MX2008010624A - Metodos para mejorar funcion inmune y metodos para prevencion o tratamiento de enfermedad en un sujeto mamifero. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un método para incrementar la actividad biológica de una citoquina o linfocina y un método para el tratamiento de una enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune o enfermedad infecciosa y un método para expandir una población de células hematopoyéticas mediante la administración de un anticuerpo capaz de enlazarse a una citoquina o mediante administración de una citoquina acomplejada con un anticuerpo o mediante la administración de una citoquina acomplejada con un receptor de citoquina a un sujeto mamífero en necesidad del mismo.

Description

METODOS PARA MEJORAR LA FUNCION INMUNE Y METODOS PARA PREVENCION O TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD EN UN SUJETO MAMIFERO CAMPO DE LA INVENCION La invención es concerniente con un método para incrementar la actividad biológica de una citoquina o linfocina mediante la administración de un anticuerpo capaz de enlazarse a una citoquina o administrar una citoquina acomplejada con un anticuerpo o administrar una citoquina acomplejada con un receptor de citoquina a un sujeto mamífero en necesidad de la misma. la invención es concerniente además con un método de tratamiento de una enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune o enfermedad infecciosa o , un método para expandir una población de células hematopoyéticas , mediante administración de una citoquina acomplejada con un anticuerpo o administración de una citoquina acomplejada con un receptor de citoquina a un sujeto mamífero en necesidad de la misma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El contacto con ciertas citoquinas, notablemente IL-2, IL-7 y IL-15, mantiene la sobrevivencia de células T naturales y de memoria. Smith, Science 240: 1169, 1988; Waldmann, Annu Rev Biochem 58: 875, 1989; Ku et al., Science 288: 675, 2000; Sprent et al., Annu Rev Immunol 20: 551, 2002; Schluns et al., Nat Rev Immunol 3: 269, 2003. La sensibilidad a IL-2 e IL-15 es controlada extensamente por un receptor dimérico compartido que consiste de una cadena ß (CD 122) y una cadena ? común (Yc) · aldmann, Annu Rev Biochem 58: 875, 1989; Takeshita et al., Science 257: 379, 1992; Nakamura et al., Nature 369: 330, 1994. La expresión de CD122 es especialmente alta en células CD8+ de "memoria" cebadas contra antigenos definidos y también sobre una población que se presenta de manera estable en la naturaleza de células CD8+ con un fenotipo similar. Estas últimas células de CD8+ de memoria-fenotipo (MP) CD122hi9h(hi) proliferan en respuesta a IL-2 ó IL-15 in vitro e IL-15 también controla su sobrevivencia y proliferación intermitente (producción) in vivo. Smith, Science 240: 1169, 1988; Zhang et al., Immunity 8: 591, 1998; Sprent et al., Annu Rev Immunol 20: 551, 2002. La sensibilidad aIL-7 es controlada por un receptor dimérico que consiste de una cadena a (CD 127) y una cadena yc; el receptor de IL-receptor es altamente expresado sobre células T naturales y de memoria. Goodwin et al., Célula 60:941, 1990; Sudo et al., Proc. Nati. Acad Sci. 90:9125, 1993; Tan et al. J. Exp. Med. 195: 1523, 2002. IL-2 es también vital para la sobrevivencia de regiones T de CD4+ in vivo. Malek et al., Nat Rev Immunol 4: 665, 2004; Fontenot et al., Nat Immunol 6: 331, 2005. Estaos últimas células son caracterizados por una fuerte expresión constitutiva de IL-2Ra (CD25) , que permite que las células expresen un receptor ß?e trimérico de alta afinidad (IL-2???ß?a) y mediante esto utilizan bajos niveles de IL-2. Reflejando su dependencia en IL-2, CD4+ T desaparece después de inyección de un anticuerpo monoclonal anti-IL-2 (mAb de IL-2). urakami et al., Proc Nati Acad Sd USA 99: 8832, 2002; Setoguchi et al. J Exp ed 201: 723, 2005. I L-15 es normalmente presentado in vivo como una célula enlazada asociada a I L-15R . I L-15ROÍ juega un papel determinante en la presentación de I L-15 endógena. Asi, como los ratones I L-15" _ (Kennedy et al., J Exp Med 191:771-80, 2000) , los ratones IL-15RcT _ carecen de células CD8+ CD122M y células NK (Lodolce et al., Immunity 9:669-76, 1998), supuestamente debido a que IL-15 sintetizado en ratones IL-15R falla en salir del citoplasma. No obstante, las células I L-2R Yc+ pueden proliferar en respuesta a una forma recombinante soluble de I L-15 en ausencia de IL-15Ra (Lodolce et al., J Exp Med 194: 1187-94, 2001). Además, bajo ciertas condiciones, I L-15Ro¡ puede ser inhibidor. Asi, inyectar ratones con una forma recombinante soluble (s) de IL-15Ra se reporta que suprime la proliferación de células NK (Nguyen et al., J Immunol 169:4279-87, 2002) y ciertas respuestas inmune T-dependientes in vivo (Ruckert et al., Eur J Immunol 33:3493-3503, 2003; Ruckert et al., J Immunol 174:5507-15, 2005; Wei et al., J Immunol 167:577-82, 2001; Ruchatz et al., J Immunol 160:5654-5660, 1998) y adición de sIL-15Ra in vitro puede bloquear la respuesta de lineas celulares a IL-15 (Ruckert et al., Eur J Immunol 33:3493-3503, 2003; Ruckert et al., J Immunol 174:5507-15, 2005; Wei et al., J Immunol 167:577-82, 2001; Ruchatz et al., J Immunol 160:5654-5660, 1998; Budagian et al., J Biol Chem 279:40368-75, 2004; Mortier et al., J Immunol 173: 1681-1688, 2004; Eisenman et al.,. Citokyne 20: 121-29, 2002). A pesar de estos hallazgos, hay otros reportes de que sIL-15Ra (Giron-Michel et al., Blood 106:2302-10, 2005), y también un dominio de sushi soluble de IL-15Ra (Mortier et al., J Biol Chem, 2005, E-pub antes de impresión) , puede mejorar la respuesta de IL-15 de lineas celulares humanas. Existe la necesidad en el arte por una terapia para mejorar la función inmune en un sujeto mamífero y por métodos mejorados para tratar enfermedades tales como enfermedad autoinmune, enfermedad neoplásica o enfermedad infecciosa mediante la administración de una citocina al sujeto mamífero. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente en general con métodos para el tratamiento de enfermedad mediante la administración a un sujeto mamífero en necesidad de la misma, de una composición que comprende un anticuerpo capaz de enlazarse a una citoquina o una composición que comprende una citoquina y un receptor a la citoquina. La presente invención es concerniente además con métodos para el tratamiento de enfermedad a acomplejar el anticuerpo con la citoquina antes de la administración y administración del complejo de anticuerpo de citoquina al sujeto mamífero. La presente invención es concerniente además con métodos para el tratamiento de enfermedad mediante acomplej amiento de la citoquina con el receptor de citoquina antes de la administración y administración del complejo de citoquina/receptor de citoquina al sujeto mamífero. Se proporciona un método para mejorar la función inmune en un sujeto mamífero al administrar una composición que comprende un anticuerpo capaz de enlazarse a una citoquina o una citoquina acomplejada con un anticuerpo, mejorando mediante esto la actividad biológica de la citoquina en el sujeto mamífero. Se proporciona un método para mejorar la función inmune en un sujeto mamífero al administrar una composición que comprende una citoquina acomplejada con un receptor de citoquina incrementando mediante esto la actividad biológica de la citoquina en el sujeto mamífero. El estado de enfermedad incluye pero no está limitado a enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune, enfermedad infecciosa o agotamiento de células hematopoyéticas resultante de irradiación o tratamiento de fármaco citotóxico o inmunodeficiencia primaria o secundaria o envejecimiento. El complejo de anticuerpo de citoquina puede ser una citoquina y un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo monoclonal, enlazado a la citoquina. El complejo de citoquina/receptor de citoquina puede ser, por ejemplo un complejo de una interleucina 15/ interleucina-15 receptor a. El método para incrementar la actividad biológica de una citoquina al administrar una citoquina acomplejada con un anticuerpo o complejo de citoquina/receptor de citoquina puede ocurrir como resultado de la expansión de células hematopoyéticas o una subpoblación de células T, por ejemplo, expansión de T de CD8+ y células reguladoras T CD4+ o expansión de células T de CD8+ o expansión de células reguladoras T CD4+ en tanto que bloquea la expansión de células T de CD8+ o expansión de células T naturales (tanto células T de CD4+ y células T de CD8+ ) o células T de memoria o una combinación de las mismas . Se proporciona un método para mejorar la función inmune en un sujeto mamífero que comprende administrar al sujeto mamífero un anticuerpo capaz de enlazarse a una citoquina incrementando mediante esto la actividad biológica de la citoquina en el sujeto mamífero. Se proporciona un método para mejorar función inmune en un sujeto mamífero que comprende administrar al sujeto mamífero una citoquina enlazada a un receptor de citoquina, mejorando mediante esto la actividad biológica de la citoquina en el sujeto mamífero. El método para mejorar la función inmune puede resultar de incrementar la presentación de la citoquina a una célula objetivo en el sujeto mamífero. El método comprende además acomplejar el anticuerpo con la citoquina antes de la administración y administrar el complejo de anticuerpo de citoquina al sujeto mamífero. En un aspecto, un anticuerpo monoclonal que comprende una porción de Fe se enlaza a la citoquina. La citoquina incluye, pero no está limitada a, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, interferones tipo I, interferones tipo II, IFN- , IFN-ß o IFN-?. El receptor de citoquina puede ser un receptor natural de la citoquina, por ejemplo, receptor de interleucina-15 capaz de enlazarse a interleucina-15. Se contemplan muchas variantes del método. Por ejemplo, en una variante, el incremento de la actividad biológica de la citoquina expande una población de células hematopoyéticas . En una variante adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande una población de células T, células B o células NK, o una combinación de los mismos. En un variante adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande células T de CD8+ y células reguladoras T de CD4+. En otro aspecto, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD8+. En un aspecto adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD4+ . En un aspecto adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células reguladoras T de CD4+ y bloquea la expansión de células T de CD8+. En otro aspecto, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T naturales o células T de memoria, o una combinación de las mismas. En una variante del método, el incrementar la actividad biológica de los interferones tipo I o interferones tipo II en una célula no hematopoyética mejora la función inmune en el sujeto mamífero. En otro aspecto, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células ex vivo. En un aspecto adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células in vivo. Un método para mejorar función inmune en un sujeto mamífero es proporcionado que comprende administrar al sujeto mamífero un anticuerpo capaz de enlazarse a citoquina, incrementando mediante esto la actividad biológica de citoquina en el sujeto mamífero. En un aspecto, la citoquina puede ser interleucina-2. En un aspecto adicional, la citoquina puede ser interleucina-7. El método para mejorar la función inmune puede resultar de incrementar la presentación de citoquina a una célula objetivo en el sujeto mamífero. El método comprende además acomplejar el anticuerpo con citoquina antes de la administración y ' administrar el complejo de anticuerpo de citoquina al sujeto mamífero. El método comprende además acomplejar la citoquina con su receptor de citoquina antes de la administración y administración del complejo de citoquina/receptor de citoquina al sujeto mamífero. En un aspecto, el anticuerpo monoclonal o el receptor de citoquina comprende una porción de Fe que se enlaza a la citoquina. En un aspecto adicional, el sujeto mamífero tiene un sistema inmune debilitado debido a la edad avanzada del sujeto mamífero. En un aspecto del método, el incrementar la presentación de la citoquina a una célula objetivo para mejorar la función inmune expande las células T naturales o células T de memoria, o una combinación de las mismas. El método puede proporcionar el efecto terapéutico que reduce o elimina enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune o enfermedad infecciosa en el sujeto mamífero o impide su presencia o recurrencia. El método puede proporcionar el efecto terapéutico que expande una población de células hematopoyéticas o mejora la recuperación de células hematopoyéticas del agotamiento celular resultante de la irradiación o tratamiento de fármaco citotóxico o inmunodeficiencia primaria o secundaria en el sujeto mamífero o envejecimiento. Se proporciona un método para prevenir o tratar enfermedad autoinmune en un sujeto · mamífero que comprende administrar un anticuerpo capaz de enlazarse a una citoquina al sujeto mamífero en una cantidad efectiva para reducir o eliminar la enfermedad autoinmune o para impedir su presencia o recurrencia. El método comprende además acomplejar el anticuerpo con la citoquina antes de la administración y administrar el complejo de anticuerpo de citoquina al sujeto mamífero. El método comprende además acomplejar la citoquina con su receptor de citoquina antes de la administración y administrar el complejo de citoquina/receptor de citoquina al sujeto mamífero. En un aspecto, un anticuerpo monoclonal que comprende una porción de Fe se enlaza a la citoquina. La citoquina incluye, pero no está limitada a, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, interferones tipo I, interferones tipo II, IFN- , IFN-ß o IFN-?. La enfermedad autoinmune incluye, pero no está limitado a, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes, enfermedad de intestino inflamatorio, psoriasis, lupus eritematoso sistémico, enfermedad alérgica o asma. Se contemplan muchas variantes del método. En un aspecto adicional el método comprende incrementar la actividad biológica de la citoquina. Por ejemplo, en una variante, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande una población de células hematopoyéticas . En una variante adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande una población de células T, células ? o células NK, o una combinación de las mismas. En una variante adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD8+ y células reguladoras T de CD4+. En otro aspecto, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD8+ . En un aspecto adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD4+. En un aspecto adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células reguladoras T de CD4+ y bloquea la expansión de células T de CD8+. En otro aspecto, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T naturales o células T de memoria, o una combinación de las mismas. En una variante del método, el incrementar la actividad biológica de los interferones tipo I o interferones tipo II en una célula no hematopoyética mejora la función inmune en el sujeto mamífero. En otro aspecto, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células ex vivo. En un aspecto adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células in vivo. Se proporciona un método para prevenir o tratar una enfermedad neoplásica en un sujeto mamífero que comprende administrar un anticuerpo capaz de enlazar una citoquina al sujeto mamífero en una cantidad efectiva para reducir o eliminar la enfermedad neoplásica o impedir su ocurrencia o recurrencia. La enfermedad neoplásica incluye, pero no está limitada a, cáncer, tumor sólido, sarcoma, melanoma, carcinoma, leucemia o linfoma. El método comprende además acomplejar el anticuerpo con la citoquina antes de la administración y administrar el complejo de anticuerpo de citoquina al sujeto mamífero. El método comprende además acomplejar la citoquina con su receptor de citoquina antes de la administración y administración del complejo de citoquina/receptor de citoquina al sujeto mamífero. En un aspecto, el anticuerpo monoclonal comprende una porción de Fe o el receptor de citoquina comprende una porción de Fe que se enlaza a la citoquina. La citoquina incluye, pero no está limitada a, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, interferones tipo I, interferones tipo II, IFN-a, IFN-ß o IFN-?. El método proporciona además el incremento de una actividad biológica de la citoquina. Se contemplan muchas variantes del método. Por ejemplo, en una variante, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande una población de células hematopoyéticas . En una variante adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande una población de células T, células B o células NK o una combinación de las mismas. En una variante adicional, el incremento de la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD8+ y células reguladoras T de CD4+. En otro aspecto, el incremento de la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD8+. En un aspecto adicional, el incremento de la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD4+. En un aspecto adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células reguladoras T de CD4+ y bloquea la expansión de células T de CD8+. En otro aspecto, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T naturales o células T de memoria, o una combinación de las mismas. En una variante del método, el incrementar la actividad biológica de interferones tipo I o interferones tipo II sobre una célula no hematopoyética mejora la función inmune en el sujeto mamífero. En otro aspecto, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células ex vivo. En un aspecto adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células in vivo. Se proporciona un método para mejorar la función inmune en un sujeto mamífero que comprende administrar al sujeto mamífero una interleucina-15 y un receptor a de interleucina-15 e incrementar mediante esto la actividad biológica de la interleucina-15 en el sujeto mamífero. El método puede comprender además incrementar la presentación de la interleucina-15 a una célula objetivo para mejorar la función inmune en el sujeto mamífero. El método puede comprender además acomplejar la interleucina-15 con el receptor a de interleucina-15 antes de la administración y administración del complejo de interleucina-15/receptor a de interleucina-15 al sujeto mamífero. En un aspecto del método, el incremento de la presentación de la interleucina-15 a una célula objetivo para mejorar la función inmune expande las células T naturales o células T de memoria, o una combinación de las mismas. La actividad biológica incrementada puede tener un efecto terapéutico para reducir o eliminar la enfermedad neoplásica o enfermedad infecciosa en el sujeto mamífero o impedir su presencia o recurrencia. La actividad biológica mejorada puede tener un efecto terapéutico para expandir una población de células hematopoyéticas o mejorar la recuperación de células hematopoyéticas del agotamiento celular resultante de la irradiación o tratamiento de fármaco citotóxico, o de inmunodeficiencia primaria o secundaria en el sujeto mamífero, o de envejecimiento en el sujeto mamífero. En un aspecto adicional, el sujeto mamífero tiene un sistema inmune debilitado debido a la edad avanzada del sujeto mamífero . Se proporciona un método para expandir una población de células hematopoyéticas en un sujeto mamífero que comprende administrar un anticuerpo capaz de enlazarse una citoquina al sujeto mamífero, proporcionando mediante esto un efecto terapéutico de la población de células hematopoyéticas expandidas en el sujeto mamífero. El método comprende además acomplejar el anticuerpo con la citoquina antes de la administración y administrar el complejo de anticuerpo de citoquina al sujeto mamífero. El método comprende además acomplejar la citoquina con su receptor de citoquina antes de la administración y administración del complejo de citoquina/receptor de citoquina al sujeto mamífero. En un aspecto, un anticuerpo monoclonal que comprende una porción de Fe o un receptor de citoquina que comprende una porción de Fe se enlaza a la citoquina. La citoquina incluye, pero no está limitada a, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, interferones tipo I, interferones tipo II, IFN-a, IFN-ß o IFN-?. El método proporciona además incrementar la actividad biológica de la citoquina. Se contemplan muchas variantes del método. Por ejemplo, en una variante, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande una población de células hematopoyéticas. En una variante adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande una población de células T, células B o células NK, o una combinación de las mismas. En una variante adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD8+ y células reguladoras T de CD4+. En otro aspecto, el incremento de la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD8+. En un aspecto adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD4+. En un aspecto adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células reguladoras T de CD4+ y bloquea la expansión de células T de CD8+. En otro aspecto, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T naturales o células T de memoria, o una combinación de las mismas. En un aspecto adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina puede expandir la población de células NK o puede expandir la población de células B. En un aspecto adicional, un efecto terapéutico de un complejo de anticuerpo de citoquina puede mejorar la recuperación de células hematopoyéticas del agotamiento celular hematopoyético resultante de irradiación o tratamiento de fármaco citotóxico o inmunodeficiencia primaria o secundaria en el sujeto mamífero. En otro aspecto, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células ex vivo. En un aspecto adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células in vivo. Se proporciona un método para prevenir o tratar enfermedad infecciosa en un sujeto mamífero que comprende administrar un anticuerpo capaz de enlazar una citoquina al sujeto mamífero en una cantidad efectiva para reducir o eliminar la enfermedad infecciosa o impedir su presencia o recurrencia. El método comprende además acomplejar el anticuerpo con la citoquina antes de la administración y administrar el complejo de anticuerpo de citoquina al sujeto mamífero. El método comprende además acomplejar la citoquina con su receptor de citoquina antes de la administración y administrar el complejo de citoquina/receptor de citoquina al sujeto mamífero. En un aspecto adicional, el anticuerpo o la citoquina acomplejada con un anticuerpo o citoquina acomplejada con su receptor es administrado con una vacuna para incrementar una respuesta inmune y para mejorar la eficacia de vacuna. En un aspecto, un anticuerpo monoclonal que comprende una porción de Fe se enlaza a la citoquina. La citoquina incluye, pero no está limitada a, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, interferones tipo I, interferones tipo II, IFN-a, IFN-ß o IFN-?. El método proporciona además el incrementar una actividad biológica de la citoquina. Se contemplan muchas variantes del método. Por ejemplo, en una variante, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande una población de células hematopoyéticas . En una variante adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande una población de células T, células B o células NK, o una combinación de las mismas. En una variante adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD8+ y células reguladoras T de CD4+. En otro aspecto, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD8+. En un aspecto adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD4+. En un aspecto adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células reguladoras T de CD4+ y bloquea la expansión de células T de CD8+. En otro aspecto, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T naturales o células T de memoria, o una combinación de las mismas. En una variante del método, el incrementar la actividad biológica de los interferones tipo I o interferones tipo II sobre una célula no hematopoyética mejora la función inmune en el sujeto mamífero. En un aspecto adicional, el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células exterminadoras naturales o expande la población de células B.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A y IB muestran la estimulación de células CD8+ de fenotipo de memoria (MP) in vivo mediante IL-2 o anticuerpo monoclonal de IL-2. La Figura 2 muestra la proliferación de células CD8+ de MP en respuesta a IL-2 o anticuerpo monoclonal de IL-2. Las Figuras 3A, 3B y 3C muestran la expansión selectiva marcada de células T CD8+ de MP y antigeno (Ag)-especifica in vivo mediante una combinación de IL-2 y anticuerpo monoclonal de IL-2. Las Figuras 4A y 4B muestran que la proliferación de células T de CD8+ a complejos de IL-2/anticuerpo monoclonal de IL-2 es confinada extensamente a células MP de Cdl22hi y es independiente de IL-15. Las Figuras 5A y 5B muestran que la proliferación de células de CD8+ de MP a complejos de IL-2 /anticuerpo monoclonal de IL-2 in vivo no requiere CD25. Las FGiguras 6A, 6N, 6C, 6D y 6E muestran la estimulación selectiva de subconjuntos de células T mediante diferentes complejos de IL-2/anticuerpo monoclonal de IL-2. Las Figuras 7A, 7B, 7C y 7D muestran requerimientos para estimular células CD8+ de MP con complejos de IL-2 /anticuerpo monoclonal de IL-2 in vivo. Las Figuras 8A, 8B, 8C y 8D muestran aspectos de la estimulación de célula T mediante complejos de citocina/anticuerpo monoclonal. Las Figuras 9A y 9B muestran que JES6-5 y anticuerpo monoclonal IL-2 S4B6 se enlazan a sitios similares sobre IL-2 que son distintos del sitio de enlace de JES6-1. Las Figuras 10A y 10B muestran efectos de complejos de IL-2/anticuerpo monoclonal de IL-2 in vitro. Las figuras 11A y 11B muestran que la inyección de una mezcla de S4B6 e IL-2 de JES6-1 bloquea la proliferación tanto de células CD8+ de MP y células de CD25+ y CD4+. Las Figuras 12A y 12B muestran que los fragmentos de F(ab' ) 2 de anticuerpo monoclonal de 11-2 son menos eficientes que el anticuerpo monoclonal de IL-2 entero. La Figura 13 muestran que los complejos de IL-2/anticuerpo monoclonal de IL-2 son significativamente más potentes que las proteínas de fusión de IL-2-anticuerpo para inducir la proliferación de células CD8+ de MP. Las Figuras 14A y 14B muestran que el complejo de IL-7/anticuerpo monoclonal de IL-7 puede inducir eficientemente el desarrollo de células T en el timo. Las Figuras 15A, 15B y 15C muestran que el complejo de IL-7 /anticuerpo monoclonal de IL-7 puede inducir eficientemente la expansión homeostática de células T naturales . La Figura 16 muestra que el complejo de IL-7/anticuerpo monoclonal de IL-7 puede impulsar la expansión tanto de células T naturales como de células T de memoria.

La Figura 17 muestra que se requiere la porción de Fe del anticuerpo monoclonal anti-IL-7 para la actividad proliferativa del complejo de IL-7 /anticuerpo monoclonal de 11-7. Las Figuras 18A y 18B muestran que el envejecimiento está asociado con una disminución severa en la habilidad para apoyar la proligeración homeostática de células T naturales y esta puede ser restaurada utilizando complejos de IL-7 /anticuerpo monoclonal de IL-7. Las Figuras 19A, 19B, 19C, 19D y 19E muestran que IL-15Ra soluble aumenta la proligeración de linfocitos moderada por IL-15 in vitro. Las Figuras 20A, 20B, 20C y 20D muestran que IL- 15Ra soluble aumenta la proliferación de linfocitos de donador mediada por IL-15 in vivo. Las Figuras 21A, 21B, 21C y 21D muestran IL-15Roc soluble aumenta la proliferación de linfocitos huésped moderada por IL.15. La Figura 22 muestra que IL-15Roc-Fc son mejores que IL-15Ra para aumentar IL-15 bajo condiciones in vivo. las Figuras 23A ' y 23B muestran que la proliferación a IL-15 inmovilizada mediante IL-15R no puede ser bloqueada por IL-15Ra-Fc solubles. Las Figuras 24A y 24B muestran que IL-2Roc soluble inhibe la proliferación moderada por IL-2. Las Figuras 25A y 25B muestran la supervivencia de IL-15 in vitro. La Figura 26 muestran que sIL-15Roc humano mejora la respuesta de células CD8+ de MP de ratón tanto a IL-15 de ratón como humana. La Figura 27 muestra la estimulación mediante complejos de IL-15/sIL-15Ra-Fc en huéspedes y en IL-15Rot_ ~. Las Figuras 28A, 28B y 28C muestran efectos de bloqueo de sIL-15Ra-Fc para respuestas a IL-15 de ratón contra IL-15 humana.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención es concerniente en general con métodos para el tratamiento de enfermedad mediante la administración de una composición que comprende un anticuerpo capaz de enlazar una citocina o una composición que comprende una citocina y un receptor a la citocina a un sujeto mamífero en necesidad del mismo. La presente invención es concerniente además con métodos para el tratamiento de enfermedad al acomplejar el anticuerpo con la citocina antes de la administración y administrar el complejo de anticuerpo de citocina al sujeto mamífero. La presente invención es concerniente además con métodos para el tratamiento de enfermedad al acomplejar a citocina con el receptor de citocina antes de la administración y administrar el complejo de citocina/receptor de citocina al sujeto mamífero. Se proporciona un método para mejorar la función inmune en un sujeto mamífero al administrar un anticuerpo capaz de enlazar una citocina o una citocina acomplejada con un anticuerpo, interpretando mediante esto la actividad biológica de la citocina en el sujeto mamífero. Se proporciona un método para mejorar una función inmune en un sujeto mamífero al administrar una composición que comprende una citocina acomplejada con un receptor de citocina, incrementando mediante esto la actividad biológica de la citocina en el sujeto mamífero. Se proporciona un método para el tratamiento de un estado de enfermedad en el cual el estado de enfermedad incluye pero no está limitado a enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune, enfermedad infecciosa o agotamiento de linfocitos resultante de irradiación o tratamiento de fármacos citotóxicos o inmunodeficiencia primaria o secundaria o en crecimiento. El complejo de anticuerpo de citocina puede ser una citocina y un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, enlazado a la citocina. El complejo de citocina/receptor de citocina puede ser por ejemplo, un complejo de interleucina 15/receptor a de interleucina-15. El método para mejorar la función inmune en un sujeto mamífero al incrementar una actividad biológica de la citocina, en un aspecto, expande la población de células hematopoyéticas en el sujeto mamífero, por ejemplo, células T, células B o células NK o una combinación de las mismas. Se proporciona un método de tratamiento de un estado de enfermedad al administrar un anticuerpo capaz de enlazar a interleucina-2 o interleucina-2 acomplejada con un anticuerpo a un sujeto mamífero en necesidad del mismo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. El incremento en la actividad biológica de interleucina-2 es útil para el tratamiento de enfermedad como se describe en la presente. La actividad de interleucina-2 incrementada se puede expandir por las poblaciones de célula T, poblaciones de célula B o poblaciones de célula NK o más específicamente, expandir poblaciones de células T de CD8+ o expandir poblaciones de células T de CD8+ y células reguladoras T de CD4+ o expandir poblaciones de células reguladoras T de CD4+ y bloquear la expansión de células T de CD8+. La expansión de células hematopoyéticas se puede llevar a cabo in vivo o ex vivo del sujeto mamífero. Se proporciona un método de tratamiento de un estado de enfermedad al administrar un anticuerpo capaz de enlazarse a citocina o citocina acomplejada con un anticuerpo a un sujeto mamífero en necesidad del mismo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. El incremento en actividad biológica de citocina es útil para el 5 tratamiento de enfermedad, como se describe en la presente. La actividad de citocina incrementada puede expandir poblaciones de células T, poblaciones de célula B o poblaciones de células NK o más específicamente, la actividad biológica de la citocina puede expandir las células T naturales (tanto células T de CD4 naturales como células T de CD8) o células T de memoria (tanto células T de CD4 naturales como células T de CD8) o una combinación de las mismas. Interleucina-2 (IL-2), un factor de crecimiento para linfocitos T, pueden también a veces ser inhibidoras. La presente invención proporciona una explicación del hecho de que la proliferación de células T de CD8+ in vivo es incrementada después de la inyección del anticuerpo monoclonal específico para IL-2 (IL-2 mAb) . La presente invención demuestra que el mAb de IL-2 aumenta la proliferación de células de CD8+ al incrementar la actividad biológica de IL-2 preexistente por medio de la formación de complejos inmunes. Cuando es acoplado con IL-2 recombinante , algunos complejos de IL-2/mAb de IL-2 por lo menos provocan expansión masiva (> 100 veces) de células CD8+ in vivo en tanto que otros estimulan selectivamente reguladores de T CD4+. Así, diferentes complejos de citocina/anticuerpo pueden ser usados para reforzar selectivamente o inhibir la respuesta inmune y son útiles para el tratamiento de estados de enfermedad. El término "aproximadamente" como se usa en la presente cuando se refiere a un patrón mensurable tal como una cantidad, una duración temporal y los semejantes se propone abarcar variaciones de + 20% o + 10%, más preferiblemente + 5%, aún más preferiblemente + 1% y todavía más preferiblemente + 0.1% del valor especificado, como tales variaciones sean apropiadas para efectuar los métodos revelados . A no ser que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entienden comúnmente por aquel de habilidad ordinaria en el arte con el cual la invención es concerniente. Aunque cualesquier métodos y materiales similares o referentes a aquellos descritos en la presente pueden ser usados en la práctica para las pruebas de la presente invención, los materiales y métodos preferidos son descritos en la presente. Al describir y reivindicar la presente invención, se usará la siguiente terminología. "Una cantidad efectiva para reducir o eliminar la enfermedad o impedir su presencia o recurrencia" se refiere a una cantidad de un compuesto terapéutico que controla un resultado del paciente o sobrevivencia en seguida del tratamiento del estado de enfermedad por ejemplo, enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune, radiación reductora de células o quimioterapia o enfermedad infecciosa, tal como se mide mediante datos de prueba de paciente, datos de supervivencia, elevación o supresión de niveles de marcador de tumor, sisceptibilidad inducida basada en el perfil genético o exposición a factores ambientales. "Linfocitos" se refiere a una población de células en circulación en los que se incluye pero no limitadas a células T, células B o células exterminadoras naturales (NK) . "Proliferación de células T" se refiere al crecimiento y expansión de una o más subpoblaciones de células T en respuesta a una señal celular proporcionada por una citocin o linfocina. La proliferación de células T puede ocurrir in vivo o ex vivo. Las subpoblaciones de células T incluyen pero no están limitadas a células T de CD8+, células reguladoras T de CD4 (células reguladoras T) o células exterminadoras naturales (NK) . "Complejo de anticuerpo de citocina" o "complejo de citocina/receptor de citocina" se refiere a citocinas o linfocinas que están enlazadas a un anticuerpo o a su receptor de citocina ya sea mediante uan interacción de carga electrostática como en una interacción de anticuerpo de un antigeno o interacción de enlace de ligando-receptor. La molécula de anticuerpo puede ser una molécula de IgG o un fragmento de la .misma. El fragmento de anticuerpo puede incluir por lo menos una porción Fe de la molécula de anticuerpo . "Citocina" se refiere a los mediadores solubles que controlan muchas interacciones criticas entre células del sistema inmune. Las citocinas comprenden un grupo diverso de péptidos de señalización intercelular y lipoproteina . La mayoría son genética y estructuralmente similares entre sí. Cada citocina es secretada por un tipo de célula particular en respuesta a una variedad de estímulos y produce efectos característicos sobre el crecimiento, movilidad, diferenciación y/o función de células objetivo, colectivamente, las citocinas regulan no solamente los sistemas inmune e inflamatorio, si no que también están involucradas en la cicatrización de heridas, hematopoyesis, angiogénesis y muchos otros procesos. Se pretende que el término abarque todas de las varias citocinas, sin consideración de su estructura y la nomenclatura usada comúnmente. Por ejemplo, se pretende que el término abarque "linfocinas" (esto es, citocinas producidas por linfocitos) , también como "monocinas" (esto es, citocinas producidas por monocitos) . Citocina se refiere a cualquiera de los numerosos factores que ejercen una variedad de efectos sobre las células, por ejemplo, inducir el crecimiento o proliferación. Ejemplos no limitantes de citocinas que se pueden usar solas o en combinación en la práctica de la presente invención incluyen interleucina-1 (IL-1) , interleucina-2 (IL-2), interleucina 3 (IL-3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-6 (IL-6), interleucina-7 (IL-7), interleucina-9 (IL-9), interleucina 12 (IL-12), interleucina-15 (IL-15) , interleucina-21 (IL-21), interferónes tipo I, interferón- , interferón-ß, interferónes tipo II, interferón-?, factor de célula de tallo (SCF) , factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) , factor estimulador de colonia de macrófago de granulocito (GM-CSF) , interleucina-?a (IL-l ) , interleucina-11 (IL-11), MIP-la, factor inhibidor de leucemia (LIF) , ligando c-kit, trombopoyetina (TPO) y ligando flt3. La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas en las cuales una o más citocinas o uno o más anticuerpos capaces de enlazar a una citocina o una combinación de los mismos. Citocinas que están disponibles comercialmente de varios vendedores tales como por ejemplo, Genzyme (Framingham, Mass.), Genentech (Sur de San Francisco, California), Amgen (Thousand Oaks, Calif.) o R&D Systems (Minneapolis, Minn.). Se pretende anque no siempre se afirma explícitamente, que las moléculas que tienen actividad biológica similar como citocinas tipo silvestre o citocinas purificadas (por ejemplo, producidas recombinantemente o muteínas de las mismas) sean usadas dentro del espíritu y alcance de la invención.

