UA127965C2 - Спосіб лікування запальних станів - Google Patents

Abstract

Винахід стосується способу лікування запального захворювання або розладу дихальних шляхів або легень суб'єкта, лікування легеневого фіброзного захворювання або розладу у суб'єкта, або запобігання або зниження тяжкості алергічної реакції в дихальних шляхах або легенях суб'єкта, де спосіб включає введення суб'єкту, який потребує цього, однієї або більше доз терапевтично ефективної кількості антагоніста IL-33 в комбінації з однією або більше дозами терапевтично ефективної кількості антагоніста рецептора інтерлейкіну-4 (IL-4R).

Description

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ

Цей винахід відноситься до способів лікування запального стану, що включають введення суб'єкту, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості антагоніста інтерлейкіну-33 (ІЛ- 33) окремо або в комбінації з антагоністом інтерлейкіну-4 (ІЛ-4). Більш конкретно, цей винахід стосується лікування запальних або обструктивних захворювань легень або розладів шляхом введення терапевтично ефективної кількості антитіла проти інтерлейкіну-33 (ІЛ-33) окремо або в комбінації з антитілом проти інтерлейкіну-4Е (ІЛ-АР).

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Запалення ініціюється хазяїном як захисна реакція, але часто може призводити до системних патологій. Кількість запальних захворювань легень, таких як астма, алергія та хронічне обструктивне захворювпання легень (ХОЗЛ) зростає у розвинених країнах, що призводить до серйозних наслідків для витрат на охорону здоров'я. Деякі запальні клітини та їхні медіатори беруть участь у розвитку і прогресуванні цих захворювань. У деяких випадках ці захворювання відображають імунну відповідь 2 типу, яка характеризується інфільтрацією в тканини еозинофілів, базофілів, тучних клітин, СО4-Т хелперних клітин 2 типу (Т2), вродженх лімфоїдних клітин групи 2 (І.С2), макрофагів, індукованих інтерлейкіном 4 (ІЛ-4) та/або ІЛ-13, а також підвищенням сироваткового ІДЕ і збільшенням цитокінів ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-9 та ІЛ-13.

Один цитокін, який, як вважають, грає роль у запальних захворюваннях легень, є інтерлейкіном-33 (ІЛ -33), прозапальний цитокін, що вивільняється з пошкодженої епітеліальної тканини у відповідь на такі чинники, як алергени, віруси або дим. ІЛ -33 є членом родини інтерлейкіну-1 (ІЛ-1), який потужно стимулює продукцію цитокінів, асоційованих з Т-хелпером 2 типу (ТА2) (наприклад, ІЛ-4). ІЛ-33 експресується великою кількістю типів клітин, включаючи фібробласти, тучні клітини, дендритні клітини, макрофаги, остеобласти, ендотеліальні клітини і епітеліальні клітини. Інтерлейкін-33 (1ІЛ-33) є лігандом для 512 (іноді його називають "пригніченням туморогенності 2"), члена супер-сімейства тол-подібного/інтерлейкін-1 рецептора, який зв'язується з акцесорним протеїном, ІЇ/-1КАсР ("акцесорний протеїн рецептора інтерлейкіну-1", для оглядів, див., напр., КакКаг апа Г ее, Майшге Кеміем5 - ЮОгид Оівсомегу 7 (10): 827-840 (2008), ЗсПптії; еї аіІ., Іттипйу 23: 479-490 (2005); Пем/ еї аї., Майте ВНеміємув -

Іттипоіоду 10: 103-110 (2010); США 2010/0260770; США 2009/0041718). Після активації 5Т2ЛІ - 1КАсСР з допомогою ІЛ-33, сигнальний каскад ініціюється через молекули, що знаходяться нижче в каскадному ланцюгу, такі як МуУО88 (мієлоїдний фактор диференціювання 88) і ТКАЕб (фактор б, асоційований з рецептором ФНП), що призводить до активації МЕКВ (ядерний фактор-кВ), серед інших. Сигналінг ІЛ-33 задіяний як фактор у різних захворюваннях і розладах, включаючи запальні захворювання легень, розкриті в цьому документі. (Гіем/ еї аї., Майшге

Веміемє - Іттипоіоду 10:103-110 (20103). Інгібітори сигналінгу ІЛ-33 описані, наприклад, в

И5О,453,072; 58187596; О52013/17373761; О52014/0212412; О52014/0271658;

О520О14/0271642; И52014/0004107, МуО2015/099175; М/О2015/106080; М/О2011/031600;

МО2014/164959; М О2014/152195; МО2013/165894; МО2013/173761; ЕР1725261;

ЕР10815921А1; і ЕР2850103А2.

Інтерлейкін-4 (ІЛ-4, також відомий як фактор стимуляції В-клітин або В5Е-1) також задіяний як ключовий цитокін, який керує алергічними і Т-хелперними клітинами типу 2 (ТА2), поляризованими запальними процесами. Було показано, що ІЛ-4 має широкий спектр біологічних активностей, включаючи стимуляцію росту Т-клітин, тучних клітин, гранулоцитів, мегакаріоцитів і еритроцитів. 1ІЛ-4 індукує експресію молекул головного комплексу гістосумісності класу ІЇ в В-клітинах у стані спокою, і посилює секрецію ізотипів ІДЕ і Ідсвс1 стимульованими В-клітинами. Вказані біологічні активності 1ІЛ-4 опосередковуються специфічними рецепторами клітинної поверхні для ІЛ-4. Альфа-рецептор ІЛ-4 людини (ПІЛ-4Р) (ЗЕБЕО ІО МО: 347) описаний, наприклад, у патентах США Мо 5599905, 5767065, і 5840869.

Антитіла проти ПІЛ-АР описані в патентах США Мо 5717072, 7186809 і 7605237. Способи використання антитіл проти ліЛ-4Р описані в патентах США Мо 5714146; 5985280; 6716587 і 9290574.

Сучасні способи лікування запальних захворювань легень залишають значні можливості для поліпшення безпеки та ефективності у пацієнтів, які страждають, наприклад, від астми та хронічного обструктивного захворювання легень (ХОЗЛ), особливо у зменшенні загострень.

Незважаючи на доступність численних інгаляційних комбінацій протизапальних і бронхолітичних препаратів, багато пацієнтів продовжують відчувати загострення. Загострення можуть потребувати застосування системних кортикостероїдів, які є ефективними завдяки їх широкій імунонейтралізуючій здатності, але обтяжені небажаними побічними ефектами, включаючи втрату кісткової тканини та інфекцію. Деякі біологічні способи лікування, більшість з яких бо спрямовані на окремі імунні медіатори, знаходяться на завершальній стадії розробки для астми і ХОЗЛ. Однак через складність запального оточення ці агенти, ймовірно, будуть обмежені у своєму застосуванні.

Відповідно, в цій галузі існує незадоволена потреба в нових комбінаціях терапій для лікування та/або попередження запальних захворювань легень, таких як описані в цьому документі.

КОРОТКЕ ВИКЛАДЕННЯ СУТІ ВИНАХОДУ

Згідно з певними аспектами цього винаходу, запропоновані способи лікування запального захворювання або розладу, або, щонайменше, одного симптому, пов'язаного з запальним захворюванням або розладом, вказаний спосіб включає введення суб'єкту, що потребує цього, однієї або більше доз терапевтично ефективної кількості антагоніста інтерлейкіну-33 (ІЛ-33) окремо або в комбінації з однією або кількома дозами терапевтично ефективної кількості антагоніста інтерлейкіну-4 (ІЛ-4) або фармацевтичної композиції, що містить антагоніст ІЛ-33 і антагоніст ІЛ-да, пацієнту, який потребує цього. В одному варіанті реалізації цього винаходу введення антагоніста ІЛ-33 у комбінації з антагоністом ІЛ-4 призводить до підвищення терапевтичної ефективності порівняно з тією, що спостерігалась при введенні антагоніста тільки

ІЛ-33 або антагоніста тільки ІЛ-4.

У деяких варіантах реалізації цього винаходу антагоністом ІЛ-33 є будь-який агент, здатний блокувати, послаблювати або іншим чином перешкоджати сигналінгу ІЛ-33 та/або взаємодії між

ІЛ-33 і клітинним рецептором (напр. 512) або ко-рецептором (напр. І -1НАсСР) або його комплексом. Будь-який з вищезазначених може блокувати або інгібувати щонайменше одну біологічну активність ІЛ-33.

У деяких варіантах реалізації цього винаходу антагоніст ІЛ-33 є антитілом, яке зв'язується з або взаємодіє з ІЛ-33 і блокує взаємодію ІЛ-33 з його рецептором 512 і запобігає або інгібує взаємодію 512 з ко-рецептором, ІЛІ-РАСР, або запобігає утворенню сигнального комплексу. В одному варіанті реалізації цього винаходу антагоніст ІЛ-33 є моноклональним антитілом, яке зв'язується з або специфічно взаємодіє з ІЛ-33 людини. В одному варіанті реалізації цього винаходу антагоніст ІЛ-33 є пасткою на основі рецептора, що зв'язується з або специфічно взаємодіє з ІЛ-33 людини.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказаний антагоніст ІЛ-4 є антагоністом

Зо рецептора інтерлейкіну-4 (ІЛ-АР).

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказаний антагоніст ІЛ-4Р є будь-яким агентом, який зв'язується з або взаємодіє з ІЛ-4Ра або лігандом ІЛ-4Р, і інгібує або послаблює нормальну біологічну сигнальну функцію рецептора ІЛ-4 типу 1 та/або типу 2. В одному варіанті реалізації цього винаходу вказаний антагоніст ІЛ-АР є моноклональним антитілом, яке специфічно зв'язується з ІЛ-4АРа людини. В одному варіанті реалізації цього винаходу вказаний антагоніст

ІЛ-4Р є моноклональним антитілом, яке зв'язує ІЛ-4Ра і блокує опосередкований як ІЛ-4, так і ІЛ- 13 сигналінг через рецептор типу І або типу ІІ. В одному варіанті реалізації цього винаходу вказане моноклональне антитіло, яке специфічно зв'язується з ІЛ-АРа людини і блокує опосередкований як ІЛ-4, так ії ІЛ-13 сигналінг, є дупилумабом, або його біоеквівалентом. В одному варіанті реалізації цього винаходу вказаний спосіб лікування запального розладу або стану здійснюється шляхом застосування комбінації КЖЕСМ3500, що має пару амінокислотних послідовностей 5ЕО ЗЕО ІЮ МО: 274/282 варіабельної ділянки важкого ланцюга/варіабельної ділянки легкого ланцюга (НСМКЛСМЕК) і дупілумабу, що має пару амінокислотних послідовностей НСМКЛ СМК з ЗЕО ЗЕО ІЮ МО: 337/338.

В одному варіанті реалізації цього винаходу, вказане запальне захворювання або розлад, що піддається лікуванню вказаними способами з цього винаходу, обране із групи, що складається з астми, хронічного обструктивного захворювання легень (ХОЗЛ), синдрому перекриття астми і ХОЗЛ (АСОбБ), атопічного дерматиту, поліпів носа, алергічної реакції, хронічного бронхіту, емфіземи, хронічного риносинуситу з або без поліпів носа, запального захворювання кишечника, хвороби Крона, виразкового коліту, гіперчутливого пневмоніту, розсіяного склерозу, артриту (включаючи остеоартрит, ревматоїдний артрит, псоріатичний артрит), алергічного риніту, фіброзу, еозинофільного езофагіту, васкуліту, кропив'янки, синдрому Черджа-Стросса, запального болю і псоріазу.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказана астма є еозинофільною астмою.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказана астма є нееозинофільної астмою.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказана астма є алергічною астмою.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказана астма є неалергічною астмою.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказана астма є важкою рефрактерною астмою.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказана астма є стійкою до стероїдів астмою. бо В одному варіанті реалізації цього винаходу вказана астма є чутливою до стероїдів астмою.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказана астма є стероїдною рефрактерною астмою.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказана астма є загостренням астми.

В одному варіанті реалізації цього винаходу, вказане запальне захворювання або розлад полегшується, або зменшується у тяжкості, тривалості або частоті виникнення, або щонайменше один симптом, пов'язаний з запальним захворюванням або розладом, полегшується, або зменшується по тяжкості, тривалості або частоті виникнення.

В одному варіанті реалізації цього винаходу введення терапевтично ефективної кількості однієї або більше доз антагоніста ІЛ-33 суб'єкту, що потребує цього, окремо, або в комбінації з однією або більше дозами терапевтично ефективної кількості антагоніста ІЛ-АР призводило до підвищення терапевтичної ефективності, що вимірювалось за будь-яким одним або кількома з наступних параметрів: зменшення частоти одного або більше з наступних: еозинофіли, активовані В-клітини, активовані СО8 Т-клітини або співвідношення СО4/С0О8 Т-клітин у зразку тканини; зменшення одного або більше з наступних: рівні інтерлейкіну-1 бета (ІЛ-1р), інтерлейкіну-4 (ІЛ-4), інтерлейкіну-5 (ІІ -5), інтерлейкіну-б (ІІ-6), інтерлейкіну-13 (ІЛ-13), хемоаттрактантного протеїна моноцитів-1 (МСР-1) або фактора некрозу пухлин альфа (ФНПОа) у зразку тканини; або зниження рівня експресії гена одного або декількох з наступних: 14, 5, б, ПО, 13, г,

ІМ Зга2, їпї, Тоїр1, Ссі2, Ссі11, Ссі24, Со15а1 або СоіІ24а1 у зразку тканини.

В одному варіанті реалізації цього винаходу введення терапевтично ефективної кількості однієї або більше доз антагоніста ІЛ-33 суб'єкту, що потребує цього лікування, окремо, або в комбінації з однією або більше дозами терапевтично ефективної кількості антагоніста ІЛ-АР призводить до підвищення терапевтичної ефективності, що далі вимірювалось за будь-яким одним або кількома з наступних параметрів: а) зниження рівня сироваткового ІДЕ е) зниження метаплазії келихоподібних клітин в легені;

І) поліпшення консолідації легені; або 9) зменшення субепітеліального фіброзу в легені.

В одному варіанті реалізації цього винаходу, зразок тканини отримують з легені.

Зо В одному варіанті реалізації цього винаходу, вказаний зразок тканини обраний із групи, що складається з печінки, нирок, серця або цільної крові. У деяких варіантах реалізації цього винаходу, для вимірювання одного або більше вказаних вище параметрів можуть бути використані клітини крові, сироватка або плазма.

В одному варіанті реалізації цього винаходу, вказане хронічне обструктивне захворювання легень, яке піддається лікуванню вказаними способами цього винаходу, ускладнене одним або декількома з наступних: астма, вірусне захворювання, бактеріальна інфекція, експозиція до алергену, експозиція до хімічної речовини або хімічних парів або експозиція до подразника з навколишнього середовища або забруднення повітря.

У спорідненому варіанті реалізації цього винаходу астма, що піддається лікуванню вказаними способами з цього винаходу, ускладнена одним або декількома з наступних: вірусне захворювання, бактеріальна інфекція, експозиція до алергену, експозиція до хімічної речовини або хімічних парів, або експозиція до подразника з навколишнього середовища або забруднення повітря.

У певному варіанті реалізації цього винаходу астма, що піддається лікуванню вказаними способами цього винаходу, обрана з групи, що складається з еозинофільної астми, нееозинофільної астми, астми, стійкої до стероїдів і астми, чутливої до стероїдів.

В одному варіанті реалізації цього винаходу, хронічне обструктивне захворювання легень, яке піддається лікуванню вказаними способами цього винаходу, виникло в результаті або частково ускладнене сигаретним димом.

В одному варіанті реалізації цього винаходу, у пацієнтів, які страждають на хронічне обструктивне захворювання легень, що піддається лікуванню вказаними способами цього винаходу, може або не може виявлятись збільшення кількості еозинофілів.

В одному варіанті реалізації цього винаходу, у пацієнтів, які страждають на синдром перекриття астми і ХОЗЛ (АСОБ), що піддається лікуванню вказаними способами цього винаходу, може або не може виявлятись збільшення кількості еозинофілів.

Другий аспект цього винаходу пропонує лікування запального захворювання або розладу, або щонайменше одного симптому, пов'язаного з запальним захворюванням або розладом, шляхом введення ефективного кількості одного або більше додаткових терапевтичних агентів, ефективних для полегшення вказаного запального захворювання або розладу, або 60 щонайменше одного симптому вказаного запального захворювання або розладу в поєднанні з терапевтично ефективною кількістю антагоніста інтерлейкіну-33 (ІЛ-33),напр. антитіла проти ІЛ- 33 або пастки ІЛ-33 і терапевтично ефективної кількості антагоніста інтерлейкіну-4 (ІЛ-4), напр. антитіла проти ІЛ-4Р, такого як дупілумаб, або його терапевтичного еквіваленту.

В одному варіанті реалізації цього винаходу один або більше додаткових терапевтичних агентів обрані із групи, що складається з нестероїдного протизапального засобу (НПЗП), кортикостероїду (напр. інгаляційний кортикостероїд або ІС5), В2 адренергічного агоніста тривалої дії ((АВА), мускаринового антагоніста тривалої дії ((АМА), бронходилататора, антигістаміну, епінефрину, деконгестанту, антагоніста стромального лімфопоетину тимусу (Т5І Р), антагоніста ІЛ-1, антагоніста ІЛ-8, антагоніста ІЛ-13, іншого антагоніста ІЛ-4, подвійного антагоніста ІЛ-4//Л-13, подвійного антагоніста ІЛ-33/Л-13, антагоніста ІІ/-5, антагоніста ІІ -6, антагоніста ІЛ-12/23, антагоніста ІЛ-22, антагоніста ІЛ-25, антагоніста ІЛ-17, антагоніста ІЛ-З31, інгібітора ФНП, інгібітора ІдЕ, інгібітора лейкотрієну, перорального інгібітора РОЕЯ4, метилксантину, недокроміла натрію, кромоліна натрію, агоніста бета 2 тривалої дії та іншого антагоніста ІЛ-33 (напр. іншого антитіла проти ІЛ-33, іншої пастки на основі рецептора ІЛ-33, антагоніста 512, включаючи антитіло проти 512, або розчинного рецептора 512, або антагоніста до іншого рецептора ІЛ-33, відмінного від 512, або ІЛ-антагоніста 1РЕАсР, включаючи антитіло проти ІІ -1КАсР, або антитіло, яке взаємодіє з комплексом ІЛ-33/512).

У деяких варіантах реалізації цей винахід пропонує способи лікування хронічного обструктивного захворювання легень (ХОЗЛ) від середнього до високого ступеня тяжкості, що включає одночасне введення антагоніста ІЛ-4Р (напр. дупілумаб) і антагоніста ІЛ-33 (напр.

КЕСМ3500), крім фонової терапії, включаючи, наприклад, інгаляційний кортикостероїд (ІС5) та/або р2 адренергічний агоніст тривалої дії (ГАВА) та/або мускариновий антагоніст тривалої дії (ГАМА).

У певних варіантах реалізації цей винахід пропонує способи зниження частоти явищ "втрати контролю астми" (ГОАС), що включають лікування пацієнтів, які страждають на астму антагоністом ІЛ-4Р (напр. дупілумабом) у комбінації з антагоністом ІЛ-33 (напр. КЕСМ3500). У деяких варіантах реалізації цього винаходу, вказане комбіноване застосування антагоніста ІЛ- 4Р в комбінації з антагоністом ІЛ-33 забезпечує більш ефективний результат, ніж введення окремо антагоніста ІЛ-4Р або окремо антагоніста ІЛ-33.

Зо У спорідненому варіанті реалізації цього винаходу введення вказаного антагоніста ІЛ-33 у комбінації з антагоністом ІЛ-АР призводить до збільшення імунної відповіді типу 1 та/або зниження імунної відповіді типу 2, викликаного захворюванням, збудником захворювання або алергією.

Третій аспект цього винаходу пропонує спосіб лікування фіброзного захворювання або розладу, або, щонайменше, одного симптому, пов'язаного з фіброзним захворюванням або розладом, вказаний спосіб включає введення комбінації антагоніста ІЛ-33 (антитіла проти ІЛ-33 або пастки ІЛ-33), який специфічно зв'язується з ІЛ-33, і антитіла, яке специфічно зв'язується з

ІЛ-4Ра або його антиген-зв'язуючого фрагмента, або фармацевтичної композиції, що містить антагоніст ІЛ-33 їі антагоніст ІЛ-4 а, пацієнту, який потребує цього лікування, причому вказане фіброзне захворювання або розлад полегшується або зменшується у тяжкості або тривалості, або щонайменше один симптом, пов'язаний з фіброзним захворюванням або розладом, полегшується, або зменшується в тяжкості, тривалості або частоті виникнення. В одному варіанті реалізації цього винаходу лікування вказаного фіброзного захворювання антагоністом

ІЛ-33 в комбінації з антагоністом ІЛ-4Р може призводити до відновлення фіброзної тканини до її нормального стану.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказані фіброзні захворювання або порушення, які піддаються лікуванню шляхом введення анти-ІЛ-33 і ІЛ-АР антагоністів цього винаходу, таких як антитіла проти ІЛ-33 або ІЛ-33 пастки в комбінації з антитілами проти ІЛ-4Ра, описані в цьому документі, включають фіброз легень (напр. ідіопатичний фіброз легень, індукований блеоміцином фіброз легень, індукований азбестом фіброз легень і облітеруючий бронхіолітичний синдром), хронічну астму, фіброз, пов'язаний з гострим пошкодженням легень і гострою респіраторною недостатністю (напр., фіброз, індукований бактеріальною пневмонією, фіброз, індукований травмою, фіброз, індукований вірусною пневмонією, фіброз, індукований штучною вентиляцією легень, фіброз, індукований не-легеневим сепсисом, фіброз, індукований аспірацією), силікоз, фіброз, індукований опроміненням, хронічне обструктивне захворювання легень (ХОЗЛ, яке може або не може бути пов'язаним з, частково спричиненим, або бути наслідком впливу активного чи пасивного куріння), склеродермія, очний фіброз, фіброз шкіри (напр. склеродермія), фіброз печінки (напр. цироз, індукований алкоголем, фіброз печінки, неалкогольний стеатогепатит (МАЗН), пошкодження жовчних протоків, первинний біліарний 60 цироз печінки, фіброз печінки, індукований інфекцією або вірусом, аутоїмунний гепатит, фіброз нирок (нирковий), фіброз серця, атеросклероз, рестеноз стента і мієлофіброз.

Четвертий аспект цього винаходу пропонує спосіб попередження або зменшення тяжкості алергічної відповіді, вказаний спосіб включає введення однієї або більше доз терапевтично ефективної кількості антагоніста ІЛ-33 в комбінації з однією або більше доз терапевтично ефективної кількості антагоніста ІЛ-4Р суб'єкту, що потребує цього лікування, причому введення вказаної комбінації призводить до підвищення терапевтичної ефективності для попередження або зменшення тяжкості алергічної відповіді порівняно з тим, що спостерігається при введенні окремо антагоніста ІЛ-33 або окремо антагоніст ІЛ-4Р. Суб'єкт, який отримував антагоніст ІЛ-33 в комбінації з антагоністом ІЛ-4Р, може демонструвати знижену чутливість до або зменшену алергічну реакцію на алерген, або не відчувати будь-якої чутливості або алергічної реакції на або анафілактичної реакції на алерген після введення вказаної комбінації антагоніста ІЛ-33 і антагоніста ІЛ-4Р або композиції, що містить вказані антагоністи.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказаний антагоніст ІЛ-33 для застосування у вказаних способах цього винаходу є моноклональним антитілом або його антигензв'язуючим фрагментом, який зв'язується з або специфічно взаємодіє з ІЛ-33 людини. Вказане антитіло проти ІЛ-33 або його антиген зв'язуючий фрагмент може блокувати взаємодію ІЛ-33 і 5Т2, або може забезпечувати низьку афінність зв'язування ІЛ-33 з рецептором 512. При цьому 512 може усуватись від взаємодії з ІІ -1КАсР. Таким чином, вказані антитіла проти ІЛ-33 цього винаходу, є ефективними зокрема для інгібування опосередкованого ІЛ-33 сигналінгу і для лікування захворювань і розладів, викликаних або пов'язаних з активністю та/або сигналінгом ІЛ-33.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказане антитіло проти ІЛ-33 або його антиген- зв'язуючий фрагмент знижує частоту одного або більше з наступних: еозинофіли, СО4- Т- клітини, В-клітини, 5712-7/С04-- клітини в популяції Т-клітин або зменшує співвідношення Т-клітин сра/СоОв у легенях при введенні ссавцю, що має індуковане алергеном запалення легень.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказане антитіло проти ІЛ-33 або його антиген- зв'язуючий фрагмент знижує рівень експресії одного або більше з наступних: ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-6, ІЛ- 9, ІЛ-13, СсіІ2, Ссі11 СсіІ24 або МСР-1 в легенях при введенні ссавцю, що має алерген- індуковане запалення легень.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказане антитіло до ІЛ-33 або його антиген-

Зо зв'язуючий фрагмент знижує рівні сироваткового ІДЕ, метаплазію келихоподібних клітин або товщину епітеліального колагену в легенях при введенні ссавцю, що має індуковане алергеном запалення легень.

У деяких варіантах реалізації цього винаходу вказані антитіла проти ІЛ-33, які специфічно зв'язуються з ІЛ-33 людини, або їх антиген-зв'язуючі фрагменти, які можуть бути використані у вказаних способах цього винаходу, включають три СОК важкого ланцюга (НСОКІ, НОСОК і

НСОМКЗ), що містять в варіабельній ділянці важкого ланцюга (НСМК) амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮО МО: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290 і 308; і включає три СОК легкого ланцюга (І СОК1, 1СОК2 ії ІСОК3), що містять на варіабельній ділянці легкого ланцюга( СУК) амінокислотні послідовності, обрані з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298 і 316.

У деяких варіантах реалізації цього винаходу вказані антитіла проти ІЛ-33, які специфічно зв'язуються з ІЛ-33 людини, або їх антиген-зв'язуючі фрагменти, які можуть бути використані у вказаних способах цього винаходу, містять варіабельну ділянку важкого ланцюга (НСУК), що має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290 і 308, або суттєво подібну до них послідовність, що має, щонайменше, 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895 або щонайменше 99 95 ідентичності послідовності.

Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу, анти-ІЛ-33 антитіла або їх антиген зв'язуючі фрагменти для застосування у вказаних способах цього винаходу включають варіабельну ділянку легкого ланцюга (СУК), що має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з БЕО 5ЕО ІЮО МО: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298 і 316, або суттєво подібну до них послідовність, що має щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичності послідовності.

Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу, анти-ІЛ-33 антитіла або їх антиген- зв'язуючі фрагменти для застосування у вказаних способах цього винаходу містять пару послідовності НСМК і СМ (НСМРЕ/Л СУК), обрану з групи, що складається 5ЕО ІЮО МО: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 60 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298 і 308/316.

Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу антитіла проти ІЛ-33 або їх антиген зв'язуючі фрагменти для застосування у вказаних способах цього винаходу включають домен

СОКЗ важкого ланцюга (НСОКЗ), що має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з БЕО ІО МО: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296 і 314 або суттєво подібну їй послідовність що має щонайменше 90 95, щонайменше 9595, щонайменше 9895 або щонайменше 99 95 ідентичності послідовності; і домен СОКЗ легкого ланцюга (СОКЗ), що має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 2712, 288, 304 і 322, або суттєво подібну їй послідовність, що має щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичності послідовності.

Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу вказані антитіла проти ІЛ-33 або їх антиген-зв'язуючі фрагменти для застосування у вказаних способах цього винаходу включають пару амінокислотних послідовностей НСОКЗ/Л СОКЗ, обрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ

МО: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160, 168/176, 184/192, 200/208, 216/224, 232/240, 248/256, 264/272, 280/288, 296/304 і 314/322.

Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу, вказані анти-ІЛ-33 антитіла або їх антиген зв'язуючі фрагменти для застосування у вказаних способах цього винаходу додатково містять домен СОК1 важкого ланцюга (НСОКТ), що має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292 і 310, або суттєво аналогічну їм послідовність, що має щонайменше 90 965, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичності послідовності; домен СОК2 важкого ланцюга (НСОК2), що має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294 і 312 або суттєво аналогічну їм послідовність, що має щонайменше 90 95, щонайменше 9595, щонайменше 9895 або щонайменше 99 95 ідентичності послідовності; домен СОКІ (СОК) легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮО МО: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300 і 318 або суттєво аналогічну їм послідовність, що має щонайменше 90 95, щонайменше 9595, щонайменше 9895 або щонайменше 99 95 ідентичності послідовності; і

Зо домен СОК2 легкого ланцюга (І СОК2), що має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302 і 320, або суттєво подібну до них послідовність, що має щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичності послідовності.

Деякі необмежуючі, ілюстративні анти-ІЛ-33 антитіла і антиген-зв'язуючі фрагменти, які можуть бути використані у вказаних способах цього винаходу, включають НСОК1-НСОН2- нНоОВЗ-І СОВІ1-іСОВ2-І СОР домени, відповідно, мають амінокислотні послідовності, вибрані з група, що складається з: ЗЕО ІЮ МО: 4-6-8-12-14-16 (напр. НІМУ9559М); 20-22-24-28-30-32 (напр. НІМУ9566М); 36-38-40-44-46-48 (напр. НІМУ9568М); 52-54-56-60-62-64 (напр. Н4Н9б29Р); 68-70-72-76-78-80 (напр. Н4НУбЗЗР); 84-86-88-92-94-96 (напр. Ні4Н9Уб40Р); 100-102-104-108-110- 112 (напр. Н4НО9б59Р); 116-118-120-124-126-128 (напр. НАН9ОббОР); 132-134-136-140-142-144 (напр. НА4нНеОбба2Р); 148-150-152-156-158-160 (напр.Ні4НУбб3ЗР); 164-166-168-172-174-176 (напр.

НаноббаР); 180-182-184-188-190-192 (напр.Ні4НУбб5Р); 196-198-200-204-206-208 (напр.

НанНоОбббР); 212-214-216-220-222-224 (напр. Н4іНеОбб7Р); 228-230-232-236-238-240 (напр.

НаНОб7ОР); 244-246-248-252-254-256 (напр. Н4іНеОб71Р); 260-262-264-268-270-272 (напр.

Наноб7агР); 276-278-280-284-286-288 (напр. Н4іНеОб75Р); 292-294-296-300-302-304 (напр.

НаНнеб7бР); і 310-312-314-318-320-322 (НІМ9565М).

Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу анти-ІЛ-33 антитіла або їх антиген зв'язуючі фрагменти для застосування у вказаних способах цього винаходу, наприклад, для лікування запальних станів, включають СОК домени важкого і легкого ланцюга, що містяться в послідовностях варіабельної ділянки важкого і легкого ланцюга (НСМК/Л СУК), вибраних з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298 і 308/316. Способи і методи для ідентифікації СОМ в амінокислотних послідовностях НСМК і

ІСМА добре відомі в цій галузі і можуть бути використані для ідентифікації СОК в межах зазначених амінокислотних послідовностей НСМК та/або | СУК, описані в цьому документі.

Типові угоди, які можуть бути застовсоані для ідентифікації меж СОК, включають, напр., визначення за Кабат, визначення за Чотіа та визначення за АБМ. Загалом, визначення за Кабат базується на варіабельності послідовності, визначення за Чотіа базується на розташуванні структурних ділянок петлі, а визначення за АВМ є компромісом між підходами Кабат та Чотіа. 60 Див., напр., Кабат, "Зедиепсез ої Ргоївїп5 ої Іттипо|одісаї Іпіегеві," Майіопаї Іпзійшев ої Неайй,

Веїпезаа, Ма. (1991); А!-І агіКапі еї а!., У. Мої. Віої. 273:927-948 (1997); і Мартін та ін., Ргос. Маї).

Асад. Осі. ОБА 86:9268-9272 (1989). Публічні бази даних також доступні для ідентифікації послідовностей СОБЕ в антитілі.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказане антитіло до ІЛ-33 або антиген- зв'язуючий фрагмент для використання у вказаних способах цього винаходу включає пару амінокислотних послідовностей НСУМК/ЛСМУК СОК важкого і легкого ланцюга з 5БЕО ІЮ МО: 274:/282.

У спорідненому варіанті реалізації цього винаходу вказане антитіло до ІЛ-33 або антиген- зв'язуючий фрагмент для використання у вказаному способі цього винаходу включає домени неОовВ1і-НСОВ2г-НОСОвВЗ-І СОВІ1-І СОН2-І СО, відповідно, з ЗЕО ІЮ МО: 276-278-280-284-286- 288.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказане антитіло, яке специфічно зв'язує інтерлейкін-33 (ІЛ-33) людини, або антиген-зв'язуючий фрагмент для використання у вказаних способах цього винаходу включає: (а) варіабельну ділянку важкого ланцюга (НСУК), що має амінокислоту послідовність з ФЕО ІЮ МО: 274; і (в) варіабельну ділянку легкого ланцюга (І СУК), що має амінокислотну послідовність з зФЕО 10 МО: 282.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказане антитіло до ІЛ-33 або антиген- зв'язуючий фрагмент для використання у вказаних способах цього винаходу включає пару амінокислотних послідовностей НСМЕЛ СМЕ з 5ЕО ІЮ МО: 274/282.

В одному варіанті реалізації цього винаходу, вказане антитіло проти ІЛ-33 або його антиген зв'язуючий фрагмент для застосування у вказаних способах цього винаходу взаємодіє з амінокислотною послідовністю, яка знаходиться починаючи приблизно від положення 1 до приблизно положення 12 з 5ЕБЕО ІЮО МО: 349, та/або амінокислотною послідовністю, яка знаходиться починаючи приблизно від положення 50 до приблизно положення 94 з БЕО ІЮО МО: 349, як визначено за допомогою водень-дейтерієвого обміну.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказане антитіло до ІЛ-33 або його антиген- зв'язуючий фрагмент для застосування у вказаних способах цього винаходу взаємодіє з амінокислотною послідовністю, яка знаходиться починаючи від приблизно положення 112 до приблизно положення 123 з 5ЕО ІЮ МО: 348, та/або амінокислотною послідовністю починаючи

Зо від приблизно положення 161 до приблизно положення 205 з БЕО ІЮ МО: 348, як визначено за допомогою водень-дейтерієвого обміну.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказане антитіло до ІЛ-33 або його антиген- зв'язуючий фрагмент для застосування у вказаних способах цього винаходу взаємодіє або з амінокислотною послідовністю з 5ЕО ІЮО МО: 350, або з амінокислотною послідовністю з 5ЕО ІЮ

МО: 351, або взаємодіє з обома з 5ЕО ІЮ МО: 350 і 351, як визначено за допомогою водень- дейтерієвого обміну.

В одному варіанті реалізації цього винаходу, вказане антитіло до ІЛ-33 або його антиген зв'язуючий фрагмент для застосування у вказаних способах цього винаходу конкурує за зв'язування з ІЛ-33 з еталонним антитілом, що містить пару амінокислотних послідовностей

НСМКЛ-СМК з 5ЕО ІЮ МО: 274/282.

В одному варіанті реалізації цього винаходу, вказане антитіло до ІЛ-33 або його антиген- зв'язуючий фрагмент для застосування у вказаних способах цього винаходу зв'язується з тим же епітопом на ІЛ-33, що і еталонне антитіло, яке містить пару амінокислотних послідовностей

НСМКЛ-СМК з 5ЕО ІЮ МО: 274/282.

У п'ятому аспекті цей винахід пропонує молекули нуклеїнової кислоти, що кодують вказані антитіла проти ІЛ-33 або їх антиген зв'язуючі фрагменти для використання у вказаних способах цього винаходу. Рекомбінантні вектори експресії, що несуть вказані нуклеїнові кислоти цього винаходу, і клітини-хазяїни, в які були введені такі вектори, також охоплені цим винаходом, а також вказані способи отримання вказаних антитіл шляхом культивування клітин-хазяів в умовах, що дозволяють продукувати антитіла, і відновлювати продуковані антитіла.

В одному варіанті реалізації цей винахід пропонує способи застосування антитіла або його фрагмента, що специфічно зв'язується з ІЛ-33 людини, що включає НСМК, кодований послідовністю нуклеїнової кислоти, обраною з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289 і 307 або суттєво ідентичною послідовністю, що має, щонайменше, 9095, щонайменше 9595, щонайменше 98 95, або щонайменше 99 95 гомології з нею.

Цей винахід також пропонує способи застосування антитіла або його фрагмента, який специфічно зв'язується з ІЛ-33 людини, що містить ГСМК, кодовану послідовністю нуклеїнової кислоти, обраної з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 9, 25, 41, 57, 73 89, 105, 121, 137, 153, 60 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297 і 315 або по суттєво ідентичною послідовністю, що має щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95, або щонайменше 99 95 гомології з нею.

Цей винахід також пропонує способи застосування антитіла або антиген-зв'язуючого фрагмента антитіла, що специфічно зв'язується з ІЛ-33 людини, що включає домен НСОКЗ, кодований нуклеотидною послідовністю, обраною з групи, що складається з ІЮ МО: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295 і 313 або суттєво ідентичною послідовність, що має щонайменше 90 95, щонайменше, 95 965, щонайменше, 98 95 або щонайменше 99 95 гомології з нею; домен ЇСОКЗ, кодований нуклеотидної послідовністю, обраної з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303 і 321, або суттєво ідентичної послідовності, що має, щонайменше, 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95, або щонайменше 99 95 гомології З нею.

Цей винахід також пропонує способи застосування антитіла або його фрагмента, який специфічно зв'язується з ІЛ-33 людини, що додатково містить домен НОСОК, кодований нуклеотидною послідовністю, обраною з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291 і 309, або суттєво ідентичною послідовністю, що має щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 98 95, або щонайменше 99 95 гомології з нею; домен НСОК2, кодований нуклеотидною послідовністю, обраною з групи, що складається з БЕО ІЮО МО: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293 і 311, або суттєво ідентичною послідовністю, що має, щонайменше, 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95, або щонайменше 99 95 гомології З нею; домен ЇСОК1, кодований нуклеотидною послідовністю, обраною з групи, що складається з

ЗЕО ІЮ МО: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299 і 317, або суттєво ідентичною послідовністю, що має, принаймні, 90 96, щонайменше 95 95, щонайменше 9895, або щонайменше 99595 гомології з нею; домен ЇСОК2, кодований нуклеотидною послідовністю, обраною з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301 ї 319 або суттєво ідентичною послідовністю, що має, щонайменше, 9095, щонайменше 9595, щонайменше 98 95, або щонайменше 99 95 гомології з нею.

Зо Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу, вказані способи цього винаходу пропонують застосування антитіла або його фрагмента, що специфічно зв'язується з ІЛ-33 людини, який містить СОК послідовності важкого і легкого ланцюга, кодовані послідовностями нуклеїнової кислоти з 5ЕО ІЮО МО: 1 ї 9 (напр. НІМУ9559М), 17 ії 25 (напр. НІМУ9566М), 33 і 41 (напр. НІМУ568М), 49 їі 57 (напр. Н4НОб29Р), 65 і 73 (напр. Н4НОбЗЗР), 81 ї 89 (напр.

Н4АНЗб40Р), 97 і 105 (напр. Н4НОб59Р), 113 ї 121 (напр. Н4НОббОР), 129 і 137 (напр. Н4НОбба2Р), 145 ї 153 (напр. НАНОббЗР), 161 і 169 (напр. НАНОббАР), 177 і 185 (напр. Н4НОбб5Р), 193 і 201 (напр. НАНОбббР), 209 ї 217 (напр. Н4НОбб7Р), 225 і 233 (напр. Н4НОб7ОР), 241 і 249 (напр.

НА4НОб71Р), 257 і 265 (напр. Н4НОб72Р), 273 і 281 (напр. Н4НОб75Р), 289 і 297 (напр.

Н4АНЗб76Р), або 307 ії 315 (НІМУ565М).

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказаний антагоніст ІЛ-33 для застосування в способах цього винаходу є пасткою на основі рецептора ІЛ-33, такою як описана в цьому документі (див. Фіг. 1).

В одному варіанті реалізації цього винаходу пастка на основі рецептора ІЛ-33 включає в себе перший 1ІЛ-33 зв'язуючий домен (01), приєднаний до домену мультимеризації (М), причому 01 містить ІЛ-33-зв'язуючу ділянку протеїна 512.

В одному варіанті реалізації цього винаходу пастка ІЛ-33 для застосування у вказаних способах цього винаходу додатково містить другий ІЛ-33 зв'язуючий домен (02), приєднаний до

Б1 та/"або М, причому 02 включає позаклітинні частини білка І/-1КАсР. В одному варіанті реалізації цього винаходу Ю1 приєднаний до М-кінця М. В одному варіанті реалізації цього винаходу 01 приєднаний до С-кінця М. В одному варіанті реалізації цього винаходу 02 приєднаний до М-кінця М. В одному варіанті реалізації цього винаходу 02 приєднаний до С- кінця М. В одному варіанті реалізації цього винаходу 01 приєднаний до М-кінця 02, причому 02 приєднаний до М-кінця М.

В одному варіанті реалізації цього винаходу 01 включає послідовність амінокислот з ЗЕО ІЮ

МО: 328 або 329 або амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95 ідентичності з нею. В одному варіанті реалізації цього винаходу 02 включає амінокислотну послідовність з

ЗБО ІО МО: 330 або 331 або амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95 ідентичності до неї.

В одному варіанті реалізації цього винаходу антагоніст ІЛ-33 для застосування у вказаних бо способах цього винаходу включає перший зв'язуючий домен ІЛ-33 (01), приєднаний до першого домену мультимеризації (МІ), і другий ІЛ-33 зв'язуючий домен (02), приєднаний до другого домену мультимеризації (М2), причому домени 01 та/або 02 містять ІЛ-33-зв'язуючу частину рецептора, вибраного з групи, що складається з 512 і ПІ. -1ВАсрР.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказаний антагоніст ІЛ-33 для застосування у вказаних способах цього винаходу включає третій ІЛ-33-зв'язуючий домен (03), приєднаний до

Б1 або МІ, причому ОЗ містить ІЛ-33-зв'язуючу частину рецептора, вибраного з групи, що складається з 512 і 11 -1ВАсР.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказаний антагоніст ІЛ-33 для застосування у вказаних способах цього винаходу включає четвертий ІЛ-33-зв'язуючий домен (04), приєднаний до Ор2 або М2, причому 04 містить ІЛ-33-зв'язуючу частину рецептора, вибраного з групи, що складається з 512 і 11 -1ВАсР.

В одному варіанті реалізації цього винаходу О1 приєднаний до М-кінця МІ, і 02 приєднаний до М-кінця М2.

В одному варіанті реалізації цього винаходу ОЗ приєднаний до М-кінця 01.

В одному варіанті реалізації цього винаходу ОЗ приєднаний до С-кінця М1.

В одному варіанті реалізації цього винаходу 04 приєднаний до М-кінця 02.

В одному варіанті реалізації цього винаходу 04 приєднаний до С-кінця М2.

В одному варіанті реалізації цього винаходу ОЗ приєднаний до М-кінця 01, і 01 приєднаний до М-кінця М11; і причому 004 приєднаний до М-кінця 02, і 02 приєднаний до М-кінця М2.

В одному варіанті реалізації цього винаходу ОЗ є ідентичним або суттєво ідентичним до 04 і причому 01 є ідентичним або суттєво ідентичним до 02.

В одному варіанті реалізації цього винаходу і ОЗ ї 04 включають ІЛ-З3-зв'язуючу частину

ЗТ2 протеїну; причому і 01 і 02 включають позаклітинну частину протеїну ІІ -1ВАсРр.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказана пастка ІЛ-33 для застосування у вказаних способах цього винаходу включає амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 323, 324, 325, 326 і 327.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказаний антагоніст ІЛ-4 для застосування у вказаних способах цього винаходу є антагоністом рецептора інтерлейкіну-4 (ІЛ-АР).

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказаний антагоніст ІЛ-АР для застосування у

Зо вказаних способах цього винаходу є антитілом або його антиген зв'язуючим фрагментом, який зв'язує ІЛ-4Ра і перешкоджає взаємодії ІЛ-4 та/або ІЛ-13 з рецептором ІЛ-4 типу 1 або 2 типу.

В спорідненому варіанті реалізації цього винаходу, вказане антитіло до ІЛ-АР або його антиген зв'язуючий фрагмент для застосування у вказаних способах цього винаходу перешкоджає взаємодії ІЛ-4 та/або ІЛ-13 з рецепторами ІЛ-4 обох типів 1 і 2.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказаний антагоніст ІЛ-АР для застосування у вказаних способах цього винаходу є моноклональним антитілом, яке специфічно зв'язується з

ІЛ-4Ра.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказане моноклональне антитіло, яке специфічно зв'язується з ІЛ-4Ра людини для застосування у вказаних способах цього винаходу є дупілумабом або його біоеквівалентом.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказане антитіло проти ІЛ-4Р або його антиген- зв'язуючий фрагмен для застосування у вказаних способах цього винаходу включає ділянки, які визначають комплементарність важкого ланцюга (НСОК»5) варіабельної ділянки важкого ланцюга (НСУК), які включають амінокислоту послідовність з ЗЕО ІЮ МО: 335 або 5ЕО ІЮО МО: 337; і ділянки, які визначають комплементарність легкого ланцюга (І СОМ) варіабельної ділянки легкого ланцюга (І СМК), які містять амінокислотну послідовність з «ЕО ІЮ МО: 336 або 5ЕО ІЮ

МО: 338.

У спорідненому варіанті реалізації цього винаходу вказане антитіло проти ІЛ-4Р або його антиген-зв'язуючий фрагмент для застосування у вказаних способах цього винаходу включає три НСОК (НСОКІ, НОСОК і НСОКЗ) і три ІСОК (СОМ, 1 СОК2 і | СО3), причому НСОК1 включає амінокислотну послідовність з ЗЕБЕО ІЮ МО: 339, НСОК2 включає амінокислотну послідовність з ФЕО ІЮ МО: 340; НСОКЗ включає амінокислотну послідовність з зЕО ІЮ МО:341;

ІГСОК1 включає амінокислотну послідовність з «ЕО ІЮ МО: 342; | СОК2 включає амінокислотну послідовність з «ЕО ІЮ МО: 343; | СОКЗ включає амінокислотну послідовність з 5ЕО ІЮ МО: 344.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказане антитіло проти ІЛ-4 або його антиген- зв'язуючий фрагмент для застосування у вказаних способах цього винаходу включає НСУК, що включає амінокислотну послідовність з 5ЕО ІЮО МО: 335 або 5ЕО ІЮ МО: 337, та ЇСМК, що включає амінокислотну послідовність з БЕО ІЮ МО: 336 або 5ЕО ІЮ МО: 338.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказане антитіло проти ІЛ-4Р або його антиген- 60 зв'язуючий фрагмент для використання у вказаних способах цього винаходу включає пару амінокислотних послідовностей НСМЕЛ-СМЕ з 5ЕО ІЮО МО: 335/336 або 5ЕО ІЮ МО: 337/338.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказаний антагоніст ІЛ-АР для застосування у вказаних способах цього винаходу є дупілумабом (ЗЕО ІЮ МО: 337/338), або його біоеквівалентом.

У деяких варіантах реалізації цього винаходу, вказаний антагоніст ІЛ-33 і антагоніст ІЛ-АР вводяться в окремих формуляціях.

У деяких варіантах реалізації цього винаходу вказаний антагоніст ІЛ-33 і вказаний антагоніст

ІЛ-4Р комбінуються для введення пацієнту, який потребує цього лікування.

У деяких варіантах реалізації цього винаходу вказаний антагоніст ІЛ-33 і антагоніст ІЛ-АР вводять суб'єкту підшкірно, внутрішньовенно, внутрішньом'язово або інтраназально.

Вказані антитіла ІЛ-33 ії ІЛ-АР цього винаходу можуть бути повнорозмірними (наприклад, антитілом дос або Ідс4) або можуть включати тільки антиген-зв'язуючу частину (наприклад,

Еаб, Кар)г або фрагмент 5сЕм), і можуть бути модифікованими для зміни функціональності, наприклад, для видалення залишкових ефекторних функцій (Кеаау еї аї., 2000, 9. Іттипої. 164: 1925-1933).

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказані антитіла, які специфічно зв'язуються з інтерлейкіном-33 людини, або ІЛ-4Р людини, є виділеними повністю людськими моноклональними антитілами.

У шостому аспекті цей винахід пропонує фармацевтичну композицію, що включає рекомбінантне антитіло людини або його фрагмент, або пастку, яка специфічно зв'язує ІЛ-33, або антитіло, яке специфічно зв'язує ІЛ-4Р і фармацевтично прийнятний носій. У спорідненому аспекті цей винахід стосується композиції, яка є комбінацією анти-ІЛ-33 антитіла або ІЛ-33 пастки, або антитіла, яке специфічно зв'язує ІЛ-4Р і один або більше додаткових терапевтичних агентів. В одному варіанті реалізації цього винаходу, одним або декількома додатковими терапевтичними агентами є будь-який агент, який ефективно комбінується з антагоністом ІЛ-33 або антагоністом ІЛ-АР або з ними обома. Типові агенти, які можуть бути ефективними у поєднанні з антагоністом ІЛ-33 та/або антагоністом ІЛ-4Р, включають без обмеження інші агенти, які інгібують активність ІЛ-33 та/або активність ІЛ-4 (включаючи інші антитіла або їх антиген зв'язуючі фрагменти, пептидні інгібітори, низькомолекулярні антагоністи тощо) та/або

Зо агенти, які безпосередньо не зв'язують ІЛ-33 або ІЛ- 4 або ІЛ-А4Р, але тим не менш перешкоджають, блокують або послаблюють сигналінг ІЛ-33 або ІЛ-4. В одному варіанті реалізації цього винаходу один або більше додаткових терапевтичних агентів можуть бути вибрані з групи, що складається з нестероїдного протизапального (М5АЇО), кортикостероїду (напр. інгаляційний кортикостероїд), бронходилататора, антигістаміна, адреналіна, деконгестанта, антагоніста лімфопоетину строми тимусу (Т5І/ Р), антагоніста ІЛ-1, антагоніста

ІЛ-8, антагоніста ІЛ-13, іншого антагоніста ІЛ-4, подвійного антагоністаІ!Л-4//Л-13, подвійного антагоніста!/Л-33/Л-13, антагоніста ІЛ-5, антагоніста ІЛ-6, антагоніста ІЛ-12/23, антагоніста ІЛ-22, антагоніста ІЛ-25, антагоніста ІЛ-17, антагоніста ІЛ-31, інгібітора ФНП, інгібітора ІдЧЕ, інгібітора лейкотрієну, перорального інгібітора РОЕ4, метилксантину, недокроміла натрію, кромоліна натрію, агоніста бета 2 тривалої дії (І АВА), мускаринового антагоніста тривалої дії (ГАМА), інгаляційного кортикостероїда (ІС5) та іншого антагоніста ІЛ-33 або ІЛ-4 або іншого антитіла проти ІЛ-33 або ІЛ-4 або ІЛ-4Р, та іншого ІЛ-33 антагоніста.

У деяких варіантах реалізації цього винаходу вказаний антагоніст цитокіну може бути низькомолекулярним інгібітором (синтетичним або природним) або протеїном (напр. антитілом), що взаємодіє або з самим цитокіном, або з рецептором вказаного цитокіну, або з комплексом, що включає як цитокін, так і його рецептор(и). Додаткові комбіновані терапії та комбіновані формуляції, що включають анти-ІЛ-33-антитіла цього винаходу та/або ІЛ-4Р -антитіла, описані в інших частинах цього документа.

В іншому аспекті цей винахід пропонує терапевтичні способи для інгібування активності сигналінгу ІЛ-33, та/або ІЛ-4 з використанням антагоніста анти-ІЛ-33 (такого як антитіло проти

ІЇЛ-33 або пастка ІЛ-33) і антитіло до ІЛ-4Р або антиген зв'язуюча частина одного або більше антитіл цього винаходу, причому вказані терапевтичні способи включають введення терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить антитіло проти ІЛ-33 або пастку ІЛ-33, або окремо, або у комбінації з антитілом проти ІЛ-4Р або антиген-зв'язуючим фрагментом одного або більше антитіл цього винаходу. Розладом, що піддається лікуванню є будь-яке захворювання або стан, яке покращується, пом'якшується, пригнічується або запобігається шляхом усунення, інгібування або зменшення сигналінгу ІЛ-33 та/або ІЛ-4. Вказані антагоністи анти-ІЛ-33 та/або ІЛ-АР цього винаходу при сумісному застосуванні можуть функціонувати для блокування взаємодії між ІЛ-33 ї ІЛ-33-зв'язуючим партнером, і ІЛ-4 і ІЛ-4- бо зв'язуючим партнером або іншим чином інгібувати сигнальну активність як ІЛ-33, так і ІЛ-4. В одному варіанті реалізації цього винаходу вказаний антагоніст ІЛ-4Р є антитілом, яке зв'язується з ІЛ-4Ра і таким чином запобігає сигналінгу як ІЛ-4, так і ІЛ-13 через рецептори типу або типу ІІ. В одному варіанті реалізації цього винаходу вказаний ІЛ-4Ра антагоніст є дупілумабом або його біоеквівалент. Враховуючи подвійну блокуючу активність дупілумабу як для ІЛ-4, так і для ІЛ-13, вважається, що при використанні в комбінації з антагоністами ІЛ-33 цього винаходу комбінована схема лікування призведе до посиленого інгібування небажаної запальної активності, що частково є результатом сигналінгу через сигнальні шляхи ІЛ-4, ІЛ-13 і

ІЛ-33, що можуть виникати під час запалення.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказаний антагоніст ІЛ-33 являє собою антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який специфічно зв'язується з ІЛ-33 і блокує взаємодію

ІЛ-33 і його рецептора 512 (також відомого як ІЛІКІ-1).

