KR20080112232A - 포유동물 환자의 면역기능의 개선 방법 및 질병의 예방 또는 치료 방법 - Google Patents

포유동물 환자의 면역기능의 개선 방법 및 질병의 예방 또는 치료 방법 Download PDF

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KR20080112232A
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오뉴어 보이만
찰리스 디. 슈
조나단 스프렌트
마크 루빈스틴
마렉 코바르
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네이슨트 바이오로직스, 인크.
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Abstract

사이토킨 또는 림포카인의 생물 활성을 증가시키는 방법 및 종양 질병, 자가면역 질병 또는 감염성 질병을 치료하는 방법, 및 조혈 세포 집단을 확대시키는 방법은 상기 치료가 필요한 포유동물 환자에게 사이토킨과 결합할 수 있는 항체를 투여하거나, 또는 항체와 착화된 사이토킨을 투여하거나, 또는 사이토킨 수용체와 착화된 사이토킨을 투여함으로써 제공된다.
사이토킨, 림포카인

Description

포유동물 환자의 면역기능의 개선 방법 및 질병의 예방 또는 치료 방법{METHODS FOR IMPROVING IMMUNE FUNCTION AND METHODS FOR PREVENTION OR TREATMENT OF DISEASE IN A MAMMALIAN SUBJECT}
관련 출원의 상호참조
본 출원은 2006년 2월 16일자로 출원된 미국 가 출원 제 60/773,924 호의 이점을 청구하며, 상기 출원은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
정부 지원의 진술
본 발명은 국립 보건원 승인 번호 AI24187, AI46710, CA38355, AI45809, AI007244, AG001743 및 AG20189로 정부 지원이 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특권을 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 사이토킨 또는 림포카인의 생물 활성 증가가 필요한 포유동물 환자에게 사이토킨에 결합할 수 있는 항체를 투여하거나 항체와 착화된 사이토킨을 투여하거나 사이토킨 수용체와 착화된 사이토킨을 투여함으로써 상기 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질병의 치료가 필요한 포유동물 환자에게 항체와 착화된 사이토킨을 투여하거나 사이토킨 수용체와 착화된 사이토킨을 투여함으로써, 종양 질병, 자가면역 질병, 또는 감염성 질병을 치료하거나, 또는 조혈세포 집단을 확대시키는 방법에 관한 것이다.
몇몇 사이토킨, 특히 IL-2, IL-7 및 IL-15와의 접촉은 고유(naive) 및 기억 T 세포의 생존을 유지시킨다(Smith, Science 240:1169, 1988; Waldmann, Annu Rev Biochem 58:875, 1989; Ku et al., Science 288:675, 2000; Sprent et al., Annu Rev Immunol 20:551, 2002; Schluns et al., Nat Rev Immunol 3:269, 2003). IL-2 및 IL-15에 대한 반응성은 주로 β-쇄(CD122) 및 공통의 γ-쇄(γc)로 이루어진 공유된 이량체성 수용체에 의해 조절된다(Waldmann, Annu Rev Biochem 58:875, 1989; Takeshita et al., Science 257:379, 1992; Nakamura et al., Nature 369:330, 1994). CD122 발현은 한정된 항원에 대해 초회감작된 "기억" CD8+ 세포 및 또한 유사한 표현형을 갖는 CD8+ 세포의 천연 집단에서 특히 높다. 상기 후자의 CD122high(hi) 기억-표현형(MP) CD8+ 세포는 시험관 내에서 IL-2 또는 IL-15에 반응하여 증식하며, IL-15는 또한 생체 내에서 그의 생존 및 간헐적인 증식(턴오버)을 조절한다(Smith, Science 240:1169, 1988; Zhang et al., Immunity 8:591, 1998; Sprent et al., Annu Rev Immunol 20:551, 2002). IL-7에 대한 반응성은 α-쇄(CD127) 및 γc-쇄를 포함하는 이량체성 수용체에 의해 조절되고; IL-7 수용체는 고유 및 기억 T 세포 모두에서 고도로 발현된다(Goodwin et al., Cell 60:941, 1990; Sudo et al., Proc. Natl. Acad Sci. 90:9125, 1993; Tan et al., J. Exp. Med. 195:1523, 2002).
IL-2는 또한 생체 내에서 CD4+ T reg의 생존에 지극히 중요하다(Malek et al., Nat Rev Immunol 4: 665, 2004; Fontenot et al., Nat Immunol 6:331, 2005). 상기 나중의 세포는 IL-2Rα(CD25)(상기 세포가 고 친화성 삼량체성 αβγc 수용체(IL-2Rαβγc)를 발현할 수 있게 하며 이에 의해 낮은 수준의 IL-2를 이용할 수 있게 한다)의 강한 구성적 발현을 특징으로 한다. IL-2에 대한 그의 의존성에 비추어, CD4+ T reg는 항-IL-2 단클론 항체(IL-2 mAb)의 주입 후 사라진다(Murakami et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:8832, 2002; Setoguchi et al., J Exp Med 201:723, 2005).
IL-15는 통상적으로 IL-15Rα에 결합된 세포 회합된 사이토킨으로서 생체 내에 제공된다. IL-15Rα는 내생적인 IL-15의 제공에서 필수적인 역할을 한다. 따라서, IL-15-/- 마우스(Kennedy et al., J Exp Med 191:771-80, 2000)와 같이, IL-15Rα-/- 마우스는, 추정 상 IL-15R-/- 마우스에서 합성된 상기 IL-15가 세포질을 떠나지 못하므로, CD122hi CD8+ 세포 및 NK 세포가 결여되어 있다(Lodolce et al., Immunity 9:669-76, 1998). 그럼에도 불구하고, IL-2αβγc + 세포는 IL-15Rα의 부재 하에서 IL-15의 용해성 재조합 형태에 반응하여 증식할 수 있다(Lodolce et al., J Exp Med 194:1187-94, 2001). 더욱이, 몇몇 조건 하에서, IL-15Rα는 억제 성일 수 있다. 따라서, IL-15Rα의 용해성 (s)재조합체 형태를 마우스에게 주입하는 것은 NK 세포 증식(Nguyen et al., J Immunol 169:4279-87, 2002), 및 생체 내에서 몇몇 T-의존성 면역 반응(Ruckert et al., Eur J Immunol 33:3493-3503, 2003; Ruckert et al., J Immunol 174:5507-15, 2005; Wei et al., J Immunol 167:577-82, 2001; Ruchatz et al., J Immunol 160:5654-5660, 1998)을 억제하는 것으로 보고되었으며, 시험관 내에서 sIL-15Rα를 가하는 것은 IL-15에 대한 세포 주의 반응을 차단할 수 있다(Ruckert et al., Eur J Immunol 33:3493-3503, 2003; Ruckert et al., J Immunol 174:5507-15, 2005; Wei et al., J Immunol 167:577-82, 2001; Ruchatz et al., J Immunol 160:5654-5660, 1998; Budagian et al., J Biol Chem 279:40368-75, 2004; Mortier et al., J Immunol 173:1681-1688, 2004; Eisenman et al., Cytokine 20:121-29, 2002). 이러한 발견에도 불구하고, sIL-15Rα(Giron-Michel et al., Blood 106:2302-10, 2005), 및 또한 IL-15Rα의 용해성 스시 도메인(Mortier et al., J Biol Chem, 2005, E-pub ahead of print)이 인간 세포주의 IL-15 반응을 향상시킬 수 있다는 다른 보고서들이 존재한다. 당해 분야에서는 포유동물 환자에게 사이토킨을 투여함으로써 상기 포유동물 환자의 면역 기능을 개선시키는 요법 및 자가면역 질병, 종양 질병, 또는 감염성 질병과 같은 질병을 치료하기 위한 개선된 방법을 필요로 한다.
발명의 요약
본 발명은 일반적으로 질병의 치료가 필요한 환자에게, 사이토킨과 결합할 수 있는 항체를 포함하는 조성물 또는 사이토킨 및 상기 사이토킨에 대한 수용체를 포함하는 조성물을 투여함으로써 상기 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 투여 전에 상기 항체와 사이토킨을 착화시키고, 상기 사이토킨 항체 복합체를 상기 포유동물 환자에게 투여함으로써 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 투여 전에 상기 사이토킨을 상기 사이토킨 수용체와 착화시키고 상기 포유동물 환자에게 상기 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체를 투여함으로써 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 포유동물 환자의 면역 기능 개선 방법은 사이토킨과 결합할 수 있는 항체 또는 항체와 착화된 사이토킨을 포함하는 조성물을 투여하고 이에 의해 상기 포유동물 환자에서 상기 사이토킨의 생물학적 활성을 증가시킴으로써 제공된다. 포유동물 환자의 면역 기능 개선 방법은 사이토킨 수용체와 착화된 사이토킨을 포함하는 조성물을 투여하고 이에 의해 상기 포유동물 환자에서 상기 사이토킨의 생물학적 활성을 증가시킴으로써 제공된다. 상기 질병 상태는 비 제한적으로 종양 질병, 자가면역 질병, 감염성 질병, 또는 방사선요법 또는 세포독성 약물 치료로부터 발생하는 조혈세포 고갈, 또는 1차 또는 2차 면역결핍 또는 노화를 포함한다. 상기 사이토킨 항체 복합체는 사이토킨 및 상기 사이토킨에 결합된 항체, 예를 들어 단클론 항체일 수 있다. 상기 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체는 예를 들어 인터류킨 15/인터류킨-15 수용체 α 복합체일 수 있다. 항체와 착화된 사이토킨 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체를 투여함으로써 사이토킨의 생물학적 활성을 증가시키는 방법은, CD8+ T 세포의 확대, 또는 고유 T 세포(CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 모두) 또는 기억 T 세포의 확대, 또는 이들 의 조합을 차단하면서 조혈세포 또는 T 세포의 아집단의 확대, 예를 들어 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 조절 세포의 확대, 또는 CD8+ T 세포의 확대, 또는 CD4 T+ 조절 세포의 확대의 결과로서 일어날 수 있다.
사이토킨과 결합할 수 있는 항체를 포유동물 환자에게 투여하고 이에 의해 상기 포유동물 환자에서 상기 사이토킨의 생물학적 활성을 증가시킴을 포함하는 포유동물 환자의 면역 기능 개선 방법을 제공한다. 사이토킨 수용체에 결합된 사이토킨을 포유동물 환자에게 투여하고 이에 의해 상기 포유동물 환자에서 상기 사이토킨의 생물학적 활성을 증가시킴을 포함하는 포유동물 환자의 면역 기능 개선 방법을 제공한다. 상기 면역 기능 개선 방법은 상기 포유동물 환자에서 표적 세포에 대한 상기 사이토킨의 제공을 증가시킴으로써 생성될 수 있다. 상기 방법은 또한 상기 투여 전에 상기 항체와 사이토킨을 착화시키고, 상기 사이토킨 항체 복합체를 상기 포유동물 환자에게 투여함을 포함한다. 하나의 태양에서, Fc 부분을 포함하는 단클론 항체는 사이토킨에 결합한다. 상기 사이토킨은 비 제한적으로 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, I형 인터페론, II형 인터페론, IFN-α, IFN-β, 또는 IFN-γ를 포함한다. 상기 사이토킨 수용체는 상기 사이토킨의 천연 수용체, 예를 들어 인터류킨-15와 결합할 수 있는 인터류킨-15 수용체 α일 수 있다.
상기 방법의 여러 변형들이 고려된다. 예를 들어, 하나의 변형에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 조혈 세포 집단을 확대시킨다. 추가의 변형에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 T 세포, B 세포, 또는 NK 세포의 집단, 또는 이들의 조합을 확대시킨다. 추가의 변형에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 조절 세포를 확대시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 CD8+ T 세포를 확대시킨다. 추가의 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 CD4+ T 세포를 확대시킨다. 추가의 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 CD4+ T 조절 세포를 확대시키고 CD8+ T 세포의 확대를 차단시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 고유 T 세포 또는 기억 T 세포, 또는 이들의 조합을 확대시킨다. 상기 방법의 변형에서, 비-조혈 세포상의 I형 인터페론 또는 II형 인터페론의 생물 활성 증가는 포유동물 환자의 면역 기능을 개선시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 생체 외에서 상기 세포 집단을 확대시킨다. 추가의 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 생체 내에서 상기 세포 집단을 확대시킨다.
사이토킨과 결합할 수 있는 항체를 포유동물 환자에게 투여하고 이에 의해 상기 포유동물 환자에서 상기 사이토킨의 생물학적 활성을 증가시킴을 포함하는 포유동물 환자의 면역 기능 개선 방법을 제공한다. 하나의 태양에서, 상기 사이토킨은 인터류킨-2일 수 있다. 추가의 태양에서, 상기 사이토킨은 인터류킨-7일 수 있다. 상기 면역 기능 개선 방법은 상기 포유동물 환자에서 표적 세포에 대한 상기 사이토킨의 제공을 증가시킴으로써 생성될 수 있다. 상기 방법은 또한 상기 투여 전에 상기 항체와 사이토킨을 착화시키고, 상기 사이토킨 항체 복합체를 상기 포유동물 환자에게 투여함을 포함한다. 상기 방법은 또한 상기 투여 전에 상기 사이토킨을 그의 사이토킨 수용체와 착화시키고, 상기 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체를 상기 포유동물 환자에게 투여함을 포함한다. 하나의 태양에서, Fc 부분을 포함하는 단클론 항체 또는 사이토킨 수용체는 사이토킨에 결합한다. 추가의 태양에서, 상기 포유동물 환자는 상기 포유동물 환자의 고령으로 인해 약해진 면역계를 갖는다. 상기 방법의 하나의 태양에서, 면역 기능의 개선을 위한 표적 세포에의 상기 사이토킨 제공의 증가는 고유 T 세포 또는 기억 T 세포, 또는 이들의 조합을 확대시킨다. 상기 방법은 상기 포유동물 환자에서 종양 질병, 자가면역 질병, 또는 감염성 질병을 감소 또는 제거하거나, 그의 발병 또는 재발을 예방하는 치료 효과를 제공할 수 있다. 상기 방법은 조혈 세포 집단을 확대시키거나 또는 방사선요법 또는 세포독성 약물 치료로부터 발생하는 세포 고갈, 또는 포유동물 환자에서 1차 또는 2차 면역결핍 또는 노화로부터 조혈세포 회수를 개선시키는 치료 효과를 제공할 수 있다.
사이토킨과 결합할 수 있는 항체를 자가면역 질병의 감소 또는 제거 또는 그의 발병 또는 재발의 예방에 유효한 양으로 포유동물 환자에게 투여함을 포함하는 포유동물 환자의 자가면역 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 또한 상기 투여 전에 상기 항체와 사이토킨을 착화시키고, 상기 사이토킨 항체 복합체를 상기 포유동물 환자에게 투여함을 포함한다. 상기 방법은 또한 상기 투여 전에 상기 사이토킨을 그의 사이토킨 수용체와 착화시키고, 상기 사이토킨/사이토 킨 수용체 복합체를 상기 포유동물 환자에게 투여함을 포함한다. 하나의 태양에서, Fc 부분을 포함하는 단클론 항체는 사이토킨에 결합한다. 상기 사이토킨은 비 제한적으로 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, I형 인터페론, II형 인터페론, IFN-α, IFN-β, 또는 IFN-γ를 포함한다. 상기 자가면역 질병은 비 제한적으로 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병, 염증성 장 질병, 건선, 전신 홍반성 루프스, 알레르기성 질병, 또는 천식을 포함한다.
상기 방법의 여러 변형들이 고려된다. 추가의 태양에서, 상기 방법은 상기 사이토킨의 생물 활성을 증가시킴을 포함한다. 예를 들어, 하나의 변형에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 조혈 세포 집단을 확대시킨다. 추가의 변형에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 T 세포, B 세포, 또는 NK 세포의 집단, 또는 이들의 조합을 확대시킨다. 추가의 변형에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 조절 세포를 확대시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 CD8+ T 세포를 확대시킨다. 추가의 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 CD4+ T 세포를 확대시킨다. 추가의 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 CD4+ T 조절 세포를 확대시키고 CD8+ T 세포의 확대를 차단시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 고유 T 세포 또는 기억 T 세포, 또는 이들의 조합을 확대시킨다. 상기 방법의 변형에서, 비-조 혈 세포상의 I형 인터페론 또는 II형 인터페론의 생물 활성 증가는 포유동물 환자의 면역 기능을 개선시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 생체 외에서 상기 세포 집단을 확대시킨다. 추가의 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 생체 내에서 상기 세포 집단을 확대시킨다.
사이토킨과 결합할 수 있는 항체를 종양 질병의 감소 또는 제거 또는 그의 발병 또는 재발의 예방에 유효한 양으로 포유동물 환자에게 투여함을 포함하는 포유동물 환자의 종양 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 종양 질병은 비 제한적으로 암, 고형 종양, 육종, 흑색종, 암종, 백혈병 또는 림프종을 포함한다. 상기 방법은 또한 상기 투여 전에 상기 항체와 사이토킨을 착화시키고, 상기 사이토킨 항체 복합체를 상기 포유동물 환자에게 투여함을 포함한다. 상기 방법은 또한 상기 투여 전에 상기 사이토킨을 그의 사이토킨 수용체와 착화시키고, 상기 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체를 상기 포유동물 환자에게 투여함을 포함한다. 하나의 태양에서, Fc 부분을 포함하는 단클론 항체 또는 Fc 부분을 포함하는 사이토킨 수용체는 사이토킨에 결합한다. 상기 사이토킨은 비 제한적으로 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, I형 인터페론, II형 인터페론, IFN-α, IFN-β, 또는 IFN-γ를 포함한다.
상기 방법은 또한 상기 사이토킨의 생물 활성을 증가시킴을 포함한다. 상기 방법의 여러 변형들이 고려된다. 예를 들어, 하나의 변형에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 조혈 세포 집단을 확대시킨다. 추가의 변형에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 T 세포, B 세포, 또는 NK 세포의 집단, 또는 이들의 조합을 확대시킨다. 추가의 변형에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 조절 세포를 확대시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 CD8+ T 세포를 확대시킨다. 추가의 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 CD4+ T 세포를 확대시킨다. 추가의 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 CD4+ T 조절 세포를 확대시키고 CD8+ T 세포의 확대를 차단시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 고유 T 세포 또는 기억 T 세포, 또는 이들의 조합을 확대시킨다. 상기 방법의 변형에서, 비-조혈 세포상의 I형 인터페론 또는 II형 인터페론의 생물 활성 증가는 포유동물 환자의 면역 기능을 개선시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 생체 외에서 상기 세포 집단을 확대시킨다. 추가의 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 생체 내에서 상기 세포 집단을 확대시킨다.
인터류킨-15 및 인터류킨-15 수용체 α를 포유동물 환자에게 투여하고 이에 의해 상기 포유동물 환자에서 상기 인터류킨-15의 생물학적 활성을 증가시킴을 포함하는 포유동물 환자의 면역 기능 개선 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 포유동물 환자에서 표적 세포에 대한 상기 인터류킨-15의 제공을 증가시켜 면역 기능을 개선시킴을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 상기 투여 전에 상기 인터류킨-15와 인터류킨-15 수용체 α를 착화시키고, 상기 인터류킨-15/인터류킨-15 수용체 α 복합체를 상기 포유동물 환자에게 투여함을 포함한다. 상기 방법의 하나 의 태양에서, 면역 기능의 개선을 위한 표적 세포에의 상기 인터류킨-15 제공의 증가는 고유 T 세포 또는 기억 T 세포, 또는 이들의 조합을 확대시킨다. 상기 증가된 생물 활성은 상기 포유동물 환자에서 종양 질병 또는 감염성 질병을 감소 또는 제거하거나, 그의 발병 또는 재발을 예방하는 치료 효과를 가질 수 있다. 상기 증가된 생물 활성은 조혈 세포 집단을 확대시키거나 또는 방사선요법 또는 세포독성 약물 치료로부터 발생하는 조혈세포 고갈, 또는 포유동물 환자의 1차 또는 2차 면역결핍 또는 포유동물 환자의 노화로부터 조혈세포 회수를 개선시키는 치료 효과를 가질 수 있다. 추가의 태양에서, 상기 포유동물 환자는 상기 포유동물 환자의 고령으로 인해 약해진 면역계를 갖는다.
사이토킨과 결합할 수 있는 항체를 포유동물 환자에게 투여하고, 이에 의해 상기 포유동물 환자에서 확대된 조혈 세포 집단의 치료 효과를 제공함을 포함하는 상기 포유동물 환자에서 조혈세포 집단의 확대 방법을 제공한다. 상기 방법은 또한 상기 투여 전에 상기 항체와 사이토킨을 착화시키고, 상기 사이토킨 항체 복합체를 상기 포유동물 환자에게 투여함을 포함한다. 상기 방법은 또한 상기 투여 전에 상기 사이토킨을 그의 사이토킨 수용체와 착화시키고, 상기 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체를 상기 포유동물 환자에게 투여함을 포함한다. 하나의 태양에서, Fc 부분을 포함하는 단클론 항체 또는 Fc 부분을 포함하는 사이토킨 수용체는 사이토킨에 결합한다. 상기 사이토킨은 비 제한적으로 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, I형 인터페론, II형 인터페론, IFN-α, IFN-β, 또는 IFN-γ를 포함한다.
상기 방법은 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가를 또한 제공한다. 상기 방법의 여러 변형들이 고려된다. 예를 들어, 하나의 변형에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 조혈 세포 집단을 확대시킨다. 추가의 변형에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 T 세포, B 세포, 또는 NK 세포의 집단, 또는 이들의 조합을 확대시킨다. 추가의 변형에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 조절 세포를 확대시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 CD8+ T 세포를 확대시킨다. 추가의 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 CD4+ T 세포를 확대시킨다. 추가의 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 CD4+ T 조절 세포를 확대시키고 CD8+ T 세포의 확대를 차단시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 고유 T 세포 또는 기억 T 세포, 또는 이들의 조합을 확대시킨다. 추가의 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 NK 세포 집단을 확대시키거나 B 세포 집단을 확대시킬 수 있다. 추가의 태양에서 상기 사이토킨 생물 활성의 증가는 방사선요법 또는 세포독성 약물 치료로부터 발생하는 조혈세포 고갈, 또는 포유동물 환자의 1차 또는 2차 면역결핍으로부터의 조혈 세포 회수를 개선시킬 수 있다. 또 다른 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 생체 외에서 상기 세포 집단을 확대시킨다. 추가의 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 생체 내에서 상기 세포 집단을 확대시킨다.
사이토킨과 결합할 수 있는 항체를 감염성 질병의 감소 또는 제거 또는 그의 발병 또는 재발의 예방에 유효한 양으로 포유동물 환자에게 투여함을 포함하는 포유동물 환자의 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 또한 상기 투여 전에 상기 항체와 사이토킨을 착화시키고, 상기 사이토킨 항체 복합체를 상기 포유동물 환자에게 투여함을 포함한다. 상기 방법은 또한 상기 투여 전에 상기 사이토킨을 그의 사이토킨 수용체와 착화시키고, 상기 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체를 상기 포유동물 환자에게 투여함을 포함한다. 추가의 태양에서, 상기 항체 또는 항체와 착화된 사이토킨, 또는 그의 수용체와 착화된 사이토킨을 백신과 함께 투여하여 면역 반응을 증가시키고 백신 효능을 강화시킨다. 하나의 태양에서, Fc 부분을 포함하는 단클론 항체는 사이토킨에 결합한다. 상기 사이토킨은 비 제한적으로 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, I형 인터페론, II형 인터페론, IFN-α, IFN-β, 또는 IFN-γ를 포함한다.
상기 방법은 또한 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가를 제공한다. 상기 방법의 여러 변형들이 고려된다. 예를 들어, 하나의 변형에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 조혈 세포 집단을 확대시킨다. 추가의 변형에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 T 세포, B 세포, 또는 NK 세포의 집단, 또는 이들의 조합을 확대시킨다. 추가의 변형에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 조절 세포를 확대시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 CD8+ T 세포를 확대시킨다. 추가의 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 CD4+ T 세포를 확대시킨다. 추가의 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 CD4+ T 조절 세포를 확대시키고 CD8+ T 세포의 확대를 차단시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성의 증가는 고유 T 세포 또는 기억 T 세포, 또는 이들의 조합을 확대시킨다. 상기 방법의 변형에서, 비-조혈 세포 상의 I형 인터페론 또는 II형 인터페론의 생물 활성 증가는 포유동물 환자의 면역 기능을 개선시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 생체 외에서 상기 세포 집단을 확대시킨다. 추가의 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가는 생체 내에서 상기 세포 집단을 확대시킨다.
도 1A 및 1B는 IL-2 또는 IL-2 단클론 항체에 의한 생체 내 기억 표현형(MP) CD8+ 세포의 자극을 나타낸다.
도 2는 IL-2 또는 IL-2 단클론 항체에 반응한 생체 내 MP CD8+ 세포의 증식을 나타낸다.
도 3A, 3B 및 3C는 IL-2 및 IL-2 단클론 항체의 조합에 의한 생체 내 MP 및 항원(Ag)-특이적 기억 CD8+ T 세포의 현저한 선택적인 확대를 나타낸다.
도 4A 및 4B는 IL-2/IL-2 단클론 항체 복합체에 대한 CD8+ T 세포의 증식이 주로 CD122hi MP 세포에 국한되고 IL-15-의존성임을 나타낸다.
도 5A 및 5B는 생체 내 IL-2/IL-2 단클론 항체 복합체에 대한 MP CD8+ 세포의 증식이 CD25를 필요로 하지 않음을 나타낸다.
도 6A, 6B, 6C, 6D 및 6E는 상이한 IL-2/IL-2 단클론 항체 복합체에 의한 T 세포 서브세트의 선택적인 자극을 나타낸다.
도 7A, 7B, 7C 및 7D는 생체 내 IL-2/IL-2 단클론 항체 복합체에 의한 MP CD8+ 세포 자극의 요건을 나타낸다.
도 8A, 8B, 8C 및 8D는 사이토킨/단클론 항체 복합체에 의한 T 세포 자극의 특징을 나타낸다.
도 9A 및 9B는 JES6-5 및 S4B6 IL-2 단클론 항체가 JES6-1의 결합 부위와 다른 IL-2 상의 유사 부위에 결합함을 나타낸다.
도 10A 및 10B는 시험관 외에서 IL-2/IL-2 단클론 항체 복합체의 효과를 나타낸다.
도 11A 및 11B는 S4B6 및 JES6-1 IL-2 단클론 항체의 혼합물의 주입이 MP CD8+ 세포와 MP CD4+ CD25+ 세포 모두의 증식을 차단함을 나타낸다.
도 12A 및 12B는 IL-2 단클론 항체의 F(ab')2 단편이 전체 IL-2 단클론 항체보다 덜 효율적임을 나타낸다.
도 13은 IL-2/IL-2 단클론 항체 복합체가 MP CD8+ 세포 증식의 유도에서 IL-2 항체 융합 단백질보다 현저하게 더 효능이 있음을 나타낸다.
도 14A 및 14B는 IL-7/IL-7 단클론 항체 복합체가 흉선에서 T 세포 발생을 효율적으로 유도할 수 있음을 나타낸다.
도 15A, 15B 및 15C는 IL-7/IL-7 단클론 항체 복합체가 고유 T 세포의 항상성 확대를 효율적으로 유도할 수 있음을 나타낸다.
도 16은 IL-7/IL-7 단클론 항체 복합체가 고유 및 기억 T 세포 모두의 확대를 구동할 수 있음을 나타낸다.
도 17은 항-IL-7 단클론 항체의 Fc 부분이 IL-7/IL-7 단클론 항체 복합체의 증식 활성에 필요함을 나타낸다.
도 18A 및 18B는 노화가 고유 T 세포의 항상성 증식을 지지하는 능력의 심한 감퇴와 관련되고 이를 IL-7/IL-7 단클론 항체 복합체를 사용하여 복원할 수 있음을 나타낸다.
도 19A, 19B, 19C, 19D 및 19E는 용해성 IL-15Rα가 시험관 내에서 IL-15-매개된 림프구 증식을 증대시킴을 나타낸다.
도 20A, 20B, 20C 및 20D는 용해성 IL-15Rα가 생체 내에서 IL-15-매개된 공여 림프구 증식을 증대시킴을 나타낸다.
도 21A, 21B, 21C 및 21D는 용해성 IL-15Rα가 IL-15-매개된 숙주 림프구 증식을 증대시킴을 나타낸다.
도 22는 IL-15Rα-Fc가 생체 내 조건 하에서 IL-15의 증대에 있어서 IL-15Rα보다 양호함을 나타낸다.
도 23A 및 23B는 IL-15Rα에 의해 고정화된 IL-15에 대한 증식이 용해성 IL- 15Rα-Fc에 의해 차단될 수 있음을 나타낸다.
도 24A 및 24B는 용해성 IL-2Rα가 IL-2 매개된 증식을 억제함을 나타낸다.
도 25A 및 25B는 시험관 외에서 IL-15의 생존을 나타낸다.
도 26은 인간 sIL-15Rα-Fc가 마우스 및 인간 IL-15 모두에 대한 마우스 MP CD8+ 세포의 반응을 향상시킴을 나타낸다.
도 27은 IL-15Rα-/- 숙주에서 IL-15/sIL-15Rα-Fc 복합체에 의한 자극을 나타낸다.
도 28A, 28B 및 28C는 마우스 대 인간 IL-15에 대한 반응에 대한 sIL-15Rα-Fc의 차단 효과를 나타낸다.
본 발명은 일반적으로 질병의 치료가 필요한 환자에게, 사이토킨과 결합할 수 있는 항체를 포함하는 조성물 또는 사이토킨 및 상기 사이토킨에 대한 수용체를 포함하는 조성물을 투여함으로써 상기 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 투여 전에 상기 항체와 사이토킨을 착화시키고, 상기 사이토킨 항체 복합체를 상기 포유동물 환자에게 투여함으로써 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 투여 전에 상기 사이토킨을 상기 사이토킨 수용체와 착화시키고 상기 포유동물 환자에게 상기 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체를 투여함으로써 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 포유동물 환자의 면역 기능 개선 방법은 사이토킨과 결합할 수 있는 항체 또는 항체와 착화된 사이토킨을 포함하는 조성물을 투여하고 이에 의해 상기 포유동물 환자에서 상기 사이토킨의 생물학적 활성을 증가시킴으로써 제공된다. 포유동물 환자의 면역 기능 개선 방법은 사이토킨 수용체와 착화된 사이토킨을 포함하는 조성물을 투여하고 이에 의해 상기 포유동물 환자에서 상기 사이토킨의 생물학적 활성을 증가시킴으로써 제공된다. 상기 질병 상태의 치료 방법이 제공되며, 이때 상기 질병 상태는 는 비 제한적으로 종양 질병, 자가면역 질병, 감염성 질병, 또는 방사선요법 또는 세포독성 약물 치료로부터 발생하는 림프구 고갈, 또는 1차 또는 2차 면역결핍 또는 노화를 포함한다. 상기 사이토킨 항체 복합체는 사이토킨 및 상기 사이토킨에 결합된 항체, 예를 들어 단클론 항체일 수 있다. 상기 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체는 예를 들어 인터류킨 15/인터류킨-15 수용체 α 복합체일 수 있다.
하나의 태양에서, 상기 사이토킨의 생물 활성 증가에 의해 포유동물 환자의 면역 기능을 개선시키는 방법은 상기 포유동물 환자에서 조혈 세포, 예를 들어 T 세포, B 세포, 또는 NK 세포의 집단, 또는 이들의 조합을 확대시킨다. 질병 상태의 치료 방법은 상기 치료가 필요한 포유동물 환자에게 인터류킨-2 또는 항체와 착화된 인터류킨-2에 결합할 수 있는 항체를 투여함으로써 제공된다. 상기 항체는 단클론 항체일 수 있다. 인터류킨-2의 생물 활성 증가는 본 발명에 개시한 바와 같이 질병의 치료에 유용하다. 상기 증가된 인터류킨-2 활성은 T 세포 집단, B 세포 집단, 또는 NK 세포 집단을 확대시키거나, 또는 보다 구체적으로 CD8+ T 세포의 집단을 확대시키거나, 또는 CD8+ T 세포와 CD4+ T 조절 세포의 집단을 확대시키거나, 또는 CD4+ T 조절 세포의 집단을 확대시키고 CD8+ T 세포의 확대를 차단할 수 있다. 조혈 세포 확대를 상기 포유동물 환자의 생체 내 또는 생체 외에서 수행할 수 있다.
질병 상태의 치료 방법은 상기 치료가 필요한 포유동물 환자에게 사이토킨 또는 항체와 착화된 사이토킨에 결합할 수 있는 항체를 투여함으로써 제공된다. 상기 항체는 단클론 항체일 수 있다. 사이토킨의 생물 활성 증가는 본 발명에 개시한 바와 같이 질병의 치료에 유용하다. 상기 증가된 사이토킨 활성은 T 세포 집단, B 세포 집단, 또는 NK 세포 집단을 확대시키거나, 또는 보다 구체적으로 상기 사이토킨의 생물 활성은 고유 T 세포(고유 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포 모두) 또는 기억 T 세포(고유 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포 모두), 또는 이들의 조합을 확대시킬 수 있다.
T 림프구의 성장 인자인 인터류킨-2(IL-2)는 또한 때때로 억제성일 수 있다. 본 발명은 생체 내에서 CD8+ T 세포의 증식이 IL-2에 특이적인 단클론 항체(IL-2 mAb)의 주입 후 증가한다는 사실에 대한 설명을 제공한다. 본 발명은 IL-2 mAb가 면역 복합체의 형성을 통해 기존 IL-2의 생물 활성을 증가시킴으로써 CD8+ 세포의 증식을 증대시킴을 입증한다. 재조합 IL-2와 커플링 시, 일부 IL-2/IL-2 mAb 복합체는 생체 내에서 CD8+ 세포의 대량(>100 배) 확대를 유발시키는 반면 다른 것들은 CD4+ T reg를 선택적으로 자극한다. 따라서, 상이한 사이토킨/항체 복합체를 사용하여 면역 반응을 선택적으로 증가시키거나 억제시킬 수 있으며 이는 질병 상태의 치료에 유용하다.
본 발명에 사용된 "약"이란 용어는 측정 가능한 값, 예를 들어 양, 일시적인 지속기간 등을 언급하는 경우, 변화가 개시된 방법을 수행하는데 적합한 한, 지정된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 보다 바람직하게는 ±5%, 훨씬 더 바람직하게는 ±1%, 훨씬 더 바람직하게는 ±0.1%의 변화를 포함함을 의미한다.
달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에 개시된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질을 본 발명의 시험의 실시에 사용할 수 있지만, 본 발명에서는 바람직한 물질 및 방법을 개시한다. 본 발명의 개시 및 청구에 있어서, 하기의 용어들이 사용될 것이다.
"질병을 감소 또는 제거하거나 또는 그의 발병 또는 재발을 예방하기에 유효한 양"은 환자 시험 데이터, 생존 데이터, 종양 마커 수준의 상승 또는 억제, 유전자 프로파일에 근거한 감소된 민감성 또는 환경 인자에의 노출에 의해 측정 시, 질병 상태, 예를 들어 종양 질병, 자가면역 질병, 세포를 쇠약게 하는 방사선 치료 또는 화학요법, 또는 감염성 질병에 대한 치료에 따라 환자 결과 또는 생존을 개선시키는 치료 화합물의 양을 지칭한다.
"림프구"는 비 제한적으로 T 세포, B 세포, 또는 천연 살해(NK) 세포를 포함한 순환하는 세포 집단을 지칭한다.
"T 세포 증식"은 사이토킨 또는 림포킨에 의해 제공된 세포 신호에 반응한 T 세포의 하나 이상의 하위집단의 성장 및 확대를 지칭한다. T 세포 증식은 생체 내 또는 생체 외에서 일어날 수 있다. T 세포의 하위집단은 비 제한적으로 CD8+ T 세포, CD4 T 조절 세포(T reg 세포), 또는 천연 살해(NK)세포를 포함한다.
"사이토킨 항체 복합체" 또는 "사이토킨/사이토킨 수용체 복합체"는 항체-항원 또는 리간드-수용체 결합 상호작용에서와 같이 정전기 전하 상호작용에 의해 항체 또는 그의 사이토킨 수용체에 결합된 사이토킨 또는 림포카인을 지칭한다. 상기 항체 분자는 IgG 분자 또는 그의 단편일 수 있다. 상기 항체 단편은 적어도 상기 항체 분자의 Fc 부분을 포함할 수 있다.