"Receptor de citocina" se refiere a moléculas receptoras que reconocen y que se enlazan a citocinas. Se pretende que el término abarque receptores de citocinas solubles también como receptores de citocinas que están enlazados a las células. En algunas modalidades, el término ser refiere a receptor a de interleucina-15 , que se enlaza a interleucina-15. Se pretende que el término también abarque moléculas receptoras de citocina modificadas (esto es, "receptores de citocina variantes"), en las que se incluyen aquellas con sustituciones, cancelac iones y/o adiciones a la secuencia de aminoácidos y/o ácidos nucleicos de receptor de citocina. Asi, se pretende que el término abarque receptores de citocina tipo silvestre, también como recombinante, producidos sintéticamente. "Receptor de citocina" se refiere a todos los receptores de citocina humanos en el arte que se enlazan a una o más citocina (s), como se define previamente en la presente, en los que se incluyen pero no limitados a receptores de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, interferónes tipo I, interferónes tipo II, IFN-ot, IFN-ß o IFN-?. "Mejorar la función inmune en un sujeto mamífero" se refiere a la habilidad de tratamiento con las composiciones de la presente invención para reducir exitosamente o eliminar una enfermedad en un sujeto mamífero o prevenir su presencia o recurrencia. enfermedades incluyen pero no están limitadas a, enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune o enfermedad infecciosa o en donde la función inmune mejorada proporciona un efecto terapéutico para expandir una población de células hematopoyéticas o mejora la recuperación de células hematopoyéticas del agotamiento celular resultante de irradiación o tratamiento de fármaco citotóxico o inmunodeficiencia primaria o secundaria en el sujeto mamífero o envejecimiento. Por ejemplo, las composiciones y formulaciones usadas para tratar o prevenir enfermedad neoplásica e incluyen anticuerpos a citocinas o complejos de anticuerpo citocina o complejos de citocina/receptor de citocina que pueden servir para interferir con la inducción del tumor; mantener i mejorar la función inmune, por ejemplo incrementar poblaciones de células hematopoyéticas en general o durante quimioterapia y por ejemplo mejorar la actividad de linfocitos de infiltración de tumor y/o reducir la supresión inducida por quimioterapia de citotoxicidad de células NK y citotoxicidad de células exterminadoras activadas por linfocinas y reactividad mitogénica de linfocitos en sujetos con cáncer. "Incrementar actividad biológica" y "biológicamente activos" con respecto a composiciones de complejo de citocina/anticuerpo o composiciones de complejo de citocina/receptor de citocina de la presente invención se refiere a la habiolidad de la citocina o molécula de linfocina para enlazarse específicamente a y señalar en una población de células hematopoyéticas . por ejemplo, en una población de células T para expandir un subconjunto de la población de células T. "Incrementar actividad biológica" también se puede referir a moléculas de citocina, por ejemplo, interferónes tipo I o interferónes tipo II, que se enlazan específicamente a y señalan en una población de células no hematopoyéticas, por ejemplo, células epiteliales o células de hígado. Incrementar la actividad biológica de una citocina mediante un complejo de citocin o un complejo de citocina/receptor de citocina de la presente invención incluye la habilidad de expandir la población de células T, en los que se incluyen pero no limitados a, expadir células T de CD8+ y células reguladoras T de CD4+, expandir células T de CD8+ o expandir células reguladoras T de CD4+ y bloquear la expansión de células T de CD8+ o expandir células T de CD4+ y células CD8+ o expandir células T naturales (tanto células T de CD4+ como células T de CD8+) o células T de memoria o una combinación de las mismas. Así, la administración de los compuestos o agentes de la presente invención puede prevenir o retardar, aliviar o detener o inhibir el desarrollo de los síntomas o condiciones asociados a la enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune, irradiación de agotamiento celular o quimioterapia o enfermedad infecciosa en un sujeto mamífero. Las moléculas de interferón son agrupadas en la familia heterogénea de citocinas, identificadas originalmente en base a su habilidad para inducir resistencia celular a infecciones virales (Diaz et al., J. Interferón Cytokine Res., 16: 179-180, 1996). "Interferón tipo I", por ejemplo, interferónes a/ß, incluyen muchos miembros de la familia de interferón a (interferón al, a2 , ? y t) también como interferón ß. "Interferón tipo II", por ejemplo, interferón ?, es diferente del tipo I en los mecanismos particulares que regulan su producción. Mientras que la producción de interferónes a/ß es inducida más eficientemente en muchos tipos de células después de la infección viral, interferón-? es producido principalmente en células del sistema hematopoyético, tales como células T o células exterminadoras baturales, después de la estimulación por antígenos o citocinas, respectivamente. Estos dos sistemas de interferón son funcionalmente no redundantes en el tratamiento de enfermedad y en huésped de defensa antivural . El receptor para IL-15 consiste de tres cadenas, a, ß y Ye, la cadena a es exclusiva para IL-15, mientras que las cadenas ß (CD122) y yc (CD132) son compartidas con el receptor para IL-2 (Kovanen y Leonard, Immunol Rec 202: 67- 83, 2004). CD122 es expresado al nivel más alto en la mayoría (~ 70%) de las células de CD8 de MP en ratones normales y a niveles bajos pero significativos en células CD8 naturales y CD4 de MP; virtualmente nada de CD122 expresado en células de CD4 naturales (Zhang et al., Immunity 8(5): 591-99, 1998). Reflejando el patrón de expresión de CD122, IL-15 probó ser especial para el •envolvimiento y sobrevivencia de células CD8 de MP CD122hl. Así, la generación de ratones de IL-15" reveló que estos ratones carecían de células CD8 de MP de CD122hl Kennedy et al., J Exp Med 191(5): 771-780, 2000). La ausencia de células CD8 de MP de CD122hl pareció reflejar la carencia de supervivencia celular, en lugar de un defecto de desarrollo, ya que las células CD8 de MP de CD122hl se transfirieron adoptablemente a ratones IL-15" fallaron en proliferante y desaparecieron rápidamente (Judge et al., J Exp Med 196(7): 935-46, 2002). Se debe mencionar que las células de NK, que son CD122hl, también se encontraron ser exclusivamente dependientes de IL-15 para la supervivencia. Así, como las células CD8 de MP de CDl22hi, las células NK pueden estar marcadamente reducidas en ratones IL-15" (Kennedy, et al., J. Exp. Med. 191: 771-780, 2000) . Los ratones IL-15" también muestran una reducción de 50% en números de células de CD8 naturales, indicando que IL-15 juega un papel significativo en sostener la supervivencia de células de CD8 naturales (Kennedy et al., J Exp Med 191(5): 771-780, 2000; Berard et al., J Immunol 170(10): 5018-26, 2003). A nivel de células de CD8, la homeostasis de células naturales de CD4 de MP no es adectada notablemente en ratones de IL-15" (Kennedy et al., J Exp Med 191 (5) : 771-780, 2000). El papel directo de IL-15 sobre células de CD8 de memoria es también indicado por el hallazgo de la sobreexpresion de IL-15, como en ratones transgénicos de IL-15, incrementa los números totales de células de CD8 de MP de CD122hi (Marks-Konczalik et al., Proc Nati Acad Sci EUA 97(21): 11445-50, 2000; Fehninger et al., J Exp Med 193(2): 219-31, 2001) . Como con otras citocinas que señalan por medio de receptores de ye, IL-15 probablemente soporta la supervivencia de células CD8 de memoria al · regular ascendentemente las moléculas anti-apoptóticas tales como Bcl-2. Las rutas de señalización disparadas por IL-15 parecieran ser transmitidas via STAT5 y son moduladas negativamente por SOCS-1. Asi, números incrementados de células de CD8 de Mp están presentes en ratones transgénicos que expresan una forma constitutivamente activada de STAT5 (Burchill et al., J Immunol 171(11): 5853-64, 2003) y aún más sorprendentemente, en ratones en donde el efecto negativo de SOCS-1 es abrogado, como en ratones IFNy" SOCS-1" (Ilangumaran et al., J Immunol 171(5): 2435-45). En ambos casos, las células de CD8 naturales parecen modular sensibilidad incrementada a IL-15, que provoca que estas células sufran proliferación espontánea y diferenciación subsecuente a células MP, esta transición es dependiente de la señalización de TCR de contacto con ligandos de autopéptidos/ HC Ilangumaran et al., J Immunol 171(5): 2435-45; Davey et al., J £xp ed 202(8) . 1099-108, 2005). Aunque es considerada una citocina soluble, IL.15 bajo condiciones in vivo es presentada en una forma asociada a la célula enlazada a la cadena de IL-15Ra. El papel esencial de IL-15oc para presentación de IL-15 fue observado por primera vez en lineas celulares humanas (Dubois et al., Immunity 17(5): 537-47, 2002). El trabajo subsecuente en ratones demostró que tanto IL-15 como IL-15Ra necesitan ser sintetizados por la misma célula, indicando que IL-15 está pre-asociada con la cadena de IL-15Ra en el citoplasma antes que la expresión sobre la superficie celular (Burkett et al., J Exp Med 200(7): 825-34, 2004). Este modo de presentación única explica la paradoja de que células de CD8 de MP transferidas a ratones de IL-15Ra" fallan en sufrir proliferación biconstante en respuesta a Poli I:C (Lodolce et al., J Exp Med 194(8): 1187-94, 2001). Este modelo también explica porqué los ratones de IL-15Ra~ que carecen de células de CD8 de MP y confirma la sugerencia original del autor de que IL-15Ra es requerida para el reconocimiento de IL-15 (Lodolce et al., Immunity 9(5): 669-76, 1998). Se debe notar que la cadena de IL-15Ra es expresada sobre muchos tipos de células, en las que se incluyen células T y APC y es fácilmente regulada ascendentemente después de la activación de estas células, aunque solamente las células que no son T parecen sintetizar IL-15 (Doherty et al., J Immunoln 156(2): 735-41, 1996). Aunque el papel obligatorio para la expresión de IL-15Ra sobre APC para presentación de IL-15 es claro, la razón por la que las células de CD8 expresan IL-15Ra es oscura. Asi, la expresión de células T de IL-15Ra es extensamente prescindible para el reconocimiento de IL-15 por células de CD8 yla expresión de solamente las cadenas ß y ? de IL-15R sobre células de CD8 es suficiente para respuestas normales de células de CD8 de memoria a IL-15 (Lodolce et al., J Exp Med 194(8): 1187-94, 2001; Nurkett et al., Proc Nati Acad Sel EUA 100(8): 4724-9, 2003). La función de IL-15Ra sobre las células de CD8 sigue siendo un misterio, pero podría estar involucrado en la trans-presentación de IL-15 soluble a otras células T (Dubois et al., Immunity 17(5): 537-47, 2002) o posiblemente para aumentar la activación de APC (Budagian et al., J Biol Chem 279 (40) : 42192-201, 2004). Bajo condiciones normales, el nivel basal de IL-15 es establecido probablemente por la producción constitutiva de IL-15 mediante DC, que sintetiza tanto IL-15 como IL-15Ra (Burkett et al., J Exp Med 200 (7 ) : 825-34, 2004). Puesto que la producción de IL-15 es inducida eficientemente por IFN, especialmente por IFN-I, surge la pregunta de si la producción de fondo de IFN-I mantiene el novel basal de IL-15. En apoyo a esta idea, ratones dedicientes del receptor IFN-I poseen menos de la mitad de células de CD8 de P de CD122hl encontradas en ratones B6 normales y hay aún un agotamiento adicional de células de CD8 de MP de CD122hl aparente en ratones de STAT-l", que no son sensibles tanto a IFN-I e IFN-?. El sistema hematopoyético está compuesto de diferentes tipos de células que efectúan funciones distintas. Muchas de diversas funciones requiere el movimiento coordinado de receptores de superficie celular en los que se incluyen canales de ión, moléculas de superficie de adhesión que coordinen la interacción de célula-célula y receptores de citocina. A pesar- de sus diversas actividades funcionales, se cree que todas las células hepatopoyéticas se desarrollan a partir de una célula de tallo hematopoyética de médula ósea multipotente. Se ha demostrado que tal célula de tallo expresa un marcador de superficie denominado CD34. Durante la diferenciación, la célula de tallo da surgimiento a células progenitoras en cada uno de varios linajes celulares hematopoyéticos específicos. Luego la célula progenitora sufre una serie de cambios morfológicos y funcionales para producir células hematopoyéticas funcionalmente comprometidas maduras. Entre las funciones efectuadas por las células hematopoyéticas, ciertos tipos de células están involucrados exclusivamente en inmunidad. Por ejemplo, los linfocitos, que incluyen células T, células b y células exterminadoras naturales (NK) , son efectores de respuestas inmunes. Monocitos y granulocitos (esto es, neutrófilos, basófilos y eosinófilos) juegan un papel en forma no especifica de defensa. Los linfocitos, monocitos y granulocitos son denominados colectivamente como células ed sangre banca o leucocitos. Por otra parte, otras células hematopoyéticas efectúan funciones que no están relacionadas con el sistema inmune. Por ejemplo, los eritrocitos están involucrados en el transporte de gas y las células de la serie trombocitica están involucradas en la coagulación de sangre. Las células T y células B reconocen antigenos y generan una respuesta inmune. Las células T reconocen antigenos mediante receptores de superficie heterodiméricos denominados el receptor de célula T (TCR) . El TCR está asociado con una serie de polipéptidos denominados colectivamente como complejo CD3. Las células B reconocen antigenos mediante inmunoglobulinas (Ig) de superficie, como también son moléculas segregadoras. Además, un gran número de receptores de superficie co-estimuladores han sido identificados en células T y en células B, que aumentan la activación celular durante la activación inducida de antigeno . Además del complejo de receptor de antigeno de célula T/CD3 (TCR/CD3) , otras moléculas expresadas por moléculas T que moderan una activación de señal, incluyen pero no están limitados a CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD18, CD43, CD45, CD152 (CTLA-4), CD154, MHC clase I, HC clase II, CDwl37 (4-1BB), CDwl50 y los semejantes (Barclay et al., The Leucocyte Antigen Facts Book, 1997, segunda edición, Academic Press; Leucocyte Typing, 1984, Bernard et al. (editores), Springer-Verlag; Leukocyte Typing II, 1986, Reinherz et al. (editores), Springer-Verlag; Leukocyte Typing III, 1987, McMichael (editor), Oxford University Press; Leukocyte Typing IV, 1989, Knapp et al. (editores), Oxford University Press; Cd Antigens, 1996, VI Internet Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens. Los antigenos de superficie celular que trabajan conjuntamente con TCR/CD3 son denominados frecuentemente como co-receptores en el arte. Anticuerpos específicos han sido generados contra todos los antígenos de sueprficie de células T mencionados anteriormente. Otras moléculas que se enlazan a los receptores de sueprficie de células T mencionados anteriormente incluyen derivados de anticuerpo de enlace de antígeno tales como dominios variables, péptidos, superantígenos y sus ligandos naturales tales como CD58 (LFA-3) para CD2, HIB gpl20 para CD4 , CD27L para CD27, CD80 o CD86 para CD152, ICAM1, ICAM2 e ICAM3 para CDlla/CD18, 4-1BBL para CDwl37. Las moléculas de activación son expresadas por células B, incluyen pero no están limitadas a Ig de superficie, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD40, CD45, CD80, CD86 e ICAMl. Similarmente , los ligandos naturales de estas moléculas y anticuerpos dirigidos a ellos también como derivados de anticuerpo pueden ser utilizados para administrar una señal de activación a células B. "Enfermedad neoplásica", "cáncer", "malignidad", "tumor sólido" o "alteración hiperproliferativa" son usados como términos sinónimos que se refieren a cualquiera de un número de enfermedades que son caracterizadas por la proliferación anormal sin control de células, la habilidad de las células afectadas para esparcirse localmente o por lo medio de la corriente sanguínea y sistema linfático a otras partes del cuerpo (esto es, experimentar metástasis), también como cualquiera de un número de aspectos estructuralmente y/o moleculares característicos. Una célula "cancerosa" o "maligna" o "célula de tumor sólido" se comprende como una célula que tiene propiedades estructurales especificas, carentes de diferenciación y es capaz de invasión y metástasis. "Enfermedad neoplásica" o "cáncer" se refiere a todos los tipos de cáncer o neoplasma o se tumores malignos encontrados en mamíferos, en los que se incluyen carcinomas, sarcomas, linfornas y leucemias. Ejemplos son cánceres de pecho, pulmón, estómago y esófago, cerebro y sistema nervioso, cabeza y cuello, hueso, hígado, vesícula biliar, páncreas, colon, sistema genitourinario, vejiga urinaria, sistema urinario, riñon, testículos, útero, ovario, próstata, piel y apéndices de piel, melanoma, mesotelioma, sistema endocrino (véase DeVita, et al., (editores) , 2001, Cáncer Principies and Practice of Oncology, 6a edición, Lippincott Williams y Wilkins, Filadelfia, PA; esta referencia es incorporada en la presente en su totalidad para todos los propósitos) . "Metastático" se refiere a células de tumor como se define anteriormente que se esparcen a otros órganos o a sitios distantes del mismo órgano. "Cáncer-asociado" se refiere a la relación de un ácido nucleico y su expresión o carente de la misma o una proteína y su nivel o actividad o carencia de la misma, al inicio de la malignidad en una célula de sujeto. Por ejemplo, un cáncer puede estar asociado con la expresión de un gen particular que no es expresado o es expresado a un nivel más bajo, en una célula saludable normal.

Inversamente, un gen cáncer-asociado puede ser uno que no es expresado en una célula maligna (o en una célula que sufre transformación) o es expresada a un nivel más bajo en la célula maligna que el que es expresado en una célula salidable normal. En el contexto de cáncer, el término "transformación" se refiere al cambio que una célula normal sufre a medida que se vuelve maligna. En eucariontes, el término "transformación" puede ser usado para describir la conversión de células normales a células malignas en cultivo celular . "Células proliferantes" son aquellas que están sufriendo activamente división ceñular y crecimiento exponencialmente, "Pérdida del control de proliferación celular" se refiere a la propiedad de las células que han perdido los controles de ciclo celular que aseguran normalmente la restricción apropiada de división celular. Las células que han perdido tales controles proliferan a una velocidad más rápida de la normal, sin señales estimulatorias y no responden a señales inhibidoras. "Cáncer avanzado" significa cáncer que ya no está localizado al sitio de tumor primario o un cáncer que es de Etapa III o IV de acuerdo con el American Joint Committee on Cáncer (AJCC) . "Bien tolerado" se refiere a la ausencia de cambios adversos en el estatus de salud que ocurren como resultado del tratamiento y afectarían decisiones de tratamiento . "Metastático" se refiere a células de tumor, por ejemplo, tumor sólido de humano o malignidad genitourinaria que son aptas de establecer lesiones de tumor secundarias en los pulmones, hígado, huesos o cerebro de ratones deficientes inmunes después de inyección al cojinete trasero mamario y/o la circulación del ratón deficiente inmune.

TRATAMIENTO DE CÁNCER Un complejo de anticuerpo de citoquina o un complejo de citoquina/ receptor de citoquina es útil en un método de tratamiento de enfermedad, por ejemplo enfermedad neoplásica. Un "tumor sólido" incluye pero no está limitado a, sarcoma, melanoma, carcinoma u otro cáncer de tumor sólido . "Sarcoma" se refiere a un tumor que está compuesto de una sustancia semejante al tejido conectivo embriónico y está en general compuesto de células empacadas estrechamente embebidas o incrustadas en una sustancia fibrilar u homogénea. Los sarcomas incluyen pero no están limitados a, condrosarcoma , fibrosarcoma, linfosarcoma, melanosarcoma, mixosarcoma, osteosarcoma , sarcoma de Abemethy, sarcoma adiposo, liposarcoma, sarcoma de parte blanda alveolar, sarcoma ameloblástico, sarcoma botrioide, sarcoma cloroma, coriocarcinoma, sarcoma embrional, sarcoma de tumor de Wilms, sarcoma endometrial, sarcoma estromal, Sarcoma de Ewing, sarcoma facial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de célula gigante, sarcoma granulocitico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma hemorrágico pigmentado múltiple idiopático, sarcoma inmunoblástico de células B, linfoma, sarcoma inmunoblástico de células T, sarcoma de Jensen, Sarcoma de Kaposi, sarcoma de célula de Kupffer, angiosarcoma, leucosarcoma, sarcoma mesenquioma maligno, sarcoma pareosteal, sarcoma reticulocitico, sarcoma .de Rous, sarcoma serocistico, sarcoma sinovial y sarcoma telangiectático o fibroma. "Melanoma" se refiere a un tumor que surge del sistema melanocitico de la piel y otros órganos. Los melanomas incluyen, por ejemplo melanoma acral-lentiginoso, melanoma amelanótico, melanoma juvenil benigno, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma de Harding-Passey, melanoma juvenil, melanoma maligno lentigo, melanoma maligno, melanoma nodular, melanoma subungal y melanoma de esparcimiento superficial. "Carcinoma" se refiere a un nuevo crecimiento maligno compuesto de células epiteliales que tienden a infiltrarse a los tejidos de los alrededores y dar surgimiento a metástasis. Carcinomas ejemplares incluyen, por ejemplo, carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenocístico, carcinoma cístico adenoide, carcinoma adenomatosura, carcinoma de corteza adrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de célula alveolar, carcinoma de célula basal, carcinoma basocellulare , carcinoma basaloide, carcinoma de célula basoescamosa, carcinoma bronquioalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogénico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriónico, carcinoma coloide, comedo carcinoma, corpus carcinoma, carcinoma cribiforme, carcinoma en cuirasse, carcinoma cutaneum, carcinoma cilindrico, carcinoma de célula cilindrica, carcinoma de ducto, carcinoma durum, carcinoma embrional, carcinoma encefaloide, carcinoma epidermoide, carcinoma epitheliale adenoides, carcinoma exofítico, carcinoma ex ulcere, carcinoma fibrosum, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de célula gigante, carcinoma gigantocellulare, carcinoma glandular, carcinoma de célula granulosa, carcinoma de vello-matriz, carcinoma hematoide, carcinoma hepatocelular , carcinoma de célula de Hurthle, carcinoma hialino, carcinoma hipemefroide, carcinoma embrional infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial , carcinoma de Krompecher, carcinoma de célula de Kulchitzky, carcinoma de célula grande, carcinoma lenticular, carcinoma lenticulare, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial , carcinoma medullare, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma molle, carcinoma mucinoso, carcinoma muciparum, carcinoma mucocellulare, carcinoma mucoepidernoide, carcinoma mucosum, carcinoma mucoso, carcinoma mixomatodes , carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células de avena, carcinoma ossificans, carcinoma osteoide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma pre-invasivo, carcinoma de célula de prickle, carcinoma pultáceo, carcinoma de célula renal de riñon, carcinoma de célula de reserva, carcinoma sarcomatodes , carcinoma schneideriano, carcinoma escirroso, carcinoma scroti, carcinoma de célula en anillo de sello, carcinoma simplex, carcinoma de célula pequeña, carcinoma solanoide, carcinoma de célula esferoidal, carcinoma de célula de husillocarcinoma spongiosum, carcinoma escamoso, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de string, carcinoma telangiectaticum, carcinoma telangiectodes , carcinoma de célula transicional , carcinoma tuberosum, carcinoma tuberoso, carcinoma verrugoso y carcinoma viflosum. "Leucemia" se refiere a enfermedades malignas progresivas de los órganos que forman sangre y está en general caracterizada por una proliferación distorsionada y desarrollo de leucocitos y sus- precursores en la sangre y médula ósea. La leucemia es clasificada en general en base a (1) la duración y carácter de la enfermedad—aguda o crónica; (2) el tipo de célula involucrada; mieloide (milogenosa) , linfoide ( linfogenosa ) o monocítica; y (3) el incremento o no incremento en el número de células anormales en la sangre-leucémica o aleucémica (subleucémica) . La leucemia incluye, por ejemplo, leucemia no linfocitica aguda, leucemia linfocitica crónica, leucemia granulocitica aguda, leucemia granulocitica crónica, leucemia promielocitica aguda, leucemia de célula T adulta, leucemia aleucémica, una leucemia leucocitémica, leucemia basofilica, leucemia de célula de blasto, leucemia bovina, · leucemia mielocitica crónica, leucemia cutis, leucemia embrional, leucemia eosinofilica, leucemia de Gross, leucemia de célula de vello, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocitica, leucemia de célula de tallo, leucemia monocítica aguda, leucemia leucopénica, leucemia linfática, leucemia linfoblástica , leucemia linfocitica, leucemia linfogenosa, leucemia linfoide, leucemia de célula linfosarcoma, leucemia de célula cebada, leucemia megacariocítica, leucemia micromieloblástica, leucemia monocítica, leucemia mieloblástica, leucemia mielocitica, leucemia granulocitica mieloide, leucemia mielomonocítica, leucemia de Naegeli, leucemia de célula de plasma, leucemia plasmacítica, leucemia promielocitica, leucemia de célula de Rieder, leucemia de Schilling, leucemia de célula de tallo, leucemia subleucémica y leucemia de célula sin diferenciar.

Cánceres adicionales incluyen, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, linfoma que no de Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de pecho, cáncer de ovarios, cáncer de pulmón, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores de pulmón de célula pequeña, tumores de cerebro primarios, cáncer de estómago, cáncer de colon, insulanoma pancreático maligno, carcinoide maligno, cáncer de vejiga urinaria, lesiones de la piel premalignas, cáncer testicular, linfomas, cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer esofagal, cáncer del sistema genitourinario, hipercalcemia maligna, cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer cortical adrenal y cáncer de próstata .

APLICACIÓN TERAPÉUTICA DE UN COMPLEJO DE CITOCINA DE ANTICUERPO Como es bien entendido en el arte, reactivos de captura bioespecificos incluyen anticuerpos, fragmentos de enlace de anticuerpos que se enlazan a citoquinas o linfocinas (por ejemplo, moléculas de anticuerpo completas que tienen cadenas pesadas y cadenas ligeras de plena longitud o cualquier fragmento de las mismas o aficuerpos (Affibody, Teknikringen 30, Bx 700 04, Stockholm SE-10044, Suecia; véase patente estadounidense No. 5,831,012, incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos) ) . Dependiendo del uso propuesto, también pueden incluir receptores y otras proteínas que se enlazan específicamente a otra biomolécula. "Anticuerpo" se refiere a un polipéptido que comprende una región de estructura a partir de un gen de inmunoglobulina o fragmento del mismo que se enlazan específicamente y reconocen un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilón y mu, también como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras son clasificadas ya sea como kappa o lambda. Las cadenas pesadas son clasificadas como gamma, mu, alfa, delta o epsilón, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD y IgE, respectivamente. Comúnmente, la región de enlace de antígeno de un anticuerpo será más crítica en especificidad y afinidad de enlace. Los anticuerpos híbridos y fragmentos de anticuerpo híbridos incluyen moléculas de anticuerpo completas que tienen cadenas pesadas y ligeras de plena longitud o cualquier fragmento de las mismas, por ejemplo, fragmentos de anticuerpo que incluyen la región de Fe. Los anticuerpos quiméricos que tienen regiones variables como se describe en la presente y regiones constantes de varias especies también son apropiados. Véase, por ejemplo, solicitud de patente estadounidense No. 20030022244. Inicialmente, un objeto blanco predeterminado es escogido a la cual un anticuerpo puede ser criado. Las técnicas para generar anticuerpos monoclonales dirigidos a objetos blanco u objetivo son bien conocidos para aquellos experimentados en el arte. Ejemplos de tales técnicas incluyen, pero no están limitados a, aquellas que involucran bibliotecas de despliegue, ratones xeno o humab, hibridomas y los semejantes. Los objeto objetivo incluyen cualquier sustancia que es capaz de exhibir antigenicidad y son usualmente proteínas o polisacáridos de proteína. Ejemplos incluyen receptores, enzimas, hormonas, factores de crecimiento, péptidos y los semejantes. Se debe entender que no solamente están los anticuerpos que se presentan de manera estable en la naturaleza apropiados para uso de acuerdo con la presente revelación, sino que anticuerpos y fragmentos de anticuerpo diseñados que están dirigidos a un objeto predeterminado son también apropiados. Los anticuerpos (Ab) que pueden ser sometidos a las técnicas resumidas en la presente incluyen anticuerpos monoclonal y policlonales , y fragmentos de anticuerpos que incluyen la región de Fe, tales como diacuerpos, cadenas ligeras de anticuerpo, cadenas pesadas de anticuerpo y/o fragmentos de anticuerpo derivados de las tecnologías de despliegue de fago o fagémido. Para empezar, un anticuerpo inicial es obtenido a partir de una especie de origen. Más en particular, la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos de la porción variable de la cadena ligera, cadena pesada o ambas, de un anticuerpo de especie de origen que tiene especificidad por un antigeno objetivo es necesaria. La especie de origen es cualquier especie que fue usada para generar los anticuerpos o bibliotecas de anticuerpo, por ejemplo, rata, ratón, conejo, pollo, mono, humano y los semejantes. Técnicas para generar y clonar anticuerpos monoclonales son bien conocidas para aquellos experimentados en el arte. Después que se obtiene un anticuerpo deseado, las regiones variables (VH y VL) son separadas en partes componente (esto es, estructuras (FR) y CDR) utilizando cualquier definición posible de CDR (por ejemplo, Kabat solo, Chothia solo, Kabat y Chothia combinados o cualesquier otros conocidos para aquellos experimentados en el arte) . Una vez que se ha obtenido, la selección de estructuras de especie objetivo apropiadas es necesaria. Una modalidad involucra la alineación de cada región de estructura individual de la secuencia de anticuerpo de la especie de origen con secuencias de aminoácidos variables o secuencias genéticas de la especie objetivo. Programas para buscar alineaciones son bien conocidos en el arte, por ejemplo, BLAST y los semejantes.

Por ejemplo, si la especie objetivo es humana, una fuente de tales secuencias de aminoácidos o secuencias genéticas (linea germinal o secuencias de anticuerpo rearregladas ) se puede encontrar en cualquier base de datos de referencia apropiado tal como Genbank, el banco de datos de proteínas de NCBI (por ejemplo http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), VBASE, una base de datos de genes de anticuerpos humanos (http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc) "'y la base de datos de Kabat de inmunoglobulinas (http://www.immuno.bme.nwu.edu) o productos traducidos de los mismos. Si las alineaciones se hacen basadas en la secuencia de nucleótidos, entonces los genes seleccionados deben ser analizados para determinar cuales genes de aquel subconjunto tienen la homología de aminoácidos más estrecha al anticuerpo de la especie de origen. Se contempla que secuencias dé aminoácidos o secuencias genéticas que se aproximan a una homología de un grado más alto en comparación con otras secuencias en la base de datos pueden ser utilizadas y manipuladas de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente. Además, las secuencias de aminoácidos o genes que tienen menor homología pueden ser utilizados cuando codifican productos que, cuando son manipulados y seleccionados de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente, exhiben especificidad por el antígeno objetivo predeterminado. En ciertas modalidades, un intervalo aceptable de homología es mayor de aproximadamente 50%. Se debe comprender que la especie objetivo puede ser diferente a la humana. "Tratamiento" se refiere a cualesquier indicaciones de éxito en el tratamiento o mejora de una prevención de cáncer, en los que se incluyen cualquier objetivo o subjetivo tal como abatimiento; remisión; disminución de los síntomas o hacer las condiciones de la enfermedad más tolerables al paciente; alentamiento en la velocidad de degeneración o disminución; o hacer el punto final punto de degeneración menos debilitante. El tratamiento o mejora de síntomas puede estar basado en parámetros objetivos o subjetivos, en los que se incluyen los resultados de un examen por un médico. Así, el término "tratamiento" incluye la administración de los compuestos o agentes de la presente invención para prevenir o retardar, aliviar o detener o inhibir el desarrollo de los síntomas o condiciones asociadas con la enfermedad, por ejemplo, enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune, radiación de agotamiento celular o quimioterapia o enfermedad infecciosa. El término "efecto terapéutico" se refiere a la reducción, eliminación o prevención de la enfermedad, síntomas de la enfermedad o efectos secundarios de la enfermedad en el suj eto . "En combinación con", "terapia de combinación" y "productos de combinación" se refieren, en ciertas modalidades, a la administración concurrente a un paciente de un primer terapéutico y los compuestos como se usan en la presente. Cuando es administrado en combinación, cada componente puede ser administrado al mismo tiempo o secuencialmente en cualquier orden o puntos diferentes en el tiempo. Asi, cada componente puede ser administrado separadamente pero suficientemente cercano en tiempo para proporcionar el efecto terapéutico deseado. "Administración concomitante" de un fármaco terapéutico de cáncer conocido o fármaco terapéutico autoinmune con una composición farmacéutica de la presente invención significa la administración del fármaco y el anticuerpo o composición de complejo de anticuerpo de citoquina o composición de complejo de citoquina/receptor de citoquina a un tiempo tal que tanto el fármaco conocido como la composición de la presente invención tendrán un efecto terapéutico. Tal administración concomitante puede involucrar la administración concurrente (esto es, al mismo tiempo) , antes o subsecuente a la administración del fármaco terapéutico de cáncer o fármaco terapéutico autoinmune con respecto a la administración de un compuesto de la presente invención. La persona de habilidad ordinaria en el arte, no tendría dificultad en determinar la temporización, secuencia y dosificaciones apropiadas de administración para fármacos y composiciones particulares de la presente invención.

