JP2016518361A - 血管漏出症候群の発生を抑制するサイトカイン治療 - Google Patents

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Abstract

本発明は、高用量のインターロイキン−２（ＨＤＩＬ−２）を用いて得られるナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の増殖以上の増殖を誘導する用量のＩＬ−１５誘導体コンジュゲートを医薬的に許容可能なキャリアと共に投与することにより対象の癌又は感染症を治療するための医薬組成物に関する。【選択図】なし

Description

本国際特許出願は、２０１３年４月１９日に出願された欧州特許出願ＥＰ１３００２０６６．２号の優先権を主張し、その出願は本明細書に参照として組み込まれる。
本発明は、対象における癌及び／又は感染症を治療するための新規の医薬組成物及びそれに関連する方法に関する。
免疫療法は、腫瘍若しくは病原菌に対する有効な保護、又は存在する腫瘍若しくは病原菌の有効な除去のための免疫系の能力の欠如を克服するために、ここ数十年の間に開発されてきた。
免疫療法の中で、サイトカインに基づくものが特に関心をもたれている。それらの分子は、可溶性の分子であり、液性及び／又は細胞性免疫を制御している。それらの中で、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５が特に関心をもたれており、これらはＮＫ細胞の生存及び／又は増殖を誘導するので、感染症又は癌の治療のためのアジュバントとして関心がもたれている。
一例として、ヒトｒＩＬ−２は、転移性黒色腫又は腎癌を患う患者において２５〜３０％の腫瘍退縮を起こすことを示した。断続的なＩＬ−２療法は、高活性抗レトロウィルス療法と組み合わせてＨＩＶ感染患者にも用いられ、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の保護レベルの維持を取り戻す。
それにもかかわらず、そのようなサイトカインの使用は、それらの用量依存的な毒性のために制限され、それは特に血管漏出症候群（ＶＬＳ）として現れ、これは血管透過性の増大及び微小循環性灌流の低減により特徴付けられ、ＩＬ−２投与後、２〜２４時間以内に間質浮腫及び多臓器不全を引き起こす。
サイトカイン誘導性ＶＬＳのメカニズムの分析は、ＶＬＳのいくつかの段階におけるサイトカイン誘導性ＮＫ細胞の関連を証明した（ASSIER et al., Cytokines, vol.32(6), p:280-6, 2005）。Ｔ細胞のＶＬＳへの関連は、ＶＬＳがＴｒｅｇ細胞の欠損により顕著となることでも立証された（KOTTKE et al., Mol. Ther., vol.16(7), p:1217-26, 2008）。
サイトカインの使用は、実際に、非許容性又は致死的なＶＬＳを誘導しない範囲で、最大限のＮＫ細胞の増殖を誘導するように制限される。
この要件及び疑わしい安全性のため、サイトカインの高用量での使用は、実際に、慢性感染症及び進行した転移性癌に限定される。
今般、本願発明者らは、ｈＩＬ−１５アミノ酸配列を含む分子（ＲＬＩ）がＩＬ−１５又はＩＬ−２のうちのいずれかと比較して全く異なる安全性を示し、ＲＬＩの安全性が好ましいことを驚くべきことに見出した。その結果は、ＩＬ−２及びＩＬ−１５では考えられない治療ウィンドウでＲＬＩが使用され得ることを示す。
この安全性は、予後不良に関連する疾病を治療するために高用量のＲＬＩの使用を可能とし、正しい予後又は予後良好に関連する疾病を治療するためにより低い用量のＲＬＩの使用を可能とする。
従って、本発明は、第１の態様において、高用量のインターロイキン−２（ＨＤＩＬ−２）を用いて得られるナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の増殖以上の増殖を誘導するような量のコンジュゲートを対象に投与することにより、該対象の癌、感染症又は免疫不全障害を治療するための組成物に関し、該コンジュゲートは、
ａ）インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、
ｂ）ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む。
第２の態様において、本発明は、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の増殖以上の増殖を誘導するような量のコンジュゲートを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、該対象の癌、感染症又は免疫不全障害を治療するための方法に関し、該コンジュゲートは、
ａ）インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、
ｂ）ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む。
好ましくは、コンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＣＤ８Ｔ細胞の増殖よりも高い増殖を誘導する量が投与される。
第３の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＴｒｅｇ細胞（FoxP3+CD4+CD25high）の増殖よりも低い増殖を誘導する量が対象に投与される。
第３の態様において、本発明は、癌、感染症又は免疫不全障害を患う対象に投与するためのコンジュゲートの治療有効量を決定するための（インビトロ）方法に関し、該方法は、
ｉ）前記対象から得られた末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）をＰＢＭＣの増殖が可能な培養条件下において、所定の段階的に増大させた複数の用量のコンジュゲートと接触させるステップと、
ｉｉ）前記対象から得られた他のＰＢＭＣをＰＢＭＣの増殖が可能な培養条件下において、高用量のインターロイキン−２と接触させるステップと、
ｉｖ）ＨＤＩＬ−２を用いて得られたＰＢＭＣにおけるＮＫ細胞の増殖以上の増殖を誘導するようなコンジュゲートの治療有効量を選択するステップとを含む。
好ましくは、該治療有効量のコンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られたＴｒｅｇ細胞の増殖率に対するＮＫ細胞及び／又はＣＤ８Ｔ細胞の増殖率の比率よりも少なくとも２５％高い比率、好ましくは少なくとも５０％高い比率、より好ましくは少なくとも７５％高い比率を誘導する。
図１は、ＩＬ−２及びＩＬ−１５と比較したヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）におけるインビトロでのＲＬＩの用量効果を示す。 図２は、ＩＬ−２及びＩＬ−１５と比較したヒトＴｒｅｇの分集団におけるインビトロでのＲＬＩの効果を示す。 図３は、ハツカネズミへの注射のプロトコールを示す。 図４は、ＰＢＳ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＲＬＩのいずれかが注射されたマウスにおけるＮＫ細胞、ＣＤ８＋細胞、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＦｏｘｐ３−ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖率を示す。 図５は、ＰＢＳ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＲＬＩが注射されたマウスにおけるＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖に対するＮＫ細胞の増殖の比率を示す。 図６は、ＰＢＳ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＲＬＩのいずれかが注射されたマウスにおけるＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞のうちの細胞を産生するＩＦＮγの割合、並びにＰＢＳ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＲＬＩのいずれかが注射されたマウスにおけるＹＡＣ−１細胞株に対するＮＫ細胞の細胞毒性の割合を示す。 図７は、ドナー細胞とＰＢＳ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＲＬＩとが注射されたマウスにおけるドナー細胞、ＭＰＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の総細胞数を示す。 図８は、ドナー細胞とＰＢＳ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＲＬＩとが注射されたマウスにおけるＶＬＳを示す。 サイトカイン療法に依存する腫瘍体積の進展を示す。 図１０は、時間の関数として注射量に依存するマカクの血液中のＲＬＩ用量の観察された進展及びモデル化された進展を示す。 図１１は、ＰＢＳ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＲＬＩが注射されたマウスにおいて誘導されたＶＬＳ対ＮＫ細胞及びＣＤ８細胞の増殖を示す。 図１２は、ＰＢＳと比較したの等モル量のＲＬＩ、ＩＬ−２及びＩＬ−１５による健康なドナーのＰＢＭＣからのＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の３、４、５、６及び７日後のインビトロ増殖効果を示す。 図１３は、ＮＫ細胞の増大におけるＲＬＩの用量応答効果を示す。 図１４は、肺及び肝臓のＶＬＳにおけるＲＬＩの用量応答効果を示す。 図１５は、肺のＶＬＳにおけるＲＬＩの用量応答効果を示す。 図１６は、ＮＫ細胞の増大におけるＲＬＩの用量応答効果を示す。 図１７は、Ｔｒｅｇ細胞の増大におけるＲＬＩの用量応答効果を示す。 図１８は、Ｔｒｅｇ対ＮＫ細胞の比率におけるＲＬＩの用量応答効果を示す。 図１９は、ＲＬＩの薬理学的有効性対毒性を示す。
本明細書において用いられる「対象」の用語は、げっ歯動物、ネコ科動物、イヌ科動物又は霊長類動物等の哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。
本技術分野における一般的な意味の「コンジュゲート」の用語は、共有結合又は非共有結合複合体、好ましくは共有結合複合体、最も好ましくは融合タンパク質を意味する。
「インターロイキン２」は、本技術分野における一般的な意味で用いられる（核酸及びアミノ酸配列についてはそれぞれ受け入れ番号ＮＭ＿０００５８６．３及びＮＰ＿０００５７７．２を参照）。
「高用量インターロイキン−２」又は「ＨＤＩＬ−２」の表現は、当業者に周知である。高用量のＩＬ−２（８時間毎に１回の静脈内投与により６０００００〜７２００００ＩＵ／ｋｇ）は、米国において最も一般的に用いられるレジメンである。一例として、転移性腎細胞癌又は黒色腫（６か月未満の予後中央値の癌）の治療のための食品医薬品局（ＦＤＡ）承認の用量は、１４の用量の最大において、８時間毎に１５分かけて静脈内投与で６０００００ＩＵ／ｋｇである。その後に９日間あけて、患者に許容されるならばそのレジメンが繰り返される。毒性を低減し得るため低用量の皮下投与ＩＬ−２レジメン（１００万〜３０００万ＩＵ／ｍ２／ｄ）が研究されているが、有効性も低減する（FYFE, FISHER & ROSENBERG et al., J. Clin. Oncol., vol.13,p:668-696, 1995）。ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）の生物学的効果は、リンパ球の増殖のバイオアッセイにより決定され、インターロイキン−２（ヒト）の世界保健機関の一次国際標準品により確立された国際単位で表される。有効性とタンパク質の量との関係は、以下の通りであり、１８００万国際単位のＰＲＯＬＥＵＫＩＮ＝１．１ｍｇのタンパク質である。法務当局（例えばＦＤＡ、ＥＭＡ等）が、代替的治療が無い状況で患者の生存率を増大させる致死的疾患（例えば転移性腎細胞癌又は黒色腫）の治療におけるより重大な副作用を許容することに注目すべきである。
本技術分野において一般的な意味の「インターロイキン１５」の用語は、ＩＬ−２に類似の構造を有するサイトカインを意味する（GRABSTEIN et al., Science, vol.264(5161), p:965-968, 1994）。このサイトカインは、ＩＬ−１５、ＩＬ１５又はＭＧＣ９７２１としても知られている。このサイトカイン及びＩＬ−２は、多くの生物学的活性を共有し、それらは共通のヘマトポエチン受容体サブユニットと結合することが知られている。従って、それらは、同一の受容体に対して競合し、互いの活性を負に制御する。ＩＬ−１５がＴ細胞及びナチュラルキラー細胞の活性及び増殖を制御すること、並びにＣＤ８＋メモリ細胞の数がこのサイトカインとＩＬ２との間のバランスにより制御されることが立証されている。ＩＬ−１５の活性は、実施例に開示するように、ｋｉｔ２２５細胞株（HORI et al., Blood, vol.70(4), p:1069-72, 1987）での増殖誘導を決定することにより測定され得る。
