CN112760403B

CN112760403B - 丝瓜的内参基因及其引物和应用

Info

Publication number: CN112760403B
Application number: CN202110136742.7A
Authority: CN
Inventors: 赵钢军; 吴海滨; 罗剑宁; 龚浩; 李俊星; 郑晓明; 刘小茜
Original assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2021-02-01
Filing date: 2021-02-01
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-02-01
Also published as: CN112760403A

Abstract

本发明公开了丝瓜不同组织的内参基因，为PP2A和/或β‑ACTIN，所述内参基因PP2A的序列如SEQ ID No.1所示；所述内参基因β‑ACTIN的序列如SEQ ID No.2所示。本发明的内参基因PP2A、β‑ACTIN比其他内参基因具有更高的稳定性，并且这两个内参基因是筛选出来的，是丝瓜不同组织中最稳定的内参基因，数据真实可靠，解决了现有丝瓜基因表达分析中没有内参基因的现状，也能够提高检测效率和检测结果，具有较高的实用价值，为丝瓜在不同组织中获得功能基因表达的精确定量数据提供有力支持，为丝瓜基因功能研究提供理论基础。

Description

丝瓜的内参基因及其引物和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及丝瓜的内参基因及其引物和应用。

背景技术

丝瓜(Luffa cylindrica)是我国、印度和东南亚地区广泛种植的一种重要的蔬菜作物。未成熟的丝瓜果实是碳水化合物、维生素和各种矿物质的良好来源。最近的研究表明，冬瓜具有抗菌、抗癌、抗氧化等作用，在医学上得到了广泛的应用。成熟的丝瓜复合物可用于清洗、过滤，并与石墨烯纳米片结合，制成新型电磁屏蔽复合材料。

实时定量PCR(qRT-PCR)因其灵敏度、准确性和快速性而被广泛应用于基因表达的定量分析。然而，qRT-PCR的准确性容易受到多种因素的影响，包括RNA含量和质量、逆转录效率和扩增效率。为了尽量减少这些影响的影响，参考基因被用作内部控制，以消除或减少样本之间的技术差异，并准确测量目标基因的表达。理想的参考基因应该在不同的组织、发育阶段和不同的实验条件下保持稳定。但到目前为止，缺少在丝瓜不同组织中稳定表达的内参基因。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中缺少在丝瓜不同组织中稳定表达的内参基因的技术问题。为此，本发明提出检测PP2A和/或β-ACTIN的试剂在检测丝瓜内参基因中的应用，所述内参基因能够在丝瓜的不同组织中稳定表达。