"Que trata" o "tratamiento" de enfermedad, por ejemplo, enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune, radiación de agotamiento celular o quimioterapia o enfermedad infecciosa, utilizando los métodos de la presente invención incluye impedir el inicio de síntomas en un sujeto que puede estar en riesgo incrementado de enfermedad pero que todavía no experimenta o exhibe síntomas de infección, inhibir los síntomas de infección (alentar o detener su desarrollo) , proporcionar alivio de los síntomas o efectos secundarios de infección (en los que se incluyen tratamiento paliativo) y alivio de los síntomas de infección (provocar regresión) . "Unidad de dosificación" se refiere a unidades físicamente discretas apropiadas como dosificaciones unitarias para el individuo particular a ser tratado. Cada unidad puede contener una cantidad predeterminada de compuesto (s) activo (s) calculada para producir el (los) efecto (s) terapéutico ( s ) deseado (s) en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación pueden ser determinadas por (a) las características únicas del (los) compuesto (s) activo(s) y el (los) efecto(s) terapéutico ( s ) particular (es ) a ser obtenidos y (b) las limitaciones inherentes en el arte de combinar tal(es) compuesto(s) activo(s).

"Idéntico" o por ciento de "identidad," en el contexto de dos o más secuencias ¦ de ácidos nucleicos o polipéptidos , se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos (esto es, aproximadamente 60% de identidad, preferiblemente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o identidad más alta en una región especificada (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica una citoquina, anticuerpo o receptor de citoquina, como se describe en la presente o secuencia de aminoácidos de una citoquina, anticuerpo o receptor de citoquina, como se describe en la presente) , cuando es comparada y alineada por correspondencia máxima en una ventana de comparación o región designada) tal como se mide utilizando algoritmos de comparación de secuencias BLAST o BLAST 2.0 con parámetros predeterminados descritos posteriormente en la presente o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, sitio web de NCBI). Entonces se dice que tales secuencias son "sustancialmente idénticas". Este término también se refiere a o puede aplicado al complemento de una secuencia de prueba. El término también incluye secuencias que tienen cancelaciones y/o adiciones, . también como aquellas que tienen sustituciones. Como se describe posteriormente en la presente, los algoritmos preferidos pueden tomar en cuenta espacios y los semejantes. Preferiblemente, la identidad existe sobre una región que es por lo menos de aproximadamente 25 aminoácidos o nucleótidos de longitud o más preferiblemente sobre una región que es de 50-100 aminoácidos o nucleótidos de longitud. Para la comparación de secuencias, comúnmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, a la cual la secuencia de prueba cuando son comparadas. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia son introducidas a una computadora, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario y se designan parámetros del programa de algoritmo de secuencia. Preferiblemente, se pueden usar los parámetros predeterminados del programa o se pueden designar parámetros alternativos. Luego el algoritmo de comparación de secuencias calcula el por ciento de identidades de secuencias para la secuencia de prueba en relación con la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa. Una "ventana de comparación", como se usa en la presente, incluye referencia a un segmento de cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste de 20 a 600, usualmente alrededor de 50 a alrededor de 200, más usualmente alrededor de 100 a alrededor de 150 en la cual una secuencia puede ser comparada con una secuencia de referencia del mismo miembro de posición contiguas después que las dos secuencias son alineadas óptimamente. Métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en el arte. La alineación óptima de secuencias para comparación se puede llevar a cabo, por ejemplo mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math, 2: 482, 1981, mediante el algoritmo de alineación de homología de Nedleman y Wunsch, J. Mol. Biol, 48:443, 1970, mediante el método de búsqueda de similaridad de Pearson y Lipman, Proc. Nafl. Acad. Sci. USA, 85:2444, 1988, mediante implementación computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de elementos de programación o software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante alineación manual e inspección visual {véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds . , Current Protocols in Molecular Biology. Complemento 1995) . Un ejemplo preferido de algoritmo que es apropiado para determinar el por ciento de identidad de secuencia y similaridad de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que son descritos en Altschul et al., Nuc. Acids Res, 25:3389-3402, 1977 y Altschul et al., J. Mol. Biol, 215:403-410, 1990, respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 son usados, con los parámetros descritos en la presente, para determinar el por ciento de identidad de secuencia para los ácidos nucleicos y proteínas como modalidades de la invención. Elementos de programación o software para efectuar análisis de BLAST están disponible públicamente por medio del Nacional Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra identificar primero pares de secuencia de alta puntuación (HSP) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia de interrogación, que ya sea coinciden o satisfacen alguna puntuación T de umbral de valor positivo cuando es alineada con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T es denominado como el umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et al., supra) . Estos aciertos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas por HSP más largas que los contienen. Los aciertos de palabra son extendidos en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en cuanto a tan lejos la puntuación de alineación acumulativa puede ser incrementada. Las puntuaciones acumulativas son calculadas utilizando para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación hacia atrás para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalidad para residuos que no coinciden; siempre < 0) . Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección son detenidas cuando: la puntuación de alineación acumulativa falla por la cantidad X de su valor obtenido máximo; la puntuación acumulativa va a cero o menor, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa o se llega al final ya sea de una u otra secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, =5, N=-4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como predeterminados una longitud de palabra de 3 y esperanza (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 89:10915, 1989) alineaciones (B) de 50, esperanza (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras. "Polipéptido" , "péptido" y "proteína" son usados intercambiablemente en la presente . para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos es un mimético químico artificial de un aminoácido que se presentan de manera estable en la naturaleza correspondiente, también como a polímeros de aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza y polímeros de aminoácidos que no se presentan de manera estable en la naturaleza. "Aminoácido" se refiere a aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza y aminoácidos sintéticos, también como análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza. Los aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza son aquellos codificados por el código genético, también como aquellos aminoácidos que son modificados más tarde, por ejemplo, hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato y O-fosfoserina . Análogos de aminoácido se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica como un aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza, esto es, un carbono a que está enlazado a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina metil sulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas fundamentales de péptido modificadas, pero retienen la misma estructura química básica como un aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza. Miméticos de aminoácido se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza . Los aminoácidos pueden ser denominados en la presente ya sea por sus símbolos de tres letras conocidos comúnmente o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Asimismo, los nucleótidos pueden ser denominados por sus códigos de una sola letra aceptados comúnmente. "Variantes modificadas conservadoramente" se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, variantes modificadas conservadoramente se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas o en donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido de la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican el aminoácido alanina. Así, en cada posición en donde se específica una alanina por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silentes", que son una especie de variaciones modificadas conservadoramente . Cada secuencia de ácidos nucleicos en la presente que codifica un polipéptido también describe cada variación silente posible del ácido nucleico. Aquel de habilidad en el arte reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón para metionina y TGG, que es ordinariamente el único codón para triptófano) puede ser modificado para producir una molécula funcionalmente idéntica. Asi, cada variación silente de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita con respecto a producto de expresión, pero no con respecto a secuencias de sonda reales. En cuanto a secuencias de aminoácidos, aquel de habilidad en el arte reconocerá que sustituciones, cancelaciones o adiciones individuales a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia de proteína que altera, agrega o cancela un solo aminoácido o un porcentaje pequeño de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada conservadoramente" en donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en el arte. Tales variantes modificadas conservadoramente son además de y no excluyen variantes polimórficas , homólogos de interespecie y alelos como modalidades de la invención. Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre si: 1) Alanina (A), Glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W) ; 7) Serina (S), Treonina (T) ; y 8) Cisteina (C) , Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984) ) . Las estructuras macromoleculares tales como estructuras de polipéptidos pueden ser descritas en términos de varios niveles de organización. Para una discusión general de esta organización, véase, por ejemplo, Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 3a ed. , 1994) y Cantor y Schimmel, Biophysical Chemistry Part I: The Conformation de Biological Macromolecules , 1980. "Estructura primaria" se refiere a la secuencia de aminoácidos de un péptido particular. "Estructura secundaria" se refiere a estructuras tridimensionales ordenadas localmente dentro de un polipéptido. Estas estructuras son comúnmente conocidas como dominios, por ejemplo dominios enzimáticos, dominios extracelulares, dominios de transmembrana, dominios de poro y dominios de cola citoplásmicos . Los dominios son porciones de un polipéptido que forman una unidad compacta del polipéptido y son comúnmente de 15 a 350 aminoácidos de largo. Dominios ejemplares incluyen dominios con actividad enzimática, por ejemplo, un dominio de cinasa. Los dominios típicos están compuestos de secciones de organización menor tales como estiramientos de hoja ß y a-hélices. "Estructura terciaria" se refiere a la estructura tridimensional completa de un monómero de polipéptido. "Estructura cuaternaria" se refiere a la estructura tridimensional formada por la asociación no covalente de unidades terciarias independientes. Los términos anisotrópicos son también conocidos como términos de energía. Una secuencia de ácidos nucleicos particular también abarca implícitamente "variantes de empalme". Similarmente, una proteína particular codificada por un ácido nucleico abarca implícitamente cualquier proteína codificada por una variante de empalme de aquel ácido nucleico. "Variantes de empalme", como el nombre sugiere, son productos de empalme alternativo de un gen. Después de la transcripción, un transcripto de ácido nucleico inicial puede ser empalmado, de tal manera que diferentes productos de empalme de ácido nucleico (alterno) codifican diferentes polipéptidos . Mecanismos para la producción de variantes de empalme varían, pero incluyen empalme alternado de exones. Polipéptidos alternados derivados del mismo ácido nucleico mediante transcripción de lectura son también abarcados por la definición. Cualesquier productos de una región de empalme, en las que se incluyen formas recombinantes de los productos de empalme, están incluidos en esta definición. "Recombinante" cuando se usa con referencia, por ejemplo, a una célula o ácido nucleico, proteina o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteina o vector, ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o proteina heterólogo o la alteración de un ácido nucleico o proteina o que la célula es derivada de una célula asi modificada. Asi, por ejemplo, células recombinantes expresan genes que no son encontrados en la forma natural (no recombinante ) de la célula o expresa genes naturales que son de otra manera expresado anormalmente, sub-expresados o no expresados para nada. La frase "condiciones de hibridización severas" se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda se hibridizará a su subsecuente objetivo, comúnmente en una mezcla compleja de ácidos nucleicos, pero no a otras secuencias. Las condiciones severas son dependientes de secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas se hibridizan específicamente a temperatura más altas. Una guía extensa a la hibridización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, "Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hibridization with Nucleic Probes, "Overview de principies de hybridization and the strategy de nucleic acid assays, 1993. En general, condiciones severas son seleccionadas para ser de aproximadamente 5-10°C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia especificada a un pH de fuerza iónica definida. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica, pH y concentración de ácido nucleico definido) a la cual el 50% de las sondas complementarias al objetivo se hibridizan a la secuencia objetivo al equilibrio (ya que las secuencias objetivo están presentes en exceso, a Tm, el 50% de las sondas son ocupadas en equilibrio) . Condiciones severas pueden también ser obtenidas con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para la hibridización especifica o selectiva, una señal positiva es por lo menos dos veces el fondo, preferiblemente 10 veces la hibridización de fondo. Condiciones de hibridización severas ejemplares pueden ser como sigue: formamida al 50%, SSC 5x y SDS al 1%, incubación a 42°C, o SSC 5x, SDS al 1%, incubación a 65°C, con lavado en SSC 0.2x y SDS al 0.1% a 65°C. Ácidos nucleicos que no se hibridizan entre si bajo condiciones severas son todavía sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico utilizando la degeneración de codón máxima permitida por el código genético. En tales casos, los ácidos nucleicos se hibridizan comúnmente bajo condiciones de hibridización moderadamente severas. "Condiciones de hibridización moderadamente severas" ejemplares incluyen una hibridización en un solución reguladora del pH de formamida al 40%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C y un lavado en SSC IX a 45°C. Una hibridización positiva es por lo menos dos veces el fondo. Aquellos de habilidad ordinaria reconocerán fácilmente que condiciones de hibridización y lavado alternativas pueden ser utilizadas para proporcionar condiciones de severidad similares. Guias adicionales para determinar parámetros de hibridización son provistos en numerosas referencias, por ejemplo, Ausubel et al., supra. Para PCR, una temperatura de aproximadamente 36°C es típica para una amplificación de baja severidad, aunque las temperaturas de recocido pueden variar entre aproximadamente 32 °C y 48 °C dependiendo de la longitud del cebador. Para amplificación de PCR de alta severidad, una temperatura de aproximadamente 62 °C es típica, aunque las temperaturas de recocido de alta severidad pueden fluctuar de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 65 °C, dependiendo de la longitud y especificidad del cebador. Condiciones de ciclo típicas tanto para amplificaciones de alta o baja severidad incluyen una fase de desnaturalización de 90°C- 95°C por 30 segundos-2 minutos, y una fase de recocido que dura 30 segundos-2 minutos y una fase de extensión de aproximadamente 72°C durante 1-2 minutos. Protocolos y guias para reacciones de amplificación de alta y baja severidad son provistos, por ejemplo, en Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y., 1990. "Excipiente aceptable farmacéuticamente" significa un excipiente que es útil en la proporción de una composición farmacéutica que es en general seguro, no tóxico y deseable, e incluye excipientes que son aceptables para uso veterinario también como para uso farmacéutico humano. Tales excipientes pueden ser sólidos, líquidos, semisólidos o en el caso de una composición en aerosol, gaseosos. "Sales y ésteres aceptables farmacéuticamente" significa sales y ésteres que son aceptables farmacéuticamente y tienen las propiedades farmacológicas deseadas. Tales sales incluyen sales que pueden ser formadas en donde protones ácidos presentes en los compuestos son capaces de reaccionar con bases inorgánicas u orgánicas. Sales inorgánicas apropiadas incluyen aquellas formadas con los metales alcalinos, por ejemplo sodio y potasio, magnesio, calcio y aluminio. Sales orgánicas apropiadas incluyen aquellas formadas con bases orgánicas tales como las bases de amina, por ejemplo etanolamina, dietanolamina, trietanolamina , trometamina, N-metilglucamina y los semejantes. Tales sales también incluyen sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos {por ejemplo, ácidos clorhídrico y bromhídrico) y ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético, ácido cítrico, ácido maleico y los ácidos alean- y aren- sulfónicos tales como ácido metansulfónico y ácido becensulfónico) . Esteres aceptables farmacéuticamente incluyen esteres formados a partir de grupos carboxi, sulfoniloxi y fosfonoxi presentes en los compuestos, por ejemplo Ci- 6 alquil ésteres. Cuando hay dos grupos ácido presentes, una sal o éster aceptable farmacéuticamente puede ser una mono-sal o éster mono-ácido o una di-sal o éster y similarmente , en donde hay más de dos grupos ácidos presentes algunos o todos de tales grupos pueden ser salificados o esterificados . Los compuestos nombrados en esta invención pueden estar presentes en forma sin salificar o sin esterificar o en forma salificada y/o esterificada y se pretende que la mención de tales componentes incluya tanto el compuesto original (sin salificar y sin esterificar) y sus sales y ésteres aceptables farmacéuticamente. También, ciertos compuestos nombrados en esta invención pueden estar presente en más de una forma estereoisomérica y la mención de tales compuestos se propone incluir todos de los estereoisómeros individuales y todas las mezclas (ya sea racémicas o de otra manera) de tales estereoisómeros . "Aceptable farmacéuticamente", "tolerable fisiológicamente" y variaciones gramáticas de las mismas, ya que se refieren a composiciones, portadores, diluyentes y reactivos, son usados intercambiablemente y representan que los materiales son aptos de administración a o en un humano sin la producción de efectos fisiológicos indeseables a un grado que prohibiría la administración de la composición. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" significa que la cantidad, cuando es administrada a un sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar el tratamiento por aquella enfermedad. Excepto en donde se indique, "sujeto" o "paciente" son usados intercambiablemente y se refieren a mamíferos tales como pacientes humanos y primates no humanos, también como animales experimentales tales como conejos, ratas y ratones y otros animales. Así, el término "sujeto" o "paciente" como se usa en la presente significa cualquier paciente o sujeto mamífero al cual las composiciones pueden ser administradas. En algunas modalidades de la presente invención, el paciente estará sufriendo de enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune, radiación o quimioterapia de agotamiento celular, enfermedad infecciosa o una condición que provoca resistencia disminuida a la enfermedad, por ejemplo, HIV. En una modalidad ejemplar de la presente invención, para identificar pacientes sujetos para el tratamiento con una composición farmacéutica que comprende uno o más complejos de anticuerpo de citoquina de acuerdo con los métodos de selección aceptados son usados para determinar el estatus de una enfermedad o condición existente en un sujeto o factores de riesgo asociados con una enfermedad o condición apuntada o sospechada. Estos métodos de selección incluyen por ejemplo, exámenes para determinar si un sujeto está sufriendo de una enfermedad. Estos y otros métodos de rutina permiten que el clínico seleccione sujetos en necesidad de terapia. Después de seleccionar candidatos de región de estructura apropiados de la misma familia y/o el mismo miembro de familia, ya sea una u otra o ambas de las regiones variables de cadena pesada y ligera son producidas al injertar las CDR de la especie de origen a las regiones de estructura híbridas. El ensamble de anticuerpos híbridos o fragmentos de anticuerpo híbridos que tienen regiones de cadena variable híbridas entre sí de los aspectos anteriores se pueden llevar a cabo utilizando métodos convencionales conocidos para aquellos experimentados en el arte. Por ejemplo, secuencias de ADN que codifican los dominios variables híbridos descritos en la presente (esto es, estructuras basadas en la especie objetivo y CDR de la especie de origen) pueden ser producidas mediante síntesis de oligonucleótidos y/o PCR. El ácido nucleico que codifica regiones de CDR puede también ser aislado a partir del anticuerpo de la especie de origen utilizando enzimas de restricción apropiadas y ligados a la estructura de especie objetivo mediante ligación con enzimas de ligación apropiadas. Alternativamente, las regiones de estructura de las cadenas variables del anticuerpo de especie de origen pueden ser cambiadas mediante mutagénesis dirigida al sitio. Puesto que los híbridos son construidos de elecciones entre múltiples candidatos correspondiente a cada región de estructura, existen muchas combinaciones de secuencias que son propensas a construcción de acuerdo con los principios descritos en la presente. Así, bibliotecas de híbridos pueden ser ensambladas que tienen miembros con diferentes combinaciones de regiones de estructura individuales. Tales bibliotecas pueden ser colocaciones de bases de datos electrónicas de secuencias o colecciones físicas de híbridos. El ensamble de un anticuerpo físico o biblioteca de fragmento de anticuerpo se lleva a cabo preferiblemente utilizando oligonucleótidos sintéticos. En un ejemplo, oligonucleótidos son diseñados que tienen regiones de superposición o traslapantes de tal manera que se podrían recocer y ser llenados mediante una polimerasa, tal como con reacción en cadena de polimerasa (PCR). Múltiples etapas de extensión de superposición son efectuadas con el fin de generar los insertos de gen de VL y VH. Aquellos fragmentos son diseñados con regiones de superposición con dominios constantes humanos, de tal manera que podrían ser fusionados mediante extensión de superposición para producir cadenas ligeras de plena longitud y fragmentos de cadena pesada de Fd. Las regiones de cadena Fd ligera y pesada pueden ser enlazadas conjuntamente mediante extensión de superposición para crear un solo inserto de biblioteca de Fab a ser clonado a un vector de despliegue. También se puede usar métodos alternativos para el ensamble de los genes de biblioteca humanizados. Por ejemplo, la biblioteca puede ser ensamblada de la superposición de oligonucleótidos utilizando un procedimiento de reacción en cadena de ligasa (LCR) . Chalmers et al., Biotechniques, 30-2: 249-252, 2001. Varias formas de fragmentos de anticuerpo pueden ser generadas y clonadas a un vector apropiado para crear una biblioteca de anticuerpo híbrida o biblioteca de fragmento de anticuerpo híbrida. Por ejemplo genes variables pueden ser clonados a un vector que contiene, en cuadro, la porción restante del dominio constante necesario. Ejemplos de fragmentos adicionales que pueden ser clonados incluyen cadenas ligeras enteras, la porción de Fe de cadenas pesadas o fragmentos que contienen tanto la secuencia de codificación de Fe de cadena ligera y pesada. Cualquier sistema de despliegue de selección puede ser usado en conjunción con una biblioteca de acuerdo con la presente revelación. Protocolos de selección para aislar miembros deseados de bibliotecas grandes son conocidos en el arte, tal como se tipifica por técnicas de despliegue de fago. Tales sistemas, en los cuales diversas secuencias de péptidos son desplegadas sobre la superficie de bacteriófagos filamentosos han probado ser útiles para crear bibliotecas de fragmentos de anticuerpo (y las secuencias de nucleótidos que los codifican) para la selección y amplificación in vitro de fragmentos de anticuerpo específicos que se enlazan a un antígeno objetivo. Scott et al., Science, 249: 386, 1990. Las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones de VH y VL son enlazadas a fragmentos de gen que codifican señales líderes que los dirigen al espacio periplásmico de E. coli y como resultado, los fragmentos de anticuerpo resultante son desplegados sobre la superficie del bacteriófago, comúnmente como fusiones a proteínas de recubrimiento de bacteriófago (por ejemplo, pIII o pVIII). Alternativamente, los fragmentos de anticuerpo son desplegados externamente sobre el fago lambda o cápsidos de T7 ( fagecuerpos ) . Una ventaja de los sistemas de despliegue a base de fago es que, debido a que son sistemas biológicos, miembros de biblioteca seleccionados pueden ser amplificados simplemente al cultivar el fago que contiene el miembro de biblioteca seleccionado en células bacterianas. Además, puesto que la secuencia de nucleótidos que codifica el miembro de biblioteca de polipéptido está contenida sobre un fago o vector de fagémido, la secuenciación, expresión y subsecuente manipulación genética es relativamente directa. Métodos para la construcción de bibliotecas de despliegue de anticuerpo de bacteriófago y bibliotecas de expresión de fago de lambda son bien conocidos en el arte. McCafferty et al., Nature, 348: 552, 1990; Kang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 88: 4363, 1991. La presente invención es concerniente además con anticuerpos y receptores de antigeno de célula T (TCR) que se enlazan específicamente a las citoquinas o linfocinas de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención incluyen IgG (en los que se incluyen IgGl, IgG2, IgG3 y IgG4), IgA (en los que se incluyen IgAl y IgA2), IgD, IgE o IgM y IgY. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" (Ab) se propone incluir anticuerpos enteros, en los que se incluyen anticuerpos enteros de una sola cadena y fragmentos de enlace de antígeno de los mismos. Más preferiblemente los anticuerpos son fragmentos de anticuerpo de enlace de antígeno humanos de la presente invención e incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos de una sola cadena, Fv disulfuro-enlazados (sdFv) , fragmentos que comprenden el dominio de Fe y fragmentos que comprende ya sea un dominio de VL o VH. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen de animal en los que se incluyen aves y mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos son humanos, murinos, de conejo, cabra, conejillo de indias, camello, caballo o pollo. Los fragmentos de anticuerpo de enlace de antígeno, en los que se incluyen anticuerpos de una sola cadena, pueden comprender la(s) región (es) variable (s) sola o en combinación con todos o parciales de los siguientes: región de engozne, dominio CHi, CH2 y CH3. También incluidos en la invención están cualquier combinaciones de región (es) variable (s) y región de engozne, dominios de CHi, CH2 y CH3. La presente invención incluye además anticuerpos monoclonales , policlonales , quiméricos, humanizados y monoclonales humanos y policlonales humanos que se enlazan específicamente a los polipéptidos de la presente invención. La presente invención incluye además anticuerpos que son anti-idiotípicos a los anticuerpos de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecífieos , bisespecífieos , trisespecífieos o de mayor multiespecificidad . Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para epítopos diferentes de un polipéptido de la presente invención o pueden ser específicos tanto para un polipéptido de la presente invención también como para composiciones heterologas, tales como un polipéptido heterologo o material de soporte sólido. Véase, por ejemplo, WO 93/17715; WO 92/08802; O 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al., J. Immunol. 147: 60-69, 1991; patentes estadounidenses Nos. 5,573,920; 4,474,893; 5,601,819; 4,714,681; 4,925,648, cada una incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos; Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553, 1992. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser descritos o especificados en términos del (de los) epítopo(s) o porción (es) de un polipéptido de la presente invención que son reconocidos o enlazados específicamente por el anticuerpo. El (los) epítopo(s) o porción (es) de polipéptido pueden ser especificados como se describe en la presente, por ejemplo, por posiciones N-terminal y C-terminal, por tamaño en residuos de aminoácidos contiguos. Los anticuerpos que se enlazan específicamente a cualquier epítopo o polipéptido de la presente invención pueden también ser excluidos. Por consiguiente, la presente invención incluye anticuerpos que se enlazan específicamente a polipéptidos de la presente invención y permiten la exclusión de los mismos.

Los anticuerpos de la presente invención pueden también ser descritos o especificados en términos de su reactividad cruzada. Los anticuerpos que no se enlazan a cualquier otro análogo, ortólogo u homólogo de los polipéptidos de la presente invención están incluidos. Los anticuerpos que no se enlazan a polipéptidos con menos de 95%, menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55% y menos de 50% de identidad (como se calcula utilizando métodos conocidos en el arte y descritos en la presente) a un polipéptido de la presente invención también incluido en la presente invención. Incluidos adicionalmente en la presente invención están los anticuerpos que se enlazan solamente a polipéptidos codificados por polinucleótidos que se hibridizan a un polinucleotido de la presente invención bajo condiciones de hibridización severas (como se describe en la presente) . Los anticuerpos de la presente invención pueden también ser descritos o especificados en términos de su afinidad de enlace. Las afinidades de enlace preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor de 5 X 106M, 10"6 , 5 X 10"7M, 10"7M, 5 X 10"8M, 10"8M, 5 X 10"9M, 10"9M, 5 X 10"10M, 10"10M, 5 X 10_11M, 10_11M, 5 X 10" 12 , 10"12 , 5 X 10"13M, 10"13M, 5 X 10"14M, 10"14 , 5 X 10"15M y 10"15M.

