KR20210066949A - 감소된 혈관 누출 증후군에 대한 사이토카인 유도체 치료 - Google Patents

감소된 혈관 누출 증후군에 대한 사이토카인 유도체 치료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고용량의 인터류킨-2로 얻어지는 증식보다 높거나 같은 자연 살해 세포의 증식을 유도하기 위한 용량의 IL-15 유도체 컨쥬게이트를 대상체에 투여하여 암, 감염을 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다; 결국 약학적으로 허용가능한 담체 (carrier)와 관련된다.

Description

감소된 혈관 누출 증후군에 대한 사이토카인 유도체 치료 {CYTOKINE DERIVED TREATMENT WITH REDUCED VASCULAR LEAK SYNDROME}
본 발명은 새로운 약학적 조성물 및 이와 관련된 대상체에서 암(cancer) 및/또는 감염(infection)을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 국제특허출원은 본 명세서에서 참조로 인용된 2013년 4월 9일에 제출된 유럽특허출원 EP 13002066.2의 우선권을 주장한다.
지난 수년간 면역 시스템의 불능을 극복하기 위해 종양 또는 미생물의 나타나는 것을 막거나 종양 또는 미생물의 침입에 대해서 효과적으로 보호하기 위한 면역치료 (Immunotherapy)가 발전되고 있다.
면역치료 중에서, 사이토카인에 기초를 둔 것은 특히 흥미롭다. 이러한 분자 (수용성 분자)는 호르몬성 및/또는 세포성 면역을 조절한다. 이들 중에서 IL-2, IL-7, IL-12 및 IL-15는 NK 세포 생존 및/또는 증식을 유도하기 때문에 더 특히 흥미롭다; 따라서, 감염 또는 암을 치료하는데 아쥬반트가 된다.
예를 들어, 인간 rIL-2는 전이성 흑색종 또는 신장 암 (renal carcinoma)의 환자의 25-30%에서 종양 퇴행이 발생하는 것으로 나타났다. 간헐적으로 IL-2 치료는 또한 HIV-감염된 환자에서 고활성 항 레트로바이러스 치료와 함께 CD4+ T 림프구의 보호 수준의 지속적인 복원으로 사용되었다.
그럼에도 불구하고, 혈관 누출 증후군 (VLS)과 같이 분명하게 나타나는 용량-의존적 세포독성 때문에 이러한 사이토카인의 사용은 제한적이며, VLS는 증가된 혈관 투과성과 감소된 미세순환계 관류의 특성을 갖고, IL-2 투여 후 2-24시간 내에 다중 장기 실패 및 간질부종을 유발한다.
사이토카인-유도된 VLS의 메커니즘 분석은 VLS의 몇몇 단계에서 사이토카인 유도된-NK 세포의 함축을 입증해 왔다 (ASSIER et al., Cytokines, vol.32(6), p:280-6, 2005). VLS는 Treg 세포의 결실에 의해 두드러지기 때문에 T 세포의 VLS 암시 또한, 입증되어 왔다 (KOTTKE et al., Mol. Ther., vol.16(7), p:1217-26, 2008).
마지막으로, 사이토카인의 사용은 허용할 수 없는 또는 치명적인 VLS를 유도하지 않기 위해, 실제적으로 최대 NK 세포 증식 유도하는데 제한된다.
이러한 필요성 및 안전상의 문제 때문에, 사이토카인의 고용량의 사용은 실제적으로 말기의 전이성 암, 만성 감염으로 제한된다.
이제, 본 발명자들은 놀랍게도 hIL-15 아미노산 서열을 포함하는 그들의 분자 (RLI)가 IL-15 또는 IL-2과 비교해서 매우 다른 안정성을 보이고, RLI 안정성이 훨씬 유리하다는 사실을 입증하였다. 마지막으로, 그들의 결과는 RLI는 IL-2 및 IL-15 모두에 대해 생각할 수 없는 치료적 윈도우(therapeutic window)로 사용될 수 있다는 사실을 입증하였다.
이러한 안정성은 나쁜 예후 (bad prognosis)와 관련된 질병을 치료하기 위한 고용량의 RLI 사용과 정확한 (correct) 또는 좋은 예후 (good prognosis)와 관련된 질병을 치료하기 위한 최저의 RLI 사용을 가능하게 한다.
그러므로, 첫 번째 측면에서 본 발명은 고용량의 인터류킨-2 (High Dose of interleukin-2, HDIL-2)로 얻어지는 증식 보다 높거나 같은 자연 살해 세포 (NK cell)의 증식을 유도하기 위한 용량의 컨쥬게이트를 대상체에 투여하여 대상체의 암 (cancer), 감염 (infection), 또는 면역결핍 장애 (immunodeficiency disorder)를 치료하기 위한 조성물에 관한 것이고, 상기 컨쥬게이트는
a) 인터류킨 15 또는 이의 유도체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및
b) IL-15Rα의 스시 도메인 (Sushi domain) 또는 그 유도체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 HDIL-2로 얻어지는 증식보다 높거나 같은 자연 살해 세포 (NK cell)의 증식을 유도하기 위한 용량의 컨쥬게이트를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 암 (cancer), 감염 (infection), 또는 면역결핍 장애 (immunodeficiency disorder)를 치료하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 컨쥬게이트는
a) 인터류킨 15 또는 이의 유도체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및
b) IL-15Rα의 스시 도메인 (Sushi domain) 또는 그 유도체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
바람직하게, 상기 컨쥬게이트 또한 HDIL-2로 얻어진 증식보다 더 높은 CD8 T 세포 (CD8 T cell)의 증식을 유도하는 용량으로 투여된다.
*세 번째 바람직한 구체예에서, 상기 컨쥬게이트는 HDIL-2로 얻어진 증식보다 더 적은 Treg 세포 (Treg cell, FoxP3+CD4+CD25high)의 증식을 유도하는 용량으로 대상체에 투여된다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 암 (cancer)으로부터, 감염 (infection)으로부터 또는 면역결핍 장애 (immunodeficient disorder)로부터 고통받는 대상체에 투여되는 컨쥬게이트의 치료적으로 유효한 용량을 결정하기 위한 (인비트로) 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다;
i) 상기 대상체로부터 얻어진 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 증가한 (increasing) 용량의 앞에서 정의된 상기 컨쥬게이트와 상기 PBMC의 증식을 가능하게 하는 배양 조건 (culture condition)에서 접촉하는 것;
ii) HDIL-2와 대상체로부터 얻어진 다른 PBMC를 상기 PBMC의 증식을 가능하게하는 배양조건에서 접촉하는 것;
iv) HDIL-2로 얻어진 증식보다 높거나 같은 NK 세포 (NK cell)의 증식을 유도하는 치료적으로 유효한 용량의 컨쥬게이트를 선택하는 것.
더욱 바람직하게, 상기 용량의 컨쥬게이트는 증식 Treg 세포 (Treg cell)에 대한 증식 NK 세포 (NK cell) 및/또는 CD8 T 세포 (CD8 T cell)의 백분율의 비율(ratio)을 유도하고, 이것은 HDIL-2로 얻어진 것보다 적어도 25% 더 높은; 바람직하게 적어도 50% 더 높은; 더욱 바람직하게 적어도 75% 더 높다.
도 1 IL-2 및 IL-15와 비교해서 사람 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 RLI의 인비트로 (in vitro) 용량-효과(dose-effect)를 보여준다.
도 2는 IL-2 및 IL-15와 비교해서 사람 Treg 모집단 (subpopulation)에서 RLI의 인비트로 (in vitro) 효과를 보여준다.
도 3은 Mus musculus 주입의 프로토콜을 보여준다.
도 4 PBS, IL-2, IL-15 또는 RLI이 투여된 마우스에서 NK 세포 (NK cell), CD8+ T 세포, Foxp3+ CD4+ T 세포 및 Foxp3- CD4+ T 세포를 증식하는 비율 (proportion)을 나타낸다.
도 5는 PBS, IL-2, IL-15 또는 RLI가 투여된 마우스(mouse)에서 Foxp3+ T 세포 (Treg cell)에 대한 NK 세포 (NK cell)의 증식하는 비율을 나타낸다.
도 6은 NK 세포 (NK cell), CD8+ T 세포 (CD8+ T cell) 및 CD4+ T 세포 (CD4+ T cell) 중에서 IFN 생산하는 세포의 백분율를 나타내고, PBS, IL-2, IL-15 또는 RLI가 투여된 마우스의 YAC-1 세포주에 대해서 상기 NK 세포 (NK cell) 독성을 나타낸다.
도 7은 PBS, IL-2, IL-15 또는 RLI와 공여 세포가 함께 투여된 마우스에서 공여 세포 (donor cell), MP CD8+ T 세포 (CD8+ T cell), 및 NK 세포 (NK cell)의 전체 세포 수를 보여준다.
도 8은 PBS, IL-2, IL-15 또는 RLI와 공여 세포가 함께 투여된 마우스에서 VLS를 나타낸다.
도 9는 사이토카인 요법 (cytokine regimen)에 따른 종양 볼륨의 변화 (evolution)를 나타낸다.
도 10은 시간에 따른 투여 용량에 따라 마카크 (macaque) 혈액에서 RLI 농도의 관찰된 변화와 모델화된 (modelized) 변화를 나타낸다.
도 11은 PBS, IL-2, IL-15, 및 RLI가 투여된 마우스에서 유도된 NK 및 CD8 세포 증식 대 VLS를 나타낸다.
도 12는 PBS와 비교해서 동몰 용량 (equimolar dose)의 RLI, IL-2 및 IL-15의 건강한 공여자의 PBMC로부터 NK 세포 (NK cell) 및 CD8 T 세포 (CD8 T cell)에 대한 3, 4, 5, 6, 및 7일째의 in vitro 증식 효과와 보여준다.
도 13은 NK 세포 팽창 (NK cell expansion)에 대한 RLI의 용량-반응 효과를 나타낸다.
도 14는 간과 폐에서 VLS에 대한 RLI의 용량-반응 효과를 나타낸다.
도 15는 폐에서 VLS에 대한 RLI의 용량-반응 효과를 나타낸다.
도 16은 NK 세포 팽창 (NK cell expansion)에 대한 RLI의 용량-반응 효과를 나타낸다.
도 17은 Treg 세포 팽창 (Treg cell expansion)에 대한 RLI의 용량-반응 효과를 나타낸다.
도 18은 NK 세포 대 Treg 세포 백분률의 비율에 대한 RLI의 용량-반응 효과를 나타낸다.
도 19는 RLI에 대한 독성 대 약리효능을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "대상체 (subject)"는 포유동물, 예를 들어 설치류 (rodent), 고양이과 (feline), 개 (canine) 또는 영장류 (primate), 그리고 가장 바람직하게는 인간을 의미한다.
기술분야에서 일반적인 의미에서의 용어 "컨쥬게이트 (conjugate)" 그리고 용어 "컨쥬게이트 (conjugate)"는 공유 결합 또는 비공유 결합 컴플렉스, 바람직하게는 공유 결합 컴플렉스 그리고 가장 바람직하게는 융합 단백질 (fusion protein)을 나타낸다.
용어 "interleukin 2"는 기술분야에서 일반적인 의미 (핵산 및 아미노산 서열에 대해, 각각 수탁 번호 NM_000586.3 및 NP_000577.2를 참조)로 사용된다.
표현 "고용량의 인터류킨-2 (high dose of interleukin-2)" 또는 "HDIL-2"는 통상의 기술자에게 잘 알려져있다. 고용량의 IL-2 (매 8시간 IV에 의한 600,000-720,000 IU/kg)이 미국에서 가장 일반적으로 사용되는 요법 (regimen) 이다. 예를 들어, 전이성 신장 세포 암종 (metastatic renal cell carcinoma) 또는 흑색종 (melanoma, 6개월 미만의 중간 예후를 갖는 암)의 치료를 위한 식품 의약품 안전청 (FDA)-승인 복용량 (dosage)은 최대 14 도즈(dose)에 대해 매 8시간 마다 15분 이상 정맥 볼루스 (IV bolus) 투여되는 600,000 IU/kg이다. 9일 이후에, 만약에 환자가 견뎌내면, 상기 요법 (regimen)이 반복된다. 독성은 줄일 수 있지만, 효과가 줄어들 수 있기 때문에 낮은-도즈 피하의 IL-2 (1-30 million IU/m2/d) 요법 (regimens)가 연구되어 왔다 (Fyfe, FishER & Rosenberg et al., J. Clin. Oncol., vol.13, p:668-696, 1995). 프로류킨 (Proleukin®) 생물학적 역가 ( biological potency)는 림프구 (lymphocyte) 증식 생물학적 검정에 의하여 결정되고, 인터류킨-2 (인간)에 대한 세계 보건기구 (WHO)의 첫 번째 국제 표준에 의하여 만들어진 국제 단위에 의해서 기술된다. 역가 (potency)와 단백질 질량 (protein mass) 사이의 관계는 다음과 같다: 1,800 만 국제 단위 프로류킨 (Proleukin) = 1.1 mg의 단백질 (protein).
법적 당국 (예: FDA, EMA 등)은 다른 치료법 (alternative treatment)이 없는 상황에서 치명적인 질병 (예: 전이성 신장 세포 암종 또는 흑색종)의 환자의 생존을 증가시키는 치료법에 대해서 더 많은 부작용을 용인한다는 사실을 주의해야 한다.
상기 용어 "인터류킨 15 (interleukin 15)"는 기술분야에서 일반적인 의미를 가지고 IL-2와 구조적인 유사성을 갖는 사이토카인 (cytokine)을 나타낸다 (Grabstein et al., Science, vol.264(5161), p:965-968, 1994). 또한, 이 사이토카인 (cytokine)은 IL-15, IL15 또는 MGC9721로 알려져 있다. 이 사이토카인 및 IL-2는 많은 생물학적 활성을 공통으로 가지고, 공통의 헤마토포이에틴 수용체 서브유닛 (hematopoietin receptor subunit)에 결합하는 것이 발견되었다. 따라서, 이들은 동일한 수용체에 대해서 경쟁하면서, 각각 서로의 활성을 음성적으로 (negatively) 조절할 것이다. IL-15가 T 세포와 자연 살해 세포의 활성화 및 증식을 조절한다는 사실과, CD8+ 기억 세포의 수 (CD8+ memory cell)는 IL2와 이 사이토카인 사이에서 균형에 의하여 조절되는 것이 보여진다는 사실이 밝혀져 왔다. 실시예에 기재된 바와 같이, IL-15 활성은 kit225 세포주에서 증식 유도를 결정함으로써 측정될 수 있다 (HORI et al., Blood, vol.70(4), p:1069-72, 1987).