本发明还检测PP2A和/或β-ACTIN的试剂在制备检测丝瓜内参基因的试剂中的应用。

根据本发明的第一个方面，所述检测PP2A和/或β-ACTIN的试剂为扩增PP2A的引物和/或扩增β-ACTIN的引物。

进一步地，扩增PP2A的引物的核酸序列为：

PP2A-F：CTAGTGGCTCTGAAAGTTCGTTATAG(SEQ ID No.15)；

PP2A-R：CATACACTTGAGTTATCTGTCGGC(SEQ ID No.16)。

扩增β-ACTIN的引物的核酸序列为：

β-ACTIN-F：AGATTTGTATGGTAACATTGTTCTCA(SEQ ID No.5)；

β-ACTIN-R：ACACTGTATTTCCTTTCGGGTG(SEQ ID No.6)。

进一步地，所述PP2A的序列如SEQ ID No.1所示：

ATGCCGTCTCACGCGGATCTGGACCGTCAGATCGAGCATCTGATGGAGTGCAAGCCGTTGTCGGAAGCGGAGGTGAAAATACTGTGTGATCAGGCGAGAGCGGTTCTGGTCGAGGAGTGGAACGTGCAGCCGGTTAAGTGTCCGGTGACGGTCTGCGGTGATATTCATGGCCAATTTTACGATCTCATTGAACTGTTCCGGATAGGAGGCCGTACTCCCGATACTAATTACCTTTTCATGGGTGATTACGTGGATCGTGGGTACTACTCTGTCGAGACGGTTACTCTTCTAGTGGCTCTGAAAGTTCGTTATAGAGATAGAATTACAATATTAAGGGGAAATCATGAGAGCCGACAGATAACTCAAGTGTATGGCTTTTATGATGAATGCTTGAGAAAATATGGAAATGCCAATGTCTGGAAACACTTCACCGATCTTTTCGATTACCTACCTCTTACAGCTCTAGTTGAGAGTCAGGTTTTCTGTTTACATGGAGGACTTTCTCCATCATTGGATACCTTGGATAACATCCGCTCGTTGGACCGCATACAGGAGGTCCCCCATGAGGGGCCAATGTGTGATCTCTTGTGGTCTGATCCAGATGACCGGTGTGGATGGGGAATATCTCCACGTGGTGCTGGCTATACATTTGGTCAGGATATAGCTGCTCAGTTCAATCATACAAATGGGCTTACTCTTATATCCAGGGCACACCAACTTGTCATGGAAGGATACAACTGGTGTCAGGATAAGAACGTGGTGACTGTCTTTAGTGCTCCAAATTATTGTTATCGATGTGGGAATATGGCCGCAATACTGGAAATTGGGGAGACTATGGATCAGAATTTTCTACAATTTGACCCAGCTCCTCGGCAAATTGAGCCTGATACCACACGCAAGACTCCTGATTATTTTTTGTGA。

进一步地，所述β-ACTIN的序列如SEQ ID No.2所示：

ATGGCCGATGCTGAGGATATCCAGCCACTTGTTTGCGATAATGGTACCGGAATGGTGAAGGCTGGATTTGCTGGTGATGATGCTCCCAGGGCAGTGTTTCCCAGTATTGTTGGTCGACCCCGACACACCGGTGTCATGGTGGGTATGGGCCAGAAAGATGCTTATGTTGGTGATGAGGCCCAATCCAAAAGAGGTATTCTTACCTTGAAATATCCAATTGAGCATGGTATTGTCAGCAACTGGGATGATATGGAAAAGATTTGGCATCACACATTCTACAATGAGCTTCGTGTTGCACCTGAAGAACACCCAGTGCTTCTTACTGAAGCTCCTCTCAATCCTAAAGCCAACAGAGAAAAGATGACACAAATCATGTTTGAGACTTTTAATGTACCTGCCATGTATGTTGCCATCCAGGCCGTTCTATCTCTGTATGCCAGTGGTCGTACAACAGGTATTGTGCTGGACTCTGGTGATGGTGTCAGTCACACTGTGCCAATCTATGAGGGTTATGCTCTACCCCATGCTATCCTTCGTCTGGACCTTGCTGGTCGTGATTTAACTGATGCTTTGATGAAGATTCTCACTGAGAGAGGGTACATGTTCACAACCACTGCCGAACGGGAAATTGTCCGTGACATGAAAGAGAAGCTTGCTTATGTTGCACTCGACTATGAGCAGGAACTTGAGACTGCTAAGAGTAGCTCCTCAATTGAGAAGAACTACGAACTGCCTGATGGACAAGTCATCACAATTGGAGCTGAGAGATTCCGTTGCCCCGAAGTTCTTTTCCAGCCATCCCTCATCGGAATGGAAGCTGCTGGAATCCACGAGACTACCTACAACTCAATTATGAAGTGTGATGTGGATATCAGAAAAGATTTGTATGGTAACATTGTTCTCAGTGGTGGTTCGACCATGTTCCCTGGTATTGCTGACCGAATGAGCAAAGAGATCACAGCTCTTGCTCCCAGCAGCATGAAAATTAAGGTCGTTGCACCACCCGAAAGGAAATACAGTGTCTGGATTGGAGGGTCAATCCTTGCATCGCTCAGCACCTTCCAGCAGATGTGGATCTCGAAGGGCGAGTATGACGAATCTGGCCCATCCATCGTCCACAGGAAGTGCTTCTAA。