Los anticuerpos a citoquinas que forman un complejo de anticuerpo de citoquina tienen usos en los que se incluyen, pero no limitados a, métodos conocidos en el arte para purificar, detectar y apuntar los polipéptidos de la presente invención en los que se incluyen tanto métodos de diagnóstico y terapéuticos in vitro como in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos tienen uso en inmunoanálisis para medir cualitativa y cuantitativamente niveles de los polipéptidos de la presente invención en muestras biológicas. Véase, por ejemplo, Harlo y Lañe, supra, incorporado en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser usados ya sea solos o en combinación con otras composiciones. Los anticuerpos pueden además ser fusionados recombinantemente a un polipéptido heterologo en el término N- o C- o conjugados químicamente (en los que se incluyen conjugaciones covalentes y no covalentes) a polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser fusionados recombinantemente o conjugado a moléculas de citoquina o linfocina. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden ser fusionados recombinantemente o conjugados a moléculas útiles como marcadores en análisis de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos o toxinas. Véase, por ejemplo, WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; patente estadounidense No. 5,314,995; y EP 0 396 387, cada una incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos . Los anticuerpos a citoquinas o linfocinas de la presente invención pueden ser preparados mediante cualquier método apropiado conocido en el arte. Por ejemplo, las citoquinas o linfocinas de la presente invención o un fragmento antigénico de las mismas puede ser administrado a un animal con el fin de inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales . El término "anticuerpo monoclonal" no está limitado a anticuerpos producidos por medio de tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que es derivado de un solo clon, en los que se incluyen cualquier clon eucarióntico, procarióntico o fago y no el método mediante el cual es producido. Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en el arte en las que se incluyen el uso de hibridoma, recombinante y tecnología de despliegue de fago. Las técnicas de hibridoma incluyen aquellas conocidas en el arte y enseñadas en Harlow y Lañe, supra; Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, 563-681, 1981, dichas referencias incorporadas por referencia en su totalidad. Los fragmentos Fab y F(ab')2 pueden ser producidos mediante escisión proteolitica, utilizando enzimas tales como papaina (para producir fragmentos de Fab) o pepsina (para producir fragmentos de F(ab' )2) · Alternativamente, los anticuerpos a citoquinas o linfocinas pueden ser producidos por medio de la aplicación de tecnología de ADN recombinante y despliegue de fago o por medio de química sintética utilizando métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden ser preparados utilizando varios métodos de despliegue de fago conocidos en el arte. En los métodos de despliegue de fago, dominios de anticuerpo funcionales son desplegados sobre la superficie de una partícula de fago que porta secuencias de polinucleótidos que los codifica. El fago con una propiedad de enlace deseada son seleccionados de un repertorio o biblioteca de anticuerpos combinatorial (por ejemplo, humana o murina) al seleccionar directamente con antígeno, comúnmente antígeno enlazado o capturado a una superficie sólida o perla. El fago usado en estos métodos son comúnmente fagos filamentosos en los que se incluye fd y M13 con Fab, Fv o dominios de anticuerpo de Fv estabilizados por disulfuro fusionados recombinantemente ya sea al gen III de fago o proteína de gen VIII. Ejemplos de métodos de despliegue de fago que pueden ser usados para fabricar los anticuerpos de la presente invención incluyen aquellos revelados en Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50, 1995; Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186, 1995; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958, 1994; Persic et al., Gene 187: 9-18, 1997; Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280, 1994; PCT/GB91/01134 ; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y patentes estadounidenses Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5, 427,908; 5, 516,637; 5, 780,225; 5,658, 727 y' 5,733, 743, cada una incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos. Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de fago, las regiones de codificación de anticuerpo del fago pueden ser aisladas y usadas para generar anticuerpos enteros, en los que se incluyen anticuerpos humanos o cualquier otra fragmento de enlace de antigeno deseado y expresado en cualquier huésped deseado en los que se incluyen células mamiferas, células de insectos, células de plantas, levadura y bacterias. Por ejemplo, técnicas para producir recombinantemente fragmentos de anticuerpo que incluyen la región de Fe del anticuerpo pueden ser usadas utilizando métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, técnicas para producir recombinantemente fragmentos de Fab, Fab1 y F(ab')2 pueden también ser usadas utilizando métodos conocidos en el arte tal como aquellos revelados en WO 92/22324; Mullinax et al, BioTechniques 12: 864-869, 1992; y Sawai et al., AJRI 34: 26-34, 1995; y Better et al., Science 240: 1041-1043, 1988. Ejemplos de técnicas que pueden ser usadas para producir Fv de una sola cadena y anticuerpos incluyen aquellas descritas en las patentes estadounidenses Nos. 4,946,778 y 5,258,498, cada una incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos; Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88, 1991; Shu, L. et al., PNAS 90: 7995-7999, 1993; y Skerra et al., Science 240: 1038-1040, 1988. Para algunos usos, en los que se incluyen el uso in vivo de anticuerpos en humanos y en análisis de detección in vitro, puede ser preferible utilizar anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en el arte. Véase por ejemplo, Morrison, Science 229: 1202, 1985; Oi et al., BioTechniques 4: 214, 1986; Gillies et al., J. Immunol. Methods, 125: 191-202, 1989; y patente estadounidense No. 5,807,715. Los anticuerpos pueden ser humanizados utilizando una variedad de técnicas en las que se incluyen injertación de CDR (EP 0 239 400; WO 91/09967; y patentes estadounidenses Nos. 5,530,101 y 5,585,089), revestimiento o recubrimiento (EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E. A., Molecular Immunology, 28: 489-498, 1991; Studnicka et al., Protein Enginering 7:805-814, 1994; Roguska et al., PNAS 91: 969-973, 1994) y entremezcla de cadena (patente estadounidense No. 5,565,332). Anticuerpos humanos pueden ser fabricados mediante una variedad de métodos conocidos en el arte en los que se incluyen métodos de despliegue de fago descrito anteriormente. Véase también, por ejemplo patentes estadounidenses Nos. 4,444,887; 4,716,111; 5,545,806; y 5,814,318; y WO 98/46645; O 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; y WO 91/10741, cada una incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos. Incluidos adicionalmente en la presente invención están los anticuerpos fusionados recombinantemente o conjugados químicamente (en los que se incluyen tanto conjugaciones covalentes y no covalentes) a una citoquina o linfocina de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser específicos para antígenos diferentes a citoquinas o linfocinas de la presente invención. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser usados para apuntar las citoquinas o linfocinas de la presente invención a tipos de células particulares, ya sea in vitro o in vivo, al fusionar o conjugar los polipéptidos de la presente invención a anticuerpos específicos para receptores de superficie celular particulares. Los anticuerpos fusionados o conjugados a los polipéptidos de la presente invención pueden también ser usados en inmunoanálisis in vitro y métodos de purificación utilizando métodos conocidos en el arte. Véase por ejemplo, Harbor et al., supra y WO 93/21232; EP 0 439 095; Naramura et al., Immunol . Lett . 39: 91-99, 1994; patente estadounidense No. 5,474,981, incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos; Gillies et al., PNAS 89: 1428-1432, 1992; Fell et al., J. Immunol. 146: 2446-2452, 1991. La presente invención incluye además composiciones que comprenden las citoquinas o linfocinas de la presente invención fusionadas o conjugadas a los dominios de anticuerpo de una región de Fe de anticuerpo o porción de la misma. La porción de anticuerpo fusionada a un polipéptido de la presente invención puede comprender la región de engozne, dominio CHi, dominio (¾ y dominio CH3 o cualquier combinación de dominios enteros o porciones de los mismos. Las citoquinas o linfocinas de la presente invención pueden ser fusionadas o conjugadas a las porciones de anticuerpo anteriores para incrementar la vida media in vivo de los polipéptidos o para uso en inmunoanálisis utilizando métodos conocidos en el arte. Los polipéptidos pueden también ser fusionados o conjugados a las porciones de anticuerpo anteriores para formar multimeros. Por ejemplo, porciones de Fe fusionadas a los polipéptidos de la presente invención pueden formar dimeros por medio de enlace de disulfuro entre las porciones de Fe. Formas multiméricas superiores pueden ser elaboradas al fusionar los polipéptidos a porciones de IgA y IgM. Métodos para fusionar o conjugar el complejo de anticuerpo de citoquina de la presente invención a porciones de anticuerpo son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, patentes estadounidenses Nos. 5,336,603; 5, 622, 929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851; 5,112,946; EP 0 307 434, EP 0 367 166; WO 96/04388; y WO 91/06570, cada una incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos; Ashkenazi et al., PNAS, 88: 10535-10539, 1991; Zheng et al., J. Immunol, 154: 5590-5600, 1995; y Vil et al., PNAS, 89: 11337-11341, 1992. La invención es concerniente además con anticuerpos que actúan como agonistas de las citoquinas o linfocinas de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos que activan el receptor por citoquinas o linfocinas. Estos anticuerpos puede actuar como agonistas para ya sea todas o menos de todas de las actividades biológicas afectadas por la activación del receptor moderada por ligando. Los anticuerpos pueden ser especificados como agonistas para actividades biológicas que comprenden actividades especificas reveladas en la presente. Los agonistas de anticuerpo anteriores pueden ser elaborados utilizando métodos conocidos en el arte. Véase por ejemplo, WO 96/40281; patente estadounidense No. 5,811,097, cada una incorporada por referencia en su totalidad y para todos los propósitos; Deng et al., Blood 92: 1981-1988, 1998; Chen, et al., Cáncer Res., 58: 3668-3678, 1998; Harrop et al., J. Immunol. 161: 1786-1794, 1998; Zhu et al., Cáncer Res., 58: 3209-3214, 1998; Yon, et al., J. Immunol, 160: 3170-3179, 1998; Prat et al, J. Cell Sci., 111: 237-247, 1998; Pitard et al., J. Immunol. Methods, 205: 177-190, 1997; Liautard et al., Cytokinde, 9: 233-241, 1997; Carlson et al., J. Biol Chem., 272: 11295-11301, 1997; Taryman et al., Neuron, 14: 755-762, 1995; Muller et al., Structure, 6: 1153-1167, 1998; Bartunek et al., Cytokinem, 8: 14-20, 1996. Como se discute anteriormente, los anticuerpos a citoquinas o linfocinas sobre células metastáticas pueden a su vez, ser utilizados para generar anticuerpos anti-idiotipicos que "imitan" los polipéptidos como modalidades de la invención utilizando técnicas bien conocidas para aquellos experimentados en el arte. (Véase, por ejemplo, Grenspan et al., FASEB J. 7: 437-444, 1989 y Nissinoff, J. Immunol 147: 2429-2438, 1991). Por ejemplo, los anticuerpos que se enlazan a e inhiben competitivamente la multimerización de polipéptido y/o enlace de un polipéptido como modalidades de la invención a ligando pueden ser usados para generar anti-idiotipos que "imitan" la multimerización del polipéptido y/o dominio de enlace y como consecuencia, se enlazan a y neutralizan el polipéptido y/o su ligando. Tales anti-idiotipos neutralizantes o fragmentos de Fab de tales anti-idiotipos pueden ser usados en regímenes terapéuticos para neutralizar el ligando de polipéptido. Por ejemplo, tales anticuerpos anti-idiotípicos pueden ser usados para enlazar un polipéptido como modalidades de la invención y/o enlazar su ligandos/receptores y bloquear mediante esto su actividad biológica . "Inhibidores", "activadores", y "moduladores" de receptor de citoquina sobre células metastáticas o células infectadas o receptor de Fe sobre célula de macrófago son usados para referirse a moléculas inhibidoras, activadoras o moduladoras, respectivamente, identificadas utilizando análisis in vitro e in vivo para enlace de receptor o señalización, por ejemplo, ligandos, agonistas, antagonistas y sus homólogos o miméticos. "Modulador" incluye inhibidores y activadores. Los inhibidores son agentes que, por ejemplo, se enlazan a, bloquean parcial o totalmente la estimulación, disminuyen, impiden, retardan la activación, desactivan, desensibilizan o regulan descendentemente la actividad de citoquinas o linfocinas sobre receptores celulares, por ejemplo, antagonistas. Los activadores son agentes que, por ejemplo, se enlazan a, estimulan, incrementan, abren, activan, facilitan, mejoran la activación, sensibilizan o regulan ascendentemente la actividad de citoquinas o linfocinas sobre receptores celulares, por ejemplo, agonistas. Los moduladores incluyen agentes que por ejemplo, alteran la interacción de citoquina o receptor de linfocina con: proteínas que se enlazan a activadores o inhibidores, receptores, en los que se incluyen proteínas, péptidos, lípidos, carbohidratos, polisacáridos o combinaciones de los anteriores, por ejemplo, lipoproteínas, glicoproteínas y los semejantes. Los moduladores incluyen versiones modificadas genéticamente de citoquinas o linfocinas que se presentan de manera estable en la naturaleza, por ejemplo, con actividad alterada, también como ligandos que se presentan de manera estable en la naturaleza y sintéticos, antagonistas, agonistas, moléculas químicas pequeñas y los semejantes. Tales análisis para inhibidores y activadores incluyen, por ejemplo aplicación de compuestos moduladores opuestos a una célula que expresa un receptor de citoquina o linfocina y luego determinar los efectos funcionales sobre la señalización de citoquina o linfocina, como se describe anteriormente. Muestras o análisis que comprenden un receptor que son tratados con un activador potencial, inhibidor o modulador son comparadas con muestras de control sin el inhibidor, activador o modulador para examinar la extensión de activación o inhibición. Las muestras de control (sin tratar con inhibidores) pueden ser asignadas a un valor de actividad de receptor relativa de 100%. La inhibición de receptor es obtenida cuando el valor de actividad del receptor en relación con el control es aproximadamente 80%, opcionalmente 50% o 25-0%. La activación del receptor se obtiene cuando el valor de actividad del receptor en relación con el control es 110%, opcionalmente 150%, opcionalmente 200-500% o 1000-3000% más alta . La habilidad de una molécula para enlazarse a un receptor de citoquina o linfocina puede ser determinada, por ejemplo, por la habilidad del ligando supuesto para enlazarse a una inmunoadhesina de receptor activada recubierta sobre la placa de análisis. La especificidad de enlace puede ser determinada al comparar el enlace a un receptor no activado. En una modalidad, el enlace de anticuerpo al receptor de citoquina o linfocina puede ser analizado ya sea al inmovilizar el ligando o el receptor. Por ejemplo, el análisis puede incluir inmovilizar el receptor de citoquina o linfocina fusionado a una etiqueta de His sobre perlas de resina de NTA Ni-activada. El anticuerpo puede ser agregado en una solución reguladora del pH apropiada y las perlas incubadas por un periodo de tiempo a una temperatura dada. Después de lavados para remover el material sin enlazar, la proteina enlazada puede ser liberada con por ejemplo, SDS, soluciones reguladoras del pH ¦ con un alto pH y los semejantes y analizada.

EXPRESIÓN DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES Y RECEPTORES Los anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos y receptores a citocinas o lifocinas por ejemplo, complejos de anticuerpos de citocina y complejos de receptor de citocina, com producidoscomúnmente mediante la expresión recombinante . Los constructos de polinucleótidos recombinantes incluyen comumente una secuencia de control de expresión enlazada operativamente a las secuencias de codificación de cadenas de anticuerpo, en las que se incluyen regiones asociadas naturalmente o regiones de promotor heterólogas. Preferiblemente, las secuencias de control de expresión son sistemas de promotor eucariónticos en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariónticas . una vez que el vector ha sido incorporado al huésped apropiado, el huésped es mantenido bajo condiciones apropiadas para la expresión de alto nivel de las secuencias de nucleótidos y la colección y purificación de los anticuerpos de reacción cruzada. Véase Solicitud de Patente Estadounidense No. 20020199213 incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos. Estos vectores de expresión son típicamente replicables en los organismos huésped ya sea como episomas o como parte integral del ADN cromosomal del huésped. Comúnmente, los vecores de expresión contienen marcadores de selección, por ejemplo, resistencia a ampicilina o resistencia a higromicina, para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas . E. coli es un huésped procarióntico particularmente útil para clonar las secuencias de ADN de la presente ivnención. Microbios, tales como levaduras son también útiles para expresión. Saccharomyces es un huésped de levadura preferido, con vectores asociados que tienen secuencias de control de la expresión, un origen de replicación, secuencias de terminación y los semejantes como se desee. Los promotores típicos incluyen 3-fosfoglicerato cinasa y otras enzimas glicolíticas . Los promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables por la utilización de maltosa y galactosa. Las células mamiferas son un huésped preferido para expresar segmentos del nucleótido que codifican inmunoglobulinas y receptores de citocina o fragmentos de los mismos. Véase innacker, From Genes To Clones, VCH Publishers, NY, 1987. Un número de líneas de células huésped apropiadas capaces de secretar proteínas heterólogas intactas han sido desarrolladas en el arte e incluyen lineas celulares de ovario de hámster chino (CHO) , varias lineas celulares de COS, células HeLa, células L y lineas celulares de mieloma. Preferiblemente, las células son no humanas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, tal como un origen de replicación, un promotor, un mejorador y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de enlace de ribosoma. sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de terminador transcripcional . Queen et al., immunol. Rec. 89: 49, 1986. las secuencias de control de expresión preferidas son promotores derivados de genes endógenos, citomegalovirus , SV40, adenovirus, papilomavirus bovino y los semejantes. Co, et al., J Immunol 148: 1149, 1992. Alternativamente, las secuencias de codificación de anticuerpo y receptor de citocina pueden ser incorporadas en transgenes para introducción al genoma de un animal transgénico y subsecuente expresión en la leche del animal transgénico. Véase por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 5,741,957; 5,304,489 y 5,849,992, cada una incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos. Transgenes apropiados incluyen secuencias de codificación para cadenas ligeras y/o pesadas y enlace operable con un promotor y mejorador de un gen especifico de glándula mamaria, tal como caseína o beta lactoglobulina . Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés pueden ser transferidos a la célula huésped mediante métodos bien conocidos, dependiendo del tipo de huésped celular, por ejemplo, la transfección de cloruro de calcio es usada comúnmente para células procariónticas, mientras que el tratamiento de fosfato de calcio, electroporación, lipofección, biolística o transfección viral-basada pueden ser usada para otros huéspedes celulares. Otros métodos usados para transformar células mamíferas incluyen el uso de polibreno, fusión de protoplasto, liposomas, electroporación y microinyección (véase en general, Sambrook et al., Molecular Cloning) . Para la producción de animales transgénicos , los transgenes pueden ser microinyectados a oocitos fertilizados o pueden ser incorporados al genoma de células de tallo embriónico y los núcleos de tales células transíectadas a oocitos enucleados. Una vez expresados, las colecciones de anticuerpos y receptores son purificados del medio de cultivo y células huésped. Los anticuerpos y receptores que pueden ser purificados de acuerdo con procedimientos estándar en el arte, en los que se incluyen purificación de HPLC, cromatografía en columna, electroporesis en gel y los semejantes. Usualmente, las cadenas de anticuerpo son expresadas con secuencias de señal y son así liberadas al medio de cultivo. Sin embargo, si las cadenas de anticuerpos no son secretadas naturalmente por las células huésped, las cadenas de anticuerpo pueden ser liberadas mediante el tratamiento con un detergente moderado. Luego las cadenas de anticuerpo pueden ser purificadas mediante métodos convencionales en los que se incluyen precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de afinidad al objetivo inmovilizado, cromatografía en columna, electroporesis de gel y los semejantes (véase en general Scopes, Protein Purification, Springer-Berlag, N.Y., 1982). Los métodos anteriores dan como resultado bibliotecas de secuencias de ácidos nucleicos que codifican cadenas de anticuerpos que tiene afinidad específica por un objetovo escogido. Las bibliotecas de ácidos nucleicos tienen comúnmente por losmenos 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 104, 105, 106, 107, 108 o 109 diferentes miembros, usualmente, ningún solo miembro individual constituye más del 25 o 50% de las secuencias totales en la biblioteca. Comúnmente, por lo menos 25, 50%, 75, 90, 95, 99 o 99.9% de los miembros de biblioteca codifican cadenas de anticuerpo con afinidad específica por las moléculas objetivo. En el caso de bibliotecas de anticuerpo de doble cadena, un par de segundos de ácidos nucleicos que codifican cadenas pesadas y ligeras respectivamente es considerada un miembro de biblioteca. Las bibliotecas de ácido nucleico pueden existir en forma libre, como componentes de cualquier vector o transíectadas como un componente de un vector a las células huésped . La biblioteca de ácidos nucleicos pueden ser expresadas para generar bibliotecas policlonales de anticuerpos que tienen afinidad especifica con un objetivo. La composición de tales bibliotecas es determinada a partir de la composición de las bibliotecas de anticuerpos. Asi, tales bibliotecas tienen comúnmente por lo menos 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 105, 106, 107, 108 o 109 diferentes miembros con diferente composición de aminoácidos. Usualmente, ningún miembro individual constituye más de 25 o 50% de los polipéptidos totales en la biblioteca. El porcentaje de cadenas de anticuerpos en la biblioteca de cadena de anticuerpo que tiene afinidad especifica por un objetivo que es comúnmente más bajo que el porcentaje de ácidos nucleicos correspondientes que codifican las cadenas de anticuerpo, la diferencia es debida al hecho de que no todos los polipéptidos se fijan a na estructura apropiada para el enlace a pesar de tener la secuencia de aminoácidos primaria apropiada para soportar el pegado apropiado. En algunas bibliotecas, por lo menos 25, 50, 75, 90, 99 o 99.9% de las cadenas de anticuerpo tienen afinidad especifica por las moléculas objetivo. Otra vez, en bibliotecas de anticuerpos de multicadenas, cada anticuerpo (tal como Fab o anticuerpo intacto) es considerado un miembro de biblioteca. Las diferentes cadenas de anticuerpo difieren entre si en términos de especificidad de enlace fina y afinidad por el anticuerpo. Algunas de tales bibliotecas comprenden elementos que se enlazan a diferentes epitopos del mismo antigeno. Algunas de tales bibliotecas comprenden por lo menos dos miembros que se enlazan a diferentes epxotopos del mismo antigeno sin competir entre si. Las bibliiotecas policlonales de anticuerpos humanos resultantes de los métodos anteriores son distinguidas de las poblaciones naturales de anticuerpos humanos tanto por los altos porcentajes de aglutinantes de alta afinidad en las bibliiotecas presentes y en que ias bibliotecas presentes comúnmente no muestran la misma diversidad de anticuerpos presentes en las poblaciones naturales. La diversidad reducida en las bibliotecas presentes es debida a los animales transgénicos no humanos que proporcionan la fuente de materiales fuente que no incluyen todos los genes de inmunoglobulina humano, por ejemplo, algunas bibliotecas de anticuerpos policlonales están libres de anticuerpos que tienen cadenas ligeras lentas. Algunas bibliotecas de anticuerpo policlonal como modalidades de la invención tienen cadenas pesadas de anticuerpo codificadas por menos de 10, 20, 30 o 40 genes VH. Algunas bibliotecas de anticuerpo policlonales como modalidades de la invención tienen cadenas ligeras de anticuerpos codificadas por menos de 10, 20, 30 o 40 genes vH.

ANTICUERPOS MODIFICADOS Y RECEPTORES También incluidos en la invención se encuentran los anticuerpos modificados a citocinas o linfocinas y receptores a citocinas o linfocinas, para incrementar las poblaciones de células T y para el tratamiento de enfermedad. "Anticuerpo modificado" se refiere a anticuerpos y fragmentos de anticuerpo optimizados químicamente o mediante diseño molecular a formatos diferentes, en los que se incluyen pero no limitados a diacuerpos, triacuerpos o anticuerpos específicos, derivados de PEG, variantes derivadas de evolución molecular para mejorar la afinidad, estabilidad o valencia. Los anticuerpos modificados también incluyen formatos tales como anticuerpos monoclonales , anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados que han sido modificados mediante por ejemplo, cancelación, adición o sustitución de porciones del anticuerpo. Por ejemplo , un anticuerpo puede ser modificado al cancelar la región constante y reemplazarla con una región constante lo que significa incrementar la vida media, por ejemplo, vida media en el suero, estabilidad o afinidad del anticuerpo.

El complejo de citocina/anticuerpo complejo de citocina/receptor de citocina puede ser usado para modificar la respuesta biológica dada o crear una respuestya biológica (por ejemplo, reclutar células efectoras) . La porción de fármaco no será interpretada limitada a agentes terapéuticos químicos clásicos, por ejemplo, la porción de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa o fragmento activo de la misma, tal como abrina, resina A, exotoxina de pseudomonas o toxina de difteria; una proteína tal como factor de necrosis de interferón-alfa o modificadores de respuesta biológica tales como por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-4 ("IL-4"), interleucina-ß ("IL-6"), interleucina-7 ("IL-7"), interleucina-15 ("IL-15"), factor estimulador de colonias de macrófagos de granulocitos ("GM-CSF"), factor estimulador de colonia de granulocito ("G-CSF") u otros factores de crecimiento. otros derivados pueden incluir proteínas de fusión de anticuerpos con porciones que inducen apoptosis tales como TRAIL, ligando que induce apoptosis relacionado con el factor de necrosis de tumor y moléculas de reporteros tales como sondas de luciferasa o sondas fluorescentes y nanopartículas para la formación de imágenes no invasivas o administración apuntada de moléculas de carga a sitios con carga de tumor y micro- y macro-metástasis . En ciertas modalidades de la invención, el complejo de citocina/cuerpo o complejo de citocina/receptor de citocina, por ejemp'lo, puede ser acoplado o conjugado a una o más porciones terapéuticas o citotóxicas. Como se usa en la presente, "porción citotóxica" simplemente significa una porción que inhibe el crecimiento celular o promueve la muerte celular cuando está próxima a o es absorbida por una célula. Porciones citotóxicas apropiadas a este respecto incluyen agentes radioactivos o isótopos ( radionúclidos ) , agentes quimiotóxicos tales como inductores de diferenciación, inhibidores y fármacos quimiotóxicos pequeños, proteínas de toxina y derivados de las mismas, también como secuencias de nucleótidos (o su secuencia antisentido) . Por consiguiente, la porción citotóxica puede ser, a manera de ejemplo no limitante, un agente quimioterapéutico, una toxina fotoactivada o un agente radioactivo . En general, los agentes terapéuticos pueden ser conjugados al complejo de citocina/anticuerpo o composiciones de complejo de citocina/receptor de citocina, por ejemplo, un complejo de anticuerpo de citocina solo o en combinación con otro agente terapéutico, mediante cualquier técnica apropiada, o configuración apropiada de la necesidad de estabilidad farmacocinética y toxicidad global reducida al paciente. Un agente terapéutico solo o en combinación con otro agente terapéutico puede ser acopladoa una porción de anticuerpo apropiada ya sea directa o indirectamente (por ejemplo, vía un grupo enlaador) . Una reacción directa entre una citocina o linfocina y un anticuerpo es posible cuando cada uno posee un grupo funcional capaz de reaccionar con el otro, por ejemplo, un grupo nucleofilico, tal como un grupo amino o sulhidrilo, puede ser capaz de reaccionar con el grupo que contiene carbonilo, tal como un anhídrido o un haluro de ácido o con un grupo alquilo que contiene un grupo saliente bueno (por ejemplo, unhaluro) . Alternativamente, se puede usar un grupo enlazador químico apropiado. Un grupo enlazador puede funcionar como un separador para preparar un anticuerpo de un agente con el fin de evitar interferencias con las propiedades de enlace. Un grupo enlazador puede también servir para incrementar la reactividad química de un sustituyente sobre una porción o un anticuerpo y así incrementar la eficiencia de acoplamiento. Un incremento en reactividad química puede también facilitar el tipo de porciones o grupos funcionales sobre porciones que de otra manera no serían posibles. Químicas de enlace apropiadas incluyen enlazadores de maleimidilo enlazadores de haluro de alquilo (que reaccionan con un sulfhidrilo sobre la porción de anticuerpo) y enlazadores de succinimidilo) que reaccionan con una amina primaria sobre la porción de anticuerpo) . Varios .grupos de amina primaria y sulfhidrilo están presentes en inmunoglobulinas y grupos adicionales pueden ser diseñados a moléculas de inmunoglobulina recombinantes . Será evidente para aquellos experimentados en el arte que una variedad de agentes bifuncionales o polifuncionales , tanto homo- como hetero-funcionales (tales como aquellos descritos en el catálogo de la Pierce Chemical Co . , Rockford, Ilinois), pueden ser empleados como un grupo enlazador. El acoplamiento puede ser efectuado, por ejemplo, por medio de grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo o residuos de carbohidrato oxidado (véase por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,671,958). Como un método de acoplamiento alternativo, agentes citotóxicos pueden ser acoplados a los anticuerpos y las composiciones de complejo de anticuerpo de citocina como modalidades de la invención, por ejemplo, por medio de un grupo carbohidrato oxidado en un sitio de glicosilación, como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,057,313 y 5,156,840. Todavía otro método alternativo de acoplamiento de anticuerpos y composiciones de anticuerpo a la poprción citotóxica o formación de imagen es mediante el uso de un par de enlaces no covalentes, tal como estreptavidina/biotina o acidina/biotina . En estas modalidades, un miembro del par es acoplado covalentemente a porciones de un anticuerpo y el otro miembro del par aglutinante es acoplado covalentemente a la porción citotóxica o porción de formación de imagen. En donde una citocina, linfocina o porción citotóxica es más potente cuando está libre de la porción de anticuerpo de los inmunoconjugados de la presente invención, puede ser deseable usar un grupo enlazador que es escindible durante o después de la internalización en una célula o que es escondible gradualmente sobre el paso del tiempo en el medio ambiente extracelular . Un número de grupos de enlazador escindibles diferentes han sido descritos, los mecanismos para la liberación intracelular de un agente de porción de estos grupos enlazadores incluyen escisión mediante la reducción de un enlace de disulfuro (por ejemplo, Patente estadounidense No. 4,489,710), mediante irradiación de un enlace fotolábil (por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,625,014) mediante hidrólisis de cadenas laterales de aminoácidos derivadas (por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,638,045), mediante hidrólisis moderada por complemento de suero (por ejemplo, Patente estadounidense No. 4,671,958) e hidrólisis catalizada por ácido (por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,569,789). Puede ser deseable acoplar más de una citocina, linfocina terapéutica o porción citotóxica y/o de formaciónd e imagen a un complejo de citocina/anticuerpo o composiciones de complejo de citocina/receptor de citocina. Al poli-derivar los anticuerpos, varias estrategias terapéuticas y/o citotóxicas pueden ser implementadas simultáneamente, -un anticuerpo se puede hacer útil como un agente de contraste para varias técnicas de visualización o un anticuerpo terapéutico puede ser marcado para seguimiento de una técnica de visualización. En una modalidad, múltiples moléculas de una porción citotoxica son acopladas a una molécula de anticuerpo. En otra modalidad, mas de un tipo de porción puede ser acoplada a un anticuerpo. Por ejemplo, una porción terapéutica, tal como una citocina o una linfocina, puede ser acoplada a un anticuerpo en combinación con una porción quimiotóxica o radiotóxica, e incrementar la efectividad de la quimioterapia o terapia radiotóxica, también como disminuir la dosificación requerida necesaria para obtener el efecto terapéutico deseado. Sin consideración de la modalidad particular, inmunoconjugados con más de una porción pueden ser preparados de una variedad de maneras. Por ejemplo, más de una porción puede ser acoplada directamente a una molécula de anticuerpo o enlazadores que proporcionan múltiples sitios para anexión (por ejemplo, dendrimeros) pueden ser usados. Alternartivamente, un portador con la capacidad de retener más de una porción citotoxica puede ser usado.

Como se explica anteriormente, un portador puede llevar los agentes en una variedad de maneras, en las que se incluyen enlace covalente ya sea directamente o vía un grupo enlazador y asociaciones no covalentes. Portadores de enlaces covalentes apropiados incluyen proteínas tales como albúminas (por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,507,234), péptidos y polisacáridos tales como aminodextrana (véase Patente Estadounidense No. 4,699,784), cada uno de los cuales tiene múltiples sitios para la anexión de porciones, un portador puede también llevar un agente mediante asociaciones no covalentes, tal como enlace no covalente o mediante encapsulacion, tal como dentro de un vesículo de liposoma (vénase Patentes Estadounidenses Nos. 4,429,008 y 4,873,088). Los portadores de encapsulacion son especialmente útiles en modalidades terapéuticas quimiotóxicas , ya que pueden permitir que las composiciones terapéuticas liberen gradualmente una porción quimiotóxica en el paso del tiempo en tanto que las concentran en la vecindad de las células ibjetivo. Radionúclidos preferidos para uso como porciones citotóxicas son los radionúclidos que son apropiadospara administración farmacológica. Tales radionúclidos incluyen 123I, 125I, 131I, 90Y, 211At, 67Cu, 186Re, 188Re, 212Pb y 212Bi . El yodo e isótopos de astatina son radionúclidos más preferidos para uso en las composiciones farmacéuticas de la presente invención, ya que un gran cuerpo de literatura se ha acumulado con respecto a su uso. 131I es particularmente preferido, como lo son otros núclidos que emiten radiación beta, que tienen un intervalo efectivo de varios milímetros. 123I, 125I, 131I o 211At pueden ser conjugados a porciones de anticuerpo para uso en las composiciones y métodos utilizando cualquiera de varios reactivos de conjugación conocidos, en los que se incluyen Yodogen, N-succinimidil 3-[211At ] astatobenzoato, N-succinimidil 3- [131I] yodobenzoato (SIB) y N-succinimidil 5- [131I ] yodob-3-piridincarboxilato (SIPC) · Cualquier isótopo de yodo puede ser utilizado en los reactivos de yodo citados. Otros radionúclidos pueden ser conjugados al complejo de citocina/anticuerpo o composiciones de complejo de citocina/receptor de citocina mediante agentes de quelación apropiados conocidos para aquellos de habilidad en el arte de medicina nuclear. Agentes quimiotóxicos preferidos incluyen fármacos de moléculas pequeñas tales como metotrexato y pirimidina y análogos de purina. Inductores de diferenciación de quimiotoxina preferidos incluyen ésteres de forbol y ácido butírico. Las porciones quimiotóxicas pueden ser conjugadas directamente al complejo de citocina/anticuerpo o composiciones de complejo de citocina/receptor de citocina vía un enlazador químico o pueden ser encapsulados en un portador, que a su vez es acoplado al complejo decitocinas/anticuerpo o composición de complejo de citocina/receptor de citocina. Proteínas de toxina preferidas para uso como porciones citotóxicas incluyen resina, abrina, toxina de difteria, toxina de cólera, gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina Shigella, proteína antiviral de pokeweed y otras proteínas de toxina conocidas en el arte de bioquímica medicinal. Ya que estos agentes de toxina pueden reducir respuestas inmunes indeseables en pacientes, especialmente si fueron inyectadas intravascularmente, es preferido que sean encapsuladas en un portador para acoplamiento al complejo de citocina/anticuerpo o composiciones de complejo de citocina/receptor de citocina. La porción citotóxica de la inmunotoxina puede ser un fármaco citotóxico o una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano o de planta o un fragmento enzimáticamente activo ("cadena A") de tal toxina. Toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas usadas son cadena de difteria A, fragmentos activos no enlazantes de toxina de difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricino A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina , fenomicina y enomicina. En otra modalidad, los anticuerpos son conjugados a fármacos anticáncer de molécula pequeña. Conjugados del anticuerpo monoclonal y tales porciones citotóxicas son elaborados utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteina bifuncionales . Ejemplos de tales reactivos son SPDP, IT, derivados bifuncionales de imidoésteres tales como apidimidato de dimetilo HC1, ésteres activos tales como suberato de disuccinimidilo, aldehidos tales como glutaraldehido, compuestos bis-azido tales como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina, derivados de bis-diazonio tales como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilendiamina, diisocianatos tales como 2 , 6-diisocianato de tolileno y compuestos de flúor bis-activos tales como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno . La porción de lisis de una toxina puede ser unida al fragmento Fab de anticuerpos. Ventajosamente, el complejo de citoquina/anticuerpo o composiciones de complejo de citoquina/receptor de citoquina se enlazan específicamente al dominio externo de la citoquina o anticuerpo puede ser conjugado a cadena de ricino A. Mas ventajosamente, la cadena de ricino A es desglicosilada y producida por medio de medios recombinantes . Un método ventajoso de fabricación de la inmunotoxina de ricino es descrito en Vitetta et al., Science 238, 1098, 1987, que es incorporado por referencia en su totalidad. El término "contactado" cuando es aplicado a una célula es usado en la presente para describir el proceso mediante el cual un anticuerpo, composición de anticuerpo, agente citotóxico o porción, gen, proteina y/o secuencia antisentido, es administrado a una célula objetivo o es colocado en proximidad directa con la célula objetivo. Esta administración puede ser in vitro o in vivo y puede involucrar el uso de un sistema de vector recombinante . En otro aspecto, la presente invención comprende un complejo de citoquina/anticuerpo o complejo de citoquina/receptor de citoquina o fragmento del mismo, conjugado a una porción terapéutica, tal como una citotoxina, un fármaco {por ejemplo, un inmunosupresor ) o una radiotoxina. Tales conjugados son denominados en la presente como "inmunoconj ugados" . Los inmunoconj ugados que incluyen una o más citotoxinas son denominados como "inmunotoxinas". Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial a (por ejemplo, extermina) las células. Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina , daunorubicina, duocarmicina, saporina, dihidroxi antracina didne, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides , procaína, tetracaína, lidocaina, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos . Agentes terapéuticos apropiados para formar inmunoconj ugados incluye pero no están limitados a, antimetabolitos {por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, ß-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina) , agentes alquilantes {por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol , estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatina) , antraciclinas {por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina) , antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC) ) y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) . En una modalidad preferida, el agente terapéutico es un agente citotóxico o un agente radiotóxico. En otra modalidad, el agente terapéutico es un inmunosupresor . En todavía otra modalidad, el agente terapéutico es GM-CSF. En una modalidad adicional, el agente terapéutico es doxorubicina (adriamicina) , sulfato de cisplatin bleomicina, carmustina, clorambucilo, ciclofosfamida hidroxiurea o ricina A.

El complejo de citoquina/anticuerpo o composiciones de complejo de citoquina/receptor de citoquina también pueden ser conjugados a una radiotoxina, por ejemplo, yodo radioactivo, para generar radiofarmacéuticos citotóxicos para tratar por ejemplo, un cáncer. El complejo de citoquina/anticuerpo o complejo de citoquina/receptor de citoquina puede ser usado para modificar una respuesta biológica dada y la porción de fármaco no será interpretada como limitada a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa o fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina de difteria; una proteína tal como factor de necrosis de tumor o interferón-gamma; o modificadores de respuesta biológica tales como por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-I"), interleucina-2 ("IL-2") , interleucina-4 ("IL-4"), interleucina-6 ("IL-6"), interleucina-7 ("IL-7"), interleucina-15 ("IL-15"), factor estimulador de colonia de macrófago de granulocito ("GM-CSF") , factor estimulador de colonia de granulocito ("G-CSF") y otros factores de crecimiento . Técnicas para conjugar tal porción terapéutica a anticuerpos son bien conocidas. Véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting de Drugs in Cáncer Therapy", en Reisfeld et al., eds . , Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 243-56, 1985); Hellstrom et al., "Antibodies for Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery 2a Ed., Marcel Dekker, Inc., Robinson et al., eds., pp. 623-53, 1987; Thorpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cáncer Therapy: A Revie ", en Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al., eds., pp. 475-506, 1985; "Analysis, Results, and Future Prospectiva de the Therapeutic Use de Radiolabeled Antibody in Cáncer Therapy", en Molecular Antibodies for Cáncer Detection and Therapy, Baldwin et al., eds., Academic Press, pp. 303-16 1985 y Thorpe et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties de Antibody-Toxin Conjugates", Immunol, Rev. 62: 119-58, 1982.