상기 IL-15 또는 그 유도체는 kit225 세포주의 증식 유도에 대해서 인간 인터류킨-15의 활성의 적어도 10 %, 바람직하게 적어도 25 %, 그리고 더욱 바람직하게 적어도 50%를 갖는다.
상기 인터류킨 15는 포유류 인터류킨 15, 바람직하게는 영장류 인터류킨 15, 더욱 바람직하게는 인간 인터류킨 15이다.
포유류 인터류킨 15는 통상의 기술자에 의하여 간단하게 동정될 수 있다. 예를 들어, 인터류킨 15는 서스 스크로파 (Sus scrofa, Accession number ABF82250), 라투스 노르베지쿠스(Rattus norvegicus, Accession number NP_037261), 머스 머스쿨러스 (Mus musculus, Accession number NP_032383), 보스 타우루스 (Bos Taurus, Accession number NP_776515), 오릭토라구스 쿠니쿨러스 (Oryctolagus cuniculus, Accession number NP_001075685), 오비에스 아리에스 (Ovies aries, Accession number NP_001009734), 펠리스 카투스 (Felis catus, Accession number NP_001009207), 마카카 파스시쿨라리스 (Macaca fascicularis, Accession number BAA19149), 호모 사피엔스(Homo sapiens, Accession number NP_000576), 마카카 물라타 (Macaca Mulatta, Accession number NP_001038196), 카비아 포르셀루스 (Cavia porcellus, Accession number NP_001166300), 또는 클로로세부스 사바에우스 (Chlorocebus sabaeus, Accession number ACI289)로부터 인용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "포유류 인터루킨 15 (mammalian interleukin 15)"는 공통 서열 (consensus sequence) 서열번호 1을 나타낸다.
영장류 인터류킨 15는 통상의 기술자에 의해 간단하게 동정될 수 있다. 예를 들어, 인터류킨 15는 서스 스크로파 (Sus scrofa, Accession number ABF82250), 오릭토라구스 쿠니쿨러스 (Oryctolagus cuniculus, Accession number NP_001075685), 마카카 파스시쿨라리스 (Macaca fascicularis, Accession number BAA19149), 호모 사피엔스 (Homo sapiens, Accession number NP_000576), 마카카 물라타 (Macaca Mulatta, Accession number NP_001038196), 또는 클로로세부스 사바에우스 (Chlorocebus sabaeus, Accession number ACI289)로부터 인용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "영장류 인터류킨 15 (primate interleukin 15)"는 공통서열 (consensus sequence) 서열번호 2를 나타낸다.
인간 인터류킨 15는 통상의 기술자에 의해 간단하게 동정 될 수 있고, 아미노산 서열 서열번호 3을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "인터류킨 15 유도체 (interleukin 15 derivatives)"는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 92.5%의 동일성 백분율 (즉, 이는 약 10개의 아미노산 치환에 상응함)을 갖는 아미노산 서열, 바람직하게는 적어도 96%의 동일성 백분율 (즉, 이는 약 5개의 아미노산 치환에 상응함)을 갖는 아미노산 서열, 더 바람직하게는 적어도 98.5%의 동일성 백분율 (즉, 이는 약 2개의 아미노산 치환에 상응함)을 갖는 아미노산 서열, 또는 적어도 99%의 동일성 백분율 (즉, 이는 약 1개의 아미노산 치환에 상응함)을 갖는 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 유도체는 당업계의 기술상식 및 본 특허출원의 개시내용을 고려하여 통상의 기술자에 의해 간단하게 동정 될 수 있다. 상기 유도체의 예로서, 국제특허출원 PCT WO 2009/135031에 개시된 유도체가 인용될 수 있다. 또한, 천연 아미노산은 화학적으로 개질된 아미노산에 의해 대체될 수 있다는 것이 이해될 수 있을 것이다. 통상적으로, 상기 화학적으로 개질된 아미노산은 폴리펩타이드 반감기를 증가시킨다.
본 명세서에서 사용된, "동일성 백분율 (동일성 백분율 (percentage of identity))"은 상기 서열들의 최고 정렬에 의해 얻어지고, 비교된 두 개의 아미노산 서열 사이에서, 동일한 아미노산의 백분율을 의미하고. 상기 백분율은 순수하게 통계적인 것이고, 상기 2개 서열 사이의 차이는 아미노산 서열에 걸쳐 랜덤하게 퍼진 것이다. 본 명세서에서 사용된, "최고 정렬 (best alignment)" 또는 "최적 정렬 (optimal alignment)"은 측정된 동일성 백분률 (하기 참조)이 가장 높은 경우의 정렬을 의미한다. 두 개의 아미노산 서열 사이의 서열비교는 최고의 정렬에 따라 미리 배열된 상기 서열들을 비교함으로써 수행되는 것이 통상적이며; 상기 비교는 국부 부위들의 유사성 (local regions of similarity)을 동정하고 비교하기 위해 세그먼트의 비교로 수행된다. 비교를 실현하기 위한 최고의 서열 정렬은 매뉴얼 방식 외에, SMITH 및 WATERMAN (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981)이 개발한 국부 상동성 알고리즘 (local homology algorithm)을 이용함으로써, NEDDLEMAN 및 WUNSCH(J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970)가 개발한 글로벌 상동성 알고리즘 (global homology algorithm)을 이용함으로써, PEARSON 및 LIPMAN(Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988)이 개발한 유사도 방법을 이용함으로써, 상기 알고리즘들을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어(GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA, Wisconsin Genetics software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA)를 이용함으로써, MUSCLE 다중 정렬 알고리즘(Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004)을 이용함으로써, 수행 될 수 있다. 최고의 국부 정렬을 얻기 위해, 바람직하게는 BLOSUM 62 매트릭스와 BLAST 소프트웨어를 이용할 수 있다. 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 최적으로 정렬된 상기 2개의 서열을 비교함으로써 결정되며, 상기 아미노산 서열은 상기 2개의 서열 사이에서 최적 정렬을 얻기 위해 기준 서열 (reference sequence)에 대한 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 상기 2개의 서열 사이에서 동일성 백분율을 얻기 위하여, 상기 동일성 백분율은 상기 2개의 서열 사이에서 동일한 위치의 수를 결정하고, 상기 수를 비교된 위치의 총 수로 나누고, 얻어진 결과를 100으로 곱함으로써 산출된다.
바람직하게, 인터류킨 15 유도체는 IL-15 아고니스트 또는 슈퍼아고니스트 이다. 당업계에서 통상의 기술자라면 IL-15-아고니스트 또는 -슈퍼아고니스트를 간단하게 동정할 수 있다. IL-15-아고니스트 또는 -슈퍼아고니스트의 일례로서, 국제특허출원 WO 2005/085282 또는 ZHU 등의 문헌 (J. Immunol., vol.183(6), p:3598-607, 2009)에 개시되어 있는 것들이 인용될 수 있다.
더욱 바람직하게, 상기 IL-15 아고니스트 또는 슈퍼아고니스트는 L45D, L45E, S51D, L52D, N72D, N72E, N72A, N72S, N72Y 및 N72P으로 포함하는/이루어진 군에서 선택된다 (인간 IL-15 서열 참조, 서열번호 3).
본 명세서에서 사용된 용어 " IL-15Rα의 스시 도메인 (the sushi domain of IL-15Rα)"은 당업계의 일반적인 의미를 가지며, 이는 IL-15Rα의 시그널 펩티드 뒤에 첫 번째 시스테인기(cysteine residue, C1)에서 시작하여 상기 시그널 펩티드 뒤에 네 번째 시스테인기(cysteine residue, C4)에서 끝나는 도메인을 나타낸다. IL-15Rα의 세포 외 영역의 부분에 상응하는 상기 스시 도메인은 IL-15에 대한 결합을 위해 필요하다(WEI et al., J. Immunol., vol.167(1), p:277-282, 2001).
상기 IL-15Rα의 스시 도메인 또는 그 유도체는 인간 인터류킨-15에 대한 인간 IL-15Rα의 스시 도메인의 결합 활성의 적어도 10%,, 바람직하게는 적어도 25%, 더 바람직하게는 적어도 50%의 활성을 갖는다. 상기 결합 활성은 전술한 문헌 (WEI et al., J. Immunol., vol.167(1), p:277-282, 2001)에 개시되어 있는 방법에 의해 간단하게 측정될 수 있다.
상기 IL-15Rα의 스시 도메인은 포유류 IL-15Rα의 스시 도메인, 바람직하게 영장류 IL-15Rα의 스시 도메인, 더욱 바람직하게 인간 IL-15Rα의 스시도메인 이다.
상기 포유류 IL-15Rα의 스시 도메인은 통상의 기술자에 의하여 간단하게 동정 될 수 있다. 예를 들어, 라투스 노르베지쿠스 (Rattus norvegicus, Accession number XP_002728555), 머스 머스쿨러스 (Mus musculus, Accession number EDL08026), 보스 타우러스 (Bos Taurus, Accession number XP_002692113), 오릭토라구스 쿠니쿨러스 (Oryctolagus cuniculus, Accession number XP_002723298), 마카카 파스시쿨라리스쿨라리스 fascicularis, Accession number ACI42785), 마카카 네메스트리나 (Macaca nemestrina, Accession number ACI42783), 호모 사피엔스 (Homo sapiens, Accession number CAI41081), 마카카 물라타 (Macaca Mulatta, Accession number NP_001166315), 폰고 아벨리이 (Pongo abelii, Accession number XP_002820541), 세르코세부스 토르쿠아투스 (Cercocebus torquatus, Accession number ACI42784), 칼리트릭스 자크후스 (Callithrix jacchus, Accession number XP_002750073), 또는 카비아 포르셀루스 (Cavia porcellus, Accession number NP_001166314)에 의하여 인용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "포유류 IL-15Rα의 스시 도메인"은 공통서열 (consensus sequence) 서열번호 4를 나타낸다.
바람직하게, 포유류 IL-15Rα의 스시 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 공통서열 (consensus sequence) 서열번호 5를 나타낸다.
상기 영장류 IL-15Rα의 스시 도메인은 통상의 기술자에 의하여 간단하게 동정될 수 있다. 예를 들어, IL-15Rα의 스시 도메인은 오릭토라구스 쿠니쿨러스 (Oryctolagus cuniculus), 마카카 파스시쿨라리스 (Macaca fascicularis), 마카카네메스트리나 (Macaca nemestrina), 호모 사피엔스 (Homo sapiens), 마카카 물라타 (Macaca Mulatta), 폰고 아벨리이 (Pongo abelii), 세르코세부스 토르쿠아투스 (Cercocebus torquatus), 또는 칼리트릭스 자크후스 (Callithrix jacchus)로부터 인용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "영장류 IL-15Rα의 스시 도메인"은 공통서열 (consensus sequence) 서열번호 6을 나타낸다.
바람직하게, 영장류 IL-15Rα의 스시 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 공통서열 (consensus sequence) 서열번호 7을 나타낸다.
인간 IL-15Rα의 스시 도메인은 통상의 기술자에 의하여 간단하게 동정 될 수 있고, 아미노산 서열 서열번호 8을 나타낸다.
바람직하게, 인간 IL-15Rα의 스시 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 9를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "IL-15Rα의 스시 도메인의 유도체"는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 92%의 동일성 백분율을 갖는(즉, 이는 약 5개의 아미노산 치환에 상응함) 아미노산 서열, 바람직하게는 적어도 96%의 동일성 백분율을 갖는(즉, 이는 약 2개의 아미노산 치환에 상응함) 아미노산 서열, 더 바람직하게는 적어도 98%의 동일성 백분율을 갖는(즉, 이는 약 1개의 아미노산 치환에 상응함) 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 유도체는 L-15Rα의 스시 도메인의 4개 시스테인 잔기를 포함하며, 이는 당업계의 기술상식 및 본 특허출원의 개시내용을 고려하여 통상의 기술자에 의해 간단하게 동정 될 수 있다. 또한, 천연 아미노산은 화학적으로 개질 된 아미노산에 의해 대체될 수 있다는 것이 이해될 수 있다. 통상적으로, 상기 화학적으로 개질 된 아미노산은 폴리펩타이드 반감기를 증가시킬 수 있다.
바람직한 실시예에 따라, 상기 컨쥬게이트는 (ii) IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인 (hinge domain) 또는 그 유도체의 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
상기 IL-15Rα 힌지 도메인 (IL-15Rα hinge domain)은 스시 도메인 뒤의 첫 번째 아미노 잔기에서 시작하고, 첫번째 글리코실화의 가능 부위 전에 마지막 아미노산 잔기로 끝나는 아미노산 산기서열로 정의된다. 인간 IL-15Rα에서, 힌지 영역의 아미노산 서열은 IL-15R알파의 스시 도메인에 관한 C-말단 위치에서, IL-15R알파의 스시도메인 뒤에 위치한 14개의 아미노산으로 구성된다. 즉, 상기 IL- 15R알파 힌지 영역은 상기 (C4)시스테인 잔기 다음의 첫 번째 아미노산에서 시작하고, 열네 번째 아미노산에서 끝난다("N-말단에서 C-말단까지"방향으로 기준 카운팅함).
상기 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인은 포유류 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인, 바람직하게 영장류 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인, 더욱 바람직하게 인간 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인이다.
상기 포유류 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인의 아미노산 서열은 통상의 기술자에 의하여 간단하게 동정 될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 용어 " 포유류 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인"은 공통서열 (consensus sequence) 서열번호 10을 나타낸다.
상기 영장류 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인의 아미노산 서열은 통상의 기술자에 의하여 간단하게 동정 될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "영장류 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인"은 공통서열 (consensus sequence) 서열번호 11을 나타낸다.
상기 인간 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인의 아미노산 서열은 통상의 기술자에 의하여 간단하게 동정 될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "인간 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인" 공통서열 (consensus sequence) 서열번호 12를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인의 유도체"는 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 93%의 동일성 백분율 (즉, 이는 약 5개의 아미노산 치환에 상응함), 바람직하게 적어도 97%의 동일성 백분율 (즉, 이는 약 2개의 아미노산 치환에 상응함), 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 98%의 동일성 백분율 (즉, 이는 약 1개의 아미노산 치환에 상응함)을 갖는 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 유도체는 L-15Rα의 스시 도메인의 4개 시스테인 잔기를 포함하고, 본 특허출원의 개시 및 당업계의 기술상식을 고려하여 통상의 기술자에 의해 간단하게 동정 될 수 있다. 또한, 천연 아미노산은 화학적으로 개질된 아미노산에 의하여 대체될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 통상적으로 상기 화학적으로 개질된 아미노산은 폴리펩타이드 반감기를 증가시킬 수 있다.
