CN102485908B - 辅助鉴定库蚊携带的羧酸酯酶等位基因的专用引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了辅助鉴定库蚊携带的羧酸酯酶等位基因的专用引物及其应用。本发明根据已出现的羧酸酯酶等位基因，设计了专用引物，由酯酶B特异引物对和酯酶A特异引物对组成；所述酯酶B特异引物对由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成；所述酯酶A特异引物对由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。采用专用引物，可以利用PCR-RFLP法对羧酸酯酶等位基因进行区分，通过将待测样本的酶切图谱(为了增加准确性，可与已知的羧酸酯酶抗性等位基因酶切图谱比对)即可确定野生蚊虫中羧酸酯酶等位基因的种类进而统计其在种群中出现的频率，最终为准确蚊虫抗药性的发生和发展提供分子方面的依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种辅助鉴定库蚊携带的羧酸酯酶等位基因的专用引物及其应用。
背景技术
蚊虫由于其特殊的行为、生理特性，成为多种疾病的传播媒介，严重影响了旅游业、饮食业，制约了卫生城市的发展，严重的危害了人类健康。蚊虫的种类繁多，其通过叮咬传播的疾病也比较多，库蚊是丝虫病、乙型脑炎、西尼罗河病毒的主要传播媒介，按蚊是丝虫病和疟疾的主要传播媒介，伊蚊是登革热和乙型脑炎的主要传播媒介(Hemingway J and Ranson H.Insecticide resistance in insect vectors of humandisease[J].Annu.Rev.Entomol.2000，45：371-391.)。
目前主要采取物理防治、化学防治、生物防治(徐承龙，姜志宽.蚊虫防治(三)-蚊虫防治的原则与方法[J].中华卫生杀虫药械.2006c，12(6)：494-496.)等方法防止其对疾病的传染，以化学杀虫剂为主的化学防治，以其高效、快速、便捷等优势成为主要的防治方法(王以燕.我国卫生杀虫剂面临的机遇与挑战[J].中华卫生杀虫药械，2009，15(3)：215-216.)。由于大量的使用化学杀虫剂，蚊虫逐渐对有机磷、有机氯、拟除虫菊酯类杀虫剂产生了抗药性(刘维德.我国蚊类抗药性发展动向[J].中国媒介生物学及控制，1990，(1)：41-44.)。蚊虫抗药性主要分为代谢抗药性和靶标抗药性，其中导致代谢抗药性的有三种酶：羧酸酯酶(W.G.Brogdon：Comp.Biochem.Physiol.C.1988，90，145-150.；O.Dary，G.P.Georghiou，E.Parsons and N.Pasteur：J.Econ.Entomol.1990，83，2187-2192.；C.Brengues，N.J.Hawkes，F.Chandre，L.McCarroll，S.Duchon，P.Guillet，S.Manguin，J.C.Morgan andJ.Hemingway：Med.Vet.Entomol.2003，17，87-94.)，P450单加氧酶，谷胱甘肽S转移酶(W.G.Brogdon and A.M.Barber：Comp.Biochem.Physiol.B1990，96，339-342.)，与抗药性相关的靶标有：氨基丁酸受体的突变(W.Du，T.S.Awolola，P.Howell，L.L.Koekemoer，B.D.Brooke，M.Q.Benedict，M.Coetzee and L.Zheng：Insect Mol.Biol.2005，14，179-183.；R.H.ffrench-Constant，J.C.Steichenand F.Shotkoski：Med.Vet.Entomol.1994，8，99-100.)，乙酰胆碱酯酶的突变，电压门钠离子通道突变(D.Martinez-Torres，F.Chandre，M.S.Williamson，F.Darriet，J.B.Berge，A.L.Devonshire，P.Guillet，N.Pasteur and D.Pauron：Insect Mol.Biol.1998，7，179-184.；A.Lynd，H.Ranson，P.J.McCall，N.P.Randle，W.C.Black，E.D.Walker and M.J.Donnel ly：Malar.J.2005，4，16.)。
目前对于监测和鉴定蚊虫抗药性，常用方法有4种：毒效生物测定法(包括半数致死量法、区分剂量法)、酶测定法、遗传学方法和免疫学方法。其中，WHO生物测定方法(WHO technical report series，No，818.Vecter resistance to pesticide，1992.62.)，测定蚊虫四龄幼虫对不同杀虫剂的敏感性，计算LC50及抗性指数。区分剂量法，按照世界卫生组织(WHO)及全国蚊虫抗性协作组统一制定的区分剂量法进行，根据死亡率判断抗性级别。为了便于抗性调查和抗性遗传的研究，早在1958年Davidson就提出了“区分剂量”的概念，此后，大量的抗药性监测工作也使用了区分剂量法(周水森，王漪，汤林华.2005年全国疟疾形式[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2006，24：401-403.[2]；李华宪，陈国伟，杨沅川，等.云南省2001～2005年疟疾疫情分析[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2008，26(1)：46-49.；陈国伟，李唯本，任志先，等.云南省嗜人按蚊分布区疟疾防治对策研究[J].中国热带医学，2004，4(1)：29-31.)。区分计量法用于检测群体中抗性个体的出现频率，半数致死量法用于衡量群体中大多数个体抗性分布状况，但由于缺乏敏感品系做参照，现场测试不能判断其抗药性水平，只能在不同地区之间进行横向比较(孙养信，岳永杰，佘建军，孙亮，阮春来，安翠红，吕文.陕西省流行性乙型脑炎高发区三带喙库蚊的抗药性研究[J].中国媒介生物学及控制.2009，20(4)：313-316.)。