"사이토킨"은 면역계 세포들 간의 많은 중요한 상호작용들을 조절하는 용해성 매개체를 지칭한다. 사이토킨은 다양한 그룹의 세포간 신호 전달 펩타이드 및 당단백질을 포함한다. 대부분 서로 유전적으로 및 구조적으로 유사하다. 각각의 사이토킨은 다양한 자극들에 반응하여 특정한 세포 유형에 의해 분비되며 표적 세포의 성장, 이동성, 분화 및/또는 기능에 대해 특징적인 영향을 생성시킨다. 집합적으로, 사이토킨은 면역 및 염증 체계를 조절할 뿐만 아니라 상처 치유, 항상성, 혈관형성 및 다수의 다른 과정들에 관여한다. 상기 용어는 구조와 상관없이 다양한 사이토킨 모두를 포함하고자 하며, 통상적으로 사용되는 명명법이다. 예를 들어, 상기 용어는 "림포카인"(즉 림프구에 의해 생산된 사이토킨)뿐만 아니라 "모노카인"(즉 단핵구에 의해 생산된 사이토킨)을 포함하고자 한다. 사이토킨은 세포에 대해 다양한 효과들, 예를 들어 성장 또는 증식의 유도를 발휘하는 다수의 인자들 중 어느 하나를 지칭한다. 본 발명의 실시에 단독으로 또는 함께 사용될 수 있는 사이토킨의 비 제한적인 예로는 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-7(IL-7), 인터류킨-9(IL-9), 인터류킨-12(IL-12), 인터류킨-15(IL-15), 인터류킨-21(IL-21), I형 인터페론, 인터페론-α, 인터페론-β, II형 인터페론, 인터페론-γ, 줄기세포 인자(SCF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터류킨-1α(IL-1α), 인터류킨-11(IL-11), MIP-1a, 백혈병 억제 인자(LIF), c-키트 리간드, 토롬보포이에틴(TPO) 및 flt3 리간드가 있다. 본 발명은 또한 하나 이상의 사이토킨, 사이토킨에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체, 또는 이들의 조합을 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 사이토킨은 다수의 판매자들, 예를 들어 젠자임(Genzyme, Framingham, Mass.), 제넨테크(Genentech, South San Francisco, Calif.), 암젠(Amgen, Thousand Oaks, Calif), 또는 R&D 시스템스(Minneapols, Minn.)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 항상 명백한 것은 아니지만, 야생형 또는 정제된 사이토킨과 유사한 생물 활성을 갖는 분자들(예를 들어 재조합적으로 생산된 것 또는 그의 뮤테인)을 본 발명의 진의 및 범위 내에서 사용하고자 한다.
"사이토킨 수용체"는 사이토킨을 인식하고 이에 결합하는 수용체 분자를 지칭한다. 상기 용어는 세포-결합된 사이토킨 수용체뿐만 아니라 용해성 사이토킨 수용체를 포함함을 의미한다. 일부 실시태양에서, 상기 용어는 인터류킨-15에 결합하는 인터류킨-15 수용체 α를 지칭한다. 상기 용어는 또한 사이토킨 수용체 아미노산 및/또는 핵산 서열에 대한 치환, 결실 및/또는 첨가를 갖는 것들을 포함하여, 변경된 사이토킨 수용체 분자(즉 "변형 사이토킨 수용체")를 포함함을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 야생형뿐만 아니라, 재조합체, 합성적으로 생산된 것 및 변형 사이토킨 수용체를 포함함을 의미한다. "사이토킨 수용체"는 비 제한적으로 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, I형 인터페론, II형 인터페론, IFN-α, IFN-β, 또는 IFN-γ의 수용체를 포함하여, 이후에 정의하는 바와 같이, 하나 이상의 사이토킨(들)에 결합하는 당해 분야 내의 모든 인간 사이토킨 수용체를 지칭한다.
"포유동물 환자의 면역 기능 개선"은 포유동물 환자의 질병을 성공적으로 감소 또는 제거하거나 그의 발병 또는 재발을 예방하는 본 발명 조성물에 의한 치료 능력을 지칭한다. 질병은 비 제한적으로 종양 질병, 자가면역 질병, 또는 감염성 질병을 포함하거나, 또는 개선된 면역 기능은 조혈 세포 집단을 확대하기 위한 치료 효과를 제공하거나 또는 방사선치료 또는 세포독성 약물 치료로부터 발생하는 세포 고갈, 또는 포유동물 환자에서 1차 또는 2차 면역결핍, 또는 노화로부터 조혈세포 회수를 개선시킨다. 예를 들어, 종양 질병의 치료 또는 예방에 사용되는 조성물 및 제형은 종양 유발을 방해하고; 면역 기능을 유지 또는 개선시키고, 예를 들어 일반적으로 또는 화학요법 중에 조혈세포의 집단을 증가시키고; 예를 들어 종양 침투 림프구의 활성을 향상시키고/시키거나 NK-세포 및 림포카인-활성화된 살해 세포 세포독성의 화학요법 유도된 억제, 및 암 환자의 림프구 분열촉진 반응성을 감소시키는 작용을 할 수 있는 사이토킨 또는 사이토킨 항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체를 포함한다.
본 발명의 사이토킨/항체 복합체 조성물 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물에 대한 "증가하는 생물 활성" 및 "생물학적으로 활성"은 조혈세포 집단, 예를 들어 T 세포 집단에 특이적으로 결합하고 상기 세포에서 신호전달하여 상기 T 세포 집단의 서브세트를 확대시키는 상기 사이토킨 또는 림포카인 분자의 능력을 지칭한다. "증가하는 생물 활성"은 또한 비 조혈세포 집단, 예를 들어 상피 세포 또는 간 세포에 특이적으로 결합하거나 상기 세포에서 신호전달하는 사이토킨 분자, 예를 들어 I형 인터페론 또는 II형 인터페론을 지칭할 수 있다. 본 발명의 사이토킨 항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체에 의한 사이토킨의 증가하는 생물 활성은 비 제한적으로 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 조절 세포의 확대, CD8+ T 세포의 확대, 또는 CD4+ T 조절 세포의 확대 및 CD8+ T 세포의 확대 차단 또는 CD4+ 및 CD8+ 세포의 확대, 또는 고유 T 세포(CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포 모두) 또는 기억 T 세포의 확대, 또는 이들의 조합을 포함한 T 세포 집단의 확대 능력을 포함한다. 따라서, 본 발명의 화합물 또는 작용제의 투여는 포유동물 환자에서 종양 질병, 자가면역 질병, 세포 고갈성 방사선치료 또는 화학요법, 또는 감염성 질병과 관련된 증상 또는 상태의 발생을 예방 또는 지연, 경감 또는 정지 또는 억제할 수 있다.
인터페론 분자들을 원래 바이러스 감염에 대한 세포 내성을 유도하는 능력을 근거로 동정된, 이종 계열의 사이토킨들로 분류한다(Diaz et al., J. Interferon Cytokine Res., 16:179-180, 1996). "I형 인터페론", 예를 들어 인터페론 α/β는 인터페론 α 계열(인터페론 α1, α2, ω 및 τ)뿐만 아니라 인터페론 β의 다수의 구성원들을 포함한다. "II형 인터페론", 예를 들어 인터페론 γ는 그의 생산을 조절하는 특정 기전에 있어서 I형과 상이하다. 인터페론 α/β의 생산이 바이러스 감염 시 다수 유형의 세포에서 가장 효율적으로 유도되는 반면, 인터페론-γ는 각각 항원 또는 사이토킨에 의해 자극 시, 주로 조혈 시스템의 세포, 예를 들어 T-세포 또는 천연 살해 세포에서 생산된다. 이들 2 개의 인터페론 시스템은 질병의 치료 또는 항바이러스 방어 숙주에서 작용적으로 중복되지 않는다.
IL-15의 수용체는 3 개의 쇄, α, β 및 γc로 구성되며, 상기 α 쇄는 IL-15에 독점적인 반면 상기 β(CD122) 및 γc(CD132) 쇄는 IL-2에 대한 수용체와 공유된다(Kovanen and Leonard., Immunol Rev 202:67-83, 2004). CD122는 통상적인 마우스에서 MP CD8 세포의 대부분(∼70%) 상에서 최고 수준으로, 고유 CD8 및 MP CD4 세포 상에서 낮지만 유의수준으로 발현되고; 실질적으로 고유 CD4 세포 상에서 CD122는 발현되지 않는다(Zhang et al., Immunity 8(5):591-99, 1998). CD122의 발현 패턴에 비추어, IL-15는 CD122hi MP CD8 세포의 턴오버 및 생존에 필수적인 것으로 입증되었다. 따라서, IL-15- 마우스의 생성은 상기 마우스가 CD122hi MP CD8 세포가 없음을 밝혔다(Kennedy et al., J Exp Med 191(5):771-780, 2000). CD122hi MP CD8 세포의 부재는, IL-15- 마우스로 채택 전달된 CD122hi MP CD8 세포가 증식에 실패하고 급속히 사라졌으므로, 발생적 결함보다는 세포 생존의 결여를 반영하는 것으로 나타났다(Judge et al., J Exp Med 196(7):935-46, 2002). CD122hi 인 NK 세포가 또한 생존을 위해 IL-15에 심하게 의존적인 것으로 밝혀졌음을 언급해야 한다. 따라서, CD122hi MP CD8 세포처럼, NK 세포는 IL-15- 마우스에서 현저하게 감소한다(Kennedy, et al., J. Exp. Med. 191:771-780, 2000). IL-15- 마우스는 또한 고유 CD8 세포 수의 50% 감소를 나타내며, 이는 IL-15가 고유 CD8 세포의 지속적인 생존에 중요한 역할을 함을 가리킨다(Kennedy et al., J Exp Med 191(5):771-780, 2000; Berard et al., J Immunol 170(10):5018-26, 2003). CD8 세포와 달리, 고유 및 MP CD4 세포의 항상성은 IL-15- 마우스에서 현저하게 영향을 받지 않는다(Kennedy et al., J exp Med 191(5):771-780, 2000).
기억 CD8 상의 IL-15의 직접적인 역할은 또한 IL-15 트랜스제닉 마우스에서와 같이 IL-15의 과발현이 CD122hi MP CD8 세포의 총수를 증가시킨다는 발견에 의해 지시된다(Marks-Linczalik et al., Proc Natl Acad Sci USA 97(21):11445-50, 2000: Fehniger et al. J Exp Med 193(2):219-31, 2001). γc 수용체를 통해 신호를 전달하는 다른 사이토킨의 경우와 같이, IL-15는 추정 상 Bcl-2와 같은 세포자멸사 억제 분자를 상향조절함으로써 기억 CD8 세포의 생존을 지원한다. 상기 IL-15에 의해 촉발된 신호전달 경로는 STAT5를 통해 전달되는 것으로 보이며 SOCS-1에 의해 음으로 조절된다. 따라서, STAT5(Burchill et al., J Immunol 171(11):5853-64, 2003)의 구성적으로 활성화된 형태를 발현하는 트랜스제닉 마우스, 및 훨씬 더 현저하게는, IFNγ- SOCS-1- 마우스(Ilangumara et al., J Immunol 171(5):2435-45)에서와 같이, SOCS-1-의 음의 효과가 없는 마우스에서, 증가된 수의 MP CD8 세포가 존재한다. 상기 두 경우 모두에서, 고유 CD8 세포는 IL-15에 대해 증가된 민감성을 나타내는 것으로 보이며, 이는 상기 세포가 자발적인 증식 및 MP 세포로의 후속 분화를 겪게하고, 이러한 변이는 자기-펩타이드/MHC 리간드와의 접촉으로부터 TCR 신호전달에 의존한다(Ilangumaran et al., J Immunol 171(5):2435-45; Davey et al., J Exp Med 202(8):1099-108, 2005).
용해성 사이토킨을 고려하더라도, 생체 내 조건 하에서 IL-15는 IL-15Rα 쇄에 결합된 세포 회합된 형태로 제공된다. IL-15의 제공을 위한 IL-15Rα의 필수적인 역할은 인간 세포 주에서 처음 관찰되었다(Dubois et al., Immunity 17(5):537-47, 2002). 마우스에서 후속적인 연구는 IL-15 및 IL-15Rα가 모두 동일 세포에 의해 합성될 필요가 있음을 나타내며, 이는 IL-15가 세포 표면상에서 발현 전에 세포질 중의 IL-15Rα 쇄와 미리 회합됨을 가리킨다(Burkett et al., J Exp Med 200(7):825-34, 2004). 이러한 독특한 제공 방식은 IL-15Rα- 마우스로 전달된 MP CD8 세포가 폴리 I:C에 반응하여 방관자 증식에 실패한다는 역설을 설명한다(Lodolce et al., J Exp Med 194(8):1187-94, 2001). 상기 모델은 또한 IL-15Rα- 마우스가 MP CD8 세포가 없는 이유를 설명하며, IL-15Rα가 IL-15의 인식에 필요하다는 저자의 원 제안을 입증한다(Lodolce et al., Immunity 9(5):669-76, 1998). IL-15Rα 쇄가 T 세포 및 APC를 포함한 다수의 세포 유형 상에서 발현되고, 오직 비 T 세포만이 IL-15의 합성을 보인다 하더라도, 상기 세포의 활성화 시 쉽게 상향조절됨을 언급해야 한다(Doherty et al., J Immunol 156(2):735-41, 1996). IL-15의 제공을 위한 APC 상에서의 IL-15Rα 발현에 대한 필수적인 역할은 분명하지만, CD8 세포가 IL-15Rα를 발현하는 이유는 분명치 않다. 따라서, IL-15Rα의 T 세포 발현은 CD8 세포에 의한 IL-15의 인식에 크게 필요하지 않으며, CD8 세포 상의 IL-15R의 단지 β 및 γ 쇄의 발현이면 IL-15에 대한 기억 CD8 세포의 통상적인 반응에 충분하다(Lodolce et al., J Exp Med 194(8):1187-94, 2001; Burkett et al., Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4724-9, 2003). CD8 세포 상의 IL-15Rα의 기능은 여전히 미스터리지만, 상기는 다른 T 세포에의 용해성 IL-15의 트랜스-제공(Dubois et al., Immunity 17(5):537-47, 2002) 또는 추정 상 APC의 활성화 증대에 관련이 있을 수도 있다(Budagian et al., J Biol Chem 279(40):42192-201, 2004).
통상적인 조건 하에서, IL-15의 기본 수준은 추정 상 DC(IL-15 및 IL-15Rα 모두를 합성한다)에 의한 IL-15의 구성적 생산에 의해 확립된다(Burkett et al., J Exp Med 200(7):825-34, 2004). IL-15의 생산은 IFN, 특히 IFN-I에 의해 효율적으로 유도되기 때문에, IFN-I의 배경 생산이 IL-15의 기본 수준을 유지하는지 여부의 문제가 발생한다. 이러한 생각을 지지하여, IFN-I 수용체-결핍 마우스는 통상적인 B6 마우스에서 발견되는 CD122hi MP CD8 세포 수의 절반보다 적은 수를 가지며, STAT-1- 마우스(IFN-I 및 IFN-γ 모두에 비 반응성이다)에서 분명한 CD122hi MP CD8 세포의 훨씬 더 추가적인 고갈이 존재한다.
조혈 시스템은 독특한 기능들을 수행하는 상이한 세포 유형들로 구성된다. 그의 다양한 기능 중 다수는 이온 채널을 포함한 세포 표면 수용체, 세포-세포 상호작용의 조화를 위한 유착 표면 분자 및 사이토킨 수용체의 조화된 이동을 필요로 한다. 모든 조혈 세포는 그의 다양한 작용 활동에도 불구하고, 다능성 골수 조혈 줄기 세포로부터 발생하는 것으로 여겨진다. 상기와 같은 줄기 세포는 CD34라 칭하는 표면 마커를 발현하는 것으로 나타났다. 분화 도중, 상기 줄기 세포는 다수의 특이적인 조혈 세포 계통 각각의 선조 세포를 생성시킨다. 이어서 상기 선조 세포는 일련의 형태 및 기능 변화를 겪어 기능적으로 명확한 성숙한 조혈 세포를 생산한다.
조혈 세포에 의해 수행된 기능들 중에서, 몇몇 세포 유형은 면역성에 독점적으로 관련된다. 예를 들어, T 세포, B 세포 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한 림프구는 면역 반응에서 효과기이다. 단핵구 및 과립구(즉 호중구, 백혈구 및 호산구)는 비특이적인 형태로 방어 역할을 수행한다. 림프구, 단핵구 및 과립구를 집합적으로 백혈구라 칭한다. 다른 한편으로, 다른 조혈 세포는 면역계와 관련되지 않은 기능들을 수행한다. 예를 들어, 적혈구는 기체 운반과 관련이 있고, 혈소판 계열의 세포들은 혈액 응고와 관련이 있다.
T 세포 및 B 세포는 항원을 인식하고 면역 반응을 생성시킨다. T 세포는 T 세포 수용체(TCR)라 칭하는 이종이량체성 표면 수용체에 의해 항원을 인식한다. 상기 TCR은 집합적으로 CD3 복합체라 칭하는 일련의 폴리펩타이드와 회합한다. B 세포는 표면 면역글로불린(Ig)(또한 분비 분자라 칭한다)에 의해 항원을 인식한다. 또한, 다수의 공 자극 표면 수용체가 T 세포 및 B 세포에서 동정되었으며, 이들은 항원 유도된 활성화 중에 세포 활성화를 증대시킨다.
T 세포 항원 수용체/CD3 복합체(TCR/CD3) 이외에, 활성화 신호를 매개하는 T 세포에 의해 발현된 다른 분자는 비 제한적으로 CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD18, CD27, CD28, CD43, CD45, CD152(CTLA-4), CD154, MHC 등급 I, MHC 등급 II, CDw 137(4-1BB), CDw150 등을 포함한다(Barclay et al., The Leucocyte Antigen Facts Book, 1997, Second edition, Academic Press; Leucocyte Typing, 1984, Bernard et al.(eds.), Springer-Verlag; Leukocyte Typing II, 1986, Reinherz et al.(eds.), Springer-Verlag; Leukocyte Typing III, 1987, McMichael(ed.), Oxford University Press; Leukocyte Typing IV, 1989, Knapp et al.(eds.), Oxford University Press; CD Antigens, 1996, VI Internet Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens). TCR/CD3와 함께 작용하는 세포 표면 항원을 종종 당해 분야에서는 공 수용체라 칭한다.
상기 언급한 T 세포 표면 항원 모두에 대한 특이적인 항체들이 생성되었다. 상기 언급한 T 세포 표면 수용체와 결합하는 다른 분자들은 항원 결합 항체 유도체, 예를 들어 가변 도메인, 펩타이드, 초항원, 및 이들의 천연 리간드, 예를 들어 CD2에 대한 CD58(LFA-3), CD4에 대한 HIV gp120, CD27에 대한 CD27L, CD28 또는 CD152에 대한 CD80 또는 CD86, CD11a/CD18에 대한 ICAM1, ICAM2 및 ICAM3, CDw137에 대한 4-1BBL을 포함한다.
B 세포에 의해 발현된 활성화 분자는 비 제한적으로 표면 Ig, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD40, CD45, CD80, CD86 및 ICAM1을 포함한다. 유사하게, 이들 분자 및 이들에 대한 항체뿐만 아니라 항체 유도체의 천연 리간드들을 사용하여 B 세포로 활성화 신호를 전달할 수 있다.
"종양 질병", "암", "종양", "고형 종양" 또는 "과증식성 질환"은 유의어로서 사용되며, 세포의 조절되지 않는, 이상 증식, 국소적으로 또는 혈류 및 림프 시스템을 통해 신체의 다른 부분으로 확산되는(전이되는) 병든 세포의 능력뿐만 아니라 특징적인 구조 및/또는 분자 특징들 중 임의의 것을 특징으로 하는 다수의 질병들 중 임의의 것을 지칭한다. "암성" 또는 "악성 세포" 또는 "고형 종양 세포"는 특정한 구조적 성질을 갖고, 분화가 결여되며 침습 및 전이가 가능한 세포로서 이해된다. "종양 질병" 또는 "암"은 포유동물에서 발견되는 모든 유형의 암 또는 신생물 또는 악성 종양, 예를 들어 암종, 육종, 림프종 및 백혈병을 지칭한다. 예로서 유방, 폐, 위 및 식도, 뇌 및 신경계, 두경부, 뼈, 간, 담낭, 췌장, 결장, 요 생식계, 방광, 비뇨기, 신장, 고환, 자궁, 난소, 전립선, 피부 및 피부 부속물, 흑색종, 중피종, 내분비계의 암이 있다(문헌[Devita, et al., (eds.), 2001, Cancer Principles and Practice of Oncology, 6th. Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA]을 참조하시오; 상기 문헌은 본 발명의 모든 목적을 위해서 내용 전체가 참고로 인용된다).
"전이성"은 다른 기관 또는 동일 기관의 먼 부위로 확산되는 상기 정의한 바와 같은 종양 세포를 지칭한다.
"암-관련된"은 핵산과 그의 발현, 또는 그의 결여, 또는 단백질과 그의 수준 또는 활성, 또는 그의 결여의 관계, 환자 세포에서 암의 발병을 지칭한다. 예를 들어, 암은 정상의 건강한 세포에서는 발현되지 않거나, 또는 보다 낮은 수준으로 발현되는 특정 유전자의 발현과 관련될 수 있다. 환언적으로, 암 관련된 유전자는 암 세포(또는 형질전환 중인 세포)에서 발현되지 않거나, 또는 정상의 건강 세포에서 발현되는 것보다 낮은 수준으로 악성 세포에서 발현되는 것일 수 있다.
암과 관련하여, "형질전환"이란 용어는 정상 세포가 악성으로 될 때 겪는 변화를 지칭한다. 진핵생물에서, "형질전환"이란 용어는 세포 배양물에서 정상 세포의 악성 세포로의 전환을 개시하는데 사용될 수 있다.
"증식하는 세포"는 세포 분열을 능동적으로 겪고 지수적으로 성장하는 것들이다. "세포 증식 조절의 상실"은 세포 분열의 적합한 제한을 정상적으로 보장하는 세포 주기 조절을 상실한 세포의 성질을 지칭한다. 상기와 같은 조절을 상실한 세포는 자극 신호 없이 정상 속도보다 더 빠르게 증식하며, 억제 신호에 반응하지 않는다.
"진행된 암"은 원발 종양 부위로 더 이상 국한되지 않는 암, 또는 미국 암 학회(AJCC)에 따라 III 또는 IV 기인 암을 의미한다.
"잘 허용되는"은 치료의 결과로서 발생하거나 치료 결정에 영향을 미칠 수 있는, 건강 상태의 불리한 변화가 없음을 지칭한다.
"전이"는 면역 결핍 마우스의 유방 지방 패드 및/또는 순환계에 주입 시 상기 면역 결핍 마우스의 폐, 간, 뼈 또는 뇌에 2 차 종양 병변을 확립시킬 수 있는 종양 세포, 예를 들어 인간 고형 종양 또는 요 생식기 암을 지칭한다.
암 치료
사이토킨 항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체는 질병, 예를 들어 종양 질병의 치료 방법에 유용하다. "고형 종양"은 비 제한적으로 육종, 흑색종, 암종 또는 다른 고형 종양 암을 포함한다.
"육종"은 배 결합 조직과 같은 물질로 구성되고 일반적으로 근모 또는 동종 물질 중에 매몰된 치밀하게 충전된 세포들로 구성되는 종양을 지칭한다. 육종은 비 제한적으로 연골육종, 섬유육종, 림프육종, 흑색육종, 점액육종, 골육종, 아베메티 육종, 지방육종, 지질육종, 폐포 연조직 육종, 사기질세포성 육종, 포도상 육종, 녹색종 육종, 맥락막 육종, 태생 육종, 윌름 종양 육종, 자궁내막 육종, 간질 육종, 유잉 육종, 근막 육종, 섬유아세포 육종, 거대세포 육종, 과립구 육종, 호지킨 육종, 특발성 다 착색 출혈 육종, B 세포의 면역모세포 육종, 림프종, T 세포의 면역모세포 육종, 젠센 육종, 카포시 육종, 쿠퍼 세포 육종, 혈관육종, 백혈육종, 악성 간엽종 육종, 방골성 육종, 망상적혈구 육종, 라우스 육종, 혈청낭 육종, 활액 육종 및 모세관확장성 육종을 포함한다.
"흑색종"은 피부 및 다른 기관의 멜라닌세포 시스템으로부터 발생하는 종양을 지칭한다. 흑색종은 예를 들어 말단 흑자성 흑색종, 무색소성 흑색종, 양성 청소년 흑색종, 클라우드만 흑색종, S91 흑색종, 하딩-파시 흑색종, 청소년 흑색종, 흑색점 악성 흑색종, 악성 흑색종, 결절성 흑색종, 조갑하 흑색종, 및 얕은 확산성 흑색종을 포함한다.
"암종"은 주위 조직에 침투하는 경향이 있는 상피 세포로 구성된 악성의 새로운 성장을 지칭하며 전이를 발생시킨다. 예시적인 암종으로는 예를 들어 포상 암종, 입상 암종, 선낭종성 암종, 아데노이드 낭성 암종, 암성 선종, 부신 피질의 암종, 폐포성 암종, 폐포세포 암종, 기저 세포 암종, 암성 기저세포, 기저양 암종, 기저편평세포 암종, 세기관지폐포 암종, 세기관지 암종, 기관지 암종, 대뇌양 암종, 담관세포성 암종, 융모막 암종, 콜로이드 암종, 여드름 암종, 체 암종, 체모양 암종, 암성 경결, 암성 피부, 원통형 암종, 원통세포 암종, 맥관 암종, 경성 암종, 태생 암종, 뇌성 암종, 표피유사 암종, 암성 상피 아데노이드, 외부기생 암종, 암성 엑스 울세레(ex ulcere), 암성 섬유종, 아교형 암종, 아교질 암종, 거대세포 암종, 암성 거대세포, 선 암종, 과립층세포 암종, 모기질 암종, 혈액 암종, 간세포 암종, 허틀 세포 암종, 유리질 암종, 콩팥세포성 암종, 소아 태생 암종, 원위치 암종, 피내 암종, 상피내 암종, 크롬페커 암종, 쿨치스키 세포 암종, 대세포 암종, 수정체 암종, 암성 수정체, 지방종성 암종, 림프상피성 암종, 암성 속질, 속질 암종, 멜라닌 암종, 암성 몰리, 점액 암종, 암성 뮤시파룸, 암성 점막세포, 점막표피모양 암종, 암성 추벽, 점액성 암종, 암성 점액종, 비인두 암종, 연맥세포 암종, 암성 골화, 골성 암종, 유도 암종, 문백주위 암종, 전이전 암종, 가시돌기 세포 암종, 풀모양 암종, 신장의 신세포 암종, 예비 세포 암종, 암성 육종, 슈나이더 암종, 경화성 암종, 암성 음낭, 인지환세포 암종, 암성 단순체, 소세포 암종, 솔레노이드 암종, 구상세포 암종, 방추세포 암종, 암성 해면, 편평암종, 편평세포 암종, 줄 암종, 암성 화농, 암성 모세혈관확장, 전이세포 암종, 암성 괴경, 결정성 암종, 사마귀 암종 및 암성 비플로슘이 있다.
"백혈병"은 혈액 형성 기관의 진행성 악성 질병을 지칭하며 일반적으로 혈액 및 골수에서의 백혈구 및 그의 전구체의 왜곡된 증식 및 발생을 특징으로 한다. 백혈병은 일반적으로 (1) 상기 질병의 지속기간 및 특징-급성 또는 만성; (2) 관련 세포의 유형; 골수양(골수성), 림프양(림프성) 또는 단핵성; 및 (3)혈액 중 비정상 세포 수의 증가 또는 비 증가-백혈성 또는 무백혈성(아백혈성)을 기준으로 임상적으로 분류된다. 백혈병은 예를 들어 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병, 성인 T 세포 백혈병, 무백혈성 백혈병, 백혈구증가성 백혈병, 호염기성 백혈병, 모세포 백혈병, 소 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 백혈병 피부, 태생 백혈병, 호산구성 백혈병, 그로스 백혈병, 모세포 백혈병, 혈구모세포 백혈병, 혈구모세포성 백혈병, 조직구성 백혈병, 줄기세포 백혈병, 급성 단핵성 백혈병, 무백혈성 백혈병, 림프성 백혈병, 림프모세포 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프형성 백혈병, 림프양 백혈병, 림프육종 세포 백혈병, 비만세포 백혈병, 거핵구 백혈병, 작은골수모세포 백혈병, 단핵성 백혁병, 골수모세포성 백혈병, 골수세포성 백혈병, 골수성 과립구성 백혈병, 골수단핵성 백혈병, 나에젤리 백혈병, 혈장세포 백혈병, 형질세포 백혈병, 전골수세포성 백혈병, 리더 세포 백혈병, 쉴링 백혈병, 줄기세포 백혈병, 아백혈성 백혈병 및 미분화세포 백혈병을 포함한다.
추가의 암으로는 예를 들어 호지킨병, 비 호지킨병, 림프종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 유방암, 난소암, 폐암, 횡문근육종, 1차 혈소판증가증, 1차 마크로글루불린혈증, 줄기세포 폐 종양, 원발성 뇌 종양, 위암, 결장암, 악성 췌장 인슐린종, 악성 유암종, 방광암, 전암성 피부 병변, 고환 암, 림프종, 갑상선 암, 신경모세포종, 식도암, 요생식관 암, 악성 고칼슘혈증, 자궁경부암, 자궁내막암, 부신피질암, 및 전립선암이 있다.
항체 사이토킨 복합체의 치료 적용
당해 분야에 널리 이해되는 바와 같이, 생체특이성 포착 시약은 항체, 사이토킨 또는 림포카인에 결합하는 항체의 결합 단편(예를 들어 완전한 길이의 중 및 경쇄를 갖는 완전 항체 분자, 또는 그의 임의의 단편 또는 아피바디(affibody)(Affibody, Teknikringen 30, Box 700 04, Stockholm SE-10044, Sweden; 본 발명에 내용 전체가 모든 목적으로 참고로 인용된 미국 특허 제 5,831,012 호를 참조하시오))을 포함한다. 목적하는 용도에 따라, 상기는 또한 수용체 및 또 다른 생물분자에 특이적으로 결합하는 다른 단백질을 포함할 수 있다.
"항체"는 항원에 특이적으로 결합하여 이를 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 그의 단편으로부터의 하부구조 부위를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 상기 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 입실론 및 뮤 불변 부위 유전자뿐만 아니라 가지각색의 면역글로불린 가변 부위 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 입실론으로 분류되며, 이는 차례로 각각의 면역글로불린 부류, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 한정한다. 전형적으로 항체의 항원 결합 부위는 결합 특이성 및 친화성에 가장 중요할 것이다.
하이브리드 항체 및 하이브리드 항체 단편은 완전 길이 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전 항체 분자, 또는 그의 임의의 단편, 예를 들어 Fc 부위를 포함하는 항체 단편을 포함한다. 본 발명에 개시된 바와 같은 가변 부위 및 다양한 종들로부터의 불변 부위를 갖는 키메릭 항체가 또한 적합하다. 예를 들어 미국 특허 출원 제 20030022244 호를 참조하시오.
처음에, 항체가 발생할 수 있는 소정의 표적 대상을 선택한다. 표적 대상에 대한 단클론 항체를 생성시키는 기법은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 상기와 같은 기법의 예로는 비 제한적으로 표시 라이브러리, 이종 또는 휴맵(humab) 마우스, 하이브리도마 등을 포함하는 것들이 있다. 표적 대상은 항원성을 나타낼 수 있는 임의의 물질을 포함하며, 대개는 단백질 또는 단백질 폴리사카라이드이다. 예로서 수용체, 효소, 호르몬, 성장 인자, 펩타이드 등이 있다. 본 내용에 따라 사용하기에 적합한 천연 항체뿐만 아니라 소정의 대상에 대한 공학 항체 및 항체 단편이 또한 적합함은 물론이다.
본 발명에 기술한 기법들을 가할 수 있는 항체(Ab)는 단클론 및 다클론 항체, 및 Fc 부위를 포함하는 항체 단편, 예를 들어 파지 또는 파지미드 표시 기술로부터 유도된 다이아바디, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 항체 단편을 포함한다. 우선, 초기 항체를 기원 종으로부터 수득한다. 보다 특히, 표적 항원에 대한 특이성을 갖는 기원 종 항체의 경쇄, 중쇄 또는 이들 모두의 가변 부분의 핵산 또는 아미노산 서열이 필요하다. 상기 기원 종은 항체 또는 항체 라이브러리를 생성시키는데 사용된 임의의 종, 예를 들어 래트, 마우스, 토끼, 닭, 원숭이, 인간 등이다. 단클론 항체의 생성 및 클로닝 기법은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 목적하는 항체를 획득한 후에, 가변 부위(VH 및 VL)를 CDR의 임의의 가능한 정의(예를 들어 Kabat 단독, Chothia 단독, Kabat 및 Chothia 병용, 및 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 다른 것들)를 사용하여 성분 부분(즉 하부구조(FR) 및 CDR)으로 분리한다. 일단 획득되었으면, 적합한 표적 종들의 하부구조 선택이 필요하다. 하나의 실시태양은 가변 아미노산 서열을 갖는 기원 종 항체 서열 또는 표적 종으로부터의 유전자 서열로부터 각각의 개별적인 하부구조 부위의 정렬을 포함한다. 정렬 탐색 프로그램, 예를 들어 BLASST 등은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 표적 종이 인간인 경우, 상기와 같은 아미노산 서열 또는 유전자 서열(생식세포 계통 또는 재배열된 항체 서열)의 출처를 임의의 적합한 기준 데이터베이스, 예를 들어 Genbank, NCBI 단백질 데이터뱅크(http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), VBASE, 인간 항체 유전자의 데이터베이스(http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc), 및 면역글로불린의 Kabat 데이터베이스(http:///.immuno.bme.nwu.edu), 또는 그의 번역된 산물에서 찾을 수 있다. 상기 정렬이 뉴클레오타이드 서열을 기준으로 수행되는 경우, 선택된 유전자를 분석하여 어느 서브세트의 유전자가 기원 종 항체와 가장 가까운 아미노산 상동성을 갖는가를 결정해야 한다. 상기 데이터베이스 중 다른 서열에 비해 보다 높은 정도의 상동성에 접근하는 아미노산 서열 또는 유전자 서열을 사용할 수 있으며 본 발명에 개시된 과정에 따라 조작할 수 있는 것으로 생각된다. 더욱이, 보다 덜 상동성인 아미노산 서열 또는 유전자를, 상기가 본 발명에 개시된 과정에 따라 조작되고 선택될 때 상기 소정의 표적 항원에 대해 특이성을 나타내는 산물을 암호화하는 경우 사용할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 허용 가능한 상동성 범위는 약 50% 초과이다. 표적 종이 인간 이외일 수 있음은 물론이다.
"치료"는 임의의 객관적이거나 주관적인 매개변수, 예를 들어 감소; 완화; 증상의 감소 또는 상기 질병 상태를 환자에게 보다 허용될 수 있게 만드는 것; 퇴화 또는 감퇴 속도의 느려짐; 또는 최종 퇴화 점을 덜 쇠약하게 만드는 것을 포함한, 암의 치료 또는 개선 또는 예방에서 임의의 성공지수를 지칭한다. 상기 증상의 치료 또는 개선은 의사에 의한 검사 결과를 포함하여 객관적이거나 주관적인 매개변수를 근거로 할 수 있다. 따라서, "치료"란 용어는 질병, 예를 들어 종양 질병, 자가면역 질병, 세포 고갈성 방사선치료 또는 화학요법, 또는 감염성 질병과 관련된 증상 또는 상태의 발생을 예방 또는 지연, 완화, 또는 정지 또는 억제하기 위한 본 발명의 화합물 또는 작용제의 투여를 포함한다. "치료 효과"란 용어는 환자에서 상기 질병, 상기 질병의 증상, 또는 상기 질병의 부작용의 감소, 제거 또는 예방을 지칭한다.
"와 함께", "복합 요법" 및 "병행 산물"은 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 사용된 바와 같은 첫 번째 요법 및 화합물의 환자에의 동반 투여를 지칭한다. 병행 투여 시, 각각의 성분을 동시에 또는 연속적으로 상이한 시점에서 임의의 순서로 투여할 수 있다. 따라서, 각각의 성분을 별도로, 그러나 목적하는 치료 효과를 제공하기에 충분히 시간상 가깝게 투여할 수 있다. 공지된 암 치료 약물 또는 자가면역 치료 약물과 본 발명의 약학 조성물과의 "동반 투여"는 상기 공지된 약물과 본 발명의 조성물이 모두 치료 효과를 갖도록 하는 시간으로 상기 약물과 항체 또는 사이토킨 항체 복합체 조성물 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물을 투여함을 의미한다. 상기와 같은 동반 투여는 본 발명 화합물의 투여에 대해 상기 암 치료 약물 또는 자가면역 치료 약물의 동시(즉 동일한 시간), 선행 또는 후속 투여를 포함할 수 있다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 특정 약물 및 본 발명의 조성물의 투여에 적합한 타이밍, 순서 및 투여량을 어렵지 않게 결정할 것이다.