상기 컨쥬게이트의 폴리펩타이드 a) 및 b) 모두 특허 US 8,124,084 B2 및 국제특허출원 WO 2012/040323에 개시된 복합체 (complex)에서와 같이 비공유 결합 될 수 있다. 상기 컨쥬게이트 또는 복합체 (complex)는 적절한 양의 폴리펩타이드 a)를 제공하는 것, 적절한 양의 폴리펩타이드 b)를 제공하는것, 상기 두 폴리펩티드를 적절한 pH와 이온 조건에서 복합체 (즉, 컨쥬게이트)를 형성하는데 충분한 기간동안 혼합하는 것, 그리고 선택적으로 상기 복합체를 농축 또는 정제하는 것에 의하여 간단하게 얻을 수 있다. 상기 복합체 (즉, 컨쥬게이트)의 폴리펩티드는, 예를 들어 세포 또는 세포 추출물에서 각 폴리펩티드를 부분적으로 발현시키고, 그 후 상기 폴리펩티드를 분리 및 정제함으로써; 표준 방법 (standard method)에 따라 펩티드 합성기를 이용하여 형성될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 상기 치료적 폴리펩타이드 복합체는 같은 세포 또는 세포 추출물에서 두 개의 폴리펩타이드 i) 및 ii)를 모두 발현시키고, 그 다음 상기 복합체를 분리 및 정제, 예를 들어 림포카인 부분, 림포카인 수용체 부분, 또는 복합체에 대한 항체를 이용하는 친화성 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 기법을 이용, 함으로써 형성될 수 이다.
또한, 상기 컨쥬게이트의 폴리펩타이드 a) 및 b) 모두 융합 단백질에서 또는 이기능성 단백질 커플링제 (bifunctional protein coupling agent)를 이용하여 공유결합 될 수 있다.
이기능성 단백질 커플링제 (Bifunctional protein coupling agent), 예를 들어 이들을 이용하는 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 N-숙신이미딜 (2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (N-succinimidyl(2-pyridyldithio)propionate, SPDP), 숙신이미딜 (N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카복실레이트 (succinimidyl (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate), 이미노티올란 (iminothiolane, IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체 (예: 디메틸 아디피미데이트HCL (dimethyl adipimidateHCL)), 활성 에스테르 (예: 디숙신이미딜수베레이트 (disuccinimidylsuberate)), 알데히드 (aldehyde, 예: 글루타르알데히드 (glutaraldehyde)), 비스-아지도 화합물 (bis-azido compound, 예: 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민 (bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine)), 비스-디아조늄 유도체 (bis-diazonium derivative, 예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민 (bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine)), 디이소시아네이트(diisocyanate, 예: 톨루엔 2,6디이소시아네이트 (toluene 2,6diisocyanate)), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (bis-active fluorine compound, 예: 1,5-디플루로로-2,4-디니트로벤젠 (l,5-difluoro-2,4- dinitrobenzene))을 포함한다.
용어 "융합 단백질 (fusion protein)"은 본래 별개 단백질을 코딩하는 2 이상의 유전자의 연결을 통해서 생성된 단백질을 나타낸다. 이것은 또한 키메라 단백질 (chimeric protein)이라고도 알려져 있다. 상기 융합 유전자의 번역은 본래 단백질 각각으로부터 유래한 기능적 특성을 갖는 단일 폴리펩티드를 생성한다. 재조합 융합 단백질은 생물학적 연구 또는 치료에 사용하기 위해 재조합 DNA 기술에 의하여 인공적으로 생성된다. 재조합 융합 단백질은 융합 유전자의 유전공학처리를 통하여 생성된 단백질이다. 이는 통상적으로, 첫 번째 단백질을 코딩하는 cDNA 서열로부터 정지 코돈 (stop codon)을 제거하고, 그 다음 리게이션 또는 중첩 연장 PCR을 통하여 두 번째 단백질의 cDNA 서열을 프레임에 덧붙이는 것을 포함한다. 이어서, 상기 DNA 서열은 단일 단백질로 세포에 의해 발현될 것이다. 상기 단백질은 2개의 본래 단백질의 전장 서열을 모두 포함하거나 또는 둘 중 하나만 포함하도록 공학적으로 처리될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 상기 컨쥬게이트는 융합 단백질이다.
인터류킨 15 또는 그 유도체의 아미노산 서열은 IL-15Rα의 스시 도메인 또는 이의 유도체의 아미노산 서열에 대한 C-말단 또는 N-말단 위치에 있을 수 있다. 바람직하게, 상기 인터류킨 15 또는 이의 유도체의 아미노산 서열은 IL-15Rα의 스시 도메인 또는 이의 유도체의 아미노산 서열에 대한 C-말단 위치에 있다.
상기 인터류킨 15 또는 이의 유도체의 아미노산 서열과 IL-15Rα의 스시 도메인 또는 그 유도체의 아미노산 서열은 "링커 (linker)" 아미노산 서열에 의하여 분리될 수 있다. 상기 "링커" 아미노산 서열은 융합 단백질이 적절한 이차 및 삼차 구조를 형성하는 것을 확실하게 하는데 충분한 길이 일 수 있다.
상기 링커 아미노산 서열의 길이는 융합 단백질의 생물학적 활성에 유의적으로 영향을 미치지 않은채 달라질 수 있다. 통상적으로, 상기 링커 아미노산 서열은 1개 이상 30개 이하의 아미노산, 예를 들어 5-30개 아미노산의 링커, 바람직하게는 10-30개 아미노산의 링커, 더욱 바람직하게 15-30개 아미노산의 링커, 여전히 더 바람직하게 15-25개 아미노산의 링커, 가장 바람직하게는 18-22개 아미노산의 링커를 포함한다.
바람직한 링커 아미노산 서열은 컨쥬게이트가 적절한 형태 (즉, IL-15R베타/감마 시그널링 경로를 통해 적절한 시그널 형질도입 활성을 허용하는 형태)를 취할 수 있게 하는 것이다.
가장 적절한 링커 아미노산 서열은 (1) 플렉서블 신장 형태 (flexible extended conformation)를 취할 것이고, (2) 융합 단백질의 기능성 도메인과 상호작용할 수 있는 배열된(ordered) 이차 구조를 발달시키는 성향을 나타내지 않을 것이며, (3) 기능성 단백질 도메인과 상호작용을 촉진시킬 수 있는 최소한의 소수성 또는 하전된 성질을 가질 것이다.
바람직하게, 상기 링커 아미노산 서열은 Gly (G), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Ala (A), Leu (L), 및 Gln (Q)를 포함하는 군에서 선택된 거의 중성 (neutral)의 아미노산, 가장 바람직하게는 Gly (G), Asn (N), 및 Ser (S)을 포함하는 군에서 선택된 아미노산을 포함한다.
링커 서열의 예는 미국 특허 5,073,627 및 5,108,910에 개시되어 있다.
본 발명에 특히 더 적합한 구체적인 플렉서블 (flexible) 링커의 예는 서열번호 13 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ), 서열번호 14 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSGG) 또는 서열번호 15 (SGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ), 그리고 서열번호 16 (SGGSGGGGSGGGSGGGGS)의 서열에 의하여 코딩된 것들을 포함한다.
더욱 바람직한 일 실시예에서, 상기 컨쥬게이트는 서열번호 17 또는 서열번호 18의 서열을 가지는 융합단백질에 해당한다.
표현 "약학적으로 허용 가능한"은 생리학적으로 용인될 수 있고, 인간에게 투여될 때 알러지 또는 현기증, 위 불량과 같은 유사한 원치않는 반응을 통상적으로 유발하지 않는 물질 (molecular entity) 및 조성물을 나타낸다. 바람직하게, 본 명세서에서 사용한 "약학적으로 허용 가능한"이란 표현은 연방 또는 주정부의 규제기관에 의해 승인될 수 있는것, 또는 미국 약전 (Pharmacopeia)에 나열된 것, 또는 동물 특히 인간에게 사용하기 위해 일반적으로 인정되는 다른 약전에 나열된 것을 의미한다.
용어 "담체 (carrier)"는 화합물과 함께 투여되는 용매 (solvent), 아쥬반트 (adjuvant), 부형제 (excipient) 또는 운반체 (vehicle)를 나타낸다. 상기 약학적 담체는 물 및, 오일 (석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일 (예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 (sesame oil) 등을 포함)과 같은 멸균 액체 일 수 있다.
본 발명의 콤비네이션 (combination)의 투여 경로는 바람직하게 비경구 투여이다; 본 명세서에서 사용된, 용어 "비경구 투여(parenteral)"는 정맥 투여, 근육 투여, 피하 투여, 직장 투여, 질 투여 또는 복강 내 투여를 포함한다. 따라서, 약학적 조성물에는 주입을 위한 제형 (formulation)을 위한 약학적으로 허용 가능한 운반체 (vehicle)가 포함된다. 이는 특히 등장성, 멸균, 염류 용액 (인산일나트륨 또는 인산나트륨, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 이들 염의 혼합물), 또는 건조, 특히 동결건조 조성물 일 수 있고, 이는 경우에 따라서 멸균수 또는 생리식염수를 첨가시에 주사액의 구성을 허용한다. 적절한 약학적 담체 (carrier)는 E.W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기재되어 있다.
상기 중에서, 정맥투여가 가장 바람직하다.
상기 컨쥬게이트는 완충액 또는 물에 가용화되거나, 또는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 히드로겔 (예: PLGA-PEG-PLGA 삼블록 공중합체코-베이스 하이드로겔), 마이크로스피어, 나노스피어, 마이크로입자, 나노입자(예: 폴리(락틱-코-글리콜산) 마이크로입자(예: 폴리락트산(PLA); 폴리(락티드-코-글리콜산)(PLGA); 폴리글루타메이트 마이크로스피어, 나노스피어, 마이크로입자 또는 나노입자), 리포좀, 또는 다른 갈레닉 제형들에 혼입될 수 있다. 모든 경우에, 제형은 멸균되어야 하고, 허용 가능한 주사능 (syringability) 범위의 유체여야 한다. 이는 제조 및 저장의 조건하에서 안정성을 가져야 하고, 박테리아 및 균류와 같은 미생물들의 오염 작용에 대해서 보존되어야 한다.
또한, 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 이들의 혼합물 글그리고 오일에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 일반적인 조건하에서, 이러한 제조는 미생물의 성장을 방지하기 위하여 보존제를 포함한다.
상기 컨쥬게이트는 중성 또는 염 형태로 조성물 내에 제형화 될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염에는, 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산에의해 형성된 산부가염(단백질의 자유 아미노기에 의해 형성된 것) 등이 포함된다. 자유 카복실기에 의해 형성된 염은 또한 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래 될 수 있다.
또한, 상기 담체 (carrier)는 예를들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물 및 식물유를 포함하는 용매 또는 분산 배지 (dispersion medium)일 수 있다. 본 발명의 상기 컨쥬게이트는 바이오적용성 (biodisponibility)을 높이기 위하여, 예를들어 페길화 (pegylation)에 의하여 개질될 수 있다.
적절한 유동성 (fluidity)은 예를 들어, 레시틴 (lecithin)과 같은 코팅을 이용함으로써, 분산의 경우 요구되는 입자크기를 유지함으로써, 그리고 계면활성제 (surfactant)를 이용함으로써, 유지될 수 있다. 미생물들의 작용을 방지하는 것은 다양한 항박테리아 및 항진균 제제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우, 등장성 제제는 예를 들어 당류 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있을 것이다.
주사 가능 조성물의 장기적인 흡수는, 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴, 폴리올, 반감기 증대 공유 및 비공유 제형들을 조성물에서 사용함으로써 달성될 수 있다.
가수분해 및 변성을 포함한 펩티드 불안정 또는 분해의 원인들이 다수 존재한다. 소수성 상호작용은 분자들이 함께 클럼핑(즉, 응집)되는 것을 야기할 수 있다. 이러한 문제점들을 감소시키거나 방지하기 위해, 안정화제 (Stabilizer)가 첨가될 수 있다.
안정화제는 시클로덱스트린 및 이의 유도체를 포함한다(미국 특허 5,730,969 참조). 최종 제형을 안정화시키기 위해, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 트레할로스, 덱스트란 및 글리세린과 같은 적절한 보존제가 또한 첨가될 수 있다. 이온성 및 비-이온성 계면활성제, D-글루코스, D-갈락토스, D-크실로스, D-갈락투론산, 트레할로스, 덱스트란, 히드록시에틸 전분, 및 이들의 혼합물로부터 선택된 안정화제가 제형에 첨가될 수 있다. 알칼리금속 염 또는 염화마그네슘의 첨가는 펩타이드를 안정화시킬 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 덱스트란, 콘드로이틴 황산, 전분, 글리코겐, 덱스트린 및 알긴산 염으로 이루어진 군에서 선택된 당류 (saccharide)와 접촉함으로써 안정화될 수 있다. 첨가될 수 있는 다른 당류들에는 단당류 (monosaccharides), 이당류(disaccharide), 당알코올, 및 이들의 혼합물 (예: 글루코스, 만노스, 갈락토스, 프룩토스, 수크로스, 말토스, 락토스, 만니톨, 크실리톨)이 포함된다. 폴리올은 펩타이드를 안정화시킬 수 있으며, 이는 수혼화성 또는 수용성이다. 적합한 폴리올은 만니톨, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트리메틸글리콜, 비닐 피롤리돈, 글루코스, 프룩토스, 아라비노스, 만노스, 말토스, 수크로스, 및 이들의 폴리머를 포함하는 폴리하이드록시 알코올, 단당류 및 이당류 일 수 있다. 또한, 다양한 부형제 (excipient)가 펩타이드를 안정화시킬 수 있고, 여기에는 혈청 알부민, 아미노산, 헤파린, 지방산 및 인지질, 계면활성제, 금속, 폴리올, 환원제, 금속 킬레이트제, 폴리비닐 피롤리돈, 가수분해된 젤라틴, 및 황산암모늄이 포함된다.