前記ＩＬ−１５又はその誘導体は、ｋｉｔ２２５細胞株の増殖誘導における少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％のヒトインターロイキン−１５の活性を有する。
前記インターロイキン１５は、哺乳動物のインターロイキン１５、好ましくは霊長類のインターロイキン１５、より好ましくはヒトインターロイキン１５である。
哺乳動物インターロイキン１５は、当業者により簡単に同定され得る。一例として、Sus scrofa (受け入れ番号ABF82250), Rattus norvegicus (受け入れ番号NP_037261), Mus musculus (受け入れ番号 NP_032383), Bos Taurus (受け入れ番号NP_776515), Oryctolagus cuniculus (受け入れ番号NP_001075685), Ovies aries (受け入れ番号NP_001009734),Felis catus (受け入れ番号NP_001009207), Macaca fascicularis (受け入れ番号BAA19149), Homo sapiens (受け入れ番号NP_000576),Macaca Mulatta (受け入れ番号NP_001038196), Cavia porcellus (受け入れ番号NP_001166300), 又はChlorocebussabaeus (受け入れ番号ACI289)由来のものが挙げられ得る。
本明細書で用いられる「哺乳動物のインターロイキン１５」の用語は、SEQ ID No.1のコンセンサス配列を意味する。
霊長類のインターロイキン１５は、当業者により簡単に同定され得る。一例として、Sus scrofa (受け入れ番号ABF82250), Oryctolagus cuniculus (受け入れ番号NP_001075685), Macacafascicularis (受け入れ番号BAA19149), Homo sapiens (受け入れ番号NP_000576), Macaca Mulatta (受け入れ番号NP_001038196), 又はChlorocebus sabaeus (受け入れ番号ACI289)由来のものが挙げられ得る。
本明細書で用いられる「霊長類のインターロイキン１５」は、SEQ ID No.2のコンセンサス配列を意味する。
ヒトインターロイキン１５は、当業者により簡単に同定され、SEQ ID No.3のアミノ酸配列を意味する。
本明細書で用いられる「インターロイキン１５誘導体」の用語は、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2及びSEQ ID No.3からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９２．５％の同一性の割合（すなわち、約１０アミノ酸置換がある）、好ましくは少なくとも９６％（すなわち、約５アミノ酸置換がある）、より好ましくは少なくとも９８．５％（すなわち、約２アミノ酸置換がある）又は少なくとも９９％（すなわち、約１アミノ酸置換がある）の同一性の割合を有するアミノ酸配列を示すものである。そのような誘導体は、自身の知識及び本願の教示を考慮して当業者により簡単に同定され得る。そのような誘導体の一例として、国際公開ＷＯ２００９／１３５０３１の記載が挙げられ得る。また、天然アミノ酸は化学修飾アミノ酸に置換され得ることも理解されるであろう。一般に、そのような化学修飾アミノ酸は、ポリペプチド半減期を増大する。
本明細書で用いられる２つのアミノ酸配列の間の「同一性の割合」は、比較される２つの配列の最も良好なアライメントで得られた配列間の同一のアミノ酸の割合を意味し、この割合は純粋に統計的であり、これら２つの配列間の差はアミノ酸配列中にランダムに広がる。本明細書で用いられる「最も良好なアライメント」又は「最適なアライメント」は、決定された同一性の割合（以下参照）が最も高いアライメントを意味する。２つのアミノ酸配列間の配列比較は、通常、最も良好なアライメントに従って予め整列された配列を比較することにより実現され、この比較は、類似の局所領域を同定及び比較するために比較の部分で実現される。比較を行うのに最も良好な配列アライメントは、手動の方法の他に、SMITH及びWATERMAN (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981)により開発された局所的相同性アルゴリズム（local homology algorithm）、PEARSON及びLIPMOLAN (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988)により開発された全体的相同性アルゴリズム（global homology algorithm）、PEARSON及びLIPMOLAN (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988)により開発された類似度の方法（methodof similarities）、それらのようなアルゴリズムを用いたコンピュータソフトウェア(GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA（Wisconsin Geneticssoftware Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA）)、又はＭＵＳＣＬＥマルチアライメントアルゴリズム（Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004）を用いることによって実現され得る。最も良好な局所的アライメントを得るために、BLOSUM 62マトリクスと共にBLASTソフトウェアが好適に用いられ得る。アミノ酸の２つの配列間の同一性の割合は、最適に整列されたこれら２つの配列を比較することにより決定され、それら２つのアミノ酸配列間の最適な整列を得るために参照配列に対して付加又は欠失を含み得る。同一性の割合は、これら２つの配列間の同一の位置の数を決定し、この数を比較された位置の総数で割り、得られた数値に１００を掛けることにより算出される。
好ましくは、インターロイキン１５誘導体は、ＩＬ−１５のアゴニスト又はスーパーアゴニストである。当業者は、ＩＬ−１５アゴニスト又はスーパーアゴニストを簡単に同定し得る。ＩＬ−１５アゴニスト又はスーパーアゴニストの一例として、国際公開ＷＯ２００５／０８５２８２又はZHU et al. (J. Immunol., vol.183(6), p:3598-607, 2009)に開示されているものが挙げられ得る。
さらに好ましくは、ＩＬ−１５アゴニスト又はスーパーアゴニストは、L45D, L45E, S51D, L52D, N72D, N72E, N72A, N72S, N72Y 及びN72P（ヒトＩＬ−１５の配列、SEQ IDNo.3を参照とする）を含む又はからなる群から選択される。
本明細書で用いられる「ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン」の用語は、本技術分野における一般的な意味を有するものであり、ＩＬ−１５Ｒαのシグナルペプチドの後の第１システイン残基（Ｃ１）で始まり、前記シグナルペプチドの後の第４システイン残基（Ｃ４）で終わるドメインを意味する。ＩＬ−１５Ｒαの細胞外領域の部分に対応するスシドメインは、ＩＬ−１５に結合するために必要である（WEI et al., J. Immunol., vol.167(1), p:277-282, 2001）。
ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体は、ヒトインターロイキン−１５に対して少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％の結合活性を有する。この結合活性は、WEI et al. (abovementioned, 2001)に開示された方法により簡単に決定できる。
このＩＬ−１５Ｒαのスシドメインは、哺乳動物のＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン、好ましくは霊長類のＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン、より好ましくはヒトのＩＬ−１５Ｒαのスシドメインである。
哺乳動物のＩＬ−１５Ｒαのスシドメインは、当業者により簡単に同定され得る。一例として、Rattus norvegicus (受け入れ番号XP_002728555), Mus musculus (受け入れ番号EDL08026), Bos Taurus (受け入れ番号XP_002692113), Oryctolagus cuniculus (受け入れ番号XP_002723298), Macacafascicularis (受け入れ番号ACI42785), Macaca nemestrina (受け入れ番号ACI42783), Homo sapiens (受け入れ番号CAI41081), Macaca Mulatta (受け入れ番号NP_001166315), Pongo abelii (受け入れ番号XP_002820541), Cercocebus torquatus (受け入れ番号ACI42784), Callithrix jacchus (受け入れ番号XP_002750073),又はCaviaporcellus (受け入れ番号NP_001166314)由来のものが挙げられ得る。
本明細書で用いられる「哺乳動物のＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン」の用語は、SEQ ID No.4のコンセンサス配列を意味する。
好ましくは、哺乳動物ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、SEQ ID No.5のコンセンサス配列を意味する。
霊長類のＩＬ−１５Ｒαのスシドメインは、当業者により簡単に同定され得る。一例として、Oryctolagus cuniculus, Macaca fascicularis, Macaca nemestrina, Homosapiens, Macaca Mulatta, Pongo abelii, Cercocebus torquatus, 又はCallithrixjacchus由来のＩＬ−１５Ｒαのスシドメインが挙げられ得る。
本明細書で用いられる「霊長類のＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン」の用語は、SEQ ID No.6のコンセンサス配列を意味する。
好ましくは、霊長類のＩＬ−１５Ｒαのスシドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、SEQ ID No.7のコンセンサス配列を意味する。
ヒトのＩＬ−１５Ｒαのスシドメインは、当業者により簡単に同定され得て、また、SEQ ID No.8のアミノ酸配列を意味する。
好ましくは、ヒトのＩＬ−１５Ｒαのスシドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、SEQ ID No.9を意味する。
本明細書で用いられる「ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインの誘導体」の用語は、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、およびSEQ ID No.9からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９２％（すなわち約５つのアミノ酸置換に相当する）、好ましくは少なくとも９６％（すなわち約２つのアミノ酸置換に相当する）、より好ましくは少なくとも９８％(すなわち約１つのアミノ酸置換に相当する)の同一性の割合を有するアミノ酸配列を意味する。そのような誘導体は、ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインの４つのシステイン残基を含み、一般的な知見及び本願の教示から当業者によって簡単に同定され得る。また、天然アミノ酸は、化学修飾されたアミノ酸に置換され得ることも理解されるであろう。一般に、そのような化学修飾されたアミノ酸は、ポリペプチドの半減期を増大できる。
好ましい実施形態において、コンジュゲートは、ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン、又はそれらの誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド(ｂ)を備えている。