У деяких варіантах реалізації цього винаходу вказані антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, що специфічно зв'язується з ІЛ-33 людини, включає три СОК важкого ланцюга (НСОКІ, НСОМК2 ії НСОКЗ), що містять амінокислотну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга (НСУРК), обрану з групи, що складається з 5БЕО ІЮ МО: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290 і 308; і включає три СОК легкого ланцюга (СОКІ, СОК2 і ІСОКЗ), що містять амінокислотну послідовності варіабельної ділянки (СУК) легкого ланцюга, обрану з групи, що складається з ІЮ МО: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298 і 316.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказане антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який специфічно зв'язується з ІЛ-33, містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (НСУК), що має аминокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з ІЮ МО: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 2901 308.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказане антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, що специфічно зв'язується з ІЛ-33, містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (СУК), що має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з 5БЕО ІЮ МО: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298 і 316.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказане антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, що специфічно зв'язується з ІЛ-33, включає:

Зо (а) домен НСОК'І, що має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з

ЗЕО ІЮ МО: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292 і 310; (б) домен НСОК2, має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з ЗЕО

ІО МО: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294 і 312; (с) домен НСОКЗ, що має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з

ЗЕО ІО МО: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296 і 314; (4) домен ГСОКІ, що має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з

ЗЕО ІЮ МО: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284 і 318; (є) домен І! СОК2, що має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з

ЗЕО ІЮ МО: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286 і 320; () домен ГСОКЗ, що має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з

ЗЕО ІЮ МО: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288 і 322.

В одному варіанті реалізації цього винаходу, вказане антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який специфічно зв'язується з ІЛ-33, містить пару амінокислотних послідовностей

НСМКЛ СУК, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298 і 308/316.

Цей винахід включає також застосування антагоніста ІЛ-33 окремо або в комбінації з антагоністом ІЛ-4Р у виробництві лікарського засобу для лікування захворювання або розладу, пов'язаного з або викликаного активністю або сигналінгом ІЛ-33 та/або ІЛ -4 у пацієнта. В одному варіанті реалізації цього винаходу вказане захворювання або розлад, пов'язаний або викликаний активністю ІЛ-33 та/або активністю ІЛ-4 у пацієнта, є запальним захворюванням або розладом, причому запальне захворювання або розлад вибране із групи, що складається з астми (еозинофільної або нееозинофільної), хронічного обструктивного захворювання легень (ХОЗЛ), синдрому перекриття астми і ХОЗЛ (АСОС), атопічного дерматиту, поліпів носа, алергічної реакції, хронічного бронхіту, емфіземи, хронічного риносинуситу з або без поліпів носа, запального захворювання кишечника, хвороби Крона, виразкового коліту, гіперчутливого пневмоніту, розсіяного склерозу, артриту (включаючи остеоартрит, ревматоїдний артрит і бо псоріатичний артрит), алергічного риніту, фіброзу, еозинофільного езофагіту, васкуліту,

кропив'янки, синдрому Чорджа Строса, запального болю і псоріазу. Цей винахід також включає терапевтично ефективну кількість антагоніста ІЛ-33 в поєднанні з терапевтично ефективною кількістю антагоніста ІЛ-АР для застосування при лікуванні запального захворювання або розладу, або щонайменше одного симптому запального захворювання або розладу, причому введення антагоніста ІЛ-33 у поєднанні з антагоністом ІЛ-АР, призводить до підвищення терапевтичної ефективності порівняно 3з тим, що спостерігається при введенні окремо антагоніста ІЛ-33 або окремо антагоніста ІЛ-4Р. Будь-який з обговорюваних в цьому документі способів також охоплює застосування ІЛ-33 та/або ІЛ-4Р антагоністів (напр.антитіл) для лікування, або для терапії захворювань, розладів та/або симптомів, що обговорюються стосовно методів.

Інші варіанти реалізації цього винаходу будуть очевидні з огляду наступного докладного опису.

КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР

На Фіг. 1 показані чотири ілюстративні схеми окремих компонентів антагоністів ІЛ-33 один відносно одного. Панель А показує схему, в якій перший ІЛ-ЗЗ-зв'язуючий домен (01) приєднаний до М-кінця першого домену мультимеризації (М1), ії другий ІЛ-33-зв'язуючий домен (02) приєднаний до М- кінця другого домену мультимеризації (М2). 01 показаний білим квадратом, а 02 показаний чорним квадратом, що вказує, що 01 і 02 походять від різних ІЛ-33 зв'язуючих протеїнів. Панель В показує розташування, в якому перший ІЛ-33-зв'язуючий домен (01) приєднаний до М-кінця першого домену мультимеризації (М1), і другий ІЛ-З33-зв'язуючий домен (02) приєднаний до С- кінця другого домену мультимеризації (М2). 01 показаний білим квадратом, а 02 показаний чорним квадратом, що вказує, що 01 і 02 походять від різних ІЛ-33 зв'язуючих протеїнів. Панелі С ії ЮО демонструють схему, що включає чотири ІЛ-ЗЗ-зв'язуючі домен, О1, 02, 03 і 04. У цих схемах Ю3-01-М1 і 04-02-М2 об'єднані в тандемі, причому ОЗ приєднаний до М-кінця О1, і 01 приєднаний до М-кінця МІ; і 04 приєднаний до М-кінця 02, і 02 приєднаний до М-кінця М2. На панелі С 03 їі 04 ідентичні або суттєво ідентичні один одному, і р1 ії 02 ідентичні або суттєво ідентичні один одному. На панелі 0, 01 і 04 ідентичні або суттєво ідентичні один одному, і ОЗ і 02 ідентичні або суттєво ідентичні один одному.

На Фіг. 2 показано, що експозиція до НОМ індукує подібне збільшення активних еозинофілів

Зо в легенях ІЛ-33-, ІЛ-4- і ІЛ-4Ра-потрійно гуманізованих мишей і мишей дикого типу. Статистичну значущість визначали двофакторним АМОМА з тестом множинного порівнянь Тьюкі. Для позначення статистично значущих відмінностей були використані наступні символи: зірочкою """ позначають порівняння між мишами, яким вводили фізіологічний розчин і НОМ, одного генотипу; "4" символом амперсанд позначають порівняння з відповідною групою мишей дикого типу, підданих впливу фізіологічного розчину або НОМ. Збільшення числа символів вказує на збільшення значення: 1х-рх0.05; 2х х р«0,01; Зх-р«х0,001; 4х-:р«х0,0001. Скорочення: УМТ - дикий тип. Всі миші мали змішаний фенотип С57ВІ /МТас/1295655ЕмТас.

На Фіг. З показно, що комбіноване введення КЕСМ3500 і дупілумабу блокує індуковане експозицією до НОМ збільшення відносної ваги легень. Відносна вага легень виражається як відношення сирої маси легень (в мг) до маси тіла (в г). Статистичну значущість визначали за допомогою однофакторного АМОМА Крускала-Уолліса з тестом множинного порівняння Данна за отриманими результатами. Наступні символи були використані для позначення статистично значущих відмінностей: зірочка "" позначає порівняння між усіма групами 19-тижневого експозиції до НОМ; і "" хештеги позначають порівняння тварин, підданих впливу фізіологічного розчину, інтактних тварин з усіма іншими групами. Збільшення числа символів вказує на збільшення значення: їх:р«х0.05; 2херх0,01; Зх-рх0,001. Скорочення: м/К - тиждень; ІдО4Р - ізотипне контрольне антитіло, КЕСМ1945.

Нафіїг. 4А і 48 показано ефект КЕОМ3500 і дупілумабу, окремо і в комбінації, на індуковану експозицією до НОМ еозинофильну інфільтрацію легеневь. Статистичну значущість визначали за допомогою однофакторного АМОМА Крускала-Уолліса з тестом множинного порівняння

Данна по отриманих результатах. Наступні символи використовувалися для позначення статистично значущих відмінностей: зірочки "" позначають порівняння між усіма групами 19- тижневої експозиції до НОМ; хештеги "Ж" позначають порівняння тварин, підданих впливу фізіологічного розчину, інтактних тварин, з усіма іншими групами; і "«" знаком плюс позначають порівняння групи 11-тижневої експозиції до НОМ, інтактних тварин з усіма іншими групами.

Збільшення числа символів вказує на збільшення значення: їх-рх0.05; 2х - р«х0,01; Зх: рх0,001; ахер«х0,0001. Скорочення: м/К - тиждень; Ідс4Р « ізотипне контрольне антитіло, ВЕСМ1945.

На Фіг. 5 показано, що КЕСМ3500, окремо або в поєднанні з дупілумабом, блокує індуковану експозицією до НОМ інфільтрацію легень 512004: Т-клітинами. Статистичну значущість бо визначали за допомогою однофакторного АМОМА з тестом множинного порівняння Тьюкі по отриманих результатах. Наступні символи використовувалися для позначення статистично значущих відмінностей: зірочки "" позначають порівняння між усіма групами 19-тижневої експозиції до НОМ; хештеги "2" позначають порівняння тварин, підданих впливу фізіологічного розчину, інтактних тварин, з усіма іншими групами; і "«" знаком плюс позначають порівняння групи 11-тижневої експозиції до НОМ, інтактних тварин з усіма іншими групами. Збільшення числа символів вказує на збільшення значення: їх-рх0.05; 2х-р«х0,01; Зх:р«х0,001; 4х-:р«х0,0001.

Скорочення: м/кК - тиждень; ІдС4Р «- ізотипне контрольне антитіло, ВЕСМ1945.

На Фіг. 6 показано, що комбіноване введення КЕСМ3500 і дупілумабу блокує індуковане експозицією до НОМ підвищення рівня протеїну МРО в легені, маркера нейтрофільної інфільтрації. Статистичну значущість визначали за допомогою однофакторного АМОМА

Крускала-Уолліса з тестом множинного порівняння Данна по отриманих результатах. Наступні символи були використані для позначення статистично значущих відмінностей: зірочка "-" позначає порівняння між усіма групами 19-тижневої експозиції до НОМ; і "Ж" хештеги позначають порівняння тварин, підданих впливу фізіологічного розчину, інтактних тварин з усіма іншими групами. Збільшення числа символів вказує на збільшення значення: 1х-р«х0.05; 2хЕр«х0,01; Зхер«0,001. Скорочення: м/к - тиждень; ІДС4Р - ізотипне контрольне антитіло,

ВЕСМІ1945.

На Фіг. 7А і 7В показано вплив КЕСОМ3500 і дупілумабу, окремо або в комбінації, на індуковане експозицією до НОМ підвищення рівня протеїну ІЛ-5 і ІЛ-6 в легені. Легені (верхню і середню частки правої легені) збирали, а рівні протеїнів ІЛ-5 (А) і ІЛ-6 (В) вимірювали за допомогою мультиплексного імуноаналізу. Рівні протеїнів ІЛ-5 і ІЛ-6 тканини легень виражали як кількість протеїну (пг) на легеневу частку. Статистичну значущість визначали за допомогою однофакторного АМОМА Крускала-Уолліса з тестом множинного порівняння Данна по отриманих результатах. Наступні символи були використані для позначення статистично значущих відмінностей: зірочка "" позначає порівняння між усіма групами 19-тижневої експозиції до НОМ; і "" хештеги позначають порівняння тварин, підданих впливу фізіологічного розчину, інтактних тварин з усіма іншими групами. Збільшення числа символів вказує на збільшення значення: Іх-р«0.05; 2хер«х0,01; Зхер«х0,001. Скорочення: м/к - тиждень; Ідс4Р - ізотипне контрольне антитіло, КЕСМ1945.

Зо На Фіг. 8 показано, що КЕСМ3500 окремо або у поєднанні з дупілумабом блокує індуковане експозицією до НОМ підвищення рівнів циркулюючого протеїна 5АА. Через чотири дні після останньої ін'єкції антитіл цільну кров збирали серцевою пункцією і виділяли сироватку. Рівні циркулюючого протеїна 5АА вимірювали, використовуючи комерційно доступний набір ЕГІЗА.

Рівні циркулюючого протеїна ЗБАА виражені як кількість протеїна ЗАА (мкг) на мл сироватки.

Статистичну значущість визначали за допомогою однофакторного АМОМА Крускала-Уолліса з тестом множинного порівняння Данна по отриманих результатах. Наступні символи були використані для позначення статистично значущих відмінностей: зірочка "" позначає порівняння між усіма групами 19-тижневої експозиції до НОМ; і "Ж" хештеги позначають порівняння тварин, підданих впливу фізіологічного розчину, інтактних тварин з усіма іншими групами. Збільшення числа символів вказує на збільшення значення: Іх-р«к0.05; 2х:р«кО0,01;

Зхер«0,001. Скорочення: м/кК - тиждень; Ід «- ізотипне контрольне антитіло, ВЕСМ1945.

На Фіг. 9 показано, що рівні циркулюючого протеїна (ДЕ збільшуються у відповідь на експозицію до НОМ. Цільну кров збирали серцевою пункцією і виділяли сироватку. Рівні циркулюючого протеїна ІДЕ вимірювали, використовуючи комерційно доступний набір ЕГІ5А.

Рівні циркулюючого протеїна ІДЕ виражені як кількість протеїна ІДЕ (мкг) на мл сироватки.

Статистичну значущість визначали за допомогою однофакторного АМОМА Крускала-Уолліса з тестом множинного порівняння Данна по отриманих результатах. Наступні символи були використані для позначення статистично значущих відмінностей: зірочка "" позначає порівняння між усіма групами 19-тижневої експозиції до НОМ; і "Ж" хештеги позначають порівняння тварин, підданих впливу фізіологічного розчину, інтактних тварин з усіма іншими групами. Збільшення числа символів вказує на збільшення значення: Іх-р«к0.05; 2х:р«кО0,01;

Зхер«0,001. Скорочення: м/кК - тиждень; ІдС4Р «- ізотипне контрольне антитіло, ВЕСМ1945.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС СУТІ ВИНАХОДУ

Перед описом цього винаходу слід розуміти, що цей винахід не обмежується конкретними методами і описаними експериментальними умовами, оскільки такі способи і умови можуть змінюватися. Слід також розуміти, що термінологія, що використовується в цьому описі, призначена тільки для опису конкретних варіантів реалізації цього винаходу, і не є обмежуючою, оскільки обсяг цього винаходу обмежений тільки доданою формулою винаходу.

Якщо не зазначено інше, всі технічні та наукові терміни, що використовуються в цьому бо документі, мають те ж саме значення, яке зазвичай розуміється фахівцем у цій галузі, до якої належить цей винахід. Як використовується в цьому документі, термін "приблизно", коли він використовується у зв'язку з наведеним конкретним числовим значенням, означає, що значення може змінюватися від вказаного значення не більше ніж на 195. Наприклад, як використовується в цьому документі, вираз "приблизно 100" включає 99 і 101 і всі значення між ними (напр.99,1, 99,2, 99,3, 99,4 і т.д.).

Хоча будь-які способи і матеріали, подібні або еквівалентні описаним в цьому документі, можуть бути використані в практиці або тестуванні цього винаходу, зараз описані бажані способи і матеріали. Всі патенти, заявки та не патентні публікації, згадані в цьому описі, включені в цьому документі у вигляді посилання у повному об'ємі.

Визначення

Терміни "Інтерлейкін-33", "ІЛ-33" і т.п., як використовуються в цьому документі, стосуються протеїна ІЛ-33 людини і охоплюють непроцесований повно розмірний ІЛ-33 з 270 амінокислотами (див., наприклад, ЗЕО ІЮ МО: 348, або номер доступу ОпіРгоїкВ 095760), а також будь-яку форму ІЛ-33, що є результатом процесингу в клітині (див., наприклад, ЗЕО ІЮ

МО: 349, що містить амінокислотні залишки 112-270 повнорозмірного протеїна). Інші процесовані форми ІЛ-33 описані в І еїгапсаї5, та ін. (І еїгапсаїв5, еї аї., (2012), Ргос. Маї!. Асаа.

Зсі. 109 (5): 1693-1678). Вказаний термін також охоплює варіанти ІЛ-33, природного походження, наприклад, сплайс-варіанти (див., наприклад, Нопо, еї. аї., (2011), У. Віої. Спет. 286 (22): 20078-20086, або), або алельні варіанти, або будь-яка інша ізоформа ІЛ-33, така як описана в УМО2016/156440. Всі посилання на протеїни, поліпептиди і фрагменти протеїнів у цьому документі призначені для позначення варіанту відповідного протеїну людини, поліпептиду або фрагмента протеїну, якщо явно не вказано, що він походить від виду, що не є людиною.

Термін "антагоніст ІЛ-33", як використовується в цьому документі, означає будь-який агент, який здатний блокувати, послаблювати або іншим чином перешкоджати сигналінгу ІЛ-33 та/або взаємодії між ІЛ-33 і рецептором клітинної поверхні (напр., 512, також відомий як ІЛІКІ1) або ко-рецептором (напр. ІЛІ-КАсР), або їхнім комплексом. Наприклад, "антагоніст ІЛ-33", який також називають "інгібітором ІЛ-33", або "Слокатором ІЛ-33" включає будь-який з наступного: (1) агент, який зв'язується з ІЛ або взаємодіє з ІЛ-33; або (2) агент, який зв'язується з рецептором

Зо ІЛ-33 або взаємодіє з ним (іноді його називають "пригніченням туморогенності" або "5Т2"; також відомий як "ПІ 1КІ 1"); або (3) агент, який зв'язується або взаємодіє з ко-рецептором ІЛ-33 (акцесорний протеїн рецептора інтерлейкіну-1 або ІІ/1-КАсР); або (4) агент, який зв'язується з комплексом ІЛ-33/5Т12; або (5) агент, який зв'язується з 5Т2/ЛІ 1-КАсСР або взаємодіє з ним. Будь- яке з вищезазначених може призвести до інгібування або послаблення принаймні однієї біологічної активності ІЛ-33, такої як, але не обмежуючись цим, біологічна сигнальна функція, яка виникає при зв'язуванні ІЛ-33 з рецепторним/корецепторним комплексом.

В одному варіанті реалізації цього винаходу "антагоніст ІЛ-33" є антитілом, яке специфічно зв'язується з ІЛ-33 або взаємодіє з ним і запобігає зв'язуванню ІЛ-33 з 512 і таким чином запобігає взаємодії 512 з ко-рецептором ІІ -1КАсСР. В одному варіанті реалізації цього винаходу, "антагоніст ІЛ-33" є антитілом, яке специфічно зв'язується або з 512, або з комплексом ЗТ2ЛІ - 1ТКАСР, і запобігає зв'язуванню ІЛ-33 з 5Т2 або з рецепторним комплексом 5Т2/Л1-КАсР. В одному варіанті реалізації цього винаходу, "антагоніст ІЛ-33" є антитілом, яке зв'язується з комплексом ІЛ-33/512 і потім перешкоджає взаємодії 512 з ко-рецептором І -1КАсР. В одному варіанті реалізації цього винаходу, "антагоніст ІЛ-33" є антитілом, яке зв'язується з ІЛ-33 і забезпечує низько афінне зв'язування з 512, але в той же час, таке низько афінне зв'язування може перешкоджати подальшій взаємодії 512 з ко-рецептором 1І--1НАсР. "Антагоніст ІЛ-33" може також бути агентом, таким як розчинний рецептор 512, або пасткою на основі рецептора ІЛ-33, такі як описані в цьому документі і розкриті в О52014/0271642. Будь- який агент, який блокує ІЛ-33-опосередковану сигналізацію, вважається "антагоністом ІЛ-33".

Вказаний "антагоніст ІЛ-33" може представляти собою невелику органічну молекулу, протеїн, такий як антитіло або його фрагмент, або розчинну пастку на основі рецептора ІЛ-33 (як описано в цьому документі), або нуклеїнову кислоту, таку як антисмислова молекула або 5ікмМА.

Як використовується в цьому документі, "антитіло, яке зв'язує ІЛ-33" або "анти-ІЛ-33 антитіло", включає антитіла і їх антиген зв'язуючі фрагменти, які зв'язують протеїн ІЛ-33 людини або його біологічно активний фрагмент (наприклад, Див. 5ЕО ІЮ МО: 348, 349, 350 і 351).

Вираз "рецептор інтерлейкіну-4" або "ІЛ-4Р", що використовується в цьому документі, стосується ІЛ-4Ра рецептора людини, що має амінокислотну послідовність з БЕО ІЮО МО: 347.

Як використовується в цьому документі, "антагоніст ІЛ-АР" (також згадуваний тут як "інгібітор

ІЛ-4Р", "антагоніст ІЛ-4Р а", "блокатор ІЛ-4Р", "блокатор ІЛ-4Р а"), тощо) є будь-яким агентом, 60 який зв'язується або взаємодіє з ІЛ-4Р а або лігандом ІЛ-4Р, і інгібує або послаблює нормальну біологічну сигнальну функцію рецептора 2 ІЛ-4 типу 1 та/або типу. Рецептор ІЛ-4 типу 1 є димерним рецептором, що включає ланцюг ІЛ-4Р с і ланцюг ус. Рецептор ІЛ-4 типу 2 є димерним рецептором, що включає ланцюг ІЛ-4Р а і ланцюг ІЛ-13кКа1. Рецептори ІЛ-4 типу 1 взаємодіють з ІЛ-4 і стимулюються ним, тоді як ІЛ-4-рецептори типу 2 взаємодіють як з ІЛ-4, так і з ІЛ-13 і стимулюються ними. Таким чином, вказані антагоністи ІЛ-А4Р, які можуть бути використані у вказаних способах цього винаходу, можуть функціонувати шляхом блокування опосередкованого ІЛ-4 сигналінгу, опосередкованого ІЛ-13 сигналінгу, або опосередкованого як

ІЛ-4-, так ї ІЛ-13- сигналінгу. Вказані антагоністи ІЛ-АР цього винаходу можуть, таким чином, перешкоджати взаємодії ІЛ-4 та/або ІЛ-13 з рецептором типу 1 або 2. Необмежуючі приклади категорій антагоністів ІЛ-АР включають низькомолекулярні інгібітори ІЛ-4Р, аптамери анти-ІЛ- 4Р, інгібітори ІЛ-4Р на основі пептидів (напр.молекули "пептитіла"), "рецепторні тіла" (напр., сконструйовані молекули, що містять ліганд-зв'язуючий домен ІЛ-4Р компонента), і антитіла або антиген-зв'язуючі фрагменти антитіл, які специфічно зв'язують людський ІЛ-4Ра. Як використовується в цьому документі, антагоністи ІЛ-АР, також включають антиген-зв'язуючі протеїни, які специфічно зв'язують ІЛ-4 та/або ІЛ-13.

Вказаний термін "антитіло", як використовується в цьому документі, означає будь-яку антигензв'язуючу молекулу або молекулярний комплекс, що включає щонайменше одну ділянку, що визначає комплементарність (СОК), що специфічно зв'язується або взаємодіє з певним антигеном (напр., ІЛ-33 або ІЛ-4Р). Вказаний термін "антитіло" включає молекули імуноглобуліну, що містять чотири поліпептидні ланцюги, два важкі (Н) ланцюги і два легких (І) ланцюги, зв'язані між собою дисульфідними зв'язками, а також їх мультимери напр., І9М).

Кожний важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (скорочено в цьому документі як НСУК або Мн) і константну ділянку важкого ланцюга. Константна ділянка важкого ланцюга включає три домени, Сн, сн2 і Сн3. Кожний легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (скорочено в цьому документі ГСОМК або Мі) і константну ділянку легкого ланцюга. Вказана константна ділянка легкого ланцюга включає один домен (СіІ1). Вказані Мн і М. ділянки можуть бути додатково поділені на ділянки гіперваріабельності, які називаються ділянками, що визначають комплементарність (СОК5), перемішані з ділянками, які є більш консервативними, що називаються каркасними ділянками (ЕК). Кожна Мн і Мі складається з

Зо трьох СОК і чотирьох ЕК, розташованих від аміно-кінця до карбокси-кінця в наступному порядку: ЕКТ, СОКІ, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ, ЕК. У різних варіантах реалізації цього винаходу

ЕВ-антитіло проти ІЛ-33 (або його антиген-зв'язуюча частина) або антитіло проти ІЛ-АР можуть бути ідентичними до послідовностей зародкової лінії людини або можуть бути природніми або штучно модифікованими. Консенсусна послідовність амінокислот може бути визначена на основі паралельного аналізу двох або більше СОК.

Вказаний термін "антитіло", як використовується в цьому документі, також включає антиген- зв'язуючі фрагменти повних молекул антитіл. Вказані терміни "антиген-зв'язуюча частина" антитіла, "антиген-зв'язуючий фрагмент" антитіла і т.п., як використовується в цьому документі, включають будь-який природний, отриманий з допомогою ферментів, синтетичний або генетично сконструйований поліпептид або глікопротеїн, який специфічно зв'язує антиген для утворення комплексу. Антиген-зв'язуючі фрагменти антитіла можуть бути отримані, напр.від повних молекул антитіл, використовуючи будь-які відповідні стандартні методики, такі як протеолітичне розщеплення або рекомбінантні методи генної інженерії що включають маніпуляцію та експресію ДНК, що кодує варіабельні і додатково константні домени антитіла.

Така ДНК відома і/або легко отримується з, напр., комерційних джерел, бібліотек ДНК (у тому числі, напр. бібліотеки фагових антитіл), або може бути синтезована. Вказана ДНК може бути секвенована і маніпульована хімічно або з використанням методів молекулярної біології, наприклад, для організації одного або декількох варіабельних і/або константних доменів у відповідній конфігурації, або для вставки кодонів, утворення залишків цистеїну, модифікації, додавання або видалення амінокислот і т.д.

Неообмежуючі приклади антиген зв'язуючих фрагментів включають: (ї) аб фрагменти; (ії)

Кав)2 фрагменти; (ії) га фрагменти; (ім) Ем фрагменти; (м) одноланцюгові молекули Ем (5сСЕм); (м) аАб фрагменти; та (мії) мінімальні одиниці розпізнавання, що складаються з амінокислотних залишків, які імітують гіперваріабельну ділянку антитіла (напр. ізольовану ділянку, що визначає комплементарність (СОК), таку як пептид СОКЗ), або пептид з обмеженою конформаційною свободою ЕК3-СОВЗ-ЕК4. Інші сконструйовані молекули, такі як домен-специфічні антитіла, однодоменні антитіла, антитіла з видаленим доменом, химерні антитіла, антитіла з прищепленою СОК, діатіла, триатіла, тетратіла, міні-антитіла, нанотіла (напр. моновалентні нанотіла, бівалентні нанотіла і т.д.), імунофармацевтичні препарати на основі модульного бо протеїна малого розміру (ЗМІР), а також варіабельні ІДЯМАК домени акули, також включені у вираз "антиген-зв'язуючий фрагмент", як використовується у цьому документі.

Антиген-зв'язуючий фрагмент антитіла зазвичай буде включати щонайменше один варіабельний домен. Вказаний варіабельний домен може бути будь-якого розміру або амінокислотного складу і зазвичай буде включати щонайменше одну СОК, яка є суміжною до або в рамці зчитування з однією або більше послідовностями каркасу. У антиген зв'язуючих фрагментах, що мають Мн домен, пов'язаний з Мі доменом, Мн і Мі домени можуть бути розташовані один відносно одного в будь-якому прийнятному порядку. Наприклад, варіабельна ділянка може бути димерною і містити Мн-Мн, Мн-Мі або Мі-Мі димери. Альтернативно, вказаний антиген-зв'язуючий фрагмент антитіла може містити мономерний Мн або Мі домен.

У певних варіантах реалізації цього винаходу антиген-зв'язуючий фрагмент антитіла може містити принаймні один варіабельний домен, ковалентно зв'язаний щонайменше з одним константним доменом. Необмежуючі, ілюстративні конфігурації варіабельних і константних доменів, які можуть бути знайдені в антиген зв'язуючому фрагменті антитіла цього винаходу, включають: (ї) Мн-Сні; (ії) Мн-Сне; (іїї) Мн-СнЗ; (ім) Мн-Сні1і-Сне; (м) Мн-Сн1-Сн2-СнЗз; (мі) Мн-Снаг-

СнЗ; (мії) Мн-Сі; (міїї) Мі-Сн1; (їх) Мі-Снг; (х) Мі-СнЗ; (хі) Мі-Сн1-Сне; (хії) Мі-Сн1і-Сне-СнЗ; (хіїї) Мі-

Сне-СнЗ; і (хім) Мі-Сї. У будь-якій конфігурації варіабельних і константних доменів, включаючи будь-яку з наведених вище зразкових кконфігурацій, вказані варіабельні і константні домени можуть бути або безпосередньо зв'язані один з одним, або можуть бути зв'язані через повнорозмірну або часткову шарнірну або лінкерну ділянку. Шарнірна ділянка може складатися щонайменше з 2 (напр., 5, 10, 15, 20, 40, 60 або більше) амінокислот, що призводить до гнучкого або напівгнучкого зв'язків між сусідніми варіабельними та/або константними доменами в одній поліпептидній молекулі. Більш того, антиген-зв'язуючий фрагмент антитіла цього винаходу може містити гомодимер або гетеродимер (або інший мультимер) будь-якої з конфігурацій варіабельних і константних доменів, перерахованих вище в нековалентній асоціації один з одним і/або з одним або декількома мономерними Ун або Мі доменами (напр., за допомогою дисульфідних(ого) зв'язків (а).

Як і у випадку повних молекул антитіл, антиген-зв'язуючі фрагменти можуть бути моноспецифічними або мультиспецифічними (напр., біспецифічні). Мультиспецифічний антиген-зв'язуючий фрагмент антитіла зазвичай буде включати щонайменше два різних

Зо варіабельних домени, причому кожен варіабельний домен здатний специфічно зв'язуватися з окремим антигеном або з іншим оепітопом на тому ж самому антигені. Будь-який мультиспецифічний формат антитіл, включаючи ілюстративні формати біспецифічних антитіл, описаних у цьому документі, може бути адаптований для використання в контексті антиген- зв'язуючого фрагмента антитіла за цим винаходом з використанням рутинних технологій, доступних в цій галузі техніки. Наприклад, цей винахід включає способи, що включають застосування біспецифічних антитіл, в яких одне плече імуноглобуліну є специфічним для ІЛ- 4Ра або його фрагмента, або імуноглобуліну, специфічного для ІЛ-33, або його фрагмента, і інше плече імуноглобуліну є специфічним для другої терапевтичної мішені або кон'юговане з терапевтичним фрагментом. Ілюстративні біспецифічні формати, які можуть використовуватися в контексті цього винаходу, включають, без обмежень, напр., формати на основі 5сЕм або біспецифічних діатіл, злиття Ідс-5сЕм, подвійний варіабельний домен (0МО) «19, квадрогібридому, виступи -в-западини, звичайний легкий ланцюг (напр., звичайний легкий ланцюг з виступами -в-западини, і т.д.), Сто55Мар, Стго55ЕРарб, (ЗЕЕВО) тіло, лейцинова застібка,

Виобсау, Іс тЛдаг, Раб (РАБ)-ІдО подвійної дії, і Мар: біспецифічні формати (див., напр., Кіевїп та ін... 2012, тАБ5 4:6, 1-11 і посилання, наведені в ньому, для перегляду вищезгаданих форматів). Біспецифічні антитіла також можуть бути сконструйовані з використанням кон'югації пептиду/нуклеїнової кислоти, напр. де амінокислоти, що не зустрічаються в природі, з ортогональною хімічною реактивністю використовуються для отримання сайт-специфічних антитіло-олігонуклеотидних кон'югатів, які потім самостійно збираються в мультимерні комплекси з визначеним складом, валентністю і геометрією. (Див., напр., Ка;апе еї аї.,У. Ат.

Спет. 5ос. (Ериб: Оеєс. 4, 20121).

У певних варіантах реалізації цього винаходу вказані анти-ІЛ-33 і антитіла проти ІЛ-АР цього винаходу є антитілами людини. Вказаний термін "людське антитіло", як використовується в цьому документі, призначений для включення антитіл, які мають варіабельні і константні ділянки, що походять від послідовностей імуноглобуліну зародкової лінії людини. Вказані антитіла людини цього винаходу можуть включати амінокислотні залишки, що не кодуються послідовностями імуноглобулінів зародкової ліні людини (наприклад, мутації, введені випадковим або сайт-специфічним мутагенезом іп міго або шляхом соматичної мутації іп мімо), наприклад, в СОК і, зокрема, СОКЗ. Однак термін "антитіло людини", як використовується в 60 цьому документі, не призначений для включення антитіл, в яких послідовності СОК, що походять з зародкової лінії інших видів ссавців, таких як миші, були прищеплені на каркасні послідовності людські. Вказаний термін включає антитіла, рекомбінантно отримані від ссавця, що не є людиною, або в клітинах ссавця, що не є людиною. Термін не призначений для включення антитіл, виділених або утворених у людини.

Вказані антитіла цього винаходу можуть, в деяких варіантах реалізації цього, бути рекомбінантними антитілами людини. Термін "рекомбінантне антитіло людини", як він використовується в цьому документі, призначений для включення всіх антитіл людини, які отримують, експресуються, створюють або виділяють за допомогою рекомбінантних засобів, таких як антитіла, експресовані з використанням рекомбінантного вектора експресії, трансфікованого в клітину-хазяїна (описано нижче), антитіла, виділені з рекомбінантної, комбінаторної бібліотеки антитіл людини (описаної нижче), антитіла, виділені з тварини (наприклад, мишії, яка є трансгенною для генів імуноглобуліну людини (див., наприклад, ТауїЇог еї аі. (1992) Мисі. Асіа5 ВРев. 20: 6287-6295) або антитіла, отримані, експресовані, утворені або виділені будь-яким іншим способом, який включає сплайсинг послідовностей генів імуноглобуліна людини з іншими послідовностями ДНК. Такі рекомбінантні антитіла людини мають варіабельні і константні ділянки, що походять з послідовностей імуноглобуліну зародкової лінії людини. Однак, в деяких варіантах реалізації цього винаходу, такі рекомбінантні антитіла людини піддаються мутагенезу іп мійго (або, коли для послідовності (Д людини використовуються послідовності трансгенної тварини, соматичний мутагенез іп мімо) і, таким чином, вказані амінокислотні послідовності Мн і Мі ділянок рекомбінантних антитіл є послідовностями, які, одночасно походять від і споріднені з послідовностями Мн і Мі. зародкової лінії людини, можуть не зустрічатись природнім чином в репертуарі зародкової лінії антитіла людини іп мімо.

Антитіла людини можуть існувати у двох формах, що пов'язані з гетерогенністю шарніра. В одній формі молекула імуноглобуліну включає в себе стабільний чотирьох ланцюговий конструкт масою приблизно 150-160 кДа, в якому димери утримуються разом міжланцюговим дисульфідним зв'язком важкого ланцюга. У другій формі вказані димери не зв'язані міжланцюговими дисульфідними зв'язками і утворюється молекула масою приблизно 75-80 кДа, що складається з ковалентно зв'язаного легкого і важкого ланцюга (напів-антитіло). Ці форми надзвичайно важко відокремити навіть після афінної очистки.

Частота появи другої форми в різних інтактних ізотипах ІдсС обумовлена, але не обмежується, структурними відмінностями, пов'язаними з ізотипом шарнірної ділянки антитіла.

Одинарна амінокислотна заміна у вказаній шарнірній ділянці шарніра Ід4 людини може значно зменшити ймовірність появи другої форми (Апааї еї аї. (1993) МоїІесшціаг Іттипоіоду 30: 105) до рівнів, які зазвичай спостерігаються з використанням шарніру (951 людини. Цей винахід включає антитіла, які мають одну або більше мутацій в шарнірі, Сн2 або СнЗ3 ділянка, яка може бути бажаною, наприклад, у отриманні, для поліпшення виходу бажаної форми антитіла.

Вказані антитіла цього винаходу можуть бути ізольованими антитілами. Термін "виділене антитіло", як використовується в цьому документі, означає антитіло, яке було ідентифіковано і виділено та/або отримано зі щонайменше одного компонента його природного середовища.

Наприклад, антитіло, яке було виділене або отримане зі щонайменше одного компонента організму, або з тканини або клітини, в якій вказане антитіло природно існує або виробляється природним шляхом, є "ізольованим антитілом" для цілей цього винаходу. Ізольоване антитіло також включає антитіло іп 5йи в рекомбінантній клітині. Ізольовані антитіла є антитілами, які були піддані щонайменше одному етапу очищення або виділення. Згідно з певними варіантами реалізації цього винаходу, ізольоване антитіло може бути значно очищеним від іншого клітинного матеріалу та/або хімічних речовин.

Цей винахід включає нейтралізацію та/або блокування анти-ІЛ-33 антитіл і ІЛ-4Р. антитіл. "Нейтралізуюче" або "блокуюче" антитіло, як використовується в цьому документі, призначене для позначення антитіла, зв'язування якого з молекулою-мішенню, напр. або ІЛ-33 або ІЛ-4Р: (ї) перешкоджає взаємодії між молекулою-мішенню і або її рецептором (у випадку антитіл проти

ІЛ-33), або її лігандом (у випадку антитіл проти ІЛ-4Р); та/або (ії) призводить до інгібування щонайменше однієї біологічної функції молекули-мішені, напр. сигналінг. Інгібування, викликане нейтралізуючим або блокуючим антитілом проти ІЛ-33 або проти ІЛ-4Р, не обов'язково повинно бути повним за умови, що воно може бути виявлене за допомогою відповідного аналізу.

Антитіла, описані в цьому документі можуть містити одну або більше амінокислотних замін, вставок і/або делецій в каркасних і/або СОК ділянках варіабельних доменів важкого і легкого ланцюгів у порівнянні з відповідними послідовностями зародкової лінії, з яких вказані антитіла були отримані. Такі мутації можуть бути легко встановлені шляхом порівняння амінокислотних 60 послідовностей, описаних в цьому документі, з послідовностями зародкової лінії, доступними,

наприклад, з публічних баз даних послідовностей антитіл. Цей винахід включає антитіла та їх антиген зв'язуючі фрагменти, які походять від будь-якої з описаних в цьому документі амінокислотних послідовностей, де одна або більше амінокислот в межах однієї або більше каркасних і/або СОК ділянок мутували до відповідного(них) залишку(ків) послідовності зародкової лінії, від якої було отримано антитіло, або до відповідного(них) залишку(ків) іншої послідовності зародкової лінії людини або консервативної амінокислотної заміни відповідним залишком(ками) зародкової лінії (такі зміни послідовності згадуються тут в сукупності як "мутації зародкової лінії"). Фахівець у цій галузі техніки, починаючи з послідовностей варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюга, описаних у цьому документі, може легко отримувати численні антитіла і антиген-зв'язуючі фрагменти, які містять одну або більше окремих мутацій зародкової лінії або їх комбінацій. У певних варіантах реалізації цього винаходу всі каркасні та/або СОК залишки всередині Мн та/або Мі доменів мутовані зворотньо до залишків, знайдених у вихідній послідовності зародкової лінії, з якої було отримано антитіло. В інших варіантах реалізації цього винаходу тільки певні залишки мутують зворотньо до вихідної послідовності зародкової лінії, напр. тільки ті мутовані залишки, які виявлені в межах перших 8 амінокислот

ЕК!Т або в межах останніх 8 амінокислот ЕКА4, або тільки ті мутовані залишки, які виявлені в межах СОМК1, СОК2 або СОКЗ. В інших варіантах реалізації цього винаходу один або більше каркасних та/або СОМ залишків мутовані до відповідного залишку(ків) іншої послідовності зародкової лінії тобто послідовність зародкової лінії, яка відрізняється від послідовності зародкової лінії, з якої походить антитіло). Крім того, вказані антитіла цього винаходу можуть містити будь-яку комбінацію двох або більше мутацій зародкової лінії в каркасній і/або СО ділянці, напр., де певні окремі залишки мутовані до відповідного залишку певної послідовності зародкової лінії, в той час як деякі інші залишки, які відрізняються від вихідної послідовності зародкової лінії, збережені або мутовані до відповідного залишку іншої послідовності зародкової лінії. Після отримання, антитіла і антиген-зв'язуючі фрагменти, які містять одну або більше мутацій зародкової лінії можуть бути легко протестовані на одну або більше бажаних властивостей, таких як, поліпшена специфічність зв'язування, підвищена афінність зв'язування, поліпшені або посилені антагоністичні або агоністичні біологічні властивості (за певних умов) зменшена імуногенність і т.д. Антитіла і антиген-зв'язуючі фрагменти, отримані цим загальним способом, включені в цей винахід.

Цей винахід також включає антитіла, що містять варіанти будь-якої з амінокислотних послідовностей НСУМК, І СУ. та/"або СОК, описаних в цьому документі, мають одну або більше консервативних замін. Наприклад, цей винахід включає антитіла, що мають послідовності амінокислот НСМК, І СМУЕ та/або СОК з, напр., 10 або менше, 8 або менше, 6 або менше, 4 або менше, і т.д. консервативними амінокислотними замінами, зв'язаними з будь-якими з амінокислотними послідовностями НСУРЕК, І СМ та/або СОК, описаними в цьому документі.

Термін "епітоп" стосується антигенної детермінанти, яка взаємодіє зі специфічним сайтом зв'язування антигену на варіабельній ділянці молекули антитіла, відомої як паратоп. Один антиген може мати більш ніж один епітоп. Таким чином, різні антитіла можуть зв'язуватися з різними ділянками на антигені і можуть мати різні біологічні ефекти. Епітопи можуть бути конформаційними або лінійними. Конформаційний епітоп утворюється просторово суміщеними амінокислотами з різних сегментів лінійного поліпептидного ланцюга. Лінійний епітоп є таким, що утворюється сусідніми амінокислотними залишками в поліпептидному ланцюзі. За певних обставин епітоп може включати фрагменти сахаридів, фосфорильних груп або сульфонільних груп на антигені.

Термін "суттєва ідентичність" або "суттєво ідентичний", коли мається на увазі нуклеїнова кислота або її фрагмент, вказує на те, що при оптимальному вирівнюванні з відповідними нуклеотидними інсерціями або делеціями з іншою нуклесновою кислотою (або її комплементарним ланцюгом) ідентичність нуклеотидної послідовності щонайменше, приблизно

БО 95 95, і більш бажано, щонайменше, приблизно 96 95, 97 9», 98 95 або 99 95 нуклеотидних основ, як виміряно будь-яким відомим алгоритмом ідентичності послідовності, таким як ЕА5ТА, ВІ А5Т або Сар, як обговорюється нижче. Молекула нуклеїнової кислоти, що має суттєву ідентичність з еталонною молекулою нуклеїнової кислоти, може, в деяких випадках, кодувати поліпептид, що має таку ж або суттєво подібну амінокислотну послідовність, що і поліпептид, який кодується еталонною молекулою нуклеїнової кислоти.

Що стосується поліпептидів, вказаний термін "суттєва подібність" або "суттєво подібний" означає, що дві пептидні послідовності, коли оптимально вирівняні, за допомогою таких програм як САР або ВЕ5ТРЇТ з використанням штрафів за делецію за замовчуванням, мають принаймні 95 95 ідентичності послідовності, ще більш бажано щонайменше 98 95 або 99 95 ідентичності 60 послідовності. Бажано, щоб позиції залишків, які не є ідентичними, відрізнялися консервативними амінокислотними замінами. "Консервативна амінокислотна заміна" є такою, в якій амінокислотний залишок заміщений іншим амінокислотним залишком, що має бічний ланцюг (К-групу) з подібними хімічними властивостями (наприклад, заряд або гідрофобність).

Загалом, консервативна амінокислотна заміна не суттєво змінить функціональні властивості протеїна. У тих випадках, коли дві або більше амінокислотних послідовностей відрізняються одна від одної консервативними замінами, вказаний відсоток ідентичності послідовності або ступінь подібності може бути скоригований в більший бік, щоб виправити консервативний характер заміни. Засоби для здійснення цієї корекції добре відомі фахівцям в цій області. Див., напр., Реагзоп (1994) Меїпод5 Мої. ВіоЇї. 24: 307-331, включена в цей документ шляхом посилання. Приклади груп амінокислот, які мають бічні ланцюги з подібними хімічними властивостями, включають (1) аліфатичні бічні ланцюги: гліцин, аланін, валін, лейцин і ізолейцин; (2) аліфатично-гідроксильні бічні ланцюги: серин і треонін; (3) амідвмісні бічні ланцюги: аспарагін і глутамін; (4) ароматичні бічні ланцюги: фенілаланін, тирозин і триптофан; (5) основні бічні ланцюги: лізин, аргінін і гістидин; (б) кислотні бічні ланцюги: аспартат і глутамат, і (7) сірковмісні бічні ланцюги - цистеїн і метіонін. Бажаними консервативними групами заміщення амінокислот є: валін-лейцин-ізолейцин, фенілаланін-тирозин, лізин-аргінін, аланін- валін, глутамат-аспартат і аспарагін-глутамін. Альтернативно, консервативна заміна являє собою будь-яку зміну, що має позитивне значення в матриці логарифмічної правдивості

РАМ250, розкритої в Соппеї єї аї. (1992) Зсіепсе 256: 1443-1445, включена в цей документ шляхом посилання. "Помірно консервативна" заміна є будь-якою зміною, що має не негативне значення в матриці логарифмічної правдивості РАМ250.

Подібність послідовності для поліпептидів, яка також називається ідентичністю послідовності, зазвичай вимірюється за допомогою програмного забезпечення для аналізу послідовностей. Програмне забезпечення аналізу білків співставляє подібні послідовності, використовуючи параметри схожості, призначені для різних замін, делецій та інших модифікацій, включаючи консервативні амінокислотні заміни. Наприклад, програмне забезпечення СО містить програми, такі як бар і Везнй, які можуть бути використані з параметрами за замовчуванням для визначення гомології послідовності або ідентичності послідовностей між близько спорідненими поліпептидами, такими як гомологічні поліпептиди від

Зо різних видів організмів або між протеїном дикого типу і його мутантним варіантом. Див., напр., осо Версія 6.1. Поліпептидні послідовності також можуть бути порівняні за допомогою РА5ТА з використанням стандартних або рекомендованих параметрів, програма в СО Мегвіоп 6.1.

ЕАЗТА (наприклад, БГАЗТА2 і ЕАБТАЗ) забезпечує вирівнювання і відсоток ідентичності послідовностей областей кращого перекриття між послідовностями запиту і пошуку (Реагхоп (2000) вище). Іншим бажаним алгоритмом при порівнянні послідовності цього винаходу з базою даних, що містить велику кількість послідовностей від різних організмів, є комп'ютерна програма

ВГА5Т, особливо ВІ АЗТР або ТВІ А5ТМ, з використанням параметрів за замовчуванням. Див., напр., Акбспиї еї аї. (1990) 9. Мої. Віої. 215: 403-410 ії Акбспиї еї аї. (1997) Мисієїс Асіа5 Кев5. 25: 3389-402, кожна з яких включена в цьому документі шляхом посилання. "Захворювання або розлад", що використовується в цьому документі, є будь-яким станом, що піддається лікуванню вказаними антагоністами ІЛ-33 ії ІЛ-4 цього винаходу. "Запальне захворювання або розлад", що використовується в цьому документі, стосується захворювання, розладу або патологічного стану, при яких патологія, повністю або частково, походить від, напр., зміни кількості, зміни швидкості міграції або зміни активації клітин імунної системи.

Клітини імунної системи включають, наприклад, Т-клітини, В-клітини, моноцити або макрофаги, вроджені лімфоїдні клітини, антиген-презентуючі клітини (АРС), дендритні клітини, мікроглія,

МК-клітини, нейтрофіли, еозинофіли, тучні клітини або будь-які інші клітини, специфічно пов'язані з імунологією, наприклад, цитокін-продукуючі ендотеліальні або епітеліальні клітини.

Як використовується в цьому документі, в одному варіанті реалізації цього винаходу вказане "запальне захворювання або розлад" є імунним розладом або станом, вибраним з групи, що складається з астми (включаючи астму, стійку до стероїдів, астму, чутливу до стероїдів, еозинофільну астму або не еозинофільну астму), алергії, анафілаксії, розсіяного склерозу, запального розладу кишечника (напр. хвороба Крона або виразковий коліт), хронічного обструктивного захворювання легень (ХОЗЛ, яке може бути або не бути пов'язаним з, частково викликаним або виникнути в результаті впливу цигаркового диму при активному або пасивному курінні), синдрому перекриття астми і ХОЗЛ (АСОБ), еозинофільного езофагіту, хронічного бронхіту, емфіземи, хронічного риносинусита з або без поліпів носа, вовчака, атопічного дерматиту, псоріазу, склеродермії та інших фіброзних захворювань, синдрому Шегрена, васкуліту (синдрому Бечета, гігантоклітинного артеріїту, пурпури Геноха-Шонлейна і синдрому бо Чорджа Штрауса) запального болю і артриту. В одному варіанті реалізації цього винаходу артрит обраний із групи, що складається з ревматоїдного артриту, остеоартриту і псоріатичного артриту.

В одному варіанті реалізації цього винаходу, "запальне захворювання або розлад" є імунним розладом або станом, що включає відповідь типу 1 та/або відповідь типу 2. "Імунна відповідь типу 1" визначається клітинами Т хелперами 1 (Тні) ї Тн17 клітинами, цитотоксичними Т-клітинами, вродженими лімфоїдними клітинами групи 1 і групи З і імуноглобуліном М (І9М), ДА і специфічними класами дос антитіл і цитокінами, включаючи, наприклад, ФНП, ІЛ-1ДВ ї ІЛ-6. Ця ефекторна відповідь опосередковує імунітет до багатьох мікроорганізмів, включаючи бактерії, віруси, гриби і найпростіші. Елементи імунітету 1-го типу також допомагають підтримувати пухлинний імунний нагляд. "Імунна відповідь 2 типу" характеризується СЮО44Т хелперними (Тнг) клітинами, вродженими лімфоїдними клітинами групи 2 ІС), еозинофілами, базофілами, тучними клітинами, ІЛ-4 та/або

ІЛ-13 активованими макрофагами, підкласом антитіл ІДЕ їі цитокінами, включаючи, наприклад,

ІЛ-4, ІЛ -5, ІЛ-9, ІЛ-13, лімфопоетином строми тимусу, ІЛ-25 і ІЛ-33. Імунітет 2-го типу забезпечує захист від великих позаклітинних паразитів, підвищуючи захисні бар'єри. Елементи імунної відповіді типу 2 також допомагають підтримувати метаболічний гомеостаз і посилювати ремоделювання тканини після травми. Цей тип відповіді також може бути ініційований у відповідь на алергени.

Фраза "інгібує або послаблює ІЛ-33-опосередкований сигналінг" як використовується в цьому документі, стосується ступеня, до якого ІЛ-33 стимулює трансдукцію сигналу через його рецептор 512 їі ко-рецептор І--ТКАсСР, що зменшується в присутності антагоніста, такого як антитіло проти ІЛ-33, або пастка ІЛ-33, як описано в цьому документі, відносно ступеня, до якого

ІЛ-33 стимулює трансдукцію сигналу через 512 і І -1КАсР у відсутності антагоніста, такого як антитіло проти ІЛ-33 або пастка ІЛ-33, як описано в цьому документі. Фраза "пригнічує або послаблює ІЛ-4Р-опосередкований сигналінг?, як використовується в цьому документі, стосується ступеня, до якого ІЛ-А4 стимулює трансдукцію сигналу через рецептор ІЛ-4 типу 1 та/або типу 2, що зменшується в присутності антагоніста, такого як антитіло проти ІЛ-4 або ІЛ- 4Р, як описано в цьому документі, відносно ступеня, до якого ІЛ-4 стимулює трансдукцію сигналу через рецептор ІЛ-4 типу 1 та/або 2 типу за відсутності антагоніста, такого як антитіло

Зо проти ІЛ-4 або ІЛ-4Р, як описано в цьому документі. Для дослідження ступеня інгібування зразок обробляли потенційним |інгібітором/антагоністом і порівнювали з контрольним зразком без вказаного інгібітора/антагоніста. Контрольним зразкам, тобто, не обробленим антагоністом, призначають відносні значення 100 95 активності. Інгібування досягається, коли значення активності відносно контролю становить приблизно 90 95, 85 95, 80 95, 75 95, 70 95, 65 95, 60 95, 5596, 5095, 45 95, 40 96, Зо Ус, З0 95, 25 95, або 20 95 або менше. Результат інгібування може включати заздалегідь визначену кількість або відсоток напр., індикатора запалення або дегрануляції клітин, секреції або активації, таких як вивільнення цитокіну. Інгібування трансдукції сигналу ІЛ-33 через 512 і І/-1КАсР може бути визначено шляхом аналізу трансдукції сигналу ІЛ-33 в іп міїго, такого як відомий фахівцям в цій галузі техніки. Крім того, іп мімо аналізи можуть бути використані для визначення, чи є молекула антагоністом 1ІЛ-33.