본 발명의 명세서에서, 용어 "치료 (treating)"는 이러한 용어가 적용되는 상태 또는 장애, 또는 이러한 장애 또는 상태의 하나 이상의 징후를 역전시키는 것, 완화 시키는 것, 진행을 억제하는 것 또는 방지하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "암 치료 (treating cancer)"는 암세포의 성장을 억제하는 것을 의미한다. 바람직하게 상기 치료는 또한 종양 성장의 퇴화, 즉 측정가능한 종양의 크기 감소를 야기한다. 가장 바람직하게, 상기 치료는 종양의 완전한 퇴화를 야기한다.
용어 "감염 치료 (treating infection)"는 미생물 복제/증식의 억제를 의미한다.
본 명세서 사용된 용어 "면역결핍 장애 치료 (treating an immunodeficiency disorder)"는 NK 세포 (NK cell) 및/또는 T 세포 (T cell)의 유도를 의미한다.
상기 컨쥬게이트의 "유효량 (effective amount)"은 종양 성장 또는 미생물 증식의 퇴화를 유도하기에 충분한 용량이다. 투여에 사용되는 용량 (dose)은 다양한 파라미터의 함수 (function)에 따라, 특히 이용되는 투여 방식, 관련 병리학, 또는 대안적으로 필요한 치료기간의 함수에 따라서 조정 될 수 있다.
당연히, 약학적 조성물의 형태, 투여경로, 복용량 (dasage) 및 식이요법 (regimen)은 병의 중증도, 나이, 몸무게 및 대상체의 성별 등의 처치되는 조건에 당연히 의존한다. 하기에 제시되는 유효한 용량의 범위는 본 발명을 한정하려는 의도가 아니고, 바람직한 용량 범위를 대표하는 것이다그러나 바람직한 용량은 개별 대상체에 맞추어 질 수 있고, 과도한 실험을 통하지 않고서도 당업계 통상의 기술자에 의해 이해되고 결정될 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트의 매우 중요한 안전성 (safety) 때문에, 그 투여는 제한된 IL-2 테라퓨틱 윈도우가 아니라, 또한 IL-15에 대해 고찰된 테라퓨틱 윈도우에서 매우 중요한 테라퓨틱 윈도우 (therapeutic window)로 암, 감염 및 면역결핍 장애를 치료하는 것이 구상될 수 있다.
이러한 안전성은 1) 나쁜 예후를 갖는 만성 질환 (즉, 전이성 신장 선암 (metastatic renal adenocarnima) 또는 흑생종 (melanoma))을 치료하기 위한 매우 고용량의 RLI의 사용 및 2) 좋은 예후를 갖는 질병을 치료하기 위한 저용량의 RLI의 사용을 구상하는 것을 가능하게 한다.
또한, 투여되는 용량은 HDIL-2을 이용하여 얻어진 증식보다 더 높은 CD8 T 세포의 증식을 유도한다.
실시예와 같이, 적어도 하나의 컨쥬게이트의 유효 용량은 40 fmol/kg 또는 0.2 pmol/kg (1ng/kg 또는 5ng/kg) 보다 높고, 바람직하게 1 pmol/kg 또는 2 pmol/kg (25ng/kg 또는 50ng/kg) 보다 크고, 그리고 더욱 바람직하게 4 pmol/kg (100 ng/kg), 20 pmol/kg (500 ng/kg) 보다 크고, 또는 40 pmol/kg (1 mcg/kg) 보다 훨씬 크다.
분자량과 그들의 컨쥬게이트의 활성이 그것에 영향을 미칠 것이기 때문에, 다른 복용량 (dasage)은 실행 가능하다. 통상의 기술자는 상기 범위 내에서, 또는 만약 필요하다면, 상기 범위 밖에서 낮춘 적절한 복용량을 결정하는 것으로 쉽게 인정받을 수 있다.
또 다른 실시예와 같이, 적어도 하나의 컨쥬게이트의 유효 용량은 4 fmol/ml (0.1 ng/ml) 보다 높은, 바람직하게 40 또는 80 fmol/ml (1 또는 2 ng/ml) 보다 높은, 그리고 더욱 바람직하게 0.160 pmol/ml (4 ng/ml) 보다 높은 혈중 농도에 상응한다.
유리하게는, 적어도 하나의 컨쥬게이트의 투여용량은 2.4 nmol/kg (60 mcg/kg) 이하, 바람직하게 2 nmol/kg (50 mcg/kg) 또는 1.2 nmol/kg (30 mcg/kg) 이하, 그리고 더욱 바람직하게 1.0 nmol/kg (25 mcg/kg) 이하 또는 200 pmol/kg (5 mcg/kg) 보다 더 적다.
더욱 유리하게는, 적어도 하나의 컨쥬게이트의 투여용량은 0.12 nmol/ml (3,000 ng/ml), 바람직하게 80 또는 40 pmol/ml (2,000 or 1,000 ng/ml) 이하, 그리고 더욱 바람직하게 20 pmol/ml (500 ng/ml) 이하, 또는 12 pmol/ml (300 ng/ml) 보다 더 적은 혈중 농도에 상응한다.
상기 투여용량은 또한 HDIL-2를 이용해 얻어진 증식보다 더 높은 CD8 T 세포의 증식을 유도한다.
첫 번째 바람직하게 실시예에서, 상기 컨쥬게이트는 나쁜 예후와 관련된 질환으로부터 고통받는 대상체를 치료하는데 사용된다.
본 명세서에서 사용된, 나쁜 예후와 관련된 질환은 중간 예후 (median prognosis)가 2년보다 적고, 바람직하게 1년보다 적고, 더욱 바람직하게 6개월보다 적은 질환이다.
본 명세서에서 사용된, 나쁜 예후와 관련된 질환은 말기 암 (TNM 등급 IV) 또는 전이선 암dlek.
상기 측면에서, 상기 컨쥬게이트는 자연 살해 세포 (NK cell)의 증식을 유도하는 용량으로 투여되고, 상기 증식은 HDIL-2에 의해 얻어진 증식보다 적어도 20% 더 높은; 바람직하게 적어도 25% 더 높은; 그리고 더욱 바람직하게 적어도 30% 더 높다.
상기 측면에서, 상기 컨쥬게이트는 CD8+ T 세포 (CD8+ T cell)의 증식을 유도하는 용량으로 투여되고, 상기 증식은 HDIL-2에 의해 얻어진 증식보다 적어도 20% 더 높은; 바람직하게 적어도 25% 더 높은; 그리고 더욱 바람직하게 적어도 30% 더 높다.
실시예와 같이, 적어도 하나의 컨쥬게이트의 유효 용량은 24 내지 2,400 pmol/kg (0.6 내지 60 mcg/kg), 바람직하게 28 내지 800 pmol/kg (0.7 내지 20 mcg/kg) 그리고 더욱 바라직하게 32 내지 400 pmol/kg (0.8 내지 10 mcg/kg)에 포함된다.
다른 실시예와 같이, 상기 컨쥬게이트는 0.4 pmol/ml 내지 0.12 nmol/ml (10 ng/ml 내지 3,000 ng/ml), 바람직하게 0.48 pmol/ml 내지 40 pmol/ml (12 ng/ml 내지 1,000 ng/ml), 그리고 더욱 바람직하게 0.6 내지 20 pmol/ml (15 내지 500 ng/ml)에 포함되는 혈중 농도에 상응하는 용량으로 투여된다.
두 번째 바람직한 측면에서, 상기 컨쥬게이트는 좋은 예후를 갖는 대상체를 치료하는데 사용된다.
본 명세서에서 사용된, 좋은 예후와 관련된 질환은 중간 예후가 3년 이상이고, 바람직하게는 4년 이상 그리고 더욱 바람직하게는 5년 이상인 질환이다.
본 명세서에서 사용된, 좋은 예후와 관련된 질환은 비-전이성 암 (non-metastatic cancer), 바람직하게 TNM 등급 I, II 또는 III 암 또는 감염(infection) 이다.
상기 측면에서, 상기 컨쥬게이트는 HDIL-2에 의하여 얻어진 증식과 동일 또는 최고 50 또는 25% 더 높은; 바람직하게 동일 또는 최고 20% 더 높은; 그리고 더욱 바람직하게는 동일 또는 최고 10% 더 높은 자연 살해 세포 (NK cell)의 증식을 유도하는 용량으로 투여된다.
상기 측면에서, 상기 컨쥬게이트는 HDIL-2에 의하여 얻어진 증식과 동일 또는 최고 200% 더 높은; 바람직하게 동일 또는 최고 150% 더 높은; 그리고 더욱 바람직하게 동일 또는 최고 100% 더 높은 CD8+ T 세포 (CD8+ T cell)의 증식을 유도하는 용량으로 투여된다.
실시예와 같이, 적어도 하나의 컨쥬게이트의 유효한 용량은 2 내지 200 pmol/kg (50 내지 5,000 ng/kg), 바람직하게 8 내지 200 pmol/kg (200 내지 5,000 ng/kg) 그리고 더욱 바람직하게 20 내지 80 pmol/kg (500 내지 2,000 ng/kg)에 포함된다.
다른 실시예와 같이, 상기 컨쥬게이트는 40 fmol/ml 내지 12 pmol/ml (1 ng/ml 내지 300 ng/ml), 바람직하게 80 fmol/ml 내지 12 pmol/ml (2 ng/ml 내지 300 ng/ml), 그리고 더욱 바람직하게 0.16 내지 4 pmol/ml (4 내지 100 ng/ml)에 포함되는 혈중농도에 상응하는 용량으로 투여된다.
더욱 놀랍게도, 본 발명자는 상기 Il-15 유도체 NK 세포 유도는 HDIL-2에 의하여 얻어진 유도보다 낮은 조절 T 세포 유도로 얻어진다는 사실을 밝혔다.
세 번째 바람직한 측면에서, 상기 컨쥬게이트는 HDIL-2로 얻어진 증식 보다 더 적은 조절 T 세포 (FoxP3+CD4+CD25high, Treg cell)의 증식을 유도하는 용량으로 대상체에 투여된다.
유익하게는, 상기 컨쥬게이트는 HDIL-2에 의하여 얻어진 증식 보다 적어도 5% 더 적은; 바람직하게는 적어도 10 또는 20% 더 적은; 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 50% 더 적은 Treg 세포의 증식을 유도하는 양으로 대상체에 투여된다.
따라서, 가장 적은 조절 T 세포 (Treg cell) 유도 때문에 상기 IL-15 유도체로 얻어진 NK 세포 및 CD8 세포 유도는 HDIL-2에 의하여 유도된 것보다 더욱더 효과적이다.
바람직하게, 상기 컨쥬게이트는 유도된 증식 Treg 세포의 백분율에 대한 유도된 증식 NK 세포의 백분율의 비율 (ratio)이 HDIL-2에 의하여 얻어진 증식보다 적어도 25% 더 높은; 바람직하게 적어도 50% 더 높은; 그리고 더욱 바람직하게 적어도 75% 더 높은 용량으로 대상체에 투여된다.
바람직하게, 상기 컨쥬게이트는 유도된 증식 Treg 세포의 백분율에 대한 유도된 증식 CD8 T 세포의 백분율의 비율 (ratio)이 HDIL-2에 의하여 얻어진 증식보다 적어도 25% 더 높은; 바람직하게 적어도 50% 더 높은; 그리고 더욱 바람직하게 적어도 75% 더 높은 용량으로 대상체에 투여된다.
상기 용량 범위에서 컨쥬게이트의 도입은 단일 치료 또는 일련의 치료를 통해서 수행될 수 있다. 단일 복용량 (dosage)은 이점을 제공하고 질병 치료/관리를 위해 효과적으로 활용될 수 있는 반면에, 실제로 바람직한 치료 과정은 여러 번의 단계에 거쳐서 발생할 수 있고; 가장 바람직하게는, 상기 투여용량은 일일 투여용량과 부합한다. 이러한 용량은 1일 내지 20일 동안, 예를 들어 1일 내지 10일 동안, 바람직하게 2일 내지 5일 동안, 그리고 가장 바람직하게 2일 내지 4일 동안, 하루 한번 투여될 수 있다. 현재, 상기 투여용량은 컨쥬게이트의 일일 혈중 농도 유사한 컨쥬게이트로 장기적 투여하는 결과를 낼 수 있는 오래 지속되는 형태하에 있을 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 암으로부터, 감염으로부터 또는 면역결핍 장애로부터 고통받는 대상체에 투여되는 컨쥬게이트의 치료적으로 유효한 용량을 결정하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
i) 상기 대상체로부터 얻은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)와 앞서 정의된 증가한 용량의 컨쥬게이트를 상기 PBMC가 증식할 수 있는 배양조건 (culture condition)에서 접촉하는 단계;
ii) 상기 대상체로부터 얻어진 다른 PBMC와 고용량의 인터류킨-2 (High Dose of interleukin-2, HDIL-2)를 상기 PBMC가 증식할 수 있는 배양조건 (culture condition)에서 접촉하는 단계; 및
iv) HDIL-2로 얻어진 증식과 동일 또는 더 높은 PBMC의 NK 세포 (NK cell)의 증식을 유도하는 컨쥬게이트의 치료적으로 유효한 용량 (therapeutically efficient amount)을 선택하는 단계.
바람직하게, 상기 치료적으로 유효한 용량의 컨쥬게이트는 HDIL-2에 의하여 얻어진 증식과 같거나 또는 더 높은 PBMC의 CD8 T 세포의 증식을 유도한다.
상기 선택된 치료적으로 유효한 용량은 상기 대상체에서 암(cancer), 감염(infection) 또는 면역결핍 장애 (immunodeficient disorder)를 치료하기 위해 조절된다.
더욱 바람직하게, 상기 치료적으로 유효한 용량은 HDIL-2에 의하여 얻어진 증식 보다 적어도 25% 더 높은; 바람직하게 적어도 50% 더 높은; 그리고 더욱 바람직하게 적어도 75% 더 높은 Treg 세포를 증식하는 것의 유도 백분율에 대한 NK 세포 및/또는 CD8 T 세포를 증식하는 것의 유도 백분율의 비율 (ratio)에 관한 것이다.
지금, 상기 치료적으로 유효한 용량의 컨쥬게이트는 NK 세포 및/또는 CD8 T 세포의 증식을 유도하고, 이는 컨쥬게이트가 없는 배양 배지 (즉,HDIL-2 및 IL-15도 배제)를 이용하여 얻어진 증식보다 적어도 50% 높다.
상기 HDIL-2의 존재하에서 PBMC의 증식을 가능하게 하는 배양 조건 (culture condition)은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 실시예에 기재되어 있다.
