CN111676231A - 一种丝瓜内参基因tub及其引物和应用 - Google Patents

一种丝瓜内参基因tub及其引物和应用 Download PDF

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陈敏氡
王彬
温庆放
李永平
刘建汀
叶新如
曾美娟
张前荣
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Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种丝瓜内参基因TUB及其引物和应用。丝瓜内参基因TUB核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。利用该基因序列设计的丝瓜实时荧光定量PCR引物如SEQ ID No.2‑3所示。本发明利用BestKeeper，GeNorm，NormFinder和RefFinder分析软件和Delta Ct法对TUB基因的稳定性进行评价，内参基因TUB在过氧化氢和干旱胁迫条件下最稳定。本发明所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，具有很高稳定性、可靠性和重复性，为丝瓜过氧化氢和干旱胁迫等逆境胁迫下相关功能基因的精确定量提供有力支持，提高了研究的稳定性、重复性和可靠性。

Description

一种丝瓜内参基因TUB及其引物和应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种丝瓜内参基因TUB及其引物和应用。
背景技术
丝瓜(Luffa cylindrica.L)是中国重要的夏季蔬菜之一，具有营养价值高、适应性广、耐热、耐湿、抗逆性强等优点，同时兼具药用功能，因此，种植丝瓜具有很大的商业价值和巨大的市场潜力。然而，在栽培过程中丝瓜植株时常会受到多种逆境胁迫的影响。因此，提高植株自身对逆境胁迫的抗逆性是丝瓜育种工作的重要目标之一。
随着分子生物学研究的不断发展，功能基因研究已成为植物抗逆育种的重要手段，基因表达分析则是植物功能基因研究的基础。为了避免不同样本初始模板量、RNA提取、酶促反应等背景误差，通常在基因表达分析中需要利用内参基因进行数据校正和标准化。理想的内参基因应该在不同组织类型、不同生长阶段及不同环境条件下保持表达水平恒定。然而，近来的研究表明，适用于所有不同试验条件的内参基因并不存在。若只选取一种内参基因作为通用的内参基因，可能造成定量不准确甚至出现错误的实验结果。因此，根据实验条件和实验材料筛选合适的内参基因，已成为应用实时荧光定量PCR进行基因组功能分析的重要前提。
目前，丝瓜的内参基因仅有18Sr RNA基因，其它内参基因的克隆及内参基因稳定性筛选的研究未见报道，因此，在丝瓜逆境胁迫基因表达研究中尚缺合适的内参基因。本发明通过从丝瓜转录组数据获得内参基因TUB，利用BestKeeper，GeNorm，NormFinder和RefFinder分析软件和Delta Ct法对该基因的稳定性进行评价，表明该基因适用于丝瓜过氧化氢和干旱胁迫下基因表达研究，并用该基因为基础设计了实时荧光定量PCR引物，为后续丝瓜功能基因的精确定量及功能研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丝瓜内参基因TUB及其引物和应用，具体为筛选适用于丝瓜过氧化氢和干旱胁迫下基因表达研究的内参基因，并揭露了利用该丝瓜内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
一种丝瓜内参基因TUB，所述内参基因TUB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该内参基因是在分析丝瓜转录组数据基础上，以丝瓜cDNA为模板、并以如下引物对进行PCR扩增反应所得的；
正向引物5'- ATGAGGGAAATTCTTCACGTGC-3'，
反向引物5'- CTAATTGTCGAGGTCCTCTTCTTC-3'。
进一步地，以所述内参基因的核苷酸序列为基础，利用Primer Premier 5.0 软件、并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为实时荧光定量PCR引物；且该实时荧光定量PCR引物为：
正向引物5'-GTGCTGGTAATAACTGGG-3'，
反向引物5'-GGGAAGACGGAGAAAGTA-3'。
进一步地，利用所述实时荧光定量PCR引物，采用BestKeeper，GeNorm，NormFinder和RefFinder分析软件和Delta Ct法对TUB基因的稳定性进行评价，表明TUB基因在过氧化氢和干旱胁迫条件下最稳定，可以作为研究丝瓜过氧化氢和干旱胁迫条件下基因表达的内参基因。
本发明有益效果在于：
本发明公开了一种适用于丝瓜过氧化氢和干旱胁迫基因表达研究的内参基因TUB，同时揭露了利用该丝瓜内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物及其应用。本发明的内参基因可在丝瓜响应过氧化氢和干旱胁迫时稳定表达，所设计的实时荧光定量PCR引物用于丝瓜响应过氧化氢和干旱胁迫时的基因表达分析，可提高研究的稳定性、可靠性和重复性。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1 是本发明中实施例1的1%琼脂糖凝胶电泳图。
图2 是本发明中实施例2的1%琼脂糖凝胶电泳图。
图3 是本发明中实施例2的溶解曲线图。
具体实施方式
实施例1 丝瓜内参基因TUB获得