USOS DE COMPLEJO DE CITOQUINA/ANTICUERPO O COMPOSICIONES DE COMPLEJO DE CITOCINA/RECEPTOR DE CITOCINA Cada uno del complejo de citoquina/anticuerpo o composiciones de complejo de citoquina/receptor de citoquina, por ejemplo, complejos de anticuerpo de citoquina que estimulan la expansión de poblaciones de célula T, identificados en la presente pueden ser usados de numerosas maneras. La siguiente descripción debe ser considerada ejemplar y utiliza técnicas conocidas.

Un complejo de citoquina/anticuerpo o composición de complejo de citoquina/receptor de citoquina puede ser usada para analizar niveles de proteina en un muestra biológica utilizando técnicas basadas en anticuerpo. Por ejemplo, la expresión de proteina en tejidos puede ser estudiada con métodos inmunohistológicos clásicos. Jalkanen et al., J. Célula. Biol. 101: 976-985, 1985; Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096, 1987. Otros métodos basados en anticuerpo útiles para detectar expresión genética de proteínas incluyen inmunoanálisis, tales como el análisis inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA) y el radioinmunoanálisis (RIA) . Marcadores de análisis de anticuerpos apropiados son conocidos en el arte e incluyen marcadores de enzimas, tale como glucosa oxidasa y radioisótopos y otros agentes radioactivos, tal como yodo (125I, 121I), carbono (1 C) , azufre (35S) , tritio (3H) , indio (112In) y tecnecio (99mTc) y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina y biotina. Además de analizar niveles de proteína secretados en una muestra biológica, las proteínas o composiciones de anticuerpo pueden también ser detectados in vivo mediante formación de imagen. Etiquetas o marcadores de anticuerpo para formación de imagen o impresión in vivo de proteína incluyen aquellos detectables mediante radiográfica de rayo X, RMN o ESR. Para radiografía de rayos X, marcadores apropiados incluyen radioisótopos tales como bario o cesio, que emiten radiación detectable pero no son dañinos al sujeto. Marcadores apropiados para RMN y ESR incluyen aquellos con un espin característico detectable, tal como deuterio, que puede ser incorporado al anticuerpo mediante marcación de nutrientes por el clon de scFv relevante. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo proteína-específico que ha sido marcado con una porción de formación de imagen o de impresión detectable apropiada, tal como un radioisótopo (por ejemplo, 131I, 112In, 99mTc) , una sustancia radio-opaca o un material detectable mediante resonancia magnética nuclear, es introducido (por ejemplo, parenteral, subcutánea o intraperitonealmente ) al mamífero. Se comprenderá en el arte que el tamaño del sujeto y el sistema de formación de imagen o sistema de impresión usado determinarán la cantidad de porción de impresión de formación de imagen necesaria para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de una porción de radioisótopo, para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada fluctuará normalmente de alrededor de 5 a 20 millicuries de mTc. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado se acumulará preferiblemente entonces en el sitio de las células que contienen la proteína específica. La formación de imagen o impresión de tumor in vivo es descrita en Burchiel et al., Tumor Imaging: The Radiochemical Detection de Cáncer, 13, 1982. Además, el complejo de citoquina/ anticuerpo o composiciones de complejo de citoquina/ receptor de citoquina pueden ser usados para tratar enfermedad. Por ejemplo, se puede administrar a los paciente composiciones de complejo de anticuerpo de citoquina de la presente invención en un esfuerzo por mejorar la expansión de una población de células T, inhibir la actividad de un polipéptido (por ejemplo, un oncógeno) , activar la actividad de un polipéptido {por ejemplo, mediante enlace a un receptor) , reducir la actividad de un receptor enlazado a membrana al competir con el mismo por el ligando libre {por ejemplo, receptores de TNF solubles usados para reducir inflamación) o para efectuar una respuesta deseada {por ejemplo, crecimiento de vasos sanguíneos) . Similarmente, el complejo de citoquina/ anticuerpo o composiciones de complejo de citoquina/ receptor de citoquina pueden también ser usados para tratar enfermedades. Por ejemplo, la administración de un anticuerpo dirigido a un polipéptido de la presente invención se puede enlazar y reducir la sobreproducción del polipéptido. Similarmente, la administración de un anticuerpo puede activar el polipéptido, tal como mediante enlace a un polipéptido enlazado a un receptor de membrana.

REGÍMENES DE TRATAMIENTO La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden complejo de citoquina/ anticuerpo o composiciones de complejo de citoquina/ receptor de citoquina para el tratamiento de enfermedad, por ejemplo, enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune, radiación o quimioterapia de agotamiento celular o enfermedad infecciosa, formuladas junto con un portador aceptable farmacéuticamente. Algunas composiciones incluyen una combinación de múltiples composiciones (por ejemplo, dos o más) complejos de citoquina/ anticuerpo o complejo de citoquina/ receptor de citoquina. En aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas o medicamentos son administrados a un paciente susceptible de o de otra manera en riesgo de una enfermedad o condición (por ejemplo, enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune, radiación o quimioterapia de agotamiento celular o enfermedad infecciosa) en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo de recurrencia de la enfermedad o condición, disminuir la severidad o retardar el inicio de la enfermedad, incluyendo síntomas histológicos y/o conductuales bioquímicos de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones o medicamentos son administrados a un paciente que se sospecha de o que ya sufre de una enfermedad en una cantidad suficiente para curar o por lo menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad (histológico y/o conductual bioquímico) , incluyendo sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios en el desarrollo de la enfermedad. Una cantidad apropiada para llevar a cabo el tratamiento terapéutico o profiláctico es definida como una dosis terapéutica o profilácticamente efectiva. Tanto en regímenes profilácticos como terapéuticos, los agentes son administrados usualmente en varias dosificaciones hasta que se ha obtenido una respuesta anti-proliferativa suficiente. Comúnmente, la respuesta anti-proliferativa es monitoreada y dosis repetidas son dadas si la respuesta antiproliferativa comienza a disminuir.

DOSIFICACIONES EFECTIVAS Dosis efectivas del complejo de citoquina/ anticuerpo o composiciones de complejo de citoquina/ receptor de citoquina, por ejemplo, anticuerpos a citoquina o linfocina, para el tratamiento de enfermedades, por ejemplo, enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune, radiación o quimioterapia de agotamiento celular o enfermedad infecciosa, descritos en la presente varían dependiendo de muchos factores diferentes, en los que se incluyen medios de administración, sitio objetivo, estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o animal, otras medicaciones administradas y si tratamiento es profiláctico o terapéutico. Usualmente, el paciente es un humano pero mamíferos no humanos en los que se incluyen mamíferos transgénicos pueden también ser tratados. Las dosificaciones de tratamiento necesitan ser tituladas para optimizar la seguridad y eficacia. Para administración con un anticuerpo, la dosificación fluctúa de aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, y más usualmente 0.01 a 5 mg/kg del peso corporal del huésped. Por ejemplo las dosificaciones pueden ser 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o en el intervalo de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento ejemplar abarca la administración de una vez por cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. En algunos métodos, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de enlace son administrados simultáneamente, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo cae dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo es usualmente administrado en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser semanal, mensual o anualmente. Los intervalos pueden también ser irregulares como se indica al medir los niveles de sangre de anticuerpo en el paciente. En algunos métodos, la dosificación es ajustada para obtener una concentración de anticuerpo en el plasma de 1-1000 yg/ml y en algunos métodos 25-300 µq/ l. Alternativamente, el anticuerpo puede ser administrado como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguidos por anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. La dosificación y frecuencia de administración puede variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, una dosificación relativamente baja es administrada a intervalos relativamente no frecuentes en un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento por el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, una dosificación relativamente alta a intervalos relativamente cortos es algunas veces requerida hasta que el avance de la enfermedad es reducido o terminado y preferiblemente hasta que el paciente muestra una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Después de esto, se puede administrar al paciente un régimen profiláctico.

Dosis para ácidos nucleicos que codifican inmunógenos fluctúan de aproximadamente 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 g a 10 rag o 30-300 g de ADN por paciente. Las dosis para vectores virales infecciosos varían de 10-100 o más, viriones por dosis.

RUTAS DE ADMINISTRACIÓN El complejo de citoquina/ anticuerpo o composiciones de complejo de citoquina/ receptor de citoquina para inducir una respuesta inmune, por ejemplo, complejo de citoquina/ anticuerpo o complejo de citoquina/ receptor de citoquina para el tratamiento de enfermedad, por ejemplo, enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune, radiación o quimioterapia de agotamiento celular o enfermedad infecciosa, puede ser administrado mediante medios parenterales , tópicas, intravenosos, orales, subcutáneos, intraarteriales , intracraniales , intraperitoneales , intranasales o intramusculares para profilácticos como inhalantes para preparaciones de anticuerpo que apuntan a lesiones cerebrales, y/o tratamiento terapéutico. La ruta de administración más típica de una composición de complejo de anticuerpo de citoquina es subcutánea aunque otras rutas pueden igualmente ser efectivas. La siguiente ruta más común es inyección intramuscular. Este tipo de inyección es más comúnmente efectuada en el brazo o músculos de la pierna. En algunos métodos, los agentes son inyectados directamente a un tejido particular en donde se han acumulado depósitos, por ejemplo inyección intracranial . La inyección intramuscular o infusión intravenosa son preferidas para administración de anticuerpo. En algunos métodos, anticuerpos terapéuticos particulares son inyectados al cráneo. En algunos métodos, los anticuerpos son administrados como una composición o dispositivo de liberación sostenida, tal como un dispositivo Medipad™. El complejo de citoquina/ anticuerpo o composiciones de complejo de citoquina/ receptor de citoquina pueden opcionalmente ser administrados en combinación con otros agentes que son por lo menos parcialmente efectivos en el tratamiento de varias enfermedades en las que se incluyen varias enfermedades inmune-relacionadas . En el caso de metástasis de tumor al cerebro, los agentes pueden también ser administrados en conjunción con otros agentes que incrementan el paso de los agentes a través de la barrera de sangre-cerebro (BBB) .

FORMULACIÓN Las composiciones de complejo de citoquina/ anticuerpo o complejo de citoquina/ receptor de citoquina para inducir una respuesta inmune, para el tratamiento de enfermedades, por ejemplo enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune, radiación de agotamiento celular o quimioterapia o enfermedad infecciosa, son frecuentemente administradas como composiciones farmacéuticas que comprenden un agente terapéutico activo, esto es y una variedad de otros componentes aceptables farmacéuticamente. (Véase Remington's Pharmaceutical Science., 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa . , 1980). La forma preferida depende del método de administración propuesto y aplicación terapéutica. Las composiciones pueden también incluir, dependiendo de la formulación deseada, portadores o diluyentes no tóxicos aceptables farmacéuticamente, que son definidos como vehículos usados comúnmente para formular composiciones farmacéuticas para administración animal o humana. El diluyente es seleccionado para no afectar la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solución salina de pH regulado de fosfato fisiológico, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica puede también incluir otros portadores, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y los semejantes.

Las composiciones farmacéuticas pueden también incluir macromoléculas metabolizadas lentamente grandes tales como proteínas, polisacáridos y quitosana, ácidos polilácticos , ácidos poliglicólicos y copolímeros (tales como Sepharose™ funcionalizado de látex, agarosa, celulosa y los semejantes) , aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados de lípidos (tales como gotas de aceite o liposomas) . Adicionalmente, estos portadores pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes (esto es, adyuvantes) . Para administración parenteral, las composiciones que son modalidades de la invención pueden ser administradas como dosificaciones inyectables de una solución o suspensión de la sustancia en un diluyente aceptable fisiológicamente con un portador farmacéutico que puede ser un líquido estéril tales como aceites agua, solución salina, glicerol o etanol . Adicionalmente, sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, surfactantes, sustancias reguladoras del pH y los semejantes pueden estar presentes en las composiciones. Otros componentes de composiciones farmacéuticas son aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, por ejemplo aceite de cacahuate, aceite de soya y aceite mineral. En general, los glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son portadores líquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables. Los anticuerpos pueden ser administrados en forma de una inyección de depósito o preparación de implante que puede ser formulada de tal manera para permitir una liberación sostenida de ingrediente activo. Una composición ejemplar comprende anticuerpo monoclonal a 5 mg/ml, formulada en una solución reguladora del pH acuosa que contiene L-histidina 50 m , NaCl 150 mM, ajustada a pH 6.0 con HC1. Comúnmente, las composiciones son preparadas como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones liquidas; formas sólidas solubles para solución en o suspensión en vehículos líquidos antes de inyección pueden también ser preparadas. La preparación también puede ser emulsificada o encapsulada en liposomas o micropartículas tales como polilacturo, poliglicoluro o copolímero para un efecto adyuvante mejorado, como se discute anteriormente. Langer, Science 249: 1527, 1990 y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. Los agentes de esta invención pueden ser administrados en forma de una inyección de depósito o preparación de implante que puede ser formulada de tal manera para permitir una liberación sostenida o pulsátil del ingrediente activo. Formulaciones adicionales apropiadas para otros modos de administración incluyen oral, intranasal y formulaciones pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas . Para supositorios, los aglutinantes y portadores incluyen por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos ; tales supositorios pueden ser formados a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de 0.5% a 10%, preferiblemente l%-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes, tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen 10%- 95% de ingrediente activo, preferiblemente 25%-70%. La aplicación tópica puede dar como resultado la administración transdérmica o intradérmica . La administración tópica puede ser facilitada mediante coadministración del agente con toxina de cólera o derivados destoxificados o unidades de las mismas u otras toxinas bacterianas similares. Glenn et al., Nature 391: 851, 1998. La co-administración puede ser obtenida al usar los componentes como una mezcla o como moléculas enlazadas obtenidas mediante reticulación química. Alternativamente, la administración transdérmica puede ser obtenida utilizando un parche de la piel o utilizando transferosomas . Paul et al., Eur. J. Immunol. 25: 3521-24, 1995; Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368: 201-15, 1998. Las composiciones farmacéuticas son en general formuladas como estériles, sustancialmente isotónicas y en pleno cumplimiento con las Regulaciones de la Buena Práctica de Manufactura (GMP) de la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos de América.

TOXICIDAD Preferiblemente, una dosis terapéuticamente efectiva del complejo de citoquina/ anticuerpo o composiciones de complejo de citoquina/ receptor de citoquina descritas en la presente proporcionarán beneficio terapéutico sin provocar toxicidad sustancial. La toxicidad de las proteínas descritas en la presente puede ser determinada mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo al determinar la LD50 (la dosis mortal al 50% de la población) o la LDioo (la dosis mortal al 100% de la población) . La proporción de dosis entre efecto tóxico y terapéutico es el índice terapéutico. Los datos obtenidos a partir de estos análisis de cultivo celular y estudios en animales pueden ser usados para formular un intervalo de dosificación que no es tóxico para uso en humanos. La dosificación de las proteínas descritas en la presente cae preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la dosis efectiva con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. La formulación exacta, ruta de administración y dosificación pueden ser escogidas por el médico individual en vista de la condición del paciente. (Véase, por ejemplo, Fingí et al., 1975, En: The Pharmacological Basis de Therapeutics , Ch. 1.

EQUIPOS También dentro del alcance de la invención están equipos que comprenden las composiciones de complejo de citoquina/ anticuerpo o complejo de citoquina/ receptor de citoquina (por ejemplo, anticuerpos monoclonales , anticuerpos de secuencia humana, anticuerpos humanos, moléculas multiespecificas y bisespecíficas) e instrucciones para uso. El equipo puede contener además por lo menos un reactivo adicional o uno o más anticuerpos humanos adicionales (por ejemplo, un anticuerpo humano que tiene una actividad complementaria que se enlaza a un epítopo en el antígeno distinto del primer anticuerpo humano) . Los equipos incluyen comúnmente una etiqueta que indica el uso propuesto del contenido del equipo. El término etiqueta incluye cualquier material escrito o grabado suministrado sobre o con el equipo o que de otra manera acompaña el equipo.

MODALIDADES EJEMPLARES EJEMPLO 1 Proliferación de célula T en ratones enseguida de la inyección de IL-2 de ratón recombinante Estudios previos han demostrado que la productividad de células de CD8+ de MP in vivo puede ser incrementada al inyectar ya sea IL-2 o mAb de IL-2 (Figura 1) . Para IL-2, la proliferación de células de CD8+ in vivo, medida mediante dilución del tinte CFSE (Figura 1A, B) o incorporación de bromodesoxiuridina (BrdU) (Figura 2), fue prominente después de inyección de IL-2 de ratón recombinante (rmIL-2) y fue extensamente restringida a células de CD8+ de MP, tanto para células CD8+ huésped y purificadas transferidas adoptadamente . En contraste, la estimulación de células T naturales, como se define por la baja expresión de CD122 y CD44, fue mínima (Figura 2). Confirmando hallazgos previos, una proliferación aún mayor ocurrió enseguida de la inyección de mAb de IL-2, específicamente por el mAb de IL-2 anti-ratón S4B6 (Figura 1 y 2) . Ku et al., Science 288: 675, 2000; Kamimura et al., J Immunol 173: 6041, 2004. Este efecto fue también observado en huéspedes IL-15_ " y fue bloqueado por mAb de CD122 (Figura 1A) , confirmando que la citoquina efectora para proliferación no es IL-15 pero no obstante estimula vía CD122. Ku et al., Science 288: 675, 2000; Kamimura et al., J Immunol 173: 6041, 2004. La Figura 1 muestra la estimulación de células CD8+ de P in vivo mediante IL-2 o mAb de IL-2. Células T de CD8+ de MP Thyl.l (CD44hi CD122hi) purificadas CFSE-marcadas fueron transferidas intravenosamente (iv) a (A) ratones tipo silvestre (WT) o IL-15_/~, que luego recibieron diariamente inyecciones intraperitoneales (ip) de PBS, rmIL-2, S4B6 mAb de IL-2 o mAb de IL-2 más mAb CD122 o a (B) ratones WT, IL-2+/~ o IL-2_/~, seguido por inyecciones diarias de mAb de S4B6 IL-2 o mAb de control. Las células donadoras fueron analizadas en el día 7 mediante citometria de flujo. Los números representan porcentajes de CD8+ de (CFSE10) donadoras Thyl .1+ divididas. Todos los datos en estas y las siguientes figuras son representativos de por lo menos 2 experimentos separados. La Figura 2 muestra la proliferación de células de CD8+ de MP in vivo en respuesta a IL-2 o mAb de IL-2. (A) Células T de CD8+ CD44hl CD122hi Thyl .1-marcada purificadas fueron transferidas intravenosamente (iv) a ratones B6 (Thyl.2) normales. Subsecuentemente, los ratones huésped recibieron diariamente inyecciones intraperitoneales (ip) de PBS, 1.5 yg de rmIL-2 ó 0.5 mg de S4B6 IL-2 mAb durante 1 semana. Para medir la productividad de célula T, BrdU fue dado en el agua para beber por los últimos 3 días. Las células del nodo linfático (LN) y bazo fueron aisladas después de 7 días y analizadas mediante citometria de flujo. Los números representan porcentajes de célula CD8+ de Thyl .1+ donadoras (columna superior) o células BrdU+ (hileras inferiores) .

EJEMPLO 2 Proliferación de célula T en respuesta al complejo de anticuerpo de citoquina es abolida en ratones IL-2_ " o reducida en ratones IL-2+/~ Un hallazgo inesperado fue que la estimulación de células de CD8+ de MP por mAb de IL-2 en la transferencia adoptiva fue abolida en los huéspedes de Il-2_/" y considerablemente reducida en huéspedes de IL-2+ " (Figura IB) . La implicación por consiguiente es que, a pesar de su función neutralizante reportada in vitro, el mAb de IL-2 S4B6 funciona in vivo al incrementar la actividad biológica de IL-2 pre-existente, quizás por medio de la formación de complejos inmunes. Zurawski et al., J Immunol 137: 3354, 1986. Para determinar esta posibilidad, se usó un régimen de inyecciones diarias de IL-2 y mAb de IL-2. La proliferación resultante de células CD8+ transferidas adoptadamente y huéspedes fue mejorada espectacularmente con respecto a aquella observada con la administración individual de IL-2 o mAb de IL-2 (Figura 3A) y condujo a un incremento masivo (> 100 veces) en los números totales de células CD8+ de P en bazo y LN en el día 7 con amplificación marcada de estos órganos (Figura 3B) . El régimen combinado de IL-2 y mAb de IL-2 también provocó un incremento marcado (20-30 veces) en los números totales de otra población de CD122hl, es decir células NK (CD3~ NK1.1+ DX5+) , . pero tuvo efectos mínimos sobre otras células, incluyendo células MP CD44hl CD4+ y células B de B220+ (Figuras 3A, 3B) . La proliferación de células de CD8+ naturales transferidas fue relativamente baja, sugiriendo que la combinación de IL-2/mAb de IL-2 actuó extensamente sobre células de CD122hl pre-existentes, en lugar de sobre precursores de CD12210 naturales (Figura 4A) . La proliferación fue independiente de IL-15 debido a que datos comparables ocurrieron con la transferencia a huéspedes de IL-15"/_ (Figura 4B) . También hubo fuerte estimulación de células CD8+ virus-específicas cebadas (Figura 3C) , indicando que la proliferación de células de CD8+ de CD122hl aplicada a células de memoria antígeno (Ag)-específicas definidas también como células de MP. Para lo último, la proliferación no condujo a la regulación ascendente de CD25 y fue no deteriorada con las células de CD8+ de MP CD25" _' indicando que la estimulación ocurría solamente vía IL-2F^y (CD122) y no IL-2Ra Y (Figura 5) .

La Figura 3 muestra la expansión selectiva marcada de células T de CD8+ de MP y de memoria (Ag) -especifica in vivo mediante una combinación de IL-2 y mAb de IL-2. (A) células T de CD8+ de MP CFSE-marcadas fueron transferidas a ratones B6, seguidas por inyecciones ip diarias de PBS, rmIL-2, S4B6 mAb de IL-2 o rmIL-2 más mAb de IL-2. Células donadoras y células huésped de nodos linfáticos (LN) fueron examinadas en cuanto a los marcadores mostrados en el día 7. Se obtuvieron resultados comparables para células de bazo. (B) Números de células de bazo y LN totales de células T de CD44hl donadores y huéspedes de ratones en (A) (+SD, 2 ratones/grupo) . Una fotografía de dos bazos representativos y LN de los ratones inyectados es mostrada a la derecha. (C) Células T de CD8+ de memoria Ag (LCMV) -específicas CFSE-marcadas fueron transferidas a ratones B6, seguido por inyecciones diarias como se describe anteriormente. Las células donadoras fueron analizadas en el día 7 mediante citometría de flujo. Los números indican porcentajes de células de (CFSE10) divididas (A columna izquierda, C) . La Figura 4 muestra la proliferación de células T de CD8+ a complejos de IL-2/mAb de IL-2 es extensamente confinada a células de MP de CD122hl y es independiente de IL-15. Células T de CD8+ de MP purificadas CFSE-marcadas (A columna izquierda y B) o células T de CD8+ de CD4410 naturales (A columna derecha) fueron preparadas y transferidas a ratones WT (A) o a ratones IL-15~ _ (B) . Luego, inyecciones diarias de PBS, 1.5 yg de rmIL-2, 50 yg de S4B6 mAb de IL-2 o 1.5 yg de rmIL-2 más 50 yg de mAb de IL-2 fueron administrados ip. Las células donadoras fueron analizadas en el dia 7 mediante citometria de flujo. Los números indican los porcentajes de células (CFSEio) divididas . La Figura 5 muestra la proliferación de células de CD8+ de MP a complejos de IL-2/anticuerpo de IL-2 in vivo no requiere CD25. (A) Células T de CD8+ de CD122hi CD44hi Thyl.l-marcadas purificadas de ratones WT B6 fueron marcadas con CFSE y transferidas a ratones B6 (Thyl.2) normales, que luego recibieron inyecciones ip de 1.5 yg de rmIL-2 más 50 yg de S4B6 mAb de IL-2 un dia si y otro dia no. En el día 7 después de la transferencia adoptiva, las células de LN y bazo fueron organizadas mediante citometria de flujo en cuanto a la expresión de CD25 en células CD3+ totales (izquierda), CD3+ Thyl .1+ donadoras (media) y CD3+ Thyl .1" (derecha). (B) Células T de CD8+ de MP Thyl .2-marcadas purificadas de ratones WT (columna izquierda) o CD25_ ~ (columna derecha) fueron marcadas con CFSE y transferidas a ratones B6 normales Thyl .1-marcadas , que luego fueron inyectados ip con PBS, 1.5 yg de rmIL-2, 50 yg de S4B6 mAb de IL-2 o 1.5 yg de ,rmIL-2 más 50 yg de mAb de IL-2 un día sí y otro día no. 7 días después de la transferencia adoptiva, las células de LN y bazo fueron analizadas mediante citometria de flujo. Los números indican los porcentajes de células (CFSE10) divididas.

EJEMPLO 3 Proliferación de subconjuntos de célula T en respuesta a complejo de anticuerpo de citoquina especifico a anticuerpo monoclonal La expansión casi óptima de células CD8+ de CD122hl ocurrió con inyecciones diarias de una proporción molar 2:1 premezclada de IL-2 a mAb de IL-2 por 1 semana (Figura 7A flecha, Figura 7B) . A esta proporción aún una sola inyección del complejo de IL-2/anticuerpo de IL-2 provocó expansión considerable de células de CD8+ CD122hi (Figura 7C) . En base a los resultados de inyectar complejos de IL-2/mAb de IL-2 a varios tiempos antes de la transferencia de célula T, la vida media biológica de lo complejos de IL-2/mAb de IL-2 fue determinada que era relativamente corta, es decir <4 horas (Figura 7D) . Además de mAb de IL-2 de S4B6, también se observó la proliferación equivalente con mAb de IL-2 anti-ratón, JES6-5H4 (JES6-5), más rmIL-2 (Figura 6A) y mAb de IL-2 anti-humano, AB602 más IL-2 humano recombinante (rhIL-2) (Figura 6B) . Cuando es acomplejado con IL-2, cada uno de estos tres mAb (S4B6, JES6-5 y MAB602) provocó una expansión marcada de células CD8+ de CD122hl sobre la transferencia adoptiva (Figura 6A, 6B) y expansión fuerte y selectiva de células CD122hl huéspedes, en las que se incluyen tanto células CD8+ de P y células NK. Interesantemente, los resultados con un tercer mAb de IL-2 anti-ratón, JES6-1A12 (JES6-1), fueron bastante diferentes (Figura 6A) . Los complejos de IL-2/JES6-1 provocaron una proliferación más baja de células de CD8+ de CD122hl que IL-2 sola, indicando que JES6-1 bloqueó la respuesta in vivo a IL-2. Sin embargo, la inyección de JES6-1 más IL-2 condujo a una proliferación suave a una diferente población sensible a IL-2, es decir células CD4+ CD25+ (Figuras 6C, D) . Estas células fueron predominantemente Foxp3+ y asi se asemejaron a reg de T. La expansión de estas células fue también observada con inyección del otro mAb de IL-2, aunque este efecto fue reducido por la fuerte expansión de células de CD8+ de CD122hi (Figura 6E) . La Figura 6 muestra la estimulación selectiva de subconjuntos de célula T mediante diferentes complejos de IL-2/mAb de IL-2. Células T de CD8+ de MP CFSE-marcadas fueron transferidas a ratones B6, seguido por (A, B) inyecciones ip diarias de mAb de control, IL-2 (rmIL-2 en A, rhIL-2 en B) , mAb de IL-2 o IL-2 más mAb de IL-2 como en la Figura 3A. Los mAb de IL-2 usados fueron (A) S4B6 anti-ratón, JES6-5 ó JES6-1 o (B) MAB602 anti-humano. (C) células T de CD8+ de MP fueron transferidas a ratones B6, seguido por inyecciones diarias de mAb de control, rmIL-2, mAb de IL-2 o rmIL-2 más mAb de IL-2 como antes. Células donadoras y células huésped de bazo fueron examinadas en cuanto a los marcadores mostrados en el día 7. (D) Los ratones tratados como el (C) fueron dados con BrdU en agua potable por al menos 3 días. Se muestran los porcentajes de células CD3+ CD4+ CD25+ Foxp3hi que fueron BrdU+ (+SD, 2 ratones/grupo) . (E) Conteos celulares totales de células CD4+ CD25+ y células CD8+ de MP en bazos de ratones en (C) . Los números en la parte superior de las barras indican las proporciones de células M P CD8+ a CD4+ CD25+. Los ratones fueron analizados en el día 7 (A-E) . Los números indican los porcentajes de células (CFSE10) divididas (A, B, C columna izquierda) . La Figura 7 muestra requerimientos para estimular células de CD8+ de MP con complejos de IL-2/mAb de IL-2 in vivo. (A) Células T de CD8+ de MP Thyl .1-marcadas purificadas fueron marcadas con CFSE y transferidas a ratones B6, que luego recibieron inyecciones diarias de dosis tituladas (0 a 1000 yg) de mAb de IL-2 de S4B6 más una concentración fija (1.5 µg) de rmIL-2. En el día 7 después de la transferencia adoptiva, las células de LN y bazo fueron analizadas mediante citometria de flujo. La flecha denota la proliferación observada con inyección de una proporción molar de 2:1 de IL-2 a mAb de IL-2, esto es, en donde ningún reactivo estaba en exceso. (B) Los receptores de células de CD8+ de MP CFSE-marcadas purificadas fueron administrados diariamente con dosis tituladas de una proporción molar de 2:1 de complejos de rmIL-2/mAb de IL-2 de S4B6, empezando en 1.5 µg de rmIL-2 más 8 yg de mAb de IL-2 de S4B6 titulando en diluciones de 5 veces. En el día 7, después de la transferencia adoptiva, las células de LN y bazo fueron analizadas mediante citometria de flujo. (C) Se administró a los receptores de células de CD8+ de MP CFSE-marcadas purificadas inyecciones ip de 1.5 yg de rmIL-2 más 8 yg de mAb de IL-2 S4B6 en varios puntos en el tiempo después de la transferencia adoptiva: 0, nada de rmIL-2 más S4B6; 1, rmIL-2 más S4B6 en el día 0; 2, rmIL-2 más S4B6 en los dias 0 y 4; 3, rmIL-2 más S4B6 en los días 0, 2 y 4; 7, inyecciones diarias de rmIL-2 más S4B6. Todos los ratones fueron sacrificados en el día 7 después de la transferencia adoptiva y las células de LN y bazo fueron analizadas mediante citometria de flujo. (D) Se administró a los receptores de células de CD8+ de MP CFSE-marcadas purificadas con una sola inyección de 1.5 yg de rmIL-2 (·) o 1.5 yg de rmIL-2 más 50 yg de mAb de IL-2 de S4B6 (¦) a 72 horas, 48 horas, 24 horas, 4 horas o 30 minutos antes de la transferencia adoptiva de células T o al mismo tiempo como la transferencia de célula adoptiva para el punto en el tiempo 0. Todos los datos en esta figura son expresados como por ciento de proliferación máxima en donde la proliferación máxima fue ajustada como 100% y los otros valores fueron calculados en relación con el mismo.