컨쥬게이트의 농도에 상응하는 증가하는 용량의 컨쥬게이트 (Increasing amounts of conjugate)는 4 fmol/ml 내지 120 pmol/ml (0.1 내지 3,000 ng/ml), 바람직하게 40 fmol/ml 내지 80 pmol/ml (1 내지 2,000 ng/ml), 그리고 더욱 바람직하게 80 fmol/ml 내지 40 pmol/ml (2 내지 1,000 ng/ml)에 포함된다.
HDIL-2은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 50 IU/mL와 함께 PBMC의 배양에 대응된다.(Murphy, Welniak, Back et al., J. Immunol., vol.170, p:2727-33, 2003; Itoh et al., cancer Immunol. Immunother., vol.32(2), p:88-94, 1990; Ettinghausen & Rosenberg, cancer Res., vol.46(6), p:2784-92, 1986).
첫 번째 바람직한 측면에서, 상기 대상체는 나쁜 예후와 관련된 질환으로부터 고통받고있다.
상기 측면에서, 단계 iii)은 자연 살해 세포 (NK cell)의 증식을 유도하는 컨쥬게이트의 용량의 선택에 해당하고, 상기 증식은 HDIL-2에 의하여 얻어진 것보다 적어도 20 % 더 높은; 바람직하게 적어도 25% 더 높은; 그리고 더욱 바람직하게 적어도 30% 더 높다.
바람직하게, 단계 iii)은 또한 CD8 T 세포의 증식을 유도하는 컨쥬게이트의 용량의 선택에 해당하고, 상기 증식은 HDIL-2에 의하여 얻어진 것보다 적어도 20 % 더 높은; 바람직하게 적어도 25% 더 높은; 그리고 더욱 바람직하게 적어도 30% 더 높다.
두 번째 바람직한 측면에서, 상기 컨쥬게이트는 좋은 예후를 갖는 대상체를 치료하기위해 사용된다.
상기 측면에서, 단계 iii)은 자연 살해 세포 (NK cell)의 증식을 유도하는 컨쥬게이트의 용량의 선택에 해당하고, 상기 증식은 HDIL-2에 의하여 얻어진 것과 동일하거나 적어도 최고 50 또는 25% 더 높은; 바람직하게 동일하거나 또는 최고 20% 더 높은; 그리고 더욱 바람직하게 동일하거나 최고 10% 더 높다.
바람직하게, 단계 iii)은 또한 CD8 T 세포의 증식을 유도하는 컨쥬게이트의 용량의 선택에 해당하고, 상기 증식은 HDIL-2에 의하여 얻어진 증식보다 최고 200% 더 높거나 동일하고; 바람직하게 최고 150% 더 높거나 동일하고; 더욱 바람직하게는 최고 100% 더 높거나 동일하다.
세 번째 바람직한 측면에서, 본 발명의 방법은 다음의 단계를 더 포함한다.
iii) 상기 대상체로부터 얻어진 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)와 컨쥬게이트와 비교해서 증가하는 등몰 용량 (increasing equimolar amount)의 IL-15를 상기 PBMC가 증식할 수 있는 배양조건에서 접촉시키는 단계.
다음에서, 본 발명은 아미노산 서열, 핵산 서열 및 실시예들을 참조하여 더 자세하게 개시된다. 그러나, 실시예의 상세한 내용이 본 발명을 한정하려는 것은 아니다. 오히려, 본 발명은 본 명세서의 실시예에서 명시적으로 언급되지 않았지만, 통상의 기술자가 과도한 노력 없이 찾을 수 있는 상세한 내용을 포함하는 임의의 실시예에 관한 것이다.
[실시예]
RLI 효율을 결정하기 위하여, 첫 번째로 건강한 인간 공여자의 사람 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 정제된 NK 세포 및 CD8 T 세포에 해당하는 in vitro 모델을 사용하였다.
1) RLI에 의한 사람 림프구 (lymphocyte) 증식 유도
건강한 지원자의 말초 혈액 단핵 세포 (PMOLBC)를 Ficoll-Hypaque Gradient (Lymphoprep™; 1.077 g/mL)를 이용하여 분리하였다. 공여자 혈액은 공인된 윤리 규정에 따라 획득되었다.
간략하게, PBMC는 2.5 μM의 카복시 플루오레세인 숙신이미딜 에스터 (Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester, CFSE)로 5분 동안 표지되었고, NaCl로 세척되었다. 그 다음, PBMC는 공기 습도 95%, 5% CO2, 37 ℃에서 3 ~ 7일 동안 배양되었다. 세포를 모으고, 생존 세포를 선별하기 위하여 anti-CD3, CD4, CD8, CD56 및 LIVE/DEAD® Fixable Aqua로 염색하였다. 염색된 세포는 즉각적으로 FACSCanto II flow cytometer (BD biosciences) 상에서 획득되고, FlowJo 소프트웨어 (Tree Star)를 이용하여 분석이 수행되었다.
96-well U-바닥 플레이트의 웰 당 2 x 105 PBMC가 100 μL의 완전 배지 (RPMOLI 1640 + 10% 열-비활성화 소태아 혈청 (heat-inactivated FBS) + 1% L-글루타민 + 1% 비-필수 아미노산 + 1% sodium-pyruvate + 1% 페니실린-스트렙토마이신)에서 배양되었다. 그 다음, CHO 세포에서 생산된 RLI (서열번호 17 또는 서열번호 18)의 최종 농도가 2.5 pg/ml, 25 pg/ml, 250 pg/ml, 2.5 ng/ml 또는 25 ng/ml이 되도록 100 μL의 2X 배지가 배양에 첨가되었다.
음성 대조군 (negative control)으로서, PBMC는 배양배지 (culture medium)에서 배양되었다.
양성 대조군 (positive control)으로서, PBMC는 인간 사용을 위한 고용량의 IL-2에 해당하는 양인 50 IU/mL (3 ng/mL)의 인간 IL-2 (PROLEUKIN, NOVARTIS PHARMA)와 함께 배양되었다 (Murphy, Welniak, Back et al., J. Immunol., vol.170, p:2727-33, 2003; Itoh et al., cancer Immunol. Immunother., vol.32(2), p:88-94, 1990; Ettinghausen & Rosenberg, cancer Res., vol.46(6), p:2784-92, 1986). 또한 양성 대조군으로서, HDIL-2와 동일한 몰농도인 2.5 ng/mL의 재조합 인간 IL-15 (Cellgenix, preclinical CellGro®)을 사용하였다.
NK 세포 (NK cell), CD8+ T 세포 (CD8+ T cell) 및 CD4+ T 세포 (CD4+ T cell)를 증식하는 것의 백분율은 CFSE 희석에 의하여 3일 에서 7일까지 매일 측정되었다.
도 1은 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 RLI의 in vitro 용량-효과를 보여준다 (A). 인간 PBMC는 0일째 날에 CFSE로 염색되었고, 그 다음 RLI의 용량-증가 농도 (2.5; 25 ; 250 ; 2500 및 25000 pg/mL)로 4 일 및 7 일 동안 처리되었다. 4일 및 7일에, PBMC는 수확되고, 염색되고, 그리고 Fluorescence-activated cell sorting (FACS)을 이용하여 분석되었다. 미처리된 대조군 세포는 동시에 배지에서 독립적으로 배양되었다. 죽은 세포와 더블렛 (doublet)을 제외한 후에, CD3- CD56+는 NK 세포 (NK cell)로, CD3+ CD8+는 CD8+ T 세포 (CD8+ T cell)로 그리고 CD3+ CD4+ 세포는 CD4+ T 세포 (CD4+ T cell)로 간주되었다. NK 세포 (왼쪽 패널), CD8+ T 세포 (중간 패널) 그리고 CD4+ T 세포 (오른쪽 패널)를 증식하는 것의 비율을 위쪽 패널 A에 나타내었다. 도 1의 B는 RLI, rhIL-15 및 rhIL-2의 증식시키는 능력을 보여준다. 인간 PBMC는 2.5 ng/mL의 RLI, 2.5 ng/mL의 rhIL-15 및 50 UI/mL (3 ng/mL)의 rhIL-2로 4일 및 7일 동안 처리되었다.
NK 세포의 기초 데이터는 표 1에, CD8+ T 세포의 기초데이터는 표 2에 그리고 CD4+ T 세포의 기초데이터는 표 3에 요약되었다.

Day post-incubation 		NK 세포 중에서 증식세포의 백분율
IL-2
50 IU/mL (3000 pg/ml) 		IL-15
2500 pg/ml 		RLI
2.5 pg/ml 		RLI
25 pg/ml 		RLI
250 pg/ml 		RLI
2500 pg/ml 		RLI
25000 pg/ml
3 4.71 3.69 2.04 7.66 8.43 13.7 10.4
4 13.40 10.50 22.20 41.70 40.50 30.2 33.8
5 33.70 16.40 25.80 58.40 51.10 50.2 50.6
6 40.40 30.70 30.30 64.30 ND 53.7 67.5
7 59.80 35.60 19.30 74.90 78.20 79.0 79.8

Day post-incubation 		CD8+ T 세포 중에서 증식세포의 백분율
IL-2
50 UI/mL
(3000 pg/ml) 		IL-15
2500 pg/ml 		RLI
2.5 pg/ml 		RLI
25 pg/ml 		RLI
250 pg/ml 		RLI
2500 pg/ml 		RLI
25000 pg/ml
3 0.685 2.020 0.349 1.350 3.70 9.33 9.39
4 1.770 1.360 3.520 10.800 33.20 32.00 36.40
5 5.400 3.190 2.190 11.000 39.10 51.30 46.40
6 9.450 4.470 2.290 ND 28.20 45.00 46.40
7 8.990 11.400 7.840 16.400 44.50 46.20 47.10
ND : not determined

Day post-incubation 		CD4+ T 세포 중에서 증식세포의 백분율
IL-2
50 UI/mL
(3000 pg/ml) 		IL-15
2500 pg/ml 		RLI
2.5 pg/ml 		RLI
25 pg/ml 		RLI
250 pg/ml 		RLI
2500 pg/ml 		RLI
25000 pg/ml
3 0.496 0.414 0.994 0.626 3.30 1.69 4.22
4 2.780 2.300 1.490 3.130 5.69 4.34 5.19
5 9.850 12.500 16.900 10.600 20.60 16.00 23.60
6 22.100 15.300 11.000 9.860 11.00 22.40 25.70
7 26.100 20.600 16.100 14.800 25.20 27.70 32.40
상기 결과는 표 1 내지 3 및 도 1에서 보여주는 바와 같이, RLI는 NK 세포에 대해서는 25 pg/mL, CD8+ T 세포에 대해서는 250 pg/mL만큼 낮은 용량으로도 상당한 in vitro 증식을 유도할 수 있다는 것을 보여준다. 표 1 및 표2에서 보여주는 바와 같이, 25 및 250 pg/mL의 용량에서, RLI는 첫 째날 동안 2,500 pg/ml rhIL-15와 동등한 NK 세포 및 CD8+ T 세포 각각의 증식을 유도했다. 7일째 증식을 고려해보면, 250pg/ml (rhIL-15보다 10배 적은 용량)의 용량에서 rhIL-15보다 300% 더 높은 NK 세포 증식을 유도하였고, 25pg/ml (rhIL-15보다 10배 적은 용량)에서 50% 더 높은 증식을 유도하였다. 같은 날, RLI는 25pg/ml (rhIL-15보다 10배 적은 용량)에서 rhIL-15보다 100% 더 높은 CD8+ 세포의 증식을 유도하였다. 따라서, 이러한 파라미터들을 고려해 보았을때, RLI는 rhIL-15 보다 10 내지 100 배 더 생리활성적 (bioactive) 이다.
반대로, 250 및 2500 pg/mL의 용량에서 RLI는 NK 및 CD8+ T 세포 각각에 대하여 3,000 pg/mL의 IL-2와 비교해서 더 높은 증식시키는 능력을 보여주었다 (IL-2의 등몰 용량은 150 내지 1500 pg/mL (즉, 3-30 UI/mL) 임을 참고).
NK 세포에서, 상기 결과는 RLI는 IL-2와 비교해서 30% 더 높은 NK 세포 증식을 유도하였지만, 25pg/ml (100 fold less than rhIL-2)의 용량에서, 그리고 2.5 pg/ml (rhIL-2보다 1000 더 적은 용량)의 용량에서 동등한 것을 보여준다. CD8+ T 세포에서, 250 pg/ml 용량에서 RLI의 효율은 rhIL-2보다 거의 400% 더 높고, 25pg/ml의 용량에서 100% 더 높고, 2.5pg/ml의 용량에서 동등하다. 그러므로 이러한 파라미터들을 고려해서, RLI는 rhIL-2보다 적어도 2 내지 10 배 더 생리활성적 (bioactive) 이다.
상기 동일한 실험은 등몰 농도의 RLI, rhIL-2 및 rhIL-15로 재현되었다.
도 12A 및 12B는 NK 세포 및 CD8 T 세포 각각에 대해서 3, 4, 5, 6 및 7일에 RLI, rhIL-15 및 rhIL-2의 증식시키는 능력을 보여준다.
상기 결과는 활성화 다음의 3일차 부터 7일차까지 RLI는 NK 세포의 증식 뿐 아니라 CD8 T 세포의 증식을 유도하고, 이것은 등몰의 rhIL-15 및 역시 등몰의 rhIL-2에 의해 얻어지는 증식보다 크다는 것을 확인한다.
2) 인간 조절 T 세포 (human regulatory T cell) 및 RLI
Treg 세포는 Miyara et al., Immunity, vol.30(6), p:899-911, 2009에 공개된 바와 같이 분석되었다. 이러한 방법은 활성화 Treg (Foxp3high CD4+ T 세포), resting naturally Treg (Foxp3Low CD45RA+CD4+ T 세포) 그리고 활성화 작동인자 CD4+ T 세포 (Foxp3Low CD45RA-CD4+ T 세포) 사이를 식별을 할 수 있게 해준다.
간략하게, CFSE-표지된 PBMC는 1)에서 기술된 바에 따라 얻을 수 있다. 건강한 지원자의 2 백만개의 PBMC는 rhIL-15 (2.5 ng/mL), rhIL-2 (50 IU/mL = 3 ng/mL), RLI Pichia (2.5 ng/mL)와 함께 또는 배지만으로 6-well 플레이트에서 6일 동안 배양되었다. 그 다음, 세포를 수확하고, 생존 세포를 선택하기 위하여 상기 세포를 anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 및 LIVE/DEAD® Fixable Aqua로 염색하였다. 세포는 Foxp3 고정/투과화 프로토콜 (Foxp3 fix/permeabilization protocol, eBioscience)에 따라 투과화 되었고, anti-Foxp3으로 염색되었다. 표지된 세포는 flow cytometer를 이용해서 즉각적으로 획득되었다
도 2A는 증식 Foxp3- CD4+ T 세포의 비율을 보여준다.