본 발명의 방법을 사용한 질병, 예를 들어 종양 질병, 자가면역 질병, 세포 고갈성 방사선치료 또는 화학요법, 또는 감염성 질병의 "치료"는, 질병의 위험성이 증가될 수 있지만 아직 감염의 증상을 경험하거나 나타내지 않은 환자에서 증상의 개시를 예방하고, 감염 증상을 억제하고(그의 발병을 늦추거나 정지시킴), 감염 증상 또는 부작용으로부터 완화를 제공하고(경감성 치료 포함), 감염 증상을 완화시킴(퇴행을 일으킴)을 포함한다.
"투여량 단위"는 치료하려는 특정 개인에게 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 별도의 단위를 지칭한다. 각 단위는 필요한 약학 담체와 함께 목적하는 치료 효과(들)를 생성시키도록 계산된 소정 량의 활성 화합물(들)을 함유할 수 있다. 상기 투여량 단위 형태의 명세는 (a) 활성 화합물(들)의 독특한 특징 및 성취하려는 특정 치료 효과(들), 및 (b) 상기와 같은 활성 화합물(들)의 배합에 대한 당해 분야 고유의 제한에 의해 지시될 수 있다.
2 개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여 "일치하는" 또는 "일치" 퍼센트는 하기 개시하는 디폴트 매개변수를 갖는 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 연산을 사용하거나 또는 매뉴얼 정렬 및 가시적인 검사(예를 들어 NCBI 웹 사이트 참조)에 의해 측정 시 동일한(즉 비교 창 또는 지정된 범위에 대해 최대 일치를 위해 비교 및 정렬 시, 지정된 범위(예를 들어 본 발명에 개시한 바와 같은 사이토킨, 항체 또는 사이토킨 수용체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 본 발명에 개시한 바와 같은 사이토킨, 항체 또는 사이토킨 수용체의 아미노산 서열)에 대해 약 60% 일치, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 일치함) 2 개 이상의 서열 또는 하위서열들을 지칭한다. 상기와 같은 서열을 "실질적으로 일치하는"이라 한다. 상기 용어는 또한 시험 서열의 승낙을 지칭하거나 이에 적용할 수 있다. 상기 용어는 또한 결실 및/또는 부가를 갖는 서열뿐만 아니라 치환을 갖는 것도 포함한다. 하기 개시하는 바와 같이, 바람직한 연산은 격차 등을 설명할 수 있다. 바람직하게는 일치는 약 25 아미노산 또는 뉴클레오타이드 길이 이상의 범위, 보다 바람직하게는 50 내지 100 아미노산 또는 뉴클레오타이드 길이의 범위에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해서, 전형적으로는 하나의 서열이 기준 서열로 작용하며, 여기에 시험 서열들을 비교한다. 서열 비교 연산을 사용하는 경우, 시험 및 비교 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우 후속 좌표들을 지정하고, 서열 연산 프로그램 매개변수를 지정한다. 바람직하게는, 디폴트 프로그램 매개변수를 사용하거나, 또는 또 다른 매개변수들을 지정할 수 있다. 이어서 상기 서열 비교 연산은 상기 프로그램 매개변수를 근거로, 상기 기준 서열에 대한 시험 서열의 서열 일치 퍼센트를 계산한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "비교 창"은 20 내지 600, 대개 약 50 내지 약 200, 보다 대개는 약 100 내지 약 150으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 연속적인 위치들의 수 중 임의의 하나의 구획에 대한 비교를 포함하며, 여기에서 서열을 상기 두 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 같은 수의 연속적인 위치들의 기준 서열에 비교할 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열들의 최적 정렬을 예를 들어 문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math, 2:482, 1981]의 국소 상동성 연산에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol, 48:443, 1970]의 상동성 정렬 연산에 의해, 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 85:2444, 1988]의 유사성 방법에 대한 연구에 의해, 이들 연산의 컴퓨터화된 실행(문헌[Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]의 GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA)에 의해, 또는 매뉴얼 정렬 및 가시적인 검사(예를 들어 문헌[Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, 1995 supplement]을 참조하시오)에 의해 수행할 수 있다.
서열 일치 퍼센트 및 서열 유사성을 측정하기에 적합한 연산의 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 연산이며, 이는 각각 문헌[Altschul et al., Nuc. Acids Res, 25:3389-3402, 1977] 및 [Altschul et al., J. Mol. Biol, 215:403-410, 1990]에 개시되어 있다. 본 발명에 개시된 매개변수들과 함께 BLAST 및 BLAST 2.0을 사용하여 본 발명의 실시태양으로서 핵산 및 단백질에 대한 서열 일치 퍼센트를 측정한다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어를 국립 생물공학 정보 센터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 입수할 수 있다. 상기 연산은 먼저 조회 서열에서 짧은 암호 길이 W를 식별함으로써 고 득점 서열 쌍(HSP)을 식별함을 포함하며, 상기 서열은 데이터베이스 서열 중의 동일한 길이의 암호와 함께 정렬 시 일부 양의 값의 문턱 점수 T에 부합하거나 또는 이를 만족한다. T를 이웃 낱말 점수 문턱이라 칭한다(상기 Altschul et al.,). 상기 초기 이웃 암호 명중은 보다 긴 HSP를 찾기 위한 연구의 개시를 위한 시드로서 작용한다. 상기 암호 명중은 누적 정렬 점수가 증가할 수 있는 한 각 서열을 따라 양방향으로 연장된다. 누적 점수를, 뉴클레오타이드 서열의 경우, 매개변수 M(일치 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N(불일치 잔기에 대한 벌점; 항상 <0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 득점 행렬을 사용하여 누적 점수를 계산한다. 각 방향에서 암호 명중의 연장은, 누적 정렬이 그의 최대로 성취된 값으로부터 양 X에 의해 벗어났을 때; 상기 누적 점수가 하나 이상의 음-점수 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하로 갈 때; 또는 어느 한 서열의 끝이 도달할 때 멈춘다. 상기 BLAST 연산 매개변수 W, T 및 X는 상기 연산의 감도 및 속도를 결정한다. 상기 BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열의 경우)은 디폴트로서 11의 암호길이(W), 10의 기대값(E), M=5, N=4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, 상기 BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 암호길이, 10의 기대값(E), 및 50의 BLOSUM62 득점 행렬(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915, 1989), 10의 기대값(E), M=5, N=4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다
"폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본 발명에서 호환적으로 사용된다. 상기 용어를 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 아미노산의 인공적인 화학적 유사물질인 아미노산 중합체뿐만 아니라 천연 아미노산 중합체 및 비 천연 아미노산 중합체에 적용한다.
"아미노산"은 천연 및 합성 아미노산뿐만 아니라 상기 천연 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 동족체 및 아미노산 유사물질을 지칭한다. 천연 아미노산은 유전자 암호에 의해 암호화된 것들뿐만 아니라 나중에 변경된 아미노산들, 예를 들어 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 동족체는 천연 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조, 즉 수소, 카복실 그룹, 아미노 그룹 및 R 그룹에 결합된 α 탄소를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 상기와 같은 동족체는 변경된 R 그룹(예를 들어 노르류신) 또는 변경된 펩타이드 주쇄를 갖지만, 천연 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조를 유지한다. 아미노산 유사물질은 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 천연 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 지칭한다.
아미노산을 본 발명에서는 그의 통상적으로 공지된 3 문자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회에 의해 권장되는 1 문자 기호에 의해 지칭할 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오타이드를 그의 통상적으로 승인되는 1 문자 암호에 의해 지칭할 수 있다.
"보존적으로 변경된 변체"를 아미노산과 핵산 서열 모두에 적용한다. 특정한 핵산 서열에 대해서, 보존적으로 변경된 변체는 동일하거나 필수적으로 동일한 아미노산 서열, 또는 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우, 필수적으로 동일한 서열을 암호화하는 핵산을 지칭한다. 상기 유전자 암호의 퇴보로 인해, 큰 수의 기능상 동일한 핵산들이 임의의 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들어, GCA, GCC, GCG 및 GCU 코돈은 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 지정된 모든 위치에서, 상기 코돈을 상기 암호화된 폴리펩타이드의 변경 없이 개시된 상응하는 코돈들 중 임의의 것으로 변경할 수 있다. 상기와 같은 핵산 변화는 "침묵 변화"이며, 이는 보존적으로 변경된 변화의 한 종류이다. 폴리펩타이드를 암호화하는 본 발명의 모든 핵산 서열은 또한 상기 핵산의 모든 가능한 침묵 변화를 개시한다. 숙련가는 핵산 중의 각 코돈(통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)을 변경시켜 작용상 동일한 분자를 생성시킬 수 있음을 알 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 각 침묵 변화는, 실제 탐침 서열은 아닌, 발현 산물에 대해 각각 개시된 서열 중에 내재한다.
아미노산 서열에 대해서, 숙련가는 암호화된 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 퍼센트의 아미노산이 변경, 부가 또는 결실된 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 부가는, 상기 변경이 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는 경우, "보존적으로 변경된 변체"임을 인식할 것이다. 기능상 유사한 아미노산들을 제공하는 보존적 치환 표는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 상기와 같은 보존적으로 변경된 변체들은 본 발명의 실시태양으로서 중합체성 변체, 종간 동족체, 및 대립형질을 또한 포함하며 제외시키지 않는다.
하기 8 개의 그룹은 각각 서로에 대한 보존적인 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라진(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 쓰레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들어 문헌[Creighton, Proteins(1984)]을 참조하시오).
폴리펩타이드 구조와 같은 거대분자 구조를 다양한 수준의 조직화에 관하여 개시할 수 있다. 상기 조직화의 일반적인 논의에 대해서, 예를 들어 문헌[Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 3rd ed., 1994] 및 [Cantor and Schimmel, Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules, 1980]을 참조하시오. "1차 구조"는 특정 펩타이드의 아미노산 서열을 지칭한다. "2차 구조"는 폴리펩타이드 내의 국소적으로 정렬되느 3 차원 구조를 지칭한다. 이들 구조는 도메인, 예를 들어 효소 도메인, 세포 외 도메인, 막통과 도메인, 기공 도메인, 및 세포질 꼬리 도메인으로서 통상적으로 공지된다. 도메인들은 폴리펩타이드의 소형 단위를 형성하고 전형적으로 15 내지 350 아미노산 길이인 폴리펩타이드의 부분이다. 전형적인 도메인은 효소 활성을 갖는 도메인, 예를 들어 키나제 도메인을 포함한다. 전형적인 도메인은 보다 덜 조직화된 섹션, 예를 들어 β-시트 및 α-나선의 신장부로 구성된다. "3차 구조"는 폴리펩타이드 단량체의 완전한 3 차원 구조를 지칭한다. "4차 구조"는 독립적인 3원 단위들의 비공유 회합에 의해 형성된 3 차원 구조를 지칭한다. 이방성이란 용어는 또한 에너지 용어로서 공지되어 있다.
특정한 핵산 서열은 또한 "접합 변체"를 암묵적으로 포함한다. 유사하게, 핵산에 의해 암호화된 특정 단백질은 상기 핵산의 접합 변체에 의해 암호화된 임의의 단백질을 암묵적으로 포함한다. 명칭이 제시하는 바와 같이 "접합 변체"는 유전자의 교번 접합 산물이다. 전사 후에, 초기 핵산 전사물을 상이한(또 다른) 핵산 접합 산물이 상이한 폴리펩타이드를 암호화하도록 접합시킬 수 있다. 접합 변체 생산 기전은 다양하지만, 엑손의 교번 접합을 포함한다. 전사 통독에 의해 동일한 핵산으로부터 유래한 또 다른 폴리펩타이드도 또한 상기 정의에 포함된다. 재조합 형태의 접합 산물을 포함하여 접합 반응의 임의의 산물이 상기 정의에 포함된다.
"재조합체"는 예를 들어 세포, 또는 핵산, 단백질 또는 벡터에 관하여 사용될 때 상기 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변경되었거나 상기 세포가 상기와 같이 변경된 세포로부터 유래함을 가리킨다. 따라서, 예를 들어 재조합 세포는 천연(비 형질전환체) 형태의 세포 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는 달리 비정상적으로 발현되거나, 발현하에 있거나 전혀 발현되지 않은 천연 유전자를 발현한다.
"엄격한 하이브리드화 조건"이란 어구는 탐침을 전형적으로 핵산의 복합 산물에서 그의 표적 하위서열(다른 서열은 아닌)에 하이브리드화하는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며 상이한 환경 하에서는 상이할 것이다. 보다 긴 서열은 보다 높은 온도에서 특이적으로 하이브리드화한다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 안내가 문헌[Tijssen, "Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes", Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assay, 1993]에서 발견된다. 일반적으로 엄격한 조건은 한정된 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm ,)보다 약 5 내지 10 ℃ 더 낮게 선택된다. 상기 Tm은 표적에 상보적인 탐침의 50%가 평형 시 상기 표적 서열에 하이브리드화하는 온도이다(한정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서)(상기 표적 서열은 Tm에서 과잉으로 존재하므로, 상기 탐침의 50%는 평형 시 점유된다). 엄격한 조건은 또한 폼아미드와 같은 탈안정화제의 첨가에 의해 성취될 수 있다. 선택적이거나 특정한 하이브리드화를 위해서, 양의 신호는 배경의 2 배 이상, 바람직하게는 배경 하이브리드화의 10 배이다. 전형적인 엄격한 하이브리드화 조건은 하기와 같을 수 있다: 50% 폼아미드, 5 x SSC, 및 1% SDS, 42 ℃에서의 배양, 또는 5 x SSC, 1% SDS, 65 ℃에서의 배양과 0.2 x SSC 및 0.1% SDS, 65 ℃에서의 세척.
엄격한 조건 하에서 서로 하이브리드화하지 않는 핵산은 상기 핵산이 암호화하는 폴리펩타이드가 실질적으로 동일하다면 여전히 실질적으로 동일하다. 이는 예를 들어 핵산의 사본이 유전자 암호에 의해 허용된 최대 코돈 퇴보를 사용하여 생성될 때 발생한다. 상기와 같은 경우에, 상기 핵산은 전형적으로는 보통으로 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 하이브리드화한다. 전형적인 "보통으로 엄격한 하이브리드화 조건"은 37 ℃에서 40% 폼아미드, 1M NaCl, 1% SDS의 완충액 중에서의 하이브리드화 및 45 ℃에서 1 X SSC에서의 세척을 포함한다. 양의 하이브리드화는 배경의 2 배 이상이다. 통상적인 숙련가들은 교번 하이브리드화 및 세척 조건을 사용하여 유사한 엄격성의 조건을 제공할 수 있음을 쉽게 인식할 것이다. 하이브리드화 매개변수의 측정에 대한 추가적인 지침은 다수의 참고문헌들, 예를 들어 상기 오수벨(Ausubel) 등의 문헌에 의해 제공된다.
PCR의 경우, 약 36 ℃의 온도가 저 엄격성 증폭에 전형적이지만, 어닐링 온도는 프라이머 길이에 따라 약 32 내지 48 ℃로 변할 수 있다. 고 엄격성 PCR 증폭의 경우, 약 62 ℃의 온도가 전형적이나, 고 엄격성 어닐링 온도는 프라이머 길이 및 특이성에 따라 약 50 내지 약 65 ℃의 범위일 수 있다. 고 및 저 엄격성 증폭 모두에 대해 전형적인 주기 조건은 30 초 내지 2 분간 90 내지 95 ℃의 변성 단계, 30 초에서 2 분 지속되는 어닐링 단계, 및 1 내지 2 분간 약 72 ℃의 연장 단계를 포함한다. 저 및 고 엄격성 증폭 반응에 대한 프로토콜 및 지침은 예를 들어 문헌[Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y., 1990]에 제공되어 있다.
"약학적으로 허용 가능한 부형제"는 일반적으로 안전하고, 무독성이며, 바람직하고, 수의학적 용도뿐만 아니라 인간 약학 용도에도 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물의 제조에 유용한 부형제이다. 상기와 같은 부형제는 고체, 액체, 반고체, 또는 에어로졸 조성물의 경우 기상일 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한 염 및 에스터"는 약학적으로 허용 가능하고 목적하는 약물학적 성질들을 갖는 염 및 에스터를 의미한다. 상기와 같은 염은 상기 화합물 중에 존재하는 산성 양성자가 무기 또는 유기 염기와 반응할 수 있는 경우 형성될 수 있는 염을 포함한다. 적합한 무기 염은 알칼리 금속, 예를 들어 나트륨 및 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 알루미늄과 형성되는 것들을 포함한다. 적합한 유기 염은 유기 염기, 예를 들어 아민 염기, 예를 들어 에탄올아민, 다이에탄올아민, 트라이에탄올아민, 트로메타민, N 메틸글루카민 등과 형성되는 것들을 포함한다. 상기와 같은 염은 또한 무기산(예를 들어 염산 및 브롬화수소산) 및 유기산(예를 들어 아세트산, 시트르산, 말레산, 및 알칸- 및 아렌-설폰산, 예를 들어 메탄설폰산 및 벤젠설폰산)과 형성된 산 부가염을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 에스터는 상기 화합물 중에 존재하는 카복시, 설포닐옥시, 및 포스포녹시 그룹으로부터 형성되는 에스터, 예를 들어 C1 - 6알킬 에스터를 포함한다. 2 개의 산성 그룹이 존재하는 경우, 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스터는 모노-산-모노-염 또는 에스터 또는 다이-염 또는 에스터일 수 있고; 유사하게 2 개를 초과하는 산성 그룹이 존재하는 경우, 상기와 같은 그룹들 중 일부 또는 전부를 염화 또는 에스터화시킬 수 있다. 본 발명에서 명명하는 화합물들은 염화되지 않거나 에스터화되지 않은 형태, 또는 염화 및/또는 에스터화된 형태로 존재할 수 있고, 상기와 같은 화합물의 명명은 원(염화되지 않고 에스터화되지 않은) 화합물 및 그의 약학적으로 허용 가능한 염 및 에스터 모두를 포함하고자 한다. 또한 본 발명에서 명명된 몇몇 화합물은 하나보다 많은 입체이성체 형태로 존재할 수 있으며, 상기와 같은 화합물의 명명은 모든 단일 입체이성체 및 상기와 같은 입체이성체들의 모든 혼합물(라세미든 다른 것이든 간에)을 포함하고자 하는 것이다.
"약학적으로 허용 가능한", "생리학적으로 허용 가능한" 및 그의 문법적인 변형(조성물, 담체, 희석제 및 시약들을 지칭한다)을 호환적으로 사용하며 상기 물질들은 상기 조성물의 투여를 금지할 정도로 바람직하지 못한 생리학적 효과의 생산 없이 인간에게 투여될 수 있음을 나타낸다.
"치료 유효량"은 질병을 치료하기 위해 환자에게 투여 시, 상기 질병의 치료를 수행하기에 충분한 양을 의미한다.
주석을 단 경우를 제외하고, "환자"는 호환적으로 사용되며 인간 환자 및 비 인간 영장류와 같은 포유동물뿐만 아니라 토끼, 래트 및 마우스 및 다른 동물과 같은 실험 동물들을 지칭한다. 따라서, 본 발명에 사용된 바와 같은 "환자"란 용어는 상기 조성물을 투여할 수 있는 임의의 포유동물 환자를 의미한다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 환자는 종양 질병, 자가면역 질병, 세포 고갈성 방사선치료 또는 화학요법, 감염성 질병, 또는 질병에 대한 강하된 내성을 유발하는 상태, 예를 들어 HIV를 앓게 될 것이다. 본 발명의 전형적인 실시태양에서, 상기 방법에 따라 하나 이상의 사이토킨 항체 복합체를 포함하는 약학 조성물로 치료하기 위한 환자를 동정하기 위해서, 승인된 선별 방법을 사용하여 환자의 기존 질병 또는 병의 상태 또는 표적화된 또는 의심이 가는 질병 또는 상태와 관련된 위험 인자들을 측정한다. 이러한 선별 방법은 예를 들어 환자가 질병을 앓고 있는 지의 여부를 결정하기 위한 시험을 포함한다. 상기 및 다른 통상적인 방법들은 임상의로 하여금 치료가 필요한 환자를 선택할 수 있게 한다.
동일한 계열 및/또는 동일한 계열 구성원으로부터 적합한 하부구조 부위 후보를 선택한 후에, 중쇄 및 경쇄 가변 부위 중 어느 하나 또는 이들 모두를, 원래 종으로부터의 CDR을 하이브리드 하부구조 부위에 그래프팅시켜 생성시킨다. 상기 태양들 중 어느 하나에 대해 하이브리드 가변 쇄 부위를 갖는 하이브리드 항체 또는 하이브리드 항체 단편의 조립을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 하이브리드 가변 도메인(즉 표적 종에 근거한 하부구조 및 기원 종으로부터의 CDR)을 암호화하는 DNA 서열을 올리고뉴클레오타이드 합성 및/또는 PCR에 의해 생성시킬 수 있다. CDR 부위를 암호화하는 핵산을 또한 적합한 제한 효소를 사용하여 원래 종 항체로부터 단리하고 적합한 연결 효소에 의한 연결에 의해 표적 종 하부구조 내에 연결시킬 수 있다. 한편으로, 상기 원래 종 항체의 가변 쇄의 하부구조 부위를 부위 지향된 돌연변이에 의해 변화시킬 수 있다.
상기 하이브리드를 각각의 하부구조 부위에 상응하는 다수의 후보들 중에서 선택하여 제작하기 때문에, 본 발명에 개시된 원리에 따라 제작할 수 있는 서열들의 다수의 조합이 존재한다. 따라서, 개별적인 하부구조 부위의 상이한 조합을 갖는 구성원들을 갖는 하이브리드의 라이브러리를 조립할 수 있다. 상기와 같은 라이브러리는 서열들의 전자 데이터베이스 수집 또는 하이브리드의 물리적 수집일 수 있다.
물리적 항체 또는 항체 단편 라이브러리의 조립을 바람직하게는 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행한다. 일례로, 올리고뉴클레오타이드를 상기가 예를 들어 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해, 폴리머라제에 의해 어닐링할 수 있고 충전될 수 있도록 중복 부위를 갖게 디자인한다. VL 및 VH 유전자 삽입물을 생성시키기 위해서 여러 단계의 중복 연장을 수행한다. 상기 단편들은 이들이 중복 연장에 의해 융합되어 완전 길이 경쇄 및 Fd 중쇄 단편을 생성할 수 있도록 인간 불변 도메인과의 중복 부위를 갖게 디자인한다. 상기 경 및 중 Fd 쇄 부위를 중복 연장에 의해 함께 연결시켜 표시 벡터 내로 클로닝되는 단일 Fab 라이브러리 삽입물을 생성시킬 수 있다. 인간화된 라이브러리 유전자의 조립을 위한 또 다른 방법을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 라이브러리를 리가제 쇄 반응(LCR) 접근법을 사용하여 중복되는 올리고뉴클레오타이드로부터 조립할 수 있다(Chalmers et al., Biotechniques, 30-2:249-252, 2001).
다양한 형태의 항체 단편을 생성시키고 적합한 벡터에 클로닝시켜 하이브리드 항체 라이브러리 또는 하이브리드 항체 단편 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 예를 들어 가변 유전자를 프레임 안에 필요한 불변 도메인의 나머지 부분을 함유하는 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 클로닝될 수 있는 추가적인 단편의 예로는 전체 경쇄, 중쇄의 Fc 부분, 또는 경쇄와 중쇄 Fc 암호화 서열을 모두 함유하는 단편이 있다.
임의의 선택 표시 시스템을 본 내용에 따른 라이브러리와 함께 사용할 수 있다. 큰 라이브러리의 목적하는 구성원을 단리하기 위한 선택 프로토콜은 파지 표시 기법에 의해 유형화된 바와 같이, 당해 분야에 공지되어 있다. 다양한 펩타이드 서열을 필라멘트형 박테리오파지의 표면상에 표시하는 상기와 같은 시스템은 시험관 내 선별 및 표적 항원과 결합하는 특이 항체 단편의 증폭을 위한 항체 단편(및 상기를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열)의 라이브러리를 생성시키는데 유용한 것으로 입증되었다(Scott et al., Science, 249:386, 1990). VH 및 VL 부위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을, 이들을 이 콜라이의 원형질막 공간을 향하게 하는 리더 신호를 암호화하는 유전자 단편에 결합시키고, 그 결과 생성된 항체 단편이 전형적으로는 박테리오파지 피막 단백질(예를 들어 pIII 또는 pVIII)에 대한 융합으로서 상기 박테리오파지의 표면상에 표시된다. 한편으로, 항체 단편을 람다 파지 또는 T7 캡시드(파지바디) 상에 외부적으로 표시한다. 파지 기본 표시 시스템의 이점은, 상기 시스템이 생물시스템이므로, 선택된 라이브러리 구성원을 단순히 세균 세포에서 상기 선택된 라이브러리 구성원을 함유하는 파지를 증식시킴으로써 증폭시킬 수 있다는 것이다. 더욱 또한, 상기 폴리펩타이드 라이브러리 구성원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 파지 또는 파지미드 벡터 상에 함유되어 있기 때문에, 서열화, 발현 및 후속 유전자 조작이 비교적 간단하다. 박테리오파지 항체 표시 라이브러리 및 람다 파지 발현 라이브러리의 제작 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(McCafferty et al., Nature, 348:552, 1990; Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:4363, 1991).
본 발명은 또한 본 발명의 사이토킨 또는 림포카인에 특이적으로 결합하는 항체 및 T-세포 항원 수용체(TCR)에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 포함), IgA(IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE 또는 IgM, 및 IgY를 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "항체"(Ab)란 용어는 단쇄 완전 항체를 포함한 완전 항체, 및 그의 항원 결합 단편을 포함함을 의미한다. 가장 바람직하게는 상기 항체는 본 발명의 인간 항원 결합 항체 단편이며, 비 제한적으로 단쇄 항체, 다이설파이드-결합된 Fvs(sdFv), Fc 도메인을 포함하는 단편, VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함한다. 상기 항체는 조류 및 포유동물을 포함한 임의의 동물 기원으로부터 있을 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 인간, 쥐, 토끼, 염소, 기니 피그, 낙타, 말 또는 닭이다.
단쇄 항체를 포함한 항원 결합 항체 단편은 가변 부위(들)를 단독으로 또는 하기 중 전체 또는 부분과 함께 포함할 수 있다: 이음매 부위, CH1, CH2 및 CH3 도메인. 본 발명은 또한 가변 부위(들) 및 이음매 부위, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드와 특이적으로 결합하는 단클론, 다클론, 키메릭, 인간화, 및 인간 단클론 및 인간 다클론 항체를 또한 포함한다. 본 발명은 본 발명의 항체에 대해 항-유전자형인 항체를 또한 포함한다.
본 발명의 항체는 일특이성, 이특이성, 삼특이성 또는 보다 큰 다중특이성일 수 있다. 다중특이성 항체는 본 발명의 폴리펩타이드의 상이한 에피토프들에 대해 특이적이거나 본 발명의 폴리펩타이드뿐만 아니라 이종 조성물, 예를 들어 이종 폴리펩타이드 또는 고체 지지체 물질 모두에 대해 특이성일 수 있다. 예를 들어 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; 문헌[Tutt et al., J. Immunol. 147:60-69, 1991]; 미국 특허 제 5,573,920; 4,474,893; 5,601,819; 4,714,681; 4,925,648 호(이들은 각각 본 발명에 내용 전체가 모든 목적으로 인용되어 있다); 문헌[Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553, 1992]을 참조하시오.
본 발명의 항체는 상기 항체에 의해 인식되거나 특이적으로 결합된 본 발명의 폴리펩타이드의 에피토프(들) 또는 부분(들)에 대해 개시되거나 상세히 기술될 수 있다. 상기 에피토프(들) 또는 폴리펩타이드 부분(들)을 예를 들어 N-말단 및 C-말단 위치, 연속적인 아미노산 잔기들의 크기에 의해 본 발명에 개시한 바와 같이 상세히 기술될 수 있다. 본 발명의 임의의 에피토프 또는 폴리펩타이드와 특이적으로 결합하는 항체는 또한 제외될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하며, 이의 제외도 허용한다.
본 발명의 항체를 또한 그의 교차 반응성에 대해 개시하거나 상세히 기술할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 임의의 다른 동족체, 유사유전자, 또는 동족체와 결합하지 않는 항체를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드와 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만 및 50% 미만의 일치율(당해 분야에 공지되고 본 발명에 개시된 방법을 사용하여 계산 시)을 갖는 폴리펩타이드와 결합하지 않는 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 엄격한 하이브리드화 조건(본 발명에 개시됨) 하에서 오직 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 결합하는 항체가 본 발명에 추가로 포함된다. 본 발명의 항체를 또한 그의 결합 친화성에 대해 개시하거나 상세히 기술할 수 있다. 바람직한 결합 친화성은 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M 및 10-15 M 미만의 해리 상수 또는 Kd를 갖는 것을 포함한다.
사이토킨 항체 복합체를 형성하는 사이토킨에 대한 항체는 비 제한적으로 시험관 내 및 생체 내 진단 및 치료 방법 모두를 포함한 본 발명의 폴리펩타이드의 정제, 검출 및 표적화를 위해 당해 분야에 공지된 방법들을 포함하는 용도를 갖는다. 예를 들어, 상기 항체는 생물 샘플 중의 본 발명의 폴리펩타이드의 수준을 정량적으로 및 정성적으로 측정하기 위한 면역분석에서의 용도를 갖는다. 예를 들어 상기 문헌[Harlow and Lane](본 발명에 내용 전체가 모든 목적을 위해 참고로 인용되어 있다)을 참조하시오.
본 발명의 항체를 단독으로 또는 다른 조성물과 함께 사용할 수 있다. 상기 항체는 N- 또는 C-말단에서 이종 폴리펩타이드에 재조합적으로 융합되거나 또는 폴리펩타이드 또는 다른 조성물에 화학적으로 접합(공유 및 비 공유 접합 포함)될 수 있다. 예를 들어, 항체를 사이토킨 또는 림포카인 분자에 재조합적으로 융합시키거나 접합시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 검출 분석에서 표지로서 유용한 분자 및 이종 폴리펩타이드, 약물 또는 독소와 같은 효과기 분자에 재조합적으로 융합 또는 접합시킬 수 있다. 예를 들어 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 미국 특허 제 5,314,995 호; 및 EP 0 396 387(각각 본 발명에 내용 전체가 모든 목적을 위해 참고로 인용되어 있다)을 참조하시오.
본 발명의 사이토킨 또는 림포카인에 대한 항체를 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 사이토킨 또는 림포카인 또는 그의 항원 단편을 다클론 항체를 함유하는 혈청의 생산을 유도하기 위해서 동물에게 투여할 수 있다. "단클론 항체"란 용어는 하이브리도마 기술을 통해 생산되는 항체로 제한되지 않는다. "단클론 항체"란 용어는 상기를 생산하는 방법이 아닌, 임의의 진핵, 원핵, 또는 파지 클론을 포함한, 단일 클론으로부터 유도된 항체를 지칭한다. 단클론 항체를 하이브리도마, 재조합 및 파지 표시 기술의 사용을 포함한 당해 분야에 공지된 광범위하게 다양한 기법을 사용하여 제조할 수 있다.
하이브리도마 기법은 당해 분야에 공지되고 문헌[Harlow and Lane, 상기; Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, 563-681, 1981](본 발명에 내용 전체가 참고로 인용된다)을 참조하시오. Fab 및 F(ab')2 단편을 파파인(Fab 단편을 생산하기 위해서) 및 펩신(F(ab')2 단편을 생산하기 위해서)과 같은 효소를 사용하여, 단백질 분해적 절단에 의해 생산할 수 있다.
한편으로, 사이토킨 또는 림포카인에 대한 항체를 재조합 DNA 및 파지 표시 기술의 적용을 통해 또는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하는 합성 화학을 통해 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 파지 표시 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 파지 표시 방법에서, 작용성 항체 도메인을 상기를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 수반하는 파지 입자의 표면상에 표시한다. 목적하는 결합 성질을 갖는 파지를 항원, 전형적으로는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포착된 항원으로 직접 선택함으로써 레퍼토리 또는 조합적인 항체 라이브러리(예를 들어 인간 또는 쥐)로부터 선택한다. 상기 방법에 사용된 파지는 전형적으로는 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 다이설파이드 안정화된 Fv 항체 도메인을 갖는 fd 및 M13을 포함하는 필라멘트성 파지이다. 본 발명의 항체의 제조에 사용될 수 있는 파지 표시 방법의 예로는 문헌[Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50, 1995; Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186, 1995; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958, 1994; Persic et al., Gene 187:9-18, 1997; Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280, 1994; PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 특허 제 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 및 5,733,743 호(이들은 각각 본 발명에 내용 전체가 모든 목적을 위해 참고로 인용되어 있다)에 개시된 것들이 있다.
상기 참고문헌들에 개시된 바와 같이, 파지 선택 후에, 상기 파지로부터의 항체 암호화 부위를 단리하고 이를 사용하여 인간 항체를 포함한 완전 항체, 또는 임의의 다른 목적하는 항원 결합 단편을 생성시키고 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 세균을 포함한 임의의 목적하는 숙주에서 발현시킬 수 있다. 예를 들어 상기 항체의 Fc 부위를 포함하는 항체 단편을 재조합적으로 생산하는 기법을 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 사용할 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생산하는 기법을 또한 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 WO 92/22324; 문헌[Mullinax et al., BioTechniques 12:864-869, 1992] 및 [Sawai et al., AJR1 34:26-34, 1995]; 및 [Better et al., Science 240:1041-1043, 1988]을 사용하여 사용할 수 있다.
단쇄 Fvs 및 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 기법의 예는 미국 특허 제 4,946,778 및 5,258,498 호(각각 본 발명에 내용 전체가 모든 목적을 위해 참고로 인용되어 있다); 문헌[Huston et al., Methods in Enzymology, 203:46-88, 1991; Shu, L. et al., PNAS 90:7995-7999, 1993; 및 Skerra et al., Science 240:1038-1040, 1988]에 개시된 것들을 포함한다. 인간 및 시험관 내 검출 분석에서의 항체의 생체 내 사용을 포함한 일부의 용도를 위해서, 키메릭, 인간화, 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 키메릭 항체의 생산 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Morrison, Science 229:1202, 1985; Oi et al., BioTechniques 4:214, 1986; Gillies et al., J. Immunol. Methods, 125; 191-202, 1989]; 및 미국 특허 제 5,807,715 호를 참조하시오. 항체를 CDR-그래프팅(EP 0 239 400; WO 91/09967; 및 미국 특허 제 5,530,101 및 5,585,089 호); 덧붙임 또는 재포장(EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E.A., Molecular Immunology, 28:489-498, 1991; Studnicka et al., Protein Engineering 7: 805-814, 1994; Roguska et al., PNAS 91: 969-973, 1994), 및 쇄 셔플링(미국 특허 제 5,565,332 호)을 포함한 다양한 기법들을 사용하여 인간화할 수 있다. 인간 항체를 상술한 파지 표시 방법을 포함한 당해 분야에 공지된 다양한 방법들에 의해 제조할 수 있다. 또한 미국 특허 제 4,444,887; 4,716,111; 5,545,806; 및 5,814,318 호 및 WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; 및 WO 91/10741(각각 본 발명에 내용 전체가 모든 목적을 위해 참고로 인용되어 있다)을 참조하시오.
본 발명의 사이토킨 또는 림포카인에 재조합적으로 융합되거나 화학적으로 접합된(공유 및 비 공유 접합 모두 포함) 항체가 본 발명에 추가로 포함된다. 상기 항체는 본 발명의 사이토킨 또는 림포카인 이외의 항원에 대해 특이적이다. 예를 들어, 항체를 사용하여 본 발명의 사이토킨 또는 림포카인을 시험관 내 또는 생체 내에서 특정 세포 유형에, 본 발명의 폴리펩타이드를 특정 세포 표면 수용체에 특이적인 항체에 융합 또는 접합시킴으로서 표적화할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드에 융합 또는 접합된 항체를 또한 당해 분야에 공지된 방법으로 시험관 외 면역분석 및 정제 방법에 사용할 수 있다. 예를 들어 상기 문헌[Harbor et al.,] 및 WO 93/21232; EP 0 439 095; 문헌[Naramura et al., Immunol. Lett. 39:91-99, 1994; 미국 특허 제 5,474,981 호(본 발명에 내용 전체가 모든 목적을 위해 참고로 인용되어 있다); 문헌[Gillies et al., PNAS 89:1428-1432, 1992; Fell et al., J. Immunol. 146: 2446-2452, 1991]을 참조하시오.