对于蚊虫有机磷抗性，研究发现，酯酶水平的增加标志着对有机磷药物的抗性增加(Singh Y，Khanna H，Chopra AP，Mehra V.A dominant negative mutant of Bacillusanthracis protective antigen inhibits anthrax toxin action in vivo[J].J BiolChem，2001，276(25)：22090-22094.；Leppla SH.Anthrax toxin edema factor：abacterial adenylate cyclase that increases cyclic AMP concentrations ofeukaryotic cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，1982，79(10)：3162-3166.)，目前常用检测有机磷抗性的方法的就是微量滴定板法(生物化学方法)，通过酶标仪得出羧酸酯酶的活性水平(李士根.非特异性酯酶与淡色库蚊抗药性关系的研究[J].中华卫生杀虫药械，2009，15(4)：269-271.)，借以判断个体蚊虫的抗性状况。这种方法的优点是能得到羧酸酯酶活性的准确值，不足之处是必须借助酶标仪才能完成，在日常生活中较麻烦。另一种方法就是滤纸法(O.Dary，G.P.Georghiou，E.Parsonsand N.Pasteur：J.Econ.Entomol.1991，84，28-33.)，这种方法的优点在于可以长时间的保存实验结果，不足之处是在滤纸上只能进行显色反映，由于缺乏敏感品系作对照，得不到抗性水平。
昆虫对有机磷杀虫剂产生抗性的代谢机制主要是羧酸酯酶的活性升高，蚊虫的羧酸酯酶活性升高的原因之一是羧酸酯酶基因在基因组扩增，从而出现了许多抗性等位基因。尖音库蚊复组(Culex pipiens complex)为库蚊属(Genus Culex)的重要类群之一。复组包括模式种尖音库蚊，以及一些形态相似的亲缘种(siblingspecies)、亚种或“型”(陈汉彬，陆宝麟.中国尖音库蚊复组的研究.贵阳医学院学报.1983，01)，我国有4种，分别是：尖音库蚊(Culexpipiens pipiens)、致倦库蚊(Culex pipiensquinquefascia tus)、淡色库蚊(Culex pipiens pallens)、骚扰库蚊(Culex pipiensmolestus)(Dina M.Fonseca，Nusha Keyghobadi，Colin A.Malcolm，Ceylan Mehmet，Francis Schaffner，Motoyoshi Mogi，Robert C.Fleischer and Richard C.Wilkerson.Emerging Vectors in the Culex pipiens Complex.Science 5March 2004：Vol.303no.5663pp.1535-1538；宋社吾，赵彤言，董言德等.我国尖音库蚊复组的杂交及其与Wolbachia感染的关系[J].昆虫学报，2002.)。。在尖音库蚊复组里(Culex pipienscomplex)，世界上已发现的扩增酯酶有Al，B1，A2-B2，A4-B4，A5-B5，B6，B7，A8-B8，A9-B9(Raymond M.，Chevillon C.，Guillemaud T.，Lenormand T.，Pasteur N.Philos.Trans.R.Soc.Lond.，B，Biol.Sci.，1998，353(1376)：1707-1711.)。目前中国尖音库蚊复组(Culexpipiens complex)种群已出现若干羧酸酯酶抗性等位基因(B1；A2-B2，A2和B2紧密连锁；A8-B8，A8和B8紧密连锁；A9-B9，A9和B9紧密连锁；B10，B10和B10-A紧密连锁；A11-B11，A11和B11紧密连锁)，了解这些等位基因在野生种群中的频率对监测蚊虫抗药性的发生、发展极为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助鉴定库蚊(culex mosquitoes)携带的羧酸酯酶等位基因的专用引物及其应用。
本发明提供的辅助鉴定库蚊携带的羧酸酯酶等位基因的专用引物，由酯酶B特异引物对和酯酶A特异引物对组成；所述酯酶B特异引物对由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成；所述酯酶A特异引物对由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