도 2B는 증식 Foxp3+ CD4+ T 세포의 비율 (왼쪽 패널); 증식 Foxp3low CD4+ T 세포의 비율 (중간 패널) 및 증식 Foxp3high CD4+ T 세포의 비율 (오른쪽 패널)을 보여준다.
상기 결과는 RLI는 Foxp3+ CD4+ T 세포 부분 집단의 증식을 유도하지 않는다는 것을 보여준다. 그에 반해, rhIL-2는 매우 억제성 (suppressive) Treg 세포인 Foxp3high CD4+ T 세포를 포함하는 Foxp3+ CD4+ T 세포 부분 집단의 강한 증식을 유도한다.
RLI의 in vivo 특성을 더 잘 정의하기 위하여, 우리는 두 개의 상보적인 동물 모델;
1) 첫 번째, 약물 동력학 (drug pharmacokinetic)과 약물활성을 연구하기 위해 좋은 in vivo 모델인 마카크 (macaque); 및
2) 두 번째, 사이토카인 부작용과 더욱 특별히 마카크는 인간 VLS를 예측하는데 사용할 수 없기 때문에 혈관 누출 증후군 (VLS)을 연구하기 위해 좋은 in vivo 모델인 마우스 (mouse), 을 사용하기로 결정하였다;
3) 마우스: RLI 안전성 (safety) 확인
동시에, 우리는 hIL-2 및 hIL-15의 유사한 용량과 비교하여 RLI 안전성을 알아내기를 원했다. 이러한 목적을 위하여, 우리는 면역 세포 활성에 대한 그리고 인간 VLS에 대한 동물모델로 마우스를 이용하였다. 처음에, 우리는 이 동물 모델에서 RLI 활성을 알아냈다.
a) in vivo 모델 마우스에서 RLI의 생리활성
Harlan Laboratories로부터 얻은 C57BL/6 마우스에 음성 대조군으로 100 μL의 PBS, 양성 대조군으로 rhIL-2 (250　000 IU/mouse), 비교군로 rhIL-15 (1.2 ㎍/mouse) 그리고 RLI (2.5 ㎍/mouse)가 하기 도 3의 프로토콜에 따라서 복강 내로 주입 (intra-peritoneal, i.p) 되었다.
마우스는 경추 탈골법에 의하여 희생되었고, 비장 (spleen)은 4일째에 적출되었다. 비장은 주사기의 뒷면을 이용하여 100 ㎛-셀 스트레이너(strainer) 상에 단일세포 현탁액에서 분리되었다. 그 다음 혈액 세포 (blood cell)를 ACK 용액 (Ammonium-Chloride-Potassium)을 이용하여 용해시켰다. 지라세포 (Splenocyte)는 완전 배지에서 두 번 세척되었고, 생존세포는 KOVA 슬라이드를 이용하여 계수되었다. 2 백만개의 지라세포는 생존 세포를 선택하기 위하여 다음의 항체: anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, NKp46 및 LIVE/DEAD® Fixable Aqua,로 염색되었다. 그 다음, 지라세포는 제조 프로토콜 (eBioscience FoxP3 투과화 완충액)에 따라서 투과화 되고, anti-FoxP3 및 Ki67로 염색되었다. Ki67의 아이소타입이 양성 세포를 확인하는데 사용되었다. 염색된 세포는 FACSCanto II flow cytometer 상에서 즉각적으로 획득되었고, FlowJo 소프트웨어 (Tree Star)를 이용하여 분석이 수행되었다. NK 세포 (NK cell)는 CD3 음성 NKp46 양성 세포이다. CD8+ T 세포는 CD3 및 CD8 이중 양성 세포에서 게이팅 분석되었다. 조절 T 세포 분석연구에 대하여, Foxp3의 내 핵 염색은 CD4 및 CD3 이중 양성 세포에서 조절인자 (regulatory)를 작동인자 (effector) T 세포로부터 구분하기 위하여 실현되었다.
도 4는 4일 차에, 증식 NK 세포, 증식 CD8+ T 세포, 증식 Foxp3+ CD4+ T 세포 및 증식 Foxp3- CD4+ T 세포의 비율을 나타낸다.
도 5는 7일 차에, Foxp3+ T 세포 (Treg) 비율에 대한 증식 NK 세포의 비율을 보여준다.
상기 결과는 RLI는 IL-2 및 IL-15에 비해 Treg의 축적을 유도하는 것 없이 작동인자 세포 (effector cell)의 강한 증식을 유도한다는 것을 보여준다; 이러한 결과는 4일차와 7일차에 동일하다.
그 다음, 우리는 IL-2 및 IL-15와 비교하여 동물모델에서 RLI에 의한 면역세포 활성을 확인하였다.
이를 위하여, 비장세포 (splenocyte)를 앞서 기재한 프로토콜에 따라 수득하였다.
분비 분석 (secretion assay)을 위하여, 비장세포는 5 ng/mL의 PMOLA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) 및 500 ng/mL의 이오노마이신 (Ionomycin)이 첨가된 완전 배지에서 4시간 동안 배양되었다.
단백질 수송 (protein transport)을 억제하기 위하여 Brefelfin A 용액 (eBioscience)이 사용되었다. 그 다음, 세포가 수집되고, 생존 세포를 선택하기 위하여 항체(anti-CD3, CD4, CD8, NKp46 및 LIVE/DEAD® Fixable Aqua)로 염색되었다. 표면 염색 다음에, 세포는 고정되고, 제조자의 프로토콜에 따라 투과화 되었다 (BD biosciences, intracellular staining). 그 다음, 투과화된 세포는 anti-IFNγ 항체를 이용해서 염색되었고, FACS Canto II flow cytometer 상에서 즉각적으로 획득되었다.
In vitro 독성 평가를 위해, NK 세포가 마우스 NK 세포 분리 kit II (Miltenyi Biotech)를 이용하여 언리치 되었다. 정제는 유세포분석기 (flow cytometry)에 의하여 조절되었다. 2 x 104 YAC-1 세포는 96-well v-바닥 플레이트에서 다른 양의 NK 세포 (작동인자 (effector): 타겟 비율 (1:1); (5:1) 및 (10:1) )와 함께 배양되었다. 최종농도는 웰 당 100 μL 였다. 공배양의 4시간 이후에, 상청액이 수집되었고, LDH 세포독성 감지 kit (Roche Applied Science)를 이용하여 방출된 LDH가 측정되었다. 독성의 백분율은 하기에 따라서 계산되었다:
세포독성 (Cytotoxicity, %) = [(("작동인자: 타겟" - "작동인자 세포 대조군 (effector cell control)") - "낮은 대조군 (low control))" / ("높은 (high control)" - "낮은 대조군 (low control)")] x 100
도 6은 (A) NK 세포 중에서 IFNγ 생산하는 세포의 백분율 (왼쪽 패널), CD8+ T 세포 (중간 패널 ) 그리고 (B) YAC-1 세포주에 대한 NK cell 세포독성 (B) PBS, IL-2, IL-15 또는 RLI 중 하나가 주입된 마우스에 대한 세포독성을 보여준다.
상기 결과는 NK 세포 및 CD8+ T 세포를 고려해서, RLI (250,000IU/day, 즉 15 ㎍/day)는 in vivo 마우스에서 동몰 용량의 rhIL-15 및 고용량 요법 (regimen)의 IL-2와 비교해서 강한 생리활성을 보였다는 사실을 보여준다.
그러므로 이러한 데이터는 매 3일 마다 2㎍/주입만큼 낮은 용량에서 RLI는 IL-2의 15㎍씩 매일 주입과 비교해서 더 생리활성적이라는 사실을 보여주는 in vitro 인간 데이터를 확인한다.
RLI의 안전성을 더 잘 측정하기 위하여, 우리는 실험적으로 in vivo 종양 모델에서, 상기 사이토카인 요법 (regimen)의 항-종양 활성 동시에 비교하였다.
이를 위하여, 106 B16F10 흑생종 세포 마우스의 등의 상부 진피로 주입되었다. 앞서 기술한 요법 (regimen)에 따른 처치는 종양 접종 후 6일에 시작되었고, 그 시점에 종양 결절 (tumor nodule)은 명확하게 볼 수 있었으며 50-55 mm3의 크기에서 뚜렷했다. 뚜렷한 종양은 캘리퍼를 이용하여 두 개의 수직 지름이 측정되었고, 2로 평균직경을 나누어 반지름을 추정하였다. 종양 부피는 구면 성장을 가정하여 수식 4/3(πr3)를 이용하여 계산되었다.
The 도 9(A) 사이토카인 요법 (regimen)에 따른 종양 부피의 발달을 나타낸다. 도 9(B)는 표시된 시험제로 처리된 마우스에서 피하의 종양 성장에 대한 곡선 하 면적 (the Area Under the Curve, AUC)을 보여준다. 두 번의 별도의 실험을 대표하는 데이터이다.
도 9A 및 B에서 보이는 바와 같이 그리고 PBS 그룹과 비교할 때, LDRLI는 초기 종양 성장을 47% 까지 감소시키고, 이것은 초기 종양 성장을 46% 까지 감소시킨 HDRLI와 비슷하다. LDIL-2는 치료적 효과를 갖지 않고, 반면에 LDIL-15는 매우 보통의 치료효과를 갖는다 (초기 종양 성장에서 - 9%). 흥미롭게도, HDIL-2 및 HDIL-15는 초기 종양 성장에서 대단하지 않지만 중요한 치료효과 (각각 -22% 및 -28%)를 보여준다. IL-15/IL-15Ralpha-Fc는 CD8 T 및 NK 세포에서 유사한 효과에도 불구하고, 조기 종양 성장을 37% 까지 감소시키고, 이것은 LD 및 HDRLI 보다 작다. 그럼에도 불구하고, 비율 CD8/CD4 Treg 및 NK/CD4 Treg는 RLI 보다 IL-15/IL-15Ralpha-Fc에 불리하다. IL2/602 mAb는 CD8 T 및 NK 세포에서 유사한 효과와 RLI보다 불리한 비율 CD8/CD4 Treg 및 NK/CD4 Treg에도 불구하고 초기 종양 성장을 51% 감소시키고, 이것은 LD 또는 HDRLI보다 조금 더 높았다. 이는 B6F10 초기 종양 성장을 제어하기 위한 가장 중요한 면역 유발자는 이러한 세포들과 CD4 Treg의 상대적 비율 보다 CD8 T 및 NK 세포의 확장 (expansion)에 더욱 관련 있다는 것을 가리킨다. 그럼에도 불구하고, 많은 연구가 마우스 및 인간 암에서 면역 탈출을 통해 종양 진행을 선호하는 주요한 면역억제 세포로서 CD4 Treg의 활성 및 발달과 관련된다.
더욱이 전이성 신세포암 (metastatic renal cell carcinoma, Renca)에서 in vivo 실험은 IL-15 및 IL-2의 초기 종양 성장에 대한 대단하지는 않지만 중요한 치료적 효과를 확인하였고, 반면에 2㎍의 RLI를 1-4일에 매일 ip 투여로 강한 폐 전이 발달 억제가 관찰되었다.
b) 혈관 누출 증후군 ( Vascular Leak Syndrome , VLS)
농축된 CFSE 표지된 Ly5.1+CD8+ T 세포는 야생형 마우스로 트랜스퍼 되었고, PBS, 1.5 ㎍ (low dose, LD) 재조합 인간 사이토카인 또는 15 ㎍ (high dose, HD) 재조합 인간 사이토카인을 매일 4일간 투여하고, 상기 재조합 인간 사이토카인은 LDIL-2, LDIL-15, HDIL-2 및 HDIL-15를 포함하며; 1.5㎍ 사이토카인 플러스 항-인간 사이토카인 항체 (IL-2/602); 1. 5㎍ IL-15 플러스 용해성 IL-15Rα-Fc (IL-15/sIL-15Rα, 또한 IL-15 비 공유결합 복합체라고도 불림); 및 2.25 ㎍ RLI (LD RLI) 또는 15 ㎍ RLI (HD RLI). 상기 IL-2 용량은 상기 HDIL-2 안전 기초-즉, 허용가능한 리스크-베네핏 밸런스-에서, VLS 유도라는 면에서 최고 제한 용량으로서 고려될 수 있다.
5 일에, 비장세포는 (A) 공여자 Ly5.1+CD8+ 세포의 CFSE 프로파일, 호스트 CD44high CD122high 기억-표현형 CD8+ T 세포(memory-phenotype CD8+ T cell, MP CD8+), CD4+CD25+ 조절 T 세포 (Treg) 및 CD3-NK1.1+ 자연 살해 세포 (NK)에 대하여 분석되었다.
도 7은 공여 세포의 전체 세포 수, MP CD8+ T 세포, 및 NK 세포가 계산 되었음을 보여준다. 데이터는 두 번의 별개의 실험의 대표값이다.
상기 결과는 LDRLI은 트랜스퍼된 Ly5.1+ CD8+ T 세포, 언리치된 CD122+ CD44+ 세포 (작동인자 및 중앙 메모리 CD8 T 세포)의 강한 증식 및 팽창, HDRLI 그룹에서 세포증식의 97% 대 세포증식의 89%, 을 유도한다는 것을 보여준다. 따라서, LDRLI 또는 HDRLI는 RLI의 매우 높은 농도 같은 것이 최대 약리 효과를 달성하기 위하여 요구되지 않는 것을 의미하는 타겟 세포에 대해서 준-유사한 약학적 효과를 유도한다.
LDRLI는 등몰의 LDIL-2 (12%), LDIL-15 (13.5%),그리고 HDIL-2 (52%) 조차 또는 HDIL-15 (62%) 보다 트랜스퍼된 CD8 T 세포의 더 많은 증식을 유도한다.
게다가, LDRLI 및 HDRLI는 IL-2 (IL2/602 mAb; 98%) 및 IL-15 (IL-15/IL-15Ralpha-Fc; 98%)의 비-공유결합 복합체 슈퍼아고니스트와 매우 잘 비교한다.
결론적으로, RLI는 면역억제의 증폭 없이 면역세포독성 (immunocytotoxicity)으로 면역 균형을 이동하기 위한 모든 테스트 시약 및 요법 중에서 가장 좋은 능력을 보여주고, CD4 Treg의 팽창에 대한 더욱 제한된 효과와 NK 및 CD8 T 세포를 증폭하는데 매우 효과적이다.