본 발명은 또한 항체 Fc 부위의 항체 도메인 또는 그의 부분에 융합 또는 접합된 본 발명의 사이토킨 또는 림포카인을 포함하는 조성물을 추가로 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드에 융합된 항체 부분은 이음매 부위, CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인 또는 전체 도메인의 임의의 조합 또는 그의 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 사이토킨 또는 림포카인을 상기 항체 부분에 융합 또는 접합시켜 상기 폴리펩타이드의 생체 내 반감기를 증가시키거나 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 면역분석에 사용할 수 있다. 상기 폴리펩타이드를 또한 상기 항체 부분에 융합 또는 접합시켜 다량체를 형성시킬 수 있다. 예를 들어 본 발명의 폴리펩타이드에 융합된 Fc 부분은 상기 Fc 부분간의 다이설파이드 결합을 통해 이량체를 형성할 수 있다. 보다 큰 다량체 형태들은 상기 폴리펩타이드를 IgA 및 IgM의 부분에 융합시킴으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 사이토킨 항체 복합체를 항체 부분에 융합 또는 접합시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 미국 특허 제 5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851; 5,112,946 호; EP 0 307 434, EP 0 367 166; WO 96/04388; 및 WO 91/06570(각각 본 발명에 내용 전체가 모든 목적을 위해 참고로 인용되어 있다), 문헌[Ashkenazi et al., PNAS, 88:10535-10539, 1991; Zheng et al., J. Immunol., 154:5590-5600, 1995; 및 Vil et al., PNAS, 89:11337-11341, 1992]을 참조하시오.
본 발명은 또한 본 발명의 사이토킨 또는 림포카인의 작용물질로서 작용하는 항체에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 사이토킨 또는 림포카인용 수용체를 활성화하는 항체를 포함한다. 이들 항체는 리간드-매개된 수용체 활성화에 의해 영향을 받는 모든 또는 이보다 적은 생물 활성에 대한 작용물질로서 작용할 수 있다. 상기 항체를 본 발명에 개시된 특정 활성을 포함하는 생물 활성들에 대한 작용물질로서 상세히 기술할 수 있다. 상기 항체 작용물질을 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어 WO 96/40281; 미국 특허 제 5,811,097 호(각각 본 발명에 내용 전체가 모든 목적을 위해 참고로 인용되어 있다); 문헌[Deng et al., Blood 92:1981-1988, 1998; Chen, et al., Cancer Res., 58:3668-3678, 1998; Harrop et al., J. Immunol. 161: 1786-1794, 1998; Zhu et al., Cancer Res., 58:3209-3214, 1998; Yoon et al., J. Immunol., 160:3170-3179, 1998; Prat et al., J. Cell. Sci. 111:237-247, 1998; Pitard et al., J. Immunol. Methods, 205: 177-190, 1997; Liautard et al., Cytokinde, 9:233-241, 1997; Carlson et al., J. Biol. Chem., 272:11295-11301, 1997; Taryman et al., Neuron, 14: 755-762, 1995; Muller et al., Structure, 6:1153-1167, 1998; Bartunek et al., Cytokinerm, 8: 14-20, 1996]을 참조하시오. 상기 논의된 바와 같이, 차례로 전이 세포 상의 사이토킨 또는 림포카인에 대한 항체를 사용하여, 본 발명의 실시태양으로서 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 기법을 사용하여 폴리펩타이드를 "모방하는" 항-유전자형 항체를 생성시킬 수 있다(예를 들어 문헌[Greenspan et al., FASEB, J. 7:437-444, 1989 및 Nissinoff, J. Immunol. 147:2429-2438, 1991]을 참조하시오). 예를 들어, 폴리펩타이드에 결합하고 상기의 다량체화를 경쟁적으로 억제하는 항체 및/또는 본 발명의 실시태양으로서 리간드에 대한 폴리펩타이드의 결합을 사용하여 상기 폴리펩타이드 다량체화 및/또는 결합 도메인을 "모방하고" 결과적으로 폴리펩타이드 및/또는 그의 리간드에 결합하고 이를 중화시키는 항-유전자형을 생성시킬 수 있다. 상기와 같은 항-유전자형 또는 상기와 같은 항-유전자형의 Fab 단편의 중화를 치료 섭생에 사용하여 폴리펩타이드 리간드를 중화시킬 수 있다. 예를 들어, 상기와 같은 항-유전자형 항체를 사용하여 본 발명의 실시태양으로서 폴리펩타이드에 결합하고/하거나 그의 리간드/수용체에 결합하고, 이에 의해 그의 생물 활성을 차단할 수 있다.
전이 세포 또는 감염된 세포 상의 사이토킨 수용체, 또는 대식세포 상의 Fc 수용체의 "억제제", "활성화제" 및 "조절제"를 각각, 수용체 결합 또는 신호전달을 위한 시험관 내 및 생체 내 분석을 사용하여 동정한 억제, 활성화 또는 조절 분자, 예를 들어 리간드, 작용물질, 길항물질, 및 그의 동족체 및 유사물질을 지칭하는데 사용한다.
"조절제"는 억제제 및 활성화제를 포함한다. 억제제는 예를 들어 세포 수용체 상의 사이토킨 또는 림포카인에 결합하거나, 그의 자극을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 그의 활성을 감소, 방지, 지연, 불활성화, 탈감작하거나, 하향 조절하는 작용제, 예를 들어 길항물질이다. 활성화제는 예를 들어 세포 수용체 상의 사이토킨 또는 림포카인에 결합하거나, 그의 활성을 자극하거나, 증가시키거나, 개방하거나, 활성화시키거나, 촉진하거나, 향상시키거나, 감작시키거나 또는 상향 조절하는 작용제, 예를 들어 작용물질이다. 조절제는 예를 들어 활성화제 또는 억제제, 수용체, 예를 들어 단백질, 펩타이드, 지질, 탄수화물, 폴리사카라이드, 또는 상기의 조합과 결합하는 단백질과 사이토킨 또는 림포카인 수용체와의 상호작용을 변경시키는 작용제, 예를 들어 지단백질, 당단백질 등을 포함한다. 조절제는 예를 들어 변경된 활성을 갖는 유전자 변형된 버전의 천연 사이토킨 또는 림포카인뿐만 아니라 천연 및 합성 리간드, 길항물질, 작용물질, 작은 화학 분자 등을 포함한다. 억제제 및 활성화제에 대한 상기와 같은 분석은 예를 들어 추정적인 조절제 화합물을 사이토킨 또는 림포카인 수용체를 발현하는 세포에 적용시키고 이어서 본 발명에 개시된 바와 같이 사이토킨 또는 림포카인 신호전달에 대한 작용 효과를 측정함을 포함한다. 잠재적인 활성화제, 억제제 또는 조절제로 처리된 수용체를 포함하는 샘플 또는 분석을 상기 억제제, 활성화제 또는 조절제가 없는 대조용 샘플과 비교하여 활성화 또는 억제의 정도를 조사한다. 대조용 샘플(억제제로 처리되지 않은 것)을 100%의 상대 수용체 활성 값으로 설정할 수 있다. 수용체의 억제는 상기 대조용에 대한 수용체 활성 값이 약 80%, 임의로 50% 또는 25 내지 0%일 때 성취된다. 수용체의 활성화는 상기 대조용에 대한 수용체 활성 값이 110%, 임의로 150%, 임의로 200 내지 500%, 또는 1000 내지 3000% 이상일 때 성취된다.
사이토킨 또는 림포카인 수용체에 결합하는 분자의 능력을 예를 들어 분석 플레이트 상에 코팅된 활성화된 수용체 면역접합체에 결합하는 추정적인 리간드의 능력에 의해 측정할 수 있다. 결합 특이성을 활성화되지 않은 수용체에의 결합을 비교함으로써 측정할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 사이토킨 또는 림포카인 수용체에 대한 항체 결합을 상기 리간드 또는 수용체의 고정화에 의해 분석할 수 있다. 예를 들어, 상기 분석은 Ni-활성화된 NTA 수지 비드 상의 His 표지에 융합된 사이토킨 또는 림포카인 수용체의 고정화를 포함할 수 있다. 항체를 적합한 완충액에 첨가하고 상기 비드를 주어진 온도에서 일정 시간 동안 배양시킬 수 있다. 결합되지 않은 물질의 제거를 위해 세척한 후에, 상기 결합된 단백질을 예를 들어 SDS, 높은 pH의 완충액 등으로 분리시키고 분석할 수 있다.
재조합 항체 및 수용체의 발현
키메릭, 인간화 및 인간 항체 및 사이토킨 또는 림포카인에 대한 수용체, 예를 들어 사이토킨 항체 복합체 및 사이토킨 수용체 복합체는 전형적으로는 재조합 발현에 의해 생성될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오타이드 구조물은 전형적으로는 천연적으로 회합되거나 이종의 프로모터 부위를 포함하여, 항체 쇄의 암호화 서열에 작용적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터 중의 진핵 프로모터 시스템이다. 일단 벡터를 적합한 숙주 내에 통합시켰으면, 상기 숙주를 높은 수준의 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현, 및 교차 반응하는 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에서 유지시킨다. 본 발명에 내용 전체가 모든 목적을 위해 참고로 인용된 미국 특허 출원 제 20020199213 호를 참조하시오.
상기 발현 벡터는 전형적으로는 숙주 염색체 DNA의 구성 부분으로서 또는 에피솜으로서 숙주 유기체에서 복제 가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 선별 마커, 예를 들어 암피실린-내성 또는 하이그로마이신-내성을 함유하여 목적하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 허용한다.
이 콜라이는 본 발명의 DNA 서열의 클로닝에 특히 유용한 원핵 숙주이다. 미생물, 예를 들어 효모가 또한 발현에 유용하다. 사카로마이세스는 바람직한 효모 숙주이며, 이때 적합한 벡터는 경우에 따라 발현 조절 서열, 복제 기원, 종결 서열 등을 갖는다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 당분해성 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 특히 알콜 데하이드로게나제, 아이시토크롬 C, 및 말토오스 및 갈락토스 이용에 기여하는 효소를 포함한다.
포유동물 세포는 면역글로불린 및 사이토킨 수용체 또는 그의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 구획을 발현하는데 바람직한 숙주이다. 문헌[Winnacker, From Genes To Clones, VCH Publishers, NY, 1987] 참조. 완전한 이종 단백질을 분비할 수 있는 적합한 다수의 숙주 세포 주가 당해 분야에서 밝혀졌으며, 여기에는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 주, 다양한 COS 세포 주, HeLa 세포, L 세포 및 골수종 세포 주가 포함된다. 바람직하게는 상기 세포는 비인간이다. 상기 세포의 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예를 들어 복제 기원, 프로모터, 인헨서, 및 필수적인 정보 처리 부위, 예를 들어 리보솜 결합 부위, RNA 접합 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다(Queen et al., Immunol. Rev. 89:49, 1986). 바람직한 발현 조절 서열은 내생 유전자, 거대세포바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소 파필로마바이러스 등으로부터 유래된 프로모터이다(Co, et al., J Immunol. 148:1149, 1992).
한편으로, 항체 및 사이토킨 수용체 암호화 서열을 트랜스제닉 동물의 게놈에의 도입 및 상기 트랜스제닉 동물의 젖에서의 후속적인 발현을 위해 트랜스유전자에 통합시킬 수 있다. 예를 들어 본 발명에 내용 전체가 모든 목적을 위해 참고로 인용된 미국 특허 제 5,741,957; 5,340,489; 및 5,849,992 호를 참조하시오. 적합한 트랜스유전자는 유선 특이성 유전자, 예를 들어 카제인 또는 베타 락토글로불린으로부터의 프로모터 및 인헨서와 작용적으로 연결되는 경 및/또는 중쇄에 대한 암호화 서열을 포함한다.
관심 DNA 구획을 함유하는 벡터를 세포 숙주의 유형에 따라 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포에 전달할 수 있다. 예를 들어, 염화 칼슘 형질감염은 원핵 세포에 통상적으로 이용되는 반면, 인산 칼슘 처리, 일렉트로포레이션, 리포펙틴, 바이오리스틱스 또는 바이러스계 형질감염은 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다. 포유동물 세포의 형질전환에 사용되는 다른 방법은 폴리브렌, 원형질체 융합, 리포솜, 일렉트로포레이션, 및 미세주입의 사용을 포함한다(일반적으로 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning] 참조). 트랜스제닉 동물의 생산을 위해서, 트랜스유전자를 수정된 난모세포에 미세주입하거나, 또는 배 줄기 세포의 게놈에 통합시키고 상기와 같은 세포의 핵을 세포핵 제거된 난모세포로 옮길 수 있다.
일단 발현되었으면, 항체 및 수용체의 수집물을 배양 배지 및 숙주 세포로부터 정제한다. 항체 및 수용체를 당해 분야의 표준 과정, 예를 들어 HPLC 정제, 컬럼 크로마토그래피, 젤 전기영동 등에 따라 정제할 수 있다. 대개, 항체 쇄는 신호 서열에 의해 발현되고 따라서 배양 배지로 방출된다. 그러나, 항체 쇄가 숙주 세포에 의해 천연적으로 분비되지 않는다면, 상기 항체 쇄를 순한 세제 처리에 의해 방출시킬 수 있다. 이어서 항체 쇄를 암모늄 설페이트 침전, 고정화된 표적에 대한 친화성 크로마토그래피, 컬럼 크로마토그래피, 젤 전기영동 등을 포함한 통상적인 방법에 의해 정제할 수 있다(일반적으로 문헌[Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982]을 참조하시오).
상기 방법은 선택된 표적에 특이적인 친화성을 갖는 항체 쇄를 암호화하는 핵산 서열의 라이브러리를 생성시킨다. 상기 핵산 라이브러리는 전형적으로는 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 104, 105, 106, 107, 108 또는 109의 상이한 구성원들을 갖는다. 대개, 단일 구성원은 상기 라이브러리 중의 전체 서열의 25 또는 50%를 초과하여 구성하지 않는다. 전형적으로, 상기 라이브러리 구성원의 25 이상, 50%, 75, 90, 95, 99 또는 99.9%는 표적 분자에 특이적인 친화성을 갖는 항체 쇄를 암호화한다. 이중 쇄 항체 라이브러리의 경우에, 각각 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 한 쌍의 핵산 구획을 라이브러리 구성원으로 간주한다. 상기 핵산 라이브러리는 임의의 벡터의 성분으로서 유리 형태로 존재하거나, 또는 벡터의 성분으로서 숙주 세포 내로 형질감염될 수 있다.
상기 핵산 라이브러리를 표적에 특이적인 친화성을 갖는 항체의 다클론 라이브러리를 생성시키도록 발현할 수 있다. 상기와 같은 라이브러리의 조성을 상기 뉴클레오타이드 라이브러리의 조성으로부터 측정한다. 따라서, 상기와 같은 라이브러리는 전형적으로는 상이한 아미노산 조성을 갖는 5 이상, 10, 20, 50, 100, 1000, 104, 105, 106, 107, 108 또는 109의 구성원을 갖는다. 대개, 단일 구성원은 상기 라이브러리 중의 전체 서열의 25 또는 50%를 초과하여 구성하지 않는다. 표적에 대한 특이적 친화성을 갖는 항체 쇄 라이브러리 중의 항체 쇄의 퍼센트는 전형적으로는 상기 항체 쇄를 암호화하는 상응하는 핵산의 퍼센트보다 낮다. 상기 차이는 모든 폴리펩타이드가 적합한 폴딩을 지탱하기에 적합한 1 차 아미노산 서열을 가짐에도 불구하고 결합에 적합한 구조로 폴딩하지 않는다는 사실에 기인한다. 일부 라이브러리에서, 항체 쇄의 25 이상, 50, 75, 90, 95, 99 또는 99.9%는 상기 표적 분자에 특이적인 친화성을 갖는다. 다시, 다중 쇄 항체의 라이브러리에서, 각각의 항체(예를 들어 Fab 또는 완전 항체)는 라이브러리 구성원으로 간주된다. 상이한 항체 쇄는 표적에 적합한 결합 특이성 및 친화성의 면에서 서로 상이하다. 일부 상기와 같은 라이브러리는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 구성원을 포함한다. 일부 상기와 같은 라이브러리는 서로 경쟁하지 않고 동일한 항원에 결합하는 2 개 이상의 구성원을 포함한다.
상기 방법으로부터 생성되는 인간 항체의 다클론 라이브러리는 본 발명의 라이브러리 중의 고 친화성 결합제의 높은 퍼센트 및 본 발명의 라이브러리가 전형적으로는 천연 집단에 존재하는 동일한 항체 다양성을 나타내지 않는다는 점에서 인간 항체의 천연 집단과 식별된다. 본 발명의 라이브러리 중의 감소된 다양성은 모든 인간 면역글로불린 유전자를 포함하지 않는 공급원 물질을 제공하는 비인간 트랜스유전자 동물에 기인한다. 예를 들어 일부 다클론 항체 라이브러리는 람다 경쇄를 갖는 항체가 없다. 일부 다클론 항체 라이브러리는 10, 20, 30 또는 40 VH 미만의 유전자에 의해 암호화된 항체 중쇄를 갖는다. 일부 다클론 항체 라이브러리는 본 발명의 실시태양으로서 10, 20, 30 또는 40 VL 미만의 유전자에 의해 암호화되는 항체 경쇄를 갖는다.
변형된 항체 및 수용체
본 발명은 또한 T 세포 집단의 증가 및 질병의 치료를 위해, 사이토킨 또는 림포카인에 대한 변형된 항체 및 사이토킨 또는 림포카인에 대한 수용체를 포함한다.
"변형된 항체"는 화학적으로 또는 상이한 포맷, 예를 들어 비 제한적으로 다이아바디, 트라이아바디, 또는 이중특이 항체, peg화된 유도체, 친화성, 안정성 또는 원자가를 증가시키도록 진화된 분자로부터의 변체로 분자 공학에 의해 최적화된 항체 및 항체 단편을 지칭한다. 변형된 항체는 또한 예를 들어 상기 항체의 결실, 첨가 또는 치환 부분에 의해 변형된 단클론 항체, 키메릭 항체 및 인간화된 항체와 같은 포맷을 포함한다. 예를 들어, 항체를 불변 부위를 결실시키고 이를 항체의 반감기, 예를 들어 혈청 반감기, 안정성 또는 친화성을 증가시킴을 의미하는 불변 부위로 치환시킴으로써 변형시킬 수 있다.
상기 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체를 사용하여 주어진 생물 반응을 변경시키거나 생물 반응을 생성시킬 수 있다(예를 들어 효과기 세포를 보충할 수 있다). 상기 약물 부분을 전통적인 화학 치료제로 국한되는 것으로 해석해서는 안 된다. 예를 들어, 상기 약물 부분은 목적하는 생물 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기와 같은 단백질은 예를 들어 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 활성 단편, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들어 종양 괴사 인자 또는 인터페론-알파; 또는 생물학적 반응 개질제, 예를 들어 림포카인, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-4("IL-4"), 인터류킨-6("IL-6"), 인터류킨-7("IL-7"), 인터류킨-15("IL-15"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 다른 성장 인자를 포함할 수 있다. 다른 유도체는 세포자멸사 유도 부분, 예를 들어 TRAIL, 종양 괴사 인자 관련된 세포자멸사 유도 리간드, 및 정보제공인자 분자, 예를 들어 루시페라제 또는 형광 탐침 및 페이로드 분자의 종양 부하 및 미세- 및 거대-전이가 있는 부위로의 표적화된 전달 또는 비 침습적인 영상화를 위한 나노입자와의 항체 융합 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 상기 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체를 예를 들어 하나 이상의 치료 또는 세포독성 부분에 커플링 또는 접합시킬 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "세포독성 부분"은 단순히 세포에 인접하거나 상기에 의해 흡수 시 세포 성장을 억제하거나 세포사를 촉진하는 부분을 의미한다. 이와 관련하여 적합한 세포독성 부분은 방사성 작용제 또는 아이소토프(방사성핵종), 화학독성제, 예를 들어 분화 유도체, 억제제 및 작은 화학독성 약물, 독소 단백질 및 그의 유도체뿐만 아니라 뉴클레오타이드 서열(또는 그의 안티센스 서열)을 포함한다. 따라서, 상기 세포독성 부분은 비 제한적인 예로서, 화학요법제, 광활성화된 독소 또는 방사성 작용제일 수 있다.
일반적으로, 치료제를 상기 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물, 예를 들어 사이토킨 항체 복합체 단독에 또는 또 다른 치료제와 함께, 임의의 적합한 기법에 의해, 약동학적 안정성 및 환자에 대한 감소된 전체 독성에 대한 필요성을 적절히 고려하여 접합시킬 수 있다. 단독으로 또는 또 다른 치료제와 함께 적합한 항체 부분에 직접 또는 간접적으로(예를 들어 링커 그룹을 통해) 커플링시킬 수 있다. 사이토킨 또는 림포카인과 항체 간의 직접적인 반응은 각각이 다른 것과 반응할 수 있는 작용기를 갖는 경우 가능하다. 예를 들어, 친핵성 그룹, 예를 들어 아미노 또는 설프하이드릴 그룹은 카보닐 함유 그룹, 예를 들어 무수물 또는 산성 할라이드, 또는 양호한 이탈 그룹(예를 들어 할라이드)을 함유하는 알킬 그룹과 반응할 수 있다. 한편으로, 적합한 화학적 링커 그룹을 사용할 수 있다. 링커 그룹은 결합 능력에 의한 방해를 피하기 위해서 이격제로서 항체를 작용제로부터 멀어지게 하는 작용을 할 수 있다. 링커 그룹은 또한 부분 또는 항체 상의 치환체의 반응성을 증가시키고 따라서 커플링 효율을 증가시키는 작용을 할 수 있다. 화학 반응성의 증가는 또한 달리 가능하지 않을 수도 있는 부분, 또는 부분 상의 작용기의 사용을 촉진시킬 수 있다.
적합한 연결 화학은 말레이미딜 링커 및 알킬 할라이드 링커(항체 부분 상의 설프하이드릴과 반응한다) 및 숙신이미딜 링커(항체 부분 상의 1 차 아민과 반응한다)를 포함한다. 여러 1 차 아민 및 설프하이드릴 그룹이 면역글로불린 상에 존재하며, 추가의 그룹들을 재조합 면역글로불린 분자로 디자인할 수 있다. 다양한 이작용성 또는 다작용성 시약들(동종- 및 이종-작용성 모두, the Pierce Chemical Co., Rockford, Ill의 카탈로그에 개시된 것들)을 링커 그룹으로서 사용할 수 있음은 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다. 커플링을 예를 들어 아미노 그룹, 카복실 그룹, 설프하이드릴 그룹 또는 산화된 탄수화물 잔기를 통해 수행할 수 있다(미국 특허 제 4,671,958 호를 참조하시오).
또 다른 커플링 방법으로서, 세포독성제를 예를 들어 글리코실화 부위에서 산화된 탄수화물 그룹을 통해 본 발명의 실시태양으로서 상기 항체 및 상기 사이토킨 항체 복합체 조성물에 커플링시킬 수 있다(미국 특허 제 5,057,313 및 5,156,840 호 참조). 상기 항체 및 항체 조성물의 세포독성 또는 영상화 부분에의 더욱 또 다른 커플링 방법은 비 공유 결합 쌍, 예를 들어 스트렙트아비딘/비오틴, 또는 아비딘/비오틴의 사용에 의한 것이다. 이러한 실시태양에서, 상기 쌍의 하나의 구성원은 상기 항체 부분에 공유적으로 커플링하고 상기 결합 쌍의 다른 구성원은 상기 세포독성 또는 영상화 부분에 공유적으로 커플링한다.
사이토킨, 림포카인, 또는 세포독성 부분이 본 발명의 면역복합체의 항체 부분으로부터 유리될 때 더욱 효능이 있는 경우, 내면화 중 또는 내면화 시 세포로 절단될 수 있거나, 또는 세포 외 환경에서 시간에 따라 점차적으로 절단되거나 세포 외 환경에서 시간에 따라 점차적으로 절단될 수 있는 링커 그룹을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 다수의 상이한 절단성 링커 그룹들이 개시되어 있다. 이들 링커 그룹으로부터의 세포독성 부분제의 세포 내 방출 기전은 다이설파이드 결합(예를 들어 미국 특허 제 4,489,710 호), 광불안정성 결합의 조사(예를 들어 미국 특허 제 4,625,014 호), 유도체화된 아미노산 측쇄의 가수분해(예를 들어 미국 특허 제 4,638,045 호), 혈청 보체 매개된 가수분해(예를 들어 미국 특허 제 4,671,958 호), 및 산 촉매화된 가수분해(예를 들어 미국 특허 제 4,569,789 호)에 의한 절단을 포함한다.
하나보다 많은 치료제, 사이토킨, 림포카인, 또는 세포독성 및/또는 영상화 부분을 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물에 커플링시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 항체를 다중 유도체화함으로써, 여러 치료 및/또는 세포독성 전략을 동시에 실행할 수 있으며, 여러 가시화 기법을 위한 조영제로서 유용한 항체를 제조할 수 있거나, 또는 치료 항체를 추적을 위해 가시화 기법에 의해 표지할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 세포독성 부분의 다중 분자들을 하나의 항체 분자에 커플링시킨다. 또 다른 실시태양에서, 하나보다 많은 유형의 부분을 하나의 항체에 커플링시킬 수 있다. 예를 들어, 치료 부분, 예를 들어 사이토킨 또는 림포카인을 화학독성 또는 방사성독성 부분과 함께 항체에 접합시켜 상기 화학- 또는 방사성독성 요법의 유효성을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 목적하는 치료 효과를 획득하는데 필요한 투여량을 낮출 수 있다. 특정 실시태양에도 불구하고, 하나보다 많은 부분과의 면역접합체를 다양한 방식으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 하나보다 많은 부분을 항체 분자에 직접 커플링시키거나, 또는 다중 부착 부위를 제공하는 링커(예를 들어 덴드리머)를 사용할 수 있다. 한편으로, 하나보다 많은 세포독성 부분을 보유하는 능력을 갖는 담체를 사용할 수 있다.
상기 설명한 바와 같이, 담체는 다양한 방식, 예를 들어 직접 또는 링커 그룹을 통해 공유 결합에 의해, 및 비 공유 회합에 의해 상기 작용제들을 가질 수 있다. 적합한 공유 결합 담체는 단백질, 예를 들어 알부민(예를 들어 미국 특허 제 4,507,234 호), 펩타이드, 및 폴리사카라이드, 예를 들어 아미노덱스트란(예를 들어 미국 특허 제 4,699,784 호)을 포함하며, 이들은 각각 부분들의 부착을 위한 다중 부위를 갖는다. 담체는 또한 비 공유 회합, 예를 들어 비 공유 결합 또는 캡슐화에 의해, 예를 들어 리포솜 소낭 내에 작용제를 가질 수 있다(예를 들어 미국 특허 제 4,429,008 호 및 4,873,088 호). 캡슐화 담체는, 상기가 치료 조성물을 표적 세포의 부근에 농축시키면서 화학독성 부분을 점차적으로 방출할 수 있게 하므로, 화학독성 치료 실시태양에 특히 유용하다.
세포독성 부분으로서 사용하기에 바람직한 방사성핵종은 약물학적 투여에 적합한 방사성핵종이다. 상기와 같은 방사성핵종은 123I, 125I, 131I, 90Y, 211At, 67Cu, 186Re, 188Re, 212Pb, 및 212Bi를 포함한다. 요오드 및 아스타틴 동위원소가, 그의 사용에 관한 다수의 문헌들이 축적되어 있으므로, 본 발명의 치료 조성물에 사용하기에 보다 바람직한 방사성핵종이다. 131I가 특히 바람직한데, 그 이유는 수 밀리미터의 유효 범위를 갖는 다른 베타 방사선 방출 핵종이기 때문이다. 123I, 125I, 131I, 또는 211At를 상기 조성물 및 여러 공지된 접합 시약, 예를 들어 로도젠, N-숙신이미딜 3-[211At]아스타토벤조에이트, N-숙신이미딜 3-[131I]요오도벤조에이트(SIB), 및 N-숙신이미딜 5-[131I]요오도-3-피리딘카복실레이트(SIPC) 중 임의의 것을 사용하는 방법에 사용하기 위해 항체 부분에 접합시킬 수 있다. 임의의 요오드 동위원소를 상기 인용된 요오도-시약들에 사용할 수 있다. 다른 방사성핵종들을 핵 약물 분야의 숙련가들에게 공지된 적합한 킬레이트제에 의해 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물에 접합시킬 수 있다.
바람직한 화학독성제는 소 분자 약물, 예를 들어 메토트렉세이트, 및 피리미딘 및 퓨린 동족체를 포함한다. 바람직한 화학독소 분화 유도제는 포볼 에스터 및 부티르산을 포함한다. 화학독성 부분을 화학적 링커를 통해 상기 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물에 직접 접합시키거나, 또는 담체로 캡슐화하고, 차례로 이를 상기 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물에 커플링시킬 수 있다.
세포독성 부분으로서 사용하기에 바람직한 독소 단백질은 리신, 아브린, 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 젤로닌, 슈도모나스 외독소, 시겔라 독소, 미국자리공 항바이러스 단백질, 및 의학적 생화학 분야에 공지된 다른 독소 단백질을 포함한다. 이들 독소제들은 특히 혈관 내로 주입 시 환자에서 바람직하지 못한 면역 반응을 유도할 수 있으므로, 상기를 상기 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물에 커플링시키기 위해 담체에 캡슐화하는 것이 바람직하다.
상기 면역독소의 세포독성 부분은 세균 또는 식물 기원의 세포독성 약물 또는 효소 활성 독소, 또는 상기와 같은 독소의 효소 활성 단편("A 쇄")일 수 있다. 사용되는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알루라이트 포르디 단백질, 다이안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 및 에노마이신이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체를 소 분자 항암 약물에 접합시킨다. 상기 단클론 항체 및 상기와 같은 세포독성 부분의 접합체를 다양한 이작용성 단백질 커플링제를 사용하여 제조한다. 상기와 같은 시약의 예는 SPDP, IT, 이미도에스터의 이작용성 유도체, 예를 들어 다이메틸 아디피미데이트 HC1, 활성 에스터, 예를 들어 다이숙신이미딜 수베레이트, 알데하이드, 예를 들어 글루타르알데하이드, 비스-아지도 화합물, 예를 들어 비스(p-아지도벤조일)헥산다이아민, 비스-다이아조늄 유도체, 예를 들어 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민, 다이아이소시아네이트, 예를 들어 톨릴렌 2,6-다이아이소시아네이트, 및 비스 활성 불소 화합물, 예를 들어 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠이다. 독소의 세포용해 부분을 항체의 Fab 단편에 결합시킬 수 있다.
유리하게는, 상기 사이토킨 또는 항체의 외부 도메인에 특이적으로 결합하는 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물을 리신 A 쇄에 접합시킬 수 있다. 보다 유리하게는 상기 리신 A 쇄를 탈글리코실화시키고 재조합 수단을 통해 생성시킨다. 상기 리신 면역독소의 유리한 제조 방법은 문헌[Vitetta et al., Science 238, 1098, 1987](본 발명에 내용 전체가 참고로 인용됨)에 개시되어 있다.
"접촉된"이란 용어는 세포에 적용 시 본 발명에서 항체, 항체 조성물, 세포독성제 또는 부분, 유전자, 단백질 및/또는 안티센스 서열을 표적 세포로 전달하거나 상기 표적 세포와 직접 인접해서 놓는 처리를 개시하는데 사용된다. 상기 전달은 시험관 내 또는 생체 내일 수 있고 재조합 벡터 시스템의 사용을 포함할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 치료 부분, 예를 들어 세포독소, 약물(예를 들어 면역억제제) 또는 방사성독소에 접합된, 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체, 또는 그의 단편을 특징으로 한다. 상기와 같은 접합체를 본 발명에서는 "면역접합체"라 칭한다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체를 "면역독소"라 칭한다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한(예를 들어 살해하는) 임의의 작용제를 포함한다. 예로는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 마이토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 듀오카미신, 사포린, 다이하이드록시 안트라신 디딘, 미토잔트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신, 및 이들의 동족체 또는 상동물이 있다.
면역접합체의 형성에 적합한 치료제는 비 제한적으로 대사길항물질(예를 들어 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아민, 시타라빈, 5-플루오로유라실 데카바진), 알킬화제(예를 들어 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카머스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부설판, 다이브로모만니톨, 스트렙토조토신, 마이토마이신 C, 및 시스-다이클로로다이아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어 다우노루비신(이전에는 다우노마이신), 및 독소루비신), 항생제(예를 들어 닥티노마이신(이전에는 액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 및 유사분열 억제제(예를 들어 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 치료제는 세포독성제 또는 방사성독성제이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 치로제는 면역억제제이다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 치료제는 GM-CSF이다. 추가의 실시태양에서, 상기 치료제는 독소루비신(아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 설페이트, 카머스틴, 클로람부실, 사이클로포스파미드 하이드록시유레아 또는 리신 A이다.
사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물을 또한 방사성독소, 예를 들어 방사성 요오드에 접합시켜 예를 들어 암을 치료하기 위한 세포독성 방사성약제를 생성시킬 수 있다. 상기 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체를 사용하여 주어진 생물 반응을 변경시킬 수 있으며, 상기 약물 부분은 전통적인 화학적 치료제로 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다. 예를 들어 상기 약물 부분은 목적하는 생물 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기와 같은 단백질은 예를 들어 효소 활성 독소, 또는 그의 활성 단편, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들어 종양 괴사 인자 또는 인터페론-알파; 또는 생물학적 반응 개질제, 예를 들어 림포카인, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-4("IL-4"), 인터류킨-6("IL-6"), 인터류킨-7("IL-7"), 인터류킨-15("IL-15"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 다른 성장 인자를 포함할 수 있다.
상기와 같은 치료 부분을 항체에 적합시키기 위한 기법들은 널리 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[
Figure 112008064848518-PCT00001
Figure 112008064848518-PCT00002
]을 참조하시오.
사이토킨 /항체 복합체 또는 사이토킨 / 사이토킨 수용체 복합체 조성물의 용도
본 발명에서 확인된 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물, 예를 들어 T 세포 집단의 확대를 자극하는 사이토킨 항체 복합체를 다수의 방식들로 사용할 수 있다. 하기의 설명은 예시로 간주되어야 하며 공지된 기법을 사용한다.
사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물을 사용하여 항체 기재 기법으로 생물 샘플 중의 단백질 수준을 분석할 수 있다. 예를 들어, 조직 중의 단백질 발현을 전통적인 면역조직학적 방법으로 연구할 수 있다(Ialkanen et al., J. Cell. Biol. 101:976-985; Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096, 1987). 단백질 유전자 발현의 검출에 유용한 다른 항체 기재 방법은 면역분석, 예를 들어 효소 결합된 면역흡수 분석(ELISA) 및 방사성면역분석(RIA)을 포함한다. 적합한 항체 분석 표지는 당해 분야에 공지되어 있으며, 효소 표지, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 및 방사성동위원소 또는 다른 방사성 작용제, 예를 들어 요오드(125I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 삼중수소(3H), 인듐(112In) 및 테크네슘(mTc), 및 형광 표지, 예를 들어 플루오레세인 및 로다민, 및 비오틴을 포함한다.
생물 샘플 중의 분비된 단백질 수준을 분석하는 것 이외에, 단백질 또는 항체 조성물을 또한 영상화에 의해 생체 내에서 검출할 수 있다. 단백질의 생체 내 영상화를 위한 항체 표지 또는 마커는 X-방사선촬영, NMR 또는 ESR에 의해 검출될 수 있는 것들을 포함한다. X-방사선촬영의 경우, 적합한 표지는 방사성동위원소, 예를 들어 바륨 또는 세슘을 포함하며, 이들은 검출 가능한 방사선을 방출하지만 환자에게 명백히 유해하지는 않다. NMR 및 ESR에 적합한 마커는 검출 가능한 특징적인 스핀을 갖는 것들, 예를 들어 중수소를 포함하며, 상기를 관련된 scFv 클론에 대한 영양소 표지화에 의해 항체에 통합시킬 수 있다.