Наприклад, іп мімо аналіз може бути використаний для оцінки впливу антитіла проти ІЛ-33 на запалення легень у алерген-сенсибілізованих тварин, які є гомозиготними для експресії ІЛ-33 людини. Після сенсибілізації вказаних тварин алергеном підгрупі вказаних тварин вводять або анти- ІЛ-33 антитіло цього винаходу, або негативне антитіло ізотипного контролю. Потім тварин умертвляють і легені відбирають для оцінки клітинних інфільтратів, а також вимірювання цитокінів (1Л-4 і ІЛ-5). Антитіло до 1ІЛ-33, яке є ефективним як антагоніст, повинно продемонструвати тенденцію до зменшення запальних клітин в легені, а також тенденцію до зниження цитокінів, таких як ІЛ-4 і ІЛ-5. Подібні аналізи можна проводити для оцінки здатності антагоніста ІЛ-АР блокувати сигнальну трансдукцію після зв'язування ІЛ-4 з рецептором типу 1 та/або 2 типу іп мімо або іп мімо. Більш того, будь-який з вищезазначених аналізів може бути модифікований з метою порівняння ефектів використання тільки антагоніста ІЛ-33, тільки антагоніста ІЛ-4 або ІЛ-4Р, або ефекту використання комбінації антагоніста ІЛ-33 з антагоністом

ІЛ-4 або ІЛ-4Р разом.

В іншому аспекті, цей винахід пропонує способи зниження частоти прояву або рецидиву астми або ХОЗЛ, або загострення астми або ХОЗЛ у пацієнта, що потребує цього лікування, що включає введення фармацевтичної композиції, яка містить антагоніст рецептора інтерлейкіну-4 (ІЛ-4Р) пацієнту у комбінації з фармацевтичною композицією, що містить антагоніст ІЛ-33. Як використовується у цьому документі, вираз "загострення астми або ХОЗЛ" означає збільшення тяжкості та/або частоти та/або тривалості одного або більше симптомів або ознак астми або 60 ХОЗЛ. "Загострення астми або ХОЗЛ" також включає в себе будь-яке погіршення стану респіраторного здоров'я пацієнта, що вимагає і/або може лікуватись терапевтичним втручанням для астми або ХОЗЛ (наприклад, лікування стероїдами, лікування інгаляційним кортикостероїдом, госпіталізація і т.д.) "Зниження частоти прояву або рецидиву" загострення астми або ХОЗЛ означає, що пацієнт, який отримав фармацевтичні композиції цього винаходу, має меншу кількість загострень астми або ХОЗЛ (тобто, щонайменше, на одне загострення менше) після лікування, ніж до лікування, або не має загострення астми або ХОЗЛ протягом щонайменше 4 тижнів (наприклад, 4, 6, 8, 12, 14 або більше тижнів) після початку лікування фармацевтичною композицією цього винаходу. "Зниження частоти прояву або рецидиву" загострення астми або ХОЗЛ альтернативно означає, що після введення фармацевтичної композиції цього винаходу ймовірність того, що пацієнт має загострення астми або ХОЗЛ зменшується щонайменше на 10 95 (наприклад, 10 95, 15 Фо, 20 9», 2596, ЗО 96, Зо о, 40 95, 45 95, 50 95 або більше) у порівнянні з пацієнтом, який не отримав фармацевтичну композицію цього винаходу. "Фіброзне захворювання або розлад", що використовується в цьому документі, стосується умов, які включають надлишок фіброзної сполучної тканині в тканини або органі. "Фіброз" стосується патологічного процесу, який включає утворення рубця і підвищене утворення позаклітинного матриксу сполучною тканиною у відповідь на пошкодження тканини.

Використовувані в цьому документі приклади "фібротичних захворювань або розладів", які піддаються лікуванню шляхом введення анти-ІЛ-33 і антагоністів ІЛ-А4Р, цього винаходу, включають фіброз легень (напр., ідіопатичний фіброз легень, індукований блеоміцином фіброз легень, індукований азбестом фіброз легень і синдром облітеруючого бронхіоліту), хронічна астма, фіброз, асоційований з гострим пошкодженням легень і гострою легеневою недостатністю (напр., фіброз, індукований бактеріальною пневмонією, фіброз, індукований травмою, фіброз, індукований вірусною пневмонією, фіброз, індукований штучною вентиляцією легень, фіброз, індукований не легеневим сепсисом і фіброз, індукований аспірацією), силікоз, фіброз, індукований опроміненням, хронічне обструктивне захворювання легень (ХОЗЛ, яке може бути або не бути пов'язаним з, викликатись частково або бути спричиненим впливом цигаркового диму в результаті активного або пасивного куріння), склеродермію, очний фіброз, фіброз шкіри (напр., склеродермія), фіброз печінки (напр., цироз печінки, індукований алкоголем

Зо фіброз печінки, неалкогольний стеатогепатит (МАЗН), пошкодження жовчних шляхів, первинний біліарний цироз, індукований інфекцією або вірусом фіброз печінки, аутоїмунний гепатит, фіброз нирок (нирковий), фіброз серця, атеросклероз, рестеноз стента і мієлофіброз. Хоча астма і

ХОЗЛ, загалом, вважаються запальними станами, відомо, що кожен з них також демонструє властивості фіброзних розладів. "Реакція" пацієнта або "реагування пацієнта" на лікування або терапію, наприклад, лікування, що включає антагоніст ІЛ-33 (наприклад, антагоніст, що зв'язує ІЛ-33 або 512), або антагоніст ІЛ-4, стосується клінічної або терапевтичної переваги, наданої пацієнту, який перебуває під ризиком або який має ІЛ-33-опосередкований розлад (наприклад, астму, ХОЗЛ,

АСОБ5, поліпи носа, або фіброз легень, наприклад, ідіопатичний фіброз легень) від або в результаті лікування. Така перевага може включати клітинні або біологічні відповіді, повну відповідь, часткову відповідь, стабільне захворювання (без прогресування або рецидиву) або відповідь з пізнішим рецидивом пацієнта від або в результаті терапії з антагоністом. Спеціаліст, що володіє професійними навичками в цій галузі, легко зможе визначити, чи пацієнт реагує.

Наприклад, пацієнт, що страждає від астми, який реагує на терапію, яка включає антагоніст ІЛ- 33 та/або антагоніст ІЛ-4, може демонструвати видиме та/або вимірне зменшення або відсутність одного або декількох з наведених нижче типових симптомів: рецидивуюча бронхообструкція, кашель, ускладення дихання, напруженість у грудях, симптоми, які виникають або погіршуються вночі, симптоми, що викликаються холодним повітрям, фізичними вправами або впливом алергенів.

Крім того, "підвищена терапевтична ефективність" може бути визначена шляхом оцінки того, чи терапія з комбінацією антагоніста ІЛ-33 плюс антагоніста ІЛ-АР призводить до помітного поліпшення принаймні одного симптому захворювання або розладу, або поліпшення щонайменше принаймні одного з біологічних параметрів, як визначено тут (наприклад, запалення легень, вивільнення цитокіну тощо) при порівнянні з результатами, досягнутими, коли вказаний антагоніст ІЛ-33 або антагоніст ІЛ-АР використовують окремо. Будь-які біологічні показники ефективності, описані в цій заявці, можуть бути використані для визначення терапевтичної ефективності або її посилення.

Антагоністи ІЛ-33 і антагоністи ІЛ-АР

Вказані способи по цьому винаходу включають введення пацієнту, що страждає на запальне бо захворювання або розлад, терапевтично ефективної кількості антагоніста ІЛ-33 у комбінації з терапевтично ефективною кількістю антагоніста ІЛ-4Р.

Антагоністи ІЛ-33.

Термін "інтерлейкін-33 людини" або "ІЛ-33 людини" або "пІЛ-33", або "ІЛ-33" стосується 270 амінокислотного, повнорозмірного, непроцесованого ІЛ-33 (див., наприклад, ЗЕО ІЮ МО: 348, або обліковий номер ОпіРгоїкВ 095760), або його біологічно активного фрагменту, а також будь-якої форми ІЛ-33, яка є результатом процесингу в клітині (див., наприклад, 560 ІЮ МО: 349, який містить амінокислотні залишки 112-270 вказаного повнорозмірного протеїну).

Вказаний термін також охоплює варіанти ІЛ-33, природного походження, наприклад, сплайс- варіанти (див., наприклад, Нопо, еї. а!., (2011), 9. ВіоїЇ. Спет. 286 (22): 20078-20086), або алельні варіанти, або будь-яку іншу ізоформу ІЛ-33, таку як окислені або відновлені форми ІЛ-33, описані в М/О2016/156440. Активність ІЛ-33, яку можна нейтралізувати, інгібувати, блокувати, скасувати, послабити, зменшити або порушити антитілом або його антиген-зв'язуючим фрагментом згідно з цим винаходом, або пасткою ІЛ-33 згідно з цим винаходом, включає, але не обмежується, інгібування сигналінгу, опосередкованого рецептором ІЛ-33, або інгібування запалення, опосередкованого ІЛ-33.

Термін "антагоніст ІЛ-33", що використовується в цьому документі (також згадуваний в цьому документі як "інгібітор ІЛ-33", або "блокатор ІЛ-33") є будь-яким агентом, який інгібує взаємодію ІЛ-33 з одним або кількома його партнерами зв'язування і таким чином може інгібувати ІЛ-33-опосередкований сигналінг. Наприклад, "антагоніст ІЛ-33" може зв'язуватися мМабо взаємодіяти з 1Л-33, або з рецептором 1ІЛ-33, який називається "пригнічення туморогенності" ("5Т2"), або з ко-рецептором ІЛ-33, який називають "акцесорним протеїном рецептора інтерлейкіну-! ("І -1КАсР"), або з комплексом будь-якого з наступного: ІЛ-33/5Т2, або З5Т2ЛІ-1КАСР і таким чином, може інгібувати опосередкований ІЛ-33 сигналінг.

Необмежуючі приклади категорій антагоністів ІЛ-33 включають низькомолекулярні інгібітори

ІЛ-33, або антагоністи рецепторів, або нуклеїнові кислоти, які гибридизуются при жорстких умовах з послідовностями нуклеїнових кислот, що кодують або ІЛ-33, або рецептор ІЛ-33 або ко-рецептор (наприклад, короткі інтерферуючі КМА (5ікМА) або короткі регулярно кластеризовані паліндромні повтори КМА (СКІ5БРАК-КМА або сгеМА), включаючи одиночні направляючі ЕМА (59КМА»в5), що мають сгКМА і послідовність їігасткМА, як описано в Маїї еї аї.

Зо (Зсієпсе. 339: 823-26, 2013), яка включена в цей документ шляхом посилання у повному об'ємі).

Інші антагоністи ІЛ-33 включають протеїни, що містять ліганд-зв'язуючу частину рецептора ІЛ-33 (напр. 512), каркасні ІЛ-33-зв'язуючі молекули (напр., ОАКРІп5, протеїни з НЕАТ повторами, протеїни з АКМ повторами, протеїни з тетратрикопептидним повтором, каркасні конструкти на основі фібронектину та інші каркаси на основі природних протеїнів з повторами тощо. І ив., напр., Воегета апа РіосКійип, 2011, Си. Оріп. Віоїеснпої. 22:849-857 і посилання, наведені в ньому), і анти-ІЛ-33 аптамери або їх частини.

Антитіла проти ІЛ-3З3

Згідно з певними варіантами реалізації цього винаходу, антагоністи або інгібітори ІЛ-33, які можуть бути використані в контексті цього винаходу, є анти-ІЛ-33 антитілами або антиген- зв'язуючими фрагментами антитіл, які специфічно зв'язують ІЛ-33 людини. Ідентифікатори амінокислотних послідовностей для зразкових анти-ІЛ-33 антитіл для використання в описаних в цьому документі способах показані в Таблиці 1, а вказані ідентифікатори послідовності нуклеїнових кислот, що кодують ці ІЛ-33 антитіла, наведені в Таблиці 2.

В одному варіанті реалізації цього винаходу анти-ІЛ-33 антитіла, вказані в цьому документі, для використання у вказаних способах цього винаходу, описані в О59,453,072, включеному в цей документ шляхом посилання.

Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу анти-ІЛ-33 антитіла, що використовуються в способах цього винаходу, специфічно зв'язуються з ІЛ-33. Термін "специфічно зв'язує" або подібні йому, означає, що антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент утворює комплекс з антигеном, який є відносно стабільним за фізіологічних умов.

Способи для визначення того, чи специфічно антитіло зв'язується з антигеном, добре відомі в цій галузі і включають, наприклад, рівноважний діаліз, поверхневий плазмонний резонанс тощо.

Наприклад, антитіло, яке "специфічно зв'язує" ІЛ-33, використовуване в контексті цього винаходу, включає антитіла, які зв'язуються з ІЛ-33 або його біологічно активною частиною з Ко менше, ніж приблизно 1000 нМ, менше, ніж приблизно 500 нМ, менше, ніж приблизно 300 нМ, менше, ніж приблизно 200 нМ, менше, ніж приблизно 100 нМ, менше, ніж приблизно 90 нМ, менше, ніж приблизно 80 нМ, менше, ніж приблизно 70 нМ, менше, ніж приблизно 60 нМ, менше, ніж приблизно 50 нМ, менше, ніж приблизно 40 нМ, менше, ніж приблизно 30 нМ, менше, ніж приблизно 20 нМ, менше, ніж приблизно 10 нМ, менше, ніж приблизно 5 нМ, менше, 60 ніж приблизно 4 нМ, менше, ніж приблизно З нМ, менше, ніж приблизно 2 нМ, менше, ніж приблизно 1 нМ або менше, ніж приблизно 0,5 нМ, як виміряно в аналізі поверхневого плазмонного резонансу. Ізольоване антитіло, яке специфічно зв'язує ІЛ-33 людини, може, однак, мати перехресну реактивність з іншими антигенами, такими як молекули ІЛ-ІЛ-33 від інших видів (які не є людиною).

Згідно з деякими ілюстративними варіантами реалізації цього винаходу, вказаний антагоніст

ІЛ-33 є антитілом проти ІЛ-33 або його антиген-зв'язуючим фрагментом, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (НСУК), варіабельну ділянку легкого ланцюга (СУМ), та/або ділянки, що визначають комплементарність (СОЖК), що включають будь-яку з амінокислотних послідовностей анти-ІЛ-33 антитіл, як викладено в Патенті США Мо 9,453,072 і в Таблиці 1, розкритій в цьому документі. У певних варіантах реалізації цього винаходу вказаний антагоніст

ІЛ-33 є антитілом проти ІЛ-33, що має характеристики зв'язування еталонного антитіла, описаного в Ш59,453,072. В певних варіантах реалізації цього винаходу вказане анти-ІЛ-33 антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмен, який може застосовуватись у вказаних способах цього винаходу включає ділянки, які визначають комплементарність важкого ланцюга (НСОК»5) варіабельної ділянки важкого ланцюга (НСУК), які включають амінокислоту послідовність з ФЗЕО

ІО МО: 274 і ділянки, які визначають комплементарність легкого ланцюга (СОМ) варіабельної ділянки легкого ланцюга (І СУК), які включають амінокислотну послідовність з «ЕО ІЮ МО: 282.

Згідно певних варіантів реалізації цього винаходу вказане анти-ІЛ-33К антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент включає три НСОК (НСОК1, НСОК2 і НСОКЗ) і три І СОК (І СОК1,

ГСОК2 і СО), причому вказана НСОКІ1 включає амінокислотну послідовність з БЕО ІЮ МО: 276, вказана НСОКО2 включає амінокислотну послідовність з «ЕО ІЮ МО: 278; вказана НСОКЗ включає амінокислотну послідовність з БЕО ІЮ МО:280; вказана І! СОКІ1 включає амінокислотну послідовність з «ЕО ІЮ МО: 284; вказана І! СОК2 включає амінокислотну послідовність з БЗЕО ІЮ

МО: 286; і вказана /СОКЗ включає амінокислотну послідовність з ЗЕО ІЮ МО: 288. В інших варіантах реалізації цього винаходу анти-ІЛ-33 антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент містить НСМК, що включає ЗЕО ІО МО: 274, і СУК, що включає 5ЕО ІЮО МО: 282.

В одному варіанті реалізації цього винаходу вказаний антагоніст ІЛ-33 є антитілом проти ІЛ- 33, яке позначене як КЕСМ3500, яке містить НСУК, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ

МО: 274, і СУК, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 282 і ділянки, що визначають

Зо комплементарність важкого ланцюга (НСОК1-НСОН2-НСОКЗ), що мають амінокислотні послідовності БЕО ІЮ МО: 276-278-280, відповідно і ділянки, що визначають комплементарність легкого ланцюга (ГСОМК1-іСОВ82-ІСОКЗ), що мають амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮО МО: 284-286-288, відповідно.

Інші анти-ІЛ-33 антитіла та їх антиген-зв'язуючі фрагменти, які можуть бути використані в описаних в цьому документі способах, розкриті в ЕР1725261, Ш58187596, УМО2011031600,

МО2015099175, МО2015106080 (АМВО2О), О052016/0168242, МО2016/077381, МО2016/077366, або УМО2016/156440, кожне з яких включене в цьому документі шляхом посилання у повному об'ємі.

ІЛ--33 пастки

Згідно з певними варіантами реалізації цього винаходу, антагоністи або інгібітори ІЛ-33, які можуть бути використані в контексті цього винаходу, є пастками на основі рецепторів ІЛ-33, такими як описані в цьому документі.

Описані в цьому документі пастки ІЛ-33 містять, щонайменше, один ІЛ-33-зв'язуючий домен, який містить ІЛ-З33-зв'язуючу ділянку протеїна рецептора ІЛ-33, позначений 512. У деяких варіантах пастка ІЛ-33 додатково містить позаклітинні частини ко-рецептора ІЛ-33, названі акцесорним протеїном рецептора ІЛ-1, або ІЇ-1КАсР. Вказана пастка ІЛ-33 може також містити, щонайменше, один компонент, що мультимеризується, який функціонує для з'єднання різних компонентів пастки один з одним. Вказані різні компоненти пасток ІЛ-33 описані нижче і показані на Фіг.1.

В одному варіанті реалізації цього винаходу, описані в цьому документі ІЛ-33 пастки для використання у вказаних способах винаходу розкриті в 0О52014/0271642 і МО2014/152195, включені в цей документ шляхом посилання у повному об'ємі.

Коротко, вказані ІЛ-33 пастки включають перший ІЛ-33 зв'язуючий домен (01), приєднаний до домену мультимеризації (М). У певних варіантах реалізації цього винаходу, антагоністи ІЛ- 33, вказані у цьому винаході, містять другий ІЛ-33-зв'язуючий домен (02), приєднаний до 01 та/або М. Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу, ЮО1 містить ІЛ-З33-зв'язуючу частину протеїна 5712. Згідно з певними варіантами реалізації цього винаходу, 02 включає позаклітинну частину протеїна 1-1 ВАср.

Окремі компоненти ІЛ-33 пасток можуть бути розташовані один відносно одного різними 60 способами, що призводить до появи функціонально антагоністичних молекул, здатних зв'язувати ІЛ-33. Наприклад, Ю1 та/або Ю2 можуть бути приєднані до М-кінця М. В інших варіантах реалізації цього винаходу 01 та/або 02 приєднані до С-кінця М. В інших варіантах реалізації цього винаходу Ю1 приєднаний до М-кінця 02 ії 02 приєднаний до М-кінця М, в результаті чого відбувається одноосьове злиття, від М- до С-кінця, молекули антагоніста, представленої формулою 01-02-М. Інші орієнтації окремих компонентів розкриті в іншій частині документ на Фіг.1.

Необмежуючі приклади ІЛ-33 пасток для використання у вказаних способах цього винаходу показані в Таблицях За і ЗБ і включають вказані ІЛ-33 пастки, позначені "н5Т2-пЕс," "н5Т2-тЕс, пЗТ2-ПІЛІКАсР-тЕс," "нЗТ2-пІЛІКАсР-пЕс" і "теТ2-тптіЛІКАсрР-тЕс". Вони відповідають 5ЕО ІЮ

МО: 323, 324, 325, 326 і 327, відповідно. Цей винахід включає пастки на основі рецептора ІЛ-33, що мають амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 80 95, 85 95, 90 Уо, 91 Уо, 92 95, 93 Фо, 94 Фо, 95 95, 96 95, 97 Уо, 98 95 або 99 95 ідентичною будь-якій зі ілюстративних пасток на основі рецептора ІЛ-33, викладені в цьому документі (наприклад, 5ЕО ІЮО МО: 323, 324, 325, 326 і 327).

Стандартні молекулярно-біологічні методи (напр., технологія рекомбінантної ДНК) може бути використана для конструювання будь-якої з пасток ІЛ-33 цього винаходу або його варіантів.

Вказані ІЛ-33 пастки для застосування у вказаних способах цього винаходу включають щонайменше один ІЛ-З33-зв'язуючий домен (іноді згаданий тут за назвою "0", "01", "02" тощо). У деяких варіантах реалізації цього винаходу, ІЛ-33-зв'язуючий домен містить ІЛ-З3-зв'язуючу ділянку білка 512. ІЛ-33-зв'язуюча частина протеїна 512 може містити або складатися з цілісного або частини позаклітинного домену білка 5Т2. У деяких варіантах реалізації цього винаходу протеїн 512 є протеїном 5712 людини. "Протеїн 512 людини", як використовується в цьому документі, стосується протеїна 512, як показано в амінокислотах 1-556 номера доступу

МР 057316.3, показаного також як 5ЕБО ІО МО: 352. У певних варіантах реалізації цього винаходу протеїн 512 є протеїном 512 від виду, що не є людиною (напр., 512 миші, 512 мавпи і т.д.). Зразкова ІЛ-З33З-зв'язуюча частина протеїна 512 описана в цьому документі як амінокислотна послідовність ЗЕО ІЮ МО: 328 (що відповідає позаклітинному домену 512 людини Іномер доступу МСВІ К19-5328. МР 057316.31). Інші приклади ІЛ-33-зв'язуючої частини

Зо протеїну 572 викладені в цьому документі як амінокислотна послідовність БЕО ІЮО МО: 329 (що відповідає позаклітинному домену 512 миші (номер доступу МОВІ 527-НЗ32. Р147191).

У деяких варіантах реалізації цього винаходу, ІЛ-33-зв'язуючий домен містить позаклітинну частину протеїна І--1КАсР. У деяких варіантах реалізації цього винаходу протеїн І/-1КАсР є протеїном І--1ТКАсСР людини. Використовуваний в цьому документі "протеїн І--1КАсР людини" стосується протеїна ІІ-1КАсСР, що має амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО: 353. У певних варіантах реалізації цього винаходу вказаний протеїн ІІ -1КАсР є протеїном ІІ-1КАСР від виду, що не є людиною (напр., ІЛ-АКАс миші, ІЛ-1КАс мавпи і т.д.). Зразкова позаклітинна частина протеїна І-1КАсСР викладена в цьому описі як амінокислотна послідовність БЗЕО ІЮ МО: 330 (що відповідає позаклітинному домену І -1КАсР людини номер доступу МСВІ 521-Е359. О9МРНЗІ).

Інший приклад позаклітинної частини білка П/-1КАсР викладений у цьому документі як амінокислотна послідовність БЗЕО ІО МО: 331 (що відповідає позаклітинному домену І-1ВАсР миші (номер доступу МСВІ 521-Е359. 0617301).

Цей винахід включає пастки ІЛ-33, що включають компоненти 01 та/або 02, що мають амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 80 95, 85 95, 90 95, 91 Фо, 92 У, 93 Уо, 94 90, 9595, 96 95, 97 95, 9895 або 9995 ідентичною будь-якій з амінокислотних послідовностей зразкового компонента ІЛ-33-зв'язуючого домену, викладені в цьому документі (напр., «ЕЕ ІЮ

МО: 328, 329, 330 і 331).

Вказані антагоністи ІЛ-33 цього винаходу також містять щонайменше один домен мультимеризації, (іноді згадуваний тут абревіатурою "М", "М1", "М2" і т.д.). Загалом, домен(и) мультимеризації цього винаходу функціону(є)ють для з'єднання вказаних різних компонентів антагоністів ІЛ-33 (напр., вказані(ний) ІЛ-ЗЗ-зв'язуючі(ий) домен(и)) один з одним. Як використовується в цьому описі, "домен мультимеризації" є будь-якою макромолекулою, яка має здатність асоціювати (ковалентно або нековалентно) з другою макромолекулою тієї ж самої або подібної структури або будови. Наприклад, домен мультимеризації, може бути поліпептидом, що включає імуноглобулін Сн3 домен. Необмежуючим прикладом домену мультимеризації, є Ес-частина імуноглобуліну, напр.домен Ес Ідс, вибраний з ізотипів Їдс1,

ІЧО2, ІдОЗ і Ід4, а також будь-який аллотип у кожній групі ізотипу.

Необмежуючі ілюстративні домени мультимеризації, які можуть бути використані в антагоністах ІЛ-33 цього винаходу, включають Ес-ІДО1 людини (ІЮ МО: 332) або Ес миші Ідсга бо (0 МО: 333). Цей винахід включає антагоністи ІЛ-33, що включають М-компоненти, які мають амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 80 95, 85 95, 90 Уо, 91 95, 92 Ую, 93 У, 94 905, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичності до будь-якої зі ілюстративних амінокислотних послідовностей М-компонентів, викладених в цьому документі (напр. ІЮ МО: 332 або 333).

У певних варіантах реалізації цього винаходу, антагоністи ІЛ-33 цього винаходу містять два домени мультимеризації, МІ і М2, де МІ їі М2 ідентичні один одному. Наприклад, М1 може бути

Ес-доменом, що має певну амінокислотну послідовність, і М2 є Ес-доменом з тією ж амінокислотною послідовністю, що і М1.

Окремі компоненти вказаних антагоністів ІЛ-33 цього винаходу (напр., 01, 02, М і т.д.) можуть бути розташовані один відносно одного різними способами. Необмежуючі приклади всіх вищезазначених розташувань схематично проілюстровані на Фіг.1.

Необмежуючі ілюстративні приклади ІЛ-33 пасток для застосування у вказаних методах цього винаходу, що включають два домени мультимеризації (М1 і М2) і чотири ІЛ-33 зв'язуючих домени (01, 02, ОЗ і 04) також показані на Фіг.1, розташування С і 0).

Окремі компоненти вказаних ІЛ-33 пасток по цьому винаходу (напр., 01, 02, МІ, М2 тощо) можуть бути приєднані один до одного безпосередньо (напр., ОЇ та/або 02 можуть бути безпосередньо приєднані до М і т.д.); альтернативно, окремі компоненти можуть бути приєднані один до одного через лінкерний компонент (напр. 01 та/або 02 можуть бути приєднані до М через лінкер, орієнтований між окремими компонентами; 01 може бути приєднаний до 02 через лінкер; і т.д.). У будь-якому з описаних тут розташувань, де один компонент описується як "приєднаний" до іншого компонента, приєднання може бути через лінкер (навіть якщо воно спеціально не позначено). Як використовується в цьому документі, "лінкер' є будь-якою молекулою, яка з'єднує два поліпептидні компоненти разом.

Біологічні характеристики вказаних ІЛ-33 пасток для використання у вказаних способах цього винаходу описані в ШЗ2014/0271642 і в М/О2014/152195, включеному шляхом посилання у повному об'ємі у цьому документі.

Інші антагоністи ІЛ-3З3

Поліпептиди, які зв'язують ІЛ-33 та/або його рецептор (512 та/або ІЛ-1 КАСР) і блокують ліганд-рецепторну взаємодію, розглядаються як антагоністи ІЛ-33 і розкриті в М/О2014/152195, яке включене шляхом посилання у повному об'ємі. Інші агенти, які можуть діяти як антагоністи

Зо ІЛ-33 ї які можуть бути використані у вказаних способах цього винаходу, включають імуноадгезини, пептитіла і розчинний 512 або їх похідні; антитіла проти ІЛ-33 рецепторів (наприклад, анти-5Т2-антитіла, наприклад, АМО-282 (Атдеп) або 5ТІ М15 (дЧап5зеп) або будь- які антитіла проти 512, описані в УМ/О2012/113813, УМО 2013/173761, УМО 2013/165894,

О58,444,987 або 05 7,452,980, які кожне включене в цей документ шляхом посилання у повному об'ємі. Інші антагоністи ІЛ-33 для застосування у вказаних способах цього винаходу включають білки 5Т2-Ес, такі як описані в УМО2013/173761 або УМО 2013/165894, які кожне включене в цей документ у якості посилання у повному об'ємі.

ІЛ-4Р антагоністи

Як використовується в цьому документі, "антагоніст ІЛ-АР" (також згадуваний в цьому документі як "інгібітор ІЛ-4Р", "антагоніст ІЛ-4Раг", "блокатор ІЛ-АР", "блокатор ІЛ-4Ра"), тощо) є будь-яким агентом, який зв'язується або взаємодіє з ІЛ-4Ра або лігандом ІЛ-4Р, і інгібує або послаблює нормальну біологічну сигнальну функцію рецептора 2 ІЛ-4 типу 1 та/або типу. Термін "ІЛ-4Р. людини" або "ПІЛ-4Р", як використовується в цьому документі, стосується ІЛ-4Р, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 347, або її біологічно активний фрагмент. Рецептор ІЛ- 4 типу 1 є димерним рецептором, що включає ланцюг ІЛ-4Р і ланцюг ус. Рецептор ІЛ-4 типу 2 є димерним рецептором, що включає ланцюг ІЛ-4Р і ланцюг ІЛ-13Ка1. Рецептори ІЛ-4 типу 1 взаємодіють з ІЛ-4 і стимулюються ним, тоді як ІЛ-4-рецептори типу 2 взаємодіють як з ІЛ-4, так і з ІЛ-13 і стимулюються ними. Таким чином, вказані антагоністи ІЛ-4Р, які можуть бути використані у вказаних способах цього винаходу, можуть функціонувати шляхом блокування опосередкованого ІЛ-4 сигналінгу, опосередкованого ІЛ-13 сигналінгу, або опосередкованого як

ІЛ-4-, так ї ІЛ-13- сигналінгу. Вказані антагоністи ІЛ-АР цього винаходу можуть, таким чином, перешкоджати взаємодії ІЛ-4 та/або ІЛ-13 з рецептором типу 1 або 2.

Необмежуючі приклади категорій ІЛ-4Р. -антагоністів включають низькомолекулярні ІЛ-4Р - антагоністи, інгібітори експресії або активності ІЛ-4Р на основі нуклеїнової кислоти напр., БівеМА або анти-смислові), молекули на основі пептидів, які специфічно взаємодіють з ІЛ-АР (напр., пептитіла), "рецептор-тіла" (напр. зконструйовані молекули, що включають ліганд-зв'язуючий домен компонента ІЛ-4Р), ІЛ-4Р -зв'язуючі каркасні молекули (напр., ОАКРІп5, протеїни з НЕАТ- повторами, протеїни з АКМ повторами, протеїни з тетратрикопептидними повторами, конструкти каркасів на основі фібронектину та інші каркаси на основі природних протеїнів з 60 повторами тощо. Див., напр., Воегета та РійсКіІпип, 2011, Си. Оріп. Віосїесппої. 22:849-857 і посилання, наведені в ньому), і анти-ІЛ-АР, аптамери або їх частини. Згідно з певними варіантами реалізації цього винаходу, антагоністи або інгібітори ІЛ-4Р, які можуть бути використані в контексті цього винаходу, є анти-ІЛ-АР, антитілами або антиген-зв'язуючими фрагментами антитіл, які специфічно зв'язують ІЛ-4Р людини.

В одному варіанті реалізації цього винаходу анти-ІЛ-4Р -антитіло, яке описано в цьому документі для використання у вказаних способах цього винаходу, є дупілумабом (див. також

Патенти США 7,605,237; 7,608,693 і 9,290,574).

Анти-ІЛ-4Р антитіла

Згідно з деякими ілюстративними варіантами реалізації цього винаходу антагоніст ІЛ-4Р є антитілом проти ІЛ-4Ра або його антиген-зв'язуючим фрагментом, який специфічно зв'язується з ІЛ-4Ра. Термін "специфічно зв'язує" або подібні йому, означає, що антитіло або його антиген- зв'язуючий фрагмент утворює комплекс з антигеном, який є відносно стабільним за фізіологічних умов. Способи для визначення того, чи специфічно антитіло зв'язується з антигеном, добре відомі в цій галузі і включають, наприклад, рівноважний діаліз, поверхневий плазмонний резонанс тощо. Наприклад, антитіло, яке "специфічно зв'язує" ІЛ-4, використовуване в контексті цього винаходу, включає антитіла, які зв'язують ІЛ-4а4 або їх біологічно активну частину з Ко менше, ніж приблизно 1000 нМ, менше, ніж приблизно 500 нМ, менше, ніж приблизно 300 нМ, менше, ніж приблизно 200 нМ, менше, ніж приблизно 100 нМ, менше, ніж приблизно 90 нМ, менше, ніж приблизно 80 нМ, менше, ніж приблизно 70 нМ, менше, ніж приблизно 60 нМ, менше, ніж приблизно 50 нМ, менше, ніж приблизно 40 нМ, менше, ніж приблизно 30 нМ, менше, ніж приблизно 20 нМ, менше, ніж приблизно 10 нМ, менше, ніж приблизно 5 нМ, менше, ніж приблизно 4 нМ, менше, ніж приблизно З нМ, менше, ніж приблизно 2 нМ, менше, ніж приблизно 1 нМ або менше, ніж приблизно 0,5 нМ, як виміряно в аналізі поверхневого плазмонного резонансу. Ізольоване антитіло, яке специфічно зв'язує ІЛ- 4а людини, може, однак, мати перехресну реактивність з іншими антигенами, такими як молекули ІІ -4Ра від інших видів (які не є людиною).

Згідно з деякими ілюстративними варіантами реалізації цього винаходу, вказаний антагоніст

ІЛ-4Р є анти-ІЛ-4Ра антитілом або його антиген зв'язуючим фрагментом, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (НСУК), варіабельну ділянку легкого ланцюга (СУК),

Зо та/лабо ділянки, що визначають комплементарність (СОК), що включають будь-яку з амінокислотних послідовностей анти-ІЛ-4Р антитіл, як викладено в Патенті США Ме7,605,237 і 7,608,693. У певних варіантах реалізації цього винаходу антагоніст ІЛ-4Р є антитілом проти ІЛ- 4Р, що має характеристики зв'язування еталонного антитіла, згаданого в цьому описі як дупілумаб (див. О57,605,237 та 05, 608,693). В певних варіантах реалізації цього винаходу вказане анти-ІЛ-4а антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмен, який може застосовуватись у вказаних способах цього винаходу включає ділянки, які визначають комплементарність важкого ланцюга (НСОК»5) варіабельної ділянки важкого ланцюга (НСУК), які включають амінокислоту послідовність з «ЕО ІЮ МО: 337 і ділянки, які визначають комплементарність легкого ланцюга (СОР) варіабельної ділянки легкого ланцюга (ЇСМК), які включають амінокислотну послідовність з БЕО ІЮ МО: 338. Згідно певних варіантів реалізації цього винаходу вказане анти-

ІЛ-4Р а антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент включає три НСОК (НСОКІ1, НОСОК? і

НСОКЗ) і три ІСОК (1 СОК1, І СО і СОКЗ), причому вказана НСОКІ1 включає амінокислотну послідовність з БЕО ІО МО: 339, вказана НСОК2 включає амінокислотну послідовність з БЕО ІЮ

МО: 340; вказана НСОКЗ включає амінокислотну послідовність з ЗЕО ІЮ МО:341; вказана

ІГСОКІ включає амінокислотну послідовність з 5ЕО ІО МО: 342; вказана /СОК2 включає амінокислотну послідовність з 5ЕО ІЮ МО: 343; і вказана /СОКЗ включає амінокислотну послідовність з БЕО ІО МО: 344. В інших варіантах реалізації цього винаходу анти-ІЛ-4 антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент містить НСУК, що включає 5ЕО ІЮО МО: 337, і | СМУГ, що включає 5ЕО ІЮО МО: 338. В інших варіантах реалізації цього винаходу вказане анти-ІЛ-аР антитіло або його антиген- зв'язуючий фрагмент містить НСМК, що включає 5ЕО ІО МО: 335, і

ІГСМК, що включає 5ЕО ІО МО: 336. В інших варіантах реалізації цього винаходу анти- ІЛ-дР антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга (НС), як викладено в ІЮ МО: 345, і амінокислотну послідовність легкого ланцюга (І С), як викладено в ІЮ МО: 346. Згідно з деякими ілюстративними варіантами реалізації цього винаходу, вказані способи по справжньому винаходу включають застосування анти-ІЛ-4Р а антитіла, згаданого і відомого в цій галузі техніки, як дупілумаб, або його біоеквіваленту.

Дупілумаб містить НСУК, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 337, і СУК, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 338 і ділянки, що визначають комплементарність важкого ланцюга (НСОК1-НСОВ2-НОСОКЗ), мають амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 339- 60 340-341, відповідно і ділянки, що визначають комплементарність легкого ланцюга (СОК1-

І СОВ2- СО), мають амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 342-343-344, відповідно.

Інші анти-ІЛ-4Р а-антитіла, які можуть бути використані в контексті вказаних способів цього винаходу, включають, напр. вказане антитіло, що згадується і відоме в цій галузі техніки як

АМОИЗ317 (Соітеп єї а!., 2010, Ат У Везріг Стії Саге Меа., 181(8): 788-796), або МЕбБІ 9314, або будь-яке з антитіл проти ІЛ-А4Р а, як викладено в Патенті США Ме7,186,809, Патенті США

Ме7,605,237, Патенті США Ме7,638,606, Патенті США Мо 8,092,804 Патент США Мо 8,679,487 або

Патент США Ме8,877,189. рН-залежні характеристики анти-ІЛ-4 та/або анти-ІЛ-33 антитіл

Вказані анти-ІЛ-4Ра і ІЛ-33 антитіла, що використовуються в контексті способів по цьому винаходу, можуть мати рН-залежні зв'язувальні характеристики. Наприклад, анти-ІЛ-4Р. а- антитіло або анти-ІЛ-3З-антитіло для застосування в способах цього винаходу може демонструвати знижене зв'язування з ІЛ-4Р а, або ІЛ-33 відповідно, при кислому рН порівняно з нейтральним рН. Альтернативно, анти-ІЛ-4Р а-антитіло цього винаходу або анти-ІЛ-33-антитіло цього винаходу може проявляти підвищене зв'язування з його антигеном при кислому рн порівняно з нейтральним рН. Вираз "кислий рН" включає значення рН менше приблизно 6.2, напр., приблизно 6,0, 5,95, 5,9, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1, 5,05, 5,0 або менше. Як використовується в цьому документі, вираз "нейтральний рн" означає рН приблизно від 7,0 до приблизно 7,4. Вираз "нейтральний рн" включає значення рН близько 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,351 7,4.

У деяких випадках, "знижене зв'язування з ІЛ-4Р «а при кислому рН порівняно з нейтральним рН", або "знижене зв'язування з ІЛ-33 при кислому рН порівняно з нейтральним рн" виражається через співвідношення значення Ко зв'язування вказаного антитіла з ІЛ-4Р са, або

ІЛ-33, відповідно при кислому рН до значення Ко зв'язування антитіла з ІЛ-4Р а, або ІЛ-33, відповідно при нейтральному рН (або навпаки). Наприклад, антитіло або його антиген- зв'язуючий фрагмент можна вважати таким, що проявляє "знижене зв'язування з ІЛ-4Р «а при кислому рН порівняно з нейтральним рН", або "знижене зв'язування з ІЛ-33 при кислому рн порівняно з нейтральним рі" для цілей цього винаходу, якщо антитіло або його антиген- зв'язуючий фрагмент демонструє коефіцієнт співвідношення Ко кислий/нейтральний приблизно 3,0 або більше. У певних зразкових варіантах реалізації цього винаходу коефіцієнт

Зо співвідношення Ко кислий/ нейтральний для антитіла або антиген-зв'язуючого фрагмента по цьому винаходу може становити близько 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5,6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 111,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 100,0 або більше.

Можуть бути отримані антитіла з рН-залежними характеристиками зв'язування, напр. шляхом скринінгу популяції антитіл для зниженого (або посиленого) зв'язування з певним антигеном при кислому рН порівняно з нейтральним рН. Крім того, модифікації вказаного антиген-зв'язуючого домену на рівні амінокислот можуть давати антитіла з рН-залежними характеристиками. Наприклад, шляхом заміщення однієї або більше амінокислот антиген- зв'язуючого домену (напр. в межах СОК) залишком гістидину може бути отримано антитіло зі зниженим антиген-зв'язуванням при кислому рН щодо нейтрального рН. Як використовується в цьому описі, вираз "кислий рН" означає рН 6,0 або менше.

Біологічні ефекти антагоністів ІЛ-33 та ІЛ-4Р, що застосовуються у комбінованій терапії

Цей винахід включає застосування антагоніста ІЛ-33 в комбінації з антагоністом ІЛ-4Р для лікування запального стану. В одному варіанті здійснення, застосування антитіла проти ІЛ-33 в комбінації з антитілом проти ІЛАК. у моделі фіброзу і запалення легень на тваринах демонструє підвищену ефективність порівняно з результатами, отриманими, коли кожне антитіло застосовується окремо в якості монотерапії.

Наприклад, в описаній тут моделі на тваринах (яка називається моделлю запалення і фіброзу легень під дією кліща домашнього пилу (НОМ) рівень деяких цитокінів в легенях значно підвищений. Це включає підвищення 1ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-6, ІЛ-1Д і МОСР-1. Спостерігалася також тенденція до підвищення рівнів ІЛ-13 ї ФНПс в легенях мишей після введення алергену кліща домашнього пилу. Однак, при тестуванні в цій моделі, комбіноване застосування вказаного антитіла проти ІЛ-33 і антитіла проти ІЛ-АР призводило до зниження рівнів цитокінів ІЛ-4, ІЛ-5,

ІЛ-6, ІЛ-13, ІЛ-1Д, МОР-1 і ФНПа в легенях оброблених мишей. Вплив на рівні цитокінів легень, що спостерігається при поєднанні анти-ІЛ-33 ії анти-ІЛ-4Р антитіл був більшим, ніж терапія будь- яким індивідуальним антитілом при використанні окремо, як показано в Прикладі 4.

Крім того, рівні генів цитокінів, генів хемокінів і генів колагену, включаючи ІЛа4, ІЛІ13З, ІЛб,

Ссі2, ТО, ІЛІЗга? і СоІ24а21, були підвищені у мишей, які отримували алергени домашнього пилу мишей. Відзначалася тенденція до підвищення рівнів ІЛ5, ІЛО, СсіІ11, СсіІ24, Тип, ІЛІГИ, і бо Со5аї1 в цій моделі. Після терапії комбінацією анти-ІЛ-3З-антитіла і анти-ІЛ-4Р. -антитіла спостерігалося значне зниження експресії ІЛб, Ссі2, СсіІ11 ї Ссі24, у порівнянні з рівнями, які спостерігаються при терапії будь-яким з цих антитіл окремо. Також спостерігалася тенденція до зниження ІЛА, ІЛ5, ІЛІ13, ІЛО, Тпиї, Таїтр1, ІЛІг1, ІЛІЗгаг, Со15а1 і Сої24а1 коли мишам вводили анти-ІЛ-33 антитіло плюс анти-ІЛ-4Р. -антитіло, порівняно з терапією будь-яким з цих антитіл окремо.

Інший біологічний ефект, пов'язаний з комбінованим застосуванням анти-ІЛ-33 плюс анти-ІЛ- 4Р антитіл, спостерігався, коли був проведений аналіз на легеневих клітинних інфільтратах в моделі кліща домашнього пилу. Як показано в Прикладі 4, частота еозинофілів, активованих В- клітин, активованих клітин СО8, 5Т2-004-- Т-клітин і співвідношення СО4/СО8 Т-клітин була значно вищою у мишей, які отримували алерген кліщів домашнього пилу. Спостерігалася також тенденція до збільшення частоти активованих СО4-- Т-клітин у легенях мишей, які отримували алерген кліща домашнього пилу. Спостерігалася тенденція до зниження частоти еозинофілів, активованих В-клітин, активованих клітин СО8, 5Т2-204-- Т-клітин і співвідношення СО4/СО8 Т- клітин у мишей, які отримували як анти-ІЛ-33 антитіло, так і анти-ІЛ-4Р -антитіло у порівнянні з тим, що спостерігали, коли будь-яке антитіло застосовувалося окремо.

Крім того, миші, які отримують алерген кліщів домашнього пилу, також демонструють збільшення метаплазії келихоподібних клітин в легенях. Аналогічним чином, у цій моделі на мишах спостерігалося також збільшення консолідації легень (накопичення твердого або рідкого матеріалу в альвеолярному просторі) і субепітеліальний фіброз (надлишок відкладення інтерстиціального колагену під легеневим епітелієм). Лікування цих мишей анти-ІЛ-33 антитілом у комбінації з анти-ІЛ-4Р антитілом призвело до зниження метаплазії келихоподібних клітин і товщини субепітеліального колагену і значного зниження консолідації легень порівняно з результатами коли одне з двох антитіл було використане окремо.

Миші, які отримували алерген кліщів домашнього пилу, також продемонстрували збільшення рівня циркулюючих ІДЕ, а також тенденцію до збільшення Ідс1, специфічних до кліщів домашнього пилу (НОМ). Введення як анти-ІЛ-33 антитіла, так і антитіла проти ІЛ-АР призводило до значного зниження рівнів сироваткового ІДЕ і тенденції до зниження НОМ- специфічних ДОСІ порівняно з рівнями ЗЕ і НОМ-специфічних ІдДС1, що спостерігалися, коли антитіла використовували окремо.

Антагоніст ІЛ-33 і антагоніст ІЛ-4Р, такі як описані тут антитіла для застосування в якості комбінованої терапії для лікування запальних легеневих порушень або станів, можуть інгібувати або послаблювати ІЛ-33-опосередкований сигналінг і ІЛ-АР -опосередкований сигналінг і можуть проявляти одне або більше біологічних властивостей, що спостерігаються в моделі НОМ, описаній в цьому документі, наприклад, (1) зниження рівнів цитокінів, які підвищені у ссавця в результаті експозиції до алергену, напр. ІЛ-4 або ІЛ-5; (2) інгібування запалення легень внаслідок гострої або хронічної експозиції до алергену (напр. кліщі домашнього пилу (НОМ)); (3) зниження клітинної інфільтрації легень, що виникає внаслідок гострої або хронічної експозиції до алергену (напр. кліщі домашнього пилу (НОМ); (4) поліпшення складної легеневої макропатології.

Інгібування ІЛ-33-опосередкованого сигналінгу або ІЛ-А4Р -опосередкованого сигналінгу може бути виміряно в біотестах на основі клітин і означає, що анти-ІЛ-33 антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент або анти-ІЛ-4Р антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент інгібує або зменшує сигнал, що продукується в клітинах, які експресують рецептор ІЛ-33 або рецептор ІЛ-4, і репортерний елемент, який виробляє сигнал, що детектується у відповідь на зв'язування ІЛ-33 або зв'язування ІЛ-4. Наприклад, цей винахід включає антитіла і їх антиген- зв'язуючі фрагменти, які блокують ІЛ-33-опосередкований сигналінг або опосередкований ІЛ-4 сигналінг в клітинах, що експресують 512 людини, або в клітинах, що експресують рецептор ІЛ- 4, відповідно, з ЇСсо менше ніж приблизно 2 нМ, менше ніж приблизно 1 нМ, менше ніж приблизно 900 пМ, менше ніж приблизно 800 пМ, менше ніж приблизно 700 пМ, менше ніж

БО приблизно 600 пМ, менше ніж приблизно 500 пМ, менше ніж приблизно 400 пМ, менше ніж приблизно 350 пМ, менше ніж приблизно 300 пМ, менше ніж приблизно 250 пМ, менше ніж приблизно 200 пМ, менше ніж приблизно 150 пМ, менше ніж приблизно 100 пМ, менше ніж приблизно 90 пМ, менше ніж приблизно 80 пМ, менше, ніж приблизно 70 пМ, менш ніж приблизно 60 пМ, менше ніж приблизно 50 пМ, менше ніж приблизно 40 пМ, менше ніж приблизно 30 пМ, менше ніж приблизно 20 пМ, або менше ніж приблизно 10 пМ, як виміряно в клітинному блокувальному бісаналізі.

Антитіла по цьому винаходу можуть демонструвати один або більше з вищезазначених біологічних ефектів або будь-яку їх комбінацію. Інші біологічні ефекти антитіл цього винаходу будуть очевидні для фахівця в цій області техніки з огляду цього опису, включаючи робочі бо Приклади, наведені в цьому документі. Використання інших антагоністів ІЛ-33 в комбінації з антагоністом ІЛ-4 може демонструвати подібні ефекти.

Фармацевтичні композиції та введення

Цей винахід забезпечує фармацевтичні композиції, що включають антагоністи ІЛ-33, та/або антагоністи ІЛ-АР цього винаходу. Вказані антагоністи ІЛ-33 і антагоністи ІЛ-АР можуть бут приготовлені у вигляді окремих композицій, або вони можуть бути у приготовлені в одній композиції. Фармацевтичні композиції цього винаходу є готуються з відповідними носіями, наповнювачами та іншими агентами, які забезпечують поліпшення переносу, доставки, толерантності тощо. Багато відповідних препаратів можна знайти у рецептурному формулярі, відомому всім фармацевтичним хімікам: Кептіпдіоп'є Рнаптасешіса! бсіепсе5, Маск Рибіїзпіпд

Сотрапу, Еазіоп, РА. Ці формуляції включають, наприклад, порошки, пасти, мазі, желе, воски, масла, ліпіди, ліпідвмісні (катіонні або аніонні) везикули (такі як ГІРОРЕСТІМ'"М, | Ме

Тесппоіодіє5, Сагізрайд, СА), кон'югати ДНК, безводні абсорбційні пасти, емульсії масло-у-воді і вода-в-маслі, емульсії карбоваксу (поліетиленгліколі різних молекулярних мас), напівтверді гелі і напівтверді суміші, що містять карбовакс. Див. також Ромеї! еї аіІ. "Сотрепаїчт ої ехсіріепів ог рагепіега! Топтиіайопв" РОСА (1998) ) Рнагт 5сі Теснпої! 52:238-311.

Вказана доза антитіла, що вводиться пацієнту, може змінюватися в залежності від віку і розміру пацієнта, цільового захворювання, умов, способу введення тощо. Переважна доза зазвичай розраховується відповідно до маси тіла або площі поверхні тіла. Коли антитіло по цьому винаходу використовується для лікування стану або захворювання, пов'язаного з активністю ІЛ-33, та/або ІЛ-4 у дорослого пацієнта, може бути перевагою внутрішньовенне введення антитіла цього винаходу зазвичай в одноразовій дозі від приблизно 0,01 до приблизно 20 мг/кг ваги тіла, більш бажано приблизно від 0,02 до приблизно 7, приблизно від 0,03 до приблизно 5 або від приблизно 0,05 до приблизно З мг/кг ваги тіла. Залежно від тяжкості стану, частоту і тривалість лікування можна корегувати. Ефективні дози і графіки введення антитіл проти ІЛ-33 можуть бути визначені емпірично; наприклад, прогрес пацієнта може контролюватися періодичною оцінкою, і доза регулюватись відповідно. Більше того, міжвидове масштабування доз може бути виконане з використанням добре відомих методів в цій галузі техніки (напр., Могаепії еї аї., 1991, Рпаптасеці. Ке5. 8:1351).

Відомі різні системи доставки, які можуть бути використані для введення фармацевтичної

Зо композиції цього винаходу, напр., інкапсулювання в ліпосоми, мікрочастинки, мікрокапсули, рекомбінантні клітини, здатні експресувати мутантні віруси, опосередкований рецептором ендоцитоз (див., наприклад, УМи еї аї., 1987, 9. ВіоЇ. Спет. 262:4429-4432). Способи введення включають, але не обмежуються ними, внутрішньошкірні, внутрішньом'язові, внутрішньобрюшинні, внутрішньовенні, підшкірні, інтраназальні, епідуральні та пероральні шляхи. Вказану композицію можна вводити будь-яким зручним способом, наприклад, шляхом інфузії або болюсної ін'єкції шляхом абсорбції через епітеліальні або слизові оболонки (наприклад, слизова оболонка порожнини рота, ректальна і слизова оболонка кишечника тощо) і можуть вводитися разом з іншими біологічно активними агентами. Введення може бути системним або місцевим.

Фармацевтична композиція по цьому винаходу може бути доставлена підшкірно або внутрішньовенно стандартною голкою і шприцом. Крім того, що стосується підшкірної доставки, шприц-ручка придатний для доставки фармацевтичної композиції цього винаходу. Такий шприц- ручка може бути багаторазовим або одноразовим. Багаторазовий шприц-ручка зазвичай використовує змінний картридж, який містить фармацевтичну композицію. Після введення всієї фармацевтичної композиції з картриджу і спорожнення картриджу, порожній картридж можна легко викинути і замінити новим картриджем, який містить фармацевтичну композицію. Далі шприц-ручку можна повторно використовувати. На одноразовому шприці-ручці немає змінного картриджа. Точніше, вказаний одноразовий шприц-ручка поставляється попередньо заповненим фармацевтичної композицією, що міститься в резервуарі всередині пристрою. Як тільки резервуар спорожнюється від фармацевтичної композиції, весь пристрій викидається.

