲线和Ct值。正常的检测结果应为：阴性对照无检测信号，阳性对照有检测信号，且Ct平均值<35。若待检测样本的Ct值平均值>35，重做实验。

取两种浓度(2×10⁸cfu/ml，2×10⁴cfu/ml)沙门氏菌的牛乳样本分别进行直接荧光定量PCR与传统荧光定量PCR，40个循环反应后比较Ct值。如图1所示，在两种浓度下，直接荧光定量PCR的Ct值均小于传统荧光定量PCR组。因此，在沙门氏菌的检测上直接荧光定量PCR的灵敏度显著高于传统荧光定量PCR。

采用本实施例的直接荧光定量PCR方法实现了不提取细菌DNA，直接用牛乳即可检测沙门氏菌。利用本发明的直接荧光定量PCR方法检测沙门氏菌，从得到感染的牛乳样本到获得检测结果只需要1个小时。

实施例2实施例1的检测方法的灵敏度测试

按表1用无菌水将沙门氏菌纯菌进行梯度稀释，随后取5ul样本与2.5μl沙门氏菌阴性牛乳混合以模拟实际样本，然后用实施例1优化的直接荧光定量PCR方法进行沙门氏菌的检测，反应40个循环，记录Ct值，Ct值≤35视为阳性，探究本方法在沙门氏菌检测中的灵敏度。

结果表明，随着菌液浓度的逐步降低，相应Ct值也不断增大，在2.38×10⁴～2.5×10¹⁰cfu/ml浓度之间本方法都有明显扩增信号(图2A)；且沙门氏菌浓度与扩增曲线Ct值之间存在良好的线性关系(R²＝0.998，图2B)。

表1沙门氏菌的稀释方法

实施例3实施例1的检测方法的稳定性测试

从实施例2的实验结果中选出高、中、低三个浓度(6.25×10⁹cfu/ml、3.91×10⁸cfu/ml、2.44×10⁷cfu/ml)的沙门氏菌，每个浓度的沙门氏菌菌液与阴性牛乳混合，用直接荧光定量PCR进行检测，八次重复，计算平均值及标准差，探讨沙门氏菌直接荧光定量PCR方法的稳定性。

如图3所示，三种不同浓度菌液的直接荧光定量PCR重复性较好，对应的Ct值及标准差分别为18.1±0.03、22.5±0.05和26.5±0.07。因此，直接荧光定量PCR检测牛乳中沙门氏菌具有良好的稳定性。

实施例4实施例1的检测方法对牛乳的耐受性

分别在25μl直接荧光定量PCR体系中加入0μl、0.25μl、1.25μl、2.5μl、5μl、6.25μl、7.5μl、10μl沙门氏菌阴性牛乳，并分别加入等浓度沙门氏菌(2×10¹⁰cfu/ml)，使总体系中牛乳的浓度分别为0、1％、5％、10％、20％、25％、30％、40％，然后进行沙门氏菌的检测，探究沙门氏菌直接荧光定量PCR体系对牛乳浓度的耐受性。

从图4中看出，当直接荧光定量PCR反应完毕，反应体系变得浑浊；且牛乳浓度越高，浑浊程度也越高。但是，牛乳浓度在0～30％情况下直接荧光定量PCR体系都有活性(Ct值≤35)，在牛乳浓度0～20％情况下信号较强。上述结果表明，本发明的直接荧光定量PCR方法对牛乳具有较好的耐受性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量PCR的检测引物，其特征在于，所述检测引物如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示。

2.一种牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量PCR的检测探针，其特征在于，所述检测探针如SEQIDNo:3所示。

3.一种牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量PCR的检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量PCR的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应体系为：

5.根据权利要求3所述的牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量PCR的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃反应2min；94℃变性5s，60℃退火/延伸40s，反应40个循环。