EJEMPLO 4 Anticuerpos monoclonales que se pueden enlazar a diferentes sitios sobre IL-2 Los resultados anteriores sugieren que S4B6 y los mAb relacionados se pueden enlazar a un sitio diferente en IL-2 que JES6-1. Análisis de ELISA de emparedado de IL-2/mAb de IL-2 proporcionaron soporte directo para esta posibilidad (Figura 9) . Como in vivo, JES6-1 bloqueó totalmente la respuesta tanto a células de CD8+ normales y de MP de CD25_/~ a IL-2 in vitro vía CD122 (IL-2R y) (Figura 8A, 8B) . Sin embargo, en cuanto a los reg de T de CD25+ de CD4+ in vivo, los complejos de JES6-1/IL-2 fueron aptos de inducir estimulación débil pero significativa in vitro de células que expresan IL-2Ra y de alta afinidad, es decir células de CD8+ naturales CD3-activadas de CD25+ (Figura 10); estas células fueron muy sensibles a IL-2 e inhibidas fácilmente por el mAb de CD25. Asi, el mAb de JES6-1 se enlaza aparentemente a un sitio de IL-2 que es crucial para la interacción con CD122 pero menos crucial para el enlace a CD25 (IL-2RC^Y). En contraste, S4B6 falló en inhibir (o mejorar) la respuesta de células CD8+ de MP a IL-2 in vitro (Figura 8A, 8B) pero inhibió fuertemente la respuesta de IL-2 de células CD8+ CD3-activadas (Figura 10) . De aquí, S4B6 se enlaza a un sitio de IL-2 que ocluye parcialmente el enlace a CD25 pero no impide el enlace a CD122. Notablemente, cuando no está acomplejada con IL-2 exógena, una mezcla de JES6-1 y mAb de S4B6 provocó casi la abolición de proliferación de célula T in vivo, tanto para células de CD8+ de MP compara reg de T (Figura 11), sugiriendo además que S4B6 y JES6-1 reconocen diferentes sitios sobre IL-2. La Figura 8 muestra elementos de la estimulación de células T mediante complejo de citoquina/mAb . (A, B) células CD8+ de MP purificadas de ratones WT (A) o CD25" _ (B) fueron cultivadas junto con concentraciones tituladas de una proporción molar 2:1 de rmIL-2 más mAb de S4B6 (S4B6, ¦) o rmIL-2 más mAb de JES6-1 (JES6-1,A) durante 3 días; IL-2 soluble más un mAb irrelevante fue usado como control (Control, ·) . La proliferación fue medida al agregar [3H]-timidina por al menos 16 horas. (C) Células CD8+ de MP CFSE-marcadas purificadas fueron transferidas a ratones B6, que luego fueron administrados con otras inyecciones ip diarias de mAb de control, rmIL-4, mAb de IL-4 (MAB404 o 11B111) o rmIL-4 más mAb de IL-4. Los ratones fueron analizados en el día 7. Los números indican porcentajes de células (CFSE10) divididas. (D) Ratones B6 fueron irradiados con 1000 cGy e inyectados iv con células BM de B6 sin separar contra T- agotadas seguido por inyecciones ip diarias de PBS, rmIL-2, mAb de IL-2 de S4B6 o rmIL-2 más mAb de IL-2 de S4B6. 8 días después de la transferencia adoptiva las células de bazo fueron analizadas mediante citometria de flujo. Se muestran los números de células promedio de células CD3+ CD4+ y CD3+ CD8+ de receptores de B sin separar (+SD, 2 ratones/grupo) . Con inyección de BM T-agotado, ninguna restauración de números de célula T ocurrió. La Figura 9 muestra que JES6-5 y mAb de IL-2 de S4B6 se pueden enlazan a sitios similares sobre IL-2 que son distintos del sitio de enlace de JES6-1. (A) Un análisis de ELISA de emparedado de IL-2 estándar con JES6-1 sin conjugar enlazada a placa como mAb de captura y JES6-5 biotinilado como mAb de detección fue usado para detectar concentraciones tituladas de rmIL-2, empezando a 200 pg/ml y titulando en diluciones de 4 veces. Enlace del mAb de detección fue cuantificado utilizando peroxidasa de rábano estreptavidina-conj ugada junto con el sustrato o-fenilendiamina y la absorbancia fue medida a 450 nm (véase materiales y métodos) . (B) El procedimiento de ELISA en (A) fue modificado al usar JES6-1 como anticuerpo monoclonal de captura más una concentración fija (200 pg/ml) de rmIL-2. Luego, los mAb competidores sin conjugar purificado fueron agregados a concentraciones tituladas (diluciones de 5 veces empezando a 100 yg/ml) a las cavidades para detectar si estos mAb podrían bloquear el enlace de mAb de detección de JES6-5 biotinilado. Los mAb competidores usados fueron mAb de control, JES6-1, JES6-5 o mAb de IL-2 de S4B6. Luego las muestras fueron medidas como se describe anteriormente. La Figura 10 muestra efectos de complejos de IL- 2/mAb de IL-2 in vitro. Células de CD8+ de MP purificadas de ratones B6 (A columna izquierda) o células CD8+ totales activadas mediante (CD3-actividad. CD8+ A columna derecha, y B) fueron cultivadas con concentraciones tituladas de una proporción molar 2:1 de rmIL-2 más mAb de S4B6 (S4B6/IL-2, hilera media) o rmIL-2 más mAb de JES6-1 ( JES6-1/IL-2, fondo) por 3 días; IL-2 soluble más un anticuerpo monoclonal irrelevante fue usado como a control (IL-2, parte superior). Una concentración fija (10 pg/ml) de un mAb de control irrelevante (+Control, ·) , mAb de CD25 (+CD25, ¦) o CD122 mAb (+CD122, A) fue también agregado a las cavidades. (B) células CD8+ CD3-activadas , preparadas como en (A) , fueron cultivadas junto con concentraciones tituladas de una proporción molar 2:1 de rmIL-2 más mAb de S4B6 (S4B6, ¦) o rmIL-2 más mAb de JES6-1 (JES6-1, A) durante 3 días; IL-2 soluble más un mAb irrelevante fue usado como control (Control, ·) . La proliferación fue medida al agregar [3H]-timidina por las últimas 16 horas. La figura 11 muestra que la inyección de una mezcla de mAb de IL-2 S4B6 y JES6-1 bloquea la proliferación tanto de células CD8+ de P como de células CD25+ CD4+. (a) células células CD8+ de MP and CD4+ CD25+ cells. (A) Células T CD122hl CD44hl CD8+ Thy 1.1-marcadas purificadas de ratones T B6 fueron marcadas con CFSE y transferidas a ratones B6 (Thyl.2) normales, que luego fueron inyectados ip con PBS,50 yg de mAb S4B6 IL-2, 50 yg de mAb JES6-1 IL-2 o una combinación de 50 yg de mAb S4B6 IL-2 junto con 50 yg de mAb JES6-1 IL-2 cada día. En el día 7, después de la transferencia adoptiva, las células de NL y del bazo fueron analizadas mediante citometria de flujo. Los números indican los porcentajes de células (CFSE °) divididas. (B) Los ratones tratados como en (A) fueron sacrificados después de 7 dias y las células CD4+ CD25+ (endógenas) analizadas mediante citometria de flujo (izquierda) y cuantificadas (derecha). Los números indicant los porcentajes de células CD4+ CD25+ en el cuadrante. Los datos en la derecha se refieren al por ciento de células CD4+ que fueron CD25hl.

EJEMPLO 5 Los complejos de IL-2 más fragmentos de anticuerpo monoclonales F(ab')2 son mucho menos estimulatorios que los complejos de IL-2 más anticuerpo monoclonal intacto No es claro el por qué los complejos de IL-2/mAb IL-2 son tan potentes in vivo. Se reportó previamente que el enlade al anticuerpo puede incrementar la vida media de IL-2 y también IL-4 in vivo, pero a diferencia de inducir un incremento moderado en rechazo de tumor moderado por células NK, los efectos de los complejos de IL-2/mAb IL-2 sobre células T no se mencionaron. Sato et al., Biotherapy 6: 225, 1993; Finkelman et al, J Immunol 151: 1235, 1993; Courtney et al., Immunopharmacology 28: 223, 1994. También se reportó que la fracción de Fe del mAb anti-IL-2 no alteró la vida media incrementada de IL-2 y no disminuyó la actividad antitumor moderada por células NK. Sato et ah, Biol Pharm Bull 17:1101, 1994. En contraste, para la expansión marcada de células CD122hl MP CD8+ reportada en la presente, los fragmentos de mAb de F(ab' )2 fueron mucho menos estimuladores que el mAb inacto (Fig. 12) , sugiriendo que los complejos se enlazan a las células vía la región de Fe del mAb. Tal presentación puede ser inusualmente eficiente explicar por qué los complejos de IL-2/mAb IL-2 son bastante más estimuladores in vivo que in Vitro. La figura 12 muestra que los fragmentos de F(ab' )2 de mAb de IL-2 son mucho menos eficientes que el mAb de IL-2 entero. (A) células T CD1221" CD44hl CD8+ de MP Thyl.l-marcadas de ratones B6 fueron marcadas con CFSE y transferidas a ratones B6 (Thyl.2) normales, que luego recibieron inyecciones ip un dia si y un día no de PBS, 1.5 µg de rmIL-2, 50 µg de mAb de IL-2 S4B6 entero, 1.5 g de rmIL-2 más 50 µg de mAb IL-2 S4B6 entero, 50 \iq F(ab')2 mAb de IL-2 S4B6 o 1.5 µ? de rmIL-2 más 50 µq mAb de IL-2 F(ab')2 S4B6. Después de 7 días, las células de NL y de bazo fueron analizadas mediante citometria de flujo. Los números indican los porcentajes de células (CFSE10) divididas. (B) El mAb de IL-2 S4B6 F(ab')2 fue comparado con mAb de IL-2 S4B6 entero in vitro en cuanto a su habilidad para inhibir la proliferación impulsada por rmIL-2 de la linea celular IL-2-sensible CTLL-2. Células CTLL-2, 2 x 104 células/cavidad, fueron cultivadas por 48 horas en presencia de una concentración fija (100 ng/ml) de rmIL-2 y dosis tituladas ya sea de mAb de IL-2 S4B6 F(ab')2 (¦) o mAb de IL-2 S4B6 entero ( · ) . Se muestra la proporción de sitios de enlace de IL-2 a moléculas de rmIL-2. 1 \iq of mAb de IL-2 S4B6 F(ab')2 (PM -100 kD) es igual a 1.5 g de mAb de IL-2 S4B6 entero (PM -150 kD) en términos de sitios de enlace de IL-2. La proliferación fue medida al agregar [3H] -timidina por las últimas 24 horas del periodo de cultivo. Los efectos estimuladores de los complejos de IL-2/mAb IL-2 también se han aplicado a los complejos de IL-4 y mAb de IL-4 (Fig. 8C) y IL-7 and mAb de IL-7 (Fig 16) . Asi, la proliferación de células CD8+ fue mucho más alta después de la inyección de estos complejos de citoquina/mAb que con citoquina o mAb solos. Para S4B6 y anticuerpos relacionados, la inyección de complejos de IL-2/mAb IL-2 podría ser clínicamente útil para inmunoterapia de tumor y para expandir números de célula T después de trasplante de médula ósea (B ) . En apoyo de esta última idea, se administró a ratones irradiados células BM sin separar y luego un curso de inyecciones de IL-2/S4B6 mostraron una rápida restauración de números de células T maduras, especialmente células CD8+ tan prematuramente como 1 semana post-transferencia (Fig. 8D) . Inversamente, la expansión de regs de célula T de CD4+ mediante IL-2 y JES6-1 o mAb relacionados podría ser útil para tratamiento de enfermedad autoinmune.

EJEMPLO 6 Los complejos de IL-2/mAb IL-2 muestran actividad biológica significativamente más allta que proteínas de fusión recombinantes de Ab IL-2 enlazadas covalentemente Después de su introducción a principios de los 90', los complejos de citoquina/mAb recibieron solo breve atención después de esto, supuestamente debido al advenimiento concomitante de proteínas de fusión recombinantes que consisten de citoquinas enlazadas covalentemente a Ab (Davis and Gillies, Cáncer Immunol Immunother 52:297-308, 2003; Cruz et al, CHn Exp Med 4:57-64, 2004). Puesto que se consideró que la actividad biológica incrementada de los complejos de citoquina/mAb refleja la vida media incrementada de la citoquina, las proteínas de fusión recombinantes fueron favorecidas debido a su conveniencia y versatilidad en producción. Así, se construyeron proteínas de fusión, mediante lo cual IL-2, GM-CSF o IL-12 fueron enlazadas covalentemente ya sea a un mAb anti-hapteno, para promover la longevidad in vivo o a mAb reactivo a antígenos de tumor, dirigiendo así a l¾s citoquinas a sitios de tumor. (Davis and Gillies, Cáncer Immunol Immunother 52:297-308, 2003; Cruz et al., Clin Exp Med 4:57-64, 2004; Lode et al, Pharmacol Ther 80:277-292, 1998) . Por lo menos dos proteínas de fusión de Ab-IL-2 fueron generadas y estudiadas en los pasados 13 años (Davis and Gillies, Cáncer Immunol Immunother 52:297-308, 2003; Cruz et al, Clin Exp Med 4:57-64, 2004; Lode et al, Pharmacol Ther 80:277-292, 1998). Estudios en ratones mostraron que estas proteínas de fusión exhibieron actividad tumoricida significativamente mejor que ya sea Ab o citoquina solos o como una mezcla sin el enlace covalente ( Davis and Gillies, Cáncer Immunol Immunother 52:297-308, 2003; Cruz et al, Clin Exp Med 4:57-64, 2004; Lode et al, Pharmacol Ther 80:277-292, 1998). Sin embargo, a diferencia de mostrar que actividad tumoricida requerida de células CD8 y células NK, los efectos in vivo directos de las proteínas de fusión sobre sub-conj untos de células T fueron extensamente ignorados. Aunque se podría esperar que la actividad biológica de las proteínas de fusión fuera idéntica a aquella de los complejos de citoquina/mAb bajo condiciones in vivo, estos constructor todavía tienen que ser comparados directamente. Para este fin, se han obtenido recientemente proteínas de fusión de Ab-IL-2 de Dr. Sherie Morrison (UCLA, CA) para comparación con complejos de IL-2/mAb. La proteína de fusión recombinante, designada anti-DNS-IgG3-IL-2 , consiste de IL-2 humana anexada covalentemente al extremo de Fe de un Ab quimérico, que contiene región constante de IgG3 humana con región variable de ratón específica para un hapteno, dansilo (1-sulfonil cloruro de 5-dimetilamino naftaleno, DNS) (Harvill et al, J Immunol 157:3165-3170, 1996) . Puesto que DNS no se encuentra en el ratón, esta proteína de fusión debe persistir sistémicamente, similar a los complejos de citoquina/mAb. Se mide que la vida media in vivo de la protína de fusión anti-DNS-IgG3-IL-2 en ratones es de ~7 hr ( Harvill et al., J Immunol 157:3165-3170, 1996) , que es similar a aquella de los complejos de IL-2/mAb (Sato et al., Biotherapy 6:225-231, 1993) y ligeramente más larga que la otra proteína de fusión Ab-IL-2 chl4.18-IL-2 (Kendra e£ a/., Cáncer Immunol Immunother .48:219-229, 1999). Bajo condiciones in Vitro, todos estos reactivos exhibieron actividad de IL-2 similar a rIL-2 libre (Gillies et al., Proc Nati Acad Sd USA 89: 1428-32; Harvill and Morrison, Mol Immunol 33:1007-1014, 1996).

Para comparar directamente la actividad biológica de proteínas de fusión anti-DNS-IgG3-IL-2 a complejos IL-2/mAb IL-2, células de CD8 de P CFSE-marcadas de ratones B6.PL fueron purificadas, inyectadas a un grupo de ratones B6 sin irradiar, que fueron luego inyectados ya sea con PBS, rhIL-2, la proteína de fusión o el complejo a una dosis equivalente molar. . Puesto que la proteína de fusión fue construida con IL-2 humana, el complejo fue creado mediante rhIL-2 enlazante con mAb de IL-2 anti-humano (MAB602), que demostró ser muy efectivo para inducir proliferación de células CD8 de MP de ratón (Fig. 6B) . Sorprendentemente, a diferencia de la proliferación de células donadoras eficiente inducida por complejos de rhIL-2 /MAB602 de control, las proteínas de fusión anti-DNS-IgG3-IL-2 , que exhibieron actividad IL-2 esperada, fueron mínimamente efectivas para promover la proliferación de células donadoras; en efecto, las proteínas de fusión no fueron mejores que rhIL-2 libre (Fig. 13) . Este hallazgo indica fuertemente que los complejos de IL-2/mAb exhiben actividad biológica in vivo significativamente más alta que las proteínas de fusión análogas. La figura 13 muestra que los complejos de IL-2/mAb son significativamente más potentes que las proteínas de fusión de Ab-IL- 2. Células de CD8 de memoria-fenotipo (MP) Thy- 1.1 CFSE-marcadas fueron transferidas a ratones B6 normales e inyectadas ya sea con PBS, 1 µ? de rhIL-2, 1 µ? de rhIL-2 + 5 µg de MAB602 o un equivalente molar (-10 µg) de proteínas de fusión anti-DNS-IgG3-IL-2 un día sí y un día no y luego los perfiles de CFSE de células CD8 donadoras en NL huésped fueron analizados 7 días después del inicio del experimento (lado izquierdo). La actividad de IL-2 fue medida al incubar células CTLL-2 con concentraciones de titulación equivalentes molares de rhIL-2 o proteínas de fusión anti-DNS-IgG3-IL-2 (lado derecho) .

EJEMPLO 7 Habilidad del complejo de IL-7/Anticuerpo monoclonal IL-7 para expandir células T naturales IL-7 es una citoquina tipo I pequeña (PM: - 25 Kd) que pertenece a la misma familia de citoquinas como IL-2, -4, -9, -15 y -21 (Fry and Mackall, J Immunol 174:6571-76, 2005; Sugamura et al, Annu Rev Immunol 14:179-205. 1996). IL-7 fue descubierta inicialmente en 1988 por su habilidad para apoyar el crecimiento de progenitores de célula B y el gen fue clonado de una línea celular estromal de médula ósea (BM) (Ñamen et al, Nature 333:571-73, 1988; Ñamen et al., J Exp Med 167:988-1002, 1988). La función célula T - trópica de IL-2 fue descubierta subsecuentemente, empezando con el hallazgo de que IL-7 promueve el crecimiento y diferenciación de progenitores de célula T para ambos sub- conjuntos de TCR aß y ?d TCR en el timo (Conlon et al, Blood 74: 1368-73, 1989; atanbe et al, Int Immunol 3 :1067 '-7 '5, 1991) y con la confirmación de estos papeles con la generación de ratones deficientes de IL-7 y deficientes de receptor (R) de IL-7 (Peschon et al, J Exp Med 180:1955-60, 1994; vonFreeden-Jeffry et al, J Exp Med 181:1519-26, 1995). Un severo deterioro en desarrollo tanto de células B como T en estos ratones mutantes demostró un papel no redundante para IL-7 en linfopoyesis de B y T. No obstante, la variación en la dependencia de IL-7 entre diferentes especies es evidente, ya que pacientes humanos inmunodeficientes con IL-7R defectuosa son severamente deficientes en células T, pero poseen números normales de células B (vonFreeden-Jeffry et al, J Immunol 161:5673-5680, 1998; Puel et al, Nat Genet 20:394-97, 1998; vonFreeden-Jeffry et al, Immunity 7: 147- 154, 1997; Schluns et al, Nature Immunol 1:426-32, 2000; Tan et al, Proc Nati Acad Sci USA 98:8732-37, 2001). El tamaño global y composición de la acumulación de células T maduras son regulados por mecanismos homeostáticos . Surh et ah, Sem. Immunol. 17:183, 2005; Schluns et al., Nat Rev Immunol. 3:269, 2003; Jameson Nat Rev Immunol. 2:547, 2002. La supervivencia de un número constante de células T naturales requiere señales del contacto con auto-MHC/péptido ligandos e IL-7, mientras que se requieren señales del contacto con IL-7 e IL-15 para la supervivencia del número constante de células T de memoria. Surh et al, Sem. Immunol 17: 183, 2005; Schluns et al, Nat Rev Immunol. 3:269, 2003; Jameson Nat Rev Immunol. 2:547, 2002. La presencia de mecanismos homeostáticos que regulan el tamaño global de la acumulación de células T es evidente por el hallazgo de que las células T tienen la capacidad de sufrir expansión "homeostática" espontánea en respuesta a una deficiencia de célula T (T) . Ernst et al, Immunity 11:173, 1999; Goldrath et al, Immunity 11: 183, 1999. Además, la expansión homeostática de células T es dependiente de IL-7 e IL-15. Asi, en ausencia de expansión homeostática de IL-7 de células T naturales que no se presenta y en ausencia tanto de células T de memoria IL-7 e IL-15 no pueden sufrir homeostática. Schluns et al, Nat Immunol 1 :426, 2000; Tan et al, Proc Nati Acad Sci 98:8732, 2001; Tan et al, J Exp Med 195: 1523, 2002; Goldrath et al, J. Exp Med 195: 1515, 2002. Estos hallazgos han conducido colectivamente al paradigma actual de que los niveles básales producidos constitutivamente de IL-7 e IL-15 apoyan la supervivencia de un número finito de células T y en el agotamiento de células T, las concentraciones básales de IL-7 e IL-15 se incrementan, de la carencia de utilización e impulsan a las células T restantes a sufrir expansión hpmeostática Surh et al., Sem. Immunol . 17:183, 2005. Se debe enfatizar que la supervivencia y expresión homeostática de células T naturales son casi exclusivamente dependientes de IL-7, mientras que la supervivencia y proliferación homeostática de células T de memoria pueden ser apoyadas ya sea por IL-7 o IL-15, pero más óptimamente tanto por IL-7 como IL-15. Surh et ah, Sem. Immunol. 17: 183, 2005; Schluns et ah, Nat Rev Immunol. 3:269, 2003; Jameson Nat Rev Immunol. 2:547, 2002. Para ser efectiva in vivo, IL-7 tiene que ser inyectada en grandes cantidades. Por ejemplo, la inyección de IL-7 en cantidades suficientes para elevar los niveles de sangre 10-100 veces por 3 semanas provoca solamente un incremento de 3 - 7 veces en números de células T en humanos. [Rosenberg, 2006 #1889] . De aquí, mucho de la IL-7 administrada puede tener actividad biológica limitada, quizás debido a la corta vida media o falla de alcanzar sitios apropiados en los tejidos linfoides. Con respecto a lo primero, se demostró hace muchos años que la vida media de varias yc citoquinas, en las que se incluyen IL-7, puede ser incrementada mediante enlace a mAb anti-citoquina específicos [Sato, 1993 #1805; Courtney, 1994 #1895; Finkelman, 1993 #1775; Valenzona, 1998 #1896; Klein, 1995 #1876]. Para IL-2, sin embargo, se ha demostrado recientemente que la asociación con mAb de IL-2 tiene un efecto mucho más espectacular sobre la actividad de citoquina in vivo que puede ser atribuida solamente de un incremento en la vida media de citoquina [Boyman, 2006 #1835; Kamimura, 2006 #1840] . En este reporte se demuestra que los complejos de IL-7/mAb de IL-7 son vastamente superiore a la IL-7 libre para producir expansión de células pre-B y células pre-T. Estos complejos también actúan fuertemente sobre células T de CD4+ y CD8+ maduras y provocan que tanto células T naturales y de memoria sufran expansión homeostática eficiente bajo condiciones repletas de células T normales. Los complejos de IL-7/mAb de IL-7 pueden aumentar o restaurar la timopoyesis. El timo de ratones B6 inyectados con complejos de rhIL-7/mAb de IL-7 ( 25) tuvo 15-20% celularidad más alta que los ratones B6 inyectados con PBS, la mayoría de una elevación en números de células CD4/CD8 doble positivo (DP) (Fig. 14). Para determinar mejor la timopoyesis, grupos de ratones IL-7_/", que tienen un timo muy pequeño (10, 11), fueron inyectados con complejos de rhIL-7/M25, rhIL-7 solo o PBS. Dos inyecciones de 1.5 µg de rhIL-7 más 15 µq de M25, 3 días aparte, provocaron que el timo en ratones IL-7_ ~ se ampliara extensamente y mostraron un incremento de 50 - 100 veces en celularidad por 7 días; en contraste, la inyección de 1.5 µg de rhIL-7 solo indujo solamente un incremento de 2 - 3 veces relativamente menor en número de células (Fig. 14). El análisis de la pblación de CD4-CD8-(DN) de timocitos reveló que la inyección de complejos de rhlL- 7/M25 indujo surgimiento selectivo de células CD25+CD44- DN3 y CD25-CD44-DN4 , que estaban severamente deficientes en ratones IL-7_ ~; estas células no fueron restauradas con inyección de 1.5 yg de rhIL-7 solo (Fig. 14A) . La restauración de timopoyesis inducida por los complejos de rhlL-7/M25 fue transitoria ya que el timo de los ratones IL-7~/_ inyectados se revirtió a un estado hipocelular por 3 semanas después de la inyección de los complejos (Fig. 14B, izquierda). Se debe mencionar que, en contraste con el efecto marcado en el timo, la inyección de los complejos de rhIL-7/M25 provocó solo un incremento de 2 veces en la celularidad del bazo de ratones IL-7_ ~. Para estimar la actividad biológica relativa de complejos de rhIL-7/M25, ratones I L-7_ " fueron inyectados dos veces en 7 días con una dosis moderada (1 + 5 g) de complejos de rhIL-7/M25 contra dosis tituladas (1, 10 y 100 \iq) de rhIL-7 libre. El hallazgo sorprendente fue que la ampliación del timo inducida por 1 g de rhIL-7 enlazado a 25 era equivalente al tamaño del timo producido al inyectar 100 de rhIL-7 libre (Fig. 14B, derecha) . Las figuras 15 a 18 proporcionan evidencia adicional por la actividad biológica incrementada del complejo de I L-7/mAb de IL-7 con respecto a I L-7. La figura 15 muestra que los complejos de IL-7/mAb de IL-7 (M25) inducen proliferación homeostática de células T naturales. Para determinar la habilidad de los complejos de IL-7/M25 a inducir expansión de células T maduras, células de NL B6.CD45.1 CD45-congénicas , CFSE-marcadas fueron transferidas adoptadamente a ratones B6 normales sin irradiar. Luego estos huéspedes fueron inyectados con complejos de rhlL-7/M25 complexes (1.5 + 7.5 µg, 3x en 7 días) y se analizó el destino de las células donadoras; los huéspedes testigo recibieron solamente PBS, rhIL-7 o M25. Notablemente, mientras que las células B y T donadoras no proliferaron en huéspedes de control, inyecciones de complejos de rhIL-7/M25 indujeron hasta 4-5 rondas de proliferación de la mayoría de células CD8+ donadoras, una ronda de proliferación de aproximadamente la mitad de células CD4+ donadoras y casi ninguna proliferación de células B B220+ donadoras ((Fig. 15A) . Considerando el ritmo lento de la proliferación, es probable que los complejos de rhIL-7/M25 provoquen proliferación "homeostática" de células T donadoras en respuesta a auto-MHC/péptido ligandos, a pesar de estar en huéspedes repletos de célula T normales. Consistente con esta idea, la proliferación inducida por rhIL-7/M25 de dos líneas de células CD8+ transgpernicas de TCR naturales probadas (P14 y OT-I) y la proliferación de células CD8+ naturales fue extensamente abrogada en ausencia de moléculas clase I de MHC, esto es, en huéspedes TAP-I 7. Además, la inyección de complejos de rhIL-7/M25 provocó que células T naturales sufran proliferación homeostática en huéspedes IL-7_/~, que no soportan la proliferación homeostática de células T naturales donadoras (Fig. 15B) . Aquí, la inyección de rhIL-7 solo a la dosis equivalente falló en producir proliferación de células T donadoras (Fig. 15B) . Finalmente, la proliferación inducida por rhIL-7/M25 indujo la proliferación de células T donadoras al acoplarse directamente con IL-7R, ya que la proliferación fue abrogada completamente cuando el mAb anti-IL-7Ra mAb A7R34 fue coinyectado con los complejos. En cuanto a la proliferación homeostática a IL-7 endógena en huéspedes linfopénicos (12, 13), la inyección de complejos de rhIL-7/M25 provocó proliferación mucho más débil de células CD4+ que células CD8+. Puesto que (m) IL-7R de ratón se enlaza a rhIL-7 con una afinidad ligeramente más baja que rmIL-7, se examinaron los efectos de los complejos de rmIL-7/M25 sobre las células CD4+ cells. Notablemente, los complejos de rmIL-7/M25 exhibieron una actividad biológica 2-3 veces mayor que los complejos de rhIL-7/M25 y significativamente indujeron la proliferación eficiente de ambos sub-conjuntos de células CD4+ y CD8+ donadoras en huéspedes B6 normales (Fig. 15C) . La proliferación de ambos sub-conjuntos de células CD4+ y CD8+ también fue observada con complejos rhIL-7/M25 cuando estos complejos fueron inyectados a dosis más altas. La expansión también se aplicó para células T huéspedes, ya que el tamaño de la acumulación de células T naturales en estos huéspedes se incremento aproximadamente 3 veces. Se observó una expansión masiva de precursoses de célula B en bazo y médula ósea de ratones inyectados con complejo IL-7+ 25 como se reporta previamente. Finkelman et al., J Immunol 151: 1235, 1993. La figura 16 muestra que el complejo rhIL-7+ 25 (IL-7/mAb) puede impulsar la expansión tanto de células T naturales como de memoria. El complejo de IL-7/mAb es casi tan efectivo como el complejo de IL-2/mAb para expandir células CD8 (CD44hl) de memoria, pero el IL-7/mAb es mucho más eficiente que IL-2/mAb para inducir la expansión de células CD8 (CD4410) naturales. También se encontró que el complejo IL-7/mAb induce la proliferación homeostática de células CD4 naturales y de memoria, pero a proporciones más bajas que las células CD8 (Fig. 15C) . En procedimientos experimentales, células CD8 naturales (CD4410) B6.Thy-l.l CFSE-marcadas y de memoria purificadas (CD44hl) fueron inyectadas a ratones B6 normales y los huéspedes fueron inyectados con PBS, IL-7+M25 (1.5 + 15 µ? ) o IL-2+S4B6 (1.5 + 15 iq) un dia si y un día no. Las células T donadoras fueron analizadas 7 días después de inyección de las células mediante citometria de flujo, después del teñido de células esplénicas huéspedes en cuanto a Thy-1.1 y CD8. Se muestran los perfiles de CFSE de célulasa CD8 donadoras recortadas. Se obtuvieron datos similares de NL. La figura 17 muestra que la porción de anti-mAb de IL-7 M25 es requerida para su efecto de mejora cuando es acomplejado a IL-7. La remoción de la porción de Fe de M25 destruye la mayoría de la capacidad del complejo de IL-7+M24 para inducir la expansión de células T naturales. En procedimientos experimentales, células de NL B6. Thy-1.1 CFSE-marcadas fueron inyectadas a ratones ?ß normales y luego los huéspedes fueron inyectados con PBS, IL-7+ 25 (1.5 + 15 ug/inyección) o Fab de IL-7+M25 (1.5 + 15 µg/inyección) un día sí y un día no. Las células T donadoras fueron analizadas 7 días después de la inyección de células mediante citometría de flujo, después de teñido de células de NL huéspedes en cuanto a Thy-1.1, CD4 y CD8. Se muestran los perfiles de CFSE de células de CD4 y CD8 donadoras recortadas. Se obtuvieron datos similares del bazo. La figura 18 muestra la habilidad del complejo de IL-7/mAb para restaurar el defecto en homeóstasis de célula T natural evidente con la edad avanzada. La acumulación de células T maduras en individuos jóvenes está compuesta de principalmente células naturales. El envejecimiento no cambia significativamente el número total y la proporción de células CD4+ a CD8+ cells, pero está asociado con un incremento gradual en la proporción de células de memoria con la reducción compensatoria en células naturales. Hodes Immunol. Rev. 160:5, 1997; Miller Vaccine 18: 1654, 2000; Linton et al, Nat. Immunol. 5: 133, 2004. Aunque la causa exacta del desplazamiento provocado por la edad en la representación de células naturales y de memoria es desconocida, la idea más simple es que este es un reflejo del resultado timico disminuido de células naturales combinado con la conversión impulsada por antigeno continua de células naturales a células de memoria en toda la vida. Sin embargo, es probable que esta visión sea una sobre-simplificación, ya que hay probablemente múltiples mecanismos que contribuyen a la pérdida de células T naturales con el envejecimiento. Un factor contribuyente probable podría ser el defecto en los mecanismos homeostáticos que regulan la supervivencia y el tamaño global de la acumulación de células T maduras. Se ha encontrado recientemente evidencia de que el envejecimiento está .asociado con una disminución severa en la habilidad innata "para soportar la homeóstasis de céulas T naturales. Este defecto parece estar relacionado con IL-7, pero no es debido a la disminución de IL-7. Más bien, parece haber un problema en la presentación de IL-7 a células T. Aunque la causa fundamental de este defecto todavía está por ser identificado, se describe un nuevo método para invertir la disminución inducida por la edad en la habilidad para soportar la homeóstasis de células T naturales. La figura 18 muestra que IL-7 libre exógena no es efectiva, pero el complejo IL-7/mAb puede restaurar eficientemente el defecto homeostático de ratones envejecidos. El hecho de envejecimiento está asociado con un defecto en la habilidad para soportar la homeóstasis de células T naturales como se muestra en la figura 18A. Aquí, se muestra que la habilidad de los huéspedes linfopénicos para soportar la expansión homeostática disminuye empezando alrededor de 1 año de edad y se vuelve severamente deteriorado a los 16 meses de edad. Para determinar si la incapacidad de los ratones vie-jos para soportar la expansión homeostática de células T naturales puede ser restaurada, se probó el efecto de inyectar IL-7 libre y complejos de IL-7/mAb. Como se muestra en la figura 18B, la inyección del complejo IL-7/mAb fue apto de restaurar completamente el defecto en huéspedes viejos, mientras que la inyección de IL-7 libre no fue efectiva. La figura 18 muestra que el envejecimiento está asociado con una disminución severa en la habilidad para soportar la proliferación homeostática de células T naturales y esta puede ser restaurada usando IL-7 en combinación con el complejo anti-mAb de IL-7. (A) La habilidad para soportar homeóstasis de células T naturales declina con la edad. Grupos de ratones B6 de varias edades (1.5 - 22 meses) fueron irradiados (600 cGy) e inyectados con 1 x 106 células de NL CFSE-marcadas de ratones B6.Thy.l jóvenes (2 meses) y los perfiles de CFSe de células T donadoras analizados 7 dias más tarde. Se muestran resultados de NL huésped; se obtuvieron datos similares de bazo huésped. Cada grupo consistía de 2-3 ratones. (B) Restauración efectiva de defecto homeostático usando complejo de IL-7-mAb. Células T B6.Thy-l.l (CD4410) naturales, FACS-clasificadas fueron CFSE-marcadas e inyectadas a ratones B6 jóvenes (2 meses) y viejos (16 meses) irradiados. Los ratones fueron inyectados ya sea con rhIL-7 o complejo de rhIL-7 más M25 (anti-hmAb de IL-7) un día sí y un día no y el perfil de CFSE de células T donadoras fue analizado en el día 7 post-inyección de células. Una dosis de 1.5 ug de rhIL-7 fue inyectada por ratón; la misma dosis de rhIL-7 fue incubada con 15 ug de M25 por al menos 30 minutos e inyectada conjuntamente como complejo de rhIL-7 más M25. Se muestran los perfiles representativos de tres experimentos independientes con 2-3 ratones en cada grupo.