적합한 검출 가능한 영상화 부분, 예를 들어 방사성동위원소(예를 들어, 131I, 112In, 99mTc), 방사성 불투과성 물질, 또는 핵 자기 공명에 의해 검출 가능한 물질로 표지한 단백질 특이적 항체 또는 항체 단편을 포유동물에게 도입시킨다(예를 들어 비 경구, 피하, 또는 복강 내로). 환자의 크기 및 사용되는 영상화 시스템이 진단 영상의 생성에 필요한 영상화 부분의 양을 결정할 것임은 당해 분야에서 이해될 것이다. 방사성동위원소 부분의 경우에, 인간 환자에 대해 주입되는 방사능의 양은 통상적으로 약 5 내지 20 밀리퀴리 범위의 99mTc일 것이다. 이어서 표지된 항체 또는 항체 단편은 특정 단백질을 함유하는 세포의 위치에서 우선적으로 축적될 것이다. 생체 내 종양 영상화는 문헌[Burchiel et al., Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer 13, 1982]에 개시되어 있다.
더욱이, 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물을 사용하여 질병을 치료할 수 있다. 예를 들어 환자에게 T 세포 집단의 확대를 향상시키거나, 폴리펩타이드(예를 들어 종양유전자)의 활성을 억제시키거나, 폴리펩타이드의 활성을 활성화시키거나(예를 들어 수용체에 결합시킴으로써), 유리 리간드(예를 들어 염증 감소에 사용되는 용해성 TNF 수용체)와 경쟁함으로써 막 결합된 수용체의 활성을 감소시키거나, 또는 목적하는 반응(예를 들어 혈관 성장)을 유발시키려는 노력으로 본 발명의 사이토킨 항체 복합체 조성물을 투여할 수 있다.
유사하게, 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물을 또한 질병의 치료에 사용할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 항체의 투여는 상기 폴리펩타이드에 결합하여 그의 과잉생산을 감소시킬 수 있다. 유사하게, 항체의 투여는 예를 들어 막 수용체에 결합된 폴리펩타이드에 결합함으로써 폴리펩타이드를 활성화시킬 수 있다.
치료 섭생
본 발명은 질병, 예를 들어 종양 질병, 자가면역 질병, 세포 고갈성 방사선치료 또는 화학요법, 또는 감염성 질병을 치료하기 위한, 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된, 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 조성물은 다수(예를 들어 2 개 이상)의 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물의 조합을 포함한다.
예방학적 용도에서, 약학 조성물 또는 약제를 질병 또는 증상(예를 들어 종양 질병, 자가면역 질병, 세포 고갈성 방사선치료 또는 화학요법, 또는 감염성 질병)의 재발 위험성을 제거 또는 감소시키거나, 중중도를 줄이거나, 또는 상기 질병의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동 증상을 포함한 상기 질병의 개시, 그의 합병증 및 상기 질병의 발생 중에 제공되는 중간의 병리학적 표현형을 지연시키기에 충분한 양으로 상기 질병 또는 증상에 민감하거나 또는 달리 그 위험이 있는 환자에게 투여한다. 치료 용도에서, 조성물 또는 약제를 상기 질병의 발생 중 그의 합병증 및 중간의 병리학적 표현형을 포함하여 상기 질병의 증상(생화학, 조직학 및/또는 행동)을 치유 또는 적어도 부분적으로 억제시키기에 충분한 양으로 상기와 같은 질병이 의심되거나 또는 이미 상기와 같은 질병을 앓고 있는 환자에게 투여한다. 치료학적 또는 예방학적 치료를 수행하기에 적합한 양은 치료 또는 예방 유효 용량으로서 정의된다. 예방 및 치료 섭생 모두에 있어서, 작용제들을 대개는 충분한 증식 억제 반응이 성취될 때까지 수회 용량으로 투여한다. 전형적으로는, 상기 증식 억제 반응을 모니터하고 증식 억제 반응이 약해지기 시작하면 반복된 투여량을 제공한다.
유효 투여량
본 발명에 개시된 질병, 예를 들어 종양 질병, 자가면역 질병, 세포 고갈성 방사선치료 또는 화학요법, 또는 감염성 질병의 치료를 위한 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물, 예를 들어 사이토킨 또는 림포카인에 대한 항체의 유효 용량은 다수의 상이한 인자들, 예를 들어 투여 수단, 표적 부위, 환자(인간이든 동물이든 간에)의 생리 상태, 투여되는 다른 약제, 및 치료가 예방학적인지 치료학적인 지의 여부에 따라 변한다. 대개, 환자는 인간이지만, 트랜스제닉 포유동물을 포함한 비인간 동물도 또한 치료될 수 있다. 치료 투여량은 안전성 및 유효성을 최적화하기 위해 적정하는데 필요하다.
항체 투여의 경우에, 상기 투여량은 숙주 체중 ㎏ 당 약 0.0001 내지 100 ㎎, 보다 대개는 0.01 내지 5 ㎎/㎏의 범위이다. 예를 들어 투여량은 체중 ㎏ 당 1 ㎎ 또는 10 ㎎ 또는 1 내지 10 ㎎/㎏의 범위 이내일 수 있다. 전형적인 치료 섭생은 2 주마다 1 회 또는 한 달에 1 회 또는 매 3 내지 6 개월마다 1 회의 투여를 포함한다. 일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2 개 이상의 단클론 항체를 동시에 투여하며, 이 경우 투여되는 각 항체의 투여량은 지시된 범위 내에 있다. 항체를 대개는 수 회로 투여한다. 단일 투여 간의 간격은 주마다, 달마다 또는 년마다일 수 있다. 간격은 또한 환자의 혈중 항체 수준을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서, 투여량을 1 내지 1000 ㎍/㎖의 혈장 항체 농도 및 일부 방법에서 25 내지 300 ㎍/㎖을 달성하도록 조절한다. 한편으로, 항체를 서방성 제형으로서 투여할 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 필요하다. 투여량 및 빈도는 환자에서 항체의 반감기에 따라 변한다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 보이며, 다음으로 인간화된 항체, 키메릭 항체, 및 비인간 항체 순이다. 투여량 및 투여 회수는 상기 치료가 예방학적인지 치료학적인지에 따라 변할 수 있다. 예방학적 용도에서, 비교적 낮은 투여량을 긴 기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여한다. 일부 환자는 그의 남은 삶 동안 계속해서 치료를 받는다. 치료학적 용도에서, 상기 질병의 진행이 감소되거나 종료될 때까지, 바람직하게는 상기 환자가 질병 증상의 부분적인 또는 완전한 개선을 보일 때까지 비교적 짧은 간격으로 비교적 높은 투여량이 때때로 필요하다. 그 후에, 상기 환자에게 예방학적 섭생을 투여할 수 있다.
면역원을 암호화하는 핵산의 용량은 환자당 약 10 ng 내지 1 g, 100 ng 내지 100 ㎎, 1 ㎍ 내지 10 ㎎, 또는 30 내지 300 ㎍ DNA의 범위이다. 감염성 바이러스 벡터에 대한 용량은 용량 당 10 내지 100 이상의 비리온으로 변한다.
투여 경로
면역 반응을 유도하기 위한 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물, 예를 들어 질병, 예를 들어 종양 질병, 자가면역 질병, 세포 고갈성 방사선치료 또는 화학요법, 또는 감염성 질병을 치료하기 위한 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체를 뇌 병변을 표적화하는 항체 제제용 흡입제로서 예방을 위해 및/또는 치료학적 치료를 위해 비 경구, 국소, 정맥 내, 경구, 피하, 동맥 내, 두개 내, 복강 내, 비 내 또는 근육 내 수단에 의해 투여할 수 있다. 사이토킨 항체 복합체 조성물의 가장 전형적인 투여 경로는 피하이나, 다른 경로들도 동등하게 유효할 수 있다. 다음으로 가장 통상적인 경로는 근육 내 주사이다. 이러한 유형의 주사는 팔 또는 다리 근육에서 가장 전형적으로 수행된다. 일부 방법에서, 작용제를 침착물이 누적되는 특정 조직에 직접 주사한다, 예를 들어 두개 내 주사. 근육 내 주사 또는 정맥 내 주입이 항체의 투여에 적합하다. 일부 방법에서, 특정 치료 항체를 두개 내에 직접 주사한다. 일부 방법에서, 항체를 서방성 조성물 또는 장치, 예를 들어 MedipadTM 장치로서 투여할 수 있다.
사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물을 다양한 면역 관련 질병을 포함한 다양한 질병의 치료에 적어도 부분적으로 유효한 다른 작용제들과 함께 임의로 투여할 수 있다. 뇌로의 종양 전이의 경우에, 작용제를 또한 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통한 상기 작용제의 통과를 증가시키는 다른 작용제와 함께 투여할 수 있다.
제형화
질병, 예를 들어 종양 질병, 자가면역 질병, 세포 고갈성 방사선치료 또는 화학요법, 또는 감염성 질병의 치료를 위한, 면역 반응을 유도하기 위한 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물을 종종 활성 치료제 및 다양한 다른 약학적으로 허용 가능한 성분을 포함하는 약학 조성물로서 투여한다(Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980 참조). 바람직한 형태는 목적하는 투여 방식 및 치료 용도에 따른다. 상기 조성물은 또한 목적하는 제형에 따라, 약학적으로 허용 가능한 무독성 담체 또는 희석제(동물 또는 인간 투여용 약학 조성물을 제형화하는데 통상적으로 사용되는 비히클로서 한정됨)를 포함할 수 있다. 상기 희석제를 상기 조합의 생물 활성에 영향을 미치지 않도록 선택한다. 상기와 같은 희석제의 예는 증류수, 생리적 포스페이트 완충 염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 행크 용액이다. 또한, 약학 조성물 또는 제형은 또한 다른 담체, 항원보강제, 또는 무독성, 비치료성, 비면역원성 안정제 등을 포함할 수 있다.
약학 조성물은 또한 크고 느리게 대사되는 거대분자, 예를 들어 단백질, 폴리사카라이드, 예를 들어 키토산, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 공중합체(예를 들어 라텍스 작용화된 세파로스TM, 아가로스, 셀룰로스 등), 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 및 지질 집합체(예를 들어 오일 소적 또는 리포솜)를 포함할 수 있다. 또한, 이들 담체는 면역자극제(즉 항원보강제)로서 작용할 수 있다.
비 경구 투여를 위해서, 본 발명의 실시태양인 조성물을 멸균 액체, 예를 들어 수 오일, 염수, 글리세롤, 또는 에탄올일 수 있는 약학 담체와 함께 생리학적으로 허용 가능한 희석제 중의 상기 물질의 용액 또는 현탁액의 주사 가능한 투여량으로서 투여할 수 있다. 또한, 보조 물질, 예를 들어 습윤 또는 유화제, 계면활성제, pH 완충 물질 등이 조성물 중에 존재할 수 있다. 약학 조성물의 다른 성분은 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 것들, 예를 들어 땅콩 오일, 대두 오일, 및 광물성 오일이다. 일반적으로, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 특히 주사 가능한 용액에 바람직한 액체 담체이다. 항체를 활성 성분의 서방성을 허용하는 방식으로 제형화할 수 있는 데포 주사 또는 이식물 제제의 형태로 투여할 수 있다. 전형적인 조성물은 HCl에 의해 pH 6.0으로 조절된, 50 mM L-히스티딘, 150 mM NaCl로 이루어진 수성 완충액 중에서 제형화된, 5 ㎎/㎖의 단클론 항체를 포함한다.
전형적으로, 조성물을 주사 가능한 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조하며; 주사 전에 액체 비히클 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태를 또한 제조할 수 있다. 상기 제제를 또한 상기 논의된 바와 같이, 리포솜 또는 미세 입자, 예를 들어 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 또는 향상된 항원보강 효과를 위한 공중합체 중에 유화 또는 캡슐화할 수 있다(Langer, Science 249:1527, 1990 및 Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119, 1997). 본 발명의 작용제를 상기 활성 성분의 지속되거나 박동성 방출을 허용하는 방식으로 제형화할 수 있는 데포 주사 또는 이식물 제제의 형태로 투여할 수 있다.
다른 투여 방식에 적합한 추가의 제형은 경구, 비 내, 및 폐 제형, 좌약, 및 경피 적용을 포함한다.
좌약의 경우, 결합제 및 담체는 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트라이글리세라이드를 포함하며; 상기와 같은 좌약을 0.5 내지 10%, 바람직하게는 1 내지 2% 범위의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성시킬 수 있다. 경구 제형은 부형제, 예를 들어 약제 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 및 마그네슘 카보네이트를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 서방성 제형 또는 분말의 형태를 취하며 10 내지 95%, 바람직하게는 25 내지 70%의 활성 성분을 함유한다.
국소 적용은 경피 또는 피 내 전달을 생성시킬 수 있다. 국소 투여를 상기 작용제와 콜레라 독소 또는 해독된 유도체 또는 그의 서브유닛 또는 다른 유사한 세균 독소와 동시 투여함으로써 촉진시킬 수 있다(Glenn et al., Nature 391:851, 1998). 동시 투여는 상기 성분들을 혼합물로서 또는 화학적 가교결합에 의해 수득한 결합된 분자로서 사용하여 성취될 수 있다.
한편으로, 경피 전달을 피부 패치를 사용하거나 트랜스페로솜을 사용하여 성취할 수 있다(Paul et al., Eur. J. Immunol. 25:3521-24, 1995;Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368:201-15, 1998).
약학 조성물을 멸균의 실질적으로 등장성으로서, 미국 식품의약품 안전청의 모든 우수의약품제조관리 기준(GMP) 규제를 완전히 준수하여 일반적으로 제형화한다.
독성
바람직하게는, 본 발명에 개시된 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물의 치료 유효 용량은 실질적인 독성의 유발 없이 치료 이점을 제공할 것이다.
본 발명에 개시된 단백질의 독성을 예를 들어 LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 또는 LD100(집단의 100%에 치명적인 용량)을 측정함으로써 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해 측정할 수 있다. 독성 및 치료 효과 간의 용량 비는 치료 지수이다. 이들 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 획득한 데이터를 인간에 사용하기에 무독성인 투여량 범위의 제형화에 사용할 수 있다. 본 발명에 개시된 단백질의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없는 유효 용량을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 상기 투여량을 사용되는 투여형 및 사용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 변화시킬 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 조건에 비추어 개별적인 의사에 의해 선택될 수 있다(Fingl et al., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1 참조).
키트
상기 사이토킨/항체 복합체 또는 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체 조성물(예를 들어 단클론 항체, 인간 서열 항체, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 및 그의 사용 설명서를 포함하는 키트가 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 상기 키트는 하나 이상의 추가적인 시약, 또는 하나 이상의 추가적인 인간 항체(예를 들어 제 1 인간 항체와 다른 항원 중 에피토프에 결합하는 상보성 활성을 갖는 인간 항체)를 추가로 함유한다. 키트는 전형적으로는 상기 키트의 내용물의 목적하는 용도를 지시하는 표지를 포함한다. 표지란 용어는 상기 키트 상에 또는 상기 키트와 함께 공급되거나, 또는 달리 상기 키트와 동반되는 임의의 기록, 또는 기록된 자료를 포함한다.
실시예 1
재조합 마우스 IL -2의 주입에 이은 마우스에서 T 세포 증식
선행의 연구들은 생체 내 MP CD8+ 세포의 턴오버를 IL-2 또는 IL-2 mAb의 주입에 의해 증가시킬 수 있음을 입증하였다(도 1). IL-2의 경우, 염료 CFSE의 희석(도 1A, B) 또는 브로모데옥시유리딘(BrdU)의 통합(도 2)에 의해 측정된 세포 내 MP CD8+ 세포의 증식이 재조합 마우스 IL-2(rmIL-2)의 주입 후 현저하였으며 숙주 및 채택 전달된 정제된 CD8+ 세포 모두에 대해 주로 MP CD8+ 세포로 제한되었다. 대조적으로 CD122 및 CD44의 낮은 발현에 의해 한정되는 바와 같이, 고유 T 세포의 자극은 최소였다(도 2). 선행 발견의 확인으로, IL-2 mAb의 주입에 이어서, 구체적으로 항-마우스 IL-2 mAb S4B6에 의해 훨씬 더 큰 증식이 발생하였다(도 1 및 2)(Ku et al., Science 288:675, 2000; Kamimura et al., J Immunol 173:6041, 2004). 상기 효과는 또한 IL-15-/- 숙주에서 나타났으며 CD122 mAb에 의해 차단되었고(도 1A), 이는 상기 증식에 대한 효과인자인 사이토킨이 IL-15가 아니나 그럼에도 불구하고 CD122를 통해 자극함을 입증한다(Ku et al., Science 288:675, 2000; Kamimura et al., J Immunol 173:6041, 2004).
도 1은 IL-2 또는 IL-2 mAb에 의한 생체 내 MP CD8+ 세포의 자극을 나타낸다. CFSE-표지된 정제된 Thy1.1 MP(CD44hi CD122hi) CD8+ T 세포를 (A) 야생형(WT) 또는 IL-15-/- 마우스(이어서 PBS, rmIL-2, S4B6 IL-2 mAb, 또는 IL-2 mAb + CD122 mAb의 매일 복강 내(ip) 주입을 수행하였다) 또는 (B) WT, IL-2+/- 또는 IL-2-/- 마우스에게 정맥 내(iv)로 전달한 다음 S4B6 IL-2 mAb 또는 대조용 mAb를 매일 주입하였다. 공여 세포를 유식 세포측정에 의해 7일째에 분석하였다. 숫자는 분할된(CFSElo) 공여 Thy1.1+ CD8+ 세포의 퍼센트를 나타낸다. 상기 및 하기 도면에서 모든 데이터는 2 회 이상의 별도의 실험들을 나타낸다.
도 2는 IL-2 또는 IL-2 mAb에 반응한 생체 내 MP CD8+ 세포의 증식을 나타낸다. (A) 정제된 Thy1.1-표지된 MP CD44hi CD122hi CD8+ T 세포를 통상적인 B6(Thy1.2) 마우스로 정맥 내(iv)로 전달하였다. 후속적으로 숙주 마우스에게 PBS, 1.5 ㎍ rmIL-2 또는 0.5 ㎎ S4B6 IL-2 mAb를 1 주일동안 매일 복강 내(ip) 주입하였다. T 세포 턴오버를 측정하기 위해서, BrdU를 최종 3일간 음료수에 제공하였다. 림프절(LN) 및 비장 세포를 7일 후에 단리하고 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 숫자는 공여 Thy1.1+ MP CD8+ 세포(상부 열) 또는 BrdU+ 세포(하부 열)의 퍼센트를 나타낸다.
실시예 2
IL -2 -/- 마우스에서 완전히 파괴된 또는 IL -2 +/- 마우스에서 감소된 사이토킨 항체 복합체에 반응하는 T 세포 증식
뜻밖의 발견은 채택 전달 시 IL-2 mAb에 의한 MP CD8+ 세포의 자극이 IL-2-/- 숙주에서 완전히 파괴되고 IL-2+/- 숙주에서 상당히 감소한다는 것이었다(도 1B). 따라서 상기는 시험관 내에서 그의 보고된 중화 작용에도 불구하고, S4B6 IL-2 mAb가 추정 상 면역 복합체를 통해 기존 IL-2의 생물 활성을 증가시킴으로써 생체 내에서 작용함을 암시한다(Zurawski et al., J Immunol 137:3354, 1986). 상기 가능성을 평가하기 위해서, 우리는 IL-2 및 IL-2 mAb의 매일 주입 섭생을 사용하였다. 생성된 채택 전달된 숙주 MP CD8+ 세포의 증식은 단일 IL-2 또는 IL-2 mAb 투여(도 3A)에 의해 나타낸 것보다 극적으로 향상되었으며 7일째에 비장 및 LN에서 상기 기 관의 현저한 확대와 함께 MP CD8+ 세포의 전체 수가 크게(>100 배) 증가되었다(도 3B). IL-2 및 IL-2 mAb의 병행 섭생은 또한 또 다른 CD122hi 집단, 즉 NK(CD3- NK1.1+ DX5+) 세포의 총수의 현저한(20 내지 30 배) 증가를 일으켰으나, MP CD44hi CD4+ 세포 및 B220+ B 세포를 포함한 다른 세포에 대한 효과는 최소였다(도 3A, 3B). 전달된 고유 CD8+ 세포의 증식은 비교적 낮았으며, 이는 상기 IL-2/IL-2 mAb 조합이 고유 CD122lo 전구체 상에서보다는 주로 기존의 CD122lo 세포 상에서 작용함을 암시한다(도 4A). 증식은 필적할만한 데이터가 IL-15-/- 숙주로의 전달에 의해 발생하였기 때문에 IL-15와는 무관하였다(도 4B). 또한 초회감작된 바이러스-특이적 CD8+ 세포의 강한 자극이 존재하였는데(도 3C), 이는 CD122hi CD8+ 세포의 증식이 한정된 항원(Ag)-특이적 기억 세포뿐만 아니라 MP 세포에 적용됨을 가리켰다. 후자의 경우, 증식은 CD25 상향조절을 유도하지 않았으며 CD25-/- MP CD8+ 세포에 의해 손상되지 않았는데, 이는 자극이 오직 IL-2Rβγ(CD122)를 통해서만 일어나고 IL-2Rαβγ을 통해서는 아님을 가리킨다(도 5).
도 3은 IL-2 및 IL-2 mAb의 조합에 의한 MP 및 항원(Ag)-특이적 기억 CD8+ T 세포의 현저한 선택적 확대를 나타낸다. (A) CFSE-표지된 MP CD8+ T 세포를 B6 마우스로 옮긴 다음 PBS, rmIL-2, S4B6 IL-2 mAb 또는 rmIL-2 + IL-2 mAb를 매일 ip 주입하였다. 림프절(LN)로부터의 공여 및 숙주 세포를 7일째에 나타난 마커에 대해 조사하였다. 비장 세포에 대해서도 필적할만한 결과가 획득되었다. (B) (A)(+SD, 2 마우스/그룹)에서 마우스로부터 공여 및 숙주 CD44hi T 세포의 전체 비장 및 LN 세포 수. 상기 주입된 마우스로부터의 2 개의 대표적인 비장 및 LN의 사진을 우측에 나타내었다. (C) CFSE-표지된 Ag(LCMV)-특이적 기억 CD8+ T 세포를 B6 마우스로 옮긴 다음 상술한 바와 같이 매일 주입하였다. 공여 세포를 유식 세포측정에 의해 7일째에 분석하였다. 숫자는 분할된(CFSElo) 세포의 퍼센트를 가리킨다(A 좌측 컬럼, C).
도 4는 CD8+ T 세포의 IL-2/IL-2 mAb 복합체에 대한 증식이 주로 CD122hi MP 세포로 국한되고 IL-15 의존적임을 나타낸다. CFSE-표지된 정제된 MP CD8+ T 세포(A 좌측 컬럼, 및 B) 또는 고유 CD44lo CD8+ T 세포(A 우측 컬럼)를 제조하고 WT 마우스(A) 또는 IL-15-/- 마우스(B)로 옮겼다. 이어서 PBS, 1.5 ㎍ rmIL-2, 50 ㎍ S4B6 IL-2 mAb 또는 1.5 ㎍ rmIL-2 + 50 ㎍ IL-2 mAb를 ip 투여하였다. 공여 세포를 유식 세포측정에 의해 7일째에 분석하였다. 숫자는 분할된(CFSElo) 세포의 퍼센트를 가리킨다.
도 5는 생체 내에서 MP CD8+ 세포의 IL-2/IL-2 mAb 복합체에 대한 증식이 CD25를 필요로 하지 않음을 나타낸다. (A) WT B6 마우스로부터 정제된 Thy1.1-표지된 MP CD122hi CD44hi CD8+ T 세포를 CFSE로 표지하고 통상적인 B6(Thy1.2) 마우스로 전달하였으며, 이어서 2일마다 1.5 ㎍ rmIL-2 + 50 ㎍ S4B6 IL-2 mAb를 ip 주입하였다. 채택 전달 후 7일째에, LN 및 비장 세포를 전체 CD3+(좌측), 공여 Thy1.1+ CD3+(중간), 및 숙주 Thy1.1- CD3+ 세포(우측) 상에서의 CD25의 발현에 대해 유식 세포측정에 의해 분석하였다. (B) WT(좌측 컬럼) 또는 CD25-/-(우측 컬럼) 마우스로부터 정제된 Thy1.2-표지된 MP CD8+ T 세포를 CFSE로 표지하고 Thy1.1-표지된 통상적인 B6.PL 마우스로 전달하였으며, 이어서 2일마다 PBS, 1.5 ㎍ rmIL-2, 50 ㎍ S4B6 IL-2 mAb 또는 1.5 ㎍ rmIL-2 + 50 ㎍ IL-2 mAb를 ip 주입하였다. 채택 전달 후 7일째에, LN 및 비장 세포를 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 숫자는 분할된(CFSElo) 세포의 퍼센트를 가리킨다.
실시예 3
단클론 항체에 특이적인 사이토킨 항체 복합체에 반응한 T 세포 서브세트의 증식
CD122hi CD8+ 세포의 최적 부근 확대가 예비 혼합된 2:1 몰 비의 IL-2 대 IL-2 mAb의 1 주일간의 매일 주입에 의해 발생하였다(도 7A 화살표, 도 7B). 이 비에서, 심지어 IL-2/IL-2 mAb 복합체의 단일 주입도 CD122hi CD8+ 세포의 상당한 확대를 유발하였다(도 7C). T 세포 전달 전 다양한 시점에서 IL-2/IL-2 mAb 복합체의 주입 결과를 근거로, IL-2/IL-2 mAb 복합체의 생물학적 반감기가 비교적 짧은 것, 즉 <4 시간인 것으로 측정되었다(도 7D).
S4B6 IL-2 mAb 외에, 우리는 또한 또 다른 항-마우스 IL-2 mAb, JES6-5H4(JES6-5), + rmIL-2(도 6A) 및 항-인간 IL-2 mAb, MAB602, + 재조합 인간 IL-2(rhIL-2)에 의한 동등한 증식을 관찰하였다(도 6B). IL-2와 착화 시, 이들 3 개의 mAb(S4B6, JES6-5 및 MAB602)는 각각 채택 전달 시 CD122hi CD8+ 세포의 현저한 확대, 및 MP CD8+ 세포 및 NK 세포를 포함하여 숙주 CD122hi 세포의 선택적인 확대를 유발하였다.
흥미롭게도, 세 번째 항-마우스 IL-2 mAb, JES6-1A12(JES6-1)에 의한 결과는 꽤 달랐다(도 6A). IL-2/JES6-1 복합체는 IL-2 단독에 비해 CD122hi CD8+ 세포의 보다 낮은 증식을 유발하였는데, 이는 JES6-1이 IL-2에 대한 생체 내 반응을 차단하였음을 가리킨다. 그러나, JES6-1 + IL-2 주입은 상이한 IL-2 반응성 집단, 즉 CD25+ CD4+ 세포의 온화한 증식을 유도하였다(도 6C, D). 이들 세포는 현저하게는 Foxp3+이며 따라서 T reg를 닮았다. 이들 세포의 확대가 또한 다른 IL-2 mAb의 주입에 의해서도 나타났지만, 상기 효과는 CD122hi CD8+ 세포의 큰 확대에 의해 작아졌다(도 6E).
도 6은 상이한 IL-2/IL-2 mAb 복합체에 의한 T 세포 서브세트의 선택적인 자 극을 나타낸다. CFSE-표지된 MP CD8+ T 세포를 B6 마우스로 옮긴 다음 (A,B) 도 3A에서와 같이 대조용 mAb, IL-2(A에서 rmIL-2, B에서 rhIL-2), IL-2mAb 또는 IL-2 + IL-2 mAb를 매일 ip 주입하였다. 사용된 IL-2 mAb는 (A) 항-마우스 S4B6, JES6-5 또는 JES6-1 또는 (B) 항-인간 MAB602였다. (C) MP CD8+ T 세포를 B6 마우스로 옮긴 다음 상기와 같은 대조용 mAb, rmIL-2, IL-2 mAb, 또는 rmIL-2 + IL-2 mAb를 매일 주입하였다. 비장으로부터의 공여 및 숙주 세포를 7일째에 나타난 마커에 대해 조사하였다. (D) (C)에서와 같이 처리된 마우스에게 최종 3일간 음료수 중에 BrdU를 제공하였다. BrdU+(+SD, 2 마우스/그룹)인 CD3+CD4+CD25+ Foxp3 세포의 퍼센트를 나타내었다. (E) (C)의 마우스로부터의 비장 중의 CD4+ CD25+ 및 MP CD8+ 세포의 전체 세포 수. 막대 끝의 숫자는 MP CD8+ 대 CD4+ CD25+ 세포의 비를 가리킨다. 마우스를 7일째에 분석하였다(A-E). 숫자는 분할된(CFSElo) 세포의 퍼센트를 가리킨다(A, B, C 좌측 컬럼).
도 7은 생체 내에서 IL-2/IL-2 mAb 복합체에 의한 MP CD8+ 세포의 자극 요건을 나타낸다. (A) 정제된 Thy1.1-표지된 MP CD8+ T 세포를 CFSE로 표지하고 B6 마우스로 옮겼으며, 이어서 상기 마우스에게 적정된 용량(0 내지 100 ㎍)의 S4B6 IL-2 mAb + 고정된 농도(1.5 ㎍)의 rmIL-2를 매일 주입하였다. 채택 전달 후 7일째에, LN 및 비장 세포를 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 화살표는 2:1 몰 비의 IL-2 대 IL-2 mAb의 주입에 대해, 즉 어느 시약도 과잉이 아닌 경우 관찰된 증식을 나타낸다. (B) 정제된 CFSE-표지된 MP CD8+ 세포의 수용자에게, 1.5 ㎍ rmIL-2 + 8 ㎍ S4B6 IL-2 mAb에서 출발하여 5 배 희석으로 하향 적정하면서 2:1 몰 비의 rmIL-2/S4B6 IL-2 mAb 복합체의 매일 적정 용량을 제공하였다. 채택 전달 후 7일째에, LN 및 비장 세포를 유식 세포측정에 의해 분석하였다. (C) 정제된 CFSE-표지된 MP CD8+ 세포의 수용자에게 채택 전달 후 다양한 시점들에서 1.5 ㎍ rmIL-2 + 8 ㎍ S4B6 IL-2 mAb: 0, 0 rmIL-2 + S4B6; 0일째에 1, rmIL-2 + S4B6; 0 및 4일째에 2, rmIL-2 + S4B6; 0, 2 및 4일째에 3, rmIL-2 + S4B6; 7, rmIL-2 + S4B6의 매일 주입으로 1.5 ㎍ rmIL-2 + 8 ㎍ S4B6 IL-2 mAb를 ip 주입하였다. 모든 마우스를 채택 전달 후 7일째에 죽이고 LN 및 비장 세포를 유식 세포측정에 의해 분석하였다. (D) 정제된 CFSE-표지된 MP CD8+ 세포의 수용자에 T 세포의 채택 전달 전 72h, 48h, 24h, 4h 또는 30 분째에 또는 0 시점에서 채택 세포 전달과 동시에 1.5 ㎍ rmIL-2(●) 또는 1.5 ㎍ rmIL-2 + 50 ㎍ S4B6 IL-2 mAb(■)를 1 회 주입하였다. 본 도면에서 모든 데이터를 최대 증식이 100%로 고정된 경우의 최대 증식 퍼센트로서 나타내며 다른 값들을 상기에 대해 계산하였다.
실시예 4
IL -2 상의 상이한 부위에 결합할 수 있는 단클론 항체
상기 결과는 S4B6 및 관련된 mAb가 JES6-1보다 IL-2 상의 상이한 부위에 결합할 수 있음을 암시하였다. IL-2/IL-2 mAb 샌드위치 ELISA 분석은 상기 가능성에 대한 직접적인 지원을 제공하였다(도 9). 생체 내에서와 같이, JES6-1은 CD122(IL-2Rβγ)를 통해 IL-2에 대한 통상 및 CD25-/- MP CD8+ 세포 모두의 반응을 완전히 차단하였다(도 8A, 8B). 그러나, 생체 내 CD4+ CD25+ T reg에 관하여, JES6-1/IL-2 복합체는 고 친화성 IL-2Rαβγ, 즉 CD25 CD3-활성화된 고유 CD8+ 세포를 발현하는 세포의 약하지만 현저한 시험관 외 자극을 유도할 수 있으며(도 10); 이들 세포는 IL-2에 매우 민감하고 CD25 mAb에 의해 쉽게 억제되었다. 따라서, JES6-1 mAb는 CD122와의 상호작용에는 중요하지만 CD25(IL-2Rαβγ)에 대한 결합에 대해서는 덜 중요한 IL-2 부위에 명백히 결합한다. 대조적으로, S4B6는 시험관 내에서 IL-2에 대한 MP CD8+ 세포의 반응을 억제(또는 향상)하지 못했지만(도 8A, 8B) CD3-활성화된 CD8+ 세포의 IL-2 반응을 강하게 억제하였다(도 10). 따라서, S4B6는 CD25에 대한 결합을 부분적으로 방해하지만 CD122에 대한 결합은 방해하지 않는 IL-2 부위에 결합한다. 현저하게, 외부 IL-2와 착화되지 않을 때, JES6-1 및 S4B6 mAb의 혼합물은 MP CD8+ 세포 및 T reg 모두에 대해 생체 내 T 세포 증식의 거의 완전한 파괴를 일으켰으며(도 11), 이는 또한 S4B6 및 JES6-1이 IL-2 상의 상이한 부위들을 인식함을 암시한다.
도 8은 사이토킨/mAb 복합체에 의한 T 세포 자극의 특징을 나타낸다. (A,B) WT(A) 또는 CD25-/- (B) 마우스로부터의 정제된 MP CD8+ 세포를 3일 동안 적정 농도 의 2:1 몰 비의 rmIL-2 + S4B6 mAb(S4B6, ■), 또는 rmIL-2 + JES6-1 mAb(JES6-1, ▲)와 함께 배양하고; 용해성 IL-2 + 관계없는 mAb를 대조용(대조용, ●)으로 사용하였다. 증식을 최종 16 시간 동안 [3H]-티미딘을 가하여 측정하였다. (C) 정제된 CFSE-표지된 MP CD8+ 세포를 B6 마우스로 옮기고, 이어서 상기 마우스에게 대조용 mAb, rmIL-4, IL-4 mAb(MAB404 또는 11B11) 또는 rmIL-4 + IL-4 mAb를 2일마다 ip 주입하였다. 마우스를 7일째에 분석하였다. 숫자는 분할된(CFSElo) 세포의 퍼센트를 가리킨다. (D) B6 마우스에게 1000 cGy를 조사하고 비 분리 대 T-고갈된 B6 BM 세포롤 iv 주입한 다음 PBS, rmIL-2, S4B6 IL-2 mAb 또는 rmIL-2 + S4B6 IL-2 mAb를 매일 ip 주입하였다. 채택 전달 후 8일째에 비장 세포를 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 비 분리된 BM(+SD, 2 마우스/그룹)의 수용자로부터 CD3+ CD4+ 및 CD3+CD8+ 세포의 평균 세포 수를 나타낸다. T-고갈된 BM의 주입으로, T 세포 수의 복귀는 발생하지 않았다.
도 9는 JES6-5 및 S4B6 IL-2 mAb가 JES6-1의 결합 부위와 상이한 IL-2 상의 유사한 부위에 결합함을 나타낸다. (A) 포착 mAb로서 플레이트 결합된 비접합된 JES6-1 및 검출 mAb로서 비오틴화된 JES6-5를 사용하는 표준 IL-2 샌드위치 ELISA를 200 pb/㎖에서 출발하고 4 배 희석으로 하향 적정하여, 적정된 농도의 rmIL-2를 검출하는데 사용하였다. 상기 검출 mAb의 결합을 기질 o-페닐렌다이아민과 함께 스트렙트아비딘-접합된 양고추냉이 퍼옥시다제를 사용하여 정량화하고, 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다(물질 및 방법 참조). (B) (A)에서 ELISA 접근법을 포착 mAb로서 JES6-1 + 고정 농도(200 pb/㎖)의 rmIL-2를 사용하여 변형시켰다. 이어서, 정제된 비 접합된 경쟁 mAb를 적정된 농도(100 ㎍/㎖에서 출발하여 5 배 희석)로 상기 웰에 가하여 상기 mAb가 비오틴화된 JES6-5 검출 mAb의 결합을 차단할 수 있는지의 여부를 검출하였다. 상기 사용된 경쟁 mAb는 대조용 mAb, JES6-1, JES6-5, 또는 S4B6 IL-2 mAb이었다. 이어서 샘플들을 상술한 바와 같이 측정하였다.