Численні багаторазові шприци-ручки і шприц-тюбик мають застосування для підшкірної доставки фармацевтичної композиції по цьому винаходу. Приклади включають, але не обмежуються ними, АШТОРЕМ'"М (Омеп Митіога, Іпс., УмМооавіоскК, ОК), шприц-ручка

РІБЕТКОМІС "м (Пізеїгопіс Медіса! Зуєїетв5, Вегддогії, Швейцарія), шприц-ручка НОМАСОС МІХ 7175/2574, шприц-ручка НОМАГОСс тм, НОМАГСІМ 70/307м шприц-ручка (Еїї ГІЛІу ї Со., Іпаіапароїїв,

ІМ), МОМОРЕМ "М І, ІІ ї П (Ново Нордіск, Копенгаген, Данія), МОМОРЕМ ООМІОК м (Ново Нордіск,

Копенгаген, Данія), ВОМ шприц-реп (Весіоп ОісКіпзоп, ЕгапКійпт ГакКе5, МУ), ОРТІРЕМ "М,

ОРТІРЕМ РКО "М, ОРТІРЕМ 5ТАКІ ЕТ "М ї ОРТІСІ ІК м (санофі-авентіс, Франкфурт, Німеччина), щоб назвати лише декілька. Приклади одноразових шприц-ручок, що мають застосування для 60 доставки фармацевтичної композиції по цьому винаходу, включають, але не обмежуються,

шприц-ручками БОЇ ОТАК "М (санофі-авентіс), ЕГЕХРЕМ "М (Момо Могаі5К) ії КУМІКРЕМ "М (ЕЇЇ).

ПЛІУ), шприц-тюбик ЗОКЕСІІСКтТМ (Атдеп, ТНоизапа ОаК5, СА) РЕМІ'ЕТ"М (Навзеїтвеїіег,

Штутгарт, Німеччина), ЕРІРЕМ (Оеєу, І Р), і НОМІВА "М шприц-ручка (Арбоїй І арх, АБбої Рагк ІЛ), щоб назвати лише декілька.

У певних ситуаціях вказана фармацевтична композиція може бути доставлена в системі контрольованого вивільнення. В одному варіанті реалізації цього винаходу може використовуватися насос (див. І апдег, вище; Зейоп, 1987, СКС Стії. Кеї. Віотеа. Епд. 14:201). В іншому варіанті реалізації цього винаходу можна використовувати полімерні матеріали; див.,Медіса! Арріїсайоп5 ої СопігоПей Кеїеазе, Гапдег апа Умізе (ед5.), 1974, СКС Ргез., Воса

Кап, Ріогіда. Ще в одному варіанті реалізації цього винаходу система контрольованого вивільнення може бути розміщена в безпосередній близькості від мішені композиції, таким чином потрібна лише частка системної дози (див. напр., Сбоойзоп, 1984, Арріїсайоп5 ої

Сопігоїєд Веїєазе, 5зирга, мої. 2, рр. 115-138). Інші системи регульованого вивільнення обговорюються в огляді І апдег, 1990, Зсіепсе 249: 1527-1533.

Препарати для ін'єкцій можуть включати лікарські форми для внутрішньовенних, підшкірних, внутрішньошкірних та внутрішньом'язових ін'єкцій, крапельних інфузій тощо. Ці ін'єкційні препарати можуть бути отримані загальновідомими способами. Наприклад, можуть бути приготовані ін'єкційні препарати, напр. шляхом розчинення, суспендування або емульгування вказаного антитіла або його солі, описаного вище, в стерильному водному середовищі або масляному середовищі, звичайно використовуваному для ін'єкцій. В якості водного середовища для ін'єкцій є, наприклад, фізіологічний розчин, ізотонічний розчин, що містить глюкозу та інші допоміжні агенти і т.д., які можуть бути використані в комбінації з відповідним солюбілізуючим агентом, таким як спирт (наприклад, етанол), поліспирт (наприклад, пропіленгліколь, поліетиленгліколь), неіонні поверхнево-активні речовини (Інаприклад, полісорбат 80, НСО-50 (поліоксиетилен (50 моль) аддукт гідрованої касторової олії) і т.д. В якості масляного середовища використовують, наприклад, кунжутне масло, соєве масло і т.д., які можуть бути використані в комбінації з солюбілізуючим агентом, таким як бензилбензоат, бензиловий спирт і т.д. Отриманою таким чином ін'єкцією бажано наповнити відповідну ампулу.

Переважно, фармацевтичні композиції для перорального або парентерального застосування, описані вище, готуються в лікарських формах в одиничній дозі, придатній для дози прийому вказаних активних інгредієнтів. Такі лікарські форми в одиничній дозі включають, наприклад, таблетки, пігулки, капсули, ін'єкції (ампули), супозиторії та ін. Кількість зазначених вище антагоністів, як правило, становить від приблизно 5 до приблизно 500 мг на лікарську форму в одиничній дозі; особливо у формі ін'єкції, бажано, щоб вищезазначені антагоністи містилися в кількості приблизно від 5 до приблизно 100 мг і приблизно від 10 до приблизно 250 мг для інших лікарських форм.

Дозування

Вказана кількість ІЛ-33 і антагоніста ІЛ-4Р, введеного суб'єкту згідно способів цього винаходу, є, як правило, терапевтично ефективною кількістю. Як використовується в цьому описі, фраза "терапевтично ефективна кількість" означає кількість антагоніста 1Л-33 і антагоніста ІЛ-4Р, яка при використанні в комбінації призводить до значної зміни в одному або більше з наступного: (а) попередження запалення; (Б) лікування або зниження тяжкості запалення; (с) зниження частоти одного або декількох з наступних: еозинофілів, активованих В- клітин, активованих СО8 Т-клітин або співвідношення СО4/СО8 Т-клітин у легенях; (а) зниження одного або більше з наступних: інтерлейкін-1 бета (ІЛ-1рД), інтерлейкін-4 (ІЛ-4), інтерлейкін-5 (ІЛ- 5), інтерлейкін-б (ІЛ-б6), інтерлейкін-13 (ІЛ-13), моноцитарний хемоатрактантний протеїн-1 (МСР- 1) або альфа-фактор некрозу пухлини (ФНПО) рівні в легенях; (є) зниження рівня експресії гена одного або декількох з наступних: ІЛ4, ІЛ5, ІЛб, ІЛО, ІЛІ13, ІЛІгІ1, ІЛІ Згаг, їпї, ТоїтЬ1, Ссі2, Ссі11,

СсіІ24, Со15а1ї або СоІ24а2а1 в легені; ( зниження рівнів сироваткового ІДЕ; (9) зниження метаплазії келихоподібних клітин в легені; або (п) зменшення консолідації легень, як описано в цьому документі. У той час як введення антагоніста ІЛ-33 окремо або антагоніста ІЛ-АР окремо може призводити до позитивного терапевтичного ефекту, виміряного з використанням одного або декількох вищезазначених параметрів, застосування антагоністів ІЛ-33 і ІЛ-АР в комбінації покажуть значне поліпшення (напр. адитивний або синергічний ефект) у будь-якому одному або декількох параметрах порівняно з тим, що спостерігається при використанні монотерапії або тільки антагоністом ІЛ-33, або тільки антагоністом ІЛ-4Р.

У випадку антагоніста ІЛ-33 або антагоніста ІЛ-АР терапевтично ефективна кількість може становити від приблизно 0,05 мг до приблизно 600 мг. напр. приблизно 0,05 мг, приблизно 0,1 мг, приблизно 1,0 мг, приблизно 1,5 мг, приблизно 2,0 мг, приблизно 10 мг, приблизно 20 мг, 60 приблизно 30 мг, приблизно 40 мг, приблизно 50 мг, приблизно 60 мг, приблизно 70 мг,

Зо приблизно 80 мг, приблизно 90 мг, приблизно 100 мг, приблизно 110 мг, приблизно 120 мг, приблизно 130 мг, приблизно 140 мг, приблизно 150 мг, приблизно 160 мг, приблизно 170 мг, приблизно 180 мг, приблизно 190 мг, приблизно 200 мг, приблизно 210 мг, приблизно 220 мг, приблизно 230 мг, приблизно 240 мг, приблизно 250 мг, приблизно 260 мг, приблизно 270 мг, приблизно 280 мг, приблизно 290 мг, приблизно 300 мг, приблизно 310 мг, приблизно 320 мг, приблизно 330 мг, приблизно 340 мг, приблизно 350 мг, приблизно 360 мг, приблизно 370 мг, приблизно 380 мг, приблизно 390 мг, приблизно 400 мг, приблизно 410 мг, приблизно 420 мг, приблизно 430 мг, приблизно 440 мг, приблизно 450 мг приблизно 460 мг, приблизно 470 мг, приблизно 480 мг, приблизно 490 мг, приблизно 500 мг, приблизно 510 мг, приблизно 520 мг, приблизно 530 мг, приблизно 540 мг, приблизно 550 мг, приблизно 560 мг, приблизно 570 мг, приблизно 580 мг, приблизно 590 мг або приблизно 600 мг. У певних варіантах реалізації цього винаходу 75 мг, 150 мг, 200 мг або 300 мг антагоніста ІЛ-АР вводять суб'єкту в комбінації з антагоністом ІЛ-33. У певних варіантах реалізації цього винаходу 75 мг, 150 мг, 200 мг або 300 мг антагоніста ІЛ-33 вводять суб'єкту в комбінації з антагоністом ІЛ-4.

Кількість антагоніста ІЛ-33 або антагоніста ІЛ-4Р, що міститься в індивідуальних дозах, може бути виражена в міліграмах антитіла на кілограм ваги тіла пацієнта (тобто, мг/кг). Наприклад, вказаний антагоніст ІЛ-33 або антагоніст ІЛ-АР можна вводити пацієнту в дозі від приблизно 0,0001 мг/кг до приблизно 25 мг/кг ваги тіла пацієнта. У певних варіантах реалізації цього винаходу кожен з антагоністів ІЛ-АР їі ІЛ-33 може вводитися в дозах приблизно 0,1 мг/кг, 0,3 мг/кг, 1,0 мг/кг, 3,0 мг/кг або 10 мг/кг.

Вказана комбінація антагоніста ІЛ-33 і антагоніста ІЛ-АР може вводитися суб'єкту підшкірно, внутрішньовенно, внутрішньо м'язово або інтраназально. Вони можуть вводитися одночасно або послідовно.

Терапевтичне використання антитіл

Експерименти з використанням модельної системи мишей, проведені авторами цього винаходу, сприяли ідентифікації різних захворювань і станів, які можна лікувати, запобігати і/або полегшувати комбінованим антагонізмом ІЛ-33 і ІЛ-АР. Наприклад, у моделі запалення легень і фіброзу легень, викликаних кліщем домашнього пилу, терапія комбінацією антитіла проти ІЛ-33 і антитіла проти ІЛ-4Р призводила до зниження рівня цитокінів в легенях, зниження легеневих

Зо інфільтратів клітин в легенях (еозинофіли, активовані В-клітини, активовані СО8 позитивні клітини, 52004 Т-клітини і співвідношення СО4/СО8 Т-клітини), а також поліпшення консолідації легень і субепітеліального фіброзу порівняно з результатами, отриманими, коли кожне антитіло використовувалось окремо в якості монотерапії.

Вказані антитіла цього винаходу є ефективними, зокрема для лікування, запобігання та/або полегшення будь-якого захворювання або розладу, пов'язаного з, або опосередкованого експресією ІЛ-33 та експресією ІЛ-4, сигналінгом або активністю, або яке піддається лікуванню шляхом блокування взаємодії між ІЛ-33 і рецептором ІЛ- 33 (напр. 512), або блокування взаємодії між ІЛ-4 і рецептором ІЛ-4, або іншим чином інгібують активність ІЛ-33 і ІЛ-4 та/або сигналінг. У певних варіантах реалізації цього винаходу антагоніст ІЛ-АР є антитілом, яке взаємодії з ІЛ-4Ра або взаємодіючи, блокує сигнальні шляхи як ІЛ-4, так і ІЛ-13 через рецептори

ІЛ-4Р. типу 1 і типу 2. Таким чином, використання цього подвійного антагоніста ІЛ-4 і ІЛ-13 в комбінації з антагоністом ІЛ-33 може забезпечити додаткові клінічні переваги при введенні пацієнтам, які мають запальний стан, опосередкований частково всіма трьома сигнальними шляхами. Наприклад, цей винахід пропонує способи терапії астми (алергічна астма, неалергічна астма, важка рефрактерна астма, загострення астми, стійка до стероїдів астма або стероїдна рефрактерна астма, чутлива до стероїдів астма, еозинофільна астма або нееозинофільна астма і т.д.), хронічного обструктивного захворювання легень (ХОЗЛ) та загострення ХОЗЛ, синдрому перекриття астми та ХОЗЛ (АСОС), хронічного бронхіту, емфіземи, гіперчутливого пневмоніту, атопічного дерматиту, кропив'янки, псоріазу, алергії, алергічного риніту, хронічного риносинуситу з або без поліпів носової порожнини, еозинофільного езофагіту, анафілаксії серцево-судинних захворювань, захворювань центральної нервової системи, болю (включаючи запальний біль), артриту (напр., ревматоїдний артрит, остеоартрит, псоріатичний артрит та ін.), гігантськолітинних артеріїтів, васкуліту (хвороба Бечета і синдром Черджа-Строса), пурпури Шенлейна-Геноха, розсіяного склерозу, запального розладу кишечника (напр. хвороба Крона або виразковий коліт), вовчака, синдрома

Шегрена та інших запальних захворювань або розладів, частково опосередкованих сигналінгом

ІЛ-33 та/або ІЛ-4.

Антитіла по цьому винаходу є також ефективними для терапії, профілактики та/або полегшення одного або більше фіброзних захворювань або розладів. Використовувані в цьому бо документі типові "фібротичні захворювання або розлади", які піддаються лікуванню шляхом введення анти-ІЛ-33 і антагоністів ІЛ-АР, цього винаходу, включають фіброз легень (напр., ідіопатичний фіброз легень, індукований блеоміцином фіброз легень, індукований азбестом фіброз легень і синдром облітеруючого бронхіоліту), фіброз, асоційований з гострим пошкодженням легень і гострою легеневою недостатністю (напр., фіброз, індукований бактеріальною пневмонією, фіброз, індукований травмою, фіброз, індукований вірусною пневмонією, фіброз, індукований штучною вентиляцією легень, фіброз, індукований не легеневим сепсисом і фіброз, індукований аспірацією), силікоз, фіброз, індукований опроміненням, склеродермія, очний фіброз, фіброз шкіри (напр., склеродермія), фіброз печінки (напр., цироз печінки, фіброз печінки, індукований алкоголем, неалкогольний стеатогепатит (МАЗН), пошкодження жовчних шляхів, первинний біліарний цироз, індукований інфекцією або вірусом фіброз печінки, аутоїмунний гепатит, фіброз нирок (нирковий), фіброз серця, атеросклероз, рестеноз стента і мієлофіброз.

У контексті способів лікування, описаних в цьому документі, анти-ІЛ-33 антитіло і антитіло проти ІЛ-4Р можна вводити разом (тобто в якості єдиної схеми терапії) або в комбінації з одним або кількома додатковими терапевтичними агентами (приклади яких описані в інших частинах цього документу).

Комбіновані терапії

Цей винахід включає застосування композицій і терапевтичних формуляцій, що містять будь-який з антагоністів анти-ІЛ-33 і антагоністів ІЛ-4Р, описаних в цьому документі, в комбінації з одним або декількома додатковими терапевтично активними компонентами і способи лікування, що включають введення таких комбінацій суб'єктам, які потребують такого лікування.

Як використовується в цьому документі, вираз "у поєднанні 3" означає, що додаткові терапевтичні агенти вводять до, після або одночасно з фармацевтичною композицією, що містить антагоніст ІЛ-33 і антагоніст ІЛ-АР. Термін "в комбінації з" також включає послідовне або сумісне введення антагоніста ІЛ-4Р і антагоніста ІЛ-33 і одного або декількох додаткових терапевтичних агентів. Цей винахід включає фармацевтичні композиції, в яких антагоніст ІЛ-33 і антагоніст ІЛ-АР по цьому винаходу є у ко-фомуляції з одним або більше додатковим терапевтично активним компонентом.

Наприклад, при введенні "перед" фармацевтичними композиціями, що включають вказаний антагоніст ІЛ-33 і вказаний антагоніст ІЛ-АР, додатковий терапевтичний агент може вводитися приблизно за 72 години, приблизно за 60 годин, приблизно за 48 годин, приблизно за 36 годин, приблизно за 24 години, приблизно за 12 годин, приблизно за 10 годин, приблизно за 8 годин, приблизно за 6 годин, приблизно за 4 години, приблизно за 2 години, приблизно за 1 годину, приблизно за 30 хвилин, приблизно за 15 хвилин або приблизно за 10 хвилин до введення фармацевтичних композицій, що включають антагоніст ІЛ-33 і антагоніст ІЛ-АР. При введенні "після" вказаних фармацевтичних композицій, що містять вказаний антагоніст ІЛ-33 і вказаний антагоніст ІЛ-АР, додатковий терапевтичний агент може вводитися приблизно за 10 хвилин, приблизно за 15 хвилин, приблизно за 30 хвилин, приблизно за 1 годину, приблизно за 2 години, приблизно за 4 годин, приблизно за 6 годин, приблизно за 8 годин, приблизно за 10 годин, приблизно за 12 годин, приблизно за 24 годин, приблизно за 36 годин, приблизно за 48 годин, приблизно за 60 годин або приблизно за 72 години після введення фармацевтичної композиції, що включає вказаний антагоніст ІЛ-33 і вказаний антагоніст ІЛ-АР. Введення "одночасне" або з вказаними фармацевтичними композиціями, що включають вказаний антагоніст ІЛ-33 і вказаний антагоніст ІЛ-АР, означає, що додатковий терапевтичний агент вводиться суб'єкту в дозованій лікарській формі менш ніж за 5 хвилин (до, після або в той же час) введення фармацевтичних композицій, що включають вказаний антагоніст ІЛ-33 і вказаний антагоніст ІЛ-АР, або вводять суб'єкту як єдиний комбінований препарат, що містить як додатковий терапевтичний агент, антагоніст ІЛ-33, так і ІЛ-АР антагоніст.

Додатковим терапевтичним агентом може бути, напр. інший антагоніст ІЛ-33, інший антагоніст ІЛ-4Р, антагоніст ІЛ-1 (у тому числі, напр. антагоніст ІЛ-їЇ, як викладено в 05 6,927,044), антагоніст ІЛ-б, антагоніст ІЛ-6К (у тому числі, напр. анти-ІЛ-6К антитіло, як викладено в 05 7,582,298), антагоніст ІЛ-13, антагоніст ФНП, антагоніст ІЛ-8, антагоніст ІЛ-9, антагоніст ІЛ-17, антагоніст ІЛ-5 (напр. меполізумаб або МОСАГ АФ), антагоніст ІДЕ (напр. омалізумаб або ХОГАЇКФ), антагоніст СО48, антагоніст ІЛ-31 (включаючи, наприклад, як викладено в 05 7 531 637), антагоніст стромального лімфопоетину тимуса (Т5І Р) (включаючи, наприклад, як викладено в 5 2011/027468), інтерферон-гамма (ІЄМу), антибіотики, кортикостероїди (включаючи інгаляційні кортикостероїди, або ІС5), В адренергічні агоністи 2 (АВА) тривалої дії, мускаринові антагоністи тривалої дії (ГАМА), такролімус, пімекролімус, циклоспорин, азатіоприн, метотрексат, кромолін натрію, інгібітори протеїназ, антигістаміни або 60 їх комбінації.

Схеми введення

Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу, багаторазові дози антагоніста ІЛ-33 і антагоніста ІЛ-АР (або фармацевтична композиція, що включає комбінацію антагоніста ІЛ-33, антагоніста ІЛ-4Р і будь-якого з додаткових терапевтично активних агентів, згадані в цьому документі), можуть вводитися суб'єкту протягом визначеного часу. Вказані способи згідно з цим аспектом цього винаходу включають послідовне введення суб'єкту декількох доз антагоніста ІЛ- 33 і антагоніста ІЛ-АР цього винаходу. Як використовується в цьому документі, "послідовне введення" означає, що кожна доза вказаного антагоніста ІЛ-33 і вказаного антагоніста ІЛ-АР вводиться суб'єкту в різний момент часу, напр., в різні дні, розділені заздалегідь заданим інтервалом (напр., години, дні, тижні або місяці). Цей винахід включає способи, які включають послідовне введення пацієнту однієї початкової дози антагоніста ІЛ-33 і антагоніста ІЛ-4Р, за яким слідують одна або більше вторинних доз вказаного антагоніста ІЛ-33 ї вказаного антагоніста ІЛ-4Р, і потім додатково одна або декілька третинних доз вказаного антагоніста ІЛ- 33 і вказаного антагоніста ІЛ-4Р.

Терміни "початкова доза", "вторинні дози" і "третинні дози" стосуються часової послідовності введення антагоніста ІЛ-33 і антагоніста ІЛ-4Р цього винаходу. Таким чином, "початкова доза" є дозою, яку вводять на початку схеми лікування (також називають "базовою дозою"); "вторинні дози" - це дози, які вводять після вказаної початкової дози; і "третинні дози" являють собою дози, які вводять після вказаних вторинних доз. Вказані початкова, вторинні і третинні дози можуть містити однакову кількість антагоніста ІЛ-33 і антагоніста ІЛ-4Р, але зазвичай можуть відрізнятися один від одного за частотою введення. Однак, в деяких варіантах реалізації цього винаходу, вказана кількість антагоніста ІЛ-33 і антагоніста ІЛ-АР, що міститься в початкових, вторинних і/або третинних дозах, змінюються відносно одна одної (напр. корегуються вверх або вниз відповідно до доцільності) під час курсу терапії. У певних варіантах реалізації цього винаходу дві або більше (напр., 2, 3, 4 або 5) дози вводять на початку схеми лікування як "насичуючі дози", за якими слідують наступні дози, які вводяться на менш частій основі (напр., "підтримуючі дози").

У деяких ілюстративних варіантах реалізації цього винаходу кожну вторинну і/або третинну дозу вводять з 1 по 26 (напр.,1,125,2,22,3,35,4,4»,5,5»,6,6»,7,7»,8, 8», 9, 97, 10,

Зо 1075, 11, 115, 12, 1275, 13, 1355, 14, 1455, 15, 15755, 16, 162,17, 1772, 18, 187, 19, 195, 20, 2055, 21,21», 22,22», 23,23, 24, 245, 25, 2572, 26, 26725 або більше) тижнів після безпосередньо попередньої дози. Фраза "безпосередньо попередня доза", що використовується в цьому документі, означає, в послідовності декількох введень, вказану дозу антагоніста ІЛ-33 і антагоніста ІЛ-АР, яка вводиться пацієнту перед введенням наступної дози у вказаній послідовності без проміжних доз.

Вказані способи згідно з цим аспектом цього винаходу можуть включати введення пацієнту будь-якої кількості вторинних та/або третинних доз антагоніста ІЛ-33 і антагоніста

ІЛ-АР. Наприклад, у певних варіантах реалізації цього винаходу вказаному пацієнту вводять тільки одну вторинну дозу. В інших варіантах реалізації цього винаходу два або більше (напр., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або більше) вторинних доз вводять вказаному пацієнту. Аналогічно, у певних варіантах реалізації цього винаходу вказаному пацієнту вводять тільки одну третинну дозу. У певних варіантах реалізації цього винаходу дві або більше (напр., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або більше) третинні дози вводять вказаному пацієнту.

У варіантах реалізації цього винаходу, що включають кілька вторинних доз, кожна вторинна доза може бути введена з такою ж частотою, що й інші вторинні дози. Наприклад, кожну вторинну дозу можна вводити пацієнту 1-2 тижні або 1-2 місяці після безпосередньо попередньої дози. Аналогічно, у варіантах, які включають в себе кілька третинних доз, кожна третинна доза може бути введена з такою ж частотою, що й інші третинні дози. Наприклад, кожну третинну дозу можна вводити пацієнту через 2-12 тижні після безпосередньо попередньої дози. У певних варіантах реалізації цього винаходу частота, з якою вторинні та/або третинні дози вводять пацієнту, може змінюватися протягом вказаної схеми терапії. Вказана частота введення може також корегуватися в процесі терапії лікарем в залежності від потреб окремого пацієнта після клінічного обстеження.

Цей винахід включає схеми введення, в яких пацієнту вводять від 2 до б насичуючих доз з першою частотою (напр. один раз на тиждень, один раз кожні два тижні, один раз кожні три тижні, один раз на місяць, один раз на два місяці і т.д), з подальшим введенням двох або більше підтримуючих доз пацієнтові на менш частій основі. Наприклад, згідно з цим аспектом винаходу, якщо насичуючі дози вводять з частотою один раз на місяць, тоді підтримуючі дози можна вводити пацієнту раз на шість тижнів, один раз на два місяці, один раз на три місяці, і бо т.д.).

ПРИКЛАДИ

Наступні приклади викладені таким чином, щоб забезпечити фахівцю в цій області техніки повне розкриття і опис як створити і використовувати способи і композиції цього винаходу, і не призначені для обмеження обсягу того, що винахідники вважають їхнім винаходом. Були зроблені спроби забезпечити точність стосовно використовуваних чисел (наприклад, кількості, температури тощо), але слід враховувати деякі експериментальні похибки та відхилення. Якщо не вказано інше, частки є масовими частками, молекулярна маса є середньою молекулярною масою, температура вказується у градусах Цельсія, а тиск - атмосферний або близький до атмосферного.

Приклад 1. Створення антитіл людини до ІЛ-33 людини

Анти-ІЛ-33 антитіла людини створювали, як описано в патенті США Мо 9,453,072. У таблиці 1 наведено пари амінокислотних послідовностей важкого і легкого ланцюга і послідовності СОК, вибраних анти-ІЛ-33 антитіл та їх відповідних ідентифікаторів антитіл. У таблиці 2 наведено послідовності нуклеїнових кислот, що кодують пари амінокислотних послідовностей вказаного важкого і вказаного легкого ланцюга, а також послідовності СОК, вибраних анти-ІЛ-33 антитіл та їх відповідних ідентифікаторів антитіл.

Таблиця 1

Ідентифікатори послідовності амінокислот 11111111 бБОЮМо ЇЇ німо559М | 2 1 4 | 6 | 8 | 10 | 72 | 74 | 76 нанобгоР | 50 | 52 | 54 | 56 | 58 | 60 | 62 | 64 наноб33Р | 66 | 68 | 70 | 72 | 74 | 76 | 78 | 80 нанобаоР | 82 | 84 | 86 | 88 | 90 | 92 | 94 | 96 наноб59Р | 98 / 100 | 102 | 104 | 106 | 108 | 10 | 112

Таблиця 2

Ідентифікатори послідовності нуклеїнових кислот 11111111 5БОЮМО 771111 німо559мМ | 1 | з | 5 | 7 | 89 | 71 | їз | 5 нанеб33Р | 65 | 67 | 69 | 7 | 73 | 75 | 77 | ДЮ 7 наново. | 81 | 83 | 85 | 87 | 89 | 9 | 93 | 955 наноб59Р | 97 | 99 | 101 | лоз | 705 | 107 | 109 | 1

Антитіла, як правило, згадуються тут згідно з наступною номенклатурою: префікс Ес (напр. "НІМ" або "Н4Н"), за яким йде числовий ідентифікатор (напр. "9559," "9566" або "9629", як показано в Таблиці 1), за якими слідують суфікс "Р" або "М". Таким чином, згідно з цією номенклатурою, антитіло може згадуватися в цьому документі як напр., "Н1ІМ9559М", "НІМУ566М", "На.НеУб29Р", тощо префікси НІМ і На4НнН на позначеннях антитіл, що використовуються в цьому документі, вказують на конкретний ізотип Ес ділянки вказаного антитіла. Наприклад, антитіло "НІМ" має Ес Ід01 миші, тоді як антитіло "НАН" має Ес Ідс4 людини. Як буде зрозуміло фахівцеві в цій галузі техніки, антитіло, що має конкретний ізотип Ес, може бути перетворене в антитіло з іншим ізотипом Ес (напр., антитіло з Ес ЇдДе1 миші може бути перетворено в антитіло з ЇдДб4 людини і т.д.), але у будь-якому випадку, варіабельні домени (включаючи СОК) - які позначені числовими ідентифікаторами, показаними в Таблиці 1, - залишаються тими ж самими, і вказані зв'язуючі властивості, як очікується, будуть ідентичними або суттєво аналогічними незалежно від природи домену Ес.

Приклад 2: Конструювання антагоністів ІЛ-33 (ІЛ-33 пасток)

Пастки для анти-ІЛ-33 людини створювали, як описано в патенті США Мо 2014/0271642. У таблиці За наведено коротке викладення вказаних ідентифікаторів послідовності амінокислот для різних компонентів вказаних пасток ІЛ-33, а в Таблиці ЗБ наведено повно розмірні амінокислотні послідовності вказаних пасток.

П'ять різних типових антагоністів ІЛ-33 цього винаходу були сконструйовані, використовуючи стандартні методи молекулярної біології. Перший антагоніст ІЛ-33 (п5Т2-йЕс, ІЮ МО: 323) складається з розчинної позаклітинної ділянки 5Т2 людини (ЗЕО ІО МО: 328), злитої на її С-кінці з М-кінцем ділянки Ес ЇдД1 людини (ЗЕО ІЮ МО: 332). Другий антагоніст ІЛ-33 (н5Т2-тЕс, 5ЕО

ІО МО: 324) складається з розчинної позаклітинної ділянки 512 людини (ЗЕО ІЮО МО: 328), злитої на її С-кінці з М-кінцем ділянки Ес Їдб2а миші (5ЕО ІЮ МО: 333). Третій антагоніст ІЛ-33 (Н5Т2-

ПІЛІКАсСР-тЕс, 5ЕО ІО МО: 325) складається з лінійного злиття, що має 512 людини (ЗЕО ІЮ

МО: 328) на його М-кінці, за яким слідує позаклітинна ділянка ІЛ -АКАСсР людини (ЗЕО ІЮ МО: 330), за яким слідує Ес ІЇдо2а миші (ЗЕО ІЮО МО: 333) на його С-кінці. Четвертий антагоніст ІЛ-33

Зо (т5Т2-т"тІЛІКАсР-тес, ЗЕО ІЮО МО: 326) складається з лінійного злиття, що має 5Т2 миші (ЗЕО

ІО МО: 329) на його М-кінці, за яким слідує позаклітинна ділянка ІЛ -АКАсР миші (ЗЕО ІЮ МО: 331), за яким слідує Ес Ідс2а миші (ЗЕО ІО МО: 333) на його С-кінці. П'ятий антагоніст ІЛ-33

(н5Т2-ПІЛІКАсСР-пЕс, ЗЕО ІЮ МО: 327) складається з лінійного злиття, що має 512 людини (ЗЕО

ІО МО: 328) на його М-кінці, за яким слідує позаклітинна ділянка ІЛ -АКАСР людини (ЗЕО ІЮО МО: 330), за яким слідує Ес Їдс1а людини (5ЕО ІО МО: 332) на його С-кінці. У таблиці За наведено короткий опис ідентифікаторів амінокислотної послідовності для різних антагоністів ІЛ-33 та їхніх складових частин. У таблиці ЗБ наведено амінокислотні послідовності вказаних антагоністів ІЛ-33 та їхніх складових частин.

Таблиця За

Короткий опис антагоністів ІЛ-33 та їхніх складових частин

Амінокислотна

Антагоністи ІЛ- послідовність 33 повнорозмірної 01 Компонент 02 Компонент М Компонент молекули антагоніста позаклітинний І9С1 Ес людини

НОТ2-пЕгсС ЗЕО ІЮ МО323 512 людини (ЗЕО) | Відсутній (5ЕО 10 МО:332)

ІО МО:328 " позаклітинний Ідсга Ес миші

Н5Т2-тЕс ЗЕО ІО МО: 324 512 людини (ЗЕО) | Відсутній (5ЕО 10 МО:333)

ІО МО:328 І позаклітинний позаклитиннийіЇ - Іде2а Ес миші

ІО МО:328 ІО МО:330 : миші СР миші тіЛІгАсР-тЕсС МО:329 МО:331 (ЗЕО І МО:333) позаклітинний позаклитиннийіЇ -

ІО МО:328 ІО МО:330 І

Таблиця ЗБ амінокислотні послідовності

КЕЗБКОБМ/ СІ ЕМЕА ІМАСРАВОСКРОЬУТ МОМ УМ5ОТМКОІРТОЕВАВМАМЕАЗОС І.

КЕГРААМАОЗИОаМТСІМАЗРТЕМАТОМАММТІМККОВОСМУРОМІ МУЗТУБОБЕКМ

ЗКІМСРТІВІ ММУ/ТАРІЕМ/ЕКМСОАГ ОСЗАУВАНКЗЕЇ МІОМУИМТЕОАСОМТСКЕЇ

НМЕМСАМУЗУТАТАЗЕТУКОЕОСЕ5І ЕРМІСАРАОМЕЇКЕМЕІСКМАМІ ТС5БАСЕ

ЗЕО ІО МО:323 | ОКОТОРІГ ААМІ ОЇ МОаТКкКІТОБСЕРВІОСОЕЄЕЕСОМОЗЕЗМ,аЇ АСІ ОММІ ВІАОУК (неТ2-НЕс) ЕЕОГ ОМОСІ А МІ НаусгААНТУВІ ЗВКМРІОННЗОКТНТСРРОСРАРЕЇ І СС РБМ

ЕГЕРРКРКОТІ МІЗВТРЕМТСМУМОМЗНЕОРЕМКЕМУ УМО МЕМНМАКТКРВЕЕО

УМЗТИАМУ5МІ ТМ НООМ/ЛІ МОКЕМКСКУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКООРВАВЕРОММУТ

І РРУОВОЕЇ ТКМОМ5І ТС УКОЕМРБЗВІАМЕМ ЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ ОБОСОЗЕЕ

ГМ5КТМоОКАУМОСОММЕЗСОЗММНЕАЇІНМНМУТОКОІ 5І Рак

КЕЗБКОБМ/ СІ ЕМЕА ІМАСРАВОСКРОЬУТ МОМ УМ5ОТМКОІРТОЕВАВМАМЕАЗОС І.

КЕГРААМАОЗОМТСІМАЗРТЕМАТОМАММТІМККОВОСММРОМІ МУЗТУБОБЕКМ

ЗКІМСРТІВІ ММУ/ТАРІЕМ/ЕКМСОАГ ОСЗАУВАНКЗЕЇ МІОМУИМТЕОАСОМТСКЕЇ

НМЕМСАМУЗУТАТАЗЕТУКОЕОСЕ5І ЕРМІСАРАОМЕЇКЕМЕІСКМАМІ ТС5АСЕС

ЗЕО ІО МО: 324 | КаТОРІ ААМІГЛМОЇ МаткІТОЕСЕРВІООЕЄЕСОМОЗЕЗМ,аї АСІ ОММІ ВІАОМКЕЄЕ (нЗТ2-тЕс) РГГОМОСІ АСМІ НаігААНТУВІ ЗАКУМРІОННЗЕРВОРТІКРСРРСКСРАРМ СС

РОМЕІЕРРКІКОМІ МІЗІ БРІМТСМУМОМ5ЕВОРОМОЇ ЗМ ЕММММ ЕМНТАОТОТНАВЕ

ОММ5ТІ ВМУ5ЗАГРІОНОВУ/МЗОКЕРКСКУММКОЇ РАРІЕВТІЗКРКОЗУВАРОМУ

МГРРРЕЕЕМТККОМТ ТСМУМТОЕЄМРЕОВІММЕМ/ТММОКТЕІ МУКМТЕРМІ О5ОСЯ5У

ЕМУ5КІ АМЕККМУ МЕНМЗУЗСЗУМНЕСІ НМННТТК5ЕЗАТРОК

Таблиця ЗБ амінокислотні послідовності

КЕЗБКОБМ/СІ ЕМЕА ІМАСРАВОСКРОЬУТМ ОМ УМ5ОТМКОІРТОЕВАВМАМЕАЗОаСІІ К

ЕГРААМАОЗОЇМТСІМАЗРТЕМАТОаМАММТІМККОЗОСМУРОМІ МУЗТУВОЗЕКМОК

ІМСРТІОІ ММУУТАРІ ЕМ/ЕКМСОАЇ ОСЗАУВАНКЗЕЇ МІОМИМТЕВАСОМТСКРІНМ

ЕМЕОАМУЗМУМТАТАЗЕТУКОЕОСЕ5І ЕРМІСАРАОМЕІКЕМЕІСКМАМІ ТСЗАСРаКа

ТОРГААМІ МОЇ МаТКІТОЄСЕРВІООСЕЕСОМОБЕЗМИї АСІ ОММІ ВІАОУКЕЕОГ І.

ГОМОСІ АГ МІ НО ААВНТУВІ ЗАКМРІВОННІОЗЕВСОВМ СІ ОТМАОСІОМГЕОЕРАНВІК

5ЕО ІЮ МО: 325 СРІ ГЕНРІ КЕМУЗБТАНЗАСІ ТІ М УМ/ТАОЮВОЇ ЕЕРІМЕВІ РЕМАІЗКЕКОМІ М/ЕВР (пето- ТТ .МОТаТмМУТсМІ АМТТИС5КМАЕРІ ЕММОКОЗСЕМ5РМКІ РУНКІ МІЕМСІОВІТС

ПІЛІТЕАСР-ТЕС) РМУВОаУЕРБЗЗУКРТІТ МУ УМаСУКІОМЕМММІРЕСММІ 5ЕПАСІЗММОаМУТСУМТМР

ЕМОВТЕНІ ТАТІ ТУКУМОЗРКМАМРРМІНВРМОНУУММЕКЕРСОЕЕ ІРСТУМЕ5РІ М

ОБЕМЕММЛЛЛІОСККРООІТІОМТІМЕБЗБІЗНОЕТЕОЕТЕТОЇІЛЗІККМТ5ЕОІ КеА5УМСН

АВЗБАКОЕМАКААКУКОКУРАРВУТУМЕЗОСЕРВОРТІКРСОРРСКСРАРМИЇ СОРОМ РІ

ЕРРКІКОМІ МІБІ БРІУТСМУУМОМ5БЕВОРОМОЇІЗМ ЕМУМММЕУНТАОЮОТОТНАЕОММ5Т

ІЇ ВМУ5АЇ РІОНОБУУМЗОКЕРКСКУММКОЇ РАРІЕВТІЗКРКаЗУВАРОМММІ РРРЕ

ЕЕМТККОМТІ ТСМУТОЄЕМРЕВІММЕМ/ТММОКТЕЇ МУКМТЕРМІ ОБОСОМЕМУ5КІ.

АМЕККМУМУМЕНМЗМЗСЗУУНЕСІ НМННТТК5ЕЗАТРОаК

ЗКУ, ЕМЕА ІМАСРОВОаВЗТиРМЕМУУЗОТМЕБІРТОКАМВАВІЕМ5АОВІ КЕ Р

АВМЕОЗОІЇМАСМІВЗРМІ МКТОМІ ММТІНККРРУОСМІРОМІ МУЗТУВОЗОКМЕКІТСР

ТІ МММ/ ТАРМОМ/ЕКМСКАЇ ОЕРАЕВАННАЗУІ РГІОМУТНОВСЕСОМТСОЕТНАЕМО

ТММІМТАТАЗЕТМЕЕКОЕЗМЕРМІТМРРУМНТМЕМЕІ!СКРАБІАСЗАСЕРОКаЗНЕЇ А

ВОМ МО!МКТУМОаМЕСЕАВІОЕЕЕСАМЕЗЗОМОМОСІ ТОМІ ВІТаОМТЕКОІ 5БІ'ЕМОС

І А МІ НаМІВНТІВІ ВАКОРІОНАЗЕНСОВУ/ СІ ОТМАОСІОМЕЕОЕРАВІКСРІ ГЕНЕ 5ЕО ІЮ МО: 326 І КУМУБТАНЗЗаї ТИМ ММ/ТАООВОГЕЕРІМЕВІ РЕМАІЗКЕКОМІ М/'ЕВРТІ І МОТ (теТо- СМУТСМІ АМТТУС5КМАЕРГЕММОКОЗСЕМЗАМАЕРУНКММІЕНСІНКІТСРМУОС СЯ

ТІЛІВАСР-ТЕС) МЕРБЗУКРОМТМ УКОСТЕЇМОЕНММІ РЕСММІ ЗЕРІР УЗЄММаММТСсУУТУРЕМО А

І ЕНсСТАТУТУКУМазЗзРКОАЇ РРОЇМ5РМОАВУМУЕКЕРСЕЕЇ МІРСКУМЕЗРІМОЗНМ

ЕММЛМЛЛІОСККРООЮМТМОІТІМЕЗБМ5М5ЗТЕРЕТЕ ТОІЛЗІККМТРЕОГ ВЕМУУСНАВ

МТКОаЕАЕОААКУКОКМІРРАУТМЕЗСОЕРВОРТІКРСРРСКСРАРМИ СОРОМ РЇЕР

РКІКОМІ МІБІ БРІУТСМУУМОУМ5ЕВОРОМОІ5УМ ЕУМММЕМНТАОТОТНАЕОСУМ5ТІ В

МУ5АЇ РІОНОЮУМ/М5ОКЕРКСКУММКОЇ РАРІЕКТІЗКРКОЗУМВАРОМУМІ РРРЕЕЕ

МТККОМТІ ТСМУТОЄМРЕВІУМЕМТММОаКкКТтТЕЇІ МУКМТЕРМІ О5БОСОЗМЕММУЗКІ ВМ

ЕККМУМЕВМЗУЗСЗУМНЕСІ НМННТТК5ЕЗАТРОК

КЕЗБКОБМ/СІ ЕМЕА ІМАСРАВОСКРОЬУТМ ОМ УМ5ОТМКОІРТОЕВАВМАМЕАЗОаСІІ К

ЕГРААМАОЗОЇМТСІМАЗРТЕМАТОаМАММТІМККОЗОСМУРОМІ МУЗТУВОЗЕКМОК

ІМСРТІОІ ММУУТАРІ ЕМ/ЕКМСОАІ ОСЗАУВАНКЗОЕЇ МІОМУМТЕВАСОМТСКРІНМ

ЕМЕОАМУЗМТАТАЗЕТУКОЕОСЕ5І ЕРМІСАРАОМЕІКЕМЕІСКМАМІ ТСЗАСРаКа

ТОРГААМІ МОЇ МаТКІТОЄСЕРВІООСЕЕСОМОБЕЗМИї АСІ ОММІ ВІАОУКЕЕОГ І.

ГОМОСІ АГ МІ НО ААВНТУВІ ЗАКМРІВОННІОЗЕВСОВМ СІ ОТМАОСІОМГЕОЕРАНВІК

5ЕО ІЮ МО: 327 СРІ ГЕНРІ КЕМУЗБТАНЗАСІ ТІ М ММ/ТАОЮВОЇ ЕЕРІМЕВІ РЕМАІЗКЕКОМІ М/ЕВ (пето- І РТ МОТОаМУТСМІ ВМТТУСЗКМАЕРГ ЕМУМОКОЗСЕМЗРМКІ РУНКІ МІЕМОСТОВІТ

ПІЛТРАСР-НЕс) СРМУВСОУЕРБЗУКРТІ ТМ УМаТсСуУкКІОМЕМММІРЕСММІ 5ЕПАСЗММаМиУТСУМТУ

РЕМОАТЕНІ ТАТІ ТУКУМА5РКМАМРРМІНВРМОНУУМЕКЕРСОЕЕ ПІРСТУМЕБЕ

ІМО5еЕМЕММЛЛЛІТОСККРОВІТІОМТІМЕБІЗНОЕТЕОЕТЕТОЇІЛЗІККМТЗЕОІ КБУ

МСНАНЗАКОСЕМАКААКУКОКУРАРАВУТУМЕОКТНТСРРСОРАРЕЇЇ СОРБЗМУБІ ЕРРК

РКОТІ МІЗАТРЕМУТСУУМОМЗНЕОРЕУКЕМУ УМ ОС МЕМНМАКТКРАЕЄєОУМОТУВ

МУБМІ ТМ НОВУ МОКЕМКСКУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКООРАЕРОМУМТІ РРЗАНО

ЕТКМОМ5І ТСІ УКОЕМРЗВІАМЕМ/ЕЗМООРЕММУКТТРРМІ О5БООЗЕРІ МК ТМ

ОКЗАМООСММУЕЗСЗУМНЕАЇІ НМНУТОКОІ І 5РОК

КЕЗБКОБМ/СІ ЕМЕА ІМАСРАВОСКРОЬУТМ ОМ УМ5ОТМКОІРТОЕВАВМАМЕАЗОаСІІ К

ЗЕО ІО МО: 328 | Р РААМАОБЗСІМТСІМАЗРТЕМАТОаМАММТІМККОЗОСМУРОМІ МУЗТУЗОа5ЕКМ5 (позаклітинний | КІМСРТІСІ МММ/ТАРІ ЕУМЕКМСОАІ ОС5АУВАНКЗОЕЇ МІОМУИМТЕОАСОМТСКРЇІН домен 512 МЕМСАММЗУТАТАЗЕТУКОЕОСЕ5І ЕРМІСАРАОМЕІКЕМЕІСКМАМІ ТСЗАСЕОК людини) СТОР ААМІ МОЇ МОТКІТОЄСЕРВІОСОЕЄЕСОМОВЕЗМИЇ АСІ ОММІ ВІАОУКЕЕОІ.

І ГОМОСІ А МІ НаТа-гвАНТУВІ ЗАКУМРІОННО

Таблиця ЗБ амінокислотні послідовності

ЗК55УМСІ ЕМЕАМАСРОВОаВЗТУРМЕМ/МУ5ОТМЕБІРТОКАМАІЕМ5АОВІ КР Р

ЗЕО ІЮ МО:329 | АВМЕОБСІМАСМІВЗРМІ МК ТОМІ МУТІНККРРУЗСМІРОМІ МУЗТУВОЗОКМЕКІТСР (позаклітинний | ТІЇ УММ/ТАРМОМЕКМСКАЇ ОЕРВЕВАНАЗМІ РПІОМУТНОРЕСОМТСОЕТНАЕМСТ домен 512 ММІМТАТАЗЕТМЕЕКОЕЗМЕРМІТМРРУМНТМЕМЕІВКРАБІАСЗАСЕРСОКОЗНЕГ АЮ миші) МІ М'ОІМКТУМОМЕСЕАВІОЕЕЕСАМЕЗЗЗМОМОСІ ТОМІ ВІТОМТЕКОІ 5ІЕМОСІ.

АІЇ МІ. НОМІВНТІВІ ВАВКОРІОНА

ЗЕНСООМОГ ОТМАСІОМЕЕОЕРАВІКСРІ ГЕНРІ КЕМУЗТАНЗАСІ ТИМ/МУУТНОЮ

ЗЕО ІЮ МО:330 | ВО ЕЕРІМЕВІ РЕМВІЗКЕКОМІ М'ЄВРТІ І МОТОаМУТСМІ ВМТТУСЗКМАЕРІ ЕММО (позаклітинний | КОЗСЕМЗРМКІ РУНКІ МІЕЕМСІОВІТСРММОСОУЕРБЗЗУКРТІ ТМ УМОСУКІОМЕМММ домен ІЛІВАсСР | ІРЕСММІ ЗЕПАГІЗММОаМУ ТСММТУРЕМОВТЕНІ ТАТІ ТУКУМа5РКМАМРРМІН5Р людини) МОНУМУЕКЕРСЕЕРСТУМЕ5ЕЇ МОЗБАМЕУУМУ/ТІВОККРОВІТІОМТІМЕБІЗНО

КТЕВЕТКТОІЛЗІККИТЗЕВ-ККЗУМСНАКЗАКСЕМАКААКУКОКУРАРКУ ТМЕ

ЗЕНСООМОГОТМАСІОМЕЕОЕРАВІКСРІ ГЕНРІ КУММЗТАНЗЗОЇ ТІ М/МУУТВО 5ЕО ІЮ МО: 331 ОВОГЕЕРІМЕВІ РЕМАІЗКЕКОМІ М/'ЕАРТІ МОТО МУТСМІ ВМТТМС5КМАЕРІ ЕМ (позаклітинний МОКО5СЕМЗАМАЕРУМНКМУТЕНОІНКІТСРМУВаМЕРЗЗУКРОЬМТМУКОаСтТЕ МОБ

НММІ РЕСММІ ЗЕРІР УЄММО МУ ТСММТУРЕМОВІ ЕНІ ТАТУТУКУМОа5РКОАЇ Р домен ІЛІКАСР | РОу5РМОВУУУЕКЕРСЕЕІ МІРСКУУЕЗРІМОЗНМЕУМЛИТІОСККРООМТУОІТІМ миші) ЕЗМ5У55ТЕОЕТЕТОЇІЛЗІККУТРЕОІ ВЕМУУСНАВМТКСЕАЕОААКУКОКМІРР

ВАУТМЕ

ОКТНТОСРРСОРАРЕЇЇ СОРБМУБІ ЕРРКРКОТІ МІЗАВТРЕМТСМУМОМ5НЕОРЕМКЕМ

ЗЕО ІО МО:332. | УМО МЕМНМАКТКРАЕЄОУМЗТУВУММІ ТМІ НООУУІ. МОКЕМКСКУЗМКА РА людини) РЕММУКТТРРМІГ О5ОО5ЕРІ У5КІ ТМОКЗ ВУ/ОССММЕЗСЗ5УММНЕАІ НМНУТОК5

ІІ РОК

ЕРВОРТІКРСРРСКСРАРМИЇ ОРЗМУРІЕРРКІКОМІ МІБІ БРІУТСМУМОМ5ЕВОРО 5ЕО ІЮ МО:333 МОІ5М/ ЕММММ ЕМНТАОТОТНАЕОУМ5ТІ АУУЗАЇ РІОНОСБМ/МЗОКЕРКСКУММК (дс2а Ес миші) ОСІ РАРІЕВТІЗКРКаОЗУМААРОМУМІ РРРЕЕЕМТККОМТІ ТСМУТОЕМРЕВІММЕМТ

ММОКТЕСМУКМТЕРМ О5005У ЕМУ5КІ АВМЕККМУ/ МЕНМЗУ5СЗУМНЕСІ НМНН

ТТК5ЕЗАТРОК

ЗЕО ІЮ МО:З334 | ВІТСОІЗРІТЕБІ АБІ ЗТУМООЗІТЕРАГЕОЕЗУЕІММЕОІ ККОКККОКМІИ 5УМЕВОНР

Тазсісцагів ЗЕМСМЗЕЕСКТОРОМЕІСУКОМНІГАСІКМОМЕМІ ЗБЕМІЛЕКСЗЕІЛЕНННННН

Приклад 3: Антагоністичні антитіла до ІЛ-АР

Анти-ІЛ-АР антитіла людини створювали, як описано в патенті США Ме7,608,693. Вказане ілюстративне антитіло проти ІЛ-4Р, що використовується в наступному прикладі, є антитілом миші, специфічним для ІЛ-АР миші, і має наступні амінокислотні послідовності: варіабельну ділянку важкого ланцюга (НСМАК), що містить ЗЕО ІЮ МО: 335 і варіабельний домен легкого ланцюга ГСМК), що включає 5ЕО ІО МО: 336. Вказане анти-ІЛ-4Р -антитіло людини, згадуване як дупілумаб, специфічно зв'язується з ІЛ-4Ра людини і містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (НСУК), що містить 5ЕО ІЮ МО: 337, і варіабельну ділянку легкого ланцюга (СУК), що містить ЗЕО ІО МО: 338, ділянку 1, яка визначає комплементарність важкого ланцюга (НСОКТІ), що містить зЕО ІЮ МО: 339, НСОК2, що містить БЕО ІЮО МО: 340, НСОКЗ, що містить ЗЕО ІЮ

МО: 341, ділянку, що визначає комплементарність легкого ланцюга (СОМ), що містить 5ЕО ІЮ

МО: 342, 1 СОК2, що містить БЕО ІО МО: 343, і 1 СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮО МО: 344. Повно розмірний важкий ланцюг дупілумаба показаний як 5ЕО ІЮО МО: 345 і повно розмірний легкий ланцюг показаний як ЗЕО ІЮ МО: 346.

Приклад 4: Хронічна модель фіброзу і тяжкого запалення легень, індукованого кліщем домашнього пилу (НОМ), для вивчення ролі ІЛ-33 у запаленні легень. Порівняння ефективності анти-ІЛ-33 антитіла, антитіла проти ІЛ-4Р або комбінації обох.

Хронічні запальні захворювання дихальних шляхів є наслідком рецидивуючих епізодів запалення дихальних шляхів, переважно внаслідок повторного впливу алергенів або інших патогенів. У людей такі хронічні пошкоджуючі чинники викликають широкий спектр патологій, які включають легеневу інфільтрацію імунними клітинами, збільшення продукції цитокінів, виробництво слизу і відкладення колагену (Нігоїа, (2013) Спеві. бер;144(3):1026-32.; Ровіта, (2015), М Епої У Меа., зер 24;373(13):1241-9). Це збільшення запальних цитокінів і інфільтратів імунних клітин, що супроводжуються інтенсивним ремоделюванням дихальних шляхів,

призводить до звуження дихальних шляхів, гіперреактивності до вдихуваних тригерів, таких як алергени або патогени, обструкції дихальних шляхів і втрати функції легень.