ＩＬ−１５Ｒαのヒンジドメインは、スシドメインの後の第１アミノ残基で始まり、グリコシル化の第１候補サイトの前の最後のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列で定義される。ヒトＩＬ−１５Ｒαにおいて、ヒンジ領域のアミノ酸配列は、このＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン後、すなわちスシドメインよりもＣ末端側に位置する１４のアミノ酸からなり、言い換えると、ＩＬ−１５Ｒαのヒンジ領域は、前記（Ｃ４）システイン残基後の第１アミノ酸で始まり、その後の１４番目のアミノ酸で終わる（標準的にＮ末端からＣ末端方向に数える）。
ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメインは、哺乳動物のＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン、好ましくは霊長類のＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン、より好ましくはヒトＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメインである。
哺乳動物のＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメインのアミノ酸配列は、当業者により簡単に同定され得る。本明細書で用いられる「哺乳動物のＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン」は、SEQ ID No.10のコンセンサス配列を意味する。
霊長類のＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメインのアミノ酸配列は、当業者により簡単に同定され得る。本明細書で用いられる「霊長類のＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン」はSEQ ID No.11のコンセンサス配列を意味する。
ヒトのＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメインのアミノ酸配列は、当業者により簡単に同定され得る。本明細書で用いられる「ヒトのＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン」はSEQ ID No.12のコンセンサス配列を意味する。
本明細書で用いられる「ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメインの誘導体」の用語は、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11およびSEQ ID No.12からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９３％（すなわち約５つのアミノ酸置換に相当する）、好ましくは少なくとも９７％（すなわち約２つのアミノ酸置換に相当する）、より好ましくは少なくとも９８％(すなわち約１つのアミノ酸置換に相当する)の同一性の割合を有するアミノ酸配列を意味する。そのような誘導体は、ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインの４つのシステイン残基を含み、一般的な知見及び本願の教示から当業者によって簡単に同定され得る。また、天然アミノ酸は、化学修飾されたアミノ酸に置換され得ることも理解されるであろう。一般に、そのような化学修飾されたアミノ酸は、ポリペプチドの半減期を増大できる。
コンジュゲートのポリペプチドａ）及びｂ）の両方は、米国特許ＵＳ８１２４０８４Ｂ２及び国際公開ＷＯ２０１２／０４０３２３に開示された複合体等に非共有結合され得る。そのようなコンジュゲート又は複合体は、適当な量のポリペプチドａ）を準備し、適当な量のポリペプチドｂ）を準備し、それらのポリペプチドを適当なｐＨ及びイオン条件下で複合体（すなわちコンジュゲート）形成を可能とするのに十分な時間で混合し、任意に得られた複合体を濃縮又は精製することにより簡単に得られ得る。その複合体（すなわちコンジュゲート）のポリペプチドは、例えば各ポリペプチドを細胞又は細胞抽出物において別々に発現させ、それらのポリペプチドを単離及び生成することによる標準的な方法に従ったペプチド合成を用いて生成され得る。任意に、本発明の治療的ポリペプチド複合体は、ポリペプチドａ）及びｂ）の両方を同一の細胞又は細胞抽出物において発現し、例えばリンホカイン部、リンホカイン受容体部又はその複合体に対する抗体を用いた親和性クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー技術を用いて単離及び精製することにより生成され得る。
コンジュゲートの両方のポリペプチドａ）及びｂ）は、二機能性タンパク質結合剤を用いて共有結合又は融合タンパク質として共有結合され得る。
二機能性タンパク質結合剤は、当業者に周知であり、例えばＮ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキアンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トルエン２，６ジイソシアネート等）、及びビス−活性フルオリン化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を含む。
「融合タンパク質」の用語は、元は別のタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子を結合することで生成されたタンパク質を意味する。これはキメラタンパク質としても知られている。この融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能特性を有する単一のポリペプチドを生じる。組換え型融合タンパク質は、生物学的研究又は治療のために、組換えＤＮＡ技術により人工的に生成される。組換え型融合タンパク質は、融合遺伝子の遺伝子工学により生成されるタンパク質である。一般に、これは、第１のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列からストップコドンを除去し、ライゲーション又はオーバーラップエクステンションＰＣＲにより第２のタンパク質のｃＤＮＡ配列をフレームに付加することを必要とする。その後、そのＤＮＡ配列は、単一のタンパク質として細胞により発現される。そのタンパク質は、元の両方のタンパク質又はいずれか１つのタンパク質の全体配列を含むように構築され得る。
好ましい実施形態において、コンジュゲートは融合タンパク質である。
インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列は、ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列に対して、Ｃ末端側又はＮ末端側に位置され得る。好ましくは、インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列は、ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列に対して、Ｃ末端側に配置される。
インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列、及びＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列は、「リンカー」のアミノ酸配列により分離され得る。その「リンカー」のアミノ酸配列は、融合タンパク質が適切な二次構造又は三次構造を形成することを確実にするのに十分な長さを有し得る。
リンカーのアミノ酸配列の長さは、融合タンパク質の生物学的活性に顕著な影響を与えることなく変更され得る。一般に、リンカーのアミノ酸配列は、少なくとも１つ、但し３０以下のアミノ酸、例えば５〜３０のアミノ酸、好ましくは１０〜３０のアミノ酸、より好ましくは１５〜３０のアミノ酸、さらに好ましくは１５〜２５のアミノ酸、最も好ましくは１８〜２２のアミノ酸を含む。
好ましいリンカーのアミノ酸配列は、コンジュゲートを適切な構造（すなわち、ＩＬ−１５Ｒβ／γシグナル経路を通る適切なシグナル伝達活性を可能にする構造）をとる配列である。
最も適切なリンカーのアミノ酸配列は、（１）フレキシブルな伸長構造をとり、（２）融合タンパク質の機能性ドメインと相互作用できる規則的な二次構造をとる性質を示さず、（３）機能性タンパク質ドメインとの相互作用を促進できる最小の疎水性又は電荷特性を有する。
好ましくは、リンカーのアミノ酸配列は、Gly (G), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Ala (A), Leu (L)及びGln (Q)を含む群、最も好ましくはGly(G), Asn (N)及びSer (S)を含む群から選択される中性に近いアミノ酸を含む。
リンカー配列の例は、米国特許第５０７３６２７号及び５１０８９１０号に記載されている。
例示的な本発明に特に適するフレキシブルリンカーは、SEQ ID No.13 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ), SEQ ID No.14(SGGSGGGGSGGGSGGGGSGG)又はSEQ ID No.15 (SGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ), 及び SEQ ID No.16 (SGGSGGGGSGGGSGGGGS)の配列によりコードされるリンカーを含む。
より好ましい実施形態において、コンジュゲートは、SEQ ID No.17又はSEQ ID No.18の配列を有する融合タンパク質と一致する。
「医薬的に許容可能」の表現は、生理的に許容可能であり、ヒトに投与した時に通常はアレルギー、又は急性胃蠕動及びめまい等のそれに類似する望まれない反応を生成しない分子及び組成物を意味する。好ましくは、本明細書で用いられる「医薬的に許容可能」の表現は、連邦若しくは州政府、又は米国で挙げられる薬局方若しくは他の一般に認知された薬局方の監督機関により、動物、特にヒトに用いることについて承認されることを意味する。
「キャリア」の用語は、化合物と共に投与される溶媒、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを意味する。そのような医薬的キャリアは、ピーナッツ油、大豆油、鉱油及びゴマ油等の原油、動物性油、植物性油又は合成油を含む水及び油等の無菌の液体であってもよい。
本発明の組み合わせの投与経路は、非経口であることが好ましく、本明細書で用いられる「非経口」の用語は、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣又は腹腔内の投与を含む。従って、医薬組成物は、注射のために医薬的に許容可能なビヒクルを含む。それは、特に、等張で無菌の食塩水（一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウム等、又はそれらのような塩の混合物）、又は場合によって無菌水又は生理食塩水が加えられ、注射溶液の構成を許容する乾燥、特に凍結乾燥された組成物であってもよい。適当な医薬的キャリアは、E.W. Martin の「Remington's Pharmaceutical Sciences"」に記載されている。
それらのうち、静脈内投与が最も好ましい。
コンジュゲートは、緩衝液若しくは水に可溶化され得る、又はエマルジョン、マイクロエマルジョン、ハイドロゲル（例えば、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡトリブロック共重合体に基づくハイドロゲル）、ミクロスフェア、ナノスフェア、微粒子、ナノ粒子（例えば（乳酸−グリコール酸）共重合体微粒子（例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリグルタメートミクロスフェア、ナノスフェア、微粒子又はナノ粒子）、リポソーム又は他のガレヌス製剤と組み合わせられ得る。すべての場合において、その製剤は、無菌で且つ注射に使用可能な程度の流動性を有しなければならない。また、それは、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び菌類等の微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。
コンジュゲートは、中性型又は塩の形態で組成物に組み込まれ得る。医薬的に許容可能な塩は、例えば塩酸若しくはリン酸等の無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸及びマンデル酸等の有機酸で生成される（タンパク質の遊離アミノ基で生成される）酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基で生成される塩は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化鉄等の無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基由来であってもよい。