혈관 누출 증후군 (VLS)를 확인하기 위하여, 우리는 습식 및 건식 조직의 무게 사이의 비율과 관련된 폐 부종 (edema)을 평가하였다. 마우스는 마취된 상태에서 출혈로 희생되었다. 폐를 수득하고 즉각적으로 무게가 측정되었고, 50 ℃에서 2 일 동안 건조되었다. 물 유입 (Water influx)은 폐의 젖은 무게에서 건조 무게를 빼서 얻었다.
도 8은 마우스 총 중량의 백분율로서 폐 부종 (점선보다 높은)을 나타낸다. 점선은 생리적 배경 수준을 나타낸다. 데이터는 두 번의 별개 실험의 대표값이다.
PBS 그룹의 일반 폐 젖은 무게 (PWW)와 비교하면, LDIL-15 및 LDIL-2는 각각 7.3% 및 17.9%의 PWW의 보통의 증가를 유도한다. HDIL-15 및 HDIL-2 각각 약 54.5% 및 120%의 PWW를 증가시킨다. HDIL-2는 매우 중요한 PWW 증가를 유도하고, HDIL-2로 처리된 일부 환자에게서 나타나는 혈관 누출 증후군과 일치한다. HDIL-15에 대하여, PWW 증가와 같은 것이 의미없지 않음에서 불구하고, PWW 증가는 HDIL-2에 의해 유도되는 증가와 비교해서 매우 적다.
놀랍게도, 상기 결과는 show that, VLS에 대한 상한치 (highest limit)에 비교해서, RLI에 의한 NK 및 CD8 + 세포의 유도는 hIL-15 및 hIL-2에 의하여 얻어진 것보다 더 높은 반면 (3 fold 이상), 낮은 및 높은 용량에서 RLI에 의하여 유도되는 것은 허용 가능한 것으로 보인다.
IL-15/IL-15Ralpha-Fc는 76.4%까지 PWW를 증가시키고, 이는 낮은 치료 효과에도 불구하고 LDRLI에 의하여 유도된 VLS의 두 배이다. IL-2/602 mAb는 PWW를 62.6%까지 증가시키고, 이는 낮은 치료 효과에도 불구하고 LDRLI에 의하여 유도된 VLS보다 38% 더 많다. 게다가, HDRLI는 NK 및 CD8 T 세포에 대한 준-유사한 약학적 효과 및 치료적 효과에도 불구하고 LDRLI 그룹에서 38.2% 대비 96.7% 까지 PWW를 증가시켰다는 점에 주의하는 것은 흥미롭다. 그래서, 효과 플래토 (efficacy plateau)는 상기 LD 요법 (regime)으로 도달한다는 의미인 NK 및 CD8 T 세포의 활성 및 치료적 활성의 측면에서 LDRLI 및 HDRLI이 매우 잘 비교되더라도, 증가하는 RLI 용량은, 이러한 독성 효과는 치료효과와 연관된 메커니즘과 관련이 없다는 의미인, 더 높은 VLS를 유도할 수 있다.
IL-2 및 IL-15 대비 RLI의 안정성-즉, 강한 효율 및 낮은 독성-을 나타내기 위하여, 도 11 PBS, IL-2, IL-15, 및 RLI로 투여된 마우스에 대하여 NK 및 CD8+ T 세포 각각의 기능으로서 VLS를 나타낸다.
마지막으로, 우리의 결과는 RLI는 IL-2의 안전성뿐만 아니라 IL-15의 안전성 (IL-15 및 RLI가 잠재적으로 동일한 신호체계를 이용할지라도)과 비교해서 매우 현저한 안정성을 갖고, 이러한 RLI 안전성은 IL-15와 IL-2 모두의 안전성보다 더욱더 유리하다는 점을 보여준다. 결과적으로, RLI는 치료적 효과를 유도하는 작동인자 면역 세포를 부작용없이 활용하기 위하여 IL-15 및 IL-2와 비교해서 개선된 용량 한계 (dose margin)와 치료적 윈도우를 보여준다. 반대로, VLS 현상을 빠르게 유도하는 것 없이, IL-2를 이용하여 면역체계의 정확한 자극을 달성하는 것은 어려워 보이고, IL-15를 이용한 경우에도 그렇다.
c) NK 세포 팽창 대 독성 (VLS)에 대한 용량-반응 효과
폐와 간에서 NK cell 팽창 대 VLS에 대한 RLI용량-범위 효과가 앞서 기술된 프로토콜에 따라서 측정되었다. 마우스에 4일간 0일 에서 3일 까지 i.p 투여 당 0.2 ㎍, 0.5 ㎍, 1 ㎍, 또는 2 ㎍의 RLI CHO가 투여되었고, 4일 째에 희생되었다.
도 13은 NK 세포 팽창 (expansion)에 대한 RLI의 용량-반응 효과를 보여준다.
상기 결과는 RLI 치료는 비장에서 효과 시작 첫 번째 용량 0.2 ㎍부터 2 ㎍까지 (플래토 (plateau)는 1 ㎍에서 시작) 용량-의존적 NK 세포의 팽창을 유도한다는 것을 보여준다.
NK 팽창과 평행하여, VLS가 대조군 마우스 (PBS) 대비 처리된 마우스의 폐 및 간에서 측정되었다.
도 14 마우스의 폐 및 간에서 VLS에 대한 RLI의 용량-반응 효과를 보여준다.
상기 결과는 미처리된 마우스의 PWW와 비교해서, RLI의 시험 용량은 폐 및 간에서 눈에 띄는 VLS를 유도하지 않는다는 것을 보여준다. 이제, VLS의 새로운 신호는 최고 용량 2㎍에서 나타나는 것으로 고려 될 수 있다.
다시, 폐에서 VLS 대 NK 세포 팽창에 대한 RLI의 용량-범위 효과가 앞서 기재된 프로토콜에 따라서 2 가지 새로운 용량도 함께 측정되었다. 마우스는 4일 RLI CHO 투여받았고, 0 일 에서 3일 가지 ip 투여, 4일째에 희생되었으며, 1회 ip 투여 당 0.2 ㎍, 0.5 ㎍, 1 ㎍, 2 ㎍, 5 ㎍ 또는 25 ㎍로 투여되었다.
도 15 폐에서 VLS 대 NK 세포 팽창에 대한 RLI의 용량-범위 효과를 보여준다.
한번 더, RLI는 5 ㎍ 및 25 ㎍에서 유사하고 최대 강도로 잠재적 VLS를 유도하는 반면에, RLI는 폐에서 0. 2 ㎍에서 2 ㎍까지는 VLS를 유도하지 않는다.
NK 세포에 대하여, 도 16은 NK 세포 팽창의 용량 반응을 보여주고, 도 17은 Treg 팽창에 대한 RLI의 용량 반응을 보여준다.
다시 한번, 투여당 0.2 에서 5 ㎍ 용량의 RLI는 비장에서 용량-의존적 NK 세포 팽창을 유도하지만, 반면에 25 ㎍의 RLI는 활성을 잃고, 해로운 것으로 간주 될 것이다. 동시에, 이러한 요법은 대조군과 비교해서 Treg 수의 유사한 증가를 유도하는 반면에, 0.2 부터 2㎍까지 용량에서 RLI는 Treg의 백분률을 증가시키지 않는다. 이에 반해서, 최고 용량에서 RLI (5 및 25㎍)는 CD4 Treg의 수와 백분률을 증가시킨다.
도 18은 CD4 Treg 대 NK 세포의 백분율의 비율에 대한 RLI의 용량-반응 효과를 보여주고, RLI는 CD4 Treg에 대한 특이적 활성 없이 NK 세포 증식에 대한 특이적 용량-의존적 활성을 보여준다는 사실을 입증하였다.
게다가 0.2 내지 2 ㎍에서 최대 용량은 활성 및 안전, NK 세포와 같은 세포독성 면역 세포 (cytotoxic immune cell)를 VLS 유도 없이 자극할 수 있는 가능성을 반영하는 것처럼 보인다. 이러한 약학적 상한선의 존재는 환자의 안전과 효과를 관리하는데 중요하다.
도 19는 건강한 마우스에서 RLI 처리에 의해 유도되는 VLS 대 NK 및 CD8 T 세포 자극의 비교, 그리고 Renca 세포 전이 발달에 대한 세포 치료 효과를 나타낸다.
마지막으로, 이러한 결과는 IL-15 및 IL-2와 비교해서 RLI의 매우 큰 안전성을 확인하고, IL-2와 IL-15 모두 생각지 못한 치료적 윈도우 (therapeutic window): 나쁜 예후 환자에게는 매우 높은 용량 그리고 좋은 예후 환자에게는 매우 낮은 용량, 로 사용될 수 있는 RLI를 확립하였다.
Macaque를 이용한 약리역학 (Pharmacokinetics)
약 3에서 4 kg, 4년 령 시노몰구스 마카크 (Cynomolgus macaques)에 RLI가 다른 용량 (20 mcg/kg-2 마리 마카크; 23.5mcg/kg -2 마리 마카크)으로 투여되었다 (급속정맥주입, 15 분).
*본 연구는 OECD 문서 "principles of good laboratory practices" (1997년 개정)에서 개시하고 있는 현재의 GLP규정에 따라 수행되었다. 이러한 프로토콜은 This protocol was reviewed by the Ethics Committee of VetAgro Sup (프랑스)의 윤리위원회에 의하여 검토되고, no. 1162로 승인받았다. 모든 실험은 2001년 2월 13일 French Official Journal에서 발간된 European Directive 86/609/EEC에 맞게 수행될 것이다.
약동학 특징 (pharmacokinetic feature)의 분석은 다른 시간 포인트 (t-72h as t0, t+10min, t+30min, t+1h, t+4h, t+6h, t+24h 및 t+72h)에 혈청에 대한 RLI 특이적 ELISA 바이오분석을 수행함으로 완료되었다.
측정된 농도에 근거한 실험 곡선 (experimental curve)은 일반 식에 따라 정맥주사에서 제로와 두 개의 컴파트먼트 모델:
맞춤 농도 (fitted concentration) = =IF(time<tinf;InfR*A*(1-EXP(-_lbd1*time))+InfR*B*(1-EXP(lbdz*time)) ; InfR*A*(EXP(_lbd1*time)) * EXP(-_lbd1*time) + InfR*B* (EXP(lbdz*time)) * EXP(-lbdz*time))(맞춤 농도식 (Excel, Fit analysis, 제로 오더 정맥 주사와 두 개의 컴파트먼트 모델 )), 을 이용하여 분석되었다.
도 10의 A는 시간 함수로서 투여량에 따른 RLI 농도의 관찰되고 모델화된 발달을 나타낸다. 데이터는 투여량 당 두 마리 다른 마카크의 대표값이다.
두번째 구획의 반감기 (t1/2)는 각 실험에 대해서 약 3시간이다. 맞춤 (Fitted) 곡선은 RLI의 잔류 농도를 오랜 시간 동안 전체 혈류에서 측정하는 것을 가능하게 하고, 이것은 도 10의 B에서 나타난다.
이러한 결과는 20mcg/kg 그룹에 대하여, 6h 및 12h에 혈액 농도는 각각 28.67 및 6.02 ng/ml이라는 것을 보여준다. 3.5mcg/kg 그룹에 대하여, 6h 및 12h에 혈액 농도는 각각 0.55 및 0.03 ng/ml (각각 550pg/ml 및 30pg/ml)이다.
표 1 및 표 2에 따르면, 이러한 낮은 그리고 매우 낮은 농도는 인간 NK 및 CD8 T세포 각각을 자극하는데 매우 효율적이다. 이제, Treg에 대해서는 효과가 관찰되지 않은 반면에 (데이터 없음), 상기 NK 및 CD8 T 세포 증식 유도는 마카크에서 확인되었다.
동물 용량을 인간 동등한 용량으로 잘 변환하기 위하여, BSA에 근거한 이론적 모델이 존재한다.
인간 동등 용량 (HED)의 결정은 다음 식에 근거하여 얻을 수 있다:
HED (mg/kg) = 동물 용량 (mg/kg) x (동물 Km ÷ 인간 Km)
상기 식에서, Km은 몸무게와 체표면적 사이의 관계를 반영하는 보정dody 계수이다. 　
전형적인 어른 (몸무게 60 lb., 체표면적 1.6 m2), Km 은 37.　
가장 자주 사용되는 실험 동물종의 평균 Km은 마우스 3, 토끼 6, 마카크 12, 개 20, 성인 어른 37 (참조 "Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics Evaluation and Research. (2002)　Estimating the safe starting dose in clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers,　U.S. Food and Drug Administration, Rockville, Maryland, USA") 이다.
상기 요소에 기초하여, 우리는 마우스 실험과 비교함으로써 RKI의 최대 인간 등가 용량을 추정할 수 있다. 상기 용량은 표 4에 정리하였다.
용량/주입 (mice) 용량/주입
(20g)		 용량/주입
(30g)		 마카크 동등 용량
(20g)		 마카크 동등 용량
(30g)		 인간 동등 용량 (20g) 인간 동등 용량 (30g)
mcg mcg/kg mcg/kg mcg/kg mcg/kg mcg/kg mcg/kg
2,000 100,000 66,000 25,000 16,500 8,108 5,351
2,250 112,500 74,250 28,125 18,563 9,122 6,020
15,000 750,000 495,000 187,500 123,750 60,811 40,135
0,200 10,000 6,600 2,500 1,650 0,811 0,535
0,020 1,000 0,660 0,250 0,165 0,081 0,054
흥미롭게도, 우리는 고-용량 (25ng/ml)뿐 아니라 매우 낮은 용량 (2.5pg/ml or 25pg/ml)에서도 ex vivo 인간 PBMC의 인간 NK 및 CD8 T 세포를 자극할 수 있다 (tables 1 and 2, 도 1)는 점을 보여주었다. 마카크에서, 이러한 약한 (weak) 또는 매우 약학 (very weak) 농도는 피크 혈청 수준에 도달할 수 있을 것이다 (0.25 hours) (도 10A 및 B). 예를 들어, 원숭이 (Cynomolgus monkeys)에서 0.01mcg/kg의 용량에서 최대 혈중 농도는 실험 곡선의 선형 회귀 분석에 따라 약 62.5pg/ml에 다다를 수 있다 (도 10의 B). 표 1에서 보여지는 것 같이, 25pg/ml의 RLI는 인간 NK 세포에서 증식을 유도하기 위해서 HDIL-2 보다 매우 우수하다. 마카크 (macaque) 혈액에서 이러한 혈중 농도에 기초하고, 이전 공식의 관점에서, 우리는 다른 농도에 대한 RLI 인간 등가 (HED RLI, 표 5에 정리) 용량을 결정하였다. 표 5는 In vivo 원숭이 및 ex vivo 인간 PBMC에 기반한 RLI의 최소한의 인간 등가 용량의 예 이다.