Для визначення ефекту інгібування анти-ІЛ-33 у відповідних моделях іп мімо, дослідження хронічного фіброзу і важкого запалення легень і ремоделювання, індукованих екстрактом кліща домашнього пилу (НОМ), було проведене на мишах, які були гомозиготними по експресії ІЛ-33 людини замість ІЛ-33 миші (миші ІЛ-33 Нитіп; Див. Патентну заявку США 2015/0320021 і 2015/0320022). Хронічна експозиція до екстракту НОМ викликає серйозне запалення легень, що призводить до значного клітинного інфільтрату, експресії цитокінів і ремоделювання. У цій моделі порівнювали ефективність анти-ІЛ-33 антитіла, антитіла проти ІЛ-А4Ра миші або їх комбінації. Антитіло проти ІЛ-4Р с миші, що використовується в цьому дослідженні, позначається МІМ1875М і містить пару амінокислотних послідовностей НСМК/Л СУК з 5ЕО ІЮ

МО: 335/336. Вказане анти-ІЛ-33 антитіло, що використовується в цьому дослідженні, позначається Н4АНОб75Р і містить пару амінокислотних послідовностей НСМК/Л СУК з 5ЕО ІЮ

МО: 274/282.

ІЛ-33 Нитіп мишам інтраназально вводили або 50 мкг екстракту кліщів домашнього пилу (НОМ, Огеег, М"ОХРВ7ОЮЗА2.5), розведеного в 20 мкл 1Х фізіологічного розчину (РВ5), або 20 мкл 1Х РВ5 З дні на тиждень протягом 15 тижнів. Другій контрольній групі ІЛ-33 Нитіп мишей вводили 50 мкг екстракту НОМ, розведеного в 20 мкл 1Х РВ5 З дні на тиждень протягом 11 тижнів, для оцінки тяжкості захворювання на момент початку лікування антитілами. Чотирьом групам мишей, яким робили стимуляцію НОМ, вводили підшкірно 25 мг/кг анти-ІЛ-33 антитіла

Н4іНнеОб75Р, антитіла проти ІЛ-АР «а миші МІМ1875М, комбінації обох антитіл, або антитіла ізотипного контролю, починаючи з 11 тижня від початку стимуляції НОМ і потім двічі на тиждень до закінчення стимуляції НОМ (4 тижні лікування антитілами). На 108-й день дослідження всі миші були забиті, а їхні легені були зібрані. Експериментальне дозування і протокол лікування для груп мишей показано в Таблиці 4.

Таблиця 4

Експериментальне дозування і протокол лікування для груп мишей

Тривалість

Група Миша Інтраназальна стимуляція інтраназальної Антитіло стимуляції 1 Миші ІЛ-33 ІХ РВ5 і5тижнів |Немає

Нитівп

Нитівп контролю

Миші ІЛ-3З3 . Анти-ІЛ-33 антитіло . Анти-ІЛ-4Ра

З 50 мкг НОМ в 20 мкл 1Х РВЗ5 15 тижнів антитіло

МІМ1875М

Анти-ІЛ-33 спо (Н4НУОб75Р) антитіло 7 Мн 7 вом номвоомкліх РВЕ) о ІБтижнів | 4 Анти-/Л-4Ра (МІМ1875М) антитіло

Відбір легень для аналізу цитокінів:

Підвищені рівні ключових медіаторів в легенях, такі як прототипні цитокіни типу 2 ІЛ-4, ІЛ-5 і

ІЛ-13, а також цитокіни, більш характерні для імунних відповідей типу 1, такі як ІЛ-АД або ФНПа, беруть участь у розвитку захворювань легень людини (Сапапйі, (2016) Маї Кем Огид бівсом

Уап;15(1):35-50.; Ватез, (2008), Маї Вем Іттипої, Маг;8(3):183-92. В цьому дослідженні були виміряні рівні цих запальних цитокінів у легенях.

Після знекровлення верхню і середню частки правої легені від кожної миші видаляли і поміщали в пробірки, що містили розчин реагенту для екстракції тканинного протеїну (1Х Т-РЕВ реагент; Ріегсе, Ме78510), доповненого ЇХ сумішшю інгібіторів протеаз Наїї (ТНепто 5сієпійіс,

Мо87786). Всі наступні кроки проводили на льоду. Об'єм Т-РЕК реагента (містить суміш інгібіторів протеаз) регулювали для кожного зразка так, щоб він відповідав співвідношенню тканини до Т-РЕК 1: 7 (маса/об'єм). Зразки легень механічно руйнували за допомогою

Тівзцеі ухег І (Оіадеп Мо85300). Отримані лізати центрифугували для осадження дебрісу.

Супернатанти, що містять розчинні протеїнові екстракти, переносили на свіжі пробірки і зберігали при 4 "С до подальшого аналізу.

Загальний вміст протеїну в екстрактах протеїнів легені вимірювали за допомогою аналізу

Бредфорда. Для аналізу 10 мкл зразків розведених екстрактів розкапували в 96б-лункові планшети в дуплікатах і змішували з 200 мкл 1Х реагенту для забарвлення (Віогад, Ме500-0006).

Серійні розведення бичачого сироваткового альбуміну (ВЗА; бідта, МеА7979), починаючи з 700 мкг/мл в реактиві 1Х Т-Рег, використовували в якості стандарту для визначення концентрації білка в екстрактах. Після 5-хвилинної інкубації за кімнатної температури вимірювали поглинання при 595 нм на планшетному рідері МоїІесшаг Оемісе5 ЗресігаМах М5. Аналіз даних для визначення загального вмісту екстрагованого протеїна легень на основі стандарта В5А, проводили за допомогою програмного забезпечення сгарпРавй Ргібт "М,

Концентрації цитокінів у екстрактах протеїну легень вимірювали, використовуючи

Ргоіїпїаттацйюгу Рапеї! 1 (миша) мультиплексного набору для імунологічного аналізу (Мезозсаїе рівсомегу, МоК150480-2) і звичайного б-плексного набору Мийі-5рої» для імунологічного аналізу (Мезоб5саїе Рібзсомегу, МеК152А41-4), відповідно до інструкцій виробника. Коротко, 5Омкл/лунку калібраторів і зразків (розведених у Розчиннику 41) додавали на планшети, попередньо покриті антитілами для захоплення і інкубували за кімнатної температури при зтрушуванні на 700 об/хв протягом 2 годин. Потім планшети промивали З рази 1Х РВ5, що містив 0,05 Фо (м/м) Гуееп-20, з наступним додаванням 25 мкл розчину для виявлення антитіл, розведеного в Розчиннику 45.

Після 2-годинної інкубації за кімнатної температури при перемішуванні вказаний планшет промивали 3 рази і додавали 150мкл 2Х буфера для зчитування в кожну лунку.

Електрохімілюмінесценція була негайно зчитана на приладі М5О Зресіої?. Аналіз даних

Зо проводили за допомогою програмного забезпечення СгарпРаай Ргізт.

Кожна концентрація цитокінів в екстрактах загального протеїну легень від всіх мишей у кожній групі була нормалізована на загальний вміст протеїна екстрактів, виміряного за допомогою аналізу Бредфорда, і виражена для кожної групи як середнє значення пг цитокіну на мг загального протеїна легень (пг/мг), х 50), як показано в Таблиці 5.

Аналіз цитокінів легень:

Як показано в таблиці 5, рівень цитокінів і хемокінів ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-б, ІЛ-1ДВ і МеОР-1, вивільнених в легенях мишей ІЛ-33 Нитіп, які отримують НОМ протягом 15 тижнів, з або без лікування антитілом ізотипного контролю були значно вищими, ніж у мишей ІЛ-33 Нитіп, яким вводили тільки їХ РВ5. Аналогічно, спостерігалася тенденція до посилення вивільнення цитокінів ІЛ-13 і ФНПс в легенях мишей ІЛ-33 Нитіп, які отримували НОМ протягом 15 тижнів.

Навпаки, спостерігалося значне зниження рівнів ІЛ-б6, ІЛ-13 і МСР-1 в легенях мишей ІЛ-3З3

Нитіп, яким вводили комбінацію анти-ІЛ-33 і антитіл проти ІЛ-АР « миші протягом останніх чотирьох тижнів хронічної стимуляції НОМ порівняно з мишами ІЛ-33 Нитіп, яким вводили НОМ з антитілом ізотипного контролю протягом цього періоду часу. Відзначалася тенденція до зниження легеневих рівнів ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-1В8 ії ФНІПса у мишей ІЛ-33 Нитіп, які отримували комбінацію анти-ІЛ-33 та антитіл проти ІЛ-4Ра миші протягом останніх чотирьох тижнів хронічної стимуляції НОМ порівняно з мишами ІЛ-33 Нитіп, яким вводили НОМ з антитілом ізотипного контролю протягом цього періоду часу. Впливи на цитокіни легень, що спостерігалися при комбінації анти-ІЛ-33 та антитіл проти ІЛ-АР с миші, були більшими, ніж терапія окремими антитілами.

Таблиця 5

Концентрація цитокіну в протеїнових екстрактах легень

Середнє Середнє Середнє Середнє Середнє Середнє Середнє значення (ІЛ-4) значення значення значення значення значення значення

М ПЛ-51 У ПЛ-131 У МЛ-б1У МПЛ-1ВІ У ІФНПСЇ У ІМСР-1Ї у

Експеримент у протеїнових протеїнових | протеїнових | протеїнових | протеїнових | протеїнових | протетнових альна група пекень (ПМГ екстрактах екстрактах екстрактах екстрактах екстрактах екстрактах . легень (пг/мг | легень (пг/мг | легень (пг/мг | легень (пг/мг | легень (пг/мг | легень (пг/мг ня во протеїна протеїна протеїна протеїна протеїна протеїна легень) (ж ЗО) легень) (ж 5І))| легень) (х 503)| легень) (5 50))| легень) (х 503)| легень) (ж 503)| легень) (- 50) 1. Введення 0.13 0.80 н/в 4.75 1.97 2.86 4.12 1ХРВЗ(п-5)| /(ж0.17) (-1.41) (153.39) (11.67) (-1.01) (-1.12) нн 5.71 7.31 0.20 293.1 181.8 17.39 43.06 тижнів (п-4) (-3.76)7 (53.67) (70.03) (-139.337 | (-131.037 (18.90) (424.21) вон 2.70 5.13 0.19 308.3 51.79 15.38 105.6 тижнів (п-9) (-1.71) (3.20) (70.03) (-390.1) (-16.97) (168.11) (-106.537 4. Стимуля- ція НОМ 15 знтіло 5.46 7.00 0.22 395.0 162.3 19.57 141.7 ізотипного (53.38) (14.50)7 (70.02) (ї270.1)4 | (-166.5377 | (14.81) | (-126.3ух контролю п-4 5. Стимуля- ція НОМ 15 тижнів ж 115 1.93 0.20 136.8 122.9 17.05 16.64 анти-ІЛ-33 (-1.38) (-1.90) (70.02) (164.1) (41941) (14.48397 (16.40) антитіло п- 6. Стимуля- ція НОМ 15 тижнів я 2,88 15313 0.16 18,24 26,73 7,85 11,63 антитіло (12,43) (-12,81ух (70.03) (-12,43) (120,94) (14,89) (18,69) проти ІЛ-4Р а миші (п-:5) 7. Стимуля- ція НОМ 15 аниклзЗ ї 0,47 0,73 010 7,46 3,722 3,07 4,62 антитіла (10,13) (ї0,37) (-0,05у (-2,52)1 (-1,59) (-1,34) (-,27у п проти ІЛ-4Р а миші (п-:5)

Примітка: Вказана статистична значущість, визначена за допомогою Крускала-Уолліса однофакторного АМОМА з тестом множинного порівняння Данна за отриманими результатами ( - р«0,05, - р«0,01, порівняно з групами 1: миші ІЛЗЗ3 Нитіп, ведення фізіологічного розчину; Тр-0.05, Пре0.01, порівняно з групою 4: миші ІЛЗ3З3 Нитіп, стимуляція

НОМ 15 тижнів «з антитіло ізотипного контролю). н/в: Не визначено.

Відбір легень для аналізу експресії генів

Після знекровлення, додаткову частку правої легені від кожної миші видаляли, поміщали в пробірки, що містять 400 мкл КМА І агег (Атбіоп, Мо АМ7020) і зберігали при -20" С до обробки.

Тканини гомогенізували в ТКІ20ї! і використовували хлороформ для розділу фаз. Водорозчинну фаза, що містить загальну РНК, очищали, використовуючи МаздмМАХ "м -96 для мікроматричного набору для виділення загальної РНК (Атбіоп від І їе ТесппоЇодіеєх, Мо АМ1839) відповідно до специфікацій виробника. Геномну ДНК видаляли за допомогою МаздмМАХ 7 Тигро м ОМавзе буферу і ТОКВО-ОМавзе з набору МаомАХ, наведеного вище. мРНК (до 2,5 мкг) була обернено транскрибована в кКДНК за допомогою Зирегосгірк! МІЛО 7м Мабхіег Міх (Іпмйгодеп від Гіїе

Тесппоодіе5, Мо 11755500). КДНК розводили до 2 нг/І. і 10 нг кКДНК ампліфікували за допомогою

Тадмапе? Сепе Ехргеззіоп Мазхіег Міх (Арріїей Віозузіет»5 від І Ше Тесппоодіеєб5, Мо 4369542) і відповідні зразки (Ге Тесппоіодіеб; В2т миші: Мт00437762 т!1; ІЛА миші: МтО00445259 т!;

ІЛ5 миші: МітО0439646 т!1; ІЛІЗ3 миші: МіпО0434204 ті; ІЛО миші: МітО0434305 т/1; ІЛЄ миші:

Мто0446190 т1; Ссі2 миші: МтО00441242 т!; СсИ11 миші: Мт00441238 т1; СсіІ24 миші:

МтО00444701 т1; ТОЇ миші: Мто0443258 т1; ТОої1 миші МтОо1178820 тт; ІЛІг1 миші:

Мто0516117 т/1/Л1Зга?2 миші: МтоО0515166 т1; Со15а1 миші Міт00456584 т!1; СоіІ24а1 миші: Мт01323744 т1;) використовуючи секвенатор АВІ 7900НТ (Арріїей Віозуєіетв5). В2т використовували в якості генів внутрішнього контролю для нормалізації будь-яких відмінностей вхідних даних КкДНК. Еталоною групою, що використовувалась для нормалізації всіх зразків, було середнє значення для зразків групи 1 ("введення їЇХ РВ5"). Експресію кожного гена нормалізували по експресії В2т в межах однієї проби і виражали відносно його нормалізованої експресії в референтній групі (середнє х 50), як показано в таблиці 6.

Аналіз експресії генів легені

Як показано в таблиці 6, вказаний рівень експресії цитокінів, хемокінів і генів колагену ІЛ4,

ІЛ1З, ІЛб, Ссі2, ТаїТ1, ІЛІЗга2 і СоІ24а1 у легенях ІЛ-33 мишей Нитіп, які отримували НОМ протягом 15 тижнів, з або без терапії антитілом ізотипного контролю були значно підвищені порівняно з ІЛ-33 мишей Нитіп, яким вводили тільки 1Х РВ5. Аналогічно, була тенденція до збільшення експресії генів ІЛ5, ІЛО, СсІ11, Ссі24, Тпї, ІЛІПІ ї Со15а21 в легенях мишей 1ІЛ-33

Нитіп, які отримували НОМ протягом 15 тижнів.

Навпаки, було значне зниження рівнів експресії ІЛб, Ссі2, Ссі11 ї Ссі24 у легенях мишей ІЛ- 33 Нитіп, яким вводили комбінацію анти-ІЛ-33 і антитіл проти ІЛ-4Р « миші протягом останніх чотирьох тижнів хронічної стимуляції НОМ порівняно з мишами ІЛ-33 Нитіп, яким вводили НОМ з антитілом ізотипного контролю протягом цього періоду часу. Була тенденція до зниження рівнів експресії ІЛА4, ІЛ5, ІЛІ1З, ІЛО, Тпї, То, ІЛІг1, ІЛІЗга2, СоП5а1 і СоІ24а1 у мишей, які отримували комбінацію анти-ІЛ-33 і антитіл проти ІЛ-АР а миші протягом останніх чотирьох тижнів хронічної стимуляції НОМ порівняно з мишами ІЛ-33 Нитіп, яким вводили НОМ з антитілом ізотипного контролю протягом цього періоду часу. Вказані ефекти на цитокіни легень, що спостерігалися при комбінації анти-ІЛ-33 та антитіл проти ІЛ-4Р а миші, були більшими, ніж при терапії окремими антитілами окремо.

Таблиця 6

Експресія гена (Тадмап) в легенях миші

Середня Середня Середня Середня Середня Середня Середня Середня вкоперимен-| ЗМтрося омореня сіреся | відносна | відносна | відносна 0 відносна | відносна експресія | експресія ІЛб| експресія експресія експресія тальна група ди св, пев ІЛУ в легені в легені Ссі2 в легені | СсІ11 в легені Ссі24 в легені (к 50) (50) (50) (- 50) (- 50) (- 50) (- 50) (- 50) 1Х РВЗ (п-5)| (ж40,28) | (41,61) | (ж7.59) | (534.81) | (-1.09) (10.93) (41.07) (70.33) таня | 12.78 | 713 | 1141 38.66 9.12 18.86 13.36 15.44 тижнів (п-4) | (28.45) | (53.49) ) (568.3)7 (530.04) | (51.65) (18.40) (15.05) (-12.02) я НОМ 6.27 420 | 58.05 | 30.63 8.92 22.61 8.65 4.58 тижнів (пе4) | (83.39) | (51.51) | (531.61) | (х20.54) | (ж4.55) (13.37) (53.20) (-1.91) 4. Стимуля- ція НОМ 15 знтіло 10.98 5.50 92.51 19.51 13.80 24.53 12.14 12.41 ізотипного 05.46)" | (53.16) | (575.96) | (-10.29) | (6.98) | (ж9.139у (17.82) (18.73) контролю п-4 5. Стимуля- ція НОМ 15 тижнів ж 2.80 1.74 12.91 0.00 3.87 5.20 6.21 1.45 п- 6. Стимуля- ція НОМ 15 тижнів ж 1.87 7.98 69.56 63.50 2.17 2.97 1.00 0.44 проти ІЛ-4Р а миші (п-5)

Таблиця 6

Експресія гена (Тадмап) в легенях миші

Середня | Середня| Середня відносна відносна відносна | соросня | віднома | вена | вщеа | врноса

Експеримен- окопресія екопресія скопресія експресія експресія ІЛб експресія експресія експресія тальна група легені легені дегені ІЛУ в легені в легені Ссі2 в легені | СсІ11 в легені Ссі24 в легені (к 80) («є 80) («є 80) (- 50) (- 50) (- 50) (- 50) (- 50) 7. Стимуля- ція НОМ 15 аниклзЗ ї 1.37 1.56 9.34 0.57 1.04 1.08 0.72 0.15 антитіла (ї40.35) | (40.97) | (-3.10) | (41.27) | (50.31) | (30243115 | (ж0.28)ї (-0 17 проти ІЛ-4Р а миші (п-5)

Таблиця 6

Продовження: Експресія гена (Тадмап) в легенях миші

Середня Середня Середня Середня Середня с -

Експеримента відносна відносна відносна відносна відносна ередня соя льна група | експресія Тпі в | експресія Ту) експресія ІЛІТПИ Ліза в пе їс Бач пе (| експресія оо легені (4 50) | в легені (5503) | в легені (5 50) т од о /й в в легені (ж 0) 1.02 (20.24) | 1.00 (50.11) | 1.11 (50.58). 1.59 (31.96) | 1.00(50.10)... 1.02 (80.16) 2. Стимуляція

НОМ 11 1.45 (30.41) | 1.40 (10.27) 13.03 (10.88)7 148.43 (534.21)! 2.75 (10.96) | 24.55 (57.97ух тижнів (п-4)

З. Стимуляція

НОМ 15 1.58 (70.43) | 1.32 (10.33) 12.53 (ї0.79)7132.07 (413.453). 3.00 (41.22) | 17.25 (ї5.2997 тижнів (п-4) 4. Стимуляція

НОМ 15 тижнів ж антитіло 1.59 (10.78) 11.37 (ї0.12)713.45 (4-1.48)7 152.02 (140.63)) 3.80 (ї0.96)7 123.58 (ї6.18)77

ІЗОТИПНОГО контролю п-4 5. Стимуляція

НОМ 15 тижнів ж 1.38 (10.27) | 1.22 (10.24) | 0.99 (140.47) (13.54 (412.253) 1.64 (140.30) | 10.58 (15.42) анти-ІЛ-33 антитіло (п-:5) 6. Стимуляція

НОМ 15 знтіло проти! 1-00 (40.25) | 1.13 (20.20) | 3.38 (41.97) | 1.89 (40.59) | 1.24 (50.28) | 7.08 (44.56)

ІЛ-4Р а миші (п-5) 7. Стимуляція

НОМ 15 тижнів ж н анти-іл-33 10.68 (40.08)5 | 1.09 (20.12) 1.12 (0.57) | 1.89 (20.27). | 9-77 (502177). 4,76 (ю015)1 антитіла проти

ІЛ-4Р а миші п-5

Примітка: вказана статистична значущість, визначена за Крускала-Уолліса однофакторним

АМОМА з тестом множинного порівнянням Данна за отриманими результатами (С - р «0,05, р«е0,01, и - р«0,01 порівняно з групами 1: Миші ІЛЗ3З3 Нитіп, введення фізіологічного розчину;зр«0.05, 55р«0.01, порівняно з групою 3: миші ІЛЗ3З Нитіп, стимуляція НОМ 15 тижнів;

Тр-0.05, Пре«0.01, порівняно з групою 4: мишей ІЛЗЗ Нитіп, стимуляція НОМ 15 тижнів антитіло ізотипного контролю;).

Відбір легень для аналізу легеневого клітинного інфільтрату

Легенева інфільтрація імунними клітинами спостерігається при багатьох запальних захворюваннях дихальних шляхів, включаючи астму і ХОЗЛ. Нейтрофільне запалення легень було пов'язане з більш низькою функцією легень і важким ремоделюванням тканин у хворих на астму (УУеп2еї) еї аї..., (2012), Маї Меа 18 (5): 716-725) та з підвищеним легеневим ураженням у хворих на ХОЗЛ (Меїїег, еї а!., (2013), Ехреті Кем. Сііп. Іттипої. 9(11):1055-1068). Еозинофільне запалення легень є ознакою запалення типу 2, яке зазвичай спостерігається при атопічних захворюваннях (дасорзеп, еї аї..., (2014), Сііп. Ехр., АПегду, 44(9):1119-1136). У людей високі співвідношення СО4/СО8 спостерігаються у пацієнтів з гранулематозними захворюваннями легень та іншими хронічними запальними станами (Созіареї, еї аї., (1997), Еиг. Кезріг. у. 10(12):2699-2700; схо, еї.аі!., (2011), Апп. Сіїп. Віоспет, 48(РІ4):344-351). Проточна цитометрія була використана в цьому дослідженні для визначення рівня клітинної інфільтрації в легенях мишей, яким вводили НОМ.

Після знекровлення нижню частку правої легені від кожної миші видаляли, нарізали кубиками розміром приблизно від 2 до З мм, а потім поміщали в пробірку, що містила розчин

ДНКази 20 мкг/мл (Коспе, Мо 10104159001) та 0,7 О/мл І ібегахе ТН (Коспе, Мо 05401151001), розведеного в збалансованому сольовому розчині Хенка (НВ) ((зірсо, Мо 14025), який інкубували на водяній бані при 377 С протягом 20 хвилин і перемішували кожні 5 хвилин.

Вказану реакцію зупиняли додаванням етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕЮОТА, сірсо, Мо 15575) в кінцевій концентрації 10 мМ. Кожну легеню потім дисоціювали з використанням дисціатора депіемАсС5е (МІЛіепуї Віоїес, Мо 130-095-937), після чого фільтрували через фільтр 70 мкм і центрифугували. Отриманий легеневий осад ресуспендували в 1 мл 1Х буфера для лізису еритроцитів (Зідта, Ме К7757) для видалення еритроцитів. Після інкубації протягом З хвилин за кімнатної температури додавали З мл ЇХ ОМЕМ для деактивації буфера для лізису еритроцитів. Потім суспензії клітин центрифугували, і отримані осади клітин ресуспендували в 5 мл буфера МАС5 (ашоМАсС5 Киппіпд Вийег; МіЛіепуі Віоїес, Мо 130-091-221). Вказані ресуспендовані зразки фільтрували через фільтр 70 мкм і 1 х 105 клітин на лунку висівали в 96- лунковий планшет з М-подібним дном. Клітини потім центрифугували і осади промивали в 1Х

РВ5. Після другого центрифугування клітинні осади ресуспендували в 100 мкл фіксуючого розчину ГІМЕ/ЮОЕАО 2 Ріхабіе Вісе Оеаай Сеї біаїп (І їе Тесппоіодієв5, Ме І 23105), розведеного 1: 500 в ЇХ РВ5 для визначення життєздатності клітин і інкубували протягом 20 хвилин за

Зо кімнатної температури в захищеному від світла місці. Після однократного промивання в 1Х РВ5, клітини інкубували в розчині буфера МАС, що містив 10 мкг/мл очищеного блокуючого антитіла щура проти Ес СО16/С032 миші, (клон: 2.452; ВО Віозсіепсе5, Мо 553142) протягом 10 хвилин за 4 "С. Потім вказані клітини інкубували у відповідній 2х суміші антитіл (описаній в

Таблиці 7), розведеній в буфері МАС5, протягом 30 хвилин за 4 "С, в захищеному від світла місці. Після інкубації з антитілами вказані клітини двічі промивали в буфері МАС5, ресуспендували в ВО СуїоБвіх (ВО Віозсіепсе5, Мо 554655) і потім інкубували протягом 15 хвилин за 4" С, у захищеному від світла місці. Потім вказані клітини промивали, ресуспендували в буфері МАСЗ5, а потім переносили в пробірки ВО БАС5 (ВО Віозсіепсе5, Мо 352235) для аналізу клітинних інфільтратів методом протокової цитометрії. сра4 ії СО8 Т-клітини були визначені як живі клітини, СО45:, 550, Е5СЮю, бО3:, 2019, СО», сові живі, СО457, 55019, Е5Сію, СбОз3, С0р19 Ср, СО8: відповідно. Активовані СО4 Т-клітини були визначені як живі клітини, СО45:, 55019, Р5СІю, Сбрз3, Ср19, са, сові сСОб6о9».

Активовані СО8 Т-клітини були визначені як живі клітини, СО45:, 55010, Е5СІЮю, СО03:, СО19, срАа, Срезі СО69з. Активовані В-клітини були визначені як живі клітини, СО45:, 55019, ЕФ,

Сбоз3 СО19:і СО69х. 572-004 Т-клітини були визначені як живі клітини, СО457, 55019, ЕФ,

СОЗ я, С019-, 5Т2 ж і 604». Еозинофіли були визначені як живі, СО45», (481, СО11с9, Бідіесе",

Альвеолярні макрофаги були визначені як живі, СО45:, 2481 СО11сН, Бідесечі, Дані для активованих клітин виражали як частоту активованих клітин (2069) у межах материнської популяції (СО4, ж 50). Дані для 512-004 Т-клітини виражали як частоту Т-клітин (визначену,

БО як живі клітини, СО45 я, 55019, ЕС, СОЗ та СО19-). Дані для Еозинофілів та Альвеолярних макрофагів виражали як частоту живих клітин. Співвідношення СО4/С0О08 Т-клітин розраховували як відношення частоти СО4 Т до частоти СО8 Т-клітин у популяції живих клітин.

Всі дані наведені в Таблиці 8.

Таблиця 7

Антитіла, що використовуються для аналізу методом протокової цитометрії каталогом розведення

Відіеєє |ВМ421 77 1ВО 77777777 | 562681 | - /го1 дуба 0 |вОм395 ВО 77777777 | 563978 | /г00 щубс 0 ІРЕСу/ Вб 77777777 | 5605939. | 2 щ ло срі9 0 |ВУ650 7 Вб | 562701. | - 1/м00 со3 0 ІРЕСу/ Вб 552774 | г со8 0 |вОМ395.... ВО 77777777 | 563786, | 1/м400

Аналіз легеневого клітинного інфільтрату:

Як показано в таблиці 8, частота еозинофілів, активованих В-клітин, активованих клітин сов, 512-004 Т-клітин і співвідношення СО4/СО8 Т-клітин у легенях ІЛ-33 Нитіп мишей, які отримували НОМ протягом 15 тижнів, з або без терапії антитілом ізотипного контролю була значно вищою, ніж у мишей ІЛ-33 Нитіп, яким вводили тільки 1Х РВ5. Аналогічно, спостерігалася тенденція до збільшення частоти активованих СО4 Т-клітин у легенях ІЛ-33

Нитіп мишей, які отримували НОМ протягом 15 тижнів. Відзначалася тенденція до зниження частоти альвеолярних макрофагів, виявлених протоковою цитометрією в легенях мишей ІЛ-33

Нитіп, які отримували НОМ протягом 15 тижнів, за відсутності або наявності лікування антитілом ізотипного контролю. Вказана частота альвеолярних макрофагів була значно підвищеною в легенях мишей ІЛ-33 Нитіп, які отримували комбінацію анти-ІЛ-33 і антитіл проти

ІЛ-4Р « миші протягом останніх чотирьох тижнів хронічної стимуляції НОМ порівняно з ІЛ 33

Нитіп мишами, яким вводили НОМ з антитілом ізотипного контрольню протягом цього періоду часу. Аналогічно, спостерігалася тенденція до зниження частоти еозинофілів, активованих СО4 і СО8 Т-клітин, активованих В-клітин, 5Т12-004-- Т-клітин, а також відношення СО4/С08 Т-клітин у легенях мишей, які отримували комбінацію анти-ІЛ- 33 і антитіла проти ІЛ-4Р а миші протягом останніх чотирьох тижнів хронічної стимуляції НОМ порівняно з мишами ІЛ-33 Нитіп, яким вводили НОМ з антитілом ізотипного контролю протягом цього періоду часу. Вплив на частоту еозинофілів, альвеолярних макрофагів, активованих СО8 Т-клітин, 52-04 Т-клітин і співвідношення СО4/СО8 в легенях, що спостерігалось для комбінації анти-ІЛ-33 і антитіл проти

ІЛ-4Р а миші, демонструє тенденцію до більшої ефективності, ніж терапія певними антитілами окремо.

Таблиця 8

Частота легеневого інфільтрату клітин, визначена методом протокової цитометрії

Середня Середня Середня Середня Середня с частота частота Середнє частота частота частота ередня еозино-філів альвеолярних відношення активованих активованих активованих частота клітин

Експеримент не - : : : зтТт2агнораху

Й у вказаній макрофагів у | С0А/СО8 Т- клітин у клітин у клітин у її т- аль-на група живій вказаній живій клітин популяції СО4| популяції СОВ8 | популяції В Т- популяції популяції популяції (я 50) Т-клітин Т-клітин клітин пер (х 80) (х 80) (« 80) (« 80) (« 80) («5Б5) 1. Введення 1.45 5.05 3.00 13.12 3.26 0.39 3.25 1Х РВЗ (п-5)) (20.92) (11.64) (41.48) (19.89) (11.64) (-1.17) (14.15)

ЯНОМ 17.08 2.34 6.42 49.95 9.58 4.67 32.60 тижнів (п-4) | (83.94) (70.93) (12.71) (18.76) (7.44) (-1.47ух (-12.23)

Чя НОМ 15.40 4.92 6.95 58.53 15.68 3.70 37.33 тижнів (п-4) | (ЕЗ.99)" (-1.55) (50.71) | (-5.76) (-3.0337 (-1.4497 (ї-8.98)7 4. Стимуля- ція ном 15 знинтіло 15.00 2.33 7.49 57.75 14.59 3.90 37.96 ізотипного (-3.35)" (-1.60) (-1.2837 (17.64) (73.82) (-1.4837 (-16.71у7 контролю (п-) 5. Стимуля- ція НОМ 15 тижнів ж 8.51 7.44 4.03 48.22 13.86 1.72 19.24 анти-ІЛ-33 (7.52) (14.18) (-1.28) (15.66) (15.21) (70.72) (15.72) антитіло (п-5) 6. Стимуля- ція НОМ 15 тижнів ж 12.30 9.93 5.56 53.42 13.11 2.14 35.01 антитіло (ї-7.83) (15.18) (12.22) (16.52) (16.26) (-1.23) (719.83)7 проти ІЛ-4Р а миші (п-:5) 7. Стимуля- ція НОМ 15 антил.3З ї 3.78 14.64 2.96 42.52 7.90 1.74 11.78 антитіла (-1.60) (3.86)! (10.93) (79.79) (-1.30) (10.91) (53.73) проти ІЛ-АРа миші (п-5)

Примітка: Вказана статистична значущість, визначена за допомогою Крускала-Уолліса однофакторного АМОМА з тестом множинного порівняння Данна за отриманими результатами ( - р «0,05, - р«е0,01, порівняно з групами 1: миші ІЛЗ3З3 Нитіп, ведення фізіологічного розчину; Тр«е0.05, порівняно з групою 4: миші ІЛЗЗ Нитіп, стимуляція НОМ 15 тижнів ж антитіло ізотипного контролю).

Відбір легень для кількісного аналізу гістопатології:

Запальна картина, що спостерігається в цій моделі, супроводжується поширеними і серйозними структурними змінами в легенях, підданих експозиції до НОМ, з ознаками метаплазії келихоподібних клітин, збільшення відкладення субепітеліального колагену і значної консолідації легень. Ці патології Є відомими ознаками запальних респіраторних захворювань людини, які сприяють зниженню функції легень і гіперреактивності дихальних шляхів (датев, (2007) Єиг Незріг 9., Чиї; 30 (1): 134-55; Уеопо, (2007) Надіодгарпісх Мау-уУцп; 27 (3): 617-37).

Після знекровлення ліві легені видаляли і поміщали на чашки, що містять З мл розчину 4 95 (м/м) параформальдегіду (Во5іоп Віоргодисіє5, Мо ВМ-155) в 1Х РВ5 і зберігали за кімнатної температури протягом З днів. Потім зразки легень висушували промокуванням фільтрувальним папером і переносили в пробірки, що містили 70 95 етанолу, для гістологічного аналізу. Зразки були відправлені до Нізіозегм, Іпс (сСегптапіом/п, МО) для заливки парафіном, секціонування та фарбування Шифф-йодною кислотою (РАЗ) або Гематоксиліном і Еозином (НЕ).

Кількісне визначення метаплазії келихоподібних клітин:

Метаплазія келихоподібних клітин і гіперсекреція слизу є ознаками багатьох легеневих захворювань, включаючи астму, хронічне обструктивне захворювання легень і кістозного фіброзу (Воиспегаї, (20).13) Ехр І пу Рез. 2013 Мау-дЧип;39(4-5):207-16). Надмірне виробництво слизу призводить до обструкції дихальних шляхів і впливає на деякі важливі наслідки, такі як функція легень, якість життя, пов'язана зі здоров'ям, загострення, госпіталізація і смертність людей (Катобв, РІ, та ін., (2014), Іпї У Спгоп ОбБзігисі Риїтоп Оі5, дап. 24; 9:139-150). РАБ- позитивні келихоподібні клітини і загальні епітеліальні клітини підраховували в міліметровій довжині первинного бронха. Метаплазія келихоподібних клітин виражається як частота РА5Б- позитивних клітин в міліметрі бронхіального епітелію (95, - 50), як показано в Таблиці 9.

Кількісна оцінка легеневої консолідації: "Консолідація легень" визначається як накопичення твердого або рідкого матеріалу в альвеолярному просторі. Консолідація легень є складною кінцевою точкою, яка, ймовірно, відображає поєднання клітинного інфільтрату, гіперплазії та продукування слизу, що використовується тут як вимірювання загальної патології. Відносну частку площі легень, зайнятої кристалічними тілами, кількісно визначали на Момаї пентахром забарвлених залитих парафіном зрізах легень з використанням програмного забезпечення Ітаде.) (МІН, Веїйпезаа,

МО). Використовуючи функцію аналізу частинок, вимірювали загальну площу легені у вказаному зрізі, а також консолідовану площу у вказаному зрізі. Частка консолідованої ділянки легені задається співвідношенням обох вимірювань, як показано в Таблиці 9.

Кількісне визначення субепітеліального фіброзу "Субепітеліальний фіброз" визначається як надлишок відкладення інтерстиціального колагену під легеневим епітелієм (Кедіпдіоп, еї.аІ., (1997), Тпогах, Аргі/Л; 52(4):310-312). Як повідомлялося, підвищений субепітеліальний фіброз специфічно пов'язаний з астмою у людей (Воціеї, еї.аіІ. (1997) Спеві, ушу; 112(1):45-52; датез, АЇ апа УУеп?зеї, 5., (2007), Єиг Везріг у), Ушу, 30(1):134-155). В цій моделі субепітеліальний фіброз вимірювали на Мавбзоп трихром забарвлених залитих парафіном зрізах з використанням програмного забезпечення На! о (Іпадіса

Гаре, ММ). За допомогою інструменту "Товщина шару" вказана товщина колагенового шару під бронхіальним епітелієм записувалася багаторазово, з інтервалами приблизно 30 мкм, в межах міліметру первинного бронха. Субепітеліальний фіброз виражається як середня товщина колагенового шару під епітелієм (мкм, х 50), як показано в Таблиці 9.

Зо Аналіз гістопатології легень:

Як показано в таблиці 9, була тенденція до збільшення метаплазії келихоподібних клітин в легенях мишей ІЛ-33 Нитіп, які отримували НОМ протягом 15 тижнів, з або без терапії антитілом ізотипного контролю порівняно з мишами ІЛ-33 Нитіп, яким вводили тільки 1Х РВ5.

Аналогічно, було значне збільшення консолідації легень, так само як і в субепітеліальній товщини колагену, у мишей ІЛ-33 Нитіп, які отримували НОМ протягом 15 тижнів.

На противагу цьому, була тенденція до зниження метаплазії келихоподібних клітин і товщини субепітеліального колагену і значного зниження консолідації легень у мишей ІЛ-33

Нитіп, які отримували комбінацію анти-1ІЛ-33 і антитіла проти ІЛ-4Р « миші протягом останніх чотирьох тижнів хронічної стимуляції НОМ порівняно з мишами ІЛ-33 Нитіп, яким вводили НОМ з антитілом ізотипного контролю протягом цього періоду часу. Вказані впливи на метаплазію келихоподібних клітин, консолідацію легень і товщину субепітеліального колагену, що спостерігалися для комбінації анти-ІЛ-33 і антитіл проти ІЛ-4Р « миші, показали тенденцію до більшої ефективності, ніж терапія тільки окремими антитілами.

Таблиця 9

Кількісне визначення гістопатології в легенях миші

Середня метаплазія Середня товшина келихоподібних Середня редня товщ . те субепітеліального

Експериментальна група клітин консолідація легень) одагена (мкм) (5 (90 РАБ-позитивнихХ (96 -50) 50) клітин) (- 50) 4. Стимуляція НОМ 15 тижнів антитіло ізотипного контролю 81.60 (-17.56) 84.16 (ї5.85уУ 63.11 (-11.87) п-4 5. Стимуляція НОМ 15 тижнів ж 6. Стимуляція НОМ 15 тижнів антитіло проти ІЛ-4Р а миші 79.82 (525.02) 57.79 (418.72) 57.62 (415.34) п-о 7. Стимуляція НОМ 15 тижнів ж анти-ІЛ-33 ж антитіла проти ІЛ- 19.69 (18.80) 35.01 (120.68) 48.19 (-18.58) 4Р а миші (п-5)

Примітка: Вказана статистична значущість, визначена за допомогою Крускала-Уолліса однофакторного АМОМА з тестом множинного порівняння Данна за отриманими результатами ( - р «0,01, порівняно з групами 1: миші ІЛЗ3З Нитіп, введення фізіологічного розчину).

Збір сироваток для вимірювання ІДЕ та рівнів НОМ-специфічних Ідс1:

Для визначення загальної концентрації (ЧЕ в зразках сироватки для кожної миші був використаний набір сендвіч ЕГІБА ОРТЕЇА (ВО Віозсіепсе5, Ме555248) згідно з інструкціями виробника. Зразки сироватки розводили і інкубували з анти-(ДЕ захоплюючим антитілом, нанесеним на 96б-лункові планшети. Сумарний ІДЕ був виявлений біотинільованим вторинним антитілом проти мишачого ІДЕ. Очищені ІДЕ миші, мічені пероксидазою хрону (НКР), використовували в якості стандарту. Хромаген 3,3, 5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) (набір реагента субстрату ВО ОРТЕЇА, ВО, Мео555214) використовували для вимірювання активності

НЕР. Потім додавали стоп-розчин 1 М сірчаної кислоти і вимірювали поглинання при 450 нм на пристрої для зчитування планшетів Моїесшаг Оемісе5 ЗресігамМах М5. Аналіз даних проводили за допомогою програмного забезпечення Ргізт"М. Вказані середні значення рівнів циркулюючого ІДЕ в сироватці для кожної експериментальної групи виражені як нг/мл (ж 50), як показано в Таблиці 10.

Для визначення рівнів НОМ-специфічних ІдсС1 у зразках сироватки від кожної миші використовували ЕГІЗБА. Планшети з покриттям НОМ (Сгеег, МеХРВ7ОЮЗА2.5) інкубували з серійно розведеними зразками сироватки мишей з подальшою інкубацією з кон'югованим антитілом щура ІдД01-НЕР проти антитіл миші (ВО Віозсіепсе5, Ме559626). Всі зразки проявляли з розчином ТМВ і аналізували, як описано вище. Відносні рівні циркулюючого Ідс1 у сироватці були представлені у вигляді одиниць титру (одиниці титру розраховували, помноживши виміряне значення ОО на коефіцієнт розведення, необхідний для досягнення значення 00450, яке було б більше ніж у два рази, ніж фоновий рівень). Вказані середні рівні циркулюючих НОМ- специфічних ІдсС1 у сироватці для кожної піддослідної групи виражені як титр х 105 (- 503), як показано в Таблиці 10.

Аналіз рівнів циркуляції (ЗЕ ії НОМ-специфічних Ід1

Як показано в таблиці 10, було значне збільшення рівнів циркулюючих ІДЕ в сироватці мишей ІЛ-33 Нитіп, які отримували НОМ протягом 15 тижнів, з або без лікування антитілом ізотипом контролю у мишей ІЛ-33 Нитіп, яким вводили тільки їХ РВ5. Аналогічно,

Зо спостерігалася тенденція до підвищеного рівня циркулюючого НОМ-специфічного ІДС в сироватці мишей ІЛ-33 Нитіп, які отримували НОМ протягом 15 тижнів. Навпаки, було значне зниження рівнів циркулюючих ІДЕ і тенденція до зниження рівнів циркулюючих НОМ- специфічних Ідс1 в сироватці мишей ІЛ-33 Нитіп, яким вводили комбінацію анти-ІЛ-33 і антитіл проти ІЛ-4Р а« мишей протягом останніх чотирьох тижнів хронічної стимуляції НОМ порівняно з мишами ІЛ-33 Нитіп, яким вводили НОМ з антитілом ізотипного контролю.

Таблиця 10

Рівні циркулюючих ІЗЕ і НОМ-специфічних ІДдДО1 в сироватці миші. 2, Середні рівні циркулюючих (мкг/мл) (- 50) 109) (- 50) 4. Стимуляція НОМ 15 тижнів антитіло ізотипного контролю 193.07 (478.96) 1.62 (70.62) п-4 5. Стимуляція НОМ 15 тижнів ж 6. Стимуляція НОМ 15 тижнів антитіло проти ІЛ-АРа миші 11.12 (-8.65) 0.99 (70.56) п-5 7. Стимуляція НОМ 15 тижнів ж анти-ІЛ-33 ж антитіла проти ІЛ- 6.45 (ї55.7931 0.75 (10.30) 4Ра миші (п--5)

Примітка: Вказана статистична значущість, визначена за допомогою Крускала-Уолліса однофакторного АМОМА з тестом множинного порівняння Данна за отриманими результатами (С - р«0,05, и - р«0,01, и - р«0,001 порівняно з групами 1: миші ІЛЗЗ Нитіп, ведення фізіологічного розчину; тр«е0.05, порівняно з групою 4: миші ІЛЗЗ Нитіп, стимуляція

НОМ 15 тижнів «з антитіло ізотипного контролю). н/в: Не визначено.

Комбіноване лікування Н4НОб75Р і анти-тіЛ-4Ра, ініційоване в умовах важкого, змішаного запалення, покращує всі виміряні запальні параметри, зменшуючи більшість до початкових рівнів. Додатково, адитивні ефекти спостерігаються на деяких з найбільш тяжких наслідків, включаючи сукупну макропатологію легень, метаплазію келихоподібних клітин, клітинну інфільтрацію легень і рівні цитокінів. Таким чином, блокування обох шляхів одночасно має потенційну можливість впливати на множинні медіатори запалення в умовах важкого змішаного запалення і тканинної патології і нормалізувати численні параметри до початкового рівня.

Приклад 5: Картування епітопа Н4НУб75Р, що зв'язується з ІЛЗЗ за допомогою водень- дейтерієвого обміну

Для того щоб визначити епітопи ІЛЗ3З3 людини, які розпізнаються анти-ІЛЗЗ антитілом,

Н4іНеОб75Р, були проведені дослідження водень-дейтерієвого (Н/О0) обміну для антитіла, зв'язаного в комплексі з ІЛЗЗ людини. Для експериментів використовували рекомбінантний ІЛЗЗ людини, експресований з С-кінцевою міткою гексагістидину (ЗЕО ІЮ МО: 356). Загальний опис методу Н/О обміну викладено в Епгіпд еї аї. (1999) Апаїуїса! Віоспетівігу 267(2):252-259 апа

Епдеп апа тій (2001) Апаї. Спет. 73:256А-265А. Експерименти з Н/О обміну проводили на інтегрованій платформі Умаїег НОХ/М5, що складається з Іеаріес НОХ РАЇ системи для мічення дейтерієм, УМаїег5 Асдийу М-Сіає5 (допоміжний розчинник) для розщеплення та навантаження зразка, УМаїег5 Асдийу М-Сіазз (нВіпагу допоміжний розчинник) для градієнта аналітичної колонки, і Зупарі 52-51 мас-спектрометр для вимірювання маси пепсинових гідролізатів пептиду.

Розчин для мічення готували в 10 мМ буфері РВ5 в 020 при рО 7,0 (еквівалент рН 6,6). Для маркування дейтерію 3,8 мкл пПІЛЗ33-ММН (96 пмоль/мкл) або пІЛЗ3-ММН, попередньо змішаного

Зо з антитілом в молярному співвідношенні 1: 1, інкубували з 56,2 мкл 020 розчину для мічення різні проміжки часу (2 хв, 10 хв і недейтерований контроль - 0 сек). Дейтерування припиняли шляхом перенесення 50 мкл зразка на 50 мкл попередньо охолодженого 0,2 М ТСЕР, 6 М хлористого гуанідину в 100 мМ фосфатному буфері при рН 2,5 (буфер гасіння) і змішаний зразок інкубували при 1,0 "С протягом двох хвилин. Зразок після гасіння вводили в Умаїег5 НОХ

Мападег для онлайн-розщеплення пепсином/протеазою Хі в реальному часі. Розщеплені пептиди вловлювали на попередню колонку АСОШІТМ ОРІ С ВЕН С18 1.7-мкм, 2.1 х 5 мм

Мапомага при 0 "С і елювали на АСОШІТУ ОРІ С ВЕН С18 1.7-мкм, 1.0 х 50 мм з використанням 9-хвилинного розділення в градієнті 5 95 -40 96 В (рухома фаза А: 0,1 96 мурашина кислота у воді, рухома фаза В: 0,1 96 мурашина кислота в ацетонітрилі). Мас-спектрометр встановлювали на напругу конуса 37 В, час сканування 0,5 с і діапазон маса/заряд 50-1700 ТИ.

Для ідентифікації пептидів з ПІЛЗ3-ММН, І С-М5Е дані з недейтерованого зразка обробляли і шукали по базі даних, включаючи людський ІЛЗ3, пепсин і їх рандомізовані послідовності за допомогою програмного забезпечення Умаїегє Ргоїеіпі упх СіІоБра! Зегмег (РІ О5). Вказані ідентифіковані пептиди імпортували в програмне забезпечення Бупатх і фільтрували за двома критеріями: 1) мінімальна кількість продуктів на амінокислоту: 0,3 і 2) поріг файлу реплікації: 3.

Після цього програмне забезпечення ЮупатХ автоматично визначало поглинання дейтерію кожним пептидом на основі часу утримання та високої точності маси («10 ррт) в декількох часових точках з З повторами в кожній часовій точці.

Використовуючи колонку пепсин/протеаза ХІЇ в режимі реального часу, з'єднану з М5ЄЕ збором даних, загалом 68 пептидів з ПІЛЗ33-ММН були ідентифіковані у відсутності або присутності Н4НОбБ75Р, що становить 95 96 охоплення послідовностей. Одинадцять пептидів мали значно знижене поглинання дейтерування (значення дельти центроїда» 0,4 дальтон з р- значеннями «0,05) при зв'язуванні з Н4АНУОб75Р і наведені в Таблиці 11. Зафіксована пептидна маса відповідає середньому значенню маси центроїда МН" з трьох повторів. Ці пептиди, що відповідають амінокислотам 1-12 і 50-94 з 5ЕО ІО МО: 349), мали більш низьку швидкість дейтерування при зв'язуванні Н4Неб75Р. Ці ідентифіковані залишки також відповідають залишкам 112-123 і 161-205 ІЛ-33 людини, як визначено за допомогою запису Опіргої 095760 (ІЛЗ3З3 НОМАМ); див. також 5ЕО ІЮ МО: 348). Ці дані підтверджують, що амінокислотні залишки 112-123 і 161-205 5ЕО ІО МО: 348, або амінокислотні залишки 1-12 і 50-94 5ЕО ІЮ МО: 349 визначають, принаймні частково, зв'язуючу ділянку в ІЛ- 33 для антитіла Н4АНУб75Р.

Зо

Таблиця 11

Пептиди ІЛЗЗ людини зі значним зниженням дейтерування при зв'язуванні з Н4АНОб75Р

Номери на основі ІлЗЗ Ілзз-нАНевТоР ІлЗЗ Ілзз-нАневт5Р

ФЕО І Центроїд МН: | Центроїд МН" Центроїд МН Центроїд МН

МО: 349 (71-94 |2815.35:50.05 | 2814.48х0.00 )|-0.87 | 2816.06:50.12 | 2815.10:0.12 | -0.96

Приклад 6: Вплив антитіла ІЛ-33 (КЕСМ3500) та антитіла проти ІЛ-4Р (дупілумаб), окремо або в комбінації, в 19-тижневій моделі індукованого алергеном запалення легень з використанням ІЛ-33-, ІЛ-4- та ІЛ- 4Ральфа-гуманізованих мишей

Вказаний вплив тільки антитіла ІЛ-33 окремо, тільки антитіла проти ІЛ-АР окремо, або комбінації обох антитіл спочатку тестували в прикладі 4 вище, використовуючи мишей, які були гомозиготними по експресії ІЛ-33 людини замість ІЛ- 33 мишей (миші ІЛ-33 Нитіп; див.

Публікації патентів США МоМо 2015/0320021 і 2015/0320022). Повністю людське анти-1Л-33 антитіло (КЕСМ3500) і анти-мишаче ІЛ-4Ра антитіло або комбінацію обох порівнювали в цій моделі і результати описані в Прикладі 4.

Оскільки ні вказане анти-ІЛ-33 антитіло людини (КЕСМ3500), ні анти-ІЛ-4Р антитіло людини (дупілумаб) не зв'язують відповідні їм цільові білки миші, були створені генетично модифіковані миші, у яких ІЛ-33, ІЛ-4 мишії, і ектодомен ІЛ-4Р а були замінені відповідними послідовностями людини (ІЛігагчти |ДАлили | ДЗЗ), Лінія мишей ІЛагаготи | Дапо/ли | ДЗ3лчти була підтверджена як інструмент для дослідження ефекту введення КЕСМ3500 і дупілумабу з використанням 4- тижневої моделі індукованого експозицією до НОМ легеневого запалення. У цій моделі миші

ІЛа4гагйчи |ЛАйо/ли | ЛЗ, діддані стимуляції НОМ, демонстрували імунні відповіді, подібні до відповідей мишей дикого типу, що оцінювали по еозинофільній інфільтрації легень.