本发明还保护辅助鉴定库蚊携带的羧酸酯酶等位基因的试剂盒，包括所述专用引物。所述试剂盒还可包括限制性内切酶DraI、限制性内切酶APaLI和限制性内切酶XbaI。所述试剂盒还可包括如下组分：
DNA提取液：CTAB 20g，5M NaCl水溶液280mL，EDTA(0.5M，pH8.0)40mL，Tris(1M，pH8.0)100mL，β-巯基乙醇2mL，最后用蒸馏水定容至1L；
Taq酶：Long Tag DNA Polymerase；天根生化科技有限公司，产品目录号为ET103；2.5U/uL；
PCR Buffer由水和如下终浓度的溶质组成：200mM Tris-HCl(pH8.4)，200mM KCl，100mM(NH4)2SO4，15mM MgCl2；
限制性内切酶Buffer由水和如下终浓度的溶质组成：50mM KAC，20mM Tris-AC，10mM Mg(AC)2，1mM DTT；pH7.9。
所述专用引物可用于制备辅助鉴定库蚊携带的羧酸酯酶等位基因的试剂盒。
所述专用引物或所述试剂盒可用于在辅助鉴定库蚊携带的羧酸酯酶等位基因。
所述羧酸酯酶等位基因为：具有序列表的序列5所示DNA的B1抗性等位基因，具有序列表的序列6所示DNA的B2抗性等位基因，具有序列表的序列7所示DNA的B8抗性等位基因，具有序列表的序列8所示DNA的B9抗性等位基因，具有序列表的序列9所示DNA的B11抗性等位基因，具有序列表的序列10所示DNA的B10抗性等位基因，具有序列表的序列11所示DNA的致倦库蚊B敏感等位基因，具有序列表的序列12所示DNA的淡色库蚊B敏感等位基因，具有序列表的序列13所示DNA的A8抗性等位基因，具有序列表的序列14所示DNA的A9抗性等位基因，具有序列表的序列15所示DNA的B10-A抗性等位基因，或具有序列表的序列16所示DNA的致倦库蚊A敏感等位基因。
所述库蚊具体可为中国的尖音库蚊复组中的库蚊。
本发明还保护一种鉴定库蚊携带的羧酸酯酶等位基因的方法，包括如下步骤：
(1)以待测库蚊的基因组DNA为模板，用序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物B，将PCR扩增产物B进行琼脂糖凝胶电泳；如果显示一条带且位于750bp和1000bp之间，待测库蚊携带B1抗性等位基因、B2抗性等位基因、B9抗性等位基因、淡色库蚊B敏感等位基因或致倦库蚊B敏感等位基因；如果显示一条带且位于2000bp以上，待测库蚊携带B8抗性等位基因或B10抗性等位基因；如果显示一条带且位于900-1000bp之间，或同时显示两条带且分别位于900-1000bp之间和1000bp-2000bp之间，待测库蚊携带B11抗性等位基因；
(2)将步骤(1)的PCR扩增产物B用限制性内切酶DraI进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳；如果同时显示两条带且分别位于600-750bp之间和200-250bp之间，待测库蚊携带B2抗性等位基因；如果同时显示两条带且分别位于500-600bp之间和400-500bp之间，待测库蚊携带B11抗性等位基因；如果同时显示两条带且分别位于500-600bp之间和300-400bp之间，待测库蚊携带B1抗性等位基因或淡色库蚊B敏感等位基因，进行步骤(3)；如果同时显示三条带且分别位于750-1000bp之间、400-500bp之间和100-200bp之间，待测库蚊携带B8抗性等位基因或B10抗性等位基因，进行步骤(4)；如果同时显示三条带且分别位于400-500bp之间、250-300bp之间和200-250bp之间，待测库蚊携带B9抗性等位基因或致倦库蚊B敏感等位基因，进行步骤(4)；
(3)将步骤(1)的PCR扩增产物用限制性内切酶XbaI进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳；如果显示一条带且位于750-1000bp之间，待测库蚊携带B1抗性等位基因；如果同时显示两条带且分别位于300-400bp之间和500-600bp之间，待测库蚊携带淡色库蚊B敏感等位基因；
(4)以待测库蚊的基因组DNA为模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A，将PCR扩增产物A用限制性内切酶APaLI进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳；如果同时显示两条带且分别位于200-300bp之间和300-400bp之间，待测库蚊携带A8抗性等位基因；如果显示一条带且位于600-750bp之间，待测库蚊携带A9抗性等位基因或B10-A抗性等位基因；如果同时显示两条带，且均位于300-400bp，待测库蚊携带致倦库蚊A敏感等位基因；
所述B1抗性等位基因具有序列表的序列5所示DNA；所述B2抗性等位基因具有序列表的序列6所示DNA；所述B8抗性等位基因具有序列表的序列7所示DNA；所述B9抗性等位基因具有序列表的序列8所示DNA；所述B11抗性等位基因具有序列表的序列9所示DNA；所述B10抗性等位基因具有序列表的序列10所示DNA；所述致倦库蚊B敏感等位基因具有序列表的序列11所示DNA；所述淡色库蚊B敏感等位基因具有序列表的序列12所示DNA；所述A8抗性等位基因具有序列表的序列13所示DNA；所述A9抗性等位基因具有序列表的序列14所示DNA；所述B10-A抗性等位基因具有序列表的序列15所示DNA；所述致倦库蚊A敏感等位基因具有序列表的序列16所示DNA。