Figure pat00001
결론적으로, RLI의 일일 투여 용량은 치료되는 질병의 중증도에 따라 1ng/kg에서 60 mcg/kg까지 다양할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CYTUNE PHARMA IGR <120> CYTOKINE DERIVED TREATMENT WITH REDUCED VASCULAR LEAK SYNDROME <130> CYT-B-0003-PCT1 <150> EP 13002066.2 <151> 2013-04-19 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mammalian interleukin 15 consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X= N, S, T or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X= V, H, I, Q or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X= N, Y, F or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X= I or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X= S, N, L, Y, K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X= K, E, R or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X= K, T or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X= E, D or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X= D, H, S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X= I or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X=Q, R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> X= S or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> X= M, I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> X= I, V or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> X=A or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> X=E or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> X= D or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> X= V, F, A or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> X= S, N or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> X= V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> X= A or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> X= K, Q or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> X= Q, G, R, H or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> X= S or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> X= L, Q or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> X= S, F or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> X= G, K, S, N or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> X= D, H, S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> X= A, H, M, E, G, S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58) <223> X= S, V, P, T, N or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> X= I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(60) <223> X= H, S, K, N, Y or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> X= D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> X= T, I or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63) <223> X= V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> X= E, T, Q, R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(66) <223> X= L or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> X= I, T or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> X=I, M, F, Y or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> X= N, T, R, D or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73) <223> X= S, N, R, T or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75) <223> X= S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> X= S or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> X= N, I or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (78)..(78) <223> X= G, E or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> X= N, Y, D or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(80) <223> X= V, K or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (81)..(81) <223> X= T, A or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (83)..(83) <223> X= S, L or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> X= E or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> X= E or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(94) <223> X= K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(95) <223> X= N, T or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (96)..(96) <223> X= I or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(97) <223> X= K, N, A, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (101)..(101) <223> X= Q, K or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (104)..(104) <223> X= V, I or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(105) <223> X= H or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (112)..(112) <223> X= N or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (113)..(113) <223> X= = T, S, P, L or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (114)..(114) <223> X= = S or P <400> 1 Xaa Trp Xaa Xaa Val Xaa Xaa Asp Leu Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Leu Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa His Xaa Asp Xaa Thr Leu Tyr Thr Xaa Ser Xaa Xaa His 20 25 30 Pro Xaa Cys Lys Xaa Thr Xaa Met Xaa Cys Phe Leu Leu Glu Leu Xaa 35 40 45 Val Ile Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Asn Xaa Xaa Xaa Leu Ala Asn Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Glu Xaa Gly Cys Lys Xaa Cys Glu Glu Leu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Glu Phe Leu Xaa Ser Phe Xaa Xaa Ile Val Gln Met Phe Ile Xaa 100 105 110 Xaa Xaa <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> primate uinterleukin 15 consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = N or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X = N or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X = K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X = K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X = E or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X = I or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> X = M or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> X = D or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> X = V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> X = S or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> X = L or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> X = G or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> X = D or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> X = A or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58) <223> X = S, N or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(60) <223> X = H or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63) <223> X = V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> X = I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> X = N or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73) <223> X =S or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> X =S or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> X =N or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(80) <223> X =V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> X =E or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (112)..(112) <223> X = N or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (113)..(113) <223> X = T or A <400> 2 Xaa Trp Val Xaa Val Ile Ser Asp Leu Xaa Xaa Ile Xaa Asp Leu Xaa 1 5 10 15 Gln Ser Xaa His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Xaa Xaa His 20 25 30 Pro Xaa Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Xaa Glu Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Asp Thr Xaa Glu 50 55 60 Asn Leu Xaa Ile Leu Ala Asn Xaa Xaa Leu Ser Xaa Asn Gly Xaa Xaa 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Xaa Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Xaa 100 105 110 Xaa Ser <210> 3 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (93)..(93) <223> X= E or K <400> 3 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Xaa Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser <210> 4 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mammalian sushi domain consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X= P or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X= M or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X= V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X= W, R or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X= S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> X= L or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> X= Y, H or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> X= I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> X= S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> X=T or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45) <223> X=T or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45) <223> X= L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> X= A or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> X= V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> X= H or Y <400> 4 Cys Pro Xaa Pro Xaa Ser Xaa Glu His Ala Asp Ile Xaa Val Lys Xaa 1 5 10 15 Tyr Ser Xaa Xaa Ser Arg Glu Arg Tyr Xaa Cys Asn Ser Gly Phe Lys 20 25 30 Arg Lys Ala Gly Thr Ser Xaa Leu Xaa Glu Cys Val Xaa Asn Lys Xaa 35 40 45 Thr Asn Xaa Ala Xaa Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 50 55 60 <210> 5 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enlarged mammalian sushi domain consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X= T, V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X= P or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X= M or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X= V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X= W, R or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> X= S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> X=L or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> X=Y, H or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> X= I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> X= S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> X= T or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> X= L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> X= A or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> X= V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> X= H or Y <400> 5 Xaa Thr Cys Pro Xaa Pro Xaa Ser Xaa Glu His Ala Asp Ile Xaa Val 1 5 10 15 Lys Xaa Tyr Ser Xaa Xaa Ser Arg Glu Arg Tyr Xaa Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Xaa Leu Xaa Glu Cys Val Xaa Asn 35 40 45 Lys Xaa Thr Asn Xaa Ala Xaa Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 <210> 6 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> primate sushi domain consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X= P or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X= M or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X= W, R or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> X= Y or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> X= I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> X= V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> X= V or A <400> 6 Cys Pro Xaa Pro Xaa Ser Val Glu His Ala Asp Ile Xaa Val Lys Ser 1 5 10 15 Tyr Ser Leu Xaa Ser Arg Glu Arg Tyr Xaa Cys Asn Ser Gly Phe Lys 20 25 30 Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala 35 40 45 Thr Asn Xaa Ala Xaa Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 50 55 60 <210> 7 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enlarged primate sushi domain consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X= V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X= P or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X= M or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X= W, R or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> X= Y or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> X= I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> X=V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> X=H or Y <400> 7 Xaa Thr Cys Pro Xaa Pro Xaa Ser Val Glu His Ala Asp Ile Xaa Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Xaa Ser Arg Glu Arg Tyr Xaa Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Xaa Ala Xaa Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 50 55 60 <210> 8 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser 1 5 10 15 Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys 20 25 30 Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala 35 40 45 Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 50 55 60 <210> 9 <211> 64 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 <210> 10 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mammalian sushi and domains consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X= T, V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X= P or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X= M or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X= V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X= W, R or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> X= S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> X= L or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> X= Y, H or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> X= I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> X= S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> X= T or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> X= L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> X=A or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> X= V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> X= H or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> X= H or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> X=A, S or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> X= V, A, S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (71)..(71) <223> X= H or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> X= Q or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73) <223> X= R, S or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75) <223> X= A, V or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> X= P or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> X= P or T <400> 10 Xaa Thr Cys Pro Xaa Pro Xaa Ser Xaa Glu His Ala Asp Ile Xaa Val 1 5 10 15 Lys Xaa Tyr Ser Xaa Xaa Ser Arg Glu Arg Tyr Xaa Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Xaa Leu Xaa Glu Cys Val Xaa Asn 35 40 45 Lys Xaa Thr Asn Xaa Ala Xaa Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa 65 70 75 <210> 11 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> primate sushi and domains consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X= V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X= P or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X= M or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X= W, R or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> X= Y or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> X= I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> X= V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> X= H or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> X= A, S or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> X= V, A or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (71)..(71) <223> X= H or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75) <223> X= A or V <400> 11 Xaa Thr Cys Pro Xaa Pro Xaa Ser Val Glu His Ala Asp Ile Xaa Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Xaa Ser Arg Glu Arg Tyr Xaa Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Xaa Ala Xaa Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Xaa Leu Xaa Xaa Gln Arg Pro Xaa Pro Pro 65 70 75 <210> 12 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro 65 70 75 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptidic linker <400> 13 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Gln 20 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptidic linker <400> 14 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly 20 <210> 15 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptidic linker <400> 15 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Gln 20 <210> 16 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptidic linker <400> 16 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 17 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RLI <400> 17 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Gly Gly 65 70 75 80 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu 100 105 110 Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val 115 120 125 His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu 130 135 140 Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val 145 150 155 160 Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 165 170 175 Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn 180 185 190 Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile 195 200 205 Asn Thr Ser 210 <210> 18 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ANti-HER2Neu light chain <400> 18 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Gly Gly 65 70 75 80 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu 85 90 95 Gln Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu 100 105 110 Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val 115 120 125 His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu 130 135 140 Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val 145 150 155 160 Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 165 170 175 Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn 180 185 190 Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile 195 200 205 Asn Thr Ser 210

Claims (14)

  1. 고용량의 인터류킨-2(High Dose of interleukin-2, HDIL-2)로 얻어지는 증식 보다 높거나 같은 자연 살해 세포 (NK cell)의 증식을 유도하기 위한 유효량의 컨쥬게이트를 투여하여 대상체의 암 (cancer), 감염 (infection), 또는 면역결핍 장애 (immunodeficiency disorder)를 치료하기 위한 약학적 조성물:
    상기 컨쥬게이트는
    a) 인터류킨-15; 또는 키트225 세포주(Kit225 cell line)의 증식 유도에 대한 인간 인터류킨-15의 활성의 10% 이상을 가지고, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열과 92.5% 이상의 상동성을 갖는 인터류킨-15의 유도체의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 및
    b) IL-15Rα의 스시 도메인 (Sushi domain)의 아미노산 서열; 또는 인간 인터류킨-15에 대한 인간 IL-15Rα의 스시 도메인의 결합 활성의 10% 이상을 가지고 SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:9로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 92% 이상의 상동성을 갖는 IL-15Rα의 스시 도메인의 유도체의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하며,
    상기 컨쥬게이트의 유효량은 20 내지 80 pmol/kg이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 컨쥬게이트는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 결합된 것인, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 컨쥬게이트의 유효량은 500 내지 2,000 ng/kg 인, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 인터류킨-15 유도체는 키트225 세포주의 증식 유도에 대한 인간 인터류킨-15의 활성의 25% 이상을 갖는 것; 또는
    SEQ ID NO:3의 아미노산 서열과 96% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열인, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 IL-15Rα의 스시 도메인의 유도체는 인간 IL-15Rα의 스시 도메인의 결합 활성의 25% 이상을 갖는 것; 또는
    SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:9로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 96% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열인, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 컨쥬게이트는 HDIL-2로 얻어진 것보다 더 높은 CD8 T 세포의 증식을 유도하는 양으로 투여되는 것인, 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 말기 (TNM 등급 IV) 암; 또는 전이성 암 (metastatic cancer)을 치료하기 위한 것이고, 상기 컨쥬게이트의 투여량은 HDIL-2로 얻어진 증식보다 더 높은 NK 세포의 증식을 유도하는 것인, 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 컨쥬게이트는
    (I) HDIL-2로 얻어진 증식보다 20% 이상 더 높은 NK 세포의 증식을 유도하는 용량; 및/또는
    (II) HDIL-2로 얻어진 증식보다 20% 이상 더 높은 CD8+ T 세포의 증식을 유도하는 용량으로 투여되는 것인, 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 비-전이성 암, TNM 등급 I, II 또는 III기 암, 또는 감염을 치료하기 위한 것이고, 상기 컨쥬게이트의 투여량은 HDIL-2로 얻어진 증식보다 높거나 같은 NK 세포의 증식을 유도하는 것 인, 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    (I) 상기 컨쥬게이트는 HDIL-2로 얻어진 것과 같거나 최대 50% 높게 자연 살해 세포(NK cell)의 증식을 유도하는 양으로 투여되는 것;
    (II) 상기 컨쥬게이트는 HDIL-2로 얻어진 것과 같거나 최대 200% 높게 CD8+ T 세포의 증식을 유도하는 양으로 투여되는 것; 및/또는
    (III) 상기 컨쥬게이트는 0.16 pmol/ml 내지 4 pmol/ml (4 ng/ml 내지 100 ng/ml)에 포함되는 혈중농도에 대응되는 용량으로 투여되는 것인, 약학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 컨쥬게이트의 투여량은 Treg 세포 (FoxP3+CD4+CD25high, Treg cell)의 증식을 HDIL-2로 얻어진 증식보다 더 적게 유도하는 것인, 약학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    (I) 상기 컨쥬게이트의 투여량은 유도된 Treg 세포의 증식율에 대한 유도된 NK 세포의 증식율의 비율이 HDIL-2로 얻어진 것보다 25% 이상 높은 것에 해당하고; 및/또는
    (II) 상기 컨쥬게이트의 투여량은 유도된 Treg 세포의 증식율에 대한 유도된 CD8 T 세포의 증식율의 비율이 HDIL-2로 얻어진 것보다 25% 이상 높은 것에 해당하는, 약학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 컨쥬게이트는 다음 중 하나 이상을 포함하는 것인, 약학적 조성물:
    (I) 상기 컨쥬게이트의 폴리펩티드 a)와 폴리펩티드 b)는 융합 단백질로 공유 결합되는 것;
    (II) 상기 인터류킨-15는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열로 이루어진 것이고 IL-15Rα의 스시 도메인은 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열로 이루어진 것;
    (III) 상기 컨쥬게이트는 IL-15Rα의 스시 도메인(sushi domain) 또는 그 유도체의 아미노산 서열보다 C-말단 위치(C-terminal position)에 인터류킨-15 또는 그 유도체의 아미노산 서열을 포함하는 것; 및
    (IV) 상기 인터류킨 15 또는 그 유도체의 아미노산 서열 및 상기 IL-15Rα의 스시 도메인 또는 그 유도체의 아미노산 서열은 5-30 아미노산의 길이를 갖는 링커(linker) 아미노산 서열에 의하여 분리되고, 상기 링커는 Gly (G), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Ala (A), Leu (L), 및 Gln (Q)을 포함하는 그룹에서 선택된 아미노산을 포함하는 것.
  14. 제1항에 있어서,
    (I) 상기 투여량은 하루 당 투여 용량이고; 및/또는
    (II) 상기 조성물은 비경구 투여되는 것인, 약학적 조성물.
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