キャリアは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、それらの混合液、及び植物油を含む溶媒又は分散媒体であってもよい。本発明のコンジュゲートは、生物利用性を増大させるために、例えばＰＥＧ化により修飾され得る。
適切な流動性は、例えばレシチン等のコーティングの使用、分散材の場合は必要な粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸及びチメロサール等の種々の抗菌剤及び抗真菌剤によりもたらされ得る。多くの場合、例えば糖又は塩化ナトリウムといった等張剤を含むことが好ましい。
注射可能組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、ポリオールといった吸収を遅延する薬剤、半減期を変更する共有結合性及び非共有結合性製剤の組成物の使用によってもたらされ得る。
加水分解及び変性を含むペプチドの不安定又は分解の原因は多くある。疎水的相互作用は、分子同士の集合を引き起こし得る（すなわち凝集）。安定化剤は、そのような問題を低減又は防止するために加えられ得る。
安定化剤は、シクロデキストリン及びその誘導体を含む（米国特許第５７３０９６９号を参照）。スクロース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、デキストラン及びグリセリン等の適当な保存剤は、最終製剤を安定にするために加えられ得る。イオン性及び非イオン性界面活性剤、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクツロン酸、トレハロース、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ並びにそれらの混合物から選択される安定化剤は、製剤に加えられ得る。アルカリ金属塩又は塩化マグネシウムの追加は、ペプチドを安定化させ得る。ペプチドは、デキストラン、コンドロイチン硫酸、スターチ、グリコーゲン、デキストリン及びアルギン酸塩からなる群から選択される糖質と接触されることにより安定化され得る。加えられ得る他の糖は、単糖類、二糖類、糖アルコール、及びそれらの混合物（例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、キシリトール）を含む。ポリオールは、ペプチドを安定化でき、水混和性又は水溶性である。適当なポリオールは、マンニトール、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチルグリコール、ビニルピロリドン、グルコース、フルクトース、アラビノース、マンノース、マルトース、スクロース及びそれらのポリマーを含むポリヒドロキシアルコール、単糖類及び二糖類であってもよい。種々の賦形剤は、ペプチドを安定化でき、血清アルブミン、アミノ酸、ヘパリン、脂肪酸及びリン脂質、界面活性剤、金属、ポリオール、還元剤、金属器レート剤、ポリビニルピロリドン、加水分解ゼラチン及び硫酸アンモニウムを含む。
本発明において、本明細書で用いられる「治療する」の用語は、そのような用語が適用される障害若しくは状態、又はそのような障害若しくは状態の１つ以上の症候群の進行を逆行する、緩和する、阻害する、又は防止することを意味する。
本明細書で用いられる「癌の治療」の用語は、癌細胞の増殖を阻害することを意味する。好ましくは、そのような治療は、腫瘍の増大の抑制、すなわち測定できる腫瘍のサイズの低減を引き起こす。最も好ましくは、そのような治療は、腫瘍の完全な退縮を引き起こす。
本明細書で用いられる「感染症の治療」の用語は、病原菌の複製／増殖の阻害を意味する。
本明細書で用いられる「免疫不全障害の治療」の用語は、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞の誘導を意味する。
コンジュゲートの「有効用量」は、腫瘍の増大又は病原菌の複製の低減を誘導するのに十分な量を意味する。投与に用いられる用量は、種々のパラメータ、特に用いられる投与の様式、関連する病理、又は所望の治療時間の関数として適合され得る。当然、医薬組成物の形態、投与経路、用量及びレジメンは、対象の治療される状態、病気の重症度、年齢、体重、及び性別等に依存する。以下に示す有効用量の範囲は、本発明を限定することを意図するものでなく、好ましい用量範囲を示すものである。しかしながら、好ましい用量は、過度の実験の必要なく当業者に理解及び確定させ得るように、個々の対象に適合され得る。
本発明のコンジュゲートの非常に重要な安全性のため、その投与は、制限されたＩＬ−２の治療ウインドウ及びＩＬ−１５で予想される治療ウインドウではない非常に重要な治療ウインドウを用いて、癌、感染症及び免疫不全障害を治療するために考えられる。
この安全性は、１）予後不良の慢性疾病（例えば転移性腎腺癌又は黒色腫）を治療するための非常に高用量のＲＬＩの使用、及び２）予後良好の疾病を治療するための低用量のＲＬＩの使用を予想することが可能である。
投与される量は、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＣＤ８Ｔ細胞の増殖よりも高い増殖を誘導する。
一例として、少なくとも１つのコンジュゲートの有効用量は、４０ｆｍｏｌ／ｋｇ又は０．２ｐｍｏｌ／ｋｇ（１ｎｇ／ｋｇ又は５ｎｇ／ｋｇ）以上であり、好ましくは１ｐｍｏｌ／ｋｇ又は２ｐｍｏｌ／ｋｇ（２５ｎｇ／ｋｇ又は５０ｎｇ／ｋｇ）以上であり、より好ましくは４ｐｍｏｌ／ｋｇ（１００ｎｇ／ｋｇ）、２０ｐｍｏｌ／ｋｇ（５００ｎｇ／ｋｇ）又は４０ｐｍｏｌ／ｋｇ（１ｍｃｇ／ｋｇ）以上である。コンジュゲートの分子量及び活性が影響し得るため、他の用量が用いられ得る。当業者はその範囲内にある適当な用量を決定し、また、必要な場合はその範囲外で決定することが容易に認められる。
他の例として、少なくとも１つのコンジュゲートの有効用量は、４ｆｍｏｌ／ｍｌ（０．１ｎｇ／ｍｌ）以上、好ましくは４０又は８０ｆｍｏｌ／ｍｌ（１又は２ｎｇ／ｍｌ）以上、より好ましくは０．１６０ｐｍｏｌ／ｍｌ（４ｎｇ／ｍｌ）以上の血中濃度に相当する。
有利には、少なくとも１つのコンジュゲートの投与用量は、２．４ｎｍｏｌ／ｋｇ（６０ｍｃｇ／ｋｇ）以下、好ましくは２ｎｍｏｌ／ｋｇ（５０ｍｃｇ／ｋｇ）又は１．２ｎｍｏｌ／ｋｇ（３０ｍｃｇ／ｋｇ）以下、より好ましくは１．０ｎｍｏｌ／ｋｇ（２５ｍｃｇ／ｋｇ）又は２００ｐｍｏｌ／ｋｇ（５ｍｃｇ／ｋｇ）以下である。
より有利には、少なくとも１つのコンジュゲートの投与用量は、０．１２ｎｍｏｌ／ｍｌ（３０００ｎｇ／ｍｌ）以下、好ましくは８０又は４０ｐｍｏｌ／ｍｌ（２０００又は１０００ｎｇ／ｍｌ）以下、より好ましくは２０ｐｍｏｌ／ｍｌ（５００ｎｇ／ｍｌ）又は１２ｐｍｏｌ／ｍｌ（３００ｎｇ／ｍｌ）以下である。
それらの投与用量は、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＣＤ８Ｔ細胞の増殖よりも高い増殖を誘導する。
第１の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、予後不良を伴う疾病を患う対象を治療するために用いられる。
本明細書で用いられる予後不良を伴う疾病は、予後中央値が２年以下、好ましくは１年以下、より好ましくは６か月以下である疾病である。
本明細書で用いられる予後不良を伴う疾病は、進行型（ＴＮＭグレードＩＶ）又は転移性癌である。
当該実施形態において、コンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の増殖よりも少なくとも２０％以上の増殖、好ましくは少なくとも２５％以上の増殖、より好ましくは少なくとも３０％以上の増殖を誘導する用量で投与される。
当該実施形態において、コンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖よりも少なくとも２０％以上の増殖、好ましくは少なくとも２５％以上の増殖、より好ましくは少なくとも３０％以上の増殖を誘導する用量で投与される。
一例として、少なくとも１つのコンジュゲートの有効用量は、２４〜２４００ｐｍｏｌ／ｋｇ（０．６〜６０ｍｃｇ／ｋｇ）、好ましくは２８〜８００ｐｍｏｌ／ｋｇ（０．７〜２０ｍｃｇ／ｋｇ）、より好ましくは３２〜４００ｐｍｏｌ／ｋｇ（０．８〜１０ｍｃｇ／ｋｇ）である。
他の例として、コンジュゲートは、０．４ｐｍｏｌ／ｍｌ〜０．１２ｎｍｏｌ／ｍｌ（１０ｎｇ／ｍｌ〜３０００ｎｇ／ｍｌ）、好ましくは０．４８ｐｍｏｌ／ｍｌ〜４０ｐｍｏｌ／ｍｌ（１２ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ）、より好ましくは０．６ｐｍｏｌ／ｍｌ〜２０ｐｍｏｌ／ｍｌ（１５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ）の血中濃度に相当する用量で投与される。
第２の好ましい実施形態において、当該コンジュゲートは、予後良好である対象を治療するために用いられる。
本明細書で用いられる予後良好を伴う疾病は、予後中央値が３年以上、好ましくは４年以上、より好ましくは５年以上である疾病である。
本明細書で用いられる予後良好を伴う疾病は、非転移性癌、好ましくはＴＮグレードＩ、ＩＩ若しくはＩＩＩの癌、又は感染症である。
当該実施形態において、コンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の増殖と比較して、同等又は最大で５０％又は２５％高い増殖、好ましくは同等又は最大で２０％高い増殖、より好ましくは同等又は最大で１０％高い増殖を誘導する用量で投与される。
当該実施形態において、コンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖と比較して、同等又は最大で２００％高い増殖、好ましくは同等又は最大で１５０％高い増殖、より好ましくは同等又は最大で１００％高い増殖を誘導する用量で投与される。
一例として、少なくとも１つのコンジュゲートの有効用量は、２〜２００ｐｍｏｌ／ｋｇ（５０〜５０００ｎｇ／ｋｇ）、好ましくは８〜２００ｐｍｏｌ／ｋｇ（２００〜５０００ｎｇ／ｋｇ）、より好ましくは２０〜８０ｐｍｏｌ／ｋｇ（５００〜２０００ｎｇ／ｋｇ）である。
他の例として、コンジュゲートは、４０ｆｍｏｌ／ｍｌ〜１２ｐｍｏｌ／ｍｌ（１ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ）、好ましくは８０ｆｍｏｌ／ｍｌ〜１２ｐｍｏｌ／ｍｌ（２ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ）、より好ましくは０．１６ｐｍｏｌ／ｍｌ〜４ｐｍｏｌ／ｍｌ（４ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ）の血中濃度に相当する用量で投与される。
驚くべきことに、本発明者らは、当該ＩＬ−１５誘導体がＨＤＩＬ−２を用いて得られる制御性Ｔ細胞の誘導よりも低い誘導を示すことを立証した。
第３の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＴｒｅｇ細胞（(FoxP3+CD4+CD25high）の増殖よりも低い増殖を誘導する用量で対象に投与される。
有利には、コンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＴｒｅｇ細胞の増殖よりも少なくとも５％低い増殖、好ましくは少なくとも１０％又は２０％低い増殖、より好ましくは少なくとも５０％低い増殖を誘導する用量で対象に投与される。
従って、制御性Ｔ細胞の誘導が極めて小さいため、ＩＬ−１５誘導体を用いて得られるＮＫ細胞及びＣＤ８細胞の誘導は、ＨＤＩＬ−２によるその誘導よりも有効性が高い。
好ましくは、コンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＴｒｅｇ細胞の増殖率に対するＮＫ細胞の増殖率の比率よりも少なくとも２５％高い比率、好ましくは少なくとも５０％高い比率、より好ましくは少なくとも７５％高い比率が得られる用量で対象に投与される。
好ましくは、コンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＴｒｅｇ細胞の増殖率に対するＣＤ８Ｔ細胞の増殖率の比率よりも少なくとも２５％高い比率、好ましくは少なくとも５０％高い比率、より好ましくは少なくとも７５％高い比率が得られる用量で対象に投与される。
これらの用量範囲内へのコンジュゲートの導入は、単回の治療又は一連の治療として行われ得る。実際に、単回の投与量は利益を提供し、疾病の治療／管理のために有効に利用される一方で、好ましい一連の治療は、複数の段階にわたって行われ、最も好ましくはその投与用量が一日の投与用量に対応する。この用量は、１日〜２０日、例えば１日〜１０日、好ましくは２日〜５日、最も好ましくは２日〜４日の間の期間で１日に１回投与され得る。また、投与用量は、類似する毎日のコンジュゲートの血中濃度を提供する長期投与を可能にする持続形態に基づいてもよい。
他の態様において、本発明は、癌、感染症又は免疫不全障害を患う対象に投与されるコンジュゲートの治療有効量を決定するための方法に関し、当該方法は、