所述步骤(1)中的琼脂糖凝胶的浓度具体可为1％(质量百分含量)；所述步骤(2)中的琼脂糖凝胶的浓度具体可为2％(质量百分含量)；所述步骤(3)中的琼脂糖凝胶的浓度具体可为2％(质量百分含量)；所述步骤(4)中的琼脂糖凝胶的浓度具体可为2％(质量百分含量)；所述库蚊具体可为中国的尖音库蚊复组中的库蚊。
本发明根据已出现的羧酸酯酶等位基因，设计了由两对特异引物对组成的专用引物。本发明提供的试剂盒，利用PCR-RFLP法对羧酸酯酶等位基因进行区分，通过对比可以快速检测尖音库蚊复组野生种群中抗性羧酸酯酶等位基因种类及频率，进而可能用于蚊虫品系的辅助鉴定。
本发明提供的试剂盒操作简单、快速且精确度高。本发明提供的试剂盒是从基因水平上进行的精确鉴定，通过将待测样本的酶切图谱(为了增加准确性，可与已知的羧酸酯酶抗性等位基因酶切图谱比对)即可确定野生蚊虫中羧酸酯酶等位基因的种类进而统计其在种群中出现的频率，最终为准确蚊虫抗药性的发生和发展提供分子方面的依据。
附图说明
图1为羧酸酯酶B片段PCR产物电泳图1；M：maker D2000；1：B1(945bp)；2：A2-B2(941bp)；3：A8-B8(2443bp)；4：A9-B9(936bp)；5：A11-B11(942bp)；6：B10(2442bp)；7：C.p.p(942bp)；8：C.p.q(936bp)。
图2为羧酸酯酶B片段PCR产物第一种酶切电泳图；1：B1(512bp、369bp、64bp)；2：A2-B2(697bp、244bp)；3：A8-B8(951bp、888bp、424bp、89bp、69bp、22bp)，其中888bp和951bp两条带电泳没有分开，由于不完全酶切，89bp和69bp两条带做为160bp一条带出现；4：A9-B9(402bp、292bp、242bp)；5：A11-B11(519bp、423bp)；6：B10(951bp、888bp、424bp、89bp、68bp、22bp)，其中888bp和951bp两条带电泳没有分开，由于不完全酶切，89bp和68bp两条带做为160bp一条带出现；7：C.p.p(519bp、375bp、48bp)；8：C.p.q(402bp、292bp、242bp)；M1：marker I；M2：makerD2000。
图3为羧酸酯酶B片段PCR产物第二种酶切电泳图；1：C.p.p(353bp、589bp)；2：B1(945bp)；M1：markerI；M2：maker D2000。
图4为羧酸酯酶A片段PCR产物电泳图；1：A8-B8(713bp)；2：A9-B9(713bp)；3：B10(713bp)；4：C.p.q(713bp)；M：maker D2000。
图5为羧酸酯酶A片段PCR产物酶切电泳图；1：A8-B8(98bp、233bp、392bp)；2：A9-B9(98bp、615bp)；3：B10(98bp、615bp)；4：C.p.q(321bp、392bp)；M1：marker I；M2：maker D2000。
图6为中国尖音库蚊抗性羧酸酯酶的酯酶A和酯酶B淀粉凝胶电泳图谱。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实验样本(每个品系10只)如下：
尖音库蚊B1系(简称B1，携带B1抗性等位基因)；参考文献：C Mouches，Y Pauplin，M Agarwal，L Lemieux，M Herzog，M Abadon，V Beyssat-Arnaouty，O Hyrien，B Rde Saint Vincent，and G P Georghiou.Characterization of amplification coreand esterase B1gene responsible for insecticide resistance in Culex.PNASApril 1，1990 vol.87 no.7 2574-2578.。
尖音库蚊A2-B2系(简称A2-B2，携带A2抗性等位基因和B2抗性等位基因)；参考文献：Raymond，M.，Pasteur，N.，Georghiou，G.P.，Mellon，R.B.，Wirth，M.C.and Hawley，M.K.，Detoxification esterases new to California，USA，inorganophosphate-resistant Culex quinquefasciatus Diptera：Culicidae.Journalof Medical Entomology.1987.24，24-27.)。
尖音库蚊A8-B8系(简称A8-B8，携带A8抗性等位基因和B8抗性等位基因)；参考文献：Qiao C.L.Marquine M.Pasteur N.Raymond M.A New Esterase GeneAmplification Involved in OP Resistance in Culex pipiens Mosquitoes from China.Biochemieal Genetics 1998，(36)，417-426.)。