本发明还提供一种引物用于扩增PP2A和/或β-ACTIN。

进一步地，用于扩增PP2A的引物的核酸序列为：

PP2A-F：CTAGTGGCTCTGAAAGTTCGTTATAG(SEQ ID No.15)；

PP2A-R：CATACACTTGAGTTATCTGTCGGC(SEQ ID No.16)。

用于扩增β-ACTIN的引物的核酸序列为：

β-ACTIN-F：AGATTTGTATGGTAACATTGTTCTCA(SEQ ID No.5)；

β-ACTIN-R：ACACTGTATTTCCTTTCGGGTG(SEQ ID No.6)。

本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述引物。

本发明还提供上述引物或试剂盒在检测检测检测丝瓜内参基因中的应用。

进一步地，所述应用为在qRT-PCR分析中的应用。

本发明还提供一种丝瓜内参基因的筛选方法，包括以下步骤：

S1：提取丝瓜不同组织部位的RNA，合成DNA，根据核苷酸序列筛选出候选参考基因；

S2：根据候选参考基因的核苷酸序列设计引物，得到特异性扩增候选内参基因的引物；

S3：用qRT-PCR检测候选参考基因的稳定性分析；

S4：用BestKeeper、比较delta-Ct法、geNorm和NormFinder程序评估候选参考基因的表达稳定性分析，最后利用RefFinder基于上述四个程序的候选参考基因的综合排名，选择前两名最稳定的参考基因。

根据本发明的一些实施例，所述不同组织包含根、茎、叶、雄花花瓣、雌花花瓣、生长点、雄蕊、柱头、子房、果实中的一种或多种。

根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：上述内参基因PP2A、β-ACTIN比其他内参基因具有更高的稳定性，并且这两个内参基因是筛选出来的，是丝瓜不同组织中最稳定的内参基因，数据真实可靠，解决了现有丝瓜基因表达分析中没有内参基因的现状，也能够提高检测效率和检测结果，具有较高的实用价值，为丝瓜在不同组织中获得功能基因表达的精确定量数据提供有力支持，为丝瓜基因功能研究提供理论基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明实施例1中的qRT-PCR的溶解曲线。

图3为本发明实施例2中的候选内参基因的表达分析。

图4为本发明实施例3中的候选内参基因表达稳定性分析。

图5为本发明实施例3中的样本中ACS的相对表达谱。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1候选参考基因的筛选

取丝瓜P93075的根、茎、叶、生长点、雄花花瓣、雌花花瓣、雄蕊、柱头、子房、授粉后10天的果实，提取RNA，反转录成cDNA。本研究共筛选出11个候选参考基因分别为：Lc18SRNA、ACT7、β-ACTIN、DNAJ、EF1α、EIF4A、GAPDH、PP2A、RPL2、TUA、UBQ，其中包括先前文献中使用的一个参考基因Lc18SRNA，具体信息见表1。

表1候选参考基因信息

进一步通过琼脂糖凝胶电泳和qRT-PCR溶解曲线(使用QuantStudio 6Flex(ABI，USA)在10μl反应体积中进行qRT-PCR，反应体积包含0.5μl cDNA、5μl SYBR Premix Ex TaqII(Takara，日本)、0.2μl正向和反向引物(10μM)和4.1μl ddH₂O。PCR条件为：95℃，30秒；95℃，10秒，40个循环；60℃，30秒，然后在65至95℃下进行熔解曲线分析)来验证其特异性，琼脂糖凝胶电泳结果见图1，溶解曲线见图2，从图1和图2证实了PCR扩增的特异性，每个引物产生了一个单一的条带和一个峰，这表明所有引物对都产生了预期大小的特异产物。为了评价引物的扩增效率，用5倍稀释的cDNA模板，以评估扩增效率(E)和相关系数(R²)，具体结果见表1。可以看出11个候选参考基因的E值在97.45％～107.06％之间，每个基因的R²均超过0.998。这些结果表明，所有候选参考基因的引物在qRT-PCR系统中是有效的和特异的。

实施例2候选参考基因的表达分析

用qRT-PCR检测11个候选参考基因的表达水平，所有检测结果见图3。可以看出所有样本中候选参考基因的Ct值从Lc18SRNA(14.3)到TUA(33.2)不等。Lc18SRNA的Ct值最低，表现出最高的表达水平，而TUA的Ct值最高，意味着最低的表达水平。Lc18SRNA的表达变异最小，TUA的表达变异最高。