EJEMPLO 8 Conversión de IL-15 a un super-agonista mediante enlace a IL-15RCX soluble IL-15 está normalmente presente in vivo como una citoquina asociada a la célula, enlazada a IL- 15R . Se demuestra en la presente que la actividad biológica de IL-15 soluble es mucho mejorada enseguida de la interacción con IL-15Ra soluble recombinante ; después de la inyección, los complejos de IL-15/IL-15Ra solubles inducen rápidamente una expansión fuerte y selectiva de células de CD8+ de fenotipo de memoria y células NK. Estos hallazgos implican que el enlace de IL-15Ra a IL-15 puede crear un cambio conformacional que potencia el reconocimiento de I L-15 por el receptor de ß?a receptor sobre células T. El efecto de mejora del enlace de I L-15ROÍ puede explicar por qué I L-15 normalmente funciona como una citoquina célula-asociada. Significativamente, los resultados con I L-2, una citoquina soluble, son bastante diferentes; asi, la función de IL-2 es inhibida marcadamente por el enlace a IL IL-2Ra soluble. En ratones, ciertas células, es decir células T de CD8+ de fenotipo de memoria ( P) y células NK, son altamente sensibles a IL-15 (Kennedy et al., J Exp Med 191:771-80, 2000; Judge et al., J Exp. Med 196:935-46, 2002; Fehniger and Caligiuri, Blood 97:14-32, 2001; Becker et al, J Exp Med 195:1541-48, 2002; Zhang et al, Immunity 8:591-99, 1998; Waldmann, T.A., J Clin Immunol 22:51-56, 2002; Zeng et al, J Exp Med 201: 139-48, 2005; Van Belle and Grooten, Arch Immunol Ther Exp ( arz) 53: 115-26, 2005; Schluns et al, IntJBiochem Cell Biol 37: 1567-71, 2005). Las células de CD8+ de P muestran altos niveles de CD44 y como las células NK también muestran alta expresión de CD122 (IL-2R ) , un competente del receptor para ambas IL-15 y IL-2 (Waldmann, T.A., J Clin Immunol 22:51-56, 2002). Para restaurar las células, la sensibilidad a estas dos citoquinas es controlada por un receptor de dos cadenas, ß?0, que consiste de la cadena ß (CD 122) más la cadena ? común, yC f que controla la señalización intracelular . IL-15 no es secretada normalmente en forma soluble (Van Belle and Grooten, Arch Immunol Ther Exp ( arz) 53:115-26, 2005; Schluns et al, Int J Biochem Cell Biol 37:1567-71, 2005; Nguyen et al, J Immunol 169:4279-87, 2002) sino que es retenida sobre la superficie celular enlazada a un receptor único, IL-15Ra, especialmente sobre células dendriticas (DC) (Dubois et al, Immunity 17:597-47, 2002; Burkett et al, J Exp Med 200:825-34, 2004; Burkett et al, Proc Nati Acad Sd USA 100:4724-29, 2003; Schluns et al, Blood 103:988-994, 2004; Zaft et al, J Immunol 175:6428- 35, 2005; Sandau et al, J Immunol 173:6537-6541, 2004). IL-15 enlazada a la célula es entonces presentada en trans a células T y células NK y es reconocida por el receptor ß?0 en estas células; tal reconocimiento mantiene la supervivencia celular y proliferación intermitente. IL-15Ra juega un papel determinante en presentar IL-15 endógena. Así, como los ratones IL-15"/_ (1), los ratones IL- 15Ra_ ~ carecen de células CD8+ CD122hl y células o NK (Lodolce et al, Immunity 9:669-76, 1998), supuestamente debido a que la IL-15 sintetizada en ratones IL-15R_ ~ falla en salir del citoplasma. No obstante, las células ??-2?ß?a+ pueden proliferar en respuesta a una forma recombinante soluble de IL-15 en ausencia de IL-15Ra (Lodolce et al., J Exp Med 194:1187-94, 2001). Además, bajo ciertas condiciones, IL-15Ra puede ser inhibidor. Así, se reporta que la inyección de ratones con una forma recombinante soluble (s) de IL-15Ro¡ suprime la proliferación de células NK (Nguyen et al, J Immunol 169:4279-87, 2002) y ciertas respuestas inmunes T-dependientes in vivo (Ruckert et al, Eur J Immunol 33:3493-3503, 2003; Ruckert et al., J Immunol 174:5507-15, 2005; Wei et al, J Immunol 167:577-82, 2001; Ruchatz et al, J Immunol 160:5654-5660, 1998) y la adición de sIL-15Ra in vitro puede bloquear la respuesta de líneas celulares a IL-15 (Ruckert et al, J Immunol 174:5507-15, 2005; Wei et al, J Immunol 167:577-82, 2001; Ruchatz et al, J Immunol 160:5654-5660, 1998; Budagian et al, J Biol Chem 279:40368-75, 2004; Mortier et al, J Immunol 173: 1681-1688, 2004; Eisenman et al,. Cytokine 20: 121-29, 2002). A pesar de estos hallazgos, hay otros reportes de que sIL-15R (Giron-Michel et al, Blood 106:2302-10, 2005) y también un dominio de sushi soluble de IL-15Ra (Mortier et al, J Biol Chem, 2005, E-pub ahead of print) , puede mejorar respuestas de IL-15 de líneas celulares humanas.

EJEMPLO 9 Estimulad9ón mediante complejos de IL-15/IL-15Rct in Vitro Para examinar si la función estimuladora de IL-15 soluble es alterada mediante el enlace a sIL-15Ra, células de CD8+ de CD44hl CDl22hl de MP purificadas fueron cultivadas in vitro con IL-15 de ratón + sIL-15Ra de ratón enlazado covalentemente a la porción de Fe de IgGl humana (sIL-15Ra-Fc) . Para IL-sola, las respuestas medias máximas requirieron aproximadamente 30 ng/ml y las respuestas fueron despreciables con < 10 ng/ml (Figs. 19A, 19B) . Aquí, el hallazgo notable fue que la complementación de una baja concentración de IL-15, por ejemplo 5 ng/ml, con sIL-15Ra-Fc condujo a fuertes respuestas proliferativas de células células CD8+ de MP, tal como se mide ya sea mediante dilución con CFSE dilution (Fig. 19A) o incorporación de [3H] -thymidina (Fig. 19B) . No se presentó proliferación con sIL-15Ra-Fc solo (Fig. 19B) y la adición de sIL-15Ra-Fc no alteró la respuesta a células CD8+ de MP a una citoquina diferente, IL-2 (datos no mostrados) . Con IL-15, no se pudo encontrar evidencia de que sIL-15Ra-Fc actuaba al mejorar la vida media de IL-15 in vitro (Fig. 25) . Con una concentración limitante de citoquina, las respuestas de IL-15 fueron en general mejoradas por 6-9 veces mediante adición de sIL-15Ra-Fc. La adición de sIL-15Ra-Fc también mejoró considerablemente la respuesta IL-15 de células NK CDl22hl (Fig. 19C) , pero fue relatiamente no efectiva sobre células CD4+ (CD44hl) de MP que expresan niveles intermedios de CD122 CD122 (Fig. 19C) . Inesperadamente, sIL- 15Ra-Fc más IL- 15 condujeron a proliferación significativa de células CD8+ CD4410 CD12210 naturales típicas, aunque solamente con altas concentraciones de IL- 15 (Fig. 19C) . Para células CD8+ de MP, las respuestas tanto a IL-15 soluble sola como IL-15 más sIL-15Ra-Fc fueron moderadas solamente por medio de receptores de ß?a· Así, las respuestas fueron abolidas mediante la adición de mAb CD122 (Fig. 19D) y fueron tan altas con CD8+ de MP de ratones IL-15R _ " como con células CD8+ de MP normales (Fig. 19E) . Al ser una molécula dimérica, sIL-15Ra-Fc podría mejorar la actividad de IL-15 al presentar esta citoquina en forma reticulada. Sin embargo, los fragmentos monoméricos enzima-escindidos de sIL-15Ra-Fc no fueron menos potentes en aumentar las respuestas de IL-15 que las moléculas diméricas (Fig. 19A, 19B) . Por supuesto, bajo condiciones limitantes, las respuestas fueron apreciablemente más altas con los monómeros de receptor que con los dímeros de Fe (Fig. 19B) . No es claro por qué los monómeros de receptor fueron más efectivos que los dimeros, aunque por razones esféricas los complejos de monómero/IL-15 se pueden enlazar más efectivamente al receptor ß?a. Las figuras 19A, 19B, 19C, 19D y 19E muestran que IL-15ROÍ soluble aumenta la proliferación de linfocitos moderada por IL-15 in vitro. (A) Células T de CD8+ (CD44hi) de MP purificadas fueron marcadas con CFSE y cultivadas a 5 x 104 células/cavidad con 5 ng/ml de IL-15. Como se indica lyg/ml ya sea de sIL-15Ra-Fc (dimeros) o sIL-15Ra (monómeros) fueron agregados a los cultivos. La dilución de CFSE fue determinada el dia 4. Se muestran datos representativos. (B) células T de CD85+ de MP purificadas fueron cultivadas ya sea con cantidades tituladas de IL-15 más una concentración fija de receptor soluble (1 g/ml) (parte superior) o cantidades tituladas de receptor soluble más una concentraciónj fija de IL- 15 (10 ng/ml) (parte inferior) . Los datos muestras niveles medios de incorporación de [3H] -timidina (± SD) para cultivos por triplicado en el dia 3. (C) células T de CD8+ (CD441Q) naturales purificadas, células T CD8+ de MP, células NK cells o células T CD4+ de MP fueron cultivadas con IL-15 como se indica. Se agregó IL-15Ra-Fc soluble a 1 yg/ml. Se determinó la dilución de CFSE en el dia 3. (D) Como en (B) excepto que se agregaron 10 g/ml de anticuerpo anti-CD122 como se indica. (E) Células T de CD8+ de MP de ratones Ly5.2 tipo silvestre y ratones IL-15Ra_/~/Ly5.1 fueron mezclados conjuntamente, marcados con CFSE y cultivados como se indica. La dilución de CFSe sobre células Ly5.1~ _ (tipo silvestre) y células Ly5.1+ (IL-15Ra- ~) fue medida en el día 3. Los datos anteriores se refieren a IL-15 de ratón e IL-15ROÍ soluble de ratón. Datos bastante similares se aplican a IL-15/IL-15Ra humano. Asi, la respuestas de las células CD8+ de MP de ratón ya sea a IL-15 humana o de ratón fue considerablemente mejorada por la adición de sIL-15Ro¡-Fc humana (Fig. 26) . La adición de monómeros de IL-15Ra humana fue aún más efectiva. Nótese que para respuestas de IL-2Rß?c de ratón, IL-15 humana es considerablemente más débil que IL-15 de ratón (Eisenman et al,. Cytokine 20: 121-29, 2002). Las figuras 25A y 25B muestran la supervivencia de IL-15 in vitro. Células T de CD8+ de MP CFSE-marcadas fueron agregadas a cultivos que contienen IL-15 sola a 5 ng/ml (parte superior, gris) , 100 ng/ml (fondo) o 5ng/ml d IL-15 más 1 g/ml de sIL-15Ra-Fc (parte superior, linea continua) . Estos cultivos fueron ya sea recién preparados (recientes) o fueron dejados por 48 horas a 37°C (48 horas pre-cultivo) antes de la adición de células T. (B) como para (A) excepto que las células T fueron cultivadas con sobrenadantes tomados de los "pre-cultivos de 48 horas" (sobrenadante) vs los últimos cultivos que hablan sido vaciados de sobrenadante sin lavado (cavidad-fondo) . Interpretación: El experimento muestra que la actividad biológica de IL-15 (cultivada sola) no disminuyó significativamente durante el cutivo durante 48 horas a 37°C, haciendo asi improbable que sIL-15Ra-Fc actuara simplemente al prolongar la vida media de IL-15. Además, la ausencia de proliferación de células transferidas a las cavidades vaciadas (cavidad-fondo) sugiere que la actividad mejorada del receptor soluble no refleja la presentación reticulada de IL-15 enlazada vía los receptores al fondo de plástico de la cavidad. La figura 26 muestra que sIL-15Ra-Fc humana mejora la respuesta de células CD8+ de MP tanto a IL-15 de ratón como humana. Células T de CD8+ de MP purificadas, CFSE-marcadas, fueron cultivadas a 5 x 104 células/cavidad, ya sea con 100 ng/ml IL-15 humana o 5 ng/ml IL-15 murina . Como se indica, 1 pg/ml sIL-15Ra-Fc humana fue agregada a los cultivos. La dilución de CFSE fue determinada después de 3 días de cultivo. Nótese que, en contraste directo con CTLL (que expresa IL-15Ra más ?a ) , las células CD8+ de MP de ratón responden mejor a IL-15 de ratón que a IL-15 humana. Eisenman, J. , et al, Cytokine 20: 121-129, 2002.

EJEMPLO 10 Respuestas in vivo Confirmando los hallazgos previos (Judge et al . , J Exp. Med 196:935-46, 2002; Zhang et al., Immunity 8:591-99, 1998), la inyección de ratones ip con IL-15 después de inyección de células CD8+ de MP CFSE-marcadas provocó que aproximadamente el 50% de células donadoras se dividan 1-2 veces (Fig. 20A) . Sin embargo, con la co-inyección de sIL-15Ra-Fc, virtualmente todas las células donadoras se dividieron y > 95% de las células se dividieron 3 veces o más (en comparación con < 5% para IL-15 inyectada sola) ; en contraste, la inyección de sIL-15Ro¡-Fc sola no tuvo efecto sobre la proliferación. La capacidad de sIL-15Ra-Fc para mejorar las respuesas de células CD8+ de MP a IL-15 también se aplicó a células CD8+ de memoria antigeno-especificas, esto es, a células CD8+ transgénicas de TCR P14 antigeno-cebadas (Fig. 20B, parte superior) . También hubo mejora de la respuesta de IL-15 de células CD4+ de MP (Fig. 20B, fondo) . Para células CD8+ de MP, experimentos de titilación de IL-15 demostraron que las respuestas in vivo a IL-15 fueron incrementadas aproximadmente 50 veces cuando dosis limitantes de IL-15 fueron co-inyectadas con sIL-15Ra-Fc (Fig. 20C, 20D) . IL-15Ra endógena no fue requerida debido a que datos similares se aplicaron a la transferencia de célula T a huéspedes de IL-15Ra" _ (Fig. 27) . Los datos anteriores se aplican a células donadoras CFSE-marcadas . Para células huésped, la inyección de IL-15 o sIL-15Ra-Fc solo tuvo poco efecto sobre los números de células. En contraste, dos inyecciones de IL- 15 más sIL-15Ra-Fc provocaron un incremento marcado en los números totales de células CD8+ de MP huéspedes y células NK por el día 3 después de la inyección inicial y el bazo fue obviamente ampliado ((Fig. 21A, 21B) . Asimismo, la proliferación, tal como es medida por la incorporación de BrdU fue mucho más alta con inyección de IL-15 más sIL-15R -Fe que con IL-15 sola (Fig. 21C) . Ratones IL-15Ra_ ~ carecen de células CD8+ de MP CD122hl y células NK (Lodolce et al, Immunity 9:669-76, 1998), supuestamente debido a que la ausencia de IL-15R impide la presentación de IL-15 endógena. Como se muestra en la figura 21D, al inyectar a ratones IL-15Ra_ ~ con una mezcla de IL-15 y sIL-15Ra-Fc restauró rápidamente los números de células exterminadoras NK NKl .1+ DX5+ NK y células CD8+ de MP CD122hl; a la dosis usada, IL-15 sola no fue efectiva . El efecto in vivo anterior aplicado a IL-15 acomplejada con IL- 15Ra-Fc dimérico. Para determinar si se requiere el componente Fe, se probó la habilidad de los complejos de IL-15 generados con IL-15Ra monomérica desprovista de Fe para inducir proliferación de células CD8+ de MP bajo condiciones in vivo. Sorprendentemente, en tanto que los complejos IL-15/sIL-15Ra monoméricos indujeron proliferación más alta células CD8+ de MP bajo condiciones in Vitro que complejos de IL-15/IL-1 5Ra-Fc diméricos (Fig. 19A) , lo opuesto fue el caso bajo condiciones in vivo (Fig. 22) . Asi, en contraste con la actividad potente de los complejos de IL- 15/sIL-l 5Ra-Fc diméricos, los complejos de IL-15/sIL-15Ra monoméricos agotados de la porción Fe mostraron solo actividad in vivo ligeramente mejor que IL-15 libre (Fig. 22). Por consiguiente, la parte de Fe del receptor parece importante para la actividd in vivo de los complej os Las figuras 20A, 20B, 20C y 20D muestran que IL-15Ra soluble aumenta la proliferación in vivo de linfocitos de donador IL-15 moderada. (A) células T CFSE-marcadas fueron transferidas iv a receptores (B6) C57BL/6 (B6) . En los días 1 y 2 después de la transferencia, se administró ip a los receptores inyecciones de PBS, sIL-15Ra-Fc sola (7 µ?) , IL-15 sola (1.5 µg) o sIL-15Ra-Fc más IL-15 (7 xq y 1.5 g, respectivamente, lo que representa una proporción molar de 1:2). La dilución de CFSE de las células donadoras fue medida en el bazo el día . Se muestran datos representativos para células CD8+ de MP recortadas. (B) Como en (A) excepto que las células transferidas fueron de ratones LCMV-inmunes (parte superior) contra ratones normales (fondo) . (C) Células T CD8+ de MP CFSE-marcadas fueron transferidas a huéspedes B6 normales; un día más tarde, los huéspedes fueron inyectados con la dosis indicada de IL-14 con o sin sIL- 15Ra-Fc; la dosis de sIL-15Ra-Fc varió de tal manera que se inyectó una proporción molar de 2:1 de IL-15 a sIL-15Ra-Fc. Se muestran perfiles de CFSE para células CD8+ de P donadoras en bazo a 2 días después de la inyección. (D) Compilación de datos de (C) . For A, B y C, los datos mostrados son representativos de 2 ratones por grupo y también son representativos de 2 experimentos independientes. Las figuras 21A, 21B, 21C y 21D muestran que IL-15Ra soluble aumenta la proliferación de linfocito del huésped moderada por IL-15. (A) Ratones B6 normales fueron inyectados iv en los días 1 y 2 con PBS, sIL-15Ra-Fc solo, IL-15 solo o sIL-15Roí-Fc/IL-15 como se describe para la Fig. 20A. Se muestran los números totales de células T de MP de CD8+, células T de MP de CD4+ y niveles de células NK recuperadas del bazo en el día 3. (B) Los bazos de (A) fueron fotografiados como se indica. (C) Los ratones fueron tratados como en (A) , excepto que también se administró a los ratones una inyección iv inyección de BrdU el dia 1 y colocados en BrdU en el agua para beber hasta el sacrificio. Se muestra el teñido de BrdU para células CD8+ de NK, CD8 naturales, CD4+ de MP y células NK. (D) Ratones IL-15Ra fueron inyectados iv en los días days 1, 3, 5 y 7, ya sea con PBS, IL-15 (0.6 yg) o IL-15 (0.6 yg) /sIL-1 5Ra-Fc (1 yg) . Los datos muestran el teñido de células del bazo en el día 9. Para B, C, D se muestran datos representativos. Todos los datos son representativos de por lo menos 2 experimentos independientes. La figura 22 muestra que sIL-15Ra-Fc (dimeros) son mejores que sIL-15R (monómeros) bajo condiciones in vivo. Células CD8 de MP de Thy-1.1 CFSE-marcadas fueron inyectadas a huéspedes B6 normales e inyectados con 1 yg IL-15, 1 yg IL-15 + 5 yg sIL-15Ra-Fc o 1 yg sIL-15R -Fc + 10 yg sIL-15Ra y luego analizados en el día 3. Se muestran los perfiles de CFSE en células CD8 donadoras profiles recuperadas del bazo del huésped. La figura 27 muestra la estimulación por complejos de IL-15/sIL-15-Ra-Fc en huéspedes IL-15Ra_ ~. Células Células T CD8+ de MP CFSE-marcadas purificadas fueron transferidas iv a receptores de IL-15RcT _. En el día 1 después de la transferencia, se administró a los ratones receptores inyecciones ip de PBS, sIL-15Ra-Fc sola (10 yg) , IL-15 sola (2 yg) o sIL-15R -Fc más IL-15 (10 yg y 2 yg, respectivamente) . En el día 3 después de la transferencia, las células del bazo fueron cosechadas y se determinó la dilución de CFSE mediante análisis citométrico de flujo.

EJEMPLO 11 Falla de sIL-15Rcc-Fc en bloquear la presentación de IL-15 endógena Se sabe que la inyección de ratones con LPS provoca un breve incremento en la síntesis de IL-endógena (y IL-15Ra) mediante células no T in vivo, con un incremento transitorio subsecuente en la velocidad de proliferación de células CD8+ de MP CD122hi IL-15 sensible. Mattei et al, J Immunol 167:1179, 2001; Tough et al., J Exp Med 185:2089, 1997. Tal proliferación circunstante LPS-inducida es ilustrada en la figura in Fig. 23A en donde la mayoría de células CD8+ de MP donadoras sufrieron 1-2 divisiones celulares por el día 3 enseguida de la exposición a LPS en huéspedes B6 normales, que contrastó con la carencia de proliferación en huéspedes IL-15R . Significativamente, la inyección de sIL-15R -Fc después de la inyección de LPS fracasó en reducir la proliferación, aún con inyecciones diarias de sIL-15Ra-Fc (10 g/inyección) . De aquí, la inyección de sIL-15Ra-Fc no fue apta de bloquear el contacto de célula T con IL- 15 endógena enlazada a IL-15Ra endógena. También, para los huéspedes IL-15Ra, sIL-15R -Fc claramente no fue apto de compensar la carencia de IL-15Ra endógena, supuestamente debido a que la última es esencial para transportar IL- 15 a la superficie celular. Hallazgos similares se aplicaron a un sistema in Vitro en donde células CD8+ de MP fueron cultivadas en cavidades que primero fueron recubiertas con S I L-15ROÍ- FC y luego pulsadas con IL-15, seguido por lavado completo para remover la citoquina sin enlazar (Fig. 23B) . Asi, las respuestas proliferativas producidas por los complejos de IL-15R -Fc/IL-15 enlazados no podrían ser inhibidas por la adición de IL- 15Ra-Fc soluble (sin enlazar) como reactivo de bloqueo. En contraste, la adición de un anticuerpo policlonal contra IL-15 abolió la proliferación. En base a los hallazgos anteriores, la molécula de I L-15 tiene solamente un sitio de enlace para interacción con I L-15ROÍ. Una vez que este sitio es ocluido, ya sea por enlace a I L-15R endógena sobre células in vivo o on cells in vivo a a I L-15ROÍ anexada a plástico in vitro, la interacción con sIL- 15Ra-Fc exógena no se presenta y no hay interferencia con la presentación de IL-15 a células T. Este escenario no explica por qué sIL-15Ro¡ puede bloquear la respuesta de líneas celulares a IL-15 ( (Ruckert et al, J Immunol 174:5507-15, 2005; Wei et al, J Immunol 167:577-82, 2001; Ruchatz et al, J Immunol 160:5654-5660, 1998; Budagian et al, J Biol Chem 279:40368-75, 2004; Mortier et al, J Immunol 173: 1681-1688, 2004; Eisenman et al,. Cytokine 20: 121-29, 2002) . Aquí puede ser relevante que estos estudios usados en IL-15 humana o de simio y no IL-15 de ratón como en nuestro estudio, que hace surgir la posibilidad de distintas diferencias de especie en IL-15. A favor de esta idea, se encontró que, como para células CD8+ de MP, la respuesta de células CTLL de ratón a IL-15 de ratón fue mejorada por sIL-15Ra-Fc de ratón (Fig. 28A) . En contraste, confirmando los hallazgos de otros (Ruckert et al, J Immunol 174:5507-15, 2005; ei et al, J Immunol 167:577-82, 2001; Ruchatz et al, J Immunol 160:5654-5660, 1998; Budagian et al, J Biol Chem 279:40368-75, 2004), la alta respuesta de células CTLL a IL-15 humana (Eisenman et al,. Cytokine 20: 121-29, 2002) fue fuertemente inhiboda por sIL-15Ra-Fc de ratón (Fig. 28B) . Las respuestas de CTLL a IL-2 como control no fueron afectadas al agregar sIL-15Ra-Fc (Fig. 28C) . Los hallazgos anteriores no explican los reportes que constructos de sIL-15R murinos son inhibidores para la proliferación de células NK (Nguyen et al, J Immunol 169:4279-87, 2002) y respuestas de célula T impulsadas por antigeno (Ruckert et al, Eur J Immunol 33:3493-3503, 2003; Ruckert et al, J Immunol 174:5507-15, 20.05; Wei et al, J Immunol 167:577-82, 2001; Ruchatz et al, J Immunol 160:5654-5660, 1998). Esta discrepancia todavía tiene que ser resuelta, aunque es de interés que las respuestas proliferativas antígeno-específicas de células CD8+ transgénicas de TCR OT-1 a péptido específico in vivo no fueron bloqueadas por la co-inyección de sIL-15Ra-Fc y las respuestas fueron considerablemente mejoradas cuando se inyectó una mezcla de SIL-15R y IL- 15 (Fig. 28D) . Ya que todavía no se han usado las dosis muy grandes de sIL-15Ra requeridas para bloquear respuestas in vivo, por ejemplo, 400 g/inyección para proliferación de células NK (Nguyen et al, J Immunol 169:4279-87, 2002). También, es posiblemente relevante que los estudios que muestran inhibición mediante sIL-15Ra in vivo usaran constructos cultivados en bacterias, mientras que nuestros constructos fueron cultivados en células mamíferas. Las figuras 23A y 23B muestran que la proliferación a IL-15 inmobilizada por IL-15Ra no puede ser bloqueada por IL-15Ra-Fc soluble. (A) células T CFSE-marcadas fueron inyectadas iv a huéspedes B6 Thyl-congénicos o IL-15Ra" _. Un día más tarde, los ratones fueron inyectados ip con PBS o 500 ng de LPS. Como se indica, los ratones también fueron tratados con 10 µq de sIL-15R -Fc diariamente, comenzando el día de la inyección de LPS. Tres días después de la inyección de LPS, los ratones fueron sacrificados y se determinó la dilución de CFSE de células T de CD8+ de P. (B) Placas de 96 cavidades fueron pre-recubiertas durante toda la noche con 10 pg/ml de sIL-15Ra-Fc. Luego las placas fueron lavadas e incubadas con 1 pg/ml IL-15 por 1 hora a 37°. Después de esto, las placas fueron lavadas y se agregaron 5 x 104 células T de CD8+ de MP junto con 1) 10 g/ml sIL-15Ra-Fc, 2) 10 pg/ml de anticuerpo policlonal anti-IL-15 o 3) medio de control; como control adicional, se agregó IL-15 libre (32 ng/ml) a algunas cavidades. Los datos muestran los niveles promedio de incorporación de [H]-timidina (SD) para cultivos por triplicado en el día 3. Las figuras 28A, 28B y 28C muestran efectos de bloqueo de sIL-15Ra-Fc por respuestas a IL-15 de ratón vs humana. (A, B, C) Células CTLL-2 fueron cultivadas por 2 días, ya sea con (A) IL-15 murina, (B) IL-15 humana o (C) IL-2 murina. Como se indica, los cultivos fueron complementados con 1 µg ml sIL-15Ra-Fc murina. Se agrega [3H] -timidina durante las últimas 24 horas de cultivo. Los datos muestran los niveles promedio de incorporación de [3H] -timidina (± SD) para cultivos por triplicado. (D) Un millón de células (Thy 1.1 oncogénicas) fueron transferidas adoptadamente iv a ratones B6 receptores en el día - 1. En el día 0, los ratones fueron vacunados con un millón de células dendríticas SIINFEKL-pulsadas iv. En los días 1-7, se administró a los ratones receptores inyecciones ip diariamente de PBS, sIL-15R -Fc sola (5 ]iq) , IL-15 sola (1 µg) o sIL-15Ra-Fc más IL-15 (5 µg ay 1 g, respectivamente). En el día 8, los bazos fueron cosechados, contados y evaluados mediante análisis citométrico de flujo en cuanto células OT-I donadoras. Los datos muestran las veces de incremento de miembros absolutos de células OT-I en relación con la vacunación sin citoquina o tratamiento de receptor'.

Todos los datos son representativos de por lo menos 2 experimentos independientes .

EJEMPLO 12 Estimulación mediante IL-2 más IL-2R La observación de que la actividad biológica de IL- 15 fue mejorada mediante enlace a IL-15Ra soluble hizo surgir la cuestión de si hallazgos comparables se aplicarían a IL-2 e IL-2Ra (CD25) . Como se muestra en la Fig. 24, este claramente no fue el caso. Así, las respuestas proliferativas of células CD8+ de MP a IL-2 de ratón in vitro fueron marcadamente inhibidas mediante la adición de IL-2Ra de ratón soluble (Fig. 24A izquierda, 24B) . Similar inhibición se aplicó a células CD8+ de MP (ratón) que responden a IL-2 humana y IL-2Ra hyumana soluble (Fig. 24A derecha) . Así, mienstra que IL-15Ra soluble potenció la función de IL-15, IL-2Ra soluble bloqueó la función de IL-2. Las figuras 24A y 24B muestran que IL-2Ra soluble inhibe la proliferación moderada por IL-2. (A) Células T CD8+ de MP CFSE-marcadas purificadas fueron cultivadas ya sea con IL-2 murina o IL-2 humana a la concentración mostrada. Como se indica, 2.5 pg/ml ya sea de IL-2R murina soluble o IL-2Ra humana soluble fue agregada a los cultivos. La dilución de CFSE fue determinada en el día 3. Se muestran datos representativos. (B) células T de CD8+ de P purificadas fueron cultivadas con cantidades tituladas de IL-2 murina con o sin mIL-2Ra soluble (2.5 µ?/p??) . Los datos muestran niveles medios de incorporación de [3H] -timidina (+ SD) para cultivos por triplicado en el dia 3.

EJEMPLO 13 Complejos solubles de IL-15 y IL-15Ra son más estimuladores que IL-15 soluble sola La conclusión principal de los experimentos anteriores es que los complejos solubles de IL-15 e IL-15Ro¡ son mucho más estimuladores que IL-15 soluble sola, tanto in vivo como in vitro. Sin estudios estruct5urales en cuanto a la interacción de IL-15/IL-15Ra solamente se puede especular el por qué y cómo esta interacción potencia la función de IL-15. Hay varias posibilidades. En primer lugar, el enlace de IL-15Ra a IL-15 podría deteriorar la internalización de IL-15 por células T y mediante esto reforzar la señalización por medio del receptor ß?a receptor. Esta idea está en línea con reportes de que la internalización de ciertas citoquinas, por ejemplo, IL-2, sirve para atenuar la señalización del receptor (Chang et al., J Biol Chem 271:13349-55, 1996). Sin embargo, no se favorece esta posibilidad por dos razones. En primer lugar, si la fuerte estimulación por complejos de IL- 15/sIL-15Ra refleja la internalizacion de IL-15 reducida, se podría esperar ver una reducción paralela en la internalizacion de CD122, el receptor para IL-15. Tal como se mide por regulación descendente de la superficie celular, sin embargo, se aplica lo opuesto, esto es, mayor regulación descendente de CD122 con los complejos de IL-15/sIL-15Ra que con IL-15 sola (datos no mostrados) . El segundo argumento contra los complejos de IL-15/sIL-15R que impiden la internalizacion de IL-15 es que, si este fuera el caso, se deberían haber visto hallazgos similares con IL-2/sIL-2R , que no fue así. Así, los complejos de IL-2 /sIL-2Ra fueron mucho menos estimuladores que IL-2 soluble sola, que contrastó claramente con los complejos de · IL-15Ra/IL-15 que son más estimuladores que IL-15 sola. Una segunda posibilidad en cuanto a cómo sIL-15Ra potencia la actividad de IL-15 es que SIL-15ROÍ podría impedir la degradación de IL-15. Esta idea merece consideración debido a que el efecto de mejora de sIL-15Ra-Fc sobre la función de IL-15 fue más pronunciada in vivo que in Vitro. Aquí, es notable que el enlace de ciertas citoquinas a anticuerpos o receptores solubles pueda extender la supervivencia de citoquina in vivo (Finkelman et al, J Immunol 151:1235-44, 1993; Ma et al, J Pharmacol Exp Ther 279:340-50, 1996; Peters et al., J Exp Med 183:1399-1406, 1996; Rosenblum et al, Cáncer Res 45:2421-24, 1985; Peleg-Shulman et al, J Biol Chem 279:18046- 18053, 2004; Kobayashi et al, Cytokine 11:1065-75, 1999). De aquí, en enlace de sIL-15Ra-Fc a IL- 15 puede incrementar la vida media de IL-15 in vivo. Notablemente, sin embargo, no se observó incremento en la vida media de IL-15 in vitro A la luz de lo anterior, se favorece una tercera posibilidad, es decir que IL-15Ra mejora la función de IL-15 al inducir un cambio conformacional en IL-15, que aumenta la interacción con el receptor de ß?a, cambiando asi IL-15 de agonista a super-antagonista . Este modelo está en linea con la afinidad interacción de IL-15/IL-15Ra que es bastante más alta que para la interacción de IL-2/IL- 2R interaction (Fehniger and Caligiuri, Blood 97: 14-32, 2001; Van Belle and Grooten, Arch Immunol Ther Exp ( arz) 53:115-26, 2005) y explica por qué, a diferencia de IL-2, IL-15 funciona tan bién como una citoquina célula-asociada. Probar esta idea requerirá obviamente estudios estructurales. A este respecto, es notable que la interacción entre IL-15 IL-15Ra involucra una red única de interacciones iónicas no encontradas en otros complejos de citoquina/receptor de citoquina (Lorenzen et al, J Biol Chem, 2005, E-pub ahead of print) . Todavía está por determinarse si esta interacción única da como resultado un cambio conformacional en IL-15. Hay evidencia acumulativa que IL-15 tiene efectos benéficos sobre la supervivencia de células T y generación de memoria y también tiene potencial para restaurar la acumulaciónde células T después de irradiación y otras formas de citoreducción (Becker et al, J Exp Med 195: 1541-48, 2002; Zhang et al, Immunity 8:591-99, 1998; Waldmann, T.A., J Clin Immunol 22:51-56, 2002; Zeng et al, J Exp Med 201:139-48, 2005; Van Belle and Grooten, Arch Immunol Ther Exp (Warz) 53: 115-26, 2005; Schluns et al.JntJ Biochem Cell Biol 37: 1567-71, 2005; Lodolce et al., J Exp Med 194:1187-94, 2001; Rubinstein et al, J Immunol 169:4928-35, 2002; Diab et al, Cytotherapy 7:23-35, 2005). Como se muestra en la presente, la actividad biológica de IL-15 como reactivo terapéutico podría ser considerablemente mejorada al administrar complejos de IL-15/IL-15R solubles preformados.