도 10은 시험관 내 IL-2/IL-2 mAb 복합체의 효과를 나타낸다. B6 마우스(A 좌측 컬럼), 또는 플레이트 결합된 항-CD3 mAb(CD3-활성. CD8+: A 우측 컬럼, 및 B)에 의해 활성화된다. 전체 CD8+ 세포를 3일 동안 적정 농도의 2:1 몰 비의 rmIL-2 + S4B6 mAb(S4B6/IL-2, 중간 열), 또는 rmIL-2 + JES6-1 mAb(JES6-1/IL-2, 기부)와 함께 배양하고; 용해성 IL-2 + 관계없는 mAb를 대조용(IL-2, 상부)으로 사용하였다. 고정된 농도(10 ㎍/㎖)의 관련 없는 대조용 mAb(+대조용, ●), CD25 mAb(+CD25, ■), 또는 CD122 mAb(+CD122, ▲)를 또한 상기 웰에 가하였다. (B) (A)에서와 같이 제조된 CD3-활성 CD8+ 세포를 3일 동안 적정 농도의 2:1 몰 비의 rmIL-2 + S4B6 mAb(S4B6, ■), 또는 rmIL-2 + JES6-1 mAb(JES6-1, ▲)와 함께 배양하고; 용해성 IL-2 + 관계없는 mAb를 대조용(대조용, ●)으로 사용하였다. 증식을 최종 16 시간 동안 [3H]-티미딘을 가하여 측정하였다.
도 11은 S4B6 및 JES6-IL-2 mAb의 혼합물 주입이 MP CD8+ 세포 및 CD4+ CD25+ 세포 모두의 증식을 차단함을 보인다. (A) WT B6 마우스로부터 정제된 Thy1.1-표지된 MP CD122hi CD44hi CD8+ T 세포를 CFSE로 표지하고 통상적인 B6(Thy1.2) 마우스로 옮겼으며, 이어서 매일 PBS, 50 ㎍ S4B6 IL-2 mAb, 50 ㎍ JES6-1 IL-2 mAb, 또는 50 ㎍ S4B6 IL-2 mAb와 50 ㎍ JES6-1 IL-2 mAb의 조합을 ip 주입하였다. 채택 전달 후 7일째에, LN 및 비장 세포를 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 숫자는 분할된(CFSElo) 세포의 퍼센트를 가리킨다. (B) (A)에서와 같이 처리된 마우스를 7일 후에 죽이고, (내생) CD4+ CD25+ 세포를 유식 세포측정(좌측)에 의해 분석하고 정량화하였다(우측). 숫자는 4분면 중의 CD4+ CD25+ 세포의 퍼센트를 가리킨다. 우측 데이터는 CD25hi인 CD4+ 세포의 퍼센트를 지칭한다.
실시예 5
IL -2 + F( ab' ) 2 단클론 항체 단편의 복합체가 IL -2 + 완전 단클론 항체의 복합체보다 훨씬 덜 자극적이다
IL-2/IL-2 mAb 복합체가 생체 내에서 매우 효능이 있는 이유는 불분명하다. 앞서 항체에 대한 결합이 NK 세포-매개된 종양 거부에서 가벼운 증가를 유도하는 것 이외에, 생체 내에서 IL-2, 및 또한 IL-4의 반감기를 증가시킬 수 있음이 보고되었으며, T 세포에 대한 IL-2/IL-2 mAb 복합체의 효과는 언급되지 않았다(Sato et al., Biotheraphy 6:225, 1993; Finkelman et al., J Immunol 151:1235, 1993; Courtney et al., Immunopharmacology 28:223, 1994). 또한 항-IL-2 mAb의 Fc 부분의 제거가 IL-2의 증가된 반감기를 변경시키지 않고 증가된 NK 세포-매개된 항-종양 활성을 감소시키지 않음이 보고되었다(Sato et al., Biol Pharm Bull 17:1101, 1994). 대조적으로, 여기에 보고된 CD122hi MP CD8+ 세포의 현저한 확대의 경우, F(ab')2 mAb 단편은 완전한 mAb보다 훨씬 덜 자극적이었으며(도 12), 이는 상기 복합체가 mAb Fc 부위를 통해 세포에 결합하게 됨을 암시한다. 상기와 같은 제공은 대단히 효율적일 수 있으며 IL-2/IL-2 mAb 복합체가 시험관 내에서보다 생체 내에서 훨씬 더 자극적인 이유를 설명한다.
도 12는 IL-2 mAb의 F(ab')2 단편이 전체 IL-2 mAb보다 훨씬 덜 효율적임을 보인다. (A) B6 마우스로부터 정제된 Thy1.1-표지된 MP CD122hi CD44hi CD8+ T 세포를 CFSE로 표지하고 통상적인 B6(Thy1.2) 마우스로 옮겼으며, 이어서 2일마다 PBS, 1.5 ㎍ rmIL-2, 50 ㎍ 전체 S4B6 IL-2 mAb, 1.5 ㎍ rmIL-2 + 50 ㎍ 전체 S4B6 IL-2 mAb, 50 ㎍ F(ab')2 S4B6 IL-2 mAb, 또는 1.5 ㎍ rmIL-2 + 50 ㎍ F(ab')2 S4B6 IL-2mAb를 ip 주입하였다. 7일 후에, LN 및 비장 세포를 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 숫자는 분할된(CFSElo) 세포의 퍼센트를 가리킨다. (B) F(ab')2 S4B6 IL-2 mAb를 IL-2 민감성 세포 주 CTLL-2의 rmIL-2 구동된 증식을 억제하는 능력에 대해 시험관 내에서 전체 S4B6 IL-2 mAb에 비교하였다. CTLL-2 세포(2 x 104 세포/ 웰)를 고정된 농도(100 ng/㎖)의 rmIL-2 및 적정된 용량의 F(ab')2 S4B6 IL-2mAb(■) 또는 완전 S4B6 IL-2 mAb(●)의 존재 하에서 48 시간 동안 배양하였다. rmIL-2 분자에 대한 IL-2 maB 결합 부위의 비를 나타낸다. 1 ㎍의 F(ab')2 S4B6 IL-2mAb(MW ∼100 kD)는 IL-2 결합 부위의 면에서 1.5 ㎍의 완전 S4B6 IL-2 mAb(MW ∼150 kD)와 같다. 증식을 상기 배양 기간의 최종 24 시간 동안 [3H]-티미딘을 가하여 측정하였다.
IL-2/IL-2 mAb 복합체의 자극 효과를 또한 IL-4 및 IL-4 mAb(도 8C) 및 IL-7 및 IL-7 mAb(도 16)의 복합체에 적용하였다. 따라서, CD8+ 세포의 증식은 사이토킨 또는 mAb 단독의 경우보다 상기 사이토킨/mAb 복합체의 주입 후에 훨씬 더 컸다.
S4B6 및 관련된 항체의 경우, IL-2/IL-2 mAb 복합체의 주입은 종양 면역요법 및 골수(BM) 이식 후 T 세포 수의 확대에 임상적으로 유용할 수 있다. 상기 후자의 생각을 옹호하여, 조사된 마우스 제공된 비 분리 BM 세포 및 이어서 IL-2/S4B6 주입의 과정은 전달 후 1 주만큼 빨리, 성숙한 T 세포 수, 특히 CD8+ 세포의 빠른 회복을 나타내었다(도 8D). 환원하면, IL-2 및 JES6-1 또는 관련된 mAb에 의한 CD4+ T reg의 확대는 자가면역 질병의 치료에 유용할 수 있다.
실시예 6
IL -2/ IL -2 mAb 복합체는 공유 결합된 IL -2- Ab 재조합 융합 단백질보다 현저하게 더 큰 생물 활성을 나타낸다
90년대 초에 도입 시, 상기 사이토킨/mAb 복합체는 그 후에, 추정 상 Abs에 공유 결합된 사이토킨을 포함하는 재조합 융합 단백질의 동시적인 출현으로 인해 단지 잠시 주목을 받았다(Davis and Gillies, Cancer Immunol Immunother 52:297-308, 2003; Cruz et al., Clin Exp Med 4:57-64, 2004). 상기 사이토킨/mAb 복합체의 증가된 생물 활성은 주로 상기 사이토킨의 증가된 반감기를 반영하는 것으로 간주되었기 때문에, 상기 재조합 융합 단백질은 그의 생산 편리성 및 다면성으로 인해 유리하였다. 따라서, 융합 단백질이 제조되었으며, 이때 IL-2, GM-CSF 또는 IL-12를 연장된 생체 내 수명을 촉진시키기 위해 항-합텐 mAb에, 또는 종양 항원에 반응성인 mAb에 공유 결합시켰으며, 따라서 상기 사이토킨을 종양 부위로 배향시켰다(Davis and Gillies, Cancer Immunol Immunother 52:297-308, 2003; Cruz et al., Clin Exp Med 4:57-64, 2004; Lode et al., Pharmacol Ther 80:277-292, 1998). 2 개 이상의 Ab-IL-2 융합 단백질이 생성되었으며 과거 13년간 연구되었다(Davis and Gillies, Cancer Immunol Immunother 52:297-308, 2003; Cruz et al., Clin Exp Med 4:57-64, 2004; Lode et al., Pharmacol Ther 80:277-292, 1998). 마우스에서의 연구는 상기 융합 단백질이 Ab 또는 사이토킨 단독 또는 공유 결합 없는 혼합물로서보다 현저하게 더 양호한 종양억제 활성을 나타냄을 보였다(Davis and Gillies, Cancer Immunol Immunother 52:297-308, 2003; Cruz et al., Clin Exp Med 4:57-64, 2004; Lode et al., Pharmacol Ther 80:277-292, 1998). 그러나, 종양억제 활성이 CD8 세포 및 NK 세포를 필요로함을 입증한 것 이외에, T 세포 서브세트에 대한 융합 단백질의 직접적인 생체 내 효과는 크게 무시 되었다.
상기 융합 단백질의 생물 활성이 생체 내 조건 하에서 사이토킨/mAb 복합체의 경우와 동일할 것으로 예상할 수도 있지만, 상기 구조물들은 아직 직접적으로 비교되지 않았다. 이 때문에, 우리는 최근에 IL-2/mAb 복합체와의 비교를 위해서 셰리 모리슨 박사(Dr. Sherie Morrison, UCLA, CA)로부터 Ab-IL-2 융합 단백질을 수득하였다. 항-DNS-IgG3-IL-2라 표시되는 재조합 융합 단백질은 합텐, 단실(5-다이메틸아미노 나프탈렌 1-설포닐 클로라이드, DNS)에 특이적인 마우스 가변 부위와 함께 인간 IgG3 불변 부위를 함유하는, 키메릭 Ab의 Fc 단부에 공유 결합된 인간 IL-2를 포함한다(Harvill et al., J Immunol 157:3165-3170, 1996). DNS는 마우스에서 발견되지 않기 때문에, 상기 융합 단백질은 사이토킨/mAb 복합체와 유사하게, 전신적으로 존속되어야 한다. 마우스에서 항-DNS-IgG3-IL-2 융합 단백질의 생체 내 반감기는 ∼7 시간으로 측정되며(Harvill et al., J Immunol 157:3165-3170, 1996), 이는 IL-2/mAb 복합체의 경우와 유사하고(Sato et al., Biotherapy 6:225-231, 1993) 다른 Ab-IL-2 융합 단백질 ch14.18-IL-2보다 약간 더 길다(Kendra et al., Cancer Immunol Immunother 48:219-229, 1999). 시험관 내 조건 하에서 이들 시약들은 모두 유리 rIL-2와 유사한 IL-2 활성을 나타내었다(Gillies et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:1428-32; Harvill and Morrison, Mol Immunol 33:1007-1014, 1996).
IL-2/IL-2 mAb 복합체에 대한 항-DNS-IgG3-IL-2 융합 단백질의 생물 활성을 직접 비교하기 위해서, B6.PL 마우스로부터 CFSE-표지된 MP CD8 세포를 정제하고, 조사되지 않은 B6 마우스의 그룹에 주입하고, 이어서 상기 마우스에게 몰 당량의 용량으로 PBS, rhIL-2, 상기 융합 단백질 또는 상기 복합체를 주입하였다. 상기 융합 단백질은 인간 IL-2로 제조되었기 때문에, 상기 복합체는 rhIL-2를 항-인간 IL-2 mAb(MAB602)와 결합시킴으로써 생성되었으며, 우리는 상기가 마우스 MP CD8 세포의 증식을 유도하는데 매우 유효함을 입증하였다(도 6B). 현저하게는, 대조용 rhIL-2/MAB602 복합체에 의해 유도된 효율적인 공여 세포 증식과 달리, 항-DNS-IgG3-IL-2 융합 단백질(예상되는 IL-2 활성을 나타내었다)은 상기 공여 세포 증식을 촉진하는데 최소로 유효하였으며; 실제로 상기 융합 단백질은 유리 rhIL-2보다 더 양호하지 않았다(도 13). 이러한 발견은 IL-2/mAb 복합체가 유사한 융합 단백질보다 현저하게 더 높은 생체 내 생물 활성을 나타냄을 강하게 가리킨다.
도 13은 IL-2/mAb 복합체가 Ab-IL-2 융합 단백질보다 현저하게 더 효능 있음을 나타낸다. CFSE-표지된 Thy-1.1 기억-표현형(MP) CD8 세포를 통상적인 B6 마우스로 옮기고 이어서 2일마다 PBS, 1 ㎍ rhIL-2, 1 ㎍ rhIL-2 + 5 ㎍ MAB602 또는 몰 당량(∼10 ㎍)의 항-DNS-IgG3-IL-2 융합 단백질을 주입하고 이어서 상기 실험 출발 후 7일째에 숙주 LN 중의 공여 CD8 세포의 CFSE 프로파일을 분석하였다(좌측). CTLL-2 세포를 몰 당량의 적정 농도의 rhIL-2 또는 항-DNS-IgG3-IL-2 융합 단백질과 함께 배양하여 IL-2 활성을 측정하였다(우측).
실시예 7
고유 T 세포를 확대시키는 IL -7/ IL -7 단클론 항체 복합체의 능력
IL-7은 IL-2, -4, -9, -15 및 -21로서 같은 계열의 사이토킨에 속하는 작 은(MW: ∼25 Kd) I 유형 사이토킨이다(Fry and Mackall, J Immunol 174:6571-76, 2005; Sugamura et al., Annu Rev Immunol 14:179-205. 1996). IL-7은 1988년 B 세포 선조의 성장을 지원하는 능력으로 처음 발견되었으며, 상기 유전자는 골수(BM) 간질 세포 주로부터 클로닝되었다(Namen et al., Nature 333:571-73, 1988; Namen et al., J Exp Med 167:988-1002, 1988). 상기 IL-7의 T 세포자극 기능은, IL-7이 흉선에서 αβ 및 γδ TCR 서브세트 모두에 대한 T 세포 선조의 성장 및 분화를 촉진한다는 발견(Conlon et al., Blood 74:1368-73, 1989; Watanbe et al., Int Immunol 3:1067-75, 1991), 및 IL-7-및 IL-7 수용체 (R)-결핍 마우스의 생산에 의한 이들 역활의 확인(Peschon et al., J Exp Med 180:1955-60, 1994; vonFreeden-Jeffry et al., J Exp Med 181:1519-26, 1995)으로부터 출발하여, 후속적으로 이해되었다. 이들 돌연변이 마우스에서 B 및 T 세포 발생 모두에서의 심각한 손상은 B 및 T 림프구형성에 대한 중복되지 않는 역할을 입증하였다. 그럼에도 불구하고, 결함성 IL-7R을 갖는 면역결핍 인간 환자는 T 세포가 심하게 결핍되지만 정상적인 수의 B 세포를 가지므로, 상이한 종들 간의 IL-7의 의존성 변이가 명백하다(vonFreeden-Jeffry et al., J Immunol 161:5673-5680, 1998; Puel et al., Nat Genet 20:394-97, 1998; vonFreeden-Jeffry et al., Immunity 7:147-154, 1997; Schluns et al., Nature Immunol 1:426-32, 2000; Tan et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:8732-37, 2001).
성숙한 T 세포 풀의 전체 크기 및 조성을 항상성 기전에 의해 조절한다(Surh et al., Sem. Immunol. 17:183, 2005; Schluns et al., Nat Rev Immunol. 3:269, 2003; Jameson Nat Rev Immunol. 2:547, 2002). 일정 수의 고유 T 세포의 생존은 자기-MHC/펩타이드 리간드 및 IL-7과의 접촉으로부터의 신호를 필요로 하는 반면, IL-7 및 IL-15와의 접촉으로부터의 신호는 일정 수의 기억 T 세포의 생존을 요한다(Surh et al., Sem. Immunol. 17:183, 2005; Schluns et al., Nat Rev Immunol. 3:269, 2003; Jameson Nat Rev Immunol. 2:547, 2002). 상기 T 세포 풀의 전체 크기를 조절하는 항상성 기전의 존재는 T 세포가 T 세포(T) 결핍의 반응으로 자발적인 "항상성" 확대를 겪는 능력을 갖는다는 발견에 의해 자명하다(Ernst et al., Immunity 11:173, 1999; Goldrath et al., Immunity 11:183, 1999). 더욱이, T 세포의 항상성 확대는 IL-7 및 IL-15에 의존한다. 따라서, IL-7의 부재 하에서 고유 T 세포의 항상성 확대는 발생하지 않으며 IL-7과 IL-15 모두의 부재 하에서 기억 T 세포는 항상성 확대를 겪을 수 없다(Schluns et al., Nat Immunol 1:426, 2000; Tan et al., Proc Natl Acad Sci 98:8732, 2001; Tan et al., J Exp Med 195; 1523, 2002; Goldrath et al., J Exp Med 195:1515, 2002). 이러한 발견은 집합적으로 구성적으로 생산된 기본 수준의 IL-7 및 IL-15가 유한 수의 T 세포의 생존을 지원하며, T 세포 고갈 시, 상기 기본 농도의 IL-7 및 IL-15는 사용의 결여로부터 증가하고 나머지 T 세포가 항상성 확대를 겪을 수 있게 구동한다는 현행 범례를 도출시켰다(Surh et al., Sem. Immunol. 17:183, 2005). 고유 T 세포의 생존 및 항상성 확대는 IL-7에 거의 독점적으로 의존하는 반면, 기억 T 세포의 생존 및 항상성 증식은 IL-7 또는 IL-15에 의해 지원될 수 있지만, IL-7 및 IL-15 모두에 의해 가장 최적으로 지원될 수 있다(Surh et al., Sem. Immunol. 17:183, 2005; Schluns et al., Nat Rev Immunol. 3:269, 2003; Jameson Nat Rev Immunol. 2:547, 2002).
생체 내에서 유효하기 위해서, IL-7을 다량으로 주입해야 한다. 예를 들어, 3 주간 10 내지 100 배의 혈액 수준을 상승시키기에 충분한 양으로 IL-7을 주입하는 것은 인간에서 T 세포 수를 단지 3 내지 7 배 증가시켰을 뿐이다[Rosenberg, 2006 #1889]. 따라서 다량의 상기 투여된 IL-7은 추정 상 짧은 반감기 또는 림프양 조직 중의 적합한 부위에 도달하지 못하는 것 때문에 제한된 생물 활성을 가질 수 있다. 전자의 경우, IL-7을 포함한 여러 γc 사이토킨의 반감기를 특이적인 항-사이토킨 mAb에의 결합에 의해 증가시킬 수 있음이 수년 전 입증되었다[Sato, 1993 #1805; Courtney, 1994 #1895; Finkelman, 1993 #1775; Valenzona, 1998 #1896; Klein, 1995 #1876]. 그러나, IL-2의 경우, 우리는 최근에 IL-2 mAb와의 회합이 오직 사이토킨 반감기의 증가로부터 기인될 수 있는 생체 내 사이토킨 활성에 훨씬 더 극적인 효과를 가짐을 입증하였다[Boyman, 2006 #1835; Kamimura, 2006 #1840]. 이 보고서에서 우리는 IL-7/IL-7 mAb 복합체가 전-B 세포 및 전-T 세포의 확대를 유도함에 있어서 유리 IL-7보다 매우 우수함을 보인다. 상기 복합체는 또한 성숙한 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 강하게 작용하며 고유 및 기억 T 세포가 통상적인 T 세포-충만한 조건 하에서 효율적인 항상성 확대를 겪게 한다.
IL-7/IL-7 mAb 복합체는 가슴샘형성을 증대 또는 복원할 수 있다. rhIL-7/IL-7 mAb(M25)를 주입한 B6 마우스의 흉선은 PBS-주입한 B6 마우스보다 15 내지 20% 더 높은 세포질을 갖는데, 이는 대개 CD4/CD8 이중 양성(DP) 세포 수의 상승으로부터 온다(도 14). 가슴샘형성에 대한 상기 효과를 보다 잘 평가하기 위해서, 매우 작은 흉선(10,11)을 갖는 IL-7-/- 마우스의 그룹들에게 rhIL-7/M25 복합체, rhIL-7 단독 또는 PBS를 주입하였다. 3일 떨어져, 1.5 ㎍ rhIL-7 + 15 ㎍ M25를 2 회 주입하여 IL-7-/- 마우스의 흉선을 크게 확대시켰으며, 이는 7일까지 50 내지 100 배의 세포질 증가를 나타내었고; 대조적으로 1.5 ㎍ rhIL-7 단독 주입은 단지 상대적으로 적은 2 내지 3 배의 세포 수 증가를 유도하였다(도 14). 가슴샘 세포의 CD4-CD8-(DN) 집단의 분석은 rhIL-7/M25 복합체의 주입이 CD25+CD44-DN3 및 CD25-CD44-DN4 세포(IL-7-/- 마우스에서 심하게 결핍되었다)의 선택적인 출현을 유도하였으며; 상기 세포는 1.5 ㎍ rhIL-7 단독 주입에 의해서는 복원되지 않았다(도 14A). rhIL-7/M25 복합체에 의해 유도된 가슴샘형성의 복원은 상기 복합체 주입 후 3주일까지 저세포 상태로 복귀된 주입된 IL-7-/- 마우스의 흉선으로서 일시적이었다(도 14B, 좌측). 상기 흉선에 대한 현저한 효과와 대조적으로, rhIL-7/M25 복합체의 주입은 IL-7-/- 마우스의 비장 세포질에서 단지 2 배의 증가를 일으켰다.
rhIL-7/M25 복합체의 상대적인 생물 활성을 평가하기 위해서, IL-7-/- 마우스에게 7일에 걸쳐, 통상적인 용량(1 + 5 ㎍)의 rhIL-7/M25 복합체 대 적정된 용량(1, 10 및 100 ㎍)의 유리 rhIL-7을 2 회 주입하였다. 현저한 발견은 M25에 결 합된 1 ㎍ rhIL-7에 의해 유도된 흉선의 확대가 100 ㎍의 유리 rhIL-7의 주입에 의해 유도된 흉선 크기와 동일하다는 것이었다(도 14B, 우측).
도 15 내지 18은 IL-7보다 IL-7/IL-7 mAb 복합체의 증가된 생물 활성에 대한 추가적인 증거를 제공한다. 도 15는 IL-7/IL-7 mAb(M25) 복합체가 고유 T 세포의 항상성 증식을 유도함을 보인다. 성숙한 T 세포의 확대를 유도하는 IL-7/M25 복합체의 능력을 평가하기 위해서, CFSE-표지된 CD45-동종 B6.CD45.1 LN 세포를 조사되지 않은 통상의 B6 마우스에게 채택 전달하였다. 이어서 상기 숙주에서 rhIL-7/M25 복합체(1.5 + 7.5 ㎍, 3x, 7일간)를 주입하고, 공여 세포의 운명을 분석하고; 대조용 숙주에게는 단지 PBS, rhIL-7 또는 M25만을 제공하였다. 현저하게, 공여 B 및 T 세포는 대조용 숙주에서 증식하지 않았지만, rhIL-7/M25 복합체의 주입은 4 내지 5 라운드의 대부분의 공여 CD8+ 세포의 증식을 유도하였으며, 이때 한 라운드의 증식은 공여 CD4+ 세포의 약 절반이며, 공여 B220+ B 세포의 증식은 거의 없었다(도 15A). 느린 페이스의 증식을 고려할 때, 상기 rhIL-7/M25 복합체는 통상적인 T 세포-충만한 숙주 중에 있음에도 불구하고, 자기-MHC/펩타이드 리간드에 반응하여 공여 T 세포의 "항상성" 증식을 일으키는듯하다. 상기 개념과 일관되게, rhIL-7/M25-유도된 2 계통의 고유 TCR 트랜스제닉 CD8+ 세포의 증식을 시험하였으며(P14 및 OT-1), 고유 CD8+ 세포의 증식은 MHC I 등급 분자의 부재 하에서, 즉 TAP-1-/- 숙주에서 대부분 없어졌다. 더욱이, rhIL-7/M25 복합체의 주입은 고유 T 세포가 IL-7-/- 숙주에서 항상성 증식을 겪게 하였으며, 이는 공여 고유 T 세포의 항상성 증식을 지원하지 않는다(도 15B). 여기에서, 동등한 용량의 rhIL-7 단독의 대조용 주입은 공여 T 세포 증식을 유도하지 못했다(도 15B). 최종적으로, rhIL-7/M25는, 상기 증식이 항-IL-7Rα mAb A7R34를 상기 복합체와 함께 주입할 때 완전히 없어지므로, IL-7R을 직접 끌어들임으로써 공여 T 세포의 증식을 유도하였다.
림프구감소성 숙주에서 내생 IL-7에 대한 항상성 증식에 관하여(12,13), rhIL-7/M25 복합체의 주입은 CD8+ 세포보다 훨씬 더 약한 CD4+ 세포의 증식을 유도하였다. 마우스(m) IL-7R은 rmIL-7보다 약간 더 낮은 친화성으로 rhIL-7과 결합하기 때문에, 우리는 CD4+ 세포에 대한 rmIL-7/M25 복합체의 효과를 조사하였다. 현저하게, rmIL-7/M25 복합체는 rhIL-7/M25 복합체보다 2 내지 3 배 더 큰 생물 활성을 나타내고, 현저하게는 통상적인 B6 숙주에서 세포의 공여 CD4+ 및 CD8+ 서브세트 모두의 효율적인 증식을 유도하였다(도 15C). CD4+ 및 CD8+ 세포 서브세트 모두의 증식은 또한 rhIL-7/M25 복합체를 보다 높은 용량으로 주입할 때 상기 복합체에 의해 나타났다. 확대가 또한 상기 숙주 중의 고유 T 세포의 크기가 약 3 배 증가하였으므로 숙주 T 세포에 적용되었다. B 세포 전구체의 대량 확대가 앞서 보고된 바와 같이 IL-7+M25 복합체를 주입한 마우스의 비장 및 골수에서 관찰되었다(Finkelman et al., J Immunol 151:1235, 1993).
도 16은 rhIL-7+M25(IL-7/mAb) 복합체가 고유 및 기억 T 세포 모두의 확대를 구동할 수 있음을 보인다. IL-7/mAb 복합체는 기억(CD44hi)CD8 세포의 확대에서 거 의 IL-2/mAb 복합체만큼 유효하지만, IL-7/mAb는 고유(CD44lo)CD8 세포의 확대 유도에서 IL-2/mAb보다 훨씬 더 효율적이다. IL-7/mAb 복합체는 또한 고유 및 기억 CD4 세포의 항상성 증식(CD8 세포보다는 더 낮은 비율로)을 유도하는 것으로 밝혀졌다(도 15C). 실험 과정에서, CFSE-표지된 B6.Thy-1.1 고유(CD44lo) 및 정제된 기억(CD44hi) CD8 세포를 통상적인 B6 마우스에 주입하고 이어서 상기 숙주에게 PBS, IL-7+M25(1.5 + 15 ㎍), 또는 IL-2+S4B6(1.5 + 15 ㎍)을 2일마다 주입하였다. 공여 T 세포를 Thy-1.1 및 CD8에 대해 숙주 비장 세포를 염색한 후에 유식 세포측정에 의해 세포 주입 후 7일째에 분석하였다. 관문을 통과한 공여 CD8 세포의 CFSE 프로파일을 나타내었다. 유사한 데이터를 LN으로부터 획득하였다.
도 17은 IL-7에 착화 시 항-IL-7 mAb M25의 Fc 부분이 그의 향상 효과를 위해 필요함을 보인다. M25로부터 상기 Fc 부분의 제거는 고유 T 세포의 확대를 유도하는 IL-7+M25 복합체의 능력을 대부분 파괴한다. 실험 과정에서, CFSE-표지된 B6.Thy-1.1 LN 세포를 통상적인 B6 마우스에 주입하고 이어서 상기 숙주에게 PBS, IL-7+M25(1.5 + 15 ㎍), 또는 IL-7+M25 Fab(1.5 + 15 ㎍)를 2일마다 주입하였다. 공여 T 세포를 Thy-1.1, CD4 및 CD8에 대해 숙주 비장 세포를 염색한 후에 유식 세포측정에 의해 세포 주입 후 7일째에 분석하였다. 관문을 통과한 공여 CD4 및 CD8 세포의 CFSE 프로파일을 나타내었다. 유사한 데이터를 비장으로부터 획득하였다.
도 18은 고유 T 세포 항상성의 결함을 회복하는 IL-7/mAb 복합체의 능력이 고령의 경우 자명함을 보인다. 어린 개인에서 성숙한 T 세포 풀은 주로 고유 세포 들로 구성된다. 노화는 CD4+ 대 CD8+ 세포의 비 및 전체 수를 현저하게 변화시키지 않지만, 이는 고유 세포의 보충적인 감소와 함께 기억 세포의 비율이 점진적으로 증가함과 관련이 있다(Hodes Immunol. Rev. 160:5, 1997; Miller Vaccine 18:1654, 2000; Linton et al., Nat. Immunol. 5:133, 2004). 고유 및 기억 세포의 표현에서 연령 관련된 이동의 정확한 원인은 알려지지 않고 있지만, 가장 단순한 생각은 상기가 생애 전체를 통해 고유 세포의 기억 세포로의 연속되는 항원-구동된 전환과 함께 고유 세포의 감소된 흉선 생산의 반영이라는 것이다. 그러나, 상기 관점은 추정상 노화에 따른 고유 T 세포의 상실에 기여하는 여러 기전이 존재하므로 지나치게 단순한듯하다. 하나의 있음 직한 기여 인자는 성숙한 T 세포 풀의 생존 및 전체 크기를 조절하는 항상성 기전의 결함일 수 있다. 우리는 최근 노화가 고유 T 세포의 항상성을 지지하는 타고난 능력의 심한 감퇴와 관련 있다는 증거를 발견하였다. 상기 결함은 IL-7 관련되는 듯하지만, IL-7 생산의 감퇴에 기인하지 않는다. 오히려, T 세포에의 IL-7 제공의 문제인 것으로 보인다. 상기 결함의 근원적인 원인은 아직 확인되지 않고 있지만, 우리는 고유 T 세포의 항상성을 지원하는 능력의 연령 유도된 감퇴를 역전시키는 신규의 방법을 개시한다.
도 18은 외부 유리 IL-7은 효과가 없지만, IL-7/mAb 복합체는 노화된 마우스의 항상성 결함을 효율적으로 복원시킬 수 있음을 나타낸다. 노화가 고유 T 세포의 항상성을 지원하는 능력의 결함과 관련이 있다는 사실을 도 18A에 나타낸다. 여기에서, 항상성 확대를 지원하는 림프구감소 숙주의 능력이 1 살 부근에서 시작 하여 감소하고 16 개월까지 심하게 손상됨을 나타낸다. 늙은 마우스가 고유 T 세포의 항상성 확대를 지원하지 못함이 복원될 수 있는 지의 여부를 결정하기 위해서, 유리 IL-7 및 IL-7/mAb 복합체의 주입 효과를 시험하였다. 도 18B에 나타낸 바와 같이, IL-7/mAb 복합체의 주입은 늙은 숙주에서의 상기 결함을 완전히 복원시킬 수 있었던 반면, 유리 IL-7의 주입은 효과가 없었다.
도 18은 노화가 고유 T 세포의 항상성 증식을 지원하는 능력의 심한 감퇴와 관련 있으며 이는 항-IL-7 mAb 복합체와 함께 IL-7을 사용하여 복원될 수 있음을 보인다. (A) 고유 T 세포의 항상성을 지원하는 능력은 연령에 따라 감퇴한다. 다양한 연령(1.5 내지 22 개월)의 B6 마우스 그룹들을 조사하고(600 cGy) 어린(2 개월) B6.Thy1.1 마우스로부터의 1 x 106의 CFSE-표지된 LN 세포를 주입하였으며 상기 공여 T 세포의 CFSE 프로파일을 7일 후에 분석하였다. 숙주 LN으로부터의 결과를 나타내며; 유사한 데이터를 숙주 비장으로부터 획득하였다. 각각의 그룹은 2 내지 3 마리의 마우스를 포함하였다. (B) IL-7 mAb 복합체를 사용한 항상성 결함의 유효 복원. FACS-분류된 고유(CD44lo) B6.Thy-1.1 T 세포를 CFSE-표지하고 조사된 어린(2 개월) 및 늙은(16 개월) B6 마우스에게 주입하였다. 마우스에게 2일마다 rhIL-7 또는 rhIL-7+M25(항-hIL-7 mAb) 복합체를 주입하고 공여 T 세포의 CFSE 프로파일을 세포 주입 후 7일째에 분석하였다. 1.5 ug 용량의 rhIL-7을 마우스당 주입하였으며; 동일 용량의 rhIL-7을 30 분 이상 동안 15 ug M25와 함께 배양하고 rhIL-7 + M25 복합체로서 함께 주입하였다. 각 그룹 중의 2 내지 3 마리의 마우스 를 사용한 3 회의 독립적인 실험의 전형적인 CFSE 프로파일을 나타낸다.
실시예 8
용해성 IL -15Rα 에의 결합에 의한 IL -15의 초작용물질로의 전환
IL-15는 통상적으로 생체 내에서 IL-15Rα에 결합된 세포 회합된 사이토킨으로서 제공된다. 우리는 여기에서 용해성 IL-15의 생물 활성이 재조합 용해성 IL-15Rα와의 상호작용에 따라 훨씬 개선되며; 주입 후 용해성 IL-15/IL-15Rα 복합체가 기억-표현형 CD8+ 세포 및 NK 세포의 강하고 선택적인 확대를 신속하게 유도함을 보인다. 이러한 발견은 IL-15에 대한 IL-15Rα의 결합이 T 세포 상의 βγc 수용체에 의한 IL-15 인식을 강화시키는 형태적 변화를 생성시킬 수 있음을 내포한다. IL-15Rα 결합의 향상 효과는 IL-15가 세포 회합된 사이토킨으로서 통상적으로 작용하는 이유를 설명할 수 있다. 현저하게, 용해성 사이토킨인 IL-2에 의한 결과는 매우 상이하며; 따라서 IL-2 작용은 용해성 IL-15Rα에의 결합에 의해 현저하게 억제된다.
마우스에서, 몇몇 세포, 즉 기억 표현형(MP) CD8+ T 세포 및 NK 세포는 IL-15에 매우 민감하다(Kenndy et al., J Exp Med 191:771-80, 2000; Judge et al., J Exp. Med 196:935-46, 2002; Fehniger and Caligiuri, Blood 97:14-32, 2001; Becker et al. J Exp Med 195:1541-48, 2002; Zhang et al., Immunity 8:591-99, 1998; Waldmann, T.A., J Clin Immunol 22:51-56, 2002; Zeng et al., J Exp Med 201:139-48, 2005; Van Belle and Grooten, Arch Immunol Ther Exp(Warz) 53:115- 26, 2005; Schluns et al., Int J Biochem Cell Biol 37:1567-71, 2005). MP CD8+ 세포는 높은 수준의 CD44를 나타내며, NK 세포처럼, 또한 CD122(IL-2Rβ)(IL-15 및 IL-2 모두에 대한 수용체의 성분)의 높은 발현을 나타낸다(Waldmann, T.A., J Clin Immunol 22:51-56, 2002). 세포의 휴지를 위해서, 상기 2 개의 사이토킨에 대한 반응성을, 세포 내 신호전달을 조절하는, β 쇄(CD122) + 공통 γ 쇄, γc로 이루어진 2-쇄 수용체 βγc에 의해 조절한다.
IL-15는 통상 용해성 형태로 분비되지 않지만(Van Belle and Grooten, Arch Immunol Ther Exp(Warz) 53:115-26, 2005; Schluns et al., Int J Biochem Cell Biol 37:1567-71, 2005; Nguyen et al., J Immunol 169:4279-87, 2002), 특히 수지상 세포(DC) 상의 독특한 수용체, IL-15Rα에 결합된 세포 표면상에서 유지된다(Dubios et al., Immunity 17:597-47, 2002; Burket et al., J Exp Med 200:825-34, 2004; Burkett et al., Proc Natl Acad Sci USA 100:4724-29, 2003; Schluns et al., Blood 103:988-994, 2004; Zaft et al., J Immunol 175:6428-35, 2005; Sandau et al., J Immunol 173:6537-6541, 2004). 이어서 세포 결합된 IL-15를 T 세포 및 NK 세포에 트랜스로 제공하며 이는 상기 세포 상의 βγc 수용체에 의해 인식되고; 상기와 같은 인식은 세포 생존 및 간헐적인 증식을 유지시킨다.