Дослідження, описане нижче, було проведено, щоб визначити, чи може одночасна блокада шляхів ІЛ-33 ї ІЛ-АЛЛ-13 мати більший вплив на запалення легень, ніж блокування будь-якого шляху окремо. У цьому дослідженні ІЛАгагели |ЛАйшни |ЛУЗпяти мишей інтраназально (ІМ) піддавали експозиції до НОМ або фізіологічного розчину протягом 19 тижнів. Контрольну групу

ІЛа4гайчти |ЛАйполи | ЛЗЗпшиНи мишей забивали після 11 тижнів стимуляції НОМ для оцінки тяжкості захворювання на початку лікування антитілами. Миші, яким вводили НОМ протягом 19 тижнів або не отримували терапії антитілами, або отримували підшкірні (5С) ін'єкції антитіл двічі на тиждень від 12-го тижня до 19-го тижня експозиції до НОМ загалом протягом 8 тижнів і 16 доз.

Наступні антитіла вводили в кінцевій дозі протеїну 11 мг/кг: (а) 11 мг/кг антитіла ізотипного контролю, (Б) 1 мг/кг КЕСМ3500--10 мг/кг антитіла ізотипного контролю (с) 10 мг/кг дупілумабу ж 1 мг/кг антитіла ізотипного контролю, або (4) 1 мг/кг КЕСМ3500-10 мг/кг дупілумабу. Ефект терапії КЕСМ3500 і дупілумабом окремо або в комбінації, на мишей, підданих експозиції до

НОМ, оцінювали за такими патологічними маркерами запалення дихальних шляхів: - макропатологія (відносна вага легень) - Інфільтрація легеневої тканини клітинами запалення 1 типу (нейтрофіли, кількісно визначені за рівнем протеїна нейтрофільного маркера мієлопероксидази легень |МРОЇ) і запальних клітин типу 2 (загальна і активована |(СО11сНДЗеозинофіли і 5712004: Т-клітини, кількісно визначені методом протокової цитометрії - рівні запального протеїна цитокіна легень (ІЛ-4 людини і ІЛ-5, ІЛ-б6, ІЛ-1В8, ФНПс, ІЄМУу, ско, і МСР-1 мишей, кількісно визначені за допомогою імуносаналізу)

Зо - Рівні циркулюючого системного маркера запалення, протеїна сироваткового амілоїду А

ІЗААЇ (визначали кількісно з допомогою імуноаналізу)

Матеріали та методи

Тест-система

Миші гуманізовані по ектодомену ІЛ-33-, ІЛ-4 і ІЛ-АРа

Ні КЕОМЗ3500, ні дупілумаб не зв'язують ІЛ-33 миші або ІЛ- 4Ка миші відповідно. Отже, для того, щоб протестувати КЕСМ3500 і дупилюмаб паралельно і в комбінації, були створені генетично модифіковані миші, в яких ІЛ-33, ІЛ-4 миші і ектгодомен ІЛ-4Р с були замінені на відповідні послідовності людини (ІЛ4А4гагони |ЛАйоти |Лудзпятя, Ця потрійна гуманізована лінія мишей була створена з використанням технології Меіосісепе? в Кедепегоп Рпаптасеціїсаі5 (Маіепгиєїа, ОМ, єї аї. Маї Віоїесппої. (2003), дип;21(6):652-9, Ройеутігои, М/Т, еї аї. Маї

Віотесппої. (2007) дап; 25 (1): 91-9) шляхом схрещування раніше охарактеризованої лінії мишей

ІЛ-АЛЛ-4Р а ІЛагайшни | Дд поли з раніше охарактеризованою ІЛ-33-гуманізованою лінією ІЛУдпони,

Модель запалення легень у мишей

У моделі запалення легень у мишей використовується повторна інтраназальна (ІМ) експозиція до екстракту НОМ, який служить джерелом алергену кліща домашнього пилу (Чонп5оп еї аї.; Атегісап Удошгпа! ої Везрігаїюгту апа Стйїса!І Саге Медісіпе; (2004) Ееб 1;169 (3):378-85), і є суттєвою причиною домашньої алергії у людей (Саїдегоп, еї аї., (2015),

Везрігаюгу аПегау сайзед Бу Нпоизе диві тіїев: М/наї до уе геаїйу Кпом/? .) АПегау Сіїп Іттипої. 2015 ди;136 (1):38-48). Як повідомляється, хронічна експозиція до НОМ викликає серйозне запалення легень, що призводить до значного легеневого інфільтрату клітин, експресії цитокінів і ремоделювання. Зокрема, було продемонстровано, що у мишей, які хронічно піддавалися експозиції до НОМ, виявляють запалення легень змішаного фенотипу типу 1/гтипу 2, таких як інфільтрація тканин запальними клітинами типу 1 і 2 (нейтрофіли і еозинофіли, відповідно), підвищений сироватковий ІДЕ, підвищений сироватовий НОМ-специфічний ІДС1Ї, а також індукція запальних цитокінів типу 2, таких як ІЛ-5 їі ІЛ-1З3 (Чоппзоп, вї аї. (2004), Атегісап уЧоштпаї ої Везрігайгу апа Стййса! Саге Медісіпе; Ге 1;169 (3):378-85; доппзоп, єї аї. (2011). Ріо5 ОМЕ.

Уап 20;6 (1ухе16175; Пор-Сиеємага, евї а!., (2008), Ріо5 ОМЕ, дип 11;3(6):62426.

Схема досліду

Модель індукованого чотиритижневою експозицією до НОМ запалення легень бо Самки мишей генотипів, вказаних в Таблиці 12, були рандомізовані на 2 групи кожна на генотип. Фізіологічний розчин (20 мкл) або 50 мкг НОМ, розведений в 20 мкл фізіологічного розчину, вводили ІМ З рази на тиждень протягом 4 тижнів. Всі миші мали змішаний фенотип

С57ВІ /6МТГас/129565уиЕмТас. Мишей забивали через 4 дні після останньої експозиції, збирали легені і визначали інфільтрацію легень еозинофілами.

Таблиця 12

Експериментальний протокол для 4-тижневої моделі НОМ . Тривалість розчину

В о одикийтиї/////77С | 5 50 мкг НОМ розчину 01117171 Плюти 50 мкг НОМ розчину 50 мкг НОМ розчину

ІЛаганоть | Лапи 50 мкг НОМ розчину

ІЛаганоно Лапи |Лузпото 50 мкг НОМ

Дикий тип - С57ВІ /ЄМТас/129565хЕмТас

Модель індукованого 19-тижневою експозицією до НОМ запалення легень

ІЛі4гайчоти |Лапини |ДЗЗйоти миші, використані в цьому дослідженні, мали змішаний фон

С57ВІ/6МТас (72 95)/1295655ЕмТас (28 95); Самки мишей були рандомізовані в 7 окремих груп.

Експозиція до НОМ та терапія або контрольний протокол дозування для кожної групи мишей показані в Таблиця 13

Фізіологічний розчин (20 мкл) або 50 мкг НОМ, розведений в 20 мкл фізіологічного розчину, вводили ІМ З рази на тиждень протягом 19 тижнів. Контрольну групу ІЛагайчти | Данон | ДЗЗ попи мишей забивали після 11 тижнів екпозиції до НОМ для оцінки тяжкості захворювання на початку лікування антитілами. Миші, які піддавалися експозиції до НОМ протягом дев'ятнадцять тижнів, або не отримували терапії антитілами, або отримували підшкірні ін'єкції (ЗС) два рази на тиждень від 12-го тижня до 19-го тижня експозиції до НОМ загалом 16 доз антитіл, як зазначено в Таблиці 13. Коротко, наступні антитіла вводили в кінцевій дозі протеїну 11 мг/кг: 11 мг/кг антитіла ізотипного контролю (група 0), 1 мг/кг КЕСМ3500-410 мг/кг антитіла ізотипного контролю (група Е), 10 мг/кг дупілумабу «т 1 мг/кг антитіла ізотипного контролю (група РЕ), або 1 мг/кг КЕСМ3500-4-10 мг/кг дупілумабу (група б). Для цілей цього документа групи подвійної терапії антитілами (групи О0-С:ї;) будуть ідентифіковані тільки за допомогою терапевтичного антитіла (КЕСМ3500 та/або дупілумаб). На 134-у добу дослідження, через 4 дні після останньої

ІЇМ експозиції та ін'єкції антитіл, всіх мишей забивали, кров збирали за допомогою серцевої пункції, і легені збирали для аналізу.

Таблиця 13

Експериментальний протокол для 19-тижневої моделі НОМ експозиції (тижні) (мг/кг) 20 мкл

А 5 фізіологічного 19 Нічого Нічого розчин

В 19 50меНнОМ | (11 |Нчою 77777777 11711 Ніною

Со 19 50меноОМ | 19 |Нчою 77777777 1171 Ніною р 19 5омкеноОмМ | 19 Моба4бКонтроль р /.:.:.|.//:/:|:/: | 1 С

Е 18 5омкнОМ | 19 |дупілумабюіюс4" Контроль. 1041 6 181 5ОмкноОмМ | 719 |ВЕОМЗ3500 єдупілумаб.д/ | 1-40

ІДа4Р Контроль - антитіло ізотип-відповідне контролю, КЕСМ1945

Розведення мишей

Протягом усього періоду кожного експерименту тварини залишалися у приміщенні для утримування тварин Кедепегоп за стандартних умов і акліматизувалися протягом щонайменше 7 днів до їхнього відбору на дослідження. Всі експерименти на тваринах проводили у відповідності з вказівками Комітету по утриманню та використанню лабораторних тварин в

Ведепегоп.

Спеціалізовані процедури

Вимірювання відносної маси легень

Вимірювання кінцевої маси тіла реєстрували перед забиттям. Після знекровлення ліву легеню з кожної миші видаляли і поміщали в пробірку, що містить розчин 4 95 параформальдегіду. Сиру масу лівої легені від кожної миші реєстрували за шкалою Мешег

Тоїеєдо Мем СІазбзіс М5. Для визначення питомої ваги легень відношення сирої маси легень (в мг) до маси тіла (в г) обчислювали шляхом ділення сирої маси легені на масу тіла.

Аналіз клітинних інфільтратів легень

Після знекровлення, нижня частка правої легені з кожної миші була вилучена, поміщена в пробірку, що містила розчин 20 мкг/мл ЮОМабзе І ії 0,7 О/мл Іірегахзе ТН, розведений у збалансованому сольовому розчині Хенка (НВ5З5), і розрізана на шматки розміром приблизно від 2 до З мм. Пробірки, що містили нарізані на шматки частки легені, потім інкубували на водяній бані з температурою 37" С протягом 20 хвилин. Вказану реакцію зупиняли додаванням етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕОТА, сірсо, Мо 15575) в кінцевій концентрації 10 мМ. Потім зразки переносили в пробірки даепіемАС5 С. Потім додавали 2 мл буфера ашомАСЗ і далі зразки дисоціювали з утворенням суспензій окремих клітин, використовуючи депіемАсС5" дисоціатор (МіІЛіепуі Віоїес). Потім вказані пробірки центрифугували і отриманий осад ресуспендували в 4 мл їх буфера для лізису еритроцитів, щоб лізувати еритроцити. Після інкубації протягом З хвилин за кімнатної температури додавали 2,5 об'єми 1Х ОРВ5 для деактивації вказаного буфера для лізису еритроцитів. Потім вказані суспензії клітин центрифугували, і отримані осади клітин повторно ресуспендували в 1 мл ОРВ5. Вказані

Зо ресуспендовані зразки фільтрували через чашоподібний фільтр 50 мкм йсоп і переносили в планшет з лунками об'ємом на 2 мл. Вказаний планшет центрифугували протягом 4 хв при 400 д і кожен зразок ресуспендували в 1 мл ОРВ5. Приблизно 1.5 х 105 клітини на лунку висівали в 9б-лунковий планшет з МО-подібним дном. Потім клітини центрифугували і осад клітин ресуспендували в 100 мкл ГІМЕ/0ЕАО фіксуючого барвника мертвих клітин, розведеного 1: 500 в 1Х ОРВ5З для визначення життєздатності клітин. Клітини інкубували з барвником для визначення життєздатністю протягом 15 хвилин за кімнатної температури у захищеному від світла місці. Після одного відмивання в 1Х ОРВ5, клітини інкубували з очищеним блокуючим антитілом щура проти Ес СО16/С032 миші, розведеним 1:50 в 50 мкл буфера ашомМАс5 протягом 15 хвилин за 4 "С. Потім клітини інкубували у відповідній суміші 2х антитіл, розведеній в буфері Вгійапі Зіаіп (описано в Таблиці 14) протягом 30 хвилин за 4 "С у захищеному від світла місці. Після інкубації з антитілами вказані клітини двічі промивали в буфері ашомМАсС5, ресуспендували в ВО СуюБРіх, розведеному 1: 4 в 1Х ОРБВЕХ, і потім інкубували протягом 15 хвилин за 4"С, у захищеному від світла місці. Потім вказані клітини промивали і ресуспендували в буфері ашомАС85. Потім клітинні суспензії фільтрували в новий планшет з дном О-форми через фільтрувальний планшет АсгоРгер Адмапсе 96 30-40 мкм. Дані зразків були отримані на аналізаторі клітин Ї5Е Ропебзбза Х-20 з використанням додатку НТ5 (ВО

Віозсіепсе5). Аналіз даних проводили за допомогою програми РіІомл)о Х 5оймаге (Тгее Заг, ОК) і статистичний аналіз проводили за допомогою сгарпРай Ргізт " (СтарпРайд боймагеє, СА).

Стратегія гейтування для еозинофілів (загальних і активованих)

Еозинофіли були визначені як інтактні, поодинокі, живі клітини (низький сигнал барвника життєздатності ІПМЕ/ЮЕАЮ), 0457, Е4/80-, І убс, 5ідіесі". Дані для еозинофілів були виражені як частота живих клітин. В популяції еозинофілів активовані еозинофіли були визначені як інтактні, поодинокі, живі, СО45:, Е4/807, Губа, бідіесї:", СО11сні ї виражені як частота від загальних еозинофілів.

Стратегія гейтування для 512004» Т-клітин

ЗТ2С04: Т-клітини були визначені як інтактні, окремі, живі, СО45:, СО03:, СО19, браз, СО87,

ЗТ27. Дані для 512004» Т-клітин були виражені як частота СО4- Т-клітин (інтактні, поодинокі, живі, 6045, СО3, 6019, бра, 2083.

Таблиця 14

Антитіла, що використовуються для аналізу протокової цитометрії

Кінцеве

Антитіло Флуорохром Виробник | Номер по каталогу Номер лоту розведен- ня

Зідієє-є |ВУ421 Іво (562681 |4234913/6007723 | 1/200

БаВоО |ІРЕ 7 |1ВО 565410 |5168715/5257914 | 1/500 уба |вОу395 |во 563978 |5156800/7103737 | /200

СО1їс |Регср-Суб5 |во (560584 |5148566/7074758 | 1/200 со19 Щ|вВОМ7З7 0 |во 1564296 |63156б61ї | 1/200 со3 ІРЕСу/ ВО 1552774 70747697 | 1/200 со8 |вОу395 |во 563786 6245983 7..-:К.Г. | 1/200 ср4 |вМ786 |во 15633931, 70755037 | 1/2

Визначення рівнів протеїна легень

Після знекровлення верхню і середню частки правої легені з кожної миші видаляли, зважували і поміщали в пробірки, що містили розчин екстракційного реагенту тканинного білка (Т-РЕК), доповненого сумішшю інгібіторів протеази. Для досягнення кінцевого співвідношення 1:8 (м//м) ваги тканини легені до об'єму Т-РЕК, додавали по 8 мкл розчину Т-РЕК (містить суміш інгібіторів протеаз) на мг тканини. Зразки легень механічно гомогенізували за допомогою

Тівзцеї! ухег ІЇ. Отримані лізати центрифугували для осадження дебрісу. Супернатанти, що містять розчинні протеїнові екстракти, переносили у свіжі пробірки і зберігали при 4 "С до подальшого аналізу. Цитокіни і концентрації МРО були виражені як загальна кількість протеїну на досліджувану частку (нг/легеневу частку і мкг/легеневу частку відповідно).

Мульфакторний імуноаналіз цитокінів

Концентрації цитокінів миші (ІЛ-5, ІЛ-13, ІЛ-б6, ІЛ-1рД, ІЛ-12р70, ФНПс, ІЕМу, ОКО і МОР-1) в

Зо протеїнових екстрактах легень були виміряні з використанням набору для мультифакторного імунологічного аналізу (Сивіот тоизе 10-Ріех, М50), згідно до інструкцій виробника. Коротко, зразки гомогенату легень розбавляли і інкубували на планшетах з попередньо нанесеними антитілами для захоплення. Калибраторні протеїни, надані виробником, використовувалися як стандарти. Цитокіни у вказаних гомогенатах детектували за допомогою мічених детектуючих антитіл, інкубованих з Кеай Вийег. Електрохемілюмінісценцію відразу зчитували на приладі

М50О Ббресю!?. Аналіз даних проводили за допомогою програмного забезпечення сгарпРай

Ргізт. Найнижча концентрація стандарту в межах лінійного діапазону кожного аналізу була визначена як нижня межа кількісного аналізу (ГГ ОС) для відповідного цитокіну. Значення ГП ОО для окремих тестованих цитокінів були наступними: ІЄМу - 0,2 пг/мл, ІЛ-1ф8 - 1,6 пг/мл, ІЛ-5-0,2 пг/мл, ІЛ-6-1,4 пг/мл, ІЛ-12р70-125,8 пг/мл, ІЛ-13-24,4 пг/мл, КО: 0,5 пг/мл, МСР-1-9,8 пг/мл,

ФНПа : 2.4 пг/мл.

ЕМІЗА ІЛ-4 людини

Концентрації ІЛ-4 людини в протеїнових екстрактах легень вимірювали за допомогою набору для сендвіч-ЕЇГ І5А згідно з інструкціями виробника (Оцапіїкіпе ЕГІЗА для ІЛ-4 людини,

КО Зузіетв5). Коротко, гомогенати легень розбавляли і інкубували на 96-лункових планшетах, попередньо покритих антитілом для захоплення антитіл проти ІЛ-4 людини. Очищений 1ІЛ-4 людини використовували в якості стандарту. Захоплений ІЛ-4 людини був виявлений з використанням НКР-кон'югованого антитіла для детекції проти ІЛ-А4 людини. Активність НКР виявляли за допомогою хромагена 3,3", 5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ). Потім додавали стоп- розчин і оптичну густину на 450 нм (ОО55о) вимірювали на пристрої для зчитування планшетів

МоїІесшіаг Оемісе5 ЗресігаМах М5. Аналіз даних проводили за допомогою програмного забезпечення сгарпРай Р'гізхт. Найнижчу концентрацію стандарту в межах лінійного діапазону аналізу визначали як Г. 00-31,25 пг/мл.

ЕИЗА МРО

Концентрації МРО в протеїнових екстрактах легень вимірювали за допомогою набору для сендвіч ЕГІБА згідно інструкцій до виробника (набір ЕГІЗА для МРО миші, Нусиї Віоїесй).

Коротко, гомогенати легень розбавляли і інкубували на 96-лункових планшетах, попередньо покритих антитілом для захоплення МРО. Очищену МРО миші використовували в якості стандарту. Захоплену МРО детектували з використанням детектуючого біотинільованого антитіла проти МРО миші. Очищений НКР-кон'югований стрептавидин використовували для виявлення біотинільованого антитіла проти МРО миші. Активність НКР виявляли за допомогою хромагена 3,3, 5,5'--етраметилбензидина (ТМВ). Потім додавали стоп-розчин і оптичну густину при 450 нм (ОЮО45о) вимірювали на пристрої для зчитування планшетів МоїІесшаг ЮОемісе5

ЗресігаМах М5. Аналіз даних проводили за допомогою програмного забезпечення СгарпРай

Ргізт. Найнижчу концентрацію стандарту в межах лінійного діапазону аналізу визначали як

ГГ.О0о0-156.3 пг/мл.

Збір сироваток

Цільну кров збирали в пробірки Місгоїаїплег шляхом серцевої пункції в кінці дослідження.

Крові давали утворити згусток, залишаючи її без зтрушування за кімнатної температури

Зо протягом щонайменше 30 хвилин. Згущену кров і клітини осаджували центрифугуванням при 18000 д протягом 10 хвилин за 4 "С. Отриманий надосад, позначений як сироватка, переносили в чисті поліпропіленові планшети і використовували для визначення рівня циркулюючих антитіл, як описано нижче.

Визначення рівнів ЗАА в сироватці за допомогою ЕГІЗА

Загальні концентрації 5БАА у вказаних зразках сироватки кожної миші визначали з використанням комерційного імунологічного аналізу (Оцапікіпе ЕГІЗА, КУО Бузіетв) згідно з інструкціями виробника. Коротко, зразки сироватки розводили і інкубували на 96б-лункових планшетах, попередньо покритих моноклональними антитілами для захоплення 5АА миші.

Рекомбінантний ЗАА миші використовували в якості стандарту. Захоплений 5АА детектували з використанням НКР-кон'югованого поліклонального детектуючого антитіла проти 5БАА миші.

Активність НКР виявляли за допомогою колориметричного субстрату НКР ТМВ. Потім додавали стоп-розчин розведеної соляної кислоти і ОЮО45о вимірювали на пристрої для зчитування планшетів Моїесшаг Оемісе5 ЗзресігаМах М5. Концентрацію циркулюючого ЗАА в сироватці крові для кожного зразка визначали як нг/мл і відображали на графіку у вигляді мкг/мл. Аналіз даних проводили за допомогою програмного забезпечення СгарпРай Ргізт.

Найнижчу концентрацію стандарту в межах лінійного діапазону вказаного аналізу визначали як

ЇГ00-31,2 пг/мл.

Визначення рівня ІЗЕ сироватки за допомогою ЕГІЗА

Загальні концентрації ЧЕ у зразках сироватки для кожної миші визначали з використанням колориметричного набору сендвіч ЕГІЗА ОРТЕЇА відповідно до інструкцій виробника. Коротко, зразки сироватки розводили і інкубували на 9б-лункових планшетах, попередньо покритих моноклональними антитілами для захоплення ІДЕ. Очищені ДЕ миші використовували в якості стандарту. Захоплені ІДЕ детектували з використанням детектуючого біотинільованого антитіла проти ІДЕ миші. Очищений НКР-кон'югований стрептавідин використовували для детекції біотинільованого антитіла проти ІДЕ миші. Активність НЕР виявляли за допомогою ТМВ. Потім додавали 2М стоп-розчин розведеної соляної кислоти і ОЮл5о вимірювали на пристрої для зчитування планшетів МоїЇесціаг Оемісе5 ЗресігамМах М5. Концентрація циркулюючого ІДЕ в сироватці для кожного зразка була виражена у мкг/мл. Аналіз даних проводили за допомогою програмного забезпечення СгарпРай Ргізт. Найнижчу концентрацію стандарту в межах 60 лінійного діапазону вказаного аналізу визначали як ГІ. 00-78,15 пг/мл.

Визначення рівнів НОМ-специфічних ІдО1 сироватки за допомогою ЕГІЗА

Для визначення рівнів НОМ-специфічних ІдС1!1 у зразках сироватки було розроблено колориметричний аналіз ЕГІ5А. На планшети сорбували НОМ в концентрації 4 мкг/мл у натрій- фосфатному буфері (РВ5) протягом ночі за 4 "С, промивали, блокували розчином 0,5 95 ВЗА в

РВ5 протягом 1 години за кімнатної температури і інкубували з серійно розведеними зразками сироватки миші. Через 1 годину за кімнатної температури планшети промивали і антитіла Ідс1, захоплені на планшети, детектували шляхом інкубації з НЕР-кон'югованим антитілом щура проти ДС1 миші протягом 1 години за кімнатної температури. Активність НКР детектували за допомогою ТМВ. Потім додавали 2М стоп-розчин розведеної соляної кислоти і ОЮх450 вимірювали на пристрої для зчитування планшетів Моїесшаг ЮОемісе5 ЗресігаМах М5. Відносні рівні Ї(ДС1 в сироватці були представлені у вигляді одиниць титру. Одиниці титру обчислювали шляхом множення вимірюваної ОЮ»а5о на коефіцієнт розведення, необхідний для досягнення

ОО»ао, який був би більше ніж у 2 рази, ніж фонове значення ОЮОг50о. Аналіз даних проводили за допомогою програмного забезпечення сСгарпРай Ргіхт. Найнижчий коефіцієнт розведення, який використовується в цьому аналізі, визначали як І 002-100.

Визначення рівнів мішень-специфічних Ід(4 антитіл людини методом ЕГІЗА

Концентрація антитіла людини (ЕЕСМ3500, дупілумаб, або Ідс4Р ізотипного контролю) у зразках сироватки для кожної миші визначали з використанням колориметричного сендвіч-

ЕІ5А, розробленого для детекції антитіл (9054 людини. Лунки для мікротитрування покривали антигеном, специфічним для вимірюваного антитіла людини, тобто ІЛ-33 людини (КЕСМ3931) для захоплення КЕСМ3500, ІЛ-4Р а людини (КЕСМ560) для захоплення КЕСМ668, Машгаї Реї а 1 для захоплення КЕСМ1945, при концентрації 2 мкг/мл в РВ5 протягом ночі за 4 "С. Лунки промивали чотири рази 0,0595 Тмееп 20 в ЮРВ5, блокували розчином 595 ВБА в ОРВ5 протягом З годин за кімнатної температури і інкубували з серійно розведеними зразками сироватки миші або серійно розведеними калібрувальними стандартами. Очищені антитіла (ВЕСОМ3500, БЕСМ668 і Ідс4Р контрольне антитіло) використовували в якості стандартів для калібрування і кількісного визначення відповідних концентрацій антитіл в сироватці. Через 1 годину за кімнатної температури планшети 7 разів промивали, і Їд054 людини, захоплений на планшети, детектували з використанням біотинільованого моноклонального антитіла миші,

Зо специфічного до /ідс4 людини з наступною інкубацією з Роу НЕР, кон'югованою зі стрептавідином. Активність НЕР детектували за допомогою субстрату ТМВ згідно з інструкціями виробника. Через 10 хвилин вимірювали абсорбцію на 450 нм з використанням мультимодального пристрою для зчитування планшетів Моїесшаг ЮОемісе5 ЗресігаМах.

Найнижчу концентрацію стандарту (ВЕСМ3500, БЕСМ668 або ІдсС4Р контрольне антитіло), використовувану для калібрування (0,002 мкг/мл), визначали як ТО) цього аналізу. Аналіз даних проводили за допомогою СгарпРай Ргізт" (сгарпРад боймаге, СА). Концентрацію антитіл людини в сироватці для кожного зразка виражали у мкг/мл.

Статистичний аналіз

Статистичні аналізи проводили з використанням ОСгарпРай Ргізт версії 7.0 (СгарпРай

Боїймаге, СА).

Статистичний аналіз даних з характеристик ІЛ-33-, ІЛ-4 і ІЛ-А4Р а-гуманізованих мишей у 4- тижневій моделі експозиції до НОМ

Результати інтерпретували двофакторним дисперсійним аналізом (АМОМА), з наступним тестом Тьюкі для множинного порівняння за отриманими результатами. Відмінності вважалися статистично значущими при р«:0,05.

Статистичний аналіз даних від терапії КЕСМ3500/дупілумабом у моделі легеневого запалення, індукованого 19-тижневою експозицією до НОМ

Нормальність даних оцінювали за допомогою тесту Шапіро-Вілка. Якщо дані пройшли тест на нормальність, а стандартні відхилення різних груп статистично не відрізнялися один від одного за оцінкою за тестом Брауна-Форсайта, результати інтерпретувалися методом однофакторного АМОМА з тестом Тьюкі для множинного порівняння за отриманими результатами. Якщо дані не пройшли тест на нормальність, або стандартні відхилення суттєво відрізнялись, результати інтерпретували з використанням тесту Крускала-Уолліса з ретроспективним тестом Данна для множинних порівнянь. Відмінності вважалися статистично значущими при ре0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ

Характеристика мишей, гуманізованих по ІЛ-33-, ІЛ-4 і ІЛ-4АРа-ектодомену

Дикий тип, ІЛУЗполи- і ІЛагагете-одиночно гуманізованих, ІЛагаготи |ДАйоли- подвійно гуманізованих, і ІЛагайоти |ЛАдйотц|Лудзичти-потрійно гуманізованих мишей піддавали ІМ бо фізіологічному розчину або НОМ З рази на тиждень протягом 4 тижнів. Мишей забивали через 4 дні після останньої експозиції, і легені збирали для оцінки інфільтрації легень активованими еозинофілами, ідентифікованими за високою експресією СО11с. Індивідуальні дані миші та статистичний аналіз наведено на Фіг. 2. Потрійно гуманізовані ІЛагаглоти |ДАно/пи |Лудлти миші показали стійку відповідь на НОМ, аналогічно до мишей дикого типу, про що свідчить значне збільшення частоти активованих еозинофілів в легеневій тканині після 4 тижнів експозиції до

НОМ. Миші ІЛагагчти |ЛА пили |ЛЗЗ поли і миші дикого типу також демонстрували подібну частоту активованого еозинофілу в легеневій тканині за відсутності експозиції до НОМ (контрольні миші, яким вводили фізіологічний розчин). Не було виявлено статистично значущих відмінностей при порівнянні НОМ-експонованих мишей дикого типу з НОМ-експонованими мишами з будь-якої з перевірених ліній гуманізованих мишей, за винятком ІЛаігагти одиночно гуманізованих мишей.

Відсутність статистично значущого індукованого експозицією до НОМ збільшення відсотка активованої еозинофільної інфільтрації легень в ІЛі4гаготн мишей, ймовірно, обумовлена тим, що ІЛ-4 миші не бере участь у сигналінгу через рецептор ІЛ-4Р а людини. Показано, що ІЛ-33 людини, з іншого боку, бере участь у сигналінгу через рецепторний комплекс (КЕСМ3500-МХ- 16069) миші. Крім того, не спостерігалося статистично значущих відмінностей, у порівнянні дикого типу мишей, яким вводили фізіологічний розчин з мишами від будь-якої з перевірених ліній гуманізованих мишей, яким вводили фізіологічний розчин. Ці дані підтверджують придатність вказаних ІЛагаготи |Лдпони | ДЗЗ лоти діній мишей для використання в якості моделі індукованого НОМ-експозицією запалення легень у мишей.

Вплив терапії КЕСМ3500 і Дупілумабом у мишей з 19-тижневою експозицією НОМ

Мишам ІЛагагони |ДаАйоти |ДЛУЗпшни |М вводили фізіологічний розчин або НОМ 3 рази на тиждень протягом 11 або 19 тижнів. Чотири групи мишей, піддані 19-тижневій експозиції до НОМ отримували двічі на тиждень ЗС-ін'єкції антитіл з 12-го тижня до 19-го тижня; всі інші групи не отримували терапії (нічого, світло-сірі квадрати). Антитіла вводили окремо або в комбінації в кінцевих дозах протеїна 11 мг/кг наступним чином: 11 мг/кг антитіло ізотипного контролю, 1 мг/кг

КЕСМ3500ж410 мг/кг антитіло ізотипного контролю, 10 мг/кг дупілумабу т 1 мг/кг антитіла ізотипного контролю, або 1 мг/кг КЕСМ3500-410 мг/кг дупілумабу. Одна когорта мишей була забита після 11 тижнів експозиції для визначення запального профілю на початку терапії антитілами (група 11-тижневої експозиції). Інші 4 когорти були забиті на 134 день (групи 19-

Зо тижневі експозиції), через чотири дні після останньої експозиції та ін'єкції антитіл. Цільну кров збирали шляхом серцевої пункції для виділення сироватки і легені відбирали для подальшого аналізу. Всі групи складалися з мишей однієї лінії (ІЛАігайчоти |ЛДАнопи |ЛУЗполя якщо не вказано інше.

Аналіз макропатології легень

Відносна вага легень була значно збільшеною у мишей, підданих 19-тижневій експозиції до

НОМ, у порівнянні з контрольними мишами, яким вводили фізіологічний розчин, Фіг. 3. Це, ймовірно, пояснюється підвищеною клітинною інфільтрацією, відкладенням колагену, гіпертрофією м'язів і виробництвом слизу. У мишей, підданих експозиції до НОМ, комбіноване введення КЕСМ3500 і дупілумабу значно блокувало індуковане експозицією до НОМ збільшення відносної ваги легень порівняно з мишами, яким вводили антитіло ізотипного контролю (Фіг.3). Тенденція до зниження відносної ваги легень спостерігалася також у мишей, підданих еспозиції до НОМ, яким вводили дозовано тільки КЕСМ3500.

Аналіз легеневих інфільтратів клітин

Через чотири дні після останньої ін'єкції антитіла легені миші були зібрані і нижня частка правої легені була дисоційована на суспензію окремих клітин для проточного цитометричного аналізу еозинофілів. Еозинофіли визначали як інтактні, поодинокі, живі, СО457, Е4/80», І убсх, зідіесЕе: і активовані еозинофіли далі визначали як СО11с"і. Інфільтрація легень активованими еозинофілами повідомлялася як частота (95) загальних еозинофілів легень у (А) їі загальна еозинофільна інфільтрація легень повідомлялась як частота (95) загальних еозинофілів легень серед живих (інтактних, поодиноких, живих) клітин. У порівнянні з контрольними мишами, яким вводили фізіологічний розчин, експозиція до НОМ протягом 19 тижнів значно підвищила легеневу інфільтрацію клітинами, що оцінювали протоковою цитометрією для виявлення загальних і активованих еозинофілів легень (Фіг.4А і 48) і 512-004: Т-клітин легень (5Т2"Сра:

Т-клітини були визначені як інтактні, поодинокі, живі, СО457, 203, С0О19, бра, С08, 512 повідомлялись як частота СО4- Т-клітин.) (Фіг. 5), або методом іммуноаналізу для виявлення рівнів протеїна МРО в легенях в якості маркера нейтрофілів (рівні протеїну МРО були виміряні методом імуноферментного аналізу. Рівні протеїна МРО легень виражені як кількість протеїна

МРО (мкг) на частку легені.) (Фіг. 6).

Комбіноване введення КЕСМ3500 і дупілумабу мишам з 19-тижневою експозицією до НОМ, бо але не будь-якого з цих антитіл окремо, значно знижувало рівень інфільтрації легень активованими еозинофілами порівняно з введенням антитіла ізотипного контролю. Примітно, що рівні інфільтрації легень активованими еозинофілами у мишей, яким вводили КЕСМЗ500, і дупілумаб в комбінації, також були значно знижені порівняно з рівнями, індукованими 11- тижневою експозицією до НОМ, що відповідає початку лікування Фіг.4А. Хоча введення кожного з антитіл окремо не призводило до значних ефектів, тенденція до зниження легеневої інфільтрації активованими еозинофілами спостерігалася у мишей, яким вводили дупілумаб.

Миші, піддані експозиції до НОМ, яким вводили КЕСМ3500 і дупілумаб в комбінації, також показали тенденцію до зниження індукованої НОМ легеневої інфільтрації за загальними еозинофілами (Фіг. 4В).

У мишей, підданих 19-тижневій експозиції до НОМ, яким вводили КЕСМ3500 окремо або в комбінації з дупілумабом, рівні інфільтрації легень 5120047 Т-клітинами були значно знижені порівняно з рівнями у мишей, яким вводили ізотипний контроль, і порівняно з рівнями, індукованими 11-тижневою експозицією до НОМ на початку лікування (Фіг. 5). Аналогічне блокування інфільтрації (середні частоти в межах 1.02-кратного значення) спостерігалося для

КЕСМЗ3500 окремо і в комбінації з дупілумабом, що вказує на те, що ця патологія в основному обумовлена ІЛ-33.

Подібно до еозинофільної інфільтрації, комбіноване введення КЕСМ3500 і дупілумабу показало більш сильний ефект на блокування нейтрофільної інфільтрації легень, ніж будь-яке з цих антитіл окремо. Індуковане експозицією до НОМ підвищення рівня протеїну мієлопероксидази (МПО) легень, маркера нейтрофільної інфільтрації, істотно блокувалося комбінованим введенням КЕСМ3500 і дупілумабу порівняно з ізотипним контролем (Фіг. 6). У той час як введення кожного антитіла окремо не призводило до значних ефектів, тенденція до зниження рівнів протеїна МРО легень спостерігалася у мишей, яким вводили КЕСМ3500.

Аналіз рівня цитокінів в тканинах легень

Вплив експозиції до НОМ і терапії антитілами на рівні протеїнів легень (загальний протеїн на частку) оцінювали для цитокінів миші ІЛ-5, ІЛ-13, ІЛ-б6, ІЛ-1Д8, ІЛ-12р70, ФНПа, ІЄМу, ОКО, і

МОР-1 і для цитокіну ПІЛ-4 людини.

Легені (верхні і середні долі правої легені) збирали, а рівні протеїнів зазначених цитокінів миші вимірювали мультиплексним імуноаналізом. Рівні протеїнів ІЛ-4 людини (ПІЛ-4) виявляли

Зо за допомогою комерційно доступного набору ЕГІ5А. Рівні протеїнів ІЛ-5 (Фіг. 7А) і ІЛ-6 (Фіг. 7В) вимірювали мультиплексним імуноаналізом. Рівні протеїнів цитокінів легеневої тканини розраховували як кількість протеїна (пг) на легеневу частку. Теплову карту фальшивих кольорів (не показану тут) генерували для позначення відносних цитокінів, що змінюються від світло- жовтого до темно-синього. Шкала відносних рівнів цитокінів легень була створена шляхом визначення найнижчого і найвищого зареєстрованого середнього рівня протеїна легень для кожного окремого цитокіну як 0 95 (світло-жовтий) і 100 95 (темно-синій) відповідно. Відносні рівні протеїна цитокінів легень (95) були позначені числами і кольором на тепловій карті. Статистичну значущість визначали за допомогою однофакторного АМОМА Крускала-Уолліса з тестом множинного порівняння Данна за отриманими результатами.

Результат для ІЛ-12р70 був нижче нижньої межі кількісного визначення для всіх груп і, отже, тут не повідомляється.

Вісім цитокінів (пІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-6, ІЛ-13, ІЛ-1ЇВ, ФНІПс, оКОа і МОСР-1) показали значне підвищення рівнів протеїна легень у відповідь на 19-тижневу експозицію до НОМ порівняно з контрольними мишами, яким вводили фізіологічний розчин. Тільки ІЕМу не показував значного збільшення рівнів протеїна легень у відповідь на 19-тижневу експозицію до НОМ порівняно з контрольованими мишами, яким вводили фізіологічний розчин, а також на рівні ІЕМУу не впливало терапевтичне введення антитіл, у порівнянні з мишами, підданими 19-тижневій експозиції до НОМ, яким вводили антитіло ізотипного контролю. Індуковані експозицією до НОМ підвищені рівні протеїна цитокінів легень (ПІЛ-4, ІЛ-6, ФНІПа, КО, і МОР-1) були істотно

БО блоковані комбінованим введенням КЕСМ3500 і дупилюмаба, але не введенням будь-якого з цих антитіл окремо, порівняно з мишами, яким вводили антитіло ізотипного контролю.

Інші 2 чутливі до експозиції до НОМ цитокіни (ІЛ-5 і ІЛ-1Д) показали тенденцію до блокування шляхом комбінованої терапії КЕСМ3500 і дупілумабом, з 83 95 і 78 95 зниженням рівнів протеїна легень відповідно, у порівнянні з мишами, яким вводили антитіла ізотипного контролю (Фіг.7А і 78). Введення індивідуальних антитіл призводило до менш виражених тенденцій у зниженні рівнів ІЛ-5 і ІЛ-1рД.

Аналіз БАА, системного маркера запалення

Через чотири дні після останньої експозиції і ін'єкції антитіла цільну кров збирали серцевою пункцією і виділяли сироватку. Рівні циркулюючого протеїна ЗАА вимірювали, використовуючи бо комерційно доступний набір ЕГІЗА. Рівні циркулюючого протеїна 5АА виражені як кількість протеїна БАА (мкг) на мл сироватки. Рівні циркулюючого протеїна системного маркера запалення ЗАА були значно збільшені у мишей, підданих 19-тижневій експозиції до НОМ, у порівнянні з контрольованими мишами, яким вводили фізіологічний розчин (Фіг. 8).

Індуковані експозицією до НОМ підвищення рівнів циркулюючих 5АА у мишей, яким вводили

КЕСМ3500 окремо або в комбінації з дупілумабом (Фіг. 8), були значно меншими, тоді як тенденція до зниження рівнів циркулюючого ЗАА спостерігалася у мишей, яким вводили тільки дупілумаб.

Кількісна оцінка гуморальних алергічних відповідей після експозиції до НОМ

Через чотири дні після останньої експозиції і ін'єкції антитіла цільну кров збирали серцевою пункцією і виділяли сироватку. Рівні циркулюючого протеїна ІДЕ вимірювали, використовуючи комерційно доступний набір ЕГІ5А. Рівні циркулюючого протеїна (ДЕ виражені як кількість протеїна ІДЕ (мкг) на мл сироватки.

Гуморальні алергічні відповіді були викликані експозицією до НОМ, що оцінювалось за рівнями циркулюючих ІДЕ (Фіг. 9) і НОМ-специфічних Ідс1 (Таблиця 15) в кінці дослідження (день 134).

Рівні циркулюючого протеїна ІДЕ були значно збільшені у мишей, підданих 19-тижневій експозиції до НОМ, у порівнянні з контрольними мишами, яким вводили фізіологічний розчин (Фіг. 9). Середні титри для циркулюючих НОМ-специфічних ІдДО1 зростали від 1,14Е-02 у контрольних мишей, яким вводили фізіологічний розчин, до рівнів від 1,37Е-06 до 2,43Е06 у мишей, яких піддавали експозиції до НОМ протягом 19 тижнів (Таблиця 15). Не було виявлено статистично значущого ефекту КЕСМ3500, дупілумабу або комбінованої терапії для будь-якої з цих кінцевих точок, але тенденція до зниження рівня ІДЕ в сироватці спостерігалася у мишей, яким вводили комбінацію КЕСМ3500 і дупілумаб.

Таблиця 15

Зведена інформація про концентрації НОМ-специфічного Ідс1 сироватки нОоМм- НОМ 19 тижнів специфіч- | Фізіологіч- НОМ ний ІдДС1 у | ний розчин 11 тижнів Без Ісав ВЕСМЗ500| Дупілумаб | ВЕСМЗ3500 -- сироватці | 19 тижнів антитіл 9 я ад Іда4Р дупілумаб (титр) 1.114402 |2.19Е--06 | 2.43Е--06 | 2.14Е--06 | 1.47Е-06 | 1.37Е--06 1.21 4-06 6.15Е-01 |1.07Е--06| 9.81Е--05 | 5.60Е-05 | 1.17Е--06 | 5.79Е05 | 5.29Е05

Кількісне визначення концентрації антитіл людини в сироватці

Концентрацію сироваткового антитіла Ідс4 людини" (Іда4Р ізотипний контроль, ВЕСМЗ500 і дупілумаб) визначали в кінці дослідження (день 134), через чотири дні після останнього введення антитіла методом ЕГІЗА за допомогою мішень-специфічного анти-Ідое4. Середні

Зо концентрації антитіл (3054 людини приведені в Таблиці 16.

Таблиця 16

Рівні антитіл людини в сироватці в кінці дослідження

Рівні антитіл сироватки, середнє значення х 50 (мкг/мл) 19-тижнів 19-тижнів 19-тижнів 19-тижнів 19-тижнів фізіологіч 11-тижнів |19-тижнів НОМІДСА| гав НО Мдутлум НОМАЄОМОВ - Р (1 мг/кг) аб(10 00 (1 мг/кг) ний ном ном (11 Р Р - Є озчиН мг/кг) асаР(10 | мг/кг)ухІде4г |«-Дупілумаб(1

Р мг/кг) (1 мг/кг) О мг/кг)

ВЕСМ3500 | «ОО | «ОО | «ПО 1144101 12.78.8

Дупілумаб | «ОО | «ОО | «ОО 8.0513.5 48.927.9 0.0ж0.0а| «ЦО | «ОО /54.5-463.9| 88.в576.0 0.10. а Одна миша в цій групі мала рівні сироваткових ІДС4Р » 100, тому тут зазначається округлене значення

СУТЬ ВИНАХОДУ

У порівнянні з контрольними мишами, яким вводили тільки фізіологічний розчин, миші, які піддавалися експозиції до НОМ протягом 19 тижнів, продемонстрували значне збільшення у всіх, крім одного (рівні ІЕМу легень) з 14 виміряних патологічних маркерів запалення, за відсутності терапії або після введення Ідс4" антитіла ізотипного контролю.

Комбіноване введення КЕСМ3500 і дупілумабу значно блокувало 10/13 досліджуваних кінцевих точок, залежних від експозиції до НОМ, порівняно з антитілом ізотипного контролю (відносна вага легень, легенева інфільтрація активованими еозинофілами, нейтрофіли МРО рівніЇ і 512004: Т-клітини, рівні протеїна цитокінів ПІЛ-4, ІЛ-6, ФНІа, СО, і МОСР-1 легень, і сироваткові рівні БАА). Більше того, рівні інфільтрації легень активованими еозинофілами і

ЗТ200ра4: Т-клітинами достовірно знижувалися до рівнів, менших за ті, які спостерігалися у мишей, підданих 11-тижневій експозиції до НОМ, що відповідає початку лікування антитілами.

Застосування тільки дупілумаба не значно блокувало будь-яку з 13 досліджуваних кінцевих точок, чутливих до експозиції до НОМ, в той час як введення тільки КЕСМЗ3500 значно блокувало 2 кінцеві точки: 52004: Т-клітинну інфільтрацію легень і рівні циркулюючого ЗАА.

Для цих двох кінцевих точок блокада, опосередкована тільки КЕСМ3500, була подібна до блокади, опосередкованої КЕСМ3500 у комбінації з дупілумабом, що свідчить про те, що ці патологічні маркери в основному обумовлені дією ІЛ-33.

Комбіноване введення КЕСМ3500 і дупілумабу показало тенденцію до блокування індукованих експозицією до НОМ відповідей для інших 3-х НОМ-чутливих кінцевих точок без досягнення статистичної значущості (легенева інфільтрація еозинофілами (|загальнаїЇ, рівень протеїна цитокінів ІЛ-5 і ІЛ-1Д легень, і рівні сироваткового протеїна ЗЕ). Для цих маркерів, індивідуальна терапія антитілами з КЕСМ3500 або дупілумабом в цілому призводила до більш слабкого зниження, ніж комбінована терапія.

Всі групи терапій антитілами були пов'язані з детектованими рівнями для цільових специфічних людських антитіл Ід4 в сироватці в кінці дослідження. У мишей, які отримували два рази на тиждень протягом 8 тижнів або терапевтичне антитіло окремо, або в комбінації, середні концентрації КЕСМ3500 в сироватці становили відповідно 11,4--10,1 і 12,7248,8 мкг/мл, а середні сироваткові концентрації дупілумаба 8,0:213,5 і 48,9427,9 мкг/мл, відповідно, наприкінці дослідження.

На закінчення, комбінована терапія з КЕСМ3500 і дупілумабом в моделі легеневого запалення, спричиненого 19-тижневою експозицією до НОМ, з використанням мишей ІЛаАгагйчти

ІЛаголи |ІЛЗЗпоти, призводила до більш вираженого поліпшення майже всіх тестованих патологій легень і маркерів запалення порівняно з терапією будь-яким з цих антитіл окремо. висновок

Комбінована терапія з КЕСМ3500 і дупілумабом в моделі легеневого запалення, спричиненого 19-тижневою експозицією до НОМ з використанням мишей ІЛагаголи |Дднити

ІЛЗЗгати призводила до більш вираженого поліпшення майже всіх досліджуваних патологій легень і маркерів запалення порівняно з терапією з будь-яким з цих антитіл окремо.

Приклад 7: Оцінка БЗАК440340/КЕСМ3500, або дупілумаба, при застосуванні окремо і при застосуванні в якості комбінованої терапії у пацієнтів з помірною і тяжкою формою ХОЗЛ

Структура дослідження

Це дослідження є рандомізованим, подвійним сліпим, плацебо-контрольованим, паралельно-груповим, 24-тижневим дослідженням для експериментальної перевірки концепції оцінки ефективності, безпеки та переносимості моноклональних антитіл проти ІЛ-33 (ЗАК440340/КЕСМ3500), моноклональних антитіл проти ІЛ- 4Р (дупілумаб, також відомий як

РОРІХЕМТФ)), коли будь-які з них використовують окремо, або при використанні в комбінації у пацієнтів з середньо-важким хронічним обструктивним захворюванням легень (ХОЗЛ).

У дослідженні візьме участь загалом вісімсот тридцять два суб'єкти. Вказане дослідження складатиметься з чотирьох груп пацієнтів, однією групою будуть пацієнти, яким вводять підшкірно (5С) тільки моноклональне антитіло проти ІЛ-33 (5БАК440340/КЕСМ3500); другою групою будуть пацієнти, яким вводять підшкірно тільки моноклональне антитіло проти ІЛ-АР (дупілумаб); третьою групою будуть пацієнти, яким будуть вводити як ЗАК440340/КЕСМ3500, так і дупілумаб підшкірно; і четвертою групою буде плацебо.

Пацієнти в 1 групі отримуватимуть 2 5С ін'єкції БАК440340/КЕСМ3500 кожні 2 тижні протягом 24 тижнів і сумісне ввення плацебо дупілумаба як 1 5С ін'єкцію кожні 2 тижні протягом 24 тижнів; пацієнти групи 2 отримуватимуть 1 5С ін'єкцію дупілумабу кожні 2 тижні протягом 24 тижнів і сумісне введення плацебо ЗАК440340/КЕСМ3500 як 2 ін'єкції 5С. кожні 2 тижні протягом 24 тижнів; пацієнти в групі З отримуватимуть 2 С ін'єкції БАК440340/КЕСМ3500 кожні 2 тижні бо протягом 24 тижнів і сумісне введення дупілумабу в 1 ЗС ін'єкції кожні 2 тижні протягом 24 бо тижнів; пацієнти в групі 4 отримуватимуть відповідні плацебо для 5АК440340/КЕСМ3500 і дупілумабу введеням шляхом 2 і 1 5С ін'єкції, відповідно, кожні 2 тижні протягом 24 тижнів.

Цілі дослідження

Головна мета цього дослідження є визначити і порівняти ефекти антитіла проти ІЛ-33 (ЗАК440340/КЕСМ3500), моноклонального антитіла проти рецептора ІЛ-4 (дупілумаб), та одночасного введення обох антитіл в порівнянні з плацебо у пацієнтів з хронічним обструктивним захворюванням легень (ХОЗЛ), яких лікували інгіляційним кортикостероїдом (С5), та В2 адренергічним агоністом тривалої дії (ГАВА) та/або мускариновим антагоністом тривалої дії (АМА) в якості фонової терапії (подвійна або потрійна терапія), на покращення дихальної функції, що оцінюється по форсованому об'єму після бронходилататора за 1 секкунду (ЕЕМ'І), протягом 24 тижнів...

Вторинні цілі полягають в оцінці ефектів ЗАК440340/КЕСМ3500, дупілумабу та одночасного введення обох, кожен у порівнянні з плацебо, на частоту загострення ХОЗЛ від середнього до важкого ступеня (АЕСОРО) протягом 24 тижнів лікування.

Іншою вторинною метою є оцінка ефектів ЗАК440340/КЕСМ3500, дупілумабу та сумісного введення обох, кожен у порівнянні з плацебо, на: РЕЕМІ1 до застосування бронхолітичного засобу протягом 24 тижнів; Тривалість від початкового рівня до першої помірної або важкої події

АЕСОРО протягом 24 тижнів; Оцінка клінічних симптомів ХОЗЛ; Безпека та переносимість.

Критерії включення

Критерії включення для вказаного дослідження наступні: (1) Пацієнти з помірним до важкого хронічним обструктивним захворюванням легень (ХОЗЛ) (після застосування бронхолітичного засобу об'єм форсованого видиху за одну секунду (ГЕМ1), форсована життєва ємність (ЕМС) -70 9б і після застосування бронхолітичного засобу РЕМІ1 95 прогнозований 80 95, але 230 Об); (2)

Пацієнти з оціночним тестом на ХОЗЛ (САТ) з балом 2 10 при скринінговому візиті 1 та візиті 2/Рандомізація; (3) Пацієнти з підтвердженими в анамнезі ознаками і симптомами хронічного бронхіту (хронічний продуктивний кашель протягом З місяців на рік до скринінгу пацієнта, у якого інші причини хронічного кашлю (наприклад, гастроезофагеальний рефлюкс, хронічний риносинусит, бронхоектаз) були виключені. (4) Пацієнти з задокументованими в анамнезі 2 2 помірних загострень або 21 важким загостренням протягом року до скринінгу; (5) Пацієнти, які

Зо отримували стандартну терапію протягом З місяців до візиту 2/рандомізації та на стабільній дозі протягом щонайменше 1 місяця до скринінгового візиту 1, включаючи або: подвійну терапію: ВД агоністом (ГАВА) тривалої дії - мускариновим антагоніст (ГАМА) тривалої дії або інгаляційним кортикостероїдом (ІС5) ж І АВА або ІС5ч| АМА; або потрійну терапію: ІС5-І АВАЧІ АМА; (6)

Підписана письмова інформована угода; та (7) Курці зараз або в минулому з історією куріння 210 упаковок/рік.