EJEMPLO 14 Materiales y métodos Ratones. Ratones C57BL/6 (B6) , B6.Ly5.1 , B6.Thy 1.1 y ratones OT-1 fueron comprados de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Los ratones IL-15Ra_ " (Lodolce et al., Immunity 9:669- 76, 1998) fueron una donación generosa de Averil Ma (University of California, San Francisco) y los ratones transgénicos (tg) IL-7 mice (Mertshing et al., Int Immunol 7:401-14, 1995) fueron una donación generosa del J. Andersson (Instituto Basilea, Suiza) . Ratones tg TCR P14 fueron proporcionados amablemente por J. Lindsay Whitton (Scripps Research Institute) . Los ratones tg IL-15R "/_, tg IL-7, P14 y tg OT-I TCR fueron todos mantenidos en un fondo de B6 y para algunos experimentos cruzados ya sea con ratones B6.Ly5.1 o B6.Thyl.l. Los ratones IL-15RoT " fueron cruzados con ratones tg IL-7 para generar ratones IL-7 tg/IL-15Ra"/_ . Como se ha descrito previamente con ratones IL-7 tg/IL-15_ " (Kieper et al., J Exp Med 195:1533-39, 2002), los ratones IL-7 tg/IL-15Rof _ tienen números grandes similares de células T de CD8+ de P CDl22hl como los ratones tg IL-7. Proteínas recombinantes .

[0269] Recombinant Proteins. sIL-15Ra-Fc murina, sIL-15Ra-Fc humana y IL-2Ra humana fueron compradas de R&D systems (Minneapolis , MN) . sIL-15Ra monomérica y IL-2Ra de ratón fueron compradas de R&D systems como reactivos de pre-liberación. sIL- 15R monomérico fue generado por digestión enzimática de la sIL-15Ra dimérica. Se verificó la digestión completa mediante Western blot usando anticuerpos policlonales anti-IL-15R (AF551 y BAF551, R&D systems) (datos no mostrados) . Las citoquinas recombinantes (en las que se incluyen IL-15 de ratón, IL-15 humana, IL-2 de ratón, IL-2 humana, IL-4 de ratón y GM-CSF de ratón) fueron comprados de Ebioscience y/o R&D systems. Aislamiento de células T y marcación de CFSE. Para obtener números apropiados de células, en la mayoría de los experimentos, células CD8+ de MP fueron preparadas a partir de ratones transgénicos IL-7. Por todos los parámetros probados, las células CD8+ de MP de ratones tg IL-7 son idénticas a las células de ratones normales. Sin embargo, los hallazgos principales reportados en la presente para complejos de IL-15/sIL-15R -Fc fueron también observados con células preparadas a partir de ratones normales, tanto in vivo como in vitro. Las células T de CD8+ de MP usadas ya sea para experimentos de transferencia in vivo o adoptables fueron aisladas de NL y bazo y purificadas mediante clasificación celular. En breve, suspensiones unicelulares fueron primero enriquecidas por células T de CD3+ usando columnas de enriquecimiento de célula T de ratón (MTCC-25, R&D systems, Minneapolis, MN) . Células T enriquecidas fueron marcadas con anticuerpos y purificadas mediante clasificación celular en cuanto a células T de CD8+CD44hl. En algunos experimentos, se usó un protocolo similar y se aislaron células CD8+CD4410, CD4+CD44hl, NK1.1+/DX5+. La clasificación celular se llevó a cabo usando un dispositivo BD FACSAria. La pureza de las células clasificadas fue probada sistemáticamente y fue de más del 98%. En algunos experimentos, las células T totales o células OT-1 fueron usadas como linfocitos donadores. Para estos experimentos, las células del bazo y NL fueron purificadas usando una columna de enriquecimiento de célula T de ratón (MTCC-25) . Para experimentos que usan células CFSE-marcadas , las células T fueron marcadas con CFSE 1.5µp? CFSE (Molecular Probes, Eugene, OR) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Generación de células T de CD8+ antigeno-especificas. Se generaron células T de memoria antigeno-especificas enseguida de la transferencia adoptiva de células T de CD8+ de tg TCR P14 (que reconoce el péptido LCMV gp33) e infección de LCMV. Brevemente, 5 x 104 P 14 células T de CD8+ transgénicas fueron transferidas adoptadamente a ratones receptores tg IL-7 congénicos de Thyl . Veinticuatro horas más tarde, los ratones recibieron 2 x 105 unidades formadoras de placa de la cepa de LCMV Armstrong. Dos meses después de infección viral, las células T fueron aisladas uando una columna de enriquecimiento de célula T de ratón (MTCC-25) , marcadas con with CFSE y transferidas adoptadamente a ratones receptores congénicos Ly5. Las células T de CD8+ P14 donadoras (Thyl .1) representaron el 15-20% de la población de células T de CD8+ donadoras (Ly5.2). Análisis in Vitro. Todos los cultivos fueron efectuados en RPMI 1640 complementado con FCS al 10%, glutamina, 2-ME, aminoácidos no esenciales y antibióticos. Células T y células NK purificadas por FACS fueron aisladas como se describe anteriormente. Las células CTLL (CTLL-2) fueron obtenidas de ATCC (Manassas, VA) y cultivadas en un medio RPMI complementado con IL-2 murina. Para experimentos con linfocitos FACS-purificados, 5 x 104 células en 200 ul fueron depositados por cavidad en placas de 96 cavidades. Se agregaron citoquina y/o receptor soluble a concentraciones descritas en la figura o leyenda de la figura. Para experimentos de bloqueo de CD122, se usó anticuerpo anti-CD122 purificado (? -ß? (NA/LE) , BD Pharmingen) . Para experimentos para bloquear IL-15 enlazado a la placa, se usó el anticuerpo policlonal anti-IL-15 (AF447, R&D systems) . Los experimentos con células CTLL fueron depositadas como linfocitos FACS-purificados , excepto usando 2 x 104 células por cavidad. Para experimentos de proliferación con [3H] -timidina, se agregó l Ci/ml como se indica en las leyendas de las figuras. Las células fueron cultivadas en cavidades por triplicado. Análisis in vivo. Para experimentos que determinan la proliferación de células transferidas adoptadadamente, las células T fueron aisladas y marcadas con CFSE (como se describe anteriormente) e inyectadas iv a ratones receptores congénicos Ly5 o Thyl . En experimentos para medir la proliferación de células huésped, los ratones fueron inyectados ip con BrdU (2mg) y luego mantenidos con agua para beber de BrdU (0.8mg/ml) usando metodología descrita previamente (Judge et al., J Exp. ed 196:935-46, 2002).

Para inyecciones de citoquina y receptor soluble, se incubaron IL-15 e sIL-15R -FC conjuntamente por 20 minutos a 37 °C. Luego las muestras fueron tituladas por lo menos 10 veces en PBS a un volumen de 500 ul antes de la inyección a ratones. En condiciones de control, citoquina o receptor solo fue también incubado por 20 minutos a 37 °C. LPS (ALX-581-008, Alexis Biochemicals , San Diego, CA) fueron inyectados ip en PBS. Para experimentos de vacunación, se prepararon células dendriticas como se describe previamente mediante cultivo de células de médula ósea con GM-CSF e IL-14 (Rubinstein et al., J Immunol 169:4928-35, 2002). Las células dendriticas fueron pulsadas por 2 horas con péptido de SI INFEKL a 37°C, lavadas e inyectadas iv. Análisis citométrico de flujo. Las células fueron analizadas mediante análisis citométrico de flujo usando protocolos estándar. Brevemente, las células fueron lavadas en solución reguladora del pH FACS que contiene FCS al 1% y EDTA 3 mM y teñidas con combinaciones de los anticuerpos: CD8-PerCP-Cy5.5, -APC o - APC-Cy7 (53-6.7, eBioscience y BD Pharmingen) , CD49b-PE and -APC (DX5, eBioscience) , NK1 . 1-FITC y -PE (PK136, BD Pharmingen), CD3-PE, -PerCP-Cy5.5 , -PE-Cy7 o -APC (145-2C11, eBioscience y BD Pharmingen), CD3-Pacifl'c Blue (500A2, BD Pharmingen), CD4-PE, PE-Cy7 o -APC (R 4-5, eBioscience y BD Pharmingen), Ly5.1-FITC, -PE, -PE- Cy7, y -APC (A20, eBioscience y BD Pharmingen), Ly5.2-FITC, -PE, -PerCP-Cy5.5 y - APC (104, eBioscience y BD Pharmingen), Thy 1.1 -F1TC, PE, -PE-Cy7 y -APC (HIS51, eBioscience), Thy 1.2-FITC, PE y -APC (53-2.1, eBioscience), CD44-FITC -APC y - Alexa Fluor 405 (IM7, eBioscience y Caltag Laboratories (Burlingame, CA) ) , CD1 22-PE (? -ß?, BD Pharmingen), B220-PerCP-Cy5.5 (RA3-6B2, BD Pharmingen) y TCR Va2-PE (B20.1 , BD Pharmingen). El teñido intracelular de BrdU fue efectuado con reactivos de FITC o equipos de flujo APC BrdU (559619 y 552598, BD Pharmingen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras citométricas de flujo fueron analizadas usando un citómetro de flujo digital BD LSR II (BD Biosciences, San José, CA) . Los datos fueron analizados usando elementos de programación Flow Jo (Tree Star, San Carlos, CA) .

EJEMPLO 15 Materiales y métodos Ratones. Ratones C57BL/6 (B6) , B6.PL (Thyl.l-congénicos), IL-2+/ y CD25+ , todos en un fondo B6, fueron comprados de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) . Ratones transgénicos (tg) IL-7 transgenic y ratones tg P14, ambos en un fondo de B6, fueron criados a un fondo B, fueron criados a un fondo Thyl.l- congénico. Kieper et al., J Exp Med 195: 1533, 2002; Pircher et al., Nature 351: 482, 1991.

Todos estos ratones, incluendo ratones IL- 15 en un fondo de B6, fueron mantenidos en la instalación de animales y usados a 3-6 meses de edad. Los ratones IL-2_ " y CD25_ ~ fueron criados de criadores de heterocigoto y seleccionados mediante protocolos de PCR estándar proporcionados en el sitio web de The Jackson Laboratory. Judge et ah, J Exp Med 196: 935, 200. Los experimentos que involucran el uso de animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional en TSRI. Citometria de flujo y clasificación celular. Se prepararon suspensiones de bazo o células de NL acumuladas (inguinal, axilar, cervical y mesentérica) de acuerdo con protocolos estándar y teñidos para análisis de FACS® o clasificación usando PBS que contiene FCS al 1% y EDTA 2 mM con los siguientes mAb (de BD Biosciences a no ser que se afirme de otra manera) : B220 Alexa Fluor 405-conjugado (RA3-6B2, Caltag Laboratories); CD3 PerCP-Cy5.5-conj ugado (145-2C11); CD4 Alexa Fluor 405-conjugado (RM4-5, Caltag Laboratories); CD8a PerCP-Cy5.5- o ACD8a PC-Cy7-conjugado (53-6.7); CD8 PE-conjugado (H35-17.2); CD25 FITC- o PE-conjugado (PC61.5); CD44 APC-conj ugado (IM7, eBioscience); CD90.1 APC-conjugadp.1 (HIS51, eBioscience); CD 122 FITC- or PE-conjugado (??-ß? o alternativamente 5H4) y Foxp3 PE-conjugado (FJK- 16s, eBioscience) . El teñido de Foxp3 intracelular se llevó a cabo siguiendo las recomendaciones del fabricante. En breve, las células fueron teñidas en cuanto a marcadores de superficie celular primero, luefo fijadas usando paraformaldehido al 2% y permeabilizadas usando saponina antes del teñido intracelular . Muestras de citometria de flujo fueron analizadas usando un citómetro de flujo digital BD LSR II. La clasificación celular se llevó a cabo usando un dispositivo BD FACS Aria. La pureza de las muestras fue probada sistemáticamente después de la clasificación y fue de más del 98%. Transferencia de célula T y administración de citoquinas y anticuerpos in vivo. Células T de CD8+ CD44hl CDl22hl (MP) de fenotipo de memoria FACS®-clasificadas (>98% puras) fueron obtenidas del bazo o NL acumulado de ratones tag IL-7, B6.PL tipo silvestre (WT) en un fondo congénito de Thyl .1 o ratones CD25_ " en donde se indica; por todos los parámetros probados, las células de CD8+ de MP de ratones tg IL-7 fueron indistinguibles de la población (mucho más pequeña) de estas células preparadas a partir de ratones B6 (o B6.PL) normales. Las células de CD8+ de MP clasificadas fueron inyectadas intravenosamente (iv) a 1-2 x 106 células/ratón. mIL-2 fue comprado de eBioscience y almacenado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El hibridoma S4B6.1 (IgG2a de rata) fue obtenido de la American Type Culture Collection (ATCC) y cultivado in vitro bajo condiciones estándar (véase posteriormente en la presente) y el mAb secretado fue obtenido del sobrenadante de cultivo. Por comparación, el mAb de S4B6 de IL-2 fue también comprado de BD Biosciences. El mAb de IL-2s JES6-1A12 (IgG2a de rata) y JES6-5H4 (IgG2b de rata) fueron comprados de eBioscience. Las preparaciones de F(ab')2 de mAb S4B6 de IL-2 fueron ordenadas sobre pedido de BD Biosciences, se hicieron correr sobre un gel de SDS-poliacrilamida al 10% bajo condiciones no reductoras para verificar la digestión y probadas in Vitro en cuanto a su habilidad para neutralizar rmIL-2 (Fig. 12B) . Iniciando el día de transferencia celular adoptiva, los ratones de edad y género semejante recibieron inyecciones intraperitoneales (ip) diarias de PBS, anticuerpo de isotipo coincidente (IgG2a de rata o IgG2b de rata, respectivamente), 1.5 µg rmIL-2, S4B6 (50 iq , excepto para Fig. 2), 50 \iq S4B6 más 10 g de mAb CD 122 (??-ß?) , 50 yg JES6-1A12, 50 \xq JES6-5H4, 1.5 xq rmIL-2 más S4B6 (50 yg, excepto para Fig. 8D) , 1.5 iq rmIL-2 más 50 µq JES6-1A12 o 1.5 µ? rmIL-2 más 50 µq JES6- 5H4. Para los experimentos que usan IL-2 humana recombinante (rhIL-2), rhIL-2 y mAb humano de IL-2 (MAB602, clon 5355) fueron comprados de R&D Systems. Como se describe anteriormente para rmIL-2, los ratones fueron inyectados ip diariamente con anticuerpo de control de isotipo coincidente (IgG2a de ratón), 1.5 g rhlL- 2, 50 yg de hmAb de MAB602 de IL-2 o una mezcla de de 1.5 g rhlL-2 más 50 yg de hmAb de MAB602 de IL-2. Para los experimentos que usan rmIL-4, rmIL-4 fue comprado de eBioscience y almacenado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El mAb anti-ratón de IL-4 MAB404 (clon 30340, IgGl de rata) fue obtenido de R&D Systems, el segundo mAb anti-ratón de IL-4 1 IB.11 (IgGl de rata) fue proporcionado por el NCI BRB Preclinical Repository (Rockville, MD) . Como se describe anteriormente, para ratones IL-2, los ratones fueron inyectados ip un día si y un dia no con anticuerpo de control de isotipo coincidente (rat IgGl de rata), 1.5 µg rmIL-4, 50 yg de mAb de IL-4 o una mezcla de 1.5 yg rmIL-4 más 50 g mAb de IL-4. 7 días después de la transferencia de célula adoptiva, las células del bazo y NL fueron analizadas mediante citometria de flujo como se describe anteriormente. Generación de células CD8+ de memoria antigeno-especificas. Ratones P14 Thyl .1-marcados, portadores de células CD8+ de tg TCR, que reconocen el epitop gp33-41 del virus de coriomeningitis linfocitica (LCMV) , fueron usados como donadores. Las células del bazo de estos ratones fueron tratados con complemento más mAb contra antigeno estable térmicamente (Jl Id), CD4 (RL 172) y mAb MHC-II (28- 16-8s), como se describe previamente, con el fin de obtener células Thyl.l+ CD8+ -95 puras, que fueron -90% de Va2+ y asi tg TCR. Kosaka et al., J Exp Med 176: 1291, 1992. Luego, estas células purificadas fueron transferidas adoptivamente iv a ratones B6 (Thyl.2) a 5 x 104 células/ratón, que recibieron 1 día después de transferencia de las células 2 x 105 unidades formadorasa de placa de cepa LCMV de Armstrong ip. Los ratones fueron dejados por > 2 meses para permitir la generación de células CD8+ de memoria. En aquel tiempo, las células de CD8+ fueron purificadas de los bazos mediante complemento más mAB como se describe anteriormente o alternativamente, mediante clasificación de FACS® en cuanto a células CD8+ de CD122hl CD44hl. Las células de CD8+ purificadas, que contienen ~ 16-20% de células T de memoria LCMV-especificas Thyl .1+ Va2+, fueron luego marcadas con CFSE y transferidas adoptivamente a 10-15 x 106 células/ratón a ratones B6 (Thyl.2), que recibieron subsecuentemente inyecciones ip diarias de PBS, 1.5 g de rmIL-2, 50 µg de mAb S4B6 de IL-2 o 1.5 g de rmIL-2 más 50 µg de mAb-de IL-2. 7 dias después de la transferencia de células adoptiva, las células de bazo y NL fueron analizadas mediante citometria de flujo como se describe anteriormente. Medición de potencia celular in vivo. La proliferación de células in vivo fue medida usando dilución del tinte CFSE o incorporación de bromodesoxiuridina (BrdU) (0.8 mg/ml) dado en el agua para beber. Kieper et ah, J Exp Med 195: 1533, 2002; Tough et al. , J Exp Med 179: 1127, 1994. El teñido de CFSE se llevó a cabo como sigue: las células fueron resuspendidas en PBS que contiene FCS al 1% a 10-20 x 106 células/ml y teñidas con 1 µ? de equipo rastrador celular Vybrant CFDA SE 5 m (Molecular Probes) por mililitro de suspensión celular durante 10 minutos a 37 °C y luego lavadas dos veces con PBS helado que contiene FCS al 1%. El teñido intracelular para BrdU se llevó a cao usando el equipo de BrdU de FITC de BD Biosciences siguiendo las recomendaciones del fabricante. Proliferación in Vitro. Células CD8+ de MP fueron clasificadas mediante citometria de flujo de ratones B6 o CD25_ ~. Para células CD3-activadas , las células CD8+ fueron purificadas de NL acumulado de ratones B6 jóvenes usando el equipo de asilamiento de células T de CD8+ MACS® (Miltenyi Biotec) ; estas células fueron >95% CD8+ y consistían de ~ 90% de células CD4410 naturales. Alternativamente, las células fueron purificadas usando FACS® para obtener células CD8+ CD4410 >99% puras. Luego, estas células de CD8+ purificadas fueron activadas usando mAb CD3 enlazado a la placa (145 -2C11, eBioscience) . En donde se indica una concentración fija (10 yg/ml) de mAb de control de isotipo coincidente, mAb CD25 (PC61.5, eBioscience) o mAb de CD 122 (??-ß?, BD Biosciences) fue agregado a las células antes de mezclarlas con complejos de IL-2/mAb IL-2. Las células fueron sembradas a 5 x 104 células por cavidad en placas de 96 cavidades y concentraciones tituladas de complejos de rmIL-2 más mAb de control de isotipo coincidente, rmIL-2 más S4B6 mAb de IL-2 o rmIL-2 más mAb de JES6-1A12 de IL-2 fueron agregados a las cavidades. Los complejos de rmlL-2/mAb IL-2 estuvieron a una proporción molar exacta de 2:1 para evitar el exceso ya sea de uno u otro de los dos componentes. Las células fueron cultivadas bajo condiciones estándar (37°C, 7% C02, atmósfera humidificada) por 3 días. Se agregó [3H] -timidina (1 pCi/ml) por las últimas 16 horas y la proliferación celular fue determinada al medir la incorporación de [3H] -timidina en un contador de centelleo de liquido (Harvester 96, Tomtec) . Reconstitución de médula ósea. Células de médula ósea (BM) fueron obtenidas de ratones B6 normales y dejadas sin tratar o fueron agotadas de células T usando complemento más mAb contra CD4 (RL 172) y CD8 (3.168), que eliminaron más del 95% de las células T maduras en BM. Ratones B6 receptores fueron irradiados a 1000 cGy antes de la inyección iv de 5-10 x 106 células de BM sin separar o células de BM agotadas de células T, respectivamente. Subsecuentemente, se administraron inyecciones diarias de PBS, 1.5 pg rmIL-2, 8 pg de mAb de IL-2 S4B6 o 1.5 g rmIL-2 más 8 g mAb de IL-2 S4B6 fueron dadas ip. 8 días después de la transferencia adoptiva, las células del bazo fueron teñidas y analizadas mediante citometria de flujo. Análisis inmunosorbente enzima-enlazado (ELISA) .

Se llevó a cabo un ELISA de emparedado de IL-2 estándar de acuerdo con las recomendaciones del fabricante usndo el equipo de ELISA de IL-2 murina de eBioscience. En breve, placas de 96 cavidades de fondo plano fueron recubiertas durante toda la noche a 4°C con mAb de "captura" JES6-1 purificado. Luego las placas fueron lavadas vigorosamente, después de lo cual se agregó mIL-2 a las cavidades e incubadas por 2 horas a temperatura ambiente. Subsecuentemente, las placas fueron lavadas vigorosamente, seguido por la adición de mAb de "detección" JES6-5 biotinilado por 1 hora a temperatura ambiente. En donde se indica, concentraciones tituladas (diluciones 5 veces, iniciando a 100 µg/ml) de mAb de control purificado, mAb JES6-1 purificado, JES6-5 purificado o S4B6 IL-2 fueron agregados junto con el mAb de detección. Subsecuentemente, las placas fueron lavadas vigorosamente antes de agregar peroxidasa de rábano estreptavidina-conjugada por 30 minutos a temperatura ambiente. Luego las muestras fueron reveladas usando el sustrato de o-fenilendiamina y después de detener la reacción con H2SO4 2 N, analizadas a 450 nm con un lector de ELISA ((Spectramax Plus 384, Molecular Devices). Cuando se usan intervalos en la presente para propiedades físicas, tal como peso molecular o propiedades químicas, tales como fórmulas químicas, se pretende que se incluyan todas de tales combinaciones y sub-combinaciones de intervalos y modalidades especificas. La revelación de cada patente, solicitud de patente y publicación citada o descrita en este documento es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Aquellos experimentados en el arte apreciarán que numerosos cambios y modificaciones se pueden efectuar a lasa modalidades de la invención y que tales cambios y modificaciones se pueden realizar sin desviarse del espíritu de la invención. Por consiguiente, se pretende que las reivindicaciones adjuntas cubran todas de tales equivalentes a medida que caigan en el verdadero espíritu y alcance de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para mejorar la función inmune en un sujeto mamífero, caracterizado porque comprende administrar al sujeto mamífero un anticuerpo capaz de enlazarse a una citoquina, incrementando mediante esto la actividad biológica en el sujeto mamífero. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además incrementar la presentación de la citoquina a una célula objetivo en el sujeto mamífero. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además acomplejar el anticuerpo con la citoquina antes de la administración y administrar el complejo de anticuerpo de citoquina al sujeto mamífero . 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque un anticuerpo monoclonal que comprende una porción de Fe se enlaza a la citoquina. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la citoquina es IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-IO, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, interferones tipo I, interferones tipo II, IFN-a, IFN-ß o IFN-?. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la citoquina es interleucina-2. 7. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la citoquina es interleucina-7. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el incremento de la actividad biológica de la citoquina expande la población de células hematopoyéticas . · 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el incremento de la actividad biológica de la citoquina expande la pblación de células T cells, células B o células NK o una combinación de las mismas. 10 El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el incremento de la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD8+ T y células T de CD4+ reguladoras. 11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T CD8+. 12. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T CD4+ T reguladoras y bloquea la expansión de células T CD8+. 13. El1 método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T naturales o células T de memoria o una combinación de las mismas. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de interferones tipo I o interferones tipo II en una célula no hematopoyética mejora la función inmune en el sujeto mamífero. 15. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células ex vivo . 16. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células in vivo . 17. Un método para mejorar la función inmune en un sujeto mamífero, caracterizado porque comprende administrar al sujeto mamífero una citoquina y su receptor natural e incrementar mediante esto la actividad biológica de la citoquina en el sujeto mamífero. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende además incrementar la presentación de la citoquina a una célula objetivo para mejorar la función inmune en el sujeto mamífero. 19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el receptor comprende además una porción de Fe que se enlaza a la citoquina. 20. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende además acomplejar la citoquina con el receptor natural antes de la admbinistración y administrar el complejjo de citoquina/receptor de citoquina al sujeto mamífero. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la citoquina es interleucina- 15 y el receptor es receptor a de interleucina-15. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células hematopoyéticas . 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células T, células B o células NK o una combinación de las mismas. 24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD8+. 25. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T naturales o células T de memoria o una combinación de las mismas. 26. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células ex vivo . 27. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células in vivo . 28. El método de conformidad con la reivindicación 21 caracterizado porque el sujeto mamífero tiene un sistema inmune debilitado debido a la edad avanzada del sujeto mamífero. 29. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la actividad biológica incrementada tiene un efecto terapéutico para reducir o eliminar enfermedad neoplásica o enfermedad infecciona en el sujeto mamífero o impide su presencia o recurrencia. 30. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la actividad biológica incrementada tiene un efecto terapéutico para expandir una población de células hematopoyéticas o mejorar la recuperación de células hematopoyéticas del agotamiento celular resultante de irradiación o tratamiento con fármaco citotóxico o de inmunodeficiencia primaria o secundaria en el sujeto mamífero o del envejecimiento en el sujeto mamífero. 31. Un método para prevenir o tratar enfermedad autoinmune en un sujeto mamífero, caracterizado porque comprende : administrar un anticuerpo apto de enlazar una citoquina al sujeto mamífero en una cantidad efectiva para reducir o eliminar la enfermedad autoinmune o impedir su presencia o recurrencia. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque comprende además administrar una citoquina acomplejada con un anticuerpo al sujeto mamífero. 33. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque comprende además incrementar la actividad biológica de la citoquina. 34. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque un anticuerpo monoclonal que comprende una porción de Fe se enlaza a la citoquina. 35. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la citoquina es IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-IO, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, interferones tipo I, interferones tipo II, IFN-a, IFN-ß, o IFN-?. 36. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes, enfermedad de intestino inflamatorio, psoriasis, lupus eritematoso sistémico, enfermedad alérgica o asma. 37. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células hematopoyéticas . 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células T, células B o células NK o una combinación de las mismas. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande células T de CD8+ y células reguladoras T de CD4+. 40. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD8+. 41. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD4+ reguladoras y bloquea la expansión de células T de CD8+. 42. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T naturales o células T de memoria o una combinación de las mismas. 43. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de interferones tipo I o interferones tipo II en una célula no hematopoyética mejora la función inmune en el sujeto mamífero. 44. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células ex vivo . 45. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células in vivo. 46. Un método para prevenir o tratar enfermedad neoplásica en un sujeto mamífero, caracterizado porque comprende: administrar un anticuerpo apto de enlazar una citoquina al sujeto mamífero en una cantidad efectiva para reducir o eliminar la enfermedad neoplásica o impedir su presencia o recurrencia. 47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porquela enfermedad neoplásica es cáncer, tumor sólido, sarcoma, melanoma, carcinoma, leucemia o linfoma. 48. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque comprende además administrar una citoquina acomplejada con un anticuerpo al sujeto mamífero. 49. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque comprende además incrementar la actividad biológica de la citoquina. 50. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque un anticuerpo monoclonal que comprende una porción de Fe se enlaza a la citoquina. 51. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la citoquina es IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-IO, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, interferones tipo I, interferones tipo II, IFN-a, IFN-ß, o IFN-?. 52. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células hematopoyéticas . 53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células T, células B o células NK o una combinación de las mismas. 54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina células T de CD8+ y células reguladoras T de CD4+. 55. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T de CD8+. 56. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células reguladoras T de CD4+ y bloquea la expansión de células T de CD8+. 57. El método de conformidad con la reivindicación 53 caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T naturales o células T de memoria o una combinación de las mismas. 58. El método de conformidad con la reivindicación 46 caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de interferones tipo I o interferones tipo II en una célula no hematopoyética mejora la función inmune en el sujeto mamífero. 59. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células ex vivo . 60. El método de conformidad con la reivindicación 53 caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande la población de células in vivo. 61. Un método para expandir una población de células hematopoyéticas en un sujeto mamífero, caracterizado porque comprende administrar un anticuerpo apto de enlazar una citoquina al sujeto mamífero, proporcionando mediante esto un efecto terapéutico a la población de células expandidas en el sujeto mamífero. 62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque comprende además administrar una citoquina acomplejada con un anticuerpo al sujeto mamífero. 63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque un anticuerpo monoclonal que comprende una porción de Fe se enlaza a la citoquina. 64. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la citoquina es IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-IO, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, interferones tipo I, interferones tipo II, IFN-a, IFN-ß, or IFN-?. 65. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque comprende además incrementar la actividad biológica de la citoquina para proporcionar el efecto terapéutico. 66. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la población de células hematopoyéticas comprende células T, células B o células NK o una combinación de las mismas . 67. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la población de células T es una población de células T de CD8+ o una población de células reguladoras T de CD4+ o una combinación de las mismas. 68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque comprende además expandir células T de CD8+ y células reguladoras T de CD4+. 69. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque comprende además expandir células T de CD8+. 70. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque comprende además expandir células reguladoras T de CD4+ y bloquear la expresión de células T de CD8+. 71. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande células T naturales o células T de memoria o una combinación de las mismas. 72. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque comprende además expandir la población de células NK. 73. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque comprende además expandir la población de células B. 74. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque comprende además proporcionar un efecto terapéutico de un complejo de anticuerpo de citoquina para mejorar la recuperación de células hematopoyéticas a partir del agotamiento de células hematopoyéticas resultante de irradiación o tratamiento con fármaco citotóxico o inmunodeficiencia primaria o secundaia en el sujeto mamífero . 75. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque comprende además expandir la población de células hematopoyéticas ex vivo. 76. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque comprende además expandir la población de células hematopoyéticas in vivo. 77. Un método para prevenif o tratar enfermedades infecciosas en un sujeto mamífero, caracterizado porque comprende administrar un anticuerpo apto de enlazar una citoquina al sujeto mamífero en una cantidad efectiva para reducir o eliminar la enfermedad infecciona o impedir su presencia o recurrencia. 78. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque comprende además administrar una vacuna para incrementar la respuesta inmune y para mejorar la eficacia de vacuna. 79. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque comprende además administrar una citoquina acomplejada con un anticuerpo al sujeto mamífero. 80. El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque un anticuerpo monoclonal que comprende una porción de Fe se enlaza a la citoquina. 81. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque la citoquina es IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-IO, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, interferones tipo I, interferones tipo II, IFN-a, IFN-ß, or IFN-?. 82. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque comprende además incrementar la actividad biológica de la citoquina. 83. El método de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque la actividad biológica incrementa la población de células hematopoyéticas que comprende células T, células B o células NK o una combinación de las mismas . 84. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque la población de células T es una población de células T de CD8+ o una población de células reguladoras T de CD4+ o una combinación de las mismas. 85. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque comprende además expandir las células T de CD8+ y células reguladoras T de CD4+. 86. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque comprende además expandir células T de CD8+. 87. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque comprende además expandir las células reguladoras T de CD4+ y bloquear la expansión de células T de CD8+. 88. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de la citoquina expande las células T naturales o células T de memoria o una combinación de las mismas. 89. El método de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque el incrementar la actividad biológica de interferones tipo I o interferones tipo II en una célula no hematopoyética mejora la función inmune en el sujeto mamífero. 90. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque comprende además expandir la población de células exterminadoras naturales. 91. El método de conformidad con la reivindicación 83 caracterizado porque comprende además expandir la población de células B.