ｉ）前記対象から得られた末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）をＰＢＭＣの増殖が可能な培養条件下において、所定の段階的に増大させた複数の用量のコンジュゲートと接触させるステップと、
ｉｉ）前記対象から得られた他のＰＢＭＣをＰＢＭＣの増殖が可能な培養条件下において、高用量のインターロイキン−２（ＨＤＩＬ−２）と接触させるステップと、
ｉｖ）ＨＤＩＬ−２を用いて得られたＰＢＭＣにおけるＮＫ細胞の増殖以上の増殖を誘導するようなコンジュゲートの治療有効量を選択するステップとを備えている。
好ましくは、コンジュゲートの治療有効量は、ＨＤＩＬ−２を用いて得られたＰＢＭＣにおけるＣＤ８Ｔ細胞の増殖以上の増殖を誘導する。
選択された治療有効量は、対象の癌、感染症又は免疫不全障害を治療するのに適する。
より好ましくは、その治療有効量は、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＴｒｅｇ細胞の増殖率に対するＮＫ細胞及び／又はＣＤ８Ｔ細胞の増殖率の比率よりも少なくとも２５％高い比率、好ましくは少なくとも５０％高い比率、より好ましくは少なくとも７５％高い比率が得られるように前記増殖を誘導する。
また、そのコンジュゲートの治療有効量は、コンジュゲートを含まない培養培地（すなわち、ＨＤＩＬ−２及びＩＬ−１５も含まない）を用いて得られたＮＫ細胞及び／又はＣＤ８Ｔ細胞の増殖よりも少なくとも５０％高い増殖を誘導する。
ＨＤＩＬ−２の存在下におけるＰＢＭＣの増殖が可能な培養条件は、当業者に周知であり、実施例に記載されている。
コンジュゲートの段階的に増大させた複数の用量は、４ｆｍｏｌ／ｍｌ〜１２０ｐｍｏｌ／ｍｌ（０．１ｎｇ／ｍｌ〜３０００ｎｇ／ｍｌ）、好ましくは４０ｆｍｏｌ／ｍｌ〜８０ｐｍｏｌ／ｍｌ（１ｎｇ／ｍｌ〜２０００ｎｇ／ｍｌ）、より好ましくは８０ｆｍｏｌ／ｍｌ〜４０ｐｍｏｌ／ｍｌ（２ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ）のコンジュゲートの濃度範囲にある。
ＨＤＩＬ−２は、当業者に周知であり、５０ＩＵ／ｍＬでＰＢＭＣを誘導する(MURPHY, WELNIAK, BACK et al., J. Immunol., vol.170, p:2727-33, 2003; ITOH etal., Cancer Immunol. Immunother., vol.32(2), p:88-94, 1990; ETTINGHAUSEN &ROSENBERG, Cancer Res., vol.46(6), p:2784-92, 1986)。
第１の好ましい実施形態において、対象は予後不良を伴う疾病を患っている。
当該実施形態において、ステップｉｖ）は、ＨＤＩＬ−２を用いて得られたナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の増殖よりも少なくとも２０％高い、好ましくは少なくとも２５％高い、より好ましくは少なくとも３０％高い増殖を誘導するコンジュゲートの用量の選択をする。
好ましくは、ステップｉｖ）は、ＨＤＩＬ−２を用いて得られたＣＤ８Ｔ細胞の増殖よりも少なくとも２０％高い、好ましくは少なくとも２５％高い、より好ましくは少なくとも３０％高い増殖を誘導するコンジュゲートの用量の選択をする。
第２の好ましい実施形態において、そのコンジュゲートは、予後良好を伴う対象を治療するのに用いられる。
当該実施形態において、ステップｉｖ）は、ＨＤＩＬ−２を用いて得られたナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の増殖と同等又はその増殖よりも最大で５０％若しくは２５％高い、好ましくは同等又は最大で２０％高い、より好ましくは同等又は最大で１０％高い増殖を誘導するコンジュゲートの用量の選択をする。
好ましくは、ステップｉｖ）は、ＨＤＩＬ−２を用いて得られたＣＤ８Ｔ細胞の増殖と同等又はその増殖よりも最大で２００％高い、好ましくは同等又は最大で１５０％高い、より好ましくは同等又は最大で１００％高い増殖を誘導するコンジュゲートの用量の選択をする。
第３の好ましい実施形態において、本発明の方法は、
ｉｉｉ）前記対象から得られた末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、前記ＰＢＭＣの増殖を可能にする培養条件下において、前記コンジュゲートと等モル量で段階的に増量されたＩＬ−１５と接触させるステップをさらに含む。
以下に、本発明が、アミノ酸配列、核酸配列及び実施例についてより詳細に説明される。しかしながら、その実施例が本発明を限定することを意図するものではない。本発明は、本明細書における実施例で明確に言及されていないが、当業者に過度の試行錯誤を強いらない事項を含むいずれの実施形態をも包含する。
ＲＬＩの有効性の決定のために、健康なヒトドナー由来のヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）から精製されたＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞のインビトロモデルをまず用いた。
１）ＲＬＩによるヒトリンパ球増殖の誘導
健康なボランティアから得られた末梢血単核球細胞（ＰＭＯＬＢＣ）を、FICOLL-HYPAQUE Gradient (LYMPHOPRE; 1.077 g/mL)により単離した。ドナーの血液を公的倫理同意に従って得た。
簡単に説明すると、ＰＢＭＣを２．５μＭのＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）で５分間標識し、ＮａＣｌで洗浄する。その後、ＰＢＭＣを、加湿された９５％空気で５％ＣＯ２の３７℃環境下において３〜７日間インキュベートする。細胞を回収し、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、及び生存細胞を選択するためのLIVE/DEAD Fixable Aquaで染色する。染色された細胞をFACSCanto II フローサイトメータ (BD BIOSCIENCES)で直ぐに得て、FLOWJOソフトウェア(TREE STAR)を用いて分析を行った。
９６ウェル丸底プレートにおいて、完全培地（ＲＰＭＯＬＩ１６４０＋１０％の熱失活させたウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１％Ｌ−グルタミン＋１％非必須アミノ酸＋１％ピルビン酸ナトリウム＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン）を１００μｌ含む１ウェル毎に２×１０５のＰＢＭＣを培養した。その後、ＣＨＯ細胞で産生されたＲＬＩ（SEQ ID No.17又はSEQ ID No.18）が２．５ｐｇ／ｍｌ、２５ｐｇ／ｍｌ、２５０ｐｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ又は２５ｎｇ／ｍｌの最終濃度となるように、１００μＬの２Ｘ培地を培養液に添加した。
陰性対照として、ＰＢＭＣを培養培地にインキュベートした。
陽性対象として、ＰＢＭＣを５０ＩＵ／ｍＬ（３ｎｇ／ｍＬ）のヒトＩＬ−２(PROLEUKIN, NOVARTIS PHARMA)と共にインキュベートし、このＩＬ−２の量はヒトに使用するための高用量ＩＬ−２と同等である(MURPHY, WELNIAK, BACK et al., J. Immunol., vol.170, p:2727-33, 2003; ITOH etal., Cancer Immunol. Immunother., vol.32(2), p:88-94, 1990; ETTINGHAUSEN &ROSENBERG, Cancer Res., vol.46(6), p:2784-92, 1986)。また、陽性対象として、ＨＤＩＬ−２と同一のモル濃度である２．５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−１５(CELLGENIX, PRECLINICAL CELLGRO（登録商標）)を用いた。
ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖率を、ＣＦＳＥ希釈により３〜７日間、毎日決定した。
図１は、ヒト末梢血単核球細胞におけるインビトロのＲＬＩの用量効果を示す（Ａ）。ヒトＰＢＭＣを、ＣＦＳＥで染色し、これを０日目とし、その後、段階的に濃度が増大されたＲＬＩ（２．５、２５、２５０、２５００及び２５０００ｐｇ／ｍＬ）で４日間及び７日間処理した。４日目及び７日目において、ＰＢＭＣを回収し、染色し、蛍光活性セルソータ（ＦＡＣＳ）により分析した。非処理の対照細胞を培地のみで同時にインキュベートした。死細胞及びダブレットを除去した後、ＣＤ３−ＣＤ５６＋をＮＫ細胞とみなし、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞をＣＤ８＋Ｔ細胞とみなし、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞をＣＤ４＋Ｔ細胞とみなした。ＮＫ細胞（左グラフ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（中央グラフ）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の増殖率が、上側のＡに示される。図１Ｂは、ＲＬＩ、ｒｈＩＬ−１５及びｒｈＩＬ−２の増殖誘導能を示す。ヒトＰＢＭＣを２．５ｎｇ／ｍＬのＲＬＩ、２．５ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１５及び５０ＩＵ／ｍＬ（３ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＩＬ−２を用いて４日間及び７日間処理した。
生データは、表１（ＮＫ細胞）、表２（ＣＤ８＋Ｔ細胞）及び表３（ＣＤ４＋Ｔ細胞）に要約される。
表１〜３及び図１に示すように、インビトロでＲＬＩは、２５ｐｇ／ｍＬ（１ｆｍｏｌ／ｍｌ）といった低い用量でＮＫ細胞の増殖を誘導でき、また、２５０ｐｇ／ｍＬといった低い用量でＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導できた。
表１及び２に示すように、２５及び２５０ｐｇ／ｍＬの用量でＲＬＩは、最初の日において、２５００ｐｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−１５と同等のＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞のそれぞれの増殖を誘導する。７日目の増殖について、ＲＬＩは、２５０ｐｇ／ｍｌ（ｒｈＩＬ−１５の１／１０）の用量でｒｈＩＬ−１５よりも３００％高いＮＫ細胞の増殖を誘導し、２５ｐｇ／ｍｌ（ｒｈＩＬ−１５の１／１００）の用量でｒｈＩＬ−１５よりも５０％高い増殖を誘導した。同日において、ＲＬＩは、２５ｐｇ／ｍｌ（ｒｈＩＬ−１５の１／１００）の用量でｒｈＩＬ−１５よりも１００％高いＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導した。従って、これらのパラメータを考慮すると、ＲＬＩは、ｒｈＩＬ−１５よりも１０〜１００倍大きい生物活性がある。
また、２５０及び２５００ｐｇ／ｍＬの用量のＲＬＩは、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞のそれぞれにおいて、３０００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−２と比較してより高い増殖誘導能を示した（なお、等モル量のＩＬ−２は１５０〜１５００ｐｇ／ｍＬ、すなわち３〜３０ＵＩ／ｍＬである）。ＮＫ細胞において、ＲＬＩが２５ｐｇ／ｍＬ（ｒｈＩＬ−２の１／１００）の用量でｒｈＩＬ−２よりも３０％高いＮＫ細胞の増殖を誘導したが、２．５ｐｇ／ｍＬ（ｒｈＩＬ−２の１／１０００）の用量では同等であった。ＣＤ８＋Ｔ細胞において、ＲＬＩの有効性は、ｒｈＩＬ−２と比較して２５０ｐｇ／ｍｌでは約４００％高く、２５ｐｇ／ｍｌでは１００％高く、２．５ｐｇ／ｍｌでは同等であった。従って、これらのパラメータを考慮すると、ＲＬＩは、ｒｈＩＬ−２よりも少なくとも２〜１０倍高いバイオ活性をもつ。
同一の試験をＲＬＩ、ｒｈＩＬ−２及びｒｈＩＬ−１５の等モル濃度で再現した。
図１２Ａ及び１２Ｂは、ＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞のそれぞれにおいて、３、４、５、６及び７日目でのＲＬＩ、ｒｈＩＬ−１５及びｒｈＩＬ−２の増殖誘導能を示す。
その結果、ＲＬＩは、３日目から７日目まで、等モル量のｒｈＩＬ−１５及び等モル量のｒｈＩＬ−２を用いて得られるＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の増殖よりも高い増殖を誘導した。
２）ヒト制御性Ｔ細胞及びＲＬＩ