IL-15Rα는 내생 IL-15의 제공에서 필수적인 역할을 한다. 따라서, IL-15-/- 마우스(1)처럼, IL-15Rα-/- 마우스는, 추정 상 IL-15-/- 마우스에서 합성된 IL-15가 세포질을 떠나지 못하기 때문에, CD122 CD8+ 세포 및 NK 세포가 결여되어 있다(Lodolce et al., Immunity 9:669-76, 1998). 그럼에도 불구하고, IL-2Rβγc + 세포는 IL-15Rα의 부재 하에서 IL-15의 용해성 재조합 형태에 반응하여 증식할 수 있다(Lodolce et al., J Exp Med 194:1187-94, 2001). 더욱이, 몇몇 조건 하에서, IL-15Rα는 억제성일 수 있다. 따라서, 마우스에게 IL-15Rα의 용해성(s) 재조합 형태를 주입하는 것이 NK 세포 증식(Nguyen et al., J Immunol 169:4279-87, 2002) 및 몇몇 T 의존성 생체 내 면역 반응(Ruckert et al., Eur J Immunol 33:3493-3503, 2003; Ruckert et al., J Immunol 174:5507-15, 2005; Wei et al., J Immunol 167:577-82, 2001; Ruchatz et al., J Immunol 160:5654-5660, 1998)을 억제하는 것으로 보고되어 있으며, 시험관 내에서 sIL-15Rα의 첨가는 IL-15에 대한 세포 주의 반응을 차단할 수 있다(Ruckert et al., J Immunol 174:5507-15, 2005; Wei et al., J Immunol 167:577-82, 2001; Ruchatz et al., J Immunol 160:5654-5660, 1998; Budagian et al., J Biol Chem 279:40368-75, 2004; Mortier et al., J Immunol 173:1681-1688, 2004; Eisenman et al., Cytokine 20:121-29, 2002). 이러한 발견에도 불구하고, sIL-15Rα(Giron-Michel et al., Blood 106:2302-10, 2005) 및 또한 IL-15Rα의 용해성 스시 도메인(Mortier et al., J Biol Chem, 2005, E-pub ahead of print)이 인간 세포 주의 IL-15 반응을 향상시킬 수 있다는 다른 보고서들이 존재한다.
실시예 9
시험관 내에서 IL -15/ IL -15Rα 복합체에 의한 자극
용해성 IL-15의 자극 작용이 sIL-15Rα에 대한 결합에 의해 변경되는 지의 여부를 조사하기 위해서, 정제된 MP CD44hi CD122hi CD8+ 세포를 인간 IgG1의 Fc 부분에 공유 결합된 마우스 sIL-15Rα±마우스 IL15와 함께 시험관 내에서 배양하였다. IL-15 단독의 경우, 최대 절반의 반응은 약 30 ng/㎖을 필요로 하였으며 <10 ng/㎖의 반응은 무시하였다(도 19A,19B). 이때, 현저한 발견은 저 농도, 예를 들어 5 ng/㎖의 IL-15를 sIL-15Rα-Fc와 함께 보충하면 CFSE 희석(도 19A) 또는 [3H]-티미딘 통합(도 19B)에 의해 측정된 바와 같이 MP CD8+ 세포의 강한 증식 반응을 도출시킨다는 것이다. sIL-15Rα-Fc 단독으로는 증식이 일어나지 않았으며(도 19B), sIL-15Rα-Fc의 첨가는 상이한 사이토킨, IL-2(데이터 도시 안 됨)에 대한 MP CD8+ 세포의 반응을 변경시키지 못했다. IL-15의 경우, 우리는 sIL-15Rα-Fc가 시험관 내에서 IL-15의 반감기를 향상시킴으로써 작용했다는 증거를 발견할 수 없었다(도 25).
제한된 농도의 사이토킨의 경우, IL-15 반응이 sIL-15Rα-Fc의 첨가에 의해 6 내지 9 배까지 일반적으로 개선되었다. sIL-15Rα-Fc의 첨가가 또한 CD122hi NK 세포의 IL-15 반응을 상당히 개선시켰지만(도 19C) 중간 수준의 CD122를 발현하는 MP (CD44hi) CD4+ 세포에 대해서는 비교적 효과가 없었다(도 19C). 뜻밖에도, sIL- 15Rα-Fc + IL-15는, 비록 고 농도의 IL-15를 사용한 경우에만 이지만 전형적인 고유 CD44lo CD122lo CD8+ 세포의 현저한 증식을 도출시켰다(도 19C).
MP CD8+ 세포의 경우, 용해성 IL-15 단독 및 IL-15+sIL-15Rα-Fc 모두에 대한 반응은 오로지 βγc 수용체를 통해서만 매개되었다. 따라서, 반응들은 CD122 mAb의 첨가에 의해서 파괴되었고(도 19D) IL-15Rα-/- 마우스로부터의 MP CD8+ 세포에 의해서 통상적인 MP CD8+ 세포만큼 높았다(도 19E).
이량체성 분자인 경우, sIL-15Rα-Fc는 상기 사이토킨을 가교결합된 형태로 제공함으로써 IL-15 활성을 향상시킬 수도 있다. 그러나, sIL-15Rα-Fc의 효소 절단된 단량체성 단편은 IL-15 반응의 증대에 있어서 이량체성 분자와 마찬가지로 효능이 있었다(도 19A, 19B). 실제로, 제한 조건 하에서, 반응들은 상기 Fc 이량체의 경우보다 상기 수용체 단량체의 경우 뚜렷하게 더 높았다(도 19B). 상기 수용체 단량체가 상기 이량체보다 더 유효한 이유는 불분명하지만, 입체의 이유로 상기 단량체/IL-15 복합체는 상기 βγc 수용체에 보다 유효하게 결합할 수 있다.
도 19A, 19B, 19C, 19D 및 19E는 용해성 IL-15Rα가 시험관 내에서 IL-15-매개된 림프구 증식을 증대시킴을 보인다. (A) 정제된 MP(CD44hi)CD8+ T 세포를 CFSE로 표지하고 5 ng/㎖의 IL-15와 함께 5 x 104 세포/웰로 배양하였다. 지시된 바와 같이, 1 ㎍/㎖의 sIL-15Rα-Fc(이량체) 또는 sIL-15Rα(단량체)를 상기 배양물에 가하였다. CFSE 희석을 4일째에 평가하였다. 전형적인 데이터를 나타낸다. (B) 정제된 MP CD8+ T 세포를 적정량의 IL-15 + 고정 농도의 용해성 수용체(1 ㎍/㎖)(상부) 또는 적정량의 용해성 수용체 + 고정 농도의 IL-15(10 ng/㎖)(기부)와 함께 배양하였다. 데이터는 3일째에 3 회 중복 배양물에 대해 평균 수준의 [3H]-티미딘 통합(±SD)을 나타낸다. (C) 정제된 고유(CD44lo) CD8+ T 세포, MP CD8+ T 세포, NK 세포, 또는 MP CD4+ T 세포를 지시된 바와 같이 IL-15와 함께 배양하였다. 용해성 IL-15Rα-Fc를 1 ㎍/㎖으로 가하였다. CFSE 희석을 3일째에 평가하였다. (D) (B)에서와 같이 10 ㎍/㎖의 항-CD122 항체를 지시된 바와 같이 첨가하였다. (E) 야생형 Ly5.2 및 IL-15Rα-/-/Ly5.1 마우스로부터의 MP CD8+ T 세포를 함께 혼합하고, CFSE로 표지하고, 지시된 바와 같이 배양하였다. Lys5.1-(야생형) 및 Ly5.1+(IL-15Rα-/-)에 대한 CFSE 희석을 3일째에 측정하였다.
상기 데이터는 마우스 IL-15 및 마우스 용해성 IL-15Rα에 관한 것이다. 매우 유사한 데이터가 인간 IL-15/IL-15Rα에 적용되었다. 따라서, 인간 또는 마우스 IL-15에 대한 마우스 MP CD8+ 세포의 반응이 인간 sIL-15Rα-Fc의 첨가에 의해 상당히 향상되었다(도 26). 인간 IL-15Rα 단량체의 첨가가 훨씬 더 유효하였다. 마우스 IL-2Rβγc 반응의 경우, 인간 IL-15는 마우스 IL-15보다 상당히 더 약하 다(Eisenman et al., Cytokine 20:121-29, 2002).
도 25A 및 25B는 시험관 내에서 IL-15의 생존을 나타낸다. (A) 정제된 CFSE-표지된 MP CD8+ T 세포를 IL-15만을 5 ng/㎖(상부, 회색), 100 ng/㎖(기부), 또는 5 ng/㎖의 IL-15+1 ㎍/㎖ sIL-15Rα-Fc(상부, 실선)를 함유하는 배양물에 가하였다. 상기 배양물들을 새로 제조하거나(새로운 것) 또는 T 세포 첨가 전에 37 ℃에서 48 시간(48 시간 전-배양물) 동안 방치시켰다. (B), T 세포를 상기 "48 시간 전-배양물"(상등액) 대 세척 없이 상등액을 비운 나중의 배양물(웰-기부)로부터 취한 상등액들과 배양함을 제외하고, (A)에서와 같다. 해석: 상기 실험은 IL-15(단독 배양된 것)의 생물 활성이 37 ℃에서 48 시간 동안 배양 중 현저하게 감퇴하지 않았음을 보이며, 따라서 단순히 IL-15의 반감기를 연장시킴으로써 작용한 sIL-15Rα-Fc와 다르다. 더욱이, 상기 빈 웰로 옮긴(웰-기부) 세포 증식의 부재는 상기 용해성 수용체의 향상 활성이 상기 웰의 플라스틱 기부에 상기 수용체를 통해 결합된 IL-15의 가교결합된 제공을 반영하지 않음을 암시한다.
도 26은 인간 sIL-15Rα-Fc가 마우스 및 인간 IL-15 모두에 대한 마우스 MP CD8+ 세포의 반응을 향상시킴을 보인다. CFSE-표지된 정제된 MP CD8+ T 세포를 5 x 104 세포/웰로, 100 ng/㎖의 인간 IL-15 또는 5 ng/㎖의 쥐 IL-15와 함께 배양하였다. 지시된 바와 같이, 1 ㎍/㎖의 인간 sIL-15Rα-Fc를 상기 배양물들에 가하였다. CFSE 희석을 배양 3일 후에 평가하였다. CTLL(IL-15Rα + βγc를 발현한다) 과 직접 대조적으로, 마우스 MP CD8+ 세포는 인간 IL-15에 대해서보다 마우스 IL-15에 대해서 양호하게 반응함에 주목한다(Eisenman, J. et al., Cytokine 20:121-129, 2002).
실시예 10
생체 내 반응
선행 발견들(Judge et al., J Exp. Med 196:935-46, 2002; Zhang et al., Immunity 8:591-99, 1998)의 확인으로, CFSE-표지된 MP CD8+ 세포의 iv 주입 후 IL-15를 마우스에게 ip 주입하여 상기 공여 세포의 약 50%가 1 내지 2 배 분열시켰다(도 20A). 그러나, sIL-15Rα-Fc의 동시주입으로, 실질적으로 상기 공여 세포 전부가 분열하였으며 상기 세포의 >95%가 3 배 이상 분열하였고(IL-15 단독 주입의 경우 <5%에 비해); 대조적으로, sIL-15Rα-Fc 단독 주입은 증식에 효과가 없었다. IL-15에 대한 MP CD8+ 세포의 반응을 향상시키는 sIL-15Rα-Fc의 능력을 또한 항원-특이적 기억 CD8+ 세포, 즉 항원-초기감작된 P14 TCR 트랜스제닉 CD8+ 세포에 적용시켰다(도 20B, 상부). MP CD4+ 세포의 IL-15 반응도 또한 향상되었다(도 20B, 기부).
MP CD8+ 세포의 경우, IL-15 적정 실험은 IL-15에 대한 생체 내 반응이, 제한 용량의 IL-15를 sIL-15Rα-Fc와 함께 주입한 경우 약 50 배 증가함을 보였다(도 20C, 20D). 내생 IL-15Rα는 유사한 데이터가 IL-15Rα-/- 숙주로의 T 세포 전달과 함께 적용되므로 필요하지 않았다(도 27).
상기 데이터를 CFSE-표지된 공여 세포에 적용한다. 숙주 세포의 경우, IL-15 또는 sIL-15Rα-Fc 단독 주입은 세포 수에 거의 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, IL-15+sIL-15Rα-Fc의 2 회 주입은 초기 주입 후 3일까지 숙주 MP CD8+ 세포 및 NK 세포의 총수를 현저하게 증가시켰으며 비장은 명백하게 확대되었다(도 21A, 21B). 마찬가지로, BrdU 통합에 의해 측정된 증식은 IL-15 단독보다 IL-15+sIL-15Rα-Fc의 주입이 훨씬 더 컸다(도 21C).
IL-15Rα-/- 마우스는 추정 상 IL-15Rα의 부재가 내생 IL-15의 제공을 제외하기 때문에 CD122hi MP CD8+ 세포 및 NK 세포가 없다(Lodolce et al., Immunity 9:669-76, 1998). 도 21D에 나타낸 바와 같이, IL-15 및 sIL-15Rα-Fc의 혼합물을 IL-15Rα-/- 마우스에게 주입하여 숙주 NK1.1+DX5+NK 세포 및 CD122hi MP CD8+ 세포의 수를 빠르게 복원시켰으며; 사용된 용량에서, IL-15 단독은 효과가 없었다.
상기 생체 내 효과를 이량체성 IL-15Rα-Fc와 착화된 IL-15에 적용시켰다. Fc 성분의 필요 유무를 결정하기 위해서, MP CD8+ 세포의 증식을 유도하는 Fc가 없는 단량체성 IL-15Rα에 의해 생성된 IL-15 복합체의 능력을 생체 내 조건 하에서 시험하였다. 현저하게는, 단량체 IL-15/sIL-15Rα 복합체가 시험관 내 조건 하에 서 이량체성 IL-15/IL-15Rα-Fc 복합체보다 더 높은 MP CD8+ 세포의 증식을 유도하였지만(도 19A), 생체 내 조건 하의 경우는 반대였다(도 22). 따라서, 이량체성 IL-15/sIL-15Rα-Fc 복합체의 효능 있는 활성과 대조적으로, Fc 부분이 고갈된 단량체 IL-15/sIL-15Rα 복합체는 유리 IL-15보다 생체 내 활성이 단지 약간 더 양호함을 나타내었다(도 22). 따라서 상기 수용체의 Fc 부분은 상기 복합체의 생체 내 활성에 중요한 것으로 보인다.
도 20A, 20B, 20C 및 20D는 용해성 IL-15Rα가 생체 내에서 IL-15-매개된 공여 림프구 증식을 증대시킴을 보인다. (A) CFSE-표지된 T 세포를 C57BL/6(B6) 수용자에게 iv 전달하였다. 전달 후 1일 및 2일째에, 상기 수용자에게 PBS, sIL-15Rα-Fc 단독(7 ㎍), IL-15 단독(1.5 ㎍), 또는 sIL-15Rα-Fc+IL-15(1:2 몰 비로, 각각 7 ㎍ 및 1.5 ㎍)를 ip 주입하였다. 상기 공여 세포의 CFSE 희석을 비장에서 4일째에 측정하였다. 관문을 통과한 MP CD8+ 세포에 대한 전형적인 데이터를 나타낸다. (B) 상기 전달된 세포가 LCMV-면역마우스(상부) 대 통상적인 마우스(기부)로부터의 것임을 제외하고 (A)에서와 같다. (C) CFSE-표지된 MP CD8+ T 세포를 통상적인 B6 숙주로 옮기고; 하루 후에, 상기 숙주에게 sIL-15Rα-Fc와 함께 또는 상기 없이 지시된 용량의 IL-15를 주입하고; sIL-15Rα-Fc의 용량을 2:1 몰 비의 IL-15 대 sIL-15Rα-Fc가 주입되도록 변화시켰다. 주입 후 2일째에 비장 중의 공여 MP CD8+ 세포에 대한 CFSE 프로파일을 나타낸다. (D) (C)로부터의 데이터의 편집. A, B 및 C의 경우, 나타낸 데이터는 그룹당 2 마우스를 나타내며 또한 2 개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 21A, 21B, 21C 및 21D는 용해성 IL-15Rα가 IL-15-매개된 숙주 림프구 증식을 증대시킴을 보인다. (A) 통상적인 B6 마우스에게 1일 및 2일째에 도 20A에 나타낸 바와 같이 PBS, sIL-15Rα-Fc 단독, IL-15 단독, 또는 sIL-15Rα-Fc/IL-15를 iv 주입하였다. 3일째에 비장으로부터 회수한 CD8+ MP T 세포, CD4+ MP T 세포 및 NK 세포의 총수를 나타낸다. (B) (A)로부터의 비장을 지시한 바와 같이 촬영하였다. (C) 마우스를 (A)에서와 같이 처리하였으나, 단 상기 마우스에게 1일째에 또한 BrdU를 iv 주입하였고 죽을 때까지 음료수 중에 BrdU를 넣었다. MP CD8+, 고유 CD8+, MP CD4+ 및 NK 세포에 대한 BrdU 염색을 나타낸다. (D) IL-15Rα-/- 마우스에게 PBS, IL-15(0.6 ㎍) 또는 IL-15(0.6 ㎍)/sIL-15Rα-Fc(1 ㎍)를 1, 3, 5 및 7일째에 iv 주입하였다. 데이터는 9일째 비장 세포의 염색을 나타낸다. B, C, D에 대한 전형적인 데이터를 나타낸다. 모든 데이터는 2 개 이상의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 22는 sIL-15Rα-Fc(이량체)가 생체 내 조건 하에서 sIL-15Rα(단량체)보다 더 양호함을 나타낸다. CFSE-표지된 Thy-1.1 MP CD8 세포에게 통상적인 B6 숙주를 주입하고 1 ㎍ IL-15, 1 ㎍ IL-15+5 ㎍ sIL-15Rα-Fc, 또는 1 ㎍ sIL-15Rα-Fc+10 ㎍ sIL-15Rα를 주입하고 이어서 3일째에 분석하였다. 숙주 비장으로부터 회수한 공여 CD8 세포에 대한 CFSE 프로파일을 나타낸다.
도 27은 IL-15Rα-/- 숙주 중의 IL-15/sIL-15Rα-Fc 복합체에 의한 자극을 나타낸다. 정제된 CFSE-표지된 MP CD8+ T 세포를 IL-15Rα-/- 수용자에게 iv 전달하였다. 전달 후 1일째에, 수용자 마우스에게 PBS, sIL-15Rα-Fc 단독(10 ㎍), IL-15 단독(2 ㎍), 또는 sIL-15Rα-Fc+IL-15(각각 10 ㎍ 및 2 ㎍)를 ip 주입하였다. 전달 후 3일째에, 비장 세포를 수확하고 CFSE 희석을 유식 세포측정 분석에 의해 평가하였다.
실시예 11
내생 IL -15의 제공을 차단하지 못하는 sIL -15Rα- Fc
LPS를 마우스에게 주입하면 생체 내에서 비-T 세포에 의한 내생 IL-15(및 IL-15Rα)의 간단한 증가를 일으키며, 결과적으로 IL-15-반응성 CD122hi MP CD8+ 세포의 증식률이 일시적으로 증가하는 것으로 공지되어 있다(Mattei et al., J Immunol 167:1179, 2001; Tough et al., J Exp Med 185:2089, 1997). 상기와 같은 LPS-유도된 방관자 증식을 도 23A에 예시하며, 여기에서 대부분의 공여 MP CD8+ 세포는 통상적인 B6 숙주에서 LPS에 노출 후에 3일까지 1 내지 2 회의 세포 분열을 겪으며, 이는 IL-15Rα-/- 숙주에서 증식이 없음과 대조적이다. 현저하게, LPS 주입 후에 sIL-15Rα의 주입은 sIL-15Rα-Fc(10 ㎍/주입)를 매일 주입하더라도 증식을 감소시키지 못했다. 따라서, sIL-15Rα-Fc의 주입은 내생 IL-15Rα에 결합된 내생 IL-15와 T 세포 접촉을 차단할 수 없었다. 또한, IL-15Rα-/- 숙주의 경우, sIL-15Rα-Fc는, 추정 상 내생 IL-15Rα가 IL-15를 세포 표면으로 운반하는데 필수적이므로, 분명히 상기 내생 IL-15Rα의 결여를 보상할 수 없었다.
유사한 발견을 시험관 내 시스템에 적용하였으며, 상기 시스템에서 MP CD8+ 세포를 먼저 sIL-15Rα-Fc로 코팅하고 이어서 IL-15를 전달한 웰에서 배양한 다음 세척을 통해 결합되지 않은 사이토킨을 제거하였다(도 23B). 따라서, 상기 결합된 IL-15Rα-Fc/IL-15 복합체에 의해 유도된 증식 반응을 차단 시약으로서 용해성(결합되지 않은)IL-15Rα-Fc의 첨가에 의해 억제시킬 수 없었다. 대조적으로, IL-15에 대한 다클론 항체의 첨가는 증식을 완전히 없앴다.
상기 발견을 근거로, IL-15 분자는 단지 IL-15Rα와의 상호작용을 위한 단일 결합 부위만을 갖는다. 일단 상기 부위가 폐색되면, 생체 내에서 세포 상의 내생 IL-15Rα, 또는 시험관 내에서 플라스틱에 부착된 IL-15Rα에 결합시킴으로써 외부 sIL-15Rα-Fc와의 상호작용이 발생하지 못하며 T 세포에의 IL-15의 제공에 대한 간섭이 없다. 이러한 시나리오는 sIL-15Rα가 IL-15에 대한 세포 주의 반응을 차단할 수 있는 이유를 설명하지 못한다(Ruckert et al., J Immunol 174:5507-15, 2005; Wei et al., J Immunol 167:577-82, 2001; Ruchatz et al., J Immunol 160:5654-5660, 1998; Budagian et al., J Biol Chem 279:40368-75, 2004; Mortier et al., J Immunol 173:1681-1688, 2004; Eisenman et al., Cytokine 20:121-29, 2002). 이때 상기 연구는 우리의 연구에서와 같이 마우스 IL-15는 아닌, 인간 또 는 유인원 IL-15를 사용한 것과 상관이 있을 수 있으며, 이는 IL-15의 독특한 종 차이의 가능성을 제기한다. 상기 데이터에 찬성하여, 우리는 MP CD8+ 세포의 경우와 같이, 마우스 IL-15에 대한 마우스 CTLL 세포의 반응이 마우스 sIL-15Rα-Fc에 의해 향상된다는 것을 발견하였다(도 28A). 대조적으로, 다른 발견들을 확인한 결과(Ruckert et al., J Immunol 174:5507-15, 2005; Wei et al., J Immunol 167:577-82, 2001; Ruchatz et al., J Immunol 160:5654-5660, 1998; Budagian et al., J Biol Chem 279:40368-75, 2004), 인간 IL-15에 대한 CTLL 세포의 높은 반응(Eisenman et al., Cytokine 20:121-29, 2002)은 마우스 sIL-15Rα-Fc에 의해 강하게 억제되었다(도 28B). 대조용으로서 IL-2에 대한 CTLL 반응은 sIL-15Rα-Fc의 첨가에 의해 영향을 받지 않았다(도 28C).
상기 발견들은 쥐 sIL-15Rα 구조물이 NK 세포 증식(Nguyen et al., J Immunol 169:4279-87, 2002) 및 생체 내에서 항원-구동된 T 세포 반응(Ruckert et al., Eur J Immunol 33:3493-3503, 2003; Ruckert et al., J Immunol 174:5507-15, 2005; Wei et al., J Immunol 167:577-82, 2001; Ruchatz et al., J Immunol 160:5654-5660, 1998)에 대해 억제성이라는 보고를 설명하지 못한다. 이러한 모순은 아직 해결되지 못하고 있지만, 생체 내에서 특이적인 펩타이드에 대한 고유 OT-1 TCR 트랜스제닉 CD8+ 세포의 항원-특이적 증식 반응은 sIL-15Rα-Fc의 공동주입에 의해 차단되지 않았으며, 상기 반응들은 sIL-15R 및 IL-15의 혼합물을 주입한 경우 상당히 향상되었음은 흥미롭다(도 28D). 아직까지, 우리는 생체 내 반응을 차단하 는데 필요한 매우 큰 용량의 sIL-15Rα, 즉 NK 세포 증식의 경우 400 ㎍/주입(Nguyen et al., J Immunol 169:4279-87, 2002)을 사용하지 않았다. 또한, 가능하게는 생체 내에서 sIL-15Rα에 의한 억제를 보이는 연구들이 세균에서 증식한 구조물을 사용한 반면, 우리의 구조물은 포유동물 세포에서 증식되었음이 관련된다.
도 23A 및 23B는 IL-15Rα에 의해 고정화된 IL-15에 대한 증식이 용해성 IL-15Rα-Fc에 의해 차단될 수 없음을 나타낸다. (A) CFSE-표지된 T 세포를 Thy1-동종 B6 또는 IL-15Rα-/- 숙주에 iv 주입하였다. 하루 후에, 마우스에게 PBS 또는 500 ng의 LPS를 ip 주입하였다. 지시한 바와 같이, 마우스를 또한 LPS 주입일에 시작하여 매일 10 ㎍의 sIL-15Rα-Fc로 ip 처리하였다. LPS 주입 후 3일째에, 마우스를 죽이고, MP CD8+ T 세포의 CFSE 희석을 평가하였다. (B) 96-웰 플레이트를 10 ㎍/㎖의 sIL-15Rα-Fc로 밤새 예비 코팅하였다. 이어서 플레이트를 세척하고 37도에서 1 시간 동안 1 ㎍/㎖의 IL-15와 함께 배양하였다. 그 후에, 플레이트를 세척하고 5 x 10 MP CD8+ T 세포를 1) 10 ㎍/㎖ sIL-15Rα-Fc, 2) 10 ㎍/㎖의 다클론 항-IL-15 항체, 또는 3) 대조용 배지와 함께 가하고; 추가적인 대조군으로서, 유리 IL-15(32 ng/㎖)를 일부 웰에 가하였다. 데이터는 3일째에 3 회 중복 배양물에 대한 [3H]-티미딘 통합의 평균 수준(SD)을 나타낸다.
도 28A, 28B, 및 28C는 마우스 대 인간 IL-15에 대한 반응들에 대한 sIL-15Rα-Fc의 차단 효과를 나타낸다. (A, B, C) CTLL-2 세포를 (A) 쥐 IL-15, (B) 인간 IL-15, 또는 (C) 쥐 IL-2와 함께 2일간 배양하였다. 지시된 바와 같이, 배양물에 1 ㎍/㎖의 쥐 sIL-15Rα-Fc를 보충하였다. [3H]-티미딘을 최종 배양 24 시간 동안 가하였다. 데이터는 삼중 중복 배양물에 대한 [3H]-티미딘 통합의 평균 수준(±SD)을 나타낸다. (D) 백만 개의 OT-1 세포(Thy1.1 동종)를 -1일째에 B6 수용 마우스에게 iv로 채택 전달하였다. 0일째에, 마우스를 백만 SIINFEKL-펄스 수지상 세포로 iv로 백신접종하였다. 1 내지 7일째에, 수용 마우스에게 PBS, sIL-15Rα-Fc 단독(5 ㎍), IL-15 단독(1 ㎍), 또는 sIL-15Rα-Fc+IL-15(각각 5 ㎍ 및 1 ㎍)를 매일 ip 주입하였다. 8일째에, 비장을 수확하고, 카운트하고, 공여 OT-1 세포에 대해 유식 세포측정 분석에 의해 평가하였다. 데이터는 사이토킨 또는 수용체 처리 없이 백신접종에 대한 OT-1 세포의 절대 수의 배 증가를 나타낸다. 모든 데이터는 2 개 이상의 독립적인 실험을 나타낸다.
실시예 12
IL -2 + IL -2Rα에 의한 자극
IL-15의 생물 활성이 용해성 IL-15Rα에의 결합에 의해 향상되었다는 관찰은 필적할만한 발견을 IL-2 및 IL-2Rα(CD25)에 적용할 수 있는 지의 여부에 대한 문제를 제기하였다. 도 24에 나타낸 바와 같이, 이는 분명히 그 경우가 아니었다. 따라서, 시험관 내에서 마우스 IL-2에 대한 MP CD8+ 세포의 증식 반응은 용해성 IL-2Rα의 첨가에 의해 현저하게 억제되었다(도 24A 좌측, 24B). 유사한 억제를 인간 IL-2 및 용해성 인간 IL-2Rα에 상응하는 MP CD8+ 세포(마우스)에 적용하였다(도 24A 우측).
따라서, 용해성 IL-15Rα는 IL-15의 작용을 강화한 반면, 용해성 IL-2Rα는 IL-2의 작용을 차단하였다.
도 24A 및 24B는 용해성 IL-2Rα가 IL-2 매개된 증식을 억제함을 보인다. (A) 정제된 CFSE-표지된 MP CD8+ T 세포를 도시된 농도에서 쥐 IL-2 또는 인간 IL-2와 함께 배양하였다. 지시된 바와 같이, 2.5 ㎍/㎖의 용해성 쥐 IL-2Rα 또는 용해성 인간 IL-2Rα를 배양물에 가하였다. CFSE 희석을 3일째에 평가하였다. 전형적인 데이터를 나타낸다. (B) 정제된 MP+ CD8 T 세포를 적정 량의 쥐 IL-2와 함께 용해성 mIL-2Rα(2.5 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하에서 배양하였다. 데이터는 3일째에 3회 중복한 배양물에 대한 [3H]-티미딘 통합의 평균 수준(±SD)을 나타낸다.
실시예 13
IL -15 및 IL -15Rα의 용해성 복합체가 용해성 IL -15 단독보다 더 자극성이다
상기 실험으로부터 주요 결론은 IL-15 및 IL-15Rα의 용해성 복합체가 생체 내 및 시험관 내에서 용해성 IL-15 단독보다 훨씬 더 자극성이라는 것이다. IL-15/IL-15Rα 상호작용에 대한 구조적 연구 없이, 단지 상기 상호작용이 IL-15 작용을 강화하는 이유 및 방법을 추측할 수 있을 뿐이다. 여러 가지 가능성이 있다.
먼저, IL-15에 대한 IL-15Rα의 결합은 T 세포에 의한 IL-15 내면화를 손상 시킬 수도 있으며 이에 의해 βγc 수용체를 통한 신호전달이 강화될 수 있다. 이러한 생각은 몇몇 사이토킨, 예를 들어 IL-2의 내면화가 수용체 신호전달을 약화시키는 작용을 한다는 보고와 일치한다(Chagn et al., J Biol Chem 271:13349-55, 1996). 그러나, 우리는 2 가지 이유로 상기 가능성을 지지하지 않는다. 먼저, IL-15/sIL-15Rα 복합체에 의한 강한 자극이 감소된 IL-15 내면화를 반영한다면, IL-15의 수용체인 CD122의 내면화의 병행 감소를 볼 수 있을 것이 예상된다. 그러나, 세포 표면으로부터의 하향조절에 의해 측정된 바와 같이, 정반대로 적용된다, 즉 IL-15 단독에 의한 것보다는 IL-15/sIL-15Rα 복합체에 의한 CD122의 하향조절이 더 크다(데이터 도시 안 됨). IL-15 내면화를 방지하는 IL-15/sIL-15Rα 복합체에 대한 두 번째 요지는, 이것이 그 경우라면, 우리는 IL-2/sIL-2Rα에 대해서도 유사한 발견을 봐야할 것이나, 그렇지 않았다. 따라서, IL-2/IL-2Rα 복합체가 용해성 IL-2 단독보다 훨씬 덜 자극성이었으며, 이는 IL-15Rα/IL-15 복합체가 IL-15 단독보다 더 자극성이라는 것과 명백히 대조적이다.
sIL-15Rα가 IL-15 활성을 어떻게 강화시키는 가에 대한 두 번째 가능성은 sIL-15Rα가 IL-15의 분해를 방지할 수도 있다는 것이다. 이러한 개념은 IL-15 작용에 대한 sIL-15Rα-Fc의 향상 효과가 시험관 내에서보다 생체 내에서 더 현저하기 때문에 고려할만하다. 이때, 항체 또는 용해성 수용체에 대한 몇몇 사이토킨의 결합을 생체 내 사이토킨 생존을 연장시킬 수 있음은 주목할만하다(Finkelman et al., J Immunol 151:1235-44, 1993; Ma et al., J Pharmacol Exp Ther 279:340-50, 1996; Peters et al, J Exp Med 183:1399-1406, 1996; Rosenblum et al., Cancer Res 45:2421-24, 1985; Peleg-Shulman et al., J Biol Chem 279:18046-18053, 2004; Kobayashi et al., Cytokine 11:1065-75, 1999). 따라서, IL-15에 대한 sIL-15Rα-Fc 결합은 IL-15의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있다. 그러나, 현저하게는, 우리는 시험관 내에서 IL-15 반감기의 증가를 관찰하지 못했다.
상기에 비추어, 우리는 세 번째 가능성, 즉 IL-15Rα가, IL-15에서의 형태 변화(상기 βγc 수용체와의 상호작용을 증대시키고, 따라서 IL-15를 작용물질에서 초작용물질로 변화시킨다)를 유도함으로써 IL-15의 작용을 개선시킴을 지지한다. 상기 모델은 IL-15/IL-15Rα 상호작용의 친화성이 IL-2/IL-2IRα 상호작용의 경우보다 훨씬 더 높은 것과 일치하며(Fehniger and Caligiuri, Blood 97:14-32, 2001; Van Belle and Grooten, Arch Immunol Ther Exp(Warz) 53:115-26, 2005) IL-2와 달리, IL-15가 세포-회합된 사이토킨과 같이 작용하는 이유를 설명한다. 상기 생각의 직접적인 시험은 분명히 구조적 연구를 필요로 할 것이다. 이에 관하여, IL-15와 IL-15Rα간의 상호작용은 다른 사이토킨/사이토킨 수용체 복합체에서 발견되지 않는 이온성 상호작용의 독특한 네트워크를 수반함을 알 수 있다(Lorenzen et al., J Biol Chem, 2005, E-pub ahead of print). 상기 독특한 상호작용이 IL-15의 형태 변화를 생성시키는 지의 여부는 아직 결정되지 않았다.
IL-15가 T 세포 생전 및 기억 발생에 유리한 영향을 미치며, 또한 조사 및 다른 형태의 세포감소 후에 T 세포 풀의 복원 가능성을 갖는다는 증거는 누적되어 있다(Becker et al., J Exp Med 195:1541-48, 2002; Zhang et al., Immunity 8:591-99, 1998; Waldmann, T.A., J Clin Immunol 22:51-56, 2002; Zeng et al., J Exp Med 201:139-48, 2005; Van Belle and Grooten, Arch Immunol Ther Exp(Warz) 53:115-26, 2005; Schluns et al., Int J Biochem Cell Biol 37:1567-71, 2005; Lodolce et al., J Exp Med 194:1187-94, 2001; Rubinstein et al., J Immunol 169:4928-35, 2002; Diab et al, Cytotherapy 7:23-35, 2005). 여기에 나타낸 바와 같이, 치료 시약으로서 IL-15의 생물 활성은 예비형성된 용해성 IL-15/IL-15R 복합체의 투여에 의해 상당히 향상될 수 있다.
실시예 14
물질 및 방법
마우스
C57BL/6(B6), B6.Ly5.1, B6.Thy1.1 및 OT-1 마우스를 잭슨 연구소(Bar Harbor, ME)로부터 구입하였다. IL-15Rα-/- 마우스(Lodolce et al., Immunity 9:669-76, 1998)는 애버릴 마(Averil Ma)(University of California, San Francisco)의 관대한 선물이었으며, IL-7 트랜스제닉(tg) 마우스(Mertshing et al., Int Immunol 7:401-14, 1995)는 제이 앤더슨(J. Andersson)(Basel Institute, Switzerland)의 관대한 선물이었다. P14 TCR tg 마우스는 친절하게도 제이 린제이 휘튼(J. Lindsay Whitton)(Scripps Research Institute)에 의해 제공되었다. IL-15Rα-/-, IL-7 tg, P14 및 OT-1 TCR tg 마우스를 모두 B6 배경 상에서 유지시켰으 며 일부 실험의 경우 B6.Ly5.1 또는 B6.Thy1.1 마우스에 교배시켰다. IL-15Rα-/- 마우스를 IL-7 tg 마우스에 교배시켜 IL-7 tg/IL-15Rα-/- 마우스를 생성시켰다. 우리가 IL-7 tg/IL-15-/- 마우스에 대해 앞서 개시한 바와 같이(Kieper et al., J Exp Med 195:1533-39, 2002), IL-7 tg/IL-15Rα-/- 마우스는 IL-7 tg 마우스와 유사한 큰 수의 CD122hi MP CD8+ T 세포를 갖는다.