（1）从丝瓜转录组数据中获得内参基因TUB，采用Primer Premier 5.0设计一对引物，且由铂尚生物技术(上海)有限公司合成该对引物，具体地，该对引物：正向引物5'-ATGAGGGAAATTCTTCACGTGC-3'，反向引物5'- CTAATTGTCGAGGTCCTCTTCTTC-3'。
（2）总RNA提取和cDNA第1链的合成：采用通用植物RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取丝瓜叶片的总RNA。使用Thermo NanoDrop2000C（ThermoScientific）测定总RNA浓度和纯度，选择在260/280nm处的吸光度比为1.8-2.0左右的RNA样品。通过1%琼脂糖凝胶电泳评估总RNA完整性。依据PrimeScript II第1链cDNA合成试剂盒（Takara）使用说明合成cDNA第1链，–20℃冰箱保存备用。
（3）PCR扩增：以经步骤（2）处理所得的cDNA为模板，并以步骤（1）中获得的引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。
PCR反应体系：反应总体积为25 μL，包括T3 Super PCR Mix 12.5 μL、正向引物（0.4 μmol·L-1）1 μL、反向引物（0.4 μmol·L-1）1 μL、模板cDNA（100 ng）2 μL和ddH20 8.5μL。
PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸60s，35个循环；最后72℃下延伸10 min；于4℃下保存。
（4）取步骤（3）所得PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，得到如图1所示大小的片段，回收该片段并进行纯化后连接到pMD18-T载体上转化，挑取阳性克隆子，PCR检测后送至测序，所测得的序列即为内参基因的核苷酸序列，其如SEQ ID NO.1所示。
实施例2 引物设计和特异性检测
（1）以实施例1获得的内参基因的核苷酸序列为基础，利用Primer Premier5.0 软件，并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，其扩增片段为226bp，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物（如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示）：正向引物5'-GTGCTGGTAATAACTGGG-3'，反向引物5'-GGGAAGACGGAGAAAGTA-3'。
（2）采用通用植物RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取丝瓜叶片的总RNA。依据PrimeScript II第1链cDNA合成试剂盒（Takara）使用说明合成cDNA第1链，-20℃冰箱保存备用。
（3）常规PCR检测：以经步骤（2）处理所得的cDNA为模板，并以步骤（1）中获得的引物对进行常规PCR扩增反应，且PCR扩增的反应体系与反应程序如下：
PCR反应体系：反应总体积为25 μL，包括T3 Super PCR Mix 12.5 μL、正向引物（0.4 μmol·L-1）1 μL、反向引物（0.4 μmol·L-1）1 μL、模板cDNA（100 ng）2 μL和ddH20 8.5 μL。
PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸60s，35个循环；最后72℃下延伸10 min；于4℃下保存。
所得PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示；由图2可知，PCR扩增得到一条单一条带，没有发现引物二聚体和非特异性扩增（图2），经测序大小为226bp，符合预期大小，表明该引物特异性较好、可信度高，可用于qRT-PCR分析。
（4）qRT-PCR检测：以经步骤（2）处理所得的cDNA为模板，并以步骤（1）中获得的引物对进行qRT-PCR扩增反应。利用ABI7500实时定量PCR仪，按照 SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒进行PCR扩增，PCR 反应的反应体系与反应程序如下：
PCR反应体系为：2×SYBR® Premix Ex TaqTM 10 μL，100 ng cDNA 模板2 μL，10 μmol·L-1正反引物各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，补ddH20至20 μL。
PCR反应程序为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸30 s，40个循环；延伸阶段收集信号，从60 ℃到95 ℃，采集熔解曲线荧光信号。
反应的结果如图3（其中ΔRn指荧光强度）所示，从图3可以看出，该内参基因表现出单峰熔化曲线，说明引物具有很高的特异性，并且扩增曲线重复性好，说明qRT-PCR结果准确可靠，可以用于表达稳定性分析。
实施例3 内参基因TUB在过氧化氢处理下表达稳定性分析
选择健壮且长势相同的丝瓜幼苗，利用100 μmmol·L-1过氧化氢喷洒处理0、2、6、12和24 h，摘取处理后的幼苗叶片立即用液氮速冻，置于-80℃超低温冰箱。提取样品的总RNA，并分别按照PrimeScript II第1链cDNA合成试剂盒（Takara）使用说明合成cDNA第1链。
以合成的样品cDNA为模板，以7个内参基因（肌动蛋白基因（ACTIN）、α-微管蛋白基因（TUA）、β-微管蛋白基因（TUB）、延伸转录因子（EF-1α）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）、泛素蛋白基因（UBQ）和18S核糖体RNA基因（18S rRNA））的荧光定量引物对(实施例2所述引物对)进行qRT-PCR扩增反应，扩增体系与扩增程序如下：