Ｔｒｅｇ細胞を他で公開しているように分析した（MIYARA et al., Immunity, vol.30(6), p:899-911, 2009）。このストラテジーは、活性型Ｔｒｅｇ（Ｆｏｘｐ３ｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞）と非活性型Ｔｒｅｇ（Ｆｏｘｐ３ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞）と活性型エフェクタＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｆｏｘｐ３ＬｏｗＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４＋Ｔ細胞）とを区別できる。
簡単に説明すると、ＣＦＳＥ標識化ＰＢＭＣを上記１）で説明したようにして得た。健康なボランティアから２００万のＰＢＭＣを、ｒｈＩＬ−１５（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ｒｈＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍＬ＝３ｎｇ／ｍＬ）、ＲＬＩPichia（２．５ｎｇ／ｍＬ）又は培地のみを含む６ウェルプレートで６日間培養した。その後、その細胞を回収し、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８及び生存細胞を選択するためのLIVE/DEAD Fixable Aquaで染色した。細胞をＦｏｘｐ３固定／透過処理プロトコール(EBIOSCIENCE)に従って透過処理し、抗Ｆｏｘｐ３で染色した。標識化細胞を、フローサイトメータを用いて直ぐに得た。
図２Ａは、Ｆｏｘｐ３−ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖率を示す。
図２Ｂは、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（左グラフ）の増殖率、Ｆｏｘｐ３ｌｏｗＣＤ４＋Ｔ細胞（中央グラフ）の増殖率、Ｆｏｘｐ３ｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の増殖率を示す。
その結果は、ＲＬＩが、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞分画の増殖を誘導しない。一方、ｒｈＩＬ−２は、Ｔｒｅｇ細胞を強く抑制するＦｏｘｐ３ｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞を含むＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞分画の増殖を強く誘導する。
インビボにおけるＲＬＩの特性を詳細に定義するために、以下の２つの相補的な動物モデルを用いることを決めた。
１）第１として、薬物活性及び薬物動態を研究するのに良いインビボモデルであるマカクモデルを用い：
２）第２として、マカクはヒトの血管漏出症候群（ＶＬＳ）を予測するのに用いられないため、サイトカイン副作用、特にＶＬＳの研究のための良好なインビボモデルであるマウスモデルを用いた。
３）マウス：ＲＬＩ安全性の確認
同時に、我々はｈＩＬ−２及びｈＩＬ−１５の同様の用量と比較したＲＬＩの安全性を決定することを望んだ。その目的のために、我々は、免疫細胞活性及びヒトＶＬＳのための動物モデルとしてマウスを用いた。最初に、我々はこの動物モデルにおけるＲＬＩ活性を決定した。
ａ）インビボモデルのマウスにおけるＲＬＩの生物活性
Harlan Laboratoriesから入手したＣ５７ＢＬ／６マウスに対して、１００μＬの陰性対照としてのＰＢＳ、陽性対照としてのｒｈＩＬ−２（２５００００ＩＵ／マウス）、対照としてのｒｈＩＬ−１５（１．２μｇ／マウス）及びＲＬＩ（２．５μｇ／マウス）を図３に示すプロトコールに従って腹腔内注射した。
４日目にマウスを頚椎脱臼により殺し、脾臓を取り出した。脾臓を、注射器の背を用いて１００μｍ−ｃｅｌｌのストレーナ上で単一の細胞懸濁液に分離した。その後、血液細胞をＡＣＫ（アンモニウム−塩化物−カリウム）溶液を用いて溶解した。脾臓細胞を完全培地で２度洗浄し、生存細胞をＫＯＶＡスライドを用いて数えた。２００万個の脾臓細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、ＮＫｐ４６及び生存細胞を選択するLIVE/DEAD Fixable Aquaといった抗体を用いて染色した。その後、脾臓細胞を、製造者のプロトコール（EBIOSCIENCE FoxP3透過処理緩衝液）に従って透過処理し、抗ＦｏｘＰ３及びＫｉ６７で染色した。
Ｋｉ６７のアイソタイプを陽性細胞の同定に用いた。染色された細胞をFACSCANTO IIフローサイトメータで直ぐに入手し、FLOWJO SOFTWARE (TREE STAR)を用いて分析を行った。ＮＫ細胞は、ＣＤ３陰性且つＮＫｐ４６陽性細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ３及びＣＤ８の二重陽性細胞で分類して分析した。制御性Ｔ細胞の分析のために、Ｆｏｘｐ３の核内染色によって、ＣＤ４及びＣＤ３の二重陽性群におけるエフェクタＴ細胞から制御性細胞を区別することを実現した。
図４は、４日目におけるＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＦｏｘｐ３−ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖率を示す。
図５は、７日目におけるＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞に対するＮＫ細胞の増殖率を示す。
その結果は、ＲＬＩがＩＬ−２及びＩＬ−１５と比較してＴｒｅｇの蓄積を誘導することなくエフェクタ細胞の顕著な増殖を誘導することを示し、これらの結果は４日目と７日目とで同一である。
また、我々は、ＩＬ−２及びＩＬ−１５と比較したＲＬＩによるこの動物モデルにおける免疫細胞活性を決定した。
このために、脾臓細胞を上述のプロトコールに従って得た。
分泌アッセイのために、脾臓細胞を５ｎｇ／ｍＬのＰＭＯＬＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）及び５００ｎｇ／ｍＬのイオノマイシンが添加された完全培地で、４時間培養した。ブレフェルフィンＡ溶液を、タンパク質輸送を阻害するために用いた(EBIOSCIENCE)。その後、細胞を回収し、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＮＫｐ４６及び生存細胞を選択するためのLIVE/DEAD Fixable Aquaといった抗体で染色した。表面染色後、細胞を製造者のプロトコール(BD BIOSCIENCES, intracellular staining)に従って固定及び透過処理した。その後、透過処理細胞を抗ＩＦＮγを用いて染色し、FACS Canto IIフローサイトメータで直ぐに得た。
インビトロの細胞毒性アッセイのために、ＮＫ細胞をマウスＮＫ細胞単離キットＩＩ(MILTENYI BIOTECH)を用いて濃縮した。純度をフローサイトメータにより制御した。２×１０４個のＹＡＣ−１細胞を、種々の量のＮＫ細胞（エフェクタ：標的比（１：１）、（５：１）及び（１０：１））を含む９６ウェルｖ底プレートで培養した。最終ボリュームを１００μＬ／ウェルにした。共培養の４時間後、上清を回収し、ＬＤＨ細胞毒性検出キット(Roche Applied Science)を用いてＬＤＨ放出を測定した。細胞毒性の割合を以下の式で算出した：
細胞毒性（％）＝［｛（エフェクタ：標的−エフェクタ細胞コントロール）−低コントロール｝／（高コントロール−低コントロール）］×１００。
図６は、ＰＢＳ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＲＬＩのいずれかが注射されたマウスにおいて、（Ａ）ＮＫ細胞（左グラフ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（中央グラフ）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）のうちのＩＦＮγ産生細胞の割合を示し、（Ｂ）ＹＡＣ−１細胞株に対するＮＫ細胞毒性を示す。
その結果から、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を考慮すると、マウスのインビボにおいて、ＲＬＩが等モル量のｒｈＩＬ−１５及び高用量のＩＬ−２（２５００００ＩＵ／日、すなわち１５μｇ／日）と比較してより強い生物活性を示すことがわかる。
従って、これらのデータは、一日に１５μｇのＩＬ−２を注射するよりもＲＬＩの２μｇ／注射を３日間注射するほうが高い生物活性を示すインビトロのヒトデータを確認する。
ＲＬＩの安全性のより良い評価のために、我々は、インビボ腫瘍モデル試験でサイトカインレジメン等の抗腫瘍活性を比較した。
このために、１０６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をマウスの背中の真皮上層に注射した。上述のレジメンに従った治療を、腫瘍の小結節が明確に目視でき触知できる５０〜５５ｍｍ３となる時点である腫瘍の接種後６日目に開始した。触知できる腫瘍に対して、カリパスを用いて２つの垂直な直径を測定し、半径を平均直径を２で割ることにより算出した。腫瘍体積を４／３（πｒ３）の数式を用いて球形成長と推定して算出した。
図９Ａは、サイトカインレジメンに依存する腫瘍体積の進展を示す。図９Ｂは、示したレジメンを用いて治療されたマウスにおける皮下の腫瘍成長を曲線下面積（ＡＵＣ）で示す。データは２つの別々の試験を表している。
図９Ａ及びＢに示すように、ＰＢＳ群と比較して、ＬＤＲＬＩは原発腫瘍の増殖を４７％まで低減し、同様にＨＤＲＬＩは原発腫瘍の増殖を４６％まで低減する。ＬＤＩＬ−２は治療効果がなく、一方、ＫＤＩＬ−１５は非常に小さい治療効果を示す（原発腫瘍増殖を−９％）。興味深いことに、ＨＤＩＬ−２及びＨＤＩＬ−１５は、原発腫瘍増殖に対して低いながらも明らかな治療効果を示す（それぞれ、−２２％及び−２８％）。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃは、原発腫瘍増殖を３７％低減し、ＣＤ８Ｔ細胞及びＮＫ細胞に対しては同様の効果であったにもかかわらずＬＤ及びＨＤＲＬＩよりも低い。それでも、ＣＤ８／ＣＤ４Ｔｒｅｇ及びＮＫ／ＣＤ４Ｔｒｅｇの比率は、ＲＬＩを用いた場合よりもＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα―Ｆｃを用いた場合の方が好ましくはなかった。ＩＬ２／６０２ｍＡｂは、原発腫瘍増殖を５１％まで低減し、ＣＤ８Ｔ細胞及びＮＫ細胞に対しては同等の効果を示し、ＣＤ８／ＣＤ４Ｔｒｅｇ及びＮＫ／ＣＤ４Ｔｒｅｇの比率はＲＬＩを用いた場合よりも好ましくなかったにもかかわらず、この結果はＬＤ又はＨＤＲＬＩを用いた場合よりもわずかに高い。これは、Ｂ６Ｆ１０原発腫瘍増殖を制御するための最も重要な免疫ドライバが、ＣＤ４Ｔｒｅｇに対するＣＤ８Ｔ細胞及びＮＫ細胞の相対比よりも、ＣＤ８Ｔ細胞及びＮＫ細胞の量的拡大に関することを示す。そうであっても、多くの研究は、マウス及びヒトの癌において、免疫回避を通じて腫瘍成長を促進する重要な免疫抑制細胞としてのＣＤ４Ｔｒｅｇの発展及び活性に関する。
さらに、転移性腎細胞癌(Renca)におけるインビボ試験は、ＩＬ−１５及びＩＬ−２の原発腫瘍増殖に対する小さいながらも明らかな効果を確認する一方で、強い肺転移の進行の阻害が１〜４日目に毎日、２μｇのＲＬＩを腹腔内注射することで観察された。
ｂ）血管漏出症候群（ＶＬＳ）
十分なＣＦＳＥ標識Ｌｙ５．１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を野生型マウスに移植し、ＰＢＳ、１．５μｇ（低用量、ＬＤ）又は１５μｇ（高用量、ＨＤ）のＬＤＩＬ−２、ＬＤＩＬ−１５、ＨＤＩＬ−２及びＨＤＩＬ−１５を含み組換えヒトサイトカイン、１．５μｇのサイトカイン＋抗ヒトサイトカイン抗体（ＩＬ−２／６０２）、１．５μｇのＩＬ−１５＋可溶性ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ（ＩＬ−１５／ｓＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−１５非共有結合複合体とも呼ぶ）、並びに２．２５μｇのＲＬＩ（ＬＤＲＬＩ）又は１５μｇ（ＲＬＩ）（ＨＤＲＬＩ）のいずれかを４日間毎日注射した。このＩＬ−２の用量（ＨＤＩＬ−２）は、安全性に基づくＶＬＳの誘導の観点から、すなわち許容できるリスクと利益とのバランスの観点から最も高い用量と考えられ得る。
５日目において、脾臓細胞を、ドナーＬｙ５．１＋ＣＤ８＋細胞、ホストＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ１２２ｈｉｇｈのメモリ表現型ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＭＰＣＤ８＋）、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及びＣＤ３−ＮＫ１．１＋ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＣＦＳＥプロファイルのために分析した（Ａ）。