实施例3候选内参基因的表达稳定性分析

分别用BestKeeper、比较delta-Ct法、geNorm和NormFinder程序对10种组织中11个候选参考基因的表达稳定性进行了评估。

1.BestKeeper根据标准差(SD)和变异系数(CV)值对候选参考基因进行排序，结果见图4中A图和表2。BestKeeper分析结果显示，CV±SD最低的是Lc18SRNA为3.25±0.50，表明该基因是最稳定的内参基因，其次是DNAJ为3.76±0.82，而TUA为17.78±4.34，CV±SD最高，是最不稳定的基因，其次是GAPDH为7.23±1.58。

表2候选基因稳定性分析

2.根据比较delta-Ct方法，SD值较低的基因表现出较高的表达稳定性，结果见图4中B图和表2。β-ACTIN是所有样本中最稳定的内参基因，其STDEV值的平均值最低为1.43，其次是PP2A为1.45，而TUA的稳定性最低，STDEV值的平均值最高为4.92。

3.GeNorm通过计算稳定性值(M)来评价候选参考基因的稳定性，M值最低的基因被认为是最稳定的，结果见图4中C图和表2。对于不同的组织，geNorm将β-ACTIN和PP2A作为最佳参考基因对，M值为0.51，而TUA是最不稳定的参考基因，M值为1.88，这些结果与比较delta-Ct法得到的结果相似。

4.利用NormFinder程序，根据各基因间的变异情况，评价参考基因的稳定性，结果见图4中D图和表2。最稳定的参考基因的稳定性值最低。EF1α被认为是最适合的内参基因，稳定性值最低为0.47，其次是PP2A和β-ACTIN，稳定性值分别为0.51和0.60。同时，TUA是最不稳定的参考基因，稳定值为4.85。

5.最后，利用RefFinder基于上述四个程序的候选参考基因的综合排名，结果见图4中E图和表2。根据结果，PP2A是最稳定的参考基因，稳定性值最低为2.00，其次是β-ACTIN，稳定性值为2.14；TUA是最不稳定的参考基因，稳定性值最高，为11.00。

6.根据RefFinder的结果，用两个最稳定的参考基因(PP2A和β-ACTIN)和最不稳定的参考基因(TUA)对1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶基因(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase，ACS)的表达谱进行了分析，具体结果见图5。结果表明，用PP2A和β-ACTIN单独或联合作为内参照物时，样本中ACS的相对表达谱非常相似。然而，当使用最不稳定的参考基因(TUA)对数据进行标准化处理时，ACS的表达模式有很大的不同。因此，PP2A为稳定可靠的内参基因，其次为β-ACTIN。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 丝瓜的内参基因及其引物和应用