Критерії виключення

Критерії виключення для вказаного дослідження такі: (1) Вік «40 років або» 75 років; (2)

Пацієнти з індексом маси тіла (ІМТ) «16; (3) Пацієнти з ХОЗЛ, діагностованим протягом 6 місяців до рандомізації; (4) Поточний діагноз астма відповідно до керівних принципів Глобальної ініціативи з астми (СІМА); (5) Серйозне захворювання легень інше, ніж ХОЗЛ (наприклад, фіброз легень, саркоїдоз, інтерстиціальна хвороба легень, легенева гіпертензія, бронхоектазія, еозинофільний гранулематоз з поліангітом, значне апное під час сну при двохрівневому позитивному тискоу в дихальних шляхах тощо) або інше діагностоване легеневе або системне захворювання з підвищеним відносним вмістом периферичних еозинофілів; (6) Діагностований дефіцит а-1 анти-трипсину; (7) Прогресуюче ХОЗЛ з хронічною необхідністю (» 15 годин на добу) кисневої підтримки; (8) Пацієнт з помірним або тяжким гострим загостренням ХОЗЛ протягом 4 тижнів до скринінгу; (9) Пацієнт, який переніс інфекцію верхніх або нижніх дихальних шляхів протягом 4 тижнів до скринінгу/візиту 1 або протягом періоду скринінгу; (10) Планова пневмонектомія або операція по зменшенню обсягу легень в анамнезі; (11) Пацієнти з анамнезом системної реакції гіперчутливості на біологічний препарат.

Приклад 8. Оцінка ЗАК440340/КЕСМ3500, або дупілумабу, при застосуванні окремо та при застосуванні в якості комбінованої терапії у пацієнтів з помірною та тяжкою формою астми

План дослідження

Це дослідження - рандомізоване, подвійне сліпе, плацебо-контрольоване, паралельно- групове, 12-тижневе дослідження (РоС) для перевірки гіпотези для оцінки ефективності, безпеки та переносимості ЗАК440340/КЕСМ3500, дупілумабу (також відомого як ОПОРІХЕМТХФ), і сумісного введення 5ЗАК440340 і дупілумаб у пацієнтів з середньо-важкою астмою, яка не достатньо добре контролюється за допомогою інгаляційного кортикостероїду (ІС5) плюс В2- адренергічного агоніста (ГАВА) тривалої дії. 60 У цьому дослідженні візьмуть участь понад 100 суб'єктів. Вказане дослідження складатиметься з чотирьох груп пацієнтів, однією групою будуть пацієнти, яким вводять підшкірно (5С) тільки моноклональне антитіло проти ІЛ-33 (5БАК440340/КЕСМ3500); другою групою будуть пацієнти, яким вводять підшкірно тільки моноклональне антитіло проти ІЛ-АР (дупілумаб); третьою групою будуть пацієнти, яким будуть вводити як ЗАК440340/КЕСМ3500, такі дупілумаб підшкірно; і четвертою групою буде плацебо.

Пацієнти в групі 1 отримуватимуть БАК440340/КЕСМ3500 введенням 2 підшкірних (5С) ін'єкцій кожні 2 тижні протягом 12 тижнів і сумісне введення плацебо дупілумабу шляхом 1 5С ін'єкції кожні 2 тижні протягом 12 тижнів; пацієнти в групі 2 отримуватимуть дупілумаб введенням 1 С ін'єкції кожні 2 тижні протягом 12 тижнів і сумісне введення

ЗАК440340/КЕСМ3500 плацебо шляхом 2 ін'єкцій ЗС кожні 2 тижні протягом 12 тижнів; пацієнти в групі З отримуватимуть ЗАК440340/КЕСМ3500 введенням 2 ін'єкцій 5С кожні 2 тижні протягом 12 тижнів, і сумісне введення дупілумабу, шляхом 1 5С ін'єкції кожні 2 тижні протягом 12 тижнів; пацієнти в групі 4 отримуватимуть сумісне введення відповідних плацебо для

ЗАК440340/КЕСМ3500 і дупілумабу, введенням 2 і 1 ін'єкцій 5С, відповідно, кожні 2 тижні протягом 12 тижнів.

Цілі дослідження

Первинною метою дослідження є оцінка ефектів 5АК440340/КЕСМ3500 з або без дупілумабу, порівняно з плацебо, на зниження частоти випадків подій "втрати контролю астми" (І ОАС).

Другорядні цілі дослідження оцінити ефекти БАК440340/КЕСМ3500 і сумісного введення

ЗАНК440340/КЕСМ3500 і дупілумабу, порівняно з плацебо, на об'єм форсованого видиху за 1 секунду (РГЕМІ1); оцінити ефекти сумісного застосування ЗАК440340/КЕСМ3500 і дупілумаба, порівняно з 5АК440340/КЕСМ3500 і порівняно з дупілумабом на ЕЕМІ1; оцінити ефекти конкурентного введення ЗАК440340/КЕСМ3500 і дупілумаба порівняно з БАК440340/КЕСМ3500 окремо на зниження І ОАС; і оцінити безпеку і переносимість ЗАК440340/КЕСМ3500 окремо і при сумісному застосуванні з дупілумабом.

Критерії включення

Критерії включення для вказаного дослідження наступні: (1) Дорослі пацієнти (від 18 років і старше) з терапевтичним діагнозом лікаря "астма" протягом принаймні 12 місяців на основі

Зо рекомендацій Глобальної ініціативи з астми (СІМА) 2016, у яких астма частково контролюється або не контролюється на комбінованій терапії ІСБ/Л АВА за наступними критеріями: існуюче лікування середньо- та високодозовими інгаляційними кортикостероїдами (ІС5) (2250 мкг флутиказону пропіонату двічі на день (ВІС) або еквіпотентною добовою дозою ІС5 максимально 2000 мкг/день флутиказону пропіонату або клінічно співставно) у комбінації з бета -агоністом тривалої дії (ГАВА) в якості вторинного препарату базової терапії протягом щонайменше З місяців зі стабільною дозою 21 місяць до візиту 1; (2) Об'єм форсованого видиху до застосування бронхолітичного засобу за одну секунду (ЕЕМІ) 250 95, але «85 95 прогнозованої норми при візиті 2/початковий рівень; (3) Оборотність принаймні 12 95 ії 200 мл РЕМІ1 після введення 2-4 затяжок (200-400 МКГ) альбутеролу/сальбутамолу або левальбутеролу/левосальбутамолу під час скринінгу (до З можливостей під час одного візиту дозволено з максимумом 12 затяжок препарату, що полегшує дихання при його переносимості пацієнтом); задокументована історія 2095 варіабельності БЕМІ! до застосування бронхолітичного засобу при порівнянні 2 прийнятних спірометричних оцінок протягом 6 місяців до візиту 1/скринінгу, або позитивна гіперреактивність дихальних шляхів до метахоліну протягом 12 місяців до візиту 1/Скринінгу вважається прийнятною для виконання цього критерію включення; (4) Перенесена протягом 1 року до візиту 1 принаймні один раз, будь-яка з наступних подій: терапія системним стероїдом (перорально або парентерально) з погіршенням астми, або госпіталізація або екстрена медична допомога через погіршення астми; (5)

Підписана письмова інформована згода.

Критерії виключення

Критерії виключення для вказаного дослідження наступні: (1) Пацієнти «18 років або» 70 років (тобто досягли віку 71 року при візиті скринінгу); (2) Пацієнти з індексом маси тіла (ІМТ) «16; (3) Хронічне захворювання легень (наприклад, хронічне обструктивне захворювання легень ІХОЗЛІ або ідіопатичний фіброз легень (РЕ), які можуть погіршити функцію легень; (4)

Астма, що загрожувала життю в анамнезі (тобто тяжке загострення, що вимагає інтубації); (5)

Коморбідне захворювання, яке може заважати оцінці ІМР; (6) Пацієнти з будь-якими з наступних подій протягом 4 тижнів до їх скринінгового візиту 1: пульс-терапія з 1 або більше системними (пероральними та/(або парентеральними) стероїдами через погіршення астми, або госпіталізація або невідкладна медична допомога через погіршення астми; (7) Бали, набрані по 60 Опитуванню для оцінки контролю астми, версії з 5 питаннями (АСО-5), 1,25 або 3,0 при

М2/рандомізація. Під час періоду скринінгу прийнятний АСО-5 до «4; (8) Антиімуноглобулін Е (І9ЗЕ) терапія (наприклад, омалізумаб (ІХоїаї/"Ф|) протягом 130 днів до візиту 1 або будь-яка інша біологічна терапія (включаючи анти-ІЛ5 тАбБ) або системним імунодепресантом (наприклад, метотрексат) для лікування запального захворювання або аутоіїмунного захворювання (наприклад, ревматоїдний артрит, запальне захворювання кишечника, первинний біліарний цироз, системний червоний вовчак, розсіяний склероз тощо) та інші захворювання протягом 2 місяців або 5 періодів напіврозпаду до візиту 1, в залежності від того, що більше; (9) Пацієнти з системною реакцією гіперчутливості на біологічний препарат в анамнезі; (10) Пацієнти в процесі або на початку бронхіальної термопластики протягом 2 років до візиту 1 або планують розпочати терапію протягом періоду скринінгу або рандомізованого періоду терапії; (11) Курець на цей період часу або такий, хто припинив куріння протягом 6 місяців до візиту 1; (12) Курець у минулому з історією куріння» 10 пачок на рік.

Перелік послідовностей «1105 ВБедепекоп Ріагкшасецтіса15, Іпс.

Чашіе Огепдо

Чеаппе А11і1ппе

Апагем Мисрпу

Сеогде Уапсороціов «1205 СПОСОБИ ЛІКУВАННЯ ЗАПАЛЬНИХ СТАНІВ «1305 10142щ4001 «150» 62/428634 «1515 2016-12-01

Зо «150» 62/473738 «1515 2017-03-30 «1505» 62/567318 «1515 2017-10-03

З5 «1605 356 «1705 РБавЕеБ5ЕО для Міпдоме версія 4.0 «21051 «2115 366 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «40051 саддєЕдсадс ЕддсддадеЕс Едддоададдс дЕддЕссадс ссдддаддеєс ссеЕдадасес 60

Єсседедсад сдєстддаєс сасссссадс адесаєддса сСдсаєєддає ссдссаддсе 120 ссаддсаадуд дасєддадед додєддсадее асаєддаєаєд асддаадааа сСааасассає 180 асадасеєссд Єдаадддссу асесассаєс сссададаса аєєссаадаа сасдсєдбсає 240 сЕдсаааєдуд асадссеєдад адссдаддас асуддсєдЕеЕдЕ аєвгассдсдс дадададада 300 басаєсадса дссаєсваєду ддддЕссдас сссеЕддддсес адддадсссе ддЕСсассдаєс 360

СсСсеса 366 «2105 2 «2115 122 «2125 БІЛОК 6о0 «213» Штучна послідовність

«223» Штучна «4005 2 сіп Уаії сбіп Гецп Уаі бій бек сіу сбіу сб1у Уаї Уаі біп Рго с01у Агд 1 5 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув Аї1а Аза бек бі1у Рпе ТПг Ропе Бек бек Туг 20 25 30 сбі1у Меє Нів Тер Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу Ппув сіу Гец біц Тгр Уаї 35 40 45

А1їа Уа1ї І1їе Тср Туг Авр б1у Агд Авп о Гув Туг Туг ТПг Авр бек Уаї 50 55 бо

Тпув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе бек Агуд Авр Авп бек ГПув Ап о ТПг Іец Туг 65 70 75 80

Тен біп Мес Авр бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТПг Аїа Уа1ї! Тук Тук Сув 85 90 95

Аза Акуд біц Агуд Туг І1е бек бек Туг Тук б1у с1у Рпе Авр Рго Тгр 100 105 110 сб1у бі1іп с1у Аза Гей Уа1 ТПг Уаі1і Бек 5ег 115 120 «2105 З «2115 24 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна

Зо «4005 З ччаєєсассе ЄсадсадеЕса дос 24 «2105 4 «2115 8 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 4 б1у Рпе ТПг Рпе бБег бБег Ту У 1 5 «2105 5 «2115 24 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 5 асаєддбєаєд агддаадааа бааа 24 «2105 6 «2115 8 бо «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність

«223» Штучна «4005 6

І1їе Тер Туг Авр б1у Агд Авп Гув 1 2 «2105 7 «2115» 45 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 7 чдсдадчачада доадсасаєсад садссаєсає додддддЕссд асссс 45 «2105 8 «2115 15 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 8

Аза Акуд бій Агуд Туг І11е бек бек Туг Тук бі1у б1у Рпе АБр Рго

Зо 1 2 10 15 «2105 9 «2115 321 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 9 часаєссада Єдасссадес Ессаєссєсс дЕдЕСЕдсає сеЕдгаддада сададеЕсасс 60 аєсасеЕєдЕеЕСсС доадсдадеЕСса доадеаєтаде адессєддеЕсад сссддраєса дсадааасса 120 чадааадссс сеЕаадудєссяе даєстаєдсесс дсаєссадееє Єдсааадедуд ддЕсСссаєса 180 аддсєсадсуд дсадеддаєс Єдддасадає ЄсСсасеєссса ссассадсад сссдсадссе 240 чаачаєвєєеєєсєвд саасесвасса ЕсдЕсаасад дссаасадееє Есссаєссас ЕсЕСОдДСсСсСсЮ 300 чодадассааас сСддасаєсаа 9д 321 «2105 10 «2115 107 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 10

Авр І1е сбіп Месє ТПг біп бек Рго бек бек Уа! бек Аза Бек Уаі Щ1У 1 2 10 15 бо Авр Агуд Уаі ТПг І1е ТПг Сув Акуд Аза бек біп с1у І1е бек бек Тгр 20 25 30

Тец Азїа Тер Ту біп біп пув Рго с1іу Ппув Аїа Рго пуб Уаї Іецй І1е 35 40 45

Туг Аїа Аїа бек бБекг ІТец біп бек біу Уаі Ркго Бек Агд Рпе Бех щЩ1У 50 55 бо

Ззек сіу бек біу ТПгЕ Авр Рпе ТПг Гей ТіПг І1е бек бек Гечп біп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аза ТПг Тук Тук Сув біп біп Аза Авп бек РоПе Рго РіПе 85 90 95

ТПЕ Рпе с1іу Рго біу ТПг Гув Гец Авр І1е Гу 100 105 «2105 11 «2115 18 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 11 садададеаєса дсадеЕс9д9 18 «2105 12 «2115 6 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 12 біп б1у І1е бек бек Тгр 1 5

З5 «2105 13 «2115 9 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 13 чдсеЕдсаєсс З «2105 14 «2115 З «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 14

Аза Аїа 5ег 1 60 «2105 15

«2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 15 саасаддсса асадеЕєеєссс асесасе 27 «2105 16 «2115 9 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 16 сбіп біп Аза Авп бек Рібе Рго Робе ТЕГ 1 2 «2105 17 «2115 357 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 17 чададєдсадс єЯдЕЕддадес Едддддадас сЕддсасадс сЕдддддудєс ссеЕдадасес 60

Есседедсад ссессуддаєсеє сассеЕссадс адссаєсдсса єдадссддує ссдссаддсеЕ 120 ссачадаадуд ддасєдчдадед доаєссеЕСсадьє ассадеддса деддаадсад сасадассас 180 чдсадасеєссд Єдаадддссу деЕЕсассарс сссададаса аєєссаддда сасдсєдсає 240 сЕдсаааєда асадссеєдад адссдаддас асдддссдбєає асгассдсдс даааасуаєеєс 300

БасврасеЕєсеЕ асододеЕєсдда счаєсеЕдодддс саадддасса сддессассддєсє ссссеса 357 «2105 18 «2115 119 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 18 бі Маї біп Гей Гей бі бек с1у с1у Авр Гей Уаі1і сіп Рго с1і1у с1У 1 2 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув Аї1а Аза бек бі1у Рпе ТПг Ропе Бек бек Туг 20 25 30

А1їа Меє бек Тер Уаі Агуд біп Аїа Рго б1у Ппув с1іу Гей бій Тер Уаї 35 40 45 зек Уаї І1їе бек с1і1у бек сіу бек бек ТПг Авр Туг Аїа Авр бек Уаї 50 З бо пув б1у Агкуд Рпе ТПг Іїе бек Агуд Авр Авп бБег Агуд Авр ТПг Іецй Нів 65 70 75 80

Тец біп Меє Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТПг Аїа Уаї Тук Тук Сув 60 85 90 95

А1їа Ппув ТПг Рбе Тук Тук Рпе Туг сбіу Іец Авр Уаі Тгр ОШ1Уу біп Щ1У

100 105 110

ТБ Тк Уаї ТНК Уаї бек 5бег 115 «2105 19 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 19 ддаєсеєсассе Есадсадста бЄдсс 24 «2105 20 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 20 б1у Рпе ТПг Рпе бБег бБег Туг Аїа 1 5

Зо «2105 21 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 21 аєсадеЕддва дЕддаадьнад саса 24 «2105 22 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 22

І1їе бек с1і1у бек с1у Бек бек ТПг 1 5 «2105 23 «2115 36 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 6о0 «223» Штучна

«4005 23 дсдаааасує Сссастасеє свасоддеЕствдд дасдеЕс 36 «2105 24 «2115 12 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 24

А1їа Ппув ТПг Рібе Тук Тук Рпе Тук біу Іец Авр Уаї 1 2 10 «2105 25 «2115 321 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 25 часаєссада Єдасссадес Ессаєссєсс сеЕдЕСЕдсає сеЕсЕаадада сададеЕсасс 60 аєсасеЕєдсс доадсдадеЕса дддсаєтадс аастаєстад ссеЕддбаєса дсадааасса 120 чадааадеєеєс сеЕааддудеєссе ааєстаєдсс дсаєссасеє єдсааєсадд ддЕСссаєся 180 саддЕєсадесд дсадеЕддаєс єдддасадее Ессасеєсеса ссаєссадсад ссєдсадасе 240

Зо чдаадаєдесд саасеЕсаєса ссдеЕсаааад багадсадесд ссссаєссас ЕЕсСсоодссся 300 чодадассааад Єддасаєсаа а 321 «2105 26 «2115 107 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 26

Авр І1е сбіп Месє ТПг біп бек Рго бек бек ТГецп бек Аїа Бек Гей Агд 1 2 10 15

Авр Акуд Уаї ТПг І1е ТПг Сув Агуд Аза бек біп с1у Іїе Бек Авп Туг 20 25 30

Тец А1їа Тер Ту біп біп пув Рго с1іу Ппув Уа1 Ркго пуб Уаї Іецй І1е 35 40 45

Ту Аїа Аїа бек ТПг Іец біп бек сіу Уаі Ркго Бек Агд Рпе Бех щЩ1У

З бо 50 зек сіу бек біу ТПг Уаї Рпе ТПг Гей ТіПг І1е бек бек Гей біп ТПг 65 70 75 80 бі Авр Уаії Аза ТПг Тук Тук Сув біп Ппув Тук бек бек Аза Рго РіПе 85 90 95

ТПЕ Рпе с1іу Рго біу ТПг Гув Уаї Авр І1е Гу 100 105 «2105 27 «2115 18 6о0 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність

«223» Штучна «4005 27 садддсаєса дсааєсає 18 «2105 28 «2115 6 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 28 біп б1у І1е Бек Авп Туг 1 5 «2105 29 «2115 9 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 29 чдсеЕдсаєсс З «2105 30 «2115 З «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 30

Аза Аїа 5ег 1 «2105 31 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 31 саааадсаса дсадеЕдсссс асесасе 27 «2105 32 «2115 9 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність бо «2205 «223» Штучна

«4005 32 біп Гуз Тук Бек Бек Аїа Рго Рое ТПг 1 2 «2105 33 «2115 351 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 33 саддаєдсеЕсс сдоасасадес гдддоасєдад деЕдаадаадс ссддддссас адедааддес 60

Есседсаадд сЕсссуддаєс сасесєссасс дудссастава єдсассддує дсдасаддсес 120 ссЕддасаад ддассЕдадед даєддадаєду аєсаассста асааєдуєдд сасааастає 180 чдсасадааде сЕСсадддсад ддЕсассаєд ассадуддаса сдеЕссаєсад сасадсссас 240 аєддааєєда дсаддсєдад аєсєдасдас асддссдаває аєсаседедс дадададеваа 300 сдасасбаасеЕ ддаадссссд дддссаддда ассседдеЕса ссуссеЕссьса 351 «2105 34 «2115 117 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна

Зо «4005 34 біп Уаї Гей Гей Уаі сбіп бек сі1у Аїа біш Уа1 Ппув Пув Рго с1у А1а 1 2 10 15

ТПЕ Уа1ї Ппув Уа1! бек Сув Гув Аза бек біу бек ТПг Рпе ТПг с1у Туг 20 25 30

Тук Меє Нів Тгр Маі Агуд сбіп А1ї1а Рго сіу біп с1у ІТеш бі Тер Меє 35 40 45 б1у Тер І1е Авп Рго Авп Авп сіу с1у ТПг Ап Туг Аїа біп Гув РБПе 50 З бо біп б1у Акуд Уаі ТПг Меє ТПг Агуд Авр ТБПг бБег Іїе бек ТПг Аїа Туг 65 70 75 80

Меє бій Гей бек Агуд Гей Агуд Бек Авр Авр ТПг Аїа Уаї! Тук Тук Сув 85 90 95

Аза Акуд біц Гец Агуд Туг АБп о Тер Гув бек Тгр с1у біп с1у ТПг ГІєец 100 105 110

Уа1ї1 ТрПг Уаї бек 5ег 115 «2105 35 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 35 ччдаєссасьсє ссассудсса стає 24 60 «2105 36 «2115 8

«2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 36 бі1у бек ТПг Рпе ТПг с1у Тук Туг 1 5 «2105 37 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 37 аєсаасссва асаасуддедуд саса 24 «2105 38 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 38

І1е Авп Рго АвБп АБп о б1іу с1у ТК 1 5 «2105 39 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 39 дсчадачдаде Едсддабаєаа ссддаадесс 30 «2105 40 «2115 10 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 40

Аза Акуд бій Гец Агуд Туг АБп о Тер Гпув бег 1 5 10 60 «2105 41 «2115 324

«2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 41 чаааєєдедЕ Єдасдсадес Ессаддсасс сЕДдЕСЕЕевБдЄ сЕССаддудда аададеЕсасс 60 сЕСЕССєдса дддссадеса дадедеЕсддс аддссстасе гадсссддра ссаасадава 120 ссеЕддссадд сеЕсссаддсе ссесаєссає ддсдсаєсса дсадддссас Едасаєссса 180 часаддеєса дЕддсааєду дЕсєдддаса дасеЕссасес сассаєсад гадассддад 240 ссеЕдаадаєсє ЕсддсадеЕдна єсаседссад садсаєдаєа асесссстєва сасеЕсєевддс. 300 саддддасса доадссддадає сааа 324 «2105» 42 «2115 108 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 42 біц І1е Уаї Гей ТПг біп бек Рго сіу ТПг Гей бек Гей бег Рго 01Уу 1 2 10 15 бі Акуд Уаї ТПпг Гей бек Сув Агуд Аза Бек біп бек Уаі! сб1у Агд Рго 20 25 30

Тук Ггеш Аїа Тер Туг біп біп І1е Рго сбіу біп Аза Рго Агд Іец Іец

Зо Іїе Тук сб1у Аїа бек бек Агуд Аза ТПг Авр І1е Рго Авр Агуд Рре 5ег

З бо б1у Авп сі1у Бек с1у ТПг Авр Рпе ТПг Гей ТПг Іїе бБег Агд Іец сій 65 70 75 80

Рго біц Авр Робе Аза УМаї Тук Тук Сув біп біп Тукг Авр Авп бег Рго

З5 85 90 95

Тук ТПкЕ Рпе сіу біп сбіу ТПг Агкд Гец біц І1е Гув 100 105 40 «2105» 43 «2115 21 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність 45 «220» «223» Штучна «4005 43 сададедеЕсд дсаддссста с 21 50 «2105» 44 «2115 7 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005» 44 бо сіп бек Уаії о1у Агкуд Рго Туг 1 2

«2105 45 «2115 9 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 45 даєдсаєсс З «2105» 46 «2115 З «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 46 сб1у А1а 5ег 1 «2105» 47 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність

Зо «2205 «223» Штучна «4005 47 садсадсаєд асааєреєсссс Есасасе 27 «2105» 48 «2115 9 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 48 сіп біп Тук Авр Авп бек Рго Тукг ТіПг 1 2 «2105 49 «2115 366 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 49 чададєдсадс бддЕддадес Едддддаддс сЄЕддсасаас сЕдддддудєс ссеЕдадасес 60

ЕссеЕдедсад ссессуддаєсеє сассеЕсвада адсеЕєсдсса ЄдадседуддЕ ссдссаддсеЕ 120 бо ссачдадаадуд ддсєддааєе доассеЕсадає сесаддасста чЕддЕддсад басасассас 180 чдсадасеєссд Єдаадддссуд дсеЕсассаєс сссададаса аєєссаадаа сасдсєдбсає 240 сЕдсаааєда асадссеєдад адссдаддас асуддссдбєає асгассдсдс даааадссас 300 баєадсасса дссддЕссодуд доддсЕсЕдас гассддддсес адддаасссєї дудєссаседеЕСсС 360

СсСсеса 366 «2105 50 «2115 122 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 50 бі Маї біп Ге Уаі сій бек сі1у сіу сі1у Гей Уаі сбіп Рго с1у щу 1 2 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув Аї1а Аїа бек бі1у Рпе ТПг Рпе Агуд бек Ріє

А1їа Меє бек Тер Уаі Агуд біп Аїа Ркго б1у Ппув с1іу Гей бій Іец Уаї 20 зек Авр Гемй Агуд ТПг бек сіу сіу бек ТПг Туг Ту Аїа Авр бек Уаї

З бо пув б1у Агкд Гей ТПг Іїе Бек Агуд Авр Авп бек Гув Ап о ТПг Іец Туг 65 70 75 80

Тец біп Меє Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТПг Аїа Уаї Тук Тук Сув 25 85 90 95

Аза Ппув бек Нів Тукг бек ТПг бБег Тгр Рпе б1у с1у Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сб1у біп с1у ТПг Гей Уа1 ТПг Уа1і Бек 5ег 115 120

Зо «2105 51 «2115 24 «2125» ДНК 35 «213» Штучна послідовність «2205 «223» Штучна 40 «4005 51 ччаєєсассе Єгадаадссе гєдсс 24 «2105 52 «2115 8 45 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна 50 «4005 52 б1у Рпе ТПг Рпе Агуд Бек Ріе Аїа 1 2 «2105 53 «2115 24 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність 60 «2205

«223» Штучна «4005 53 сЕСаддасса дсдадЕддсад баса 24 «2105 54 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 54

Тїесч Агуд Тк бек с1у с1у бек ТЕГ 1 2 «2105 55 «2115» 45 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 55 чдсдаааадсс ассаєсадсас садседдЕєсс доадддоддсессд астас 45

Зо «2105 56 «2115 15 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 56

Аза Ппув бек Нів Тукг бек ТПг бек Тгр Рпе сі1у с1іу Рпе Авр Туг 1 2 10 15 «2105 57 «2115 321 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 57 часаєссада Єдасссадес Ессарсессс дЕДЕСЕдДсСЕЄ сеЕдсаддада сададесасс 60 аєсасеЕєдЕСсС доадсдадеЕса доадЕЕсвадс адседдєвад ссеЕддбаєса дсадааасса 120 чадааадссс сеЕаадссєссе даєстаєдсесс дсаєссадееє Єдсааадедуд ддЕсСссаєса 180 аддсєсадсуд дсадеддаєс Єдддасадає ЄсСсасеєссса ссассассаа сссдсадссе 240 чаачаєєсєвд саасесвтасса ЕєдЕСаасад дсеаасадеє єсссЕСЕСас ЄЕсСсСоодсода 300 чадассаадд Єддадаєсаа а 321 «2105 58 60 «2115 107 «2125 БІЛОК

«2135 Штучна послідовність «223» Штучна «4005 58

Авр І1е сбіп Месє ТПг біп бек Рго бек бек Уа! бек Аза бек Уаі с1У 1 5 10 15

Авр Акуд Уаї ТіПг І1е ТПпг Сув Агуд Азїа бек біп с1іу РПе Бек бек Тгр 20 25 30

Тец Азїа Тер Ту біп біп пув Рго с1іу Ппув Аїа Ркго Гув Іеп Гей Ше 35 40 45

Туг Аїа Аїа бек бБекг ІТец біп бек біу Уаі Ркго Бек Агд Рпе Бех щЩ1У 50 55 бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Гей ТіПг І1е ТПг Ап Тецй сіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аза ТПг Туг Тук Сув біп біп Аза Авп бек Ріе Рго Іей 85 90 95

ТПЕ Рпе сіу сіу біу ТПгЕ Гуз Уаї сіц І1е Гув 100 105 «2105 59 «2115 18 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна

Зо «4005 59 садададЕеЕєЕеЕса дсадсеєдд 18 «2105 60 «2115 6 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 60 біп б1у Рпе бек бек Тгр 1 5 «2105 61 «2115 9 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 61 чдсеЕдсаєсс З «2105 62 «2115 З бо «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність

«223» Штучна «4005 62

А1а Аїа 5ег 1 «2105» 63 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 63 саасаддсса асадеЕєеєссс ЕСЕСасЕе 27 «2105» 64 «2115 9 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 64 сбіп біп Аза Авп бек Рібе Рго Іей ТЕПг

Зо 1 5 «2105 65 «2115 366 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 65 чададєдсадс сддЕддадес Едддддаддсес сЄЕддсасадс сЕдддддудєс ссеЕдадасес 60

ЕссеЕдедсад ссессуддаєсе сасдеєсвадс адстаєдеЕса ЕдадседддЕ ссддссаддсе 120 ссадддаадуд дасєддадед ддЕСЕСааді асєсадеддеа асоддеддсад сасааасстас 180 дсадассссуд Едаадддссуд деЕсассаєс Ессададаса агрессаадаа сасуседеве 240 сЕддаааєда асадссеєдад адссдаддас асдддссдбєає асгассдсдс даааєсасьд 300 чддаастасса счасесЕсЕеЕсеЕ додає сЕдас саседодддес адддаассся ддЕСассдєс 360

СсСсеса 366 «2105 66 «2115 122 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 66 бі Маї бі1іп Гей Уаі бі Бек сі1у сіу с1у Гей Уаі1і сіп Рго с1і1у с1У бо 1 2 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув Аї1а Аза бек бі1у Рпе ТПг Ропе Бек бек Туг

20 25 30

Уаї Меє бек Тер Уаі Акуд сіп Аза Рго сіу Ппув сіу Гец біц Тгр Уаї 35 40 45 зек бек І1е бек б1у АвБп сіу біу бек ТПг Авп Туг Аїа Авр бек Уаї 50 55 бо пув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе бек Агуд Авр Авп бек Пув Авп о ТПг Іецй РБПе 65 70 75 80

Тец бій Меє Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТПг Аїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95

А1їа Ппув бек Тей с1у ТПг ТпПг Тс Тбс Рбе Гей с1у Рпе Авр Туг Тгр 100 105 110 сб1у біп с1у ТПг Гей Уа1 ТПг Уа1і Бек 5ег 115 120 «2105 67 «2115 24 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 67 дчдаєсєсасЯає Егадсадсста єдЕС 24 «2105 68 «2115 8 «212» БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 68 б1у Рпе ТПг РпПе бек бек Тук Уаї 1 5 «2105» 69 «2115 24 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 69 аєсадеЕддва аєдоаєдденад саса 24 «2105 70 «2115 8 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 70 бо І1їе бек с1у АБп сб1у с1у бек ТПг 1 5

«2105 71 «2115» 45 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 71 чдсдаааєсас гдддаассас сасдассеес еЕгоОдоЧЕСВЧТ астає 45 «2105 72 «2115 15 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 72

Аза Ппув бек Гец біу ТПг ТПг ТБ ТБ Рпе Гей с1іу Ропе Авр Туг 1 2 10 15 «2105 7З «2115 321 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність

Зо «2205 «223» Штучна «4005 73 часаєссада Єдасссадес Ессаєсессс дЕдЕСЕдсає сеЕдгаддада сададесасс 60 аєсасеЕсдЕеЕс доадсдадеса дддсаєсадс адседдеЕсад ссеЕддсаєса дсадааасса 120 чадааадссс сгааасеєссе даєстаєдсс дсаєссадес Єдсааадсдд ддссссаєса 180 аддеЕєсадсд дсадесддаєс Едддасасає сеЕсасесеса ссаєсадсад ссеЕдсадсессяе 240 чаачаєвєєеєєсєвд саасесвасса ЕсдЕсаасад дссаасадеє ЕсссеЕсессас ЕсЕСОдсодода 300 чадассаадд Єддадаєсаа а 321 «2105 74 «2115 107 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 74

Авр чІ1е сіп Меє ТПг сбіп бек Рго бек бек Уаї! бек Аза бек Уа1і с1Уу 1 2 10 15

Авр Акуд Уаї ТіПг І1е ТПг Сув Агуд Азїа бек біп с1у Іїе Бек Бек Тгр 20 25 30

Тец Азїа Тер Ту біп біп пув Рго с1іу Ппув Аїа Рго пуб Гей Іецй І1е 35 40 45

Туг Аїа Аїа бек бек ІТец біп бек біу Уаі Ркго бек Агд Рпе Бех 01Уу 50 З бо зек сіу бек біу ТПг Тук Рпе ТПг Іец ТПг І1ї1е бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бо сі Авр Рпе Аза ТПг Туг Туг Сув біп біп Аза Авп бек РіПе Рго Іец 85 90 95

ТПЕ Рпе сіу сіу біу ТПгЕ Гув Уаї сіц І11е Гув 100 105 «2105 75 «2115 18 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 75 садддеаєса дсадсеєдд 18 «2105 76 «2115 6 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 76 сіп б1у І1е Бек бек Тгр 1 5 «2105 77

Зо «2115 9 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 77 чдсеЕдсаєсс З «2105 78 «2115 З «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 78

Аза Аїа 5ег 1 «2105 79 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна бо «4005 79 саасаддсса асадеЕєеєссс ЕСЕСасЕе 27 «2105 80 «2115 9 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 80 сбіп біп Аза Авп бек Рібе Рго Іей ТЕПг 1 2 «2105 81 «2115» 363 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 81 саддєдсадс Сдсаддадес доддсссадда седдЕдаадс ссЕсддадас ссеЕдЕсссес 60 ассеЕдсасьд ЄссссдддеЕду сессаєсаді адсваєсасе ддадседдає ссуддсадссс 120 ссадддааду дасєсддадеЕє даєєсддаєає асеєсаєсаса дедддадсас сааєсаєаас 180 сссЕсссЕса ададеЕсдаде сассавраєсеЕ дсадасасудє ссаадаасса сЕссЕССсСстд 240 аадсєдадсеЕ сЕдЕдассдс Едсддасасдуд дссубасаєсеє аседедсдад ассссадсає 300

Зо ассадсадеЕє доасасуддеЕєс ЕСсСЕеЕєдасаєс єддддссаад ддасааєдуає сассдЕсссяе 360 са 363 «2105 82 «2115 121 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 82 біп Маї біп Гей біп бій бек с1іу Рго сбіу Гецй Уа1! Ппув Рго бек бій 1 2 10 15

ТПЕ Гей бек Гей ТПг Сув ТПг Уа1! бек сіу біу бек І1е бек бек Туг 20 25 30

Тук Тер Бек Тер І1е Агд біп Рго Рго біу пув б1у Іейп бій Гей Ше 35 40 45 сбі1у Тук І1їе Туг Тук Бек сіу Бек ТПг Авп Туг Авп Рго бек Іец Гу

З бо 50 зек Акад Уа1 ТПг І1е бек Уаі Авр ТПг бек Гув АвБп о Нів РПе бек Іецй 65 70 75 80

Ту Гей бек бек Уаі ТПг Аза Аза Авр ТПг Аїа Уа1 Тукг Тук Субв А1а 85 90 95

Акуд Бек біп Туг ТіПг бек бек Тер Туг біу бек Рпе АБр І1е Тер 01У 100 105 110 біп б1у ТПпг Меє Уа1і ТПг Уа1і! бек 5ег 115 120 60 «2105 83 «2115 24

«2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 83 чаєдадсЕсСса ЄсадсадеЕса Есас 24 «2105 84 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 84 сбі1у б1у бек Іїе Бек Бек Тук Туг 1 5 «2105 85 «2115 21 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 85 авеєваєваса деЕдддадсас с 21 «2105 86

З5 «2115 7 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 86

І1е Тук Тук бек бі1у бек ТПг 1 5 «2105 87 «2115 45 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 87 чдсдадаєссс адсаєсассад Єадесддсас дадсссЕсесвд агсаєсс 45 «2105 88 «2115 15 60 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність

«223» Штучна «4005 88

Аза Агуд бек біп Туг ТПг бек бек Тгр Тук сіу Бек Рібе АБр І1е 1 2 10 15 «2105 89 «2115 321 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 89 часаєссада Єдасссадес Ессаєсессс дЕдЕСЕдсає сеЕдгаддада сададесасс 60 аєсасеЕсдЕеЕсС доадсдадеса дддсаєсадс асссддеєсад сссддссєсса дсадааасса 120 чадааадссс сеЕаадссєссе даєстаєдсесс дсаєссасесє гасааддедд ддЕСсСссаєса 180 аддеЕєсадсд дсадсддаєс Едддссадаа СЕсасесьса ссаєсадсад ссеЕдсадсесся 240 чаачаєєсєвд саасесвтасса єЕєдЕСаасад дсеєаасадеьсє єсссдеЕддас дЕєСсСддссаа 300 чоадассаадд Єддаазааєсаа а 321 «2105 90 «2115 107 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність

Зо «220» «223» Штучна «4005 90

Авр чІ1е сіп Меє ТПг сбіп бек Рго бек бек Уаї! бек Аза бек Уа1і с1Уу 1 2 10 15

Авр Акуд Уаї ТіПг І1е ТПпг Сув Агуд Аїа бек біп с1іу Іїе Бек ТПг Тгр 20 25 30

Тец А1ї1а Тер Рпе сбіп біп пув Рго с1іу Ппув Аїа Рго пуб Гей Іецй І1е 35 40 45

Ту Аїа Аїа бек ТПг Іец біп сіу сіу Уаі Ркго бек Агд Рпе Бех щ1У 50 З бо зек сіу бек біу Ркго бій Рпе ТПг Іецй ТПг І1ї1е бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 сі Авр Рпе Аза ТПг Тугк Туг Сув біп біп Аза Авп бек РоПе Рго Тгр 85 90 95

ТПЕ Рпе сіу сіп сбіу ТПг Гуз Уаї сіц І11е Гув 100 105 «2105 91 «2115 18 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 91 бо сададсаєса дсасст99д 18

«2105 92 «2115 6 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 92 сіп б1у І1е Бек ТПг Тер 1 5 «2105 93 «2115 9 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 93 чдсеЕдсаєсс З «2105 94 «2115 З «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність

Зо «2205 «223» Штучна «4005 94

Аза Аїа 5ег 1 «2105 95 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 95 саасаддсса асадеЕєеєссс деддасд 27 «2105 96 «2115 9 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 96 біп бі1іп Аза Авп бек Рпе Рго Тгр ТПг 1 5 бо

«2105 97 «2115 366 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 97 саддєєсадс сЄдоасдсадес гддадсєдад деЕдаадаадс ссддддессЕс адсдаадаеєс 60

Есседсаадд ссессуддЕеЕса сассеЕстаас адстаєдудава ЕсадседддЕ дсдасаддсесс 120 ссЕддасаад дадассЕдадед даєдодадаєдуа аєсадсессс асааєдуєаа садесастає 180

ЧдЕасадааде Єссадддсад адесеЕссард ассасадаса саєссасдад гасадсссас 240 аєддаасєда ддадсссєвад аєсєдасдас асоуддссуєдЕ аєвасесдсдс дадасасесу 300 багсассасса дссдоасасодд чддЕссєдас гаєсддоадсес аддадаасссяї ддссассаєс 360

СсСсеса 366 «2105 98 «2115 122 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 98 біп Маї біп Гей Уаі сбіп бек сі1у Аїа біш Уа1 Ппув Пув Рго с1у А1а 1 2 10 15 зек Уаї Ппув Уаії бек Сув Гув Аїа бек біу Тук ТПг Рпе Авп бек Туг

Зо 20 25 30 сб1у І1е бек Тгр Уаі Агуд сбіп Аза Рго сіу біп сіу Гец біц Тгр Меє сб1у Тер І1е бек Бек Нів Ап сіу Авп бек Нів Тук Уаї біп Гуз РБПе

З бо 35 сіп б1у Акуд Маії бек Меє ТПг ТБПг Авр ТПг бек ТПг бек ТПг А1тїа Туг 65 70 75 80

Меє бій ге Агуд Бек Гей Агуд Бек Авр Авр ТПг Аїа Уаї! Тук Тук Сув 85 90 95

Аза Акуд Нів бек Тук ТПг ТПг обег Тгр Тук б1у с1у Рпе Авр Тукг Тгр 40 100 105 110 сб1у біп с1у ТПг Гей Уа1 ТПг Уа1і Бек 5ег 115 120 45 «2105 99 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність 50 «2205 «223» Штучна «4005 99 чдаєбасассеє ЄЕаасадсса гддЧЕ 24 «2105 100 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність 60 «2205

«223» Штучна «4005 100 сб1у Тук ТПг Рпе Авп бБег Туг ШУ 1 5 «2105 101 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 101 аєсадсессс асааєсуддеаа саде 24 «2105 102 «2115 8 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 102

І1е бек бек Нібв Авп б1у Авп 5ег 1 5 «2105 103 «2115 45 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 103 чдсдадасасе сдбаєсассас садсєддсас доададЕсссда астсає 45 «2105» 104 «2115 15 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005» 104

Аза Акуд Нів бек Тукг ТПг ТПг обег Тгр Тук с1у с1у Ропе Авр Туг 1 5 10 15 «2105 105 «2115 321 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність бо «2205

«223» Штучна «4005 105 часаєссада Єдасссадес Ессаєсессс дЕдЕСЕдсає сеЕдгаддада сададесасс 60 аєсасеЕсдЕеЕсС доадсдадеса дддЕсссадс адседдеЕсад сседдсаєса дсадааасса 120 чадааадссс сЕсадсєссе даєстаєдсесс дсаєссадееє Єдсааадедуд ддЕсСссаєса 180 аддеЕєсадсд дсадесддаєс ЕдддЕсадає сЕсасессса ссаєсадсад ссеЕдсадсесся 240 чаачаєвєєеєєсєвд саасесвасса ЕсдЕсаасад дссаасадеє ЕсссеЕсессас ЕсЕСОдсодода 300 чадассаадд Єддадаєсаа а 321 «2105 106 «2115 107 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 106

Авр чІ1е сіп Меє ТПг сбіп бек Рго бек бек Уаї! бек Аза бек Уа1і с1Уу 1 2 10 15

Авр Акуд Уаї ТіПг І1е ТПпг Сув Агуд Азїа бек біп с1іу РПе Бек бек Тгр 20 25 30

Тец Азїа Тер Ту біп біп пув Рго с1іу Ппув Аза Рго Ссіп Гец Іец І1е

Туг Аїа Аїа бек бБекг ІТец біп бек біу Уаі Ркго Бек Агд Рпе Бех щЩ1У

З бо зек сіу бек біу Бек Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1ї1е бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80

Зо сі Авр Рпе Аза ТПг Туг Туг Сув біп біп Аза Авп бек Рібе Рго Гей 85 90 95

ТПЕ Рпе сіу сіу біу ТПгЕ Гув Уаї сіц І11е Гув 100 105

З5 «2105 107 «2115 18 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність 40 «220» «223» Штучна «4005 107 45 сададЕЕєеєса дсадсе99 18 «2105 108 «2115 6 «2125 БІЛОК 50 «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 108 біп б1у Рпе бек бек Тгр 1 2 60 «2105 109 «2115 9

«2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 109 чдсеЕдсаєсс З «2105 110 «2115 З «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 110

А1а Аїа 5ег 1 «2105 111 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна

Зо «4005 111 саасаддсса асадеЕєеєссс ЕСЕСасЕе 27 «2105 112 «2115 9 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 112 сбіп біп Аза Авп бек Рібе Рго Іей ТЕПг 1 2 «2105 113 «2115 366 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 113 чададєдсадс сддЕддадес содддддаддс ЄЕддЕєсадс содоадоадуаєс ссеЕдадасес 60

Есседедсад ссессуддаає сассеЕсдадс адсраєддса ЕдадседддЕ ссддссаддсе 120 ссадддаадуд дассддадед ддЕСсСдсаєсс аЕсеЕсеЕдудса дЕддЕддеЕда сссагассас 180 чдсадасеєссд Єдаадддссуд деЕЕсассаєд Сссададаса аєєссаадаа сасдсєдбсає 240 бо СЕдсаааєда асадссєдад адссдаддас асддссубає аєгтаєєдесдс дааадаєсда 300 басадеддда дссасрасдуд аддЕеЕседас саседдддсес доадддаассся ддЕСассдєс 360

СсСсеса 366 «2105 114 «2115 122 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 114 бі Маї бі1іп Гей Уаі бі Бек сі1у сіу с1у Гей Уаі1і сіп Рго с1і1у с1У 1 5 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув Аї1а Аза бек бі1у І1е ТПг Гей Бек бек Туг бі1у Меє бек Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго сіу Ппув сіу Гец біц Тгр Уаї

Аза бек І1їе Рре сСіу бек біу біу біу Рго Туг Туг Аїа Авр бек Уаї бо 20 пув бі1у Акуд Рпе ТПг Меє бег Акуд Авр АБп бек Пув Авп ТПг Гей Туг 65 70 75 80

Тец біп Меє Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТПг Аїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95

Аза пув Авр Агуд Туг бек біу бек Тук Тук б1у с1у Рпе Авр Тукг Тгр 25 100 105 110 б1у Акуд с1у ТПг Гей Уа1 ТПг Уа1і Бек 5ег 115 120

Зо «2105 115 «2115 24 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність 35 «2205 «223» Штучна «4005 115 чдааєсассеє Єдадсадсса гддс 24 40 «2105» 116 «2115 8 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність 45 «2205 «223» Штучна «4005 116 50 с1у І1їе ТПг Гей бек бек Ту ШУ 1 5 «2105 117 55 «2115 24 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 6о0 «223» Штучна

«4005 117 авг сддва дЕддеЕддЕда ссса 24 «2105 118 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 118

І1е Рре сіу бек б1у с1у сС1Уу Ркго 1 2 «2105 119 «2115» 45 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 119 чдсдааадаєс даєсасадеда дадссассас ддаддссссдд астас 45 «2105 120 «2115 15

Зо «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 120

Аза пув Авр Агуд Туг бек біу Бек Туг Тук сіу с1іу Рібе Авр Туг 1 2 10 15 «2105 121 «2115 321 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 121 дасаєссада Едасссадес Ессассеєссс деЕдЕСєдсає седсаддада сададессасс 60 аєсасеЕєдЕСсС доадсдадеЕса додадсаєвасс адседдесєвад ссеЕддбаєса дсадааасса 120 чадааадссс сргасасесссеЕ даєстаєдсс дсаєссадееє Єдсааасьдуд ддЕсСссаєса 180 аддеЕєсадсд дсадсддаєс Едддасадає сЕсасесеса ссаєсадсад ссеЕдсадсессяе 240 чаасавєеєсєвд саасесвтасса єЕєдЕСаасад дсеєаасадесє ЄсссеЕССсСас сЕсСсСоодсода 300 дадассаачд гддадаєсаа а 321 «2105 122 «2115 107 «2125 БІЛОК 6о0 «213» Штучна послідовність

«223» Штучна «4005 122

Авр чІ1е сіп Меє ТПг сбіп бек Рго бек бек Уаї! бек Аза бек Уа1і с1Уу 1 5 10 15

Авр Акуд Уаї ТіПг І1е ТПпг Сув Агуд Аїа бек біп с1у І1їе ТПг бек Тгр 20 25 30

Тец Азїа Тер Ту біп біп пув Рго с1іу Ппув Аза Рго ТПг Іец Іец І1е 35 40 45

Туг Аїа Аїа бек бек Іїец біп ТБПг сіу Уаі Ркго бек Агд Рпе Бех щЩ1У 50 55 бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1ї1е бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 сі Нів Рпе Аза ТПг Тук Тукг Сув біп біп Аза Авп бек Робе Рго Рго 85 90 95

ТПЕ Рпе сіу сіу біу ТПгЕ Гув Уаї сіц І11е Гув 100 105 «2105 123 «2115 18 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 123

Зо сададсаєса ссадсе99 18 «2105 124 «2115 6 «212» БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 124 біп б1у І1е ТПг бек Тгр 1 5 «2105» 125 «2115 9 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 125 чдсеЕдсаєсс З «2105» 126 «2115 З «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність 60 «2205

«223» Штучна «4005 126

А1а Аїа 5ег 1 «2105 127 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 127 саасаддсса асадеЕєеєссс Есстасе 27 «2105 128 «2115 9 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 128 сбіп біп Аза Авп бек Рібе Рго Рго ТЕПг 1 2

Зо «2105 129 «2115 366 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 129 чададєдсадс сддЕддадес Едддддаддс Есоддсасадс сЕдддддудєс сстаадасес 60

ЕссеЕдедсад ссессуддасе сассеЕсвадс адсваєдссе ЕдасседддЕ ссудссаддсе 120 ссадддаадуд доасєддадеЕд ддЕСЕСЕЕСЕ асгадеддна деЕддЕддсад дссаєєстас 180 чдсадасеєссд Єдаадддссуд деЕссассаєс сссададаса аєсссаадаа саєдседнає 240 седсаааєда асадссєдад адссдаддас асддссабає аєсассдеєдс даадсссста 300 басассасса дссддЕасодуд додддЕссдас сссеЕдддудес адддаассся ддЕСассдєс 360

СсСсеса 366 «2105 130 «2115 122 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 130 бі Маї бі1іп Гей Уаі бі Бек сі1у сіу с1у Гей Уаі1і сіп Рго с1і1у с1У 1 2 10 15 бо зек Геп Акуд Гей бек Сув Аїа Аза бек біу Робе ТПг Рре бек бек Туг 20 25 30

Аза гей ТПг Тгр Уаі Агуд біп Аза Рго б1у Ппув с1у Гей бій Тер Уаї 35 40 45 зек Рпе І1е бек біу бек сб1іу бі1у Агд Рго Рпе Туг Аїа Авр бек Уаї 50 55 бо пув бі1у Агкуд Рпе ТПг І1їе бБег Акуд Авр АБп бек Пув Авп Меє Гей Туг 65 70 75 80

Тец біп Меє Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТПг Аїа І1е Тук Тук Сув 85 90 95

Аза Ппув бек Гец Туг ТПг ТПг обег Тгр Тук б1у с1у Рпе Авр бек Тгр 100 105 110 сб1у біп с1у ТПг Гей Уа1 ТПг Уа1і Бек 5ег 115 120 «2105 131 «2115 24 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 131 ччаєєсассеЕ Єгадсадеса єдсс 24 «2105 132 «2115 8 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність

Зо «2205 «223» Штучна «4005 132 с1у Рре ТПг Рре бек бек Туг Аїа 1 5 «2105 133 «2115 24 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 133 аєсадеЕддва дЕддеЕддЕад десса 24 «2105 134 «2115 8 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 134

І1е бек сіу бек б1у б1у Агд Рго 60 1 5

«2105 135 «2115» 45 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 135 чдсдаадеЕссс гдсасассас садссоддсас доаододоаддеЕссд асссс 45 «2105 136 «2115 15 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 136

Аза Ппув бек Гец Тукг ТПг ТПг обег Тгр Тук с1у с1у Ропе Авр 5ег 1 2 10 15 «2105 137 «2115 321 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність

Зо «2205 «223» Штучна «4005 137 часаєссада Єдасссадес Ессаєсессс дЕдЕСЕдсає сеЕдгаддада сададесасс 60 аєсасеЕсдЕеЕсС доадсдадеса дддєдессЯаєс адседдеЕсад сседдсаєса дсадааасса 120 чадааадссс сеЕаадсеєссеЕ даєстаєдсс дсаєссадеє єдсааадсдд ддссссаєса 180 аддеЕєсадсд дсадсддаєс Едддасадає сЕсасесеса ссаєсадсад ссеЕдсадсессяе 240 чаачавєєеєсєвд саасеваєса Есдєсаасад Сссаасадее ЕсссеЕвссас ЕСсСЕСДДССсСсСЄ 300 чодадассааад Єддасаєсаа а 321 «2105 138 «2115 107 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 138

Авр чІ1е сіп Меє ТПг сбіп бек Рго бек бек Уаї! бек Аза бек Уа1і с1Уу 1 2 10 15

Авр Акуд Уаї ТіПг І1е ТПг Сув Агуд Азїа бек біп сіу Уаї Уаї бек Тгр 20 25 30

Тец Азїа Тер Ту біп біп пув Рго с1іу Ппув Аїа Рго пуб Гей Іецй І1е 35 40 45

Туг Аїа Аїа бек бек ІТец біп бек біу Уаі Ркго бек Акуд Ріе бег 01Уу 50 З бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1ї1е бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бо сі Авр Рпе Аза ТПг Туг Тук Сув біп біп бек Авп бек Рре Рго Ріе 85 90 95