図７は、ドナー細胞、ＭＰＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の総細胞数を算出したことを示す。データは２つの別の試験の代表を示す。
その結果は、ＬＤＲＬＩが移植されたＬｙ５．１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、濃縮されたＣＤ１２２＋ＣＤ４４＋細胞（エフェクタ及びセントラルメモリＣＤ８Ｔ細胞）の強い増殖及び拡大を誘導することを示し、ＨＤＲＬＩ群において８９％の増殖細胞対９７％の増殖細胞である。従って、ＬＤＲＬＩ又はＨＤＲＬＩは、標的細胞に対してほぼ類似した薬理学的効果を誘導し、そのような非常に高濃度のＲＬＩは最大限の薬理効果を達成するために必要ではないことを意味する。
ＬＤＲＬＩは、等モル量のＬＤＩＬ−２（１２％）、ＬＤＩＬ−１５（１３．５％）及びＨＤＩＬ−２（５２％）又はＨＤＩＬ−１５（６２％）を用いた場合よりも移植されたＣＤ８Ｔ細胞の増殖を高く誘導する。
さらに、ＬＤＲＬＩ及びＨＤＲＬＩは、ＩＬ−２（ＩＬ２／６０２ｍＡｂ；９８％）及びＩＬ−１５（ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ；９８％）のスーパーアゴニスト非共有結合複合体とよく比較される。
結論として、ＲＬＩは、ＣＤ４Ｔｒｅｇの拡大におけるより制限された効果によってＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞を増幅する高い効果を示し、免疫抑制を増強することなく免疫細胞毒性に対して免疫調節バランスをシフトする全ての試験試薬及びレジメンのうちで最も良好な能力を示す。
血管漏出症候群（ＶＬＳ）を評価するために、我々は、湿潤組織と乾燥組織との重量の比に関して肺浮腫を評価した。マウスを麻酔下で失血させた。肺を回収し、直ぐに重量を測り、５０℃で２日間乾燥させた。肺の湿潤重量を乾燥重量で差し引いて水浸入量を得た。
図８は、マウスの総重量の割合としての肺浮腫（点線よりも高い）を示す。点線は、生理的バックグラウンドレベルを示す。データは、２つの別々の試験の代表である。
ＰＢＳ群の正常の湿潤肺重量（ＰＷＷ）と比較して、ＬＤＩＬ−１５及びＬＤＩＬ−２は、それぞれ７．３％及び１７．９％のＰＷＷの緩やかな増大を誘導する。ＨＤＩＬ−１５及びＨＤＩＬ−２は、ＰＷＷをそれぞれ約５４．５％及び１２０％増加する。ＨＤＩＬ−２は、ＨＤＩＬ−２で治療される数人の患者で生じる血管漏出症候群と一貫して、極めて重要なＰＷＷの増大を誘導する。ＨＤＩＬ−１５において、ＰＷＷは、そのようなＰＷＷの増大がわずかでない場合でさえも、ＨＤＩＬ−２により誘導される場合よりもはるかに小さい増大を示す。
驚くべきことに、ＶＬＳにおいて最も高い限界と比較して、低用量及び高用量のＲＬＩにより誘導される増大は許容可能と考えられ、一方、ＲＬＩにより誘導されるＮＫ細胞ＣＤ８＋細胞の誘導は、ｈＩＬ−１５及びｈＩＬ−２により得られる誘導よりも高い（３倍以上）。
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα―Ｆｃは、ＰＷＷを７６．４％増大し、それは低い治療効果にもかかわらず、ＬＤＲＬＩにより誘導されるＶＬＳの２倍である。ＩＬ−２／６０２ｍＡｂは、ＰＷＷを６２．６％増大し、それは同様の治療効果にもかかわらず、ＬＤＲＬＩにより誘導されるＶＬＳよりも３９％大きい。さらに、興味深いことに、ＨＤＲＬＩは、ＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞における同様の薬理効果を示し、同様の治療効果を示すにもかかわらず、ＬＤＲＬＩ群の３８．２％のＰＷＷの増大に対して９６．７％のＰＷＷの増大を示す。たとえ、ＬＤＲＬＩ及びＨＤＲＬＩは、ＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の活性、並びに治療活性の観点で、極めて近く、すなわち効果のプラトーはＬＤレジメンで達するとしても、ＲＬＩの用量の増大は、ＶＬＳをより高く誘導し、すなわち、この毒性効果は治療効果に関するメカニズムに関連しない。
ＲＬＩ対ＩＬ−２及びＩＬ−１５の安全性、すなわち強い効果及び低い毒性について、図１１は、ＰＢＳ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＲＬＩを注射されたマウスにおけるＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞のそれぞれの関数としてのＶＬＳを示す。
我々の結果は、（ＩＬ−１５及びＲＬＩは同一のシグナル経路を潜在的に使用するとしても）ＩＬ−２及びＩＬ−１５での安全性とは全く異なる安全性を有することを示し、ＲＬＩの安全性は、ＩＬ−１５及びＩＬ−２の両方よりもはるかに好ましい。その結果、ＲＬＩは、ＩＬ−１５及びＩＬ−２と比較して副作用無く治療効果を誘導するようにエフェクタ細胞に影響を与えるための改善された用量マージン及び治療ウインドウを示す。これに対して、ＩＬ−２やＩＬ−１５を用いて、速やかなＶＬＳ現象の誘導が無い免疫系の正確な刺激を達成することは困難であることが示された。
ｃ）ＮＫ細胞の拡大対毒性（ＶＬＳ）における用量応答効果
ＮＫ細胞の拡大対肺及び肝臓のＶＬＳにおけるＲＬＩの用量範囲効果を上記のプロトコールに従って評価した。マウスに対して、０日目〜３日目まで０．２μｇ、０．５μｇ、１μｇ又は２μｇのＲＬＩＣＨＯの腹腔内注射を４日間毎日行い、４日目に殺した。
図１３は、ＮＫ細胞の拡大におけるＲＬＩの用量応答効果を示す。
その結果は、ＲＬＩが０．２μｇの第１用量から２μｇまでの開始効果を伴う脾臓でのＮＫ細胞の用量依存性拡大を誘導することを示し、プラトーは１μｇで始まる。
ＮＫの拡大と並行して、ＶＬＳを治療マウス対コントロールマウス（ＰＢＳ）の肺及び肝臓で評価した。
図１４は、マウスにおける肺及び肝臓におけるＶＬＳに対するＲＬＩの用量応答効果を示す。
その結果は、未処理マウスのＰＷＷと比較して、試験用量のＲＬＩは肺及び肝臓において顕著にＶＬＳを誘導しないことを示す。ＶＬＳの生じるシグナルは、２μｇの高用量で明確になると考えられ得る。
また、肺のＮＫ細胞の拡大対ＶＬＳにおけるＲＬＩの用量範囲効果を２つの新規の用量を用いて上記のプロトコールに従って評価した。マウスに対して、０日目〜３日目まで０．２μｇ、０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、５μｇ又は２５μｇのＲＬＩＣＨＯの腹腔内注射を４日間毎日行い、４日目に殺した。
図１５は、肺のＶＬＳにおけるＲＬＩの用量応答効果を示す。
ＲＬＩは、０．２μｇ〜２μｇの用量では肺のＶＬＳを誘導せず、一方、５μｇ及び２５μｇのＲＬＩは類似した最大強度のＶＬＳを誘導する。
ＮＫ細胞において、図１６は、ＮＫ細胞拡大におけるＲＬＩの用量応答を示し、図１７は、Ｔｒｅｇの拡大におけるＲＬＩの用量応答を示す。
１回の注射当たり０．２μｇ〜５μｇの用量のＲＬＩは、脾臓のＮＫ細胞の拡大を用量依存的に誘導し、一方、２５μｇのＲＬＩは、活性を失い、有害であるとみなされ得る。並行して、０．２μｇ〜２μｇの用量のＲＬＩはＴｒｅｇの割合を増大せず、これらのレジメンは、コントロールと比較してＴｒｅｇの数について同様の増大を誘導する。これに対して、高用量（５μｇ及び２５μｇ）のＲＬＩは、ＣＤ４Ｔｒｅｇの割合及び数を増大する。
図１８は、ＣＤ４Ｔｒｅｇの割合対ＮＫ細胞の割合の比率におけるＲＬＩの用量応答効果を示し、ＣＤ４Ｔｒｅｇにおける特異的活性がなく、ＮＫ細胞の増大における特異的な用量依存的活性をＲＬＩが示すことを表す。また、０．２μｇ〜２μｇの用量のマージンが活性及び安全性を示し、ＶＬＳの誘導が無くＮＫ細胞等の細胞毒性免疫細胞を刺激できる。そのような医薬的マージンの存在は、患者における有効性及び安全性を管理する。
図１９は、健康なマウスにおけるＲＬＩ処理によるＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の刺激と、ＶＬＳ誘導との比較を要約するものであり、Ｒｅｎｃａ細胞の転移性進展における細胞治療効果を要約する。
これらの結果は、ＩＬ−１５及びＩＬ−２の両方と比較して、ＲＬＩの非常に大きい安全性を確認するものであり、ＲＬＩが、予後不良の患者では高用量、予後良好の患者では極めて低用量といったＩＬ−２及びＩＬ−１５の両方において考えられない治療ウインドウで用いられ得ることを示す。
マカクを用いた薬物動態
約３〜４ｋｇの４歳のカニクイザルに対して、異なる用量（２匹のサルに２０ｍｃｇ／ｋｇ、２匹のサルに３．５ｍｃｇ／ｋｇ）でＲＬＩ（静脈内１回１５分）を注射した。この試験は、ＯＥＣＤのドキュメント「医薬品の安全性に関する非臨床試験実施基準」（１９９７年改訂）に記載されるようなＧＬＰ規則を遵守して行った。このプロトコールは、VETAGRO Sup（フランス）の倫理委員会により審査され、第１１６２番で承認された。全ての試験は、２００１年２月１３日のフランス官報に公開され欧州指令８６／６０９／ＥＥＣに従って行われる。
薬物動態は、ｔ０としてのｔ−７２時間、ｔ＋１０分、ｔ＋３０分、ｔ＋１時間、ｔ＋４時間、ｔ＋６時間、ｔ＋２４時間及びｔ＋７２時間の種々の時点での血清におけるＲＬＩに特異的なＥＬＩＳＡバイオアッセイを行うことにより分析した。測定濃度に基づく実験曲線は、以下の方程式に従って静脈内注射条件下でゼロを含む２つの比較モデルで分析した：
適合された濃度＝=IF(time<tinf;InfR*A*(1-EXP(-_lbd1*time))+InfR*B*(1-EXP(lbdz*time)); InfR*A*(EXP(_lbd1*time)) * EXP(-_lbd1*time) + InfR*B* (EXP(lbdz*time)) *EXP(-lbdz*time))、（適合された濃度の式（ＥＸＣＥＬ、Ｆｉｔ分析、ゼロオーダの静脈内注射を含む２つの比較モデル）。
図１０Ａは、時間の関数としての注射濃度に依存するＲＬＩ濃度の観察された進展及びモデル化された進展を示す。データは、用量ごとに２匹の異なるマカクの代表である。
第２のコンパートメントの半減期（ｔ１／２β）は、各試験で約３時間である。近似曲線は、血流の全体における残存ＲＬＩ濃度を延長時間で評価することを可能にし、それを図１０（Ｂ）に示す。
その結果は、２０ｍｃｇ／ｋｇの群において、６時間及び１２時間での血中濃度がそれぞれ２８．６７及び６．０２ｎｇ／ｍｌである。３．５ｍｃｇ／ｋｇ群において、６時間及び１２時間での血中濃度がそれぞれ０．５５及び０．０３ｎｇ／ｍｌであり、これはそれぞれ５５０ｐｇ／ｍｌ及び３０ｐｇ／ｍｌを意味する。
表１及び２によると、そのような低い濃度及び非常に低い濃度は、ヒトＮＫ細胞及びＣＤＴ細胞をそれぞれ刺激するのに、非常に有効である。そのＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の増殖誘導をマカクで確認でき、一方、Ｔｒｅｇについては何の効果も観察されなかった（データ示さず）。
動物用量のヒト等価用量への良好な転換のために、理論モデルがＢＳＡに基づいて存在する。
ヒト等価用量（ＨＥＤ）の決定は、以下の式から得られ得る。
ＨＥＤ（ｍｇ／ｋｇ）＝動物用量（ｍｇ／ｋｇ）×（動物Ｋｍ÷ヒトＫｍ）
この式において、Ｋｍは体重と体表面面積との間の関係を反映する補正係数である。
一般成人（体重６０Ｉｂ、体表面面積１．６ｍ２）において、Ｋｍは３７である。
頻繁に用いられる実験動物種において、平均Ｋｍは、マウスでは３であり、ウサギでは６であり、マカクでは１２であり、犬では２０であり、ヒトでは３７である（Center for Drug Evaluation and Research, Center for BiologicsEvaluation and Research. (2002) Estimating the safe starting dose in clinicaltrials for therapeutics in adult healthy volunteers, U.S. Food and DrugAdministration, Rockville, Maryland, USAを参照）。
それらの要素に基づいて、我々は、マウスの試験と比較したＲＬＩの最大ヒト等価用量を近似できる。その用量を表４に示す。
興味深いことに、我々は、高用量（２５ｎｇ／ｍｌ）のみならず極めて低用量（２．５ｐｇ／ｍｌ又は２５ｐｇ／ｍｌ）が、エクスビボのヒトＰＢＭＣのヒトＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞を刺激できることを示した（表１及び２、図１）。マカクにおいて、そのような小さい又はきわめて小さい濃度は、ピークの血清レベルで達し得る（０．２５時間）（図１０Ａ及びＢ）。例えば、カニクイザルにおける０．０１ｍｃｇ／ｋｇの用量で、最大血中濃度が実験曲線の準線形回帰に従って約６２．５ｐｇ／ｍｌに達し得る（図１０Ｂ）。表１に示すように、２５ｐｇ／ｍｌのＲＬＩは、ヒトＮＫ細胞における増殖を誘導するのにＨＤＩＬ−２よりも優れている。マカク血液におけるこれらの血中濃度に基づき、また、上記式の観点から、我々は、種々の濃度でのＲＬＩヒト等価用量（ＨＥＤＲＬＩ）を決定し、ＨＥＤＲＬＩは表５に要約する。