PCR扩增体系：2×SYBR® Premix Ex TaqTM 10 μL，100 ng cDNA 模板2 μL，10 μmol·L-1正反引物各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，补ddH20至20 μL。
PCR扩增程序为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸30 s，40个循环；最后72℃下延伸5 min；于4℃下保存。
利用BestKeeper、GeNorm、NormFinder和RefFinder等软件和Delta Ct法对7个候选内参基因的稳定性进行评估。GeNorm软件通过计算每个内参基因的稳定值（M）来筛选出稳定性较好的内参基因，当 M<1.5时，被认为可以作为内参基因，M值越小，稳定性越高。NormFinder软件通过计算待选内参基因的稳定值（SV），将SV值最小的基因作为最稳定基因。BestKeeper 软件通过计算Ct值的标准偏差（SD）来筛选最稳定的内参基因，其中SD值越小，稳定性越好；反之，稳定性越差。Delta Ct法通过计算ΔCt值来评价内参基因的稳定性，ΔCt值越小内参基因越稳定。RefFinder软件能够整合上述4种分析方法，对各基因单独使用4种分析方法评价时的排名计算几何平均值，得出综合排名情况，以筛选出稳定性较好的内参基因。
GeNorm分析结果表明，在过氧化氢处理中，UBQ和18S rRNA的稳定性最好，GAPDH的稳定性最差（表1）；NormFinder分析结果表明，在过氧化氢处理下，表达最为稳定的内参基因是TUB，表达最不稳定的是GAPDH（表2）；BestKeeper分析结果表明，在过氧化氢处理中，表达最为稳定的候选内参基因是TUB，最不稳定的内参基因是GAPDH（表3）；Delta Ct分析结果表明，在过氧化氢处理中，表达最为稳定的内参基因是TUB，表达最不稳定的是GAPDH（表4）；整合上述4种分析方法，得出7个内参基因在过氧化氢处理中表达的稳定性排名为TUB>UBQ>EF-1α>ACT>18S rRNA>TUA>GAPHD（表5）。因此，确定TUB是过氧化氢处理下丝瓜中最稳定的内参基因。
实施例4 内参基因TUB在干旱处理下表达稳定性分析
选择健壮且长势相同的丝瓜幼苗，利用15%PEG 6000喷洒处理0、2、6、12和24 h，摘取处理后的幼苗叶片立即用液氮速冻，置于-80℃超低温冰箱。提取样品的总RNA，并分别按照PrimeScript II第1链cDNA合成试剂盒（Takara）使用说明合成cDNA第1链。
以合成的样品cDNA为模板，与7个内参基因（ACTIN、TUA、TUB、EF-1α、GAPDH、UBQ和18S rRNA）的荧光定量引物对(实施例2所述引物对)进行qRT-PCR扩增反应，扩增体系与扩增程序如下：
PCR扩增体系：2×SYBR® Premix Ex TaqTM 10 μL，100 ng cDNA 模板2 μL，10 μmol·L-1正反引物各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，补ddH20至20 μL。
PCR扩增程序为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸30 s，40个循环；最后72℃下延伸5 min；于4℃下保存。
利用BestKeeper、GeNorm、NormFinder和RefFinder等软件和Delta Ct法对7个候选内参基因的稳定性进行评估。
GeNorm分析结果表明，在干旱处理中，ACT和18S rRNA的稳定性最好，GAPHD的稳定性最差（表1）；NormFinder分析结果表明，在干旱处理下，表达最为稳定的内参基因是TUB，表达最不稳定的是GAPHD（表2）；BestKeeper分析结果表明，在干旱处理中，表达最为稳定的候选内参基因是TUB，最不稳定的内参基因是GAPHD（表3）；Delta Ct分析结果表明，在干旱处理中，表达最为稳定的内参基因是TUB，表达最不稳定的是GAPHD（表4）；整合上述4种分析方法，得出7个内参基因在干旱处理中表达的稳定性排名为TUB>18S rRNA>ACT>UBQ>TUA>EF-1α>GAPHD（表5）。因此，确定TUB是干旱处理下丝瓜中最稳定的内参基因。
表1 GeNorm软件分析7个候选内参基因在丝瓜不同逆境胁迫下的表达稳定性
Figure 124826DEST_PATH_IMAGE001
表2 NormFinder软件分析7个候选内参基因在丝瓜不同逆境胁迫下的表达稳定性
Figure 118452DEST_PATH_IMAGE002
表3 BestKeeper软件分析7个候选内参基因在丝瓜不同逆境胁迫下的表达稳定性
Figure 422395DEST_PATH_IMAGE003
表4 Delta Ct法分析7个候选内参基因在丝瓜不同逆境胁迫下的表达稳定性
Figure 759835DEST_PATH_IMAGE004
表5 7个候选内参基因在丝瓜不同逆境胁迫下表达稳定性的综合评价
Figure 465623DEST_PATH_IMAGE005
综上，本发明提供了一种适用于丝瓜过氧化氢和干旱胁迫基因表达研究的内参基因TUB，同时揭露了利用该丝瓜内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物本发明的内参基因可在丝瓜响应过氧化氢和干旱胁迫时稳定表达，所设计的实时荧光定量PCR引物用于丝瓜响应过氧化氢和干旱胁迫时的基因表达分析，可提高研究的稳定性、可靠性和重复性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院作物研究所