<130>

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 921

<212> DNA

<213> PP2A

<400> 1

atgccgtctc acgcggatct ggaccgtcag atcgagcatc tgatggagtg caagccgttg 60

tcggaagcgg aggtgaaaat actgtgtgat caggcgagag cggttctggt cgaggagtgg 120

aacgtgcagc cggttaagtg tccggtgacg gtctgcggtg atattcatgg ccaattttac 180

gatctcattg aactgttccg gataggaggc cgtactcccg atactaatta ccttttcatg 240

ggtgattacg tggatcgtgg gtactactct gtcgagacgg ttactcttct agtggctctg 300

aaagttcgtt atagagatag aattacaata ttaaggggaa atcatgagag ccgacagata 360

actcaagtgt atggctttta tgatgaatgc ttgagaaaat atggaaatgc caatgtctgg 420

aaacacttca ccgatctttt cgattaccta cctcttacag ctctagttga gagtcaggtt 480

ttctgtttac atggaggact ttctccatca ttggatacct tggataacat ccgctcgttg 540

gaccgcatac aggaggtccc ccatgagggg ccaatgtgtg atctcttgtg gtctgatcca 600

gatgaccggt gtggatgggg aatatctcca cgtggtgctg gctatacatt tggtcaggat 660

atagctgctc agttcaatca tacaaatggg cttactctta tatccagggc acaccaactt 720

gtcatggaag gatacaactg gtgtcaggat aagaacgtgg tgactgtctt tagtgctcca 780

aattattgtt atcgatgtgg gaatatggcc gcaatactgg aaattgggga gactatggat 840

cagaattttc tacaatttga cccagctcct cggcaaattg agcctgatac cacacgcaag 900

actcctgatt attttttgtg a 921

<210> 2

<211> 1134

<212> DNA

<213> β-ACTIN

<400> 2

atggccgatg ctgaggatat ccagccactt gtttgcgata atggtaccgg aatggtgaag 60

gctggatttg ctggtgatga tgctcccagg gcagtgtttc ccagtattgt tggtcgaccc 120

cgacacaccg gtgtcatggt gggtatgggc cagaaagatg cttatgttgg tgatgaggcc 180

caatccaaaa gaggtattct taccttgaaa tatccaattg agcatggtat tgtcagcaac 240

tgggatgata tggaaaagat ttggcatcac acattctaca atgagcttcg tgttgcacct 300

gaagaacacc cagtgcttct tactgaagct cctctcaatc ctaaagccaa cagagaaaag 360

atgacacaaa tcatgtttga gacttttaat gtacctgcca tgtatgttgc catccaggcc 420

gttctatctc tgtatgccag tggtcgtaca acaggtattg tgctggactc tggtgatggt 480

gtcagtcaca ctgtgccaat ctatgagggt tatgctctac cccatgctat ccttcgtctg 540

gaccttgctg gtcgtgattt aactgatgct ttgatgaaga ttctcactga gagagggtac 600

atgttcacaa ccactgccga acgggaaatt gtccgtgaca tgaaagagaa gcttgcttat 660

gttgcactcg actatgagca ggaacttgag actgctaaga gtagctcctc aattgagaag 720

aactacgaac tgcctgatgg acaagtcatc acaattggag ctgagagatt ccgttgcccc 780

gaagttcttt tccagccatc cctcatcgga atggaagctg ctggaatcca cgagactacc 840

tacaactcaa ttatgaagtg tgatgtggat atcagaaaag atttgtatgg taacattgtt 900

ctcagtggtg gttcgaccat gttccctggt attgctgacc gaatgagcaa agagatcaca 960

gctcttgctc ccagcagcat gaaaattaag gtcgttgcac cacccgaaag gaaatacagt 1020

gtctggattg gagggtcaat ccttgcatcg ctcagcacct tccagcagat gtggatctcg 1080

aagggcgagt atgacgaatc tggcccatcc atcgtccaca ggaagtgctt ctaa 1134

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtacaactgg tatcgtgctg 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aggtccaaac ggagaatt 18

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agatttgtat ggtaacattg ttctca 26

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acactgtatt tcctttcggg tg 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catcatccca actgaccgac 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgtgcatttc ttcatcttcc tc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gctctccttg cttttaccct tg 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gacgatttca tcataccttg cct 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgtattggag gcaaaagtgt gg 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttaatggctc tggtacgcag tg 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtccattcca tcaccgcaac 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcaggcagca ctttacccac 20

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctagtggctc tgaaagttcg ttatag 26

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

catacacttg agttatctgt cggc 24

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tacaaaactt ctaccccgag ca 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggcattacga cctttaccac aa 22

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gaatcagaaa gctggctgat aac 23

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tgacaaacgc tccaaaagga 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

aggcttcgtg gtggtatcat tg 22

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gcacttgcga catatcatct tgt 23

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gtgttcttcg gaatgactgg 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

atcgtttacg gcatggacta 20

Claims

1.扩增PP2A的引物在检测丝瓜内参基因中的应用。

2.扩增PP2A的引物在制备检测丝瓜内参基因的试剂中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述扩增PP2A的引物的核酸序列为：

PP2A-F：CTAGTGGCTCTGAAAGTTCGTTATAG（SEQ ID No.15）；

PP2A-R：CATACACTTGAGTTATCTGTCGGC（SEQ ID No.16）。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述PP2A的序列如SEQ ID No.1所示。

5.试剂盒在检测丝瓜内参基因中的应用，所述试剂盒包含用于扩增PP2A的引物，用于扩增PP2A的引物的核苷酸序列为：

PP2A-F：CTAGTGGCTCTGAAAGTTCGTTATAG（SEQ ID No.15）；

PP2A-R：CATACACTTGAGTTATCTGTCGGC（SEQ ID No.16）。