재조합 단백질
쥐 sIL-15Rα-Fc, 인간 sIL-15Rα-Fc, 및 인간 IL-2Rα를 R&D 시스템스(Minneapolis, MN)로부터 구입하였다. 단량체성 sIL-15Rα 및 마우스 IL-2Rα를 예비이형제로서 R&D 시스템스로부터 구입하였다. 단량체성 sIL-15Rα를 이량체성 sIL-15Rα의 효소 절단에 의해 생성시켰다. 우리는 항-IL-15Rα 다클론 항체(AF551 및 BAF551, R&D 시스템스)를 사용하여 웨스턴 블럿에 의해 완전한 절단을 확인하였다(데이터 도시 안 됨). 재조합 사이토킨(마우스 IL-15, 인간 IL-15, 마우스 IL-2, 인간 IL-2, 마우스 IL-4, 및 마우스 GM-CSF 포함)을 이바이오사이언스(Ebioscience) 및/또는 R&D 시스템스로부터 구입하였다.
T 세포의 단리 및 CFSE 표지화
적합한 수의 세포를 수득하기 위해서, 대부분의 실험에서 MP CD8+ 세포를 IL-7 트랜스제닉 마우스로부터 제조하였다. 모든 매개변수에 의해 IL-7 tg 마우스 로부터 시험된 MP CD8+ 세포는 통상적인 마우스로부터의 세포와 동일하다. 더욱이, IL-15/sIL-15Rα-Fc 복합체에 대해 여기에서 보고된 주요 발견들은 또한 생체 내 및 시험관 내 모두에서, 통상적인 마우스로부터 제조된 세포의 경우에도 또한 관찰되었다. 시험관 내 또는 채택 전달 실험에 사용된 MP CD8+ T 세포를 LN 및 비장으로부터 단리하였으며, 세포 분류에 의해 정제하였다. 간단히, 단일 세포 현탁액을 먼저 마우스 T 세포 농축 컬럼(MTCC-25, R&D systems, Minneapolis, MN)을 사용하여 CD3+ T 세포에 대해 농축시켰다. 농축된 T 세포를 항체로 표지하고 CD8+ CD44hi T 세포에 대한 세포 분류에 의해 정제하였다. 일부 실험에서, 우리는 유사한 프로토콜을 사용하였고 CD8+CD44lo, CD4+CD44hi, NK1.1+/DX5+ 세포를 단리하였다. 세포 분류를 BD FACSAria를 사용하여 수행하였다. 분류된 세포의 정제를 통상적으로 시험하였으며 98% 이상이었다. 일부 실험에서, 전체 T 세포 또는 OT-1 세포를 공여 림프구로서 사용하였다. 이들 실험의 경우, 비장 및 LN으로부터의 세포를 마우스 T 세포 농축 컬럼(MTCC-25)을 사용하여 정제하였다. CFSE-표지된 세포를 사용하는 실험의 경우, T 세포를 제조사의 지사에 따라 1.5 ㎛ CFSE(Molecular Probes, Eugene, OR)로 표지하였다.
항원-특이적 CD8+ T 세포의 생성
우리는 P14 TCR tg CD8 T 세포(LCMV gp33 펩타이드를 인식한다) 및 LCMV 감 염의 채택 전달에 따른 항원-특이적 기억 T 세포를 생성시켰다. 간단히, 5 x 104 P14 TCR 트랜스제닉 CD8+ T 세포를 Thy1 동종 IL-7 tg 수용 마우스로 채택 전달하였다. 24 시간 후에, 머으스에게 2 x 105 플라크-형성 단위의 LCMV 암스트롱 균주를 제공하였다. 바이러스 감염 2 개월 후에 T 세포를 마우스 T 세포 농축 컬럼(MTCC-25)을 사용하여 단리하고, CFSE로 표지하고, Ly5 동종 수용 마우스로 채택 전달하였다. 공여 P14 CD8+ T 세포(Thy1.1)는 상기 공여 CD8+ T 세포(Ly5.2) 집단의 15 내지 20%를 차지한다.
시험관 내 분석
모든 배양을 10% FCS, 글루타민, 2-ME, 불필수 아미노산, 및 항생제로 보충한 RPMI 1640에서 수행하였다. FACS-정제된 T 세포 및 NK 세포를 상술한 바와 같이 단리하였다. CTLL(CTLL-2) 세포를 ATCC(Manassas, VA)로부터 수득하고, 쥐 IL-2가 보충된 RPMI 배지에서 배양하였다. FACS-정제된 림프구를 사용한 실험을 위해서, 200 ul의 5 x 104 세포를 96웰 플레이트 중의 웰에 도말하였다. 사이토킨 및/또는 용해성 수용체를 도면 및 도면 설명에 개시한 농도로 가하였다. CD122 차단 실험을 위해서, 우리는 정제된 항-CD122 항체(TM-β1(NA/LE), BD Pharmingen)를 사용하였다. 플레이트-결합된 IL-15를 차단하는 실험을 위해서, 다클론 항-IL-15 항체(AF447, R&D systems)를 사용하였다. CTLL 세포를 사용하는 실험을, 웰당 2 x 104 세포를 사용함을 제외하고, FACS-정제된 림프구와 같이 도말하였다. [3H]-티미딘을 사용한 증식 실험을 위해서, 1 μCi/㎖을 도면 설명에서 지시한 바와 같이 가하였다. 세포를 3 회 중복 웰에서 배양하였다.
생체 내 분석
채택 전달된 세포의 증식을 평가하는 실험을 위해서, T 세포를 단리하고 CFSE로 표지하고(상술한 바와 같이) 이어서 Ly5 또는 Thy1 동종 수용 마우스에 iv 주입하였다. 숙주 세포의 증식을 측정하는 실험에서, 마우스에게 BrdU(2 ㎎)를 iv 주입하고 이어서 상술한 방법을 사용하여 BrdU 음료수(0.8 ㎎/㎖) 상에서 유지시켰다(Judge et al., J Exp. Med 196:935-46, 2002). 사이토킨 및 용해성 수용체의 주입을 위해서, IL-15 및 sIL-15Rα-Fc를 37 ℃에서 20 분간 함께 배양하였다. 이어서 샘플들을 마우스에게 주입 전에 500 ul 부피의 PBS로 10 배 이상 희석하였다. 대조용 조건 하에서, 사이토킨 또는 수용체 단독을 또한 37 ℃에서 20 분간 배양하였다. LPS(ALX-581-008, Alexis Biochemicals, San Diego, CA)를 PBS 중에서 ip 주입하였다. 백신접종 실험을 위해서, 수지상 세포를 GM-CSF 및 IL-4와 골수 세포의 배양에 의해 앞서 개시한 바와 같이 제조하였다(Rubinstein et al., J Immunol 169:4928-35, 2002). 수지상 세포를 2 시간 동안 37 ℃에서 SIINFEKL 펩타이드로 펄스처리하고, 세척하고, iv 주입하였다.
유식 세포측정 분석
세포를 표준 프로토콜을 사용하여 유식 세포측정 분석에 의해 분석하였다. 간단히, 세포를 1% FCS 및 2mM EDTA를 함유하는 FACS 완충액으로 세척하고, 항체의 조합들: CD8-PerCP-Cy5.5, -APC, 또는 -APC-Cy7(53-6.7, eBioscience and BD Pharmingen), CD49b-PE 및 -APC(DX5, eBioscience), NK1.1-FITC 및 -PE(PK136, BD Pharmingen), CD3-PE, -PerCP-Cy5.5, -PE-Cy7, 또는 -APC(145-2C11, eBioscience and BD Pharmingen), CD3-Pacific Blue(500A2, BD Pharmingen), CD4-DE, PE-Cy7, 또는 -APC(RM4-5, eBioscience and BD Pharmingen), Ly5.1-FITC, -PE, -PE-Cy7 및 -APC(A20, eBioscience and BD Pharmingen), Ly5.2-FITC, -PE, -PerCP-Cy5.5, 및 -APC(104, eBioscience and BD Pharmingen), Thy1.1-FITC, PE, -PE-Cy7, 및 -APC(HIS51, eBioscience), Thy1.2-FITC, PE, 및 -APC(53-2.1, eBioscience), CD44-FITC-APC, 및 -Alexa Fluor 405(IM7, eBioscience and Caltag Laboratories(Burlingame, CA)), CD122-PE(TM-β1, BD Pharmingen), B220-PerCP-Cy5.5(RA3-6B2, BD Pharmingen), 및 TCR Vα2-PE(B20.1, BD Pharmingen)로 염색하였다. BrdU 세포 내 염색을 제조사의 지시에 따라 FITC 또는 APC BrdU 플로우 키트(559619 및 552598, BD Pharmingen)로부터의 시약을 사용하여 수행하였다. 유식 세포측정 샘플을 BD LSR II 디지털 유식 세포측정기(BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 분석하였다. 데이터를 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, San Carlos, CA)를 사용하여 분석하였다.
실시예 15
물질 및 방법
마우스
C57BL/6(B6), B6.PL(Thy1.1-동종), IL-2+/- 및 CD25+/- 마우스(모두 B6 배경)를 더 잭슨 레보라토리(Bar Harbor, ME)로부터 구입하였다. IL-7 트랜스제닉(tg) 마우스 및 P14 tg 마우스(모두 B6 배경)를 Thy1.1-동종 배경 상에서 번식시켰다(Kieper et al., J Exp Med 195:1533, 2002; Pircher et al., Nature 351:482, 1991). B6 배경 상의 IL-5-/- 마우스를 포함하여 이들 모든 마우스를 우리의 동물 시설에서 유지시키고 3 내지 6 개월의 월령으로 사용하였다. IL-2-/- 및 CD25-/- 마우스를 이형접합체 종축으로부터 번식시키고 더 잭슨 레보라토리의 웹사이트상에 제공된 표준 PCR 프로토콜에 의해 선별하였다(Judge et al., J Exp Med 196:935, 200). 동물의 사용을 수반하는 실험들은 TSRI에 있는 동물실험윤리위원회에 의해 승인되었다.
유식 세포측정 및 세포 분류
비장 또는 모은(서혜부, 겨드랑이, 경부 및 장간막) LN 세포의 현탁액을 표준 프로토콜에 따라 준비하고 하기의 mAb(달리 나타내지 않는 한 BD Bioscience로부터의 것): Alexa Fluor 405-접합된 B220(RA3-6B2, Caltag Laboratories); PerCP-Cy5.5-접합된 CD3(145-2C11); Alexa Fluor 405-접합된 CD4(RM4-5, Caltag Laboratories); PerCP-Cy5.5- 또는 APC-Cy7-접합된 CD8α(53-6.7); PE-접합된 CD8β(H35-17.2); FITC- 또는 PE-접합된 CD25(PC61.5); APC-접합된 CD44(IM7, eBioscience); APC-접합된 CD90.1(H1S51, eBioscience); FITC- 또는 PE-접합된 CD122(TM-β1 또는 한편으로 5H4); 및 PE-접합된 Foxp3(FJK-16s, eBioscience)와 함께 1% FCS 및 2 mM EDTA를 함유하는 PBS를 사용하여 FACS(등록상표) 분석 또는 분류를 위해 염색하였다. 세포 내 Foxp3 염색을 제조사의 권장사항에 따라 수행하였다. 간단히, 세포를 먼저 세포 표면 마커에 대해 염색하고, 이어서 2% 파라폼알데하이드를 사용하여 고정시키고, 세포 내 염색 전에 사포닌을 사용하여 침투성으로 만들었다. 유식 세포측정 샘플을 BD LSR II 디지털 유식 세포측정을 사용하여 분석하였다. 세포 분류를 BD FACS Aria를 사용하여 수행하였다. 상기 샘플들의 정제를 분류 후에 통상적으로 시험하였으며 98% 이상이었다.
T 세포 전달 및 사이토킨 및 항체의 생체 내 투여
FACS(등록상표)-분류된 기억-표현형(MP) CD44hi CD122hi CD8+ T 세포(>98% 순수)를 야생형(WT) B6.PL, Thy1.1 동종 배경 상의 IL-7 tg 마우스, 또는 지시된 경우 CD25-/- 마우스의 비장 또는 모은 LN으로부터 수득하였으며; 시험된 모든 매개변수들에 의해, IL-7 tg 마우스로부터 MP CD8+ 세포를 통상적인 B6(또는 B6.PL) 마우스로부터 준비한 세포의 (훨씬 더 작은) 집단과 분간할 수 없었다. 분류된 MP CD8+ 세포에게 1-2 x 106 세포/마우스를 iv 주입하였다. rmIL-2를 eBioscience로부터 구입하고 제조사의 권장에 따라 분류하였다. S4B6.1 하이브리도마(래트 IgG2a)를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)으로부터 수득하고 표준 조건(하기 참조) 하에서 시험관 내에서 배양하고 분비된 mAb를 배양 상등액으로부터 수득하였다. 비교를 위해서, S4B6 IL-2 mAb를 또한 BD Bioscience로부터 구입하였다. 상기 IL-2 mAbs JES6-1A12(래트 IgG2a) 및 JES6-5H4(래트IgG2b)를 eBioscience로부터 구입하였다. S4B6 IL-2 mAb의 F(ab')2 제제를 BD Bioscience로부터 맞춤 정렬하고, 비 환원 조건 하에서 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤 상에서 실행시켜 절단을 확인하고, rmIL-2를 중화시키는 능력에 대해 시험관 내에서 시험하였다(도 12B).
채택 세포 전달일에서 출발하여, 연령- 및 성-부합된 마우스에게 PBS, 동형-부합된 항체(각각 래트 IgG2a 또는 래트 IgG2b), 1.5 ㎍ rmIL-2, S4B6(도 2를 제외하고, 50 ㎍), 50 ㎍ S4B6 + 10 ㎍ CD122 mAb(TM-β1), 50 ㎍ JES6-1A12, 50 ㎍ JES6-5H4, 1.5 ㎍ rmIL-2 + S4B6(도 8D의 경우를 제외하고, 50 ㎍), 1.5 ㎍ rmIL-2 + 50 ㎍ JES6-1A12 또는 1.5 ㎍ rmIL-2 + 50 ㎍ JES6-5H4를 매일 ip 주입하였다. 재조합 인간 IL-2(rhIL-2)를 사용하는 실험을 위해서, rhIL-2 및 인간 IL-2 mAb(MAB602, 클론 5355)를 R&D 시스템스로부터 구입하였다. rmIL-2에 대해 상술한 바와 같이, 마우스에게 동형-부합된 대조용 항체(마우스 IgG2a), 1.5 ㎍ rhIL-2, 50 ㎍ MAB602 hIL-2 mAb 또는 1.5 ㎍ rhIL-2 + 50 ㎍ MAB602 hIL-2 mAb의 혼합물을 매일 ip 주입하였다. rmIL-4를 사용하는 실험을 위해, rmIL-4를 eBioscience로부터 구입하고 제조사의 권장에 따라 보관하였다. 항-마우스 IL-4 mAb MAB404(클론 30304, 래트 IgG1)를 R&D 시스템스로부터 수득하고, 제 2 항-마우스 IL-4 mAb 11B.11(래트 IgG1)이 NCI BRB 임상전 저장소(Rockville, MD)로부터 제공되었다. IL-2에 대해 상술한 바와 같이, 마우스에게 동형-부합된 대조용 항체(래트 IgG1), 1.5 ㎍ rmIL-4, 50 ㎍ IL-4 mAb 또는 1.5 ㎍ rmIL-4 + 50 ㎍ IL-4 mAb의 혼합물을 2일마다 ip 주입하였다. 채택 세포 전달 후 7일째에, 비장 및 LN 세포를 상술한 바와 같이 유식 세포측정에 의해 분석하였다.
항원-특이성 기억 CD8+ 세포의 생성
TCR tg CD8+ 세포(림프구성 맥락 수막염 바이러스(LCMV) gp33-41 에피토프를 인식한다)를 갖는 Thy1.1-표지된 P14 마우스를 공여체로서 사용하였다. 상기 마우스로부터의 비장 세포를, ∼95% 순수한 CD8+ Thy1.1 세포(∼90% Vα2+ 및 따라서 TCR tg이었다)를 수득하기 위해서, 앞서 개시한 바와 같이, 보체 + 심장 안정성 항원(J11d)에 대한 mAb, CD4(RL172) 및 MHC-II mAb(28-16-8s)로 처리하였다(Kosaka et al., J Exp Med 176:1291, 1992). 이어서 상기 정제된 세포를 5 x 104 세포/마우스로 B6(Thy1.2)에 채택 전달하고, 상기 마우스에게 세포 전달 후 1일째에 2 x 105 플라크-형성 단위의 LCMV 균주 암스트롱을 ip 제공하였다. 이어서 마우스를 >2 개월간 방치시켜 CD8+ 기억 세포를 생성하도록 하였다. 이 시점에서, CD8+ 세포를 상술한 바와 같이 보체 + mAb에 의해, 또는 한편으로 CD122hi CD44hi CD8+ 세포에 대한 FACS(등록상표)-분류에 의해 비장으로부터 정제시켰다. 이어서 ∼16-20% Thy1.1+ Vα2+ LCMV-특이성 기억 T 세포를 함유하는 정제된 CD8+ 세포를 CFSE 표지하고 B6(Thy1.2) 마우스에 10-15 x 106 세포/마우스로 채택 전달하고, 후속적으로 상기 마우스에게 PBS, 1.5 ㎍ rmIL-2, 50 ㎍ S4B6 IL-2 mAb 또는 1.5 ㎍ rmIL-2 + 50 ㎍ IL-2 mAb를 매일 ip 주입하였다. 채택 세포 전달 후 7일째에, 비장 및 LN 세포를 상술한 바와 같이 유식 세포측정에 의해 분석하였다.
생체 내 세포 턴오버의 측정
생체 내 세포의 증식을 음료수 중에 제공된 염료 CFSE의 희석 또는 브로모데옥시유리딘(BrdU)(0.8 ㎎/㎖)을 사용하여 측정하였다(Kieper et al., J Exp Med 195:1533, 2002; Tough et al., J Exp Med 179:1127, 1994). CFSE 염색을 하기와 같이 수행하였다: 세포를 1% FCS를 함유하는 PBS에 10-20 x 106 세포/㎖로 재현탁시키고, 1 ㎕의 5 mM Vybrant CFDA SE 세포 추적 키트(Molecular Probes)/세포 현탁액 밀리리터로 37 ℃에서 10 분간 염색하고, 이어서 1% FCS를 함유하는 빙냉 PBS로 2 회 세척하였다. BrdU에 대한 세포 내 염색을 제조사의 권장에 따라 BD Biosciences로부터 FITC BrdU 키트를 사용하여 수행하였다.
시험관 내 증식
MP CD8+ 세포를 B6 또는 CD25-/- 마우스로부터 유식 세포측정에 의해 분류하였다. CD3-활성화된 세포의 경우, CD8+ 세포를 MACS(등록상표) CD8+ T 세포 단리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 어린 B6 마우스의 모은 LN로부터 정제시켰으며; 상기 세포는 >95% CD8+이고 ∼90% CD44lo 고유 세포로 이루어졌다. 한편으로, 세포를 FACS(등록상표)를 사용하여 정제시켜 >99% 순수한 CD44lo CD8+ 세포를 수득하였 다. 이어서 상기 정제된 CD8+ 세포를 플레이트-결합된 CD3 mAb(145-2C11, eBioscience)를 사용하여 활성화하였다. 지시된 경우, 고정된 농도(10 ㎍/㎖)의 동형-부합된 대조용 mAb, CD25 mAb(PC61.5, eBioscience) 또는 CD122 mAb(TM-β1, BD Biosciences)를 상기 세포에 가한 후에 이들을 IL-2/IL-2 mAb 복합체와 혼합하였다. 세포를 96-웰 플레이트에서 웰당 5 x 104 세포로 시딩하고, 적정 농도의 rmIL-2 + 동형-부합된 대조용 mAb, rmIL-2 + S4B6 IL-2 mAb, 또는 rmIL-2 + JES6-1A12 IL-2 mAb의 복합체를 상기 웰에 가하였다. 상기 rmIL-2/IL-2 mAb 복합체는 상기 두 성분 중 어느 하나의 과잉을 피하기 위해 정확히 2:1 몰 비였다. 세포를 표준 조건(37 ℃, 7% CO2, 가습 분위기) 하에서 3일간 배양하였다. [3H]-티미딘(1 μCi/㎖)을 최종 16 시간 동안 가하고, 세포 증식을 액체 섬광 카운터(Harvester 96, Tomtec) 상에서 [3H]-티미딘 통합을 측정하여 평가하였다.
골수 재건
골수(BM) 세포를 통상적인 B6 마우스로부터 수득하고, 처리하지 않고 방치시키거나 또는 보체 + CD4(RL172) 및 CD8(3.168)에 대한 mAb를 사용하여 T 세포를 고갈시켰으며, BM 중의 95% 이상의 성숙한 T 세포가 제거되었다. 수용 B6 마우스에게 1000 cGy를 조사한 후에 각각 분리되지 않거나 또는 T 세포-고갈된 BM 세포 5-10 x 106 을 iv 주입하였다. 후속적으로, PBS, 1.5 ㎍ rmIL-2, 8 ㎍ S4B6 IL-2 mAb 또는 1.5 ㎍ rmIL-2 + 8 ㎍ S4B6 IL-2 mAb를 ip 제공하였다. 채택 전달 후 8일째 에 비장 세포를 염색하고 유식 세포측정에 의해 분석하였다.
효소 결합된 면역흡수 분석(ELISA)
표준 IL-2 샌드위치 ELISA를 eBioscience 쥐 IL-2 ELISA 키트를 사용하여 제조사의 권장에 따라 수행하였다. 간단히, 편평 바닥 96-웰 플레이트를 정제된 JES6-1 "포착" mAb로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 이어서 상기 플레이트를 격렬히 세척한 후에 rmIL-2를 상기 웰에 가하고 실온에서 2 시간 동안 배양시켰다. 후속적으로, 상기 플레이트를 격렬히 세척한 다음, 실온에서 1 시간 동안 비오틴화된 JES6-5 "검출" mAb를 가하였다. 지시된 경우, 적정 농도(100 ㎍/㎖에서 출발하여 5 배 희석)의 정제된 대조용 mAb, 정제된 JES6-1, 정제된 JES6-1, 또는 정제된 S4B6 IL-2 mAb를 검출 mAb와 함께 가하였다. 후속적으로, 상기 플레이트를 격렬히 세척한 후에 실온에서 30 분간 스트렙트아비딘-접합된 양고추냉이 퍼옥시다제를 가하였다. 이어서 상기 샘플들을 기질 o-페닐렌다이아민을 사용하여 전개시키고, 상기 반응을 2N H2SO4로 멈춘 후에, 450 ㎚에서 ELISA 판독기(Spectramax Plus 384, Molecular Devices)로 분석하였다.
물리적 성질, 예를 들어 분자량 또는 화학적 성질, 예를 들어 화학식에 대해 본 발명에 범위가 사용된 경우, 상기 범위 및 구체적인 실시태양들의 모든 조합 및 하위조합들을 포함하고자 한다.
본 문헌에 인용되거나 개시된 각각의 특허, 특허 출원 및 공보의 내용은 본 발명에 내용 전체가 참고로 인용되어 있다.
당해 분야의 숙련가들은 다수의 변화 및 변경들을 본 발명의 실시태양에 대해 수행할 수 있으며 상기와 같은 변화 및 변경들을 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 수행할 수 있음을 알 것이다. 따라서, 첨부된 청구의 범위는 본 발명의 진의 및 범위 내에 있는 모든 상기와 같은 동등한 변화를 포함하고자 한다.

Claims (91)

  1. 포유동물 환자에게 사이토킨과 결합할 수 있는 항체를 투여하여 상기 포유동물 환자에서 상기 사이토킨의 생물 활성을 증가시킴을 포함하는, 상기 포유동물 환자의 면역 기능을 개선시키는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 포유동물 환자 중의 표적 세포에 상기 사이토킨의 제공을 증가시킴을 또한 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 투여 전에 상기 사이토킨과 상기 항체를 착화시키고, 상기 사이토킨 항체 복합체를 상기 포유동물 환자에게 투여함을 또한 포함하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    Fc 부분을 포함하는 단클론 항체가 상기 사이토킨에 결합하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 사이토킨이 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, I형 인터페론, II형 인터페론, IFN-α, IFN-β, 또는 IFN-γ 인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 사이토킨이 인터류킨-2인 방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 사이토킨이 인터류킨-7인 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 조혈 세포 집단을 확대시키는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 T 세포, B 세포, 또는 NK 세포, 또는 이들의 조합의 집단을 확대시키는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 조절 세포를 확대시키는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 CD8+ T 세포를 확대시키는 방법.
  12. 제 9 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 CD4+ T 조절 세포를 확대시키고 CD8+ T 세포의 확대를 차단하는 방법.
  13. 제 9 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 고유(naive) T 세포 또는 기억 T 세포, 또는 이들의 조합을 확대시키는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 비-조혈 세포 상의 I형 인터페론 또는 II형 인터페론의 생물 활성의 증가가 상기 포유동물 환자의 면역 기능을 개선시키는 방법.
  15. 제 9 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 생체 외에서 상기 세포 집단을 확대시키는 방법.
  16. 제 9 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 생체 내에서 상기 세포 집단을 확대시키는 방법.
  17. 포유동물 환자에게 사이토킨 및 그의 천연 수용체를 투여하고, 이에 의해 상기 포유동물 환자에서 상기 사이토킨의 생물 활성을 증가시킴을 포함하는, 상기 포유동물 환자의 면역 기능을 개선시키는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    표적 세포에 대한 상기 사이토킨의 제공을 증가시켜 상기 포유동물 환자의 면역 기능을 개선시킴을 또한 포함하는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 수용체가 사이토킨에 결합하는 Fc 부분을 또한 포함하는 방법.
  20. 제 17 항에 있어서,
    상기 투여 전에 상기 사이토킨을 상기 천연 수용체와 착화시키고, 상기 사이토킨/수용체 복합체를 상기 포유동물 환자에게 투여함을 또한 포함하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 사이토킨이 인터류킨-15이고 상기 수용체가 인터류민-15 수용체 α인 방법.
  22. 제 20 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 조혈 세포 집단을 확대시키는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 T 세포, B 세포, 또는 NK 세포, 또는 이들의 조합의 집단을 확대시키는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 CD8+ T 세포를 확대시키는 방법.
  25. 제 22 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 고유 T 세포 또는 기억 T 세포, 또는 이들의 조합을 확대시키는 방법.
  26. 제 22 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 생체 외에서 상기 세포 집단을 확대시 키는 방법.
  27. 제 22 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 생체 내에서 상기 세포 집단을 확대시키는 방법.
  28. 제 21 항에 있어서,
    상기 포유동물 환자가 고령으로 인해 약해진 면역계를 갖는 방법.
  29. 제 21 항에 있어서,
    상기 증가된 생물 활성이 상기 포유동물 환자에서 종양 질병 또는 감염성 질병을 감소 또는 제거하거나, 그의 발병 또는 재발을 예방하는 치료 효과를 갖는 방법.
  30. 제 21 항에 있어서,
    상기 증가된 생물 활성이 조혈 세포 집단을 확대시키거나 또는 방사선치료 또는 세포독성 약물 치료, 또는 상기 포유동물 환자의 1 차 또는 2 차 면역결핍, 또는 상기 포유동물 환자의 노화로부터 생성되는 세포 고갈로부터 조혈 세포 회수를 개선시키는 치료 효과를 갖는 방법.
  31. 사이토킨에 결합할 수 있는 항체를 포유동물 환자에게, 자가면역 질병을 감소 또는 제거하거나 그의 발병 또는 재발을 예방하기에 유효한 양으로 투여함을 포함하는, 상기 포유동물 환자의 자가면역 질병을 예방 또는 치료하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    항체와 착화된 사이토킨을 상기 포유동물 환자에게 투여함을 또한 포함하는 방법.
  33. 제 31 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성을 증가시킴을 또한 포함하는 방법.
  34. 제 31 항에 있어서,
    Fc 부분을 포함하는 단클론 항체가 상기 사이토킨에 결합하는 방법.
  35. 제 31 항에 있어서,
    상기 사이토킨이 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, I형 인터페론, II형 인터페론, IFN-α, IFN-β, 또는 IFN-γ인 방법.
  36. 제 31 항에 있어서,
    상기 자가면역 질병이 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병, 염증성 장 질병, 건선, 전신 홍반성 루프스, 알레르기성 질병, 또는 천식인 방법.
  37. 제 33 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 조혈 세포 집단을 확대시키는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 T 세포, B 세포, 또는 NK 세포, 또는 이들의 조합의 집단을 확대시키는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 조절 세포를 확대시키는 방법.
  40. 제 38 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 CD8+ T 세포를 확대시키는 방법.
  41. 제 38 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 CD4+ T 조절 세포를 확대시키고 CD8+ T 세포의 확대를 차단하는 방법.
  42. 제 38 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 고유 T 세포 또는 기억 T 세포, 또는 이들의 조합을 확대시키는 방법.
  43. 제 31 항에 있어서,
    상기 비-조혈 세포 상의 I형 인터페론 또는 II형 인터페론의 생물 활성의 증가가 상기 포유동물 환자의 면역 기능을 개선시키는 방법.
  44. 제 38 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 생체 외에서 상기 세포 집단을 확대시키는 방법.
  45. 제 38 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 생체 내에서 상기 세포 집단을 확대시키는 방법.
  46. 사이토킨에 결합할 수 있는 항체를 포유동물 환자에게, 종양 질병을 감소 또는 제거하거나 그의 발병 또는 재발을 예방하기에 유효한 양으로 투여함을 포함하 는, 상기 포유동물 환자의 종양 질병을 예방 또는 치료하는 방법.
  47. 제 46 항에 있어서,
    상기 종양 질병이 암, 고형 종양, 육종, 흑색종, 암종, 백혈병 또는 림프종인 방법.
  48. 제 46 항에 있어서,
    항체와 착화된 사이토킨을 상기 포유동물 환자에게 투여함을 또한 포함하는 방법.
  49. 제 46 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성을 증가시킴을 또한 포함하는 방법.
  50. 제 46 항에 있어서,
    Fc 부분을 포함하는 단클론 항체가 상기 사이토킨에 결합하는 방법.
  51. 제 46 항에 있어서,
    상기 사이토킨이 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, I형 인터페론, II형 인터페론, IFN-α, IFN-β, 또는 IFN-γ인 방법.
  52. 제 49 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 조혈 세포 집단을 확대시키는 방법.
  53. 제 52 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 T 세포, B 세포, 또는 NK 세포, 또는 이들의 조합의 집단을 확대시키는 방법.
  54. 제 53 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 조절 세포를 확대시키는 방법.
  55. 제 53 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 CD8+ T 세포를 확대시키는 방법.
  56. 제 53 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 CD4+ T 조절 세포를 확대시키고 CD8+ T 세포의 확대를 차단하는 방법.
  57. 제 53 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 고유 T 세포 또는 기억 T 세포, 또는 이들의 조합을 확대시키는 방법.
  58. 제 46 항에 있어서,
    상기 비-조혈 세포 상의 I형 인터페론 또는 II형 인터페론의 생물 활성의 증가가 상기 포유동물 환자의 면역 기능을 개선시키는 방법.
  59. 제 53 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 생체 외에서 상기 세포 집단을 확대시키는 방법.
  60. 제 53 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 생체 내에서 상기 세포 집단을 확대시키는 방법.
  61. 사이토킨에 결합할 수 있는 항체를 포유동물 환자에게 투여하고, 이에 의해 상기 포유동물 환자에서 확대된 조혈 세포 집단의 치료 효과를 제공함을 포함하는, 상기 포유동물 환자에서 조혈 세포 집단을 확대시키는 방법.
  62. 제 61 항에 있어서,
    항체와 착화된 사이토킨을 상기 포유동물에게 투여함을 또한 포함하는 방법.
  63. 제 62 항에 있어서,
    Fc 부분을 포함하는 단클론 항체가 상기 사이토킨에 결합하는 방법.
  64. 제 61 항에 있어서,
    상기 사이토킨이 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, I형 인터페론, II형 인터페론, IFN-α, IFN-β, 또는 IFN-γ인 방법.
  65. 제 61 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성을 증가시켜 상기 치료 효과를 제공함을 또한 포함하는 방법.
  66. 제 61 항에 있어서,
    상기 조혈 세포 집단이 T 세포, B 세포, 또는 NK 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  67. 제 66 항에 있어서,
    상기 T 세포 집단이 CD8+ T 세포 집단 또는 CD4+ T 조절 세포 집단, 또는 이들의 조합인 방법.
  68. 제 67 항에 있어서,
    CD8+ T 세포 및 CD4+ T 조절 세포를 확대시킴을 또한 포함하는 방법.
  69. 제 67 항에 있어서,
    CD8+ T 세포를 확대시킴을 또한 포함하는 방법.
  70. 제 67 항에 있어서,
    CD4+ T 조절 세포를 확대시키고 CD8+ T 세포의 확대를 차단함을 또한 포함하는 방법.
  71. 제 67 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 고유 T 세포 또는 기억 T 세포, 또는 이들의 조합을 확대시키는 방법.
  72. 제 66 항에 있어서,
    상기 NK 세포 집단을 확대시킴을 또한 포함하는 방법.
  73. 제 66 항에 있어서,
    상기 B 세포 집단을 확대시킴을 또한 포함하는 방법.
  74. 제 61 항에 있어서,
    방사선치료 또는 세포독성 약물 치료, 또는 상기 포유동물 환자의 1 차 또는 2 차 면역결핍으로부터 생성되는 조혈 세포 고갈로부터 조혈 세포 회수를 개선시키는 사이토킨 항체 복합체의 치료 효과를 제공함을 또한 포함하는 방법.
  75. 제 66 항에 있어서,
    상기 조혈 세포 집단을 생체 외에서 확대시킴을 또한 포함하는 방법.
  76. 제 66 항에 있어서,
    상기 조혈 세포 집단을 생체 내에서 확대시킴을 또한 포함하는 방법.
  77. 사이토킨에 결합할 수 있는 항체를 포유동물 환자에게, 감염성 질병을 감소 또는 제거하거나 그의 발병 또는 재발을 예방하기에 유효한 양으로 투여함을 포함하는, 상기 포유동물 환자의 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법.
  78. 제 77 항에 있어서,
    백신을 투여하여 면역 반응을 증가시키고 백신 효능을 향상시킴을 또한 포함하는 방법.
  79. 제 77 항에 있어서,
    항체와 착화된 사이토킨을 상기 포유동물 환자에게 투여함을 또한 포함하는 방법.
  80. 제 79 항에 있어서,
    Fc 부분을 포함하는 단클론 항체가 상기 사이토킨에 결합하는 방법.
  81. 제 77 항에 있어서,
    상기 사이토킨이 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, I형 인터페론, II형 인터페론, IFN-α, IFN-β, 또는 IFN-γ인 방법.
  82. 제 77 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가를 또한 포함하는 방법.
  83. 제 82 항에 있어서,
    상기 생물 활성이 T 세포, B 세포, 또는 NK 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는 조혈 세포 집단을 증가시키는 방법.
  84. 제 83 항에 있어서,
    상기 T 세포 집단이 CD8+ T 세포 집단 또는 CD4+ T 조절 세포 집단 또는 이들의 조합인 방법.
  85. 제 84 항에 있어서,
    CD8+ T 세포 및 CD4+ T 조절 세포를 확대시킴을 또한 포함하는 방법.
  86. 제 84 항에 있어서,
    CD8+ T 세포를 확대시킴을 또한 포함하는 방법.
  87. 제 84 항에 있어서,
    CD4+ T 조절 세포를 확대시키고 CD8+ T 세포의 확대를 차단함을 또한 포함하는 방법.
  88. 제 84 항에 있어서,
    상기 사이토킨의 생물 활성의 증가가 고유 T 세포 또는 기억 T 세포, 또는 이들의 조합을 확대시키는 방법.
  89. 제 82 항에 있어서,
    상기 비-조혈 세포 상의 I형 인터페론 또는 II형 인터페론의 생물 활성의 증가가 상기 포유동물 환자의 면역 기능을 개선시키는 방법.
  90. 제 83 항에 있어서,
    상기 천연 살해 세포 집단을 확대시킴을 또한 포함하는 방법.
  91. 제 83 항에 있어서,
    상기 B 세포 집단을 확대시킴을 또한 포함하는 방법.
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