尖音库蚊A9-B9系(简称A9-B9，携带A9抗性等位基因和B9抗性等位基因)；参考文献：ZHANG Ke，YE Zhen-qing，QIAO Chuan-ling，LIN Li-feng，CAI Song-wu.Resistant level.frequency of non-specific esterases and geneticdifferentiation in mosquitoes Culex pipiens quinquefasciatus in three citiesof Guangdong.Zoological Research，2003(05)。
尖音库蚊B10系(简称B10或WU，携带B10抗性等位基因和B10-A抗性等位基因)；参考文献：Feng Cuia，Mylene Weill，Arnaud Berthomieu，Michel Raymonda，Chuan-Ling Qiao.Characterization of novel esterases in insecticide-resistantmosquitoes.Insect Biochemistry and Molecular Biology 2007(37)1131-1137.)。
尖音库蚊A11-B11系(简称A11-B11或KARA2，携带A11抗性等位基因和B11抗性等位基因)；参考文献：Feng Cuia，Mylene Weill，Arnaud Berthomieu，Michel Raymonda，Chuan-Ling Qiao.Characterization of novel esterases in insecticide-resistantmosquitoes.Insect Biochemistry and Molecular Biology 2007(37)1131-1137.)。
致倦库蚊敏感系(Culex pipiens quinquefasciatus，简称C.p.q，南方种群，携带致倦库蚊B敏感等位基因和致倦库蚊A敏感等位基因)；参考文献：Feng Cuia，Mylene Weill，Arnaud Berthomieu，Michel Raymonda，Chuan-Ling Qiao.Characterization of hovel esterases in insecticide-resistant mosquitoes.Insect Biochemistry and Molecular Biology 2007(37)1131-1137.)。
淡色库蚊敏感系(Culex pipiens pallens，简称C.p.p，北方种群，携带淡色库蚊B敏感等位基因)；参考文献：Feng Cuia，Mylene Weill，Arnaud Berthomieu，MichelRaymonda，Chuan-Ling Qiao.Characterization of novel esterases ininsecticide-resistant mosquitoes.Insect Biochemistry and Molecular Biology2007(37)1131-1137.。
实施例1、专用引物的设计和试剂盒的制备
一、专用引物的设计
根据已出现的羧酸酯酶抗性等位基因(B1；A2-B2，A2和B2紧密连锁；A8-B8，A8和B8紧密连锁；A9-B9，A9和B9紧密连锁；B10，B10和B10-A紧密连锁；A11-B11，A11和B11紧密连锁)，设计酯酶A引物1、酯酶A引物2、酯酶B引物1和酯酶B引物2组成的专用引物。
酯酶B引物1和酯酶B引物2组成酯酶B特异引物对，靶标位于酯酶B基因上；针对B1抗性等位基因的靶序列为945bp(见序列表的序列5)，针对B2抗性等位基因的靶序列为941bp(见序列表的序列6)，针对B8抗性等位基因的靶序列为2443bp(见序列表的序列7)，针对B9抗性等位基因的靶序列为936bp(见序列表的序列8)，针对B11抗性等位基因的靶序列为942bp(见序列表的序列9)，针对B10抗性等位基因的靶序列为2442bp(见序列表的序列10)，针对致倦库蚊B敏感等位基因的靶序列为936bp(见序列表的序列11)，针对淡色库蚊B敏感等位基因的靶序列为942bp(见序列表的序列12)。
酯酶A引物1、酯酶A引物2组成酯酶A特异引物对，靶标位于酯酶A基因上；针对A8抗性等位基因的靶序列为713bp(见序列表的序列13)；针对A9抗性等位基因的靶序列为713bp(见序列表的序列14)；针对B10-A抗性等位基因的靶序列为713bp(见序列表的序列15)；针对致倦库蚊A敏感等位基因的靶序列为713bp(见序列表的序列16)。
二、试剂盒的制备
试剂盒由如下组分组成：
酯酶B引物1(序列表的序列1)：5′-AGCTTAACCGTTCAGACCAA-3′。
酯酶B引物2(序列表的序列2)：5′-CAGTCCAACGTTTCGGTCCA-3′。
酯酶A引物1(序列表的序列3)：5′-CTTTATGAGAGGATCTAGTGG-3′。
酯酶A引物2(序列表的序列4)：5′-CAAGCTTCACGACACATCTC-3′。
DNA提取液：CTAB 20g，5M NaCl水溶液280mL，EDTA(0.5M，pH8.0)40mL，Tris(1M，pH8.0)100mL，β-巯基乙醇2mL，最后用蒸馏水定容至1L。
Taq酶：Long Tag DNA Polymerase；天根生化科技有限公司，产品目录号为ET103；2.5U/uL。
PCR Buffer由水和如下终浓度的溶质组成：200mM Tris-HCl(pH8.4)，200mM KCl，100mM(NH4)2SO4，15mM MgCl 2。