<120> 一种丝瓜内参基因TUB及其引物和应用
<130> 5
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgagggaaa ttcttcacgt gcaaggaggt cagtgtggta accagatcgg atccaagttt 60
tgggaagttt tgtgtgatga acatggcata gatcctaccg gccgatacac tggaacctcc 120
gatttgcaac ttgaacgtgt aaatgtgtac tacaatgagg cttcttgcgg acgttatgtc 180
cctcgtgctg tgctcatgga tctcgagcct ggtaccatgg acagtgtgag aacgggtcct 240
tatggacaaa tcttcaggcc ggacaatttc gtttttgggc aatctggtgc tggtaataac 300
tgggccaagg ggcattacac agaaggagca gaactcaatg atgccgtgct tgatgttgtg 360
agaaaggaag ccgagaactg tgattgtctt caaggtttcc aagtgtgcca ttcacttggt 420
ggcggcactg gttctggaat ggggactctg ctgatttcca aaatcagaga agaatatccg 480
gacaggatgt tgcttacttt ctccgtcttc ccttcaccaa aagtgtcaga tacagttgta 540
gagccgtaca atgccacact ttccgttcac cagctcgttg agaacgcaga tgagtgcatg 600
gtgctggaca atgaagcatt atatgatatt tgcttcagga ctctcaagtt aactactcct 660
agctttggag atctcaacca tttaatttct gctacaatga gtggggtgac atgctgtctc 720
agatttcctg gccagcttaa ctctgacctc agaaaacttg ctgtgaatct aattcccttt 780
cctcgtctac acttctttat ggtggggttt gctcctctta cctcacgtgg gtcacagcta 840
tatagggcgc tgaccgtccc agagttgaca cagcaaatgt gggattctaa aaacatgatg 900
tgtgctgcag atccacgcca tggccgatac ctcactgcct ctgcgatgtt caggggcaag 960
atgagtacca aagaagttga tgaacagatg atcaatgttc agaacaagaa ttcctcatac 1020
ttcgtcgaat ggattccaaa caatgttaaa tccagcgtct gtgacattgc tcctaaagga 1080
cttaccatgg catcaacctt cattggaaac tcaacctcca ttcaggaaat gttcaggcgt 1140
gtgagcgagc agttcactgc catgttcagg aggaaggctt tcttgcactg gtacactgga 1200
gaaggaatgg acgaaatgga gttcactgag gcagaaagca atatgaatga tctggtttct 1260
gagtatcagc agtaccagga cgctacagct gatgaggagt ataattacga agatgaagaa 1320
gaagaagaag aagaggacct cgacaattag 1350
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtgctggtaa taactggg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gggaagacgg agaaagta 18
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgagggaaa ttcttcacgt gc 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctaattgtcg aggtcctctt cttc 24

Claims (4)

1.一种丝瓜内参基因TUB，其特征在于：所述内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；且该内参基因是在分析丝瓜转录组数据基础上，以丝瓜cDNA为模板、并以如下引物对进行PCR扩增反应所得的；所述引物对序列为：
正向引物5'- ATGAGGGAAATTCTTCACGTGC-3'，
反向引物5'- CTAATTGTCGAGGTCCTCTTCTTC-3'。
2.一种丝瓜内参基因TUB的实时荧光定量PCR引物，其特征在于：以权利要求1中所述内参基因的核苷酸序列为基础，设计出一对荧光定量特异引物，即为实时荧光定量PCR引物；引物具体序列为：
正向引物5'-GTGCTGGTAATAACTGGG-3'，
反向引物5'-GGGAAGACGGAGAAAGTA-3'。
3.如权利要求1所述的丝瓜内参基因TUB在丝瓜过氧化氢和干旱胁迫条件下基因表达分析中的应用。
4.如权利要求2所述的实时荧光定量PCR引物在丝瓜过氧化氢和干旱胁迫条件下基因表达分析中的应用。
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