結果として、ＲＬＩの投与される一日当たりの量は、治療する疾病の重症度に依存して、１ｎｇ／ｋｇ〜６０ｍｃｇ／ｋｇで変更できる。

Claims (29)

  1. 高用量のインターロイキン−２（ＨＤＩＬ−２）を用いて得られるナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の増殖以上の増殖を誘導する用量のコンジュゲートを対象に投与することにより該対象の癌、感染症又は免疫不全障害を治療するための医薬組成物であって、
    前記コンジュゲートは、
    ａ）インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、
    ｂ）ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド と、を備え、
    前記コンジュゲートが医薬的に許容可能なキャリアと組み合わされる、医薬組成物。
  2. 前記コンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖よりも高い増殖を誘導する用量で投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記組成物は、予後不良を伴う疾病を治療するための組成物であり、
    前記投与される用量のコンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＮＫ細胞の増殖よりも高い増殖を誘導する、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. 前記組成物は、進行型（ＴＮＭグレードＩＶ）又は転移癌を治療するための組成物である、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 前記コンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＮＫ細胞の増殖よりも少なくとも２０％高い増殖、好ましくは少なくとも２５％高い増殖、より好ましくは少なくとも３０％高い増殖を誘導する用量で投与される、請求項３又は４に記載の医薬組成物。
  6. 前記コンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖よりも少なくとも２０％高い増殖、好ましくは少なくとも２５％高い増殖、より好ましくは少なくとも３０％高い増殖を誘導する用量で投与される、請求項３〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. 前記コンジュゲートの投与用量は、２４〜２４００ｐｍｏｌ／ｋｇ（０．６〜６０ｍｃｇ／ｋｇ）、好ましくは２８〜８００ｐｍｏｌ／ｋｇ（０．７〜２０ｍｃｇ／ｋｇ）、より好ましくは３２〜４００ｐｍｏｌ／ｋｇ（０．８〜１０ｍｃｇ／ｋｇ）である、請求項３〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  8. 前記コンジュゲートは、０．４ｐｍｏｌ／ｍｌ〜０．１２ｎｍｏｌ／ｍｌ（１０ｎｇ／ｍｌ〜３０００ｎｇ／ｍｌ）、好ましくは０．４８ｐｍｏｌ／ｍｌ〜４０ｐｍｏｌ／ｍｌ（１２ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ）、より好ましくは０．６ｐｍｏｌ〜２０ｐｍｏｌ／ｍｌ（１５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ）の血中濃度となる用量で投与される、請求項３〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  9. 前記組成物は、予後良好を伴う疾病を治療するための組成物であり、
    前記投与される用量のコンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＮＫ細胞の増殖よりも高い増殖を誘導する、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  10. 前記予後良好を伴う疾病は、非転移性癌、好ましくはＴＮＭグレードＩ、ＩＩ若しくはＩＩＩの癌、又は感染症である、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 前記コンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の増殖と比較して、同等又は最大で５０％又は２５％高い増殖、好ましくは同等又は最大で２０％高い増殖、より好ましくは同等又は最大で１０％高い増殖を誘導する用量で投与される、請求項９又は１０に記載の医薬組成物。
  12. 前記コンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖と比較して、同等又は最大で２００％高い増殖、好ましくは同等又は最大で１５０％高い増殖、より好ましくは同等又は最大で１００％高い増殖を誘導する用量で投与される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  13. 前記コンジュゲートの投与用量は、２〜２００ｐｍｏｌ／ｋｇ（５０〜５０００ｎｇ／ｋｇ）、好ましくは８〜２００ｐｍｏｌ／ｋｇ（２００〜５０００ｎｇ／ｋｇ）、より好ましくは２０〜８０ｐｍｏｌ／ｋｇ（５００〜２０００ｎｇ／ｋｇ）である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  14. 前記コンジュゲートは、４０ｆｍｏｌ／ｍｌ〜１２ｐｍｏｌ／ｍｌ（１ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ）、好ましくは８０ｆｍｏｌ／ｍｌ〜１２ｐｍｏｌ／ｍｌ（２ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ）、より好ましくは０．１６ｐｍｏｌ／ｍｌ〜４ｐｍｏｌ／ｍｌ（４ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ）の血中濃度となる用量で投与される、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  15. 前記投与される用量のコンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＴｒｅｇ細胞（(FoxP3+CD4+CD25high）の増殖よりも低い増殖を誘導する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  16. 前記投与される用量のコンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＴｒｅｇ細胞の増殖よりも少なくとも５％低い増殖、好ましくは少なくとも１０％又は２０％低い増殖、より好ましくは少なくとも５０％低い増殖を誘導する、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 前記投与される用量のコンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＴｒｅｇ細胞の増殖率に対するＮＫ細胞の増殖率の比率よりも少なくとも２５％高い比率、好ましくは少なくとも５０％高い比率、より好ましくは少なくとも７５％高い比率が得られるように前記増殖を誘導する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  18. 前記投与される用量のコンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＴｒｅｇ細胞の増殖率に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖率の比率よりも少なくとも２５％高い比率、好ましくは少なくとも５０％高い比率、より好ましくは少なくとも７５％高い比率が得られるように前記増殖を誘導する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  19. 前記コンジュゲートの前記ａ）及びｂ）のポリペプチドは、融合タンパク質として共有結合されている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  20. 前記インターロイキン１５は、SEQ ID No.１のアミノ酸配列を有し、
    前記ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインは、SEQ ID No.4のアミノ酸配列を有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  21. 前記コンジュゲートは、前記ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列よりもＣ末端側に前記インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  22. 前記インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列と前記ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列とは、５〜３０アミノ酸の長さを有するリンカーのアミノ酸配列により分離され、
    前記リンカーは、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＧｌｎ（Ｑ）を含む群から選択される中性に近いアミノ酸を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  23. 前記投与される用量は、一日当たりの投与用量である請求項１〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  24. 前記組成物は、非経口投与、好ましくは静脈内投与される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  25. 癌、感染症又は免疫不全障害を患う対象に投与されるコンジュゲートの治療有効量を決定するための方法、好ましくはインビトロ方法であって、
    ｉ）前記対象から得られた末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）をＰＢＭＣの増殖が可能な培養条件下において、所定の段階的に増大させた複数の用量のコンジュゲートと接触させるステップと、
    ｉｉ）前記対象から得られた他のＰＢＭＣをＰＢＭＣの増殖が可能な培養条件下において、高用量のインターロイキン−２（ＨＤＩＬ−２）と接触させるステップと、
    ｉｖ）ＨＤＩＬ−２を用いて得られたＰＢＭＣにおけるＮＫ細胞の増殖以上の増殖を誘導するようなコンジュゲートの治療有効量を選択するステップとを備えている方法。
  26. 前記治療有効量のコンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られたＰＢＭＣにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖以上の増殖を誘導する、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記治療有効量のコンジュゲートは、ＨＤＩＬ−２を用いて得られるＴｒｅｇ細胞の増殖率に対するＮＫ細胞及び／又はＣＤ８Ｔ細胞の増殖率の比率よりも少なくとも２５％高い比率、好ましくは少なくとも５０％高い比率、より好ましくは少なくとも７５％高い比率が得られるように前記増殖を誘導する、請求項２５又は２６に記載の方法。
  28. 前記段階的に増大させた複数の用量のコンジュゲートは、４ｆｍｏｌ／ｍｌ〜１２０ｐｍｏｌ／ｍｌ（０．１ｎｇ／ｍｌ〜３０００ｎｇ／ｍｌ）、好ましくは４０ｆｍｏｌ／ｍｌ〜８０ｐｍｏｌ／ｍｌ（１ｎｇ／ｍｌ〜２０００ｎｇ／ｍｌ）、より好ましくは８０ｆｍｏｌ／ｍｌ〜４０ｐｍｏｌ／ｍｌ（２ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ）のコンジュゲートの濃度範囲にある、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. ｉｉｉ）前記対象から得られた末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、前記ＰＢＭＣの増殖を可能にする培養条件下において、前記コンジュゲートと等モル量で段階的に増量されたＩＬ−１５と接触させるステップをさらに含む、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
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