限制性内切酶A：DraI；BioLabs，产品目录号为R0129；20U/uL。
限制性内切酶B：APaLI；BioLabs，产品目录号为R0507；10U/uL。
限制性内切酶C：XbaI；BioLabs，产品目录号为R0145；20U/uL。
限制性内切酶Buffer由水和如下终浓度的溶质组成：50mM KAC，20mM Tris-AC，10mM Mg(AC)2，1mM DTT；pH7.9。
储存条件：DNA提取液如在1个月以内使用，可不加入β-巯基乙醇，4℃保存；DNA提取液保存期在1个月以上时，需加入β-巯基乙醇，使其终浓度为2ml/L，4℃保存；其它组分储存于-20℃条件下。
实施例2、试剂盒的应用
应用实施例1制备的试剂盒，分别对每个实验样本进行如下检测：
1、提取基因组DNA
①将蚊子置于1.5ml的EP管中，加入60℃预热的DNA提取液200μl，充分研磨蚊虫，60℃水浴15min；
②加入200μl氯仿/异戊醇溶液(24体积份氯仿/1体积份异戊醇)，剧烈摇晃5min，室温下12000rpm离心10min；小心移取上清液至另一干净的1.5ml EP管中；
③加入等体积异丙醇沉淀DNA，颠倒混匀，-20℃放置10min以上；
④12000rpm离心10min，小心移除上清，用1ml 70％乙醇洗DNA沉淀；
⑤12000rpm离心5min，小心移除上清，室温晾干(37℃以下)；
⑥用20-30ul无菌水溶解基因组DNA，-20℃保存。
2、以步骤1的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(羧酸酯酶B的片段)。
PCR反应体系(50μL)：ddH2O 40μL，PCR Buffer 5μL，dNTP(10mM/L)1μL，酯酶B引物11μL，酯酶B引物21μL，基因组DNA(50-100ng/μL)1μL，Taq酶1μL。
PCR反应程序：94℃4min；94℃45s，58℃45s，72℃2min40s，35个循环；72℃10min；10℃保存。
将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图1。
每个品系的10个样本结果均一致。
B1(945bp)、A2-B2(941bp)、A9-B9(936bp)、C.p.p(942bp)、C.p.q(936bp)显示一种带型，均在750-1000bp之间有一条带。
A8-B8(2443bp)和B10(2442bp)显示一种带型，均在2000bp以上具有一条带。
A11-B11显示一种带型，在900-1000bp之间和1000-2000bp之间各有一条带，即PCR扩增时，不仅得到了目的条带(942bp)，同时得到了同一个基因的另一种拷贝(1165bp)。
将PCR扩增产物进行测序，测序结果表明：B1的PCR扩增产物为945bp(见序列表的序列5)，A2-B2的PCR扩增产物为941bp(见序列表的序列6)，A8-B8的PCR扩增产物为2443bp(见序列表的序列7)，A9-B9的PCR扩增产物为936bp(见序列表的序列8)，A11-B11的PCR扩增产物为942bp(见序列表的序列9)，B10的PCR扩增产物为2442bp(见序列表的序列10)，C.p.q的PCR扩增产物为936bp(见序列表的序列11)，C.p.p的PCR扩增产物为942bp(见序列表的序列12)。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物用限制性内切酶A进行酶切，得到酶切产物。
酶切体系(20μL)：ddH2O 2.5μL，限制性内切酶buffer 2μL，PCR扩增产物15μL，限制性内切酶A 0.5μL。37℃酶切两小时以上。
将酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图2。
A2-B2(697bp、244bp)显示一种带型(泳道2)，在600-750bp之间有一条带，在200-250bp之间有一条带。
A11-B11(519bp、423bp)显示一种带型(泳道5)，在500-600bp之间有一条带，在400-500bp之间有一条带。
B1(512bp、369bp、64bp)和C.p.p(519bp、375bp、48bp)显示一种带型(泳道1和泳道7)，在500-600bp之间(500bp左右)有一条带，在300-400bp之间有一条带。
A8-B8(951bp、888bp、424bp、89bp、69bp、22bp)和B10(951bp、888bp、424bp、89bp、68bp、22bp)显示一种带型(泳道3和泳道6)，在750-1000bp之间有一条带，在400-500bp之间有一条带，在100-200bp之间有一条带。
A9-B9(402bp、292bp、242bp)和C.p.q(402bp、292bp、242bp)显示一种带型(泳道4和泳道8)，在400-500bp之间(400bp左右)有一条带，在250-300bp之间(300bp左右)有一条带，在200-250bp之间(250bp左右)有一条带。
若出现泳道2的带型，可判断蚊虫携带B2抗性等位基因；若出现泳道5的带型，可判断蚊虫携带B11抗性等位基因。
若出现泳道1的带型，进行步骤4。若出现泳道3或泳道4的带型，进行步骤5。
4、将步骤2得到的PCR扩增产物用限制性内切酶C进行酶切，得到酶切产物。
酶切体系(20μL)：ddH2O 2.5μL，限制性内切酶buffer 2μL，PCR扩增产物15μL，BSA 0.2μL，限制性内切酶C 0.5μL。37℃酶切两小时以上。
将酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图3。
B1(945bp)显示一种带型(泳道2)，在750-1000bp之间有一条带。
C.p.p(353bp、589bp)显示一种带型(泳道1)，在300-400bp之间有一条带，在500-600bp之间有一条带。
若出现泳道1的带型，蚊虫携带淡色库蚊B敏感等位基因；若出现泳道2的带型，蚊虫携带B1抗性等位基因。
5、以步骤1的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(羧酸酯酶A的片段)。
PCR反应体系(50μL)：ddH2O 40μL，PCR Buffer 5μL，dNTP(10mM/L)1μL，酯酶A引物11μL，酯酶A引物21μL，基因组DNA(50-100ng/μL)1μL，Taq酶1μL。
PCR反应程序：94℃4min；94℃45s，58℃45s，72℃1m10s，35个循环；72℃10min；10℃保存。
将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图4。
A8-B8(713bp)、A9-B9(713bp)、B10(713bp)和C.p.q(713bp)显示一种带型，在500-750bp之间(700bp左右)有一条带。
将PCR扩增产物进行测序，测序结果表明：A8-B8的PCR扩增产物为713bp(见序列表的序列13)，A9-B9的PCR扩增产物为713bp(见序列表的序列14)，B10的PCR扩增产物为713bp(见序列表的序列15)，C.p.q的PCR扩增产物为713bp(见序列表的序列16)。
6、将步骤5的PCR扩增产物用限制性内切酶B进行酶切，得到酶切产物。
酶切体系(20μL)：ddH2O 2.3μL，限制性内切酶buffer 2μL，PCR扩增产物15μL，BSA 0.2μL，限制性内切酶B 0.5μL。
37℃酶切两小时以上。
将酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图5。
A8-B8(98bp、233bp、392bp)显示一种带型(泳道1)，200-300bp之间有一条带，在300-400bp之间(400bp左右)有一条带。
A9-B9(98bp、615bp)和B10(98bp、615bp)显示一种带型(泳道2和泳道3)，在600-750bp之间(600bp左右)有一条带。
C.p.q(321bp、392bp)显示一种带型(泳道4)，在300-400bp之间(300bp左右，400bp左右)有两条带。
若出现泳道1的带型，蚊虫携带A8抗性等位基因；若出现泳道2的带型，蚊虫携带A9抗性等位基因或B10-A抗性等位基因；若出现泳道4的带型，蚊虫携带致倦库蚊A敏感等位基因(南方种群C.p.q)。
如果实验中单只蚊虫的酶切图谱出现了两种等位基因的条带，请将图2、3、5中各个等位基因的酶切条带进行组合，由此可确定检测蚊虫中所含有的杂合等位基因。如果出现与任一所示酶切图谱不同的图谱，检测蚊虫中可能含有新的抗性等位基因，建议测序确定。
实验样本羧酸酯酶的酯酶A和酯酶B的检测结果见图6。
Claims (9)
1.辅助鉴定库蚊携带的羧酸酯酶等位基因的专用引物，由酯酶B特异引物对和酯酶A特异引物对组成；所述酯酶B特异引物对由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成；所述酯酶A特异引物对由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
2.如权利要求1所述的专用引物，其特征在于：所述羧酸酯酶等位基因为：具有序列表的序列5所示DNA的B1抗性等位基因，具有序列表的序列6所示DNA的B2抗性等位基因，具有序列表的序列7所示DNA的B8抗性等位基因，具有序列表的序列8所示DNA的B9抗性等位基因，具有序列表的序列9所示DNA的B11抗性等位基因，具有序列表的序列10所示DNA的B10抗性等位基因，具有序列表的序列11所示DNA的致倦库蚊B敏感等位基因，具有序列表的序列12所示DNA的淡色库蚊B敏感等位基因，具有序列表的序列13所示DNA的A8抗性等位基因，具有序列表的序列14所示DNA的A9抗性等位基因，具有序列表的序列15所示DNA的B10-A抗性等位基因，或具有序列表的序列16所示DNA的致倦库蚊A敏感等位基因；所述库蚊为中国的尖音库蚊复组中的库蚊。
3.辅助鉴定库蚊携带的羧酸酯酶等位基因的试剂盒，包括权利要求1所述专用引物、限制性内切酶DraI、限制性内切酶APaLI和限制性内切酶XbaI。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述羧酸酯酶等位基因为：具有序列表的序列5所示DNA的B1抗性等位基因，具有序列表的序列6所示DNA的B2抗性等位基因，具有序列表的序列7所示DNA的B8抗性等位基因，具有序列表的序列8所示DNA的B9抗性等位基因，具有序列表的序列9所示DNA的B11抗性等位基因，具有序列表的序列10所示DNA的B10抗性等位基因，具有序列表的序列11所示DNA的致倦库蚊B敏感等位基因，具有序列表的序列12所示DNA的淡色库蚊B敏感等位基因，具有序列表的序列13所示DNA的A8抗性等位基因，具有序列表的序列14所示DNA的A9抗性等位基因，具有序列表的序列15所示DNA的B10-A抗性等位基因，或具有序列表的序列16所示DNA的致倦库蚊A敏感等位基因；所述库蚊为中国的尖音库蚊复组中的库蚊。
5.权利要求1所述专用引物在制备辅助鉴定库蚊携带的羧酸酯酶等位基因的试剂盒中的应用。
6.权利要求1所述专用引物，或权利要求3或4所述试剂盒在辅助鉴定库蚊携带的羧酸酯酶等位基因中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述羧酸酯酶等位基因为：具有序列表的序列5所示DNA的B1抗性等位基因，具有序列表的序列6所示DNA的B2抗性等位基因，具有序列表的序列7所示DNA的B8抗性等位基因，具有序列表的序列8所示DNA的B9抗性等位基因，具有序列表的序列9所示DNA的B11抗性等位基因，具有序列表的序列10所示DNA的B10抗性等位基因，具有序列表的序列11所示DNA的致倦库蚊B敏感等位基因，具有序列表的序列12所示DNA的淡色库蚊B敏感等位基因，具有序列表的序列13所示DNA的A8抗性等位基因，具有序列表的序列14所示DNA的A9抗性等位基因，具有序列表的序列15所示DNA的B10-A抗性等位基因，或具有序列表的序列16所示DNA的致倦库蚊A敏感等位基因；所述库蚊为中国的尖音库蚊复组中的库蚊。
8.一种鉴定库蚊携带的羧酸酯酶等位基因的方法，包括如下步骤：
(1)以待测库蚊的基因组DNA为模板，用序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物B，将PCR扩增产物B进行琼脂糖凝胶电泳；如果显示一条带且位于750bp和1000bp之间，待测库蚊携带B1抗性等位基因、B2抗性等位基因、B9抗性等位基因、淡色库蚊B敏感等位基因或致倦库蚊B敏感等位基因；如果显示一条带且位于2000bp以上，待测库蚊携带B8抗性等位基因或B10抗性等位基因；如果显示一条带且位于900-1000bp之间，或同时显示两条带且分别位于900-1000bp之间和1000bp-2000bp之间，待测库蚊携带B11抗性等位基因；
(2)将步骤(1)的PCR扩增产物B用限制性内切酶DraI进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳；如果同时显示两条带且分别位于600-750bp之间和200-250bp之间，待测库蚊携带B2抗性等位基因；如果同时显示两条带且分别位于500-600bp之间和400-500bp之间，待测库蚊携带B11抗性等位基因；如果同时显示两条带且分别位于500-600bp之间和300-400bp之间，待测库蚊携带B1抗性等位基因或淡色库蚊B敏感等位基因，进行步骤(3)；如果同时显示三条带且分别位于750-1000bp之间、400-500bp之间和100-200bp之间，待测库蚊携带B8抗性等位基因或B10抗性等位基因，进行步骤(4)；如果同时显示三条带且分别位于400-500bp之间、250-300bp之间和200-250bp之间，待测库蚊携带B9抗性等位基因或致倦库蚊B敏感等位基因，进行步骤(4)；
(3)将步骤(1)的PCR扩增产物用限制性内切酶XbaI进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳；如果显示一条带且位于750-1000bp之间，待测库蚊携带B1抗性等位基因；如果同时显示两条带且分别位于300-400bp之间和500-600bp之间，待测库蚊携带淡色库蚊B敏感等位基因；
(4)以待测库蚊的基因组DNA为模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A，将PCR扩增产物A用限制性内切酶APaLI进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳；如果同时显示两条带且分别位于200-300bp之间和300-400bp之间，待测库蚊携带A8抗性等位基因；如果显示一条带且位于600-750bp之间，待测库蚊携带A9抗性等位基因或B10-A抗性等位基因；如果同时显示两条带，且均位于300-400bp，待测库蚊携带致倦库蚊A敏感等位基因；
所述B1抗性等位基因具有序列表的序列5所示DNA；所述B2抗性等位基因具有序列表的序列6所示DNA；所述B8抗性等位基因具有序列表的序列7所示DNA；所述B9抗性等位基因具有序列表的序列8所示DNA；所述B11抗性等位基因具有序列表的序列9所示DNA；所述B10抗性等位基因具有序列表的序列10所示DNA；所述致倦库蚊B敏感等位基因具有序列表的序列11所示DNA；所述淡色库蚊B敏感等位基因具有序列表的序列12所示DNA；所述A8抗性等位基因具有序列表的序列13所示DNA；所述A9抗性等位基因具有序列表的序列14所示DNA；所述B10-A抗性等位基因具有序列表的序列15所示DNA；所述致倦库蚊A敏感等位基因具有序列表的序列16所示DNA。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的琼脂糖凝胶的质量百分含量浓度为1％；所述步骤(2)中的琼脂糖凝胶的质量百分含量浓度为2％；所述步骤(3)中的琼脂糖凝胶的质量百分含量浓度为2％；所述步骤(4)中的琼脂糖凝胶的质量百分含量浓度为2％；所述库蚊为中国的尖音库蚊复组中的库蚊。
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