ТПкЕ Ггеш с1у Рго біу ТПг Гув Уаї Авр І1е Гу 100 105 «2105 139 «2115 18 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 139 садддЕдЕеЕсЯ Есадсеєд 18 «2105» 140 «2115 6 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005» 140 сіп сбі1у Уаї Уаї бек Ткгр 1 5 «2105 141

Зо «2115 9 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 141 чдсеЕдсаєсс З «2105 142 «2115 З «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 142

Аза Аїа 5ег 1 «2105» 143 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна бо «4005» 143 саасадеЕсса асадеЕсСЕссс єс 24 «2105 144 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 144 сбіп біп Бек Авп бек Робе Рго Ріе 1 2 «2105» 145 «2115 366 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 145 саддаєдсадс Єдадсдсадес гдддоасєдаа деЕдаадаадс ссдодддессес адедааддес 60

Есседсаадд сЕсссуддаса сассессасс ддудссасвава Єдсаседдає дсдасаддес 120 ссЕддасаад ддассЕдадед даєддадаєду аєсаассста асадедудєдда сасааастає 180 дсасадааде сЕсаддасад ддеЕсассаєд ассадуддаса сдеЕссаєсад сасадсссас 240 аєддадсеєда дсаддсєдад аєсєдасдас асддссдєдЕ аєсаседедс дададоадада 300

Зо баєддсадса дссдоасасод чддддсссдад баседдддсс адддаассся ддеЕсассдудєс 360

СсСсеса 366 «2105 146 «2115 122 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 146 біп Маї біп Гей Уаі сбіп бек сі1у Аїа біш Уа1 Ппув Пув Рго с1у А1а 1 2 10 15 зек Уаї Ппув Уаії бек Сув Гпув Аїа бек біу Туг ТПг Рпе ТПг СсС1у Нів 20 25 30

Тук Меє Туг Тер Месє Агуд біп Аза Рго сіу біп сб1у Іецп б1п Тгр Меє 35 40 45 б1у Тер І1е Авп Рго Авп бек сіу с1у ТПг Ап Туг Аїа біп Гув РБПе

З бо 50 сіп Авр Агуд Уаії ТПс Меє ТБг Акуд Авр о ТБПг бБег І1їе бек ТПг А1а Туг 65 70 75 80

Меє бій Гей бек Агуд Гей Агуд Бек Авр Авр ТПг Аїа Уаї! Тук Тук Сув 85 90 95

Аза Агкуд с1у Агуд Туг біу бек бБег Тгр Тук б1у с1у Рпе бі Туг Тгр 100 105 110 сб1у біп с1у ТПг Гей Уа1 ТПг Уа1і Бек 5ег 115 120 60 «2105 147 «2115 24

«2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 147 ччдаєасассеє ссассудсса стає 24 «2105» 148 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005» 148 сбі1у Тук ТПпг Рпе ТПг со1у Нів Туг 1 5 «2105» 149 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005» 149 аєсаасссва асадсддедуд саса 24 «2105 150

З5 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 150

І1е Авп Рго АвБп бек б1у с1у ТЕГ 1 5 «2105 151 «2115 45 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 151 чдсдачадода чдчасаєддадсад бЄадсєддсас доаддоаддасссд адсас 45 «2105 152 «2115 15 60 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність

«223» Штучна «4005 152

Аз1а Агуд с1у Акуд Туг біу бек бек Тер Тук сбіу б1у Рпбе сі Туг 1 2 10 15 «2105 153 «2115 321 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 153 часаєссада Єдасссадес Ессаєсессс дЕДдЕСсдсає сеЕдеЕєддада сададесасс 60 аєсасеЕєдЕСсС доадсдадеЕса додадсаєвасс адседдесєвад ссеЕддбаєса дсадааасса 120 дадааадссс сгаассеєссє даєссаєдсс дсадссадеє сСасааадсдуд ддссссаєса 180 аддеЕєсадсд дсадесддаєс Едддасуадає сЕсасесеса ссаєсадсад ссеЕдсадсессяе 240 чаачасеєва саасесвасса ЕсдЕсаасад дсеЕсСасадес ЕсссеЕсеЕсас ЕсЕСОдсодода 300 чадассаадд Єддадаєсаа а 321 «2105 154 «2115 107 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність

Зо «2205 «223» Штучна «4005 154

Авр І1е сбіп Месє ТПг біп бек Рго бек бек Уа1і Бек Аза бек Уаі с01У

З5 1 2 10 15

Авр Акуд Уаї ТіПг І1е ТПпг Сув Агуд Аїа бек біп с1у І1їе ТПг бек Тгр 20 25 30

Тец Азїа Тер Ту біп біп пув Рго с1іу Ппув Аза Рго АБп ІТецп Гей Ше 40 Тухг Аїа Аїа Аїа бек Гей біп бек с1іу Уа1і Рго бБег Агд Рпе бек 01Уу

З бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг Іїе бек бек Гец біп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе ТПг ТПг Туг Тук Сув біп біп Аїа Тук бек Гей Рго Іей 45 85 90 95

ТПЕ Рпе сіу сіу біу ТП Гув Уаї бій І1е Гув 100 105 50 «2105 155 «2115 18 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 155 садддеаєса ссадсеєдд 18 60 «2105 156

«2115 6 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 156 біп б1у І1е ТПг бек Тгр 1 5 «2105 157 «2115 9 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 157 дсЕдсадессес З «2105 158 «2115 З «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 158

Аза Аїа А1а 1 «2105 159 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 159 саасаддесЕ асадеЕсьссс ЕсЕСасЕ 27 «2105 160 «2115 9 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 160 біп бі1іп А1їа Туг Бек Гей Рго Гей ТПг 1 5 бо «2105 161

«2115 366 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 161 саддєЕдсадс ЕддсддадеЕс Едддоададдс дЕддЕссадс ссдддаддеєс ссеЕдадасес 60

Єсседедсад ссестддаєс сасссссадс адстаєддсеЕ Сдсаседдає ссдссадесе 120 ссаддсаадуд дассддааєд ддеЕддсассє асаєсаєваєд асоддаадсаа Саааєсастає 180 чдсадасеєссд Єдаадддссуд аєєсассаєс Ессададаса асессаадаа сасудсеЕдсає 240 сЕдсаааєда асадссеєдад ассеєдаддас асуддсєддає асеЕсссууєудс даааєссста 300 басасаасса дссддЕасодуд доадсЕсЕдас саседдддес адддаассся ддЕСассдєс 360

СсСсеса 366 «2105 162 «2115 122 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 162 біп УМаї біп Гей Уаі бі бек сіу сіу сіу Уа1 Уаі1і сіп Рго с1у Агд 1 2 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув А1ї1а Аїа бек біу Рпе ТПг Рібе бек бек Туг 20 25 30

Зо с1у Гей Ні Тер Уаі Акуд біп бек Рго сі1у Ппув с1у Те бій Тгр Уаї

Аза гей І1їе бек Туг Авр біу бек Авп о Гув Тук Туг Аза Авр бек Уаї

З бо

Тпув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе бек Агуд Авр Авп бек ГПув Ап о ТПг Іец Туг 35 65 70 75 80

Тец біп Меє Авп бек Гей Агуд Рго бій Авр ТБПг Аза б1у Тук РПпе Сув 85 90 95

Аза Ппув бек Гец Тукг ТПг ТПг о бег Тгр Тук б1у с1у Рпе Авр Тукг Тгр 100 105 110 40 сіу біп сб1у ТПг Гей Уа! ТПг Уа1ї бек бБег 115 120 «2105 163 45 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 50 «223» Штучна «4005 163 ччаєєсассеє Єсадсадсса гддс 24 «2105 164 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність бо «2205 «223» Штучна

«4005 164 б1у Рпе ТПг Рпе бБег бБег Ту У 1 5 «2105» 165 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 165 асаєсавєаєд асддаадеаа гааа 24 «2105 166 «2115 8 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 166

ІТ1е бек Тукг Авр біу Бек Авп Гув 1 5 «2105 167 «2115 45 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 167 чдсдаааєссс гасасасаас садссодбас доддасЕСт9Ч астає 45 «2105» 168 «2115 15 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 168

Аза Ппув бек Гец Тукг ТПг ТПг бек Тгр Тук с1у с1у Ропе Авр Туг 1 5 10 15 «2105 169 «2115 321 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність 60 «2205 «223» Штучна

«4005 169 часаєссада Єдасссадес Ессаєсессс дЕдЕСЕдсає сеЕдгаддада сададесасс 60 аєсасеЕєдЕСсС доадсдадеЕса доадсаєтада адседудєвад ссеЕддбаєса дсааааасса 120 чадааадссс сеЕаассєсст даєстаєдсс дсдеЕсСсадеє Єдсааадедуд ддЕсСссаєса 180 аддсєсадсуд дсадеддаєс Єдддасадає ЄсСсасеєссса ссассадсад сссдсадссе 240 чаачаєвєєеєєсєвд саасесвасса ЕсдЕсаасад дссаасадееє ЕсссеЕсссас ЕсСЕСдссСсЕ 300 чодадассааад Єддасаєсаа а 321 «2105 170 «2115 107 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 170

Авр І1е сбіп Месє ТПг біп бек Рго бек бек Уа! бек Аза Бек Уаі Щ1У 1 2 10 15

Авр Агуд Уаі ТПг І1е ТПг Сув Акуд Азїа бек біп с1у І1е Агуд бек Тер 20 25 30

Тец Азїа Тер Ту біп біп пув Рго с1іу Ппув Аза Рго Ап Гец Іецй І1е 35 40 45

Туг Аїа Аїа бек бек ІТец біп бек сіу Уаі Рго Бек Акд Ріе бег 01Уу 50 З бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1ї1е бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аза ТПг Тук Тук Сув біп біп Аза Авп бек Рое Рго Рго 85 90 95

Зо ТПЕ Рпе с1у Рго біу ТПг Ппув Маі Авр І1е Гувг 100 105 «2105 171 «2115 18 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 171 садддеаєса даадсесдд 18 «2105 172 «2115 6 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 172 біп б1у І1е Агуд бек Тгр 1 2 «2105 173 «2115 9 6о0 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність

«223» Штучна «4005 173 чдсЕдсдЕсес З «2105 174 «2115 З «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 174

А1а Аїа 5ег 1 «2105 175 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 175

Зо саасададсса асадеееєссс єсссасе 27 «2105 176 «2115 9 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 176 сбіп біп Аза Авп бек Рібе Рго Рго ТіПг 1 2 «2105 177 «2115 366 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 177 чададєдсадс бддЕддадес Едддддаддс ЄЕддсасадс сЕдддддудєс ссеЕдадасес 60

Есседедсад ссестгддуаєс сасссєсадс аассаєдсса ЕЄдасссддудє ссдссаддсеЕ 120 ссадддаадуд дасєсддадед ддЕсСЕСаасі аєссадеддса чеЕддЕдаєаа сасаєбастас 180 чдсадасеєссд Єдсадддссу деЕЕсассаєс сссададдсесс аєєссаадаа сасдсєдбсає 240 сЕдсаааєда асадссеєдад адссдаддас асуддссдбєає асгассдсдс дааассвасу 300 басадсадаа дседдЕасоду ЕдДСсСЕЕєЕдає сЕСЕЧддддудсес аадддасаає ддеЕСассдєс 360 бо ЄсСЕсса 366

«2105 178 «2115 122 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 178 сій Уаї сбіп Геп Уаії бій бек сіу с1і1у с1у ІТей Уаії сбіп Рго с1і1у с1Уу 1 5 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув Аї1а Аза бек бі1у Рпе ТПг Рпе бек Авп Туг 20 25 30

Аза Меє ТБПг Тер Уаі Агуд біп Аза Рго с1іу Ппув сіу Гец біц Тгр Уаї 35 40 45 зек ТПг І1е бек біу бек б1у Авр АвБп о ТПг Туг Туг Аїа Авр бек Уаї 50 55 бо біп б1у Акуд Рпе ТПг Іїе Бек Акуд сіу Нів бек Гув АвБп о ТПг Іец Туг 65 70 75 80

Тен біп Мес Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТПг Аїа Уа1ї! Тук Тук Сув 85 90 95

Аза Ппув Рго ТПг Туг бек Агуд бек Тгр Туг с1і1у Аїа Рбе Авр Рое Тгр 100 105 110 сб1у бі1іп с1у ТПг Меє Уа1 ТПг Уаі1і Бек 5ег 115 120 «2105 179 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна

З5 «4005 179 чадЕєсассеє Єсадсаасса гєдсс 24 «2105 180 «2115 8 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 180 б1у Рпе ТПг Рпе бБег Авп Туг Аїа 1 5 «2105 181 «2115 24 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Штучна 60 «4005 181 аєсадеддса дЕддЕдаєаа саса 24

«2105 182 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 182

І1їе бек с1у бек б1у Авр АвБп ТПг 1 2 «2105 183 «2115» 45 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 183 чдсдааасста сдбаєсадсад аадсеєддсас доасдсесссд ассес 45 «2105 184 «2115 15 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність

Зо «2205 «223» Штучна «4005 184

Аза Ппув Рго ТПг Туг бек Агуд бек Тер Туг б1у А1ї1а Рпе Авр Ріе 1 2 10 15 «2105 185 «2115 321 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 185 часаєссада Єдасссадес Ессаєссєсс дЕдЕСЕдсає сеЕдгаддада сададеЕсасс 60 аєсасеЕєдЕСсС доадсдадеЕса доадсаєвадс адседдесєвад ссеЕддбаєса дсадааассд 120 чадааадссс сЕСсСаасессст даєстаєдсс дсаєссадає Єдсааадедуд ддЕсСссаєса 180 адчсєссдоад дсадеддаєс Едддасадає ЄсСсасеєссса ссаєсадсад сседсадссе 240 чаачаєвєєеєєсєвд саасесвасса ЕсдЕсаасад дссаасааєе Есссаєєссас ЕсСЕСОдДСсСсСсЮ 300 чодадассааад Єддасаєсаа а 321 «2105 186 «2115 107 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» 6о0 «223» Штучна

«4005» 186

Авр І1е сбіп Месє ТПг біп бек Рго бек бек Уа! бек Аза Бек Уаі Щ1У 1 5 10 15

Авр Акуд Уаї ТіПг І1е ТПпг Сув Агуд Азїа бек біп с1іу Іїе Бек бек Тгр 20 25 30

Тец Азїа Тер Ту біп біп пув Рго с1іу Ппув Аза Рго Ссіп Гец Іец І1е 35 40 45

Ту Аїа Аза бек Агд їец біп бек біу Уаі Рго бек Агд Рпе Тер 0Щ1У 50 55 бо

Ззек сіу бек біу ТПгЕ Авр Рпе ТПг Гей ТіПг І1е бек бек Гечп біп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аза ТПг Тук Тук Сув біп біп Аза Авп Авп Робе Рго РіПе 85 90 95

ТПЕ Рпе с1іу Рго біу ТПг Гув Уаї Авр І1е Гу 100 105 «2105 187 «2115 18 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 187 садддеаєса дсадсеєдд 18 «2105» 188

Зо «2115 6 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 188 біп б1у І1е бек бек Тгр 1 5 «2105» 189 «2115 9 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 189 чдсеЕдсаєсс З «2105 190 «2115 З «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна 60 «4005 190

А1а Аїа 5ег «2105 191 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 191 саасаддсса асаавеєєссс асесась 27 «2105 192 «2115 9 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 192 сбіп біп Аза Авп Авп Рбе Рго Робе ТЕГ 1 2 «2105 193

Зо «2115 366 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 193 саддеЕєсадс Еддсдсадес Еддадсєдад деЕдаадаадс ссддуддссеЕсС адеЕдааддес 60

Есседсаадд сЕЄСсуддЕса сассеЕсвасс адстаєдуава ЕсадседддЕ дсдасаддсес 120 ссеЕддасаад дсссєдадед дасдочаєду аєссодсудсЕс асааєсддаєса сасааассає 180 дсасадааде сЕСсадддсад адесассаєрд ассасадаса саєссасдаа сассудсссас 240 аєддадсеєда ддасссєдаа Ессеєдасдає асддсесуєсеЕ аєсаседедс дададаєсча 300 басадеддда дсеЕЕсСсасоду ЄаасеЕсведас саседдддсес адддаасссе ддЕСассдєс 360

СсСсеса 366 «2105 194 «2115 122 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 194 сіп Уаії біп Гецп Уаії сіп бек бі1у Аї1а сіцш Уаї Ппув Гув Рго с1у Аїа 1 2 10 15 зек Уаї Ппув Уаії бек Сув Гув Аїа бек біу Тук ТПг Рпе ТПг бек Туг 20 25 30 сб1у І1е бек Тгр Уаі Агуд сбіп Аза Рго сіу біп сіу Гец біц Тгр Меє бо 35 40 45 сб1у Тер І1е Агуд Аза Тук Авп сіу Туг ТПг Авп Туг Аїа біп Гув РБПе

50 55 бо біп б1у Акуд Уа1і ТПг Меє ТПг ТПг Авр о ТпПг бек ТПг Ап ТБПг Аїа Туг 65 70 75 80

Меє бій гей Агуд ТпПг Гей Ап о бБег Авр Ар ТПг Аїа Уаї! Тук Тук Сув 85 90 95

Аза Агуд Авр Агуд Туг бек біу бек Ропе Нів б1у Авп Рпе Авр Тукг Тгр 100 105 110 сб1у біп с1у ТПг Гей Уа1 ТПг Уа1і Бек 5ег 115 120 «2105 195 «2115 24 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 195 чдаєвасассеє ЄрассадеЕса где 24 «2105 196 «2115 8 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна

Зо «4005 196 сбі1у Тук ТПг Рпе ТПг бБег Ту У 1 5

З5 «2105 197 «2115 24 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 197 аєссдсдудсЕєс асааєддеЕєба саса 24 «2105 198 «2115 8 «212» БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 198

І1е Агуд Аїа Туг АБп б1у Тук ТЕг 1 5 60 «2105 199 «2115» 45

«2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 199 чдсдачдчачдчаєс дасаєсадедуа дадсеЕсссас ддасаасессудд астас 45 «2105 200 «2115 15 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 200

Аза Агуд Авр Агуд Туг бек біу бек Рпе Нів с1у Авп Ропе Авр Туг 1 2 10 15 «2105 201 «2115 321 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна

Зо «4005 201 часаєссада Єдасссадес Ессаєсессс дЕДдЕСЕдсудЄ сЕдЕаддада сададедасс 60 аєсасеЕєдЕеЕСсС доадсдадеЕса доадвасеЕсес адседдЕеЕсад сседдсаєса дсадааасса 120 чадааадссс сеЕаадудеєссе ааєстаєдсс дсаєссааєє Єддааадедд ддЕсСссаєса 180 аддсєсадсуд дсадеддаєс Єдддасадає ЄсСсасеєссса ссассадсад сссдсадссе 240 чаачаєєеєєсєвд саасесвасса ЕсдЕсаасад дссаасадееє бассдсєсас ЕсЕСОдсодода 300 чадассаадд Єддадаєсаа а 321 «2105 202 «2115 107 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 202

Авр І1е сбіп Месє ТПг біп бек Рго бек бек Уа! бек Аза Бек Уаі Щ1У 1 2 10 15

Авр Агуд Уаі ТПг І1е ТПг Сув Агуд Аїа бек біп с1у І1е Робе бек Тгр 20 25 30

Тец Азїа Тер Ту біп біп пув Рго с1іу Ппув Аїа Рго пуб Уаї Іецй І1е 35 40 45

Ту Аїа Аза бек Авп Тец біц бек біу Уаі Ркго Бек Агд Рпе Бех щЩ1У 50 З бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1ї1е бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аза ТПг Туг Тук Сув біп біп Аза Авп бек Гей Рго Іей 85 90 95 бо ТПЕ Рпе сіу с1і1у біу ТПг Ппув Уаії сій І1їе Гув 100 105

«2105 203 «2115 18 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 203 сададсаєсе ссадсев99 18 «2105» 204 «2115 6 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 204 біп б1у І1е Рпе 5ег Тгр 1 5 «2105 205 «2115 9 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність

Зо «2205 «223» Штучна «4005 205 чдсеЕдсаєсс З «2105 206 «2115 З «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 206

Аза Аїа 5ег 1 «2105 207 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 207 саасаддсса асадеЕєвасс дсесасе 27 бо «2105 208 «2115 9

«2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 208 сбіп біп Аза Авп бек Гей Рго Темп ТЕПг 1 2 «2105» 209 «2115 366 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 209 чададєдсадс ЄддЕддадес Еддддодаддс ЄЕддЕєссадс сЕдддаддуєс сссдадасес 60

ЕссеЕдедсад ссессуддаєсе сассеЕссаде асстаєєссса єдсаседддЕ ссудссаддсе 120 ссадддааду дассддааста єдДдЕсЕСаасе ассааєааєа асоддодоадаєсас сасавбаєстає 180 чдсадасеєсьд Єдаадддсад асесассаєс Сссададаса аєєссаадаа сасдсєдбсає 240 сЕєсаасєдуд дсадссєдад ассеєдаддас асдодасєдеєдЕ аєгтаседсдс дадасадасу 300 басассадса дсесддЕасодуд додддЕссдас сссеЕдддудес адддаассся ддЕСассдєс 360

СсСсеса 366 «2105 210

Зо «2115 122 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 210 бі Маї бі1іп Гей Уаі бі Бек сі1у сіу с1у Гей Уаі1і сіп Рго с1і1у с1У 1 2 10 15 зек Геп Акуд Гей бек Сув Аїа Аза бек біу Робе ТПг Ррпе бек ТіПг Туг 20 25 30 зек Меє Нів Тгр Уаі Агуд сбіп Азїа Рго сбі1у Ппув с1у Гей бій Тук Уаї 35 40 45 ек ТПг І1е АвБп АБп АвБп о б1іу Авр ТПг ТБпг Туг Туг Аїа Авр бек Уаї

З бо

Тпув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе бек Агуд Авр Авп бек ГПув Ап о ТПг Іец Туг 65 70 75 80

Тецп біп Гей сіу Бек Гей Агуд Рго бій Авр Меє Аїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95 50 Аза Агуд сіп ТБг Туг ТрПг о бек бек Тер Туг бі1у с1у Рпе Авр бек Тгр 100 105 110 сб1у біп с1у ТПг Гей Уа1 ТПг Уа1і Бек 5ег 115 120 «2105 211 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність 60 «220»

«223» Штучна «4005 211 ччаєєсассеє Єсадсассса Ессе 24 «2105 212 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 212 с1у Ррпе ТПг Рре бек ТПг Тукг 5ег 1 5 «2105 213 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 213 аєсааєсааса аєдодаддаєбас саса 24 «2105 214 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність

З5 «2205 «223» Штучна «4005 214

І1е Авп АвБп АвБп о б1у АвБр ТПг Тс 1 5 «2105 215 «2115 45 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 215 чдсдадасада сдбаєсассад садсєддсас ддадддддЕссд асссс 45 «2105 216 «2115 15 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 6о0 «223» Штучна

«4005 216

Аза Акуд біп Тс Тугє ТП о бек бек Тгр Тук с1у с1у Ропе Авр 5ег 1 2 10 15 «2105 217 «2115 321 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 217 дасаєссада Едасссадес Ессассеєссс деЕдЕСєдсає седсаддсда сададессасс 60 аєсасеЕєдЕСсС доадсдадеЕса додадсаєвасс адседдесєвад ссеЕддбаєса дсадааасса 120 чадааадссс сргааасесссе даєстаєдсс дсаєссааєє Єдсааадедуд ддЕсСссаєса 180 аддеЕєсадсд дсадсддаєс Едддасадає сеЕсасесьса ссаєсассад ссеЕдсадсессяе 240 чадчавєєсєвд саасесвасса ЕсдЕсаасад дссаасадес Есссаєссас ЕсСЕСОдДСсСсСсЮ 300 дададассааад гддагаєсаа а 321 «2105 218 «2115 107 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна

Зо «4005 218

Авр І1е сбіп Месє ТПг біп бек Рго бек бек Уа! бек Аза Бек Уаі Щ1У 1 2 10 15

Авр Акуд Уаї ТіПг І1е ТПпг Сув Агуд Аїа бек біп с1у І1їе ТПг бек Тгр 20 25 30

Тем Аїа Тгр Тук сбіп біп Гпув Ркго сбі1у Ппув Аїа Рго ГУу5 Іецй Гей Іе 35 40 45

Ту Аїа Аїа бек Авп Тец біп бек біу Уаі Ркго Бек Агд Рпе Бех щЩ1У 50 З бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1ї1е ТПг бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аза ТПг Тук Тук Сув біп біп Аза Ап бек Гей Рго РБПе 85 90 95

ТПЕ Рпе с1іу Рго біу ТПг Гув Уаї Авр І1е Гу 100 105 «2105» 219 «2115 18 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 219 садддеаєса ссадсеєдд 18 «2105 220 «2115 6 бо «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність

«223» Штучна «4005 220 біп б1у І1е ТПг бек Тгр 1 5 «2105 221 «2115 9 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 221 чдсеЕдсаєсс З «2105 222 «2115 З «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 222

А1ї1а А1їа 5ег 1 «2105 223 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 223 саасаддсса асадеЕсеєссс асесасе 27 «2105 224 «2115 9 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 224 біп біп Аза Авп бек Гецп Рго Рпе ТПг 1 5 «2105 225 «2115 366 6о0 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність

«223» Штучна «4005 225 чададєдсадс бддЕддадес Едддддаддс ЄЕддсасадс сЕдддддудєс ссеЕдадасес 60

ЕссеЕдедсад ссессуддаєсе сасссеєвадс адсраєдсса ЕдадседддЕ ссддссаддсе 120 ссадддаадуд дасєддадед ддЕСЕСадсе аєсадеЕддса деЕддеЕддсад сасагассас 180 чдсадасеєссд Єдаадддссуд деЕЕсассаєс сссададаса аєєссаадаа сесдссдсає 240 седсааєєда асадссєдад адссдаддас асддссдрає аєсассдедс даадасоастая 300 басасврасса дссддЕасду дддсЕсссад саседдддсес адддсасссе ддЕСсасеЕдеЕс 360

СсСсеса 366 «2105 226 «2115 122 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 226 бі Маї бі1іп Гей Уаі бі Бек сі1у сіу с1у Гей Уаі1і сіп Рго с1і1у с1У 1 2 10 15 зек Геп Акуд Гей бек Сув Аїа Аза бек біу Роре ТПг Гей бек бек Туг 20 25 30

А1їа Меє бек Тер Уаі Агуд біп Аїа Рго б1у Ппув с1іу Гей бій Тер Уаї зек Аїа І1е бек біу бек сіу біу бек ТПг Туг Туг Аїа Авр бек Уаї

Зо 50 З бо

Тпув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе бек Агуд Авр Авп бек Гув Авп бекг Іец Туг 65 70 75 80

Тец біп Гей Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТБг Аїа Уаї Тук Тук Сув 85 90 95 35 А1їа Ппув ТПг Тей Туг ТПг ТпПг бек Тер Туг сбі1у с1у Рпе сіп Нів Тгр 100 105 110 сб1у біп с1у ТПг Гей Уа1 ТПг Уа1і Бек 5ег 115 120 40 «2105 227 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність 45 «2205 «223» Штучна «4005 227 ддаєсеєсассс Егадсадста бдсс 24 «2105 228 «2115 8 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Штучна 60 «4005 228 б1у Рпе ТПг Гей бек бек Туг Аїа

1 2 «2105 229 «2115 24 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 229 аєсадеЕддва дЕддеЕддсад саса 24 «2105» 230 «2115 8 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 230

І1е бек біу бек бі1у б1у Бек ТПг 1 2 «2105 231 «2115» 45 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна

З5 «4005 231 чдсдаадасдс Єдсаєсассас садсєддсас дддддссссс адсас 45 «2105 232 «2115 15 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 232

Аза Ппув ТПг Гец Тук ТПг ТПг бек Тгр Тук с1у с1у Рбе сіп Нів 1 2 10 15 «2105 233 «2115 321 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Штучна 60 «4005» 233 часаєссада Єдасссадес Ессаєсессс дЕдЕСЕдсає сраєаддада сададеЕсасс 60 аєсасеЕєдЕСсС доадсдадеЕса додадааєсадс адсеЕдудєсад ссеЕддбаєса дсадааасса 120 чадааадесс сеЕаадссссе даєставдсес дсдЕссеєсеЕЕеЕ єдсааадедуд дЕЕсСссаєса 180 аддеЕєсадсд дсадсддаєс Едддасадає сЕсасессса ссаєсаднад ссеЕдсадсессс 240 чаачаєєсєвд саасесвтасса єЕєдЕСаасад асеєсасадьсє єсссуєсодддас дудаєссоаддссаа 300 дадассаадуд Єддаааєссаа а 321 «2105 234 «2115 107 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 234

Авр І1е сбіп Месє ТПг біп бек Рго бек бек Уаі бек Аїа Бех ІШе 0Щ1У 1 2 10 15

Авр Акуд Уаї ТіПг І1е ТПпг Сув Агуд Азїа бек біп с1іу Іїе Бек бек Тгр 20 Тем Аїа Тгр Тук сбіп біп Ппув Рко сбіу Ппув Маї Ркго ГУув Іецй ІГецй Іе

Туг Аїа Аїа бек бек ІТец біп бек біу Роре Рго бек Агд Рпе Бех 0Щ1У

З бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1ї1е бек Бек Гей сбіп Рго 25 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аза ТПг Тук Тук Сув біп біп ТПкг Нів бек РоПе Рго Тгр 85 90 95

ТпПг Уа1 с1іу сбіп сбіу ТПг Гуз Уаї сіц І11е Гув 100 105

Зо «2105 235 «2115 18 «2125 ДНК 35 «213» Штучна послідовність «2205 «223» Штучна 40 «4005 235 садддааєса дсадеЕєс9дд 18 «2105 236 «2115 6 45 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна 50 «4005 236 біп б1у І1е бек бек Тгр 1 2 «2105 237 «2115 9 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність 60 «2205

«223» Штучна «4005 237 чдсЕдсдЕсес З «2105 238 «2115 З «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 238

А1а Аїа 5ег 1 «2105» 239 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 239 саасадасесс асадеЕсСЕссс деЕ9Ч 24

Зо «2105» 240 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005» 240 біп біп ТПпг Нів Бек Рпе Рго Тгр 1 2 «2105 241 «2115 366 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 241 чададєдсадс бддЕддадес Едддддаддс ЕсдддЕасадс сЕдддддадЕС сседадасес 60

ЕссеЕдедсад ссессуддаєсе сасссеєваддуд адсвтаєсеєса ЕдасседддЕ ссудссаддеЕє 120 ссадддаадуд дассддадодд ддЕСЕСадсЕеЕ аєсєтадеддса Есадедудєдда сасаєбастас 180 асадассссуд Егаадддссуд деЕсассаєс Ессададаса агрессаадаа сасудссдеЕєс 240 сЕдсаааєда асадссеєдад адссдаддас асдддссдбає асєсссудєддс дадаасоадед 300 басадеадна деЕсасвасоду дддсЕсссад саседдддсес адддсасссе ддЕСсассдаєс 360

СсСсеса 366 60 «2105 242 «2115 122

«212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 242 бі Маї бі1іп Гей Уаі бі Бек сі1у сіу с1у Гей Уаі1і сіп Рго с1і1у с1У 1 5 10 15 зек Геп Акуд Гей бек Сув Аїа Аза бек біу Роре ТПг Гей Агуд бек Туг 20 25 30

Рпе Меє ТПг Тер Уаі Агкуд біп Уаії Ркго сб1у Ппув с1у гейш біц с1іу Уаї 35 40 45 зек Аїа І1е бек б1і1у І1е бек біу б1і1у ТПг Тук Тук ТПг Авр бек Уаї 50 55 бо пув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе бек Агуд Авр Авп бек Пув Авп о ТПг Іецй РБПе 65 70 75 80

Тец біп Меє Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТПг Аїа Уаї Тук РПе Сув 85 90 95

А1а Агуд ТПг о Уа1! Туг бек бек бек Туг Тук біу с1у Рпе сіп Нів Тгр 100 105 110 сб1у біп с1у ТПг Гей Уа1 ТПг Уа1і Бек 5ег 115 120 «2105» 243 «2115 24 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність

Зо «2205 «223» Штучна «4005 243 ддаєсєсассс Егаддадсса ЕСЕС 24 «2105» 244 «2115 8 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005» 244 б1у Рпе ТПг Гей Агуд бек Тук РПе 1 5 «2105» 245 «2115 24 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005» 245 аєсадеддса ЄгадсоддеЕдуа саса 24 60 «210» 246

«2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 246

І1е бек сб1і1у І1е бек б1у с1у Тс 1 2 «2105 247 «2115» 45 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 247 чдсдадаасдд Єдеагадсад гадеЕсассас доаддддссссс адсас 45 «2105» 248 «2115 15 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 248

Аза Акуд Тс Уаї Тук бек бек бек Туг Тук б1у б1у Рпе сіп Нів 1 2 10 15 «2105» 249 «2115 321 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005» 249 часаєссада Єдасссадес Ессаєсессс дЕДдЕСЕдває седгаддада сададеЕсасс 60 аєсасеЕєдЕСсС доадсдадеЕса доадсаєвадс адсеЕдудєсад ссеЕддбаєса дсадааасса 120 чадааадссс сеЕаадсеєссе даєстаєдеЕс дсаєссадьс сасааадсудд ддссссаєса 180 аддеЕєсадсд дсадсддаєс Едддасадає сЕсасесеса ссаєсадсад ссеЕдсадсессяе 240 даадаєссєєд саасеєсасса ЄсдЕсаасад асраасадееє ссссеЕсСссас ЕЕсСсодсода 300 чадассаадд Єддадаєсаа а 321 «2105 250 «2115 107 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна бо «4005 250

Авр І1е сбіп Месє ТПг біп бек Рго бек бек Уаі! бек Уаі Бек Уаі1 С01У 1 5 10 15

Авр Акуд Уаї ТіПг І1е ТПг Сув Агуд Азїа бек біп с1у Іїе Бек бБег Тгр 20 25 30

Тем Аїа Тгр Тук сбіп біп Гпув Ркго сбі1у Ппув Аїа Рго ГУу5 Іецй Гей Іе 35 40 45

Тук Уаі1 Аїа бек бек ІТец біп бек біу Уаі Ркго бек Агд Рпе бег 01Уу 50 55 бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1ї1е бек Бек Гей сбіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аза ТПг Туг Тук Сув біп біп ТПг Авп бек РПе Рго Іецй 85 90 95

ТПЕ Рпе сіу сіу біу ТПгЕ Гув Уаї сіц І11е Гув 100 105 «2105 251 «2115 18 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 251 саддадеаєса дсадеЕс9дд 18 «2105 252 «2115 6

Зо «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна

З5 «4005 252 біп б1у І1е бек бек Тгр 1 5 «2105 253 «2115 9 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 253 дЕєдсаєсс З «2105 254 «2115 З «212» БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Штучна 60 «4005 254

Уаї А1т1а 5ег

«2105 255 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 255 саасадасса асадеЕєеєссс ЕСЕСасе 27 «2105 256 «2115 9 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 256 сбіп біп ТЕ Авп о бек Рібе Рго Іей ТЕПг 1 2 «2105 257 «2115 366 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 257 чададєдсадс бддЕддадес Едддддаддс ЄЕддсасадс сЕдддддудєс ссеЕдадасес 60

ЕссеЕдедсад ссессуддаєсеє сассссвадуда адесаєдеса ЄдсаседуддЕ ссдссадоадеЕ 120 ссадддаадуд дассддадодд ддЕСЕСадудЕ аєтадеддса чеадедудєдда сасаєбастас 180 асадассссуд Едаадддссуд деЕЕсассаєс Ессададаса агрессаадаа сасудссдеЕєс 240 сЕдсаааєда асадссеєдад адссдаддас асдддссдбає асєсссудєдас, дадаєсодадед 300 баєадврасса сссддеасду дддсЕсссад саседдддсесс адддсасссє дудєссассуєс 360

СсСсеса 366 «2105 258 «2115 122 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 258 бі Маї бі1іп Гей Уаі бі Бек сі1у сіу с1у Гей Уаі1і сіп Рго с1і1у с1У 1 2 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув Аї1а Аїа бек бі1у Рпе ТПг Гей Агуд Бек Туг 20 25 30

Уаї Меє Тук Тер Уаі Акд біп сіу Ркго сіу Ппув б1у ІТецп бій сі1у Уаї 35 40 45 бо зек с1у І1е бек с1і1у бек бек сіу с1у ТПг Тук Тук ТПг Авр бек Уаї 50 З бо

Тпув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе Бек Агуд Авр Авп бек ГПув Авп о ТПг Гей РІПе 65 70 75 80

Тец біп Меє Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТПг Аїа Уаї Тук РПе Сув 85 90 95

А1а Агуд бек Уа1 Туг бек ТПг ТПг Тер Туг сбіу с1у Рпе сіп Нів Тер 100 105 110 сб1у біп с1у ТПг Гей Уа1 ТПг Уа1і Бек 5ег 115 120 «2105 259 «2115 24 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 259 ддаєсєсассс ЕгаддадеЕса ДЕС 24 «2105 260 «2115 8 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна

Зо «4005» 260 б1у Рпе ТПг Гей Агуд бек Тук Уаї 1 5

З5 «2105 261 «2115 24 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 261 аєсадеЕддса деадсддеЕдуа саса 24 «2105 262 «2115 8 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 262

І1їе бек с1і1у бек бек о1у с1у ТПг 1 5 «2105 263 бо «2115 45 «2125» ДНК

«2135 Штучна послідовність «223» Штучна «4005» 263 чсчдачаєсдд Єдсаєсадсас сассеєддсас дддддссссс адсас 45 «2105» 264 «2115 15 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 264

Аза Акуд бек Уаї Тук бек ТП ТПг Тер Тук б1у б1у Рпе сіп Нів 1 2 10 15 «2105» 265 «2115 321 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна

Зо «4005 265 часаєссада Єдасссадес Ессаєсессс дЕДЕСсЧдсає сеЕдедддада сададесасс 60 аєсасеЕєдЕСсС доадсдадеЕса дадєсаєвадс адсеЕдудєтад ссеЕддбаєса дсеЕдааасса 120 чадааадссс сргааасесссе даєстаєдсесс дсаєссадее басааадедуд ддЕсСссаєса 180 аддеЕєсадсд дсадсддаєс Едддасадає сЕсасесеса ссаєсадсдд ссеЕдсадсесся 240 чдаадаєссєвєуд садееєсасса ЕсудЕсаасад асгаасадееє ссссеЕсСссас ЕЕсСсодсода 300 чадассаадд Єддадаєсаа а 321 «2105» 266 «2115 107 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 266

Авр І1е сбіп Месє ТПг біп бек Рго бек бек Уа1і Бек Уа1 бек Уаі 1У 1 2 10 15

Авр Акуд Уаї ТіПг І1е ТПпг Сув Агуд Азїа бек біп Уаі Іїе Бек бек Тгр 20 25 30

Тец Азїа Тер Тук сбіп Гей Ппув Рго с1іу Ппув Аза Рго Гув Іеп Гей Ше 35 40 45

Туг Аїа Аїа бек бБекг ІТец біп бек біу Уаі Ркго Бек Агд Рпе Бех щЩ1У 50 З бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Гей ТПг І1їе бек с1у Іецйц сіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аїа Уа1і Тук Тук Сув біп біп ТПг Авп бек Ріе Рго Іей 85 90 95

ТПЕ Рпе сіу сіу біу ТП Гув Уаї бій І1е Гув 60 100 105

«2105 267 «2115 18 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 267 саддеЕваєса дсадеЕс9дд 18 «2105» 268 «2115 6 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005» 268 біп Уаї І1е бек бек Тгр 1 5 «2105» 269 «2115 9 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005» 269 дсЕдсаєсс З «2105 270 «2115 З «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 270

Аза Аїа 5ег 1 «2105 271 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 271 саасадасса асадеЕєеєссс ЕСЕСасе 27 бо «2105 272

«2115 9 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 272 сбіп біп ТЕ Авп о бек Рібе Рго Іей ТЕПг 1 2 «2105 273 «2115 366 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 273 чададєЕдсадс сддЕддадес Едддддааас сЕддаасадс сЕдддддудєс ссеЕсадасес 60

Есседрасад ссессуддасе сассеЕсвадс адаєстєдсса ЕдааседддЕ ссдссдуддсеЕ 120 ссадддаадуд дассддадед ддЕСЕСадда аєтадеддеа деЕддЕдЧдєсд аасаєбастас 180 дсадассссуд Едаадддссуд деЕсассаєс сссададаса аєсссаадаа басудстасає 240 сЕдсаааєда асадссеєдад сдссдаддас асдддссдсає асгассдсдс дааадаєєссу 300 басасврасса дЕсддЕасоуд аддбсаєддас дЕСЕддддсес асдддассас ддЕСассдЯєс 360

СсСсеса 366

Зо «2105 274 «2115 122 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 274 бі Маї бі1іп Гей Уаі бі Бек с1у с1у Авп Гей бій сбіп Рго сі1у с1У 1 2 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув ТПг Аза бек біу Рпе ТПг Рібе бег Агд 5ег 20 25 30

Аза Меє Авп Тгр Уаі Агуд Агуд Аза Рго б1у Ппув с1у Гей бій Тер Уаї 35 40 45

Ззек с1у І1е бек с1і1у бек сіу б1у Ак9д ТПг Тук Туг Аза Авр бек Уаї

З бо

Тпув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе бек Агуд Авр Авп бек ГПув Ап о ТПг Іец Туг 65 70 75 80

Тец біп Меє Авп бек Гей бек Аза бій Авр ТПг Аза Аза Тук Тук Сув 50 85 90 95

Аза пув Авр бек Тук ТПг ТПг обег Тгр Тук б1у с1у Меє Авр Уа1ї Тгр 100 105 110 сбі1у Нів с1у ТПг ТпПг Уа1 ТПг Уаі1і Бек бБег 115 120 «2105 275 «2115 24 «2125 ДНК 6о0 «213» Штучна послідовність

«223» Штучна «4005 275 чдчаєєсассеє Єгадсадаєс гєдсс 24 «2105 276 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 276 б1у Рпе ТПг Рпе бБег Агуд бек Аїа 1 5 «2105 277 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 277 аєсадеЕддва дЕддеЕддЕс ааса 24 «2105 278 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 278

І1їе бек с1у бек б1у сб1у Агд ТПг 1 5 «2105 279 «2115 45 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 279 чдсдааачаєє содбаєсасвсас садесодсас ддаддабаєдда асдеЕс 45 «2105» 280 «2115 15 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність 60 «2205 «223» Штучна

«4005 280

Аза пув Авр бектк Тук ТПг ТПг бек Тер Тук бі1у б1у Меє Авр Уаї 1 2 10 15 «2105 281 «2115 321 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 281 часаєссада Єдасссадес Ессаєсессс дЕдЕСЕдсає сеЕдгаддада сададесасс 60 аєсасеЕєдЕСсС доадсдадеЕса доадсаєвєсес адседудєсад ссеЕддбаєса дсадааасса 120 чддааааадссс сеЕаадссссе даєстаєдсес дсесессадее басааадедуд ддЕсСссаєса 180 ачаєєсадсд дсадсддаєс Едддасадає сЕсасесеса ссаєсадсад ссеЕдсадсессяе 240 чаччдаєссєсєд сааєеєсасса ЄсдЕсаасад дсраасадсд Ссссдаєсас сЕсСсоддссаа 300 чодадасасдас Єддадаєстаа а 321 «2105 282 «2115 107 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна

Зо «4005 282

Авр І1е сбіп Месє ТПг біп бек Рго бек бек Уа! бек Аза Бек Уаі Щ1У 1 2 10 15

Авр Акуд Уаї ТПг І1е ТПг Сув Агуд Аза Бек біп сіу І1е Рібе бег Тгр

З5 20 25 30

Тец Азїа Тер Ту біп біп пув Рго с1іу Ппув Аїа Рго пуб Гей Іецй І1е

Туг Аїа Аїа бек бБег ІТец біп бек сіу Уаі Ркго Бек Агд Рпе Бех щЩ1У

З бо 40 Ззек сіу бек біу ТПгЕ Авр Рпе ТПг Гей ТіПг І1е бек бек Гечп біп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аза Іїе Тук Тук Сув біп біп Аза Ап бек Уаї Рго І1е 85 90 95

ТПЕ Рпе сіу сіп біу ТПг Агд Гец сіц І11е Гув 45 100 105 «2105 283 «2115 18 50 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 283 саддднавсеЕ Есадсеєд9 18 «2105» 284 60 «2115 6 «2125 БІЛОК

«2135 Штучна послідовність «223» Штучна «4005» 284 біп б1у І1е Рпе 5ег Тгр 1 5 «2105» 285 «2115 9 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 285 дсЕдсЕсесс З «2105 286 «2115 З «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 286

Аза Аїа 5ег 1 «2105 287 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 287 саасаддсса асадеЕдессс даєсасс 27 «2105» 288 «2115 9 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005» 288 біп біп Аза Авзп бек Уаі Рго І1е ТПг 1 5 «2105» 289 бо «2115 366 «2125 ДНК

«2135 Штучна послідовність «223» Штучна «4005» 289 чададєдсадс бддЕддадес Едддддаддс ЄЕддсасадс сЕдддддудєс ссеЕдадасес 60

ЕссеЕдеЕеєсад ссессуддаєсє сассеЕеєсадс адссаєсдсса Єдаассддудє ссдссаддсеЕ 120 ссадддаадуд дассддадед ддЕСсассусеЕ аєтадеддса чЕддЕдуЧєдоа сасаєастас 180 дсадассссуд Едаадддссуд деЕсассаєс Ессададаса агрессаадаа сЕСдссдЕЄЄ 240 сЕдсааєєда асадссеєдад адссдаддас асуддссудєдЕ аєвассдсдс дааасааасу 300 басассадса дсеєддЕасодуд ЕддсЕсЕедає аєсеЕддддсес аддддасаає ддеЕСсассдєс 360

ЄсСЕсса 366 «2105 290 «2115 122 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 290 бі Маї біп Ге Уаі сій бек сіу сбіу б1у ІТецпй Уаі сіп Рго б1у щу 1 2 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув Бек Аза бек біу Рпе ТПг Рпе бек бек Туг 20 25 30

Аза Меє Авп Тер Уаі Агуд біп Аза Рго с1іу Ппув сіу Гец біц Тгр Уаї

Зо ТПг Аза І1їе бек сіу бек сбіу сб1у с1у ТПг Тук Туг А1їа Авр бек Уаї1ї

З бо

Тпув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе Бек Агуд Авр Авп бек Гув АБп бек Гечип РІПе 65 70 75 80

Тец біп Гей Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТБг Аїа Уаї Тук Тук Сув

З5 85 90 95

Аза пув біп ТПг Тук ТПг бек бек Тгр Тук сіу с1іу Робе Авр І1е Тгр 100 105 110 сб1у бі1іп с1у ТПг Меє Уа1 ТПг Уаі1і Бек 5ег 115 120 40 «2105 291 «2115 24 «2125 ДНК 45 «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна 50 «4005 291 ччаєеєсассе Єгадсадсса гєдсс 24 «2105 292 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна 60 «4005 292 б1у Рпе ТПг Рпе бБег бБег Туг Аїа 1 5 «2105 293 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 293 аєсадеЕддса дЕддеЕддеЕду саса 24 «2105» 294 «2115 8 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 294

І1їе бек с1у бек сб1у с1у с1у ТЕГ 1 5 «2105» 295

Зо «2115 45 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 295 дсдааасааа сдбаєсассад садсєддсас доасддсеЕссд агаєсс 45 «2105 296 «2115 15 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 296

Аза пув біп ТПг Тук ТПг бек бек Тер Тук б1у б1у Рпе АБр Ше 1 З 10 15 «2105 297 «2115 321 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна бо «4005 297 часаєссада Єдасссадесс дссаєсессс дЕдЕССдсудЄ сЕдЕаддада сададеЕсасс 60 аєсасеЕєдЕСсС доадсдадеЕса дадЕЕсвадеі сссеЕдудєвад сседдбаєса дсадасасса 120 чадааадссс ссаадсєссеЕ даєстаєдсс дсаєсааддеЕ Єдсааадедуд ддЕсСссаєсс 180 аддеЕєссдсд дсадесддаєс Едддасадає сеЕсасессса ссаєсадсад сссдсадссе 240 чаччдаєссєсєд саасеєсасса ЄсдЕсаасад дсраасадее ссссдсссас ЕЕсСсодсода 300 чадассаадд Єддадаєсаа а 321 «2105 298 «2115 107 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 298

Авр І1е сбіп Месє ТПг біп бек Рго бек бек Уа! бек Аза Бек Уаі Щ1У 1 2 10 15

Авр Акуд Уаї ТіПг І1е ТПпг Сув Агуд Азїа бек біп с1іу РПе Бек бек Тгр 20 25 30

Тец Азїа Тер Ту біп біп І1їе Рго сіу Ппув Аза Рго пуб Гей Іецй І1е 35 40 45

Ту Аїа Аза бек Агд їец біп бек біу Уаі Рго бек Агд Рпе Агд Щ1У 50 З бо

Ззек сіу бек біу ТПгЕ Авр Рпе ТПг Гей ТіПг І1е бек бек Гечп біп Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аза ТПг Туг Тук Сув біп біп Аза Авп бек Ріе Рго Іей 85 90 95

ТПЕ Рпе сіу сіу біу ТПгЕ Гув Уаї сіц І11е Гув

Зо 100 105 «2105» 299 «2115 18 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 299 садзддЕєЄЕса деЕссвдо 18 «2105 300 «2115 6 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 300 біп б1у Рпе бек бек Тгр 1 2 «2105 301 «2115 9 «2125 ДНК 6о0 «213» Штучна послідовність

«223» Штучна «4005 301 дсЕдсаєса З «2105 302 «2115 З «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 302

Аза Аїа 5ег 1 «2105 303 «2115 27 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 303 саасаддсса асадеЕєеєссс дсеЕсась 27

Зо «2105 304 «2115 9 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність

З5 «2205 «223» Штучна «4005 304 40 біп бі1іп Аза Авп бек Рпе Рго Іец ТПг 1 5 «2105 305 45 «2115» 167 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 50 «223» Штучна «4005 305 зек Іїе ТПг сі1іу І1е бек Рго І1е ТПг бій бек Гей Аза бБег Гей б5ег 1 5 10 15 55 ТПЕ Тук Авп Авр біп бБег Іїе ТПг Рбе Аїа Гей бій АБр бій бек Туг 20 25 30 сбіш І1е Тук Уаі бій Авр Гей Ппув Пув Авр о Ппув пуб пуб Авр о Тув Уаї

Тецп Гей бек Туг Тук бі Бек сбіп Нів Рго бек бек біц бек б1у Авр бо 50 55 6о сбі1у Маї Авр сіу Ппув Меє Гей Меє Уа1! ТПг Гей бек Рго ТПг Тув Авр

65 70 75 80

Рпе Тер Гец біп Аз1а Авп Авп Гуз бі Нів бек Уаі сій Гей Нів Гув 85 90 95

Сув б1п Гпув Рго Гей Рго Авр сіп Аза Рпе Рпе Уа1і Гей Нібв Авп Агд 100 105 110 зек Рпе Авп Сув Уаі! бек Рпе біц Суб Гув ТПг Авр Рго сіу Уа1 Ре 115 120 125

ІІе сі1у Уаї пуб Авр АвБп о Нів Іец Аза Іїецй І1е Ппув Уаі Авр Тук 5ег 130 135 140 сій Авп о Гец сіу бек бій Авп І1їе Гей Рбе Ппув5 Гей бек бій І1е Гец 145 150 155 160 сій Нів Нів Нів Нів Нів Нів 165 «2105 306 «2115» 167 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 306 зек Іїе ТПг сбі1іу І1е бек Рго І1їе ТПг бій бек Ге Аїа бек Гей 5ег 1 2 10 15

ТПЕ Тук Авп Авр біп бег І1е ТПг Рбе Аїа їец біц Авр бій бек Туг 20 25 30 сбіш І1е Тук Уаі бій Авр Гей Ппув Пув Авр о Тув пуб Гув Авр о Гув Уаї

Зо 35 40 45

Тецп Гей бек Туг Тук бі Бек сбіп Нів Рго бек бек біц бек б1у Авр 50 З бо сбі1у Маї Авр сіу Ппув Меє Ггецй Меє Уаі! ТБПг Іец бек Рго ТПг Гпув Авр 65 70 75 80

Рпе Тер Гей біп Аза Авп Авзп о пув бій Нів бек Уаії сій Гей Нів Гуз 85 90 95

Сув б1іп Гпув Рго Гей Рго Авр сбіп Аїа Рібе Рібе Уаії Іецйц Нів Авп Аг4д 100 105 110 зек Рпе Авп Сув Уаі! бек Рпе біц Суб Гув ТПг Авр Рго сіу Уа1 Ре 115 120 125

ІІе сі1у Уаї пуб Авр АБп о Нів їец Аїа Гей Іїе пув Уаї Авр Туг 5ег 130 135 140 біц АвБп о Гей сіу Бек бій Авп Іїе Гей Рпе Ппув Гей бек біц І1е Іей 145 150 155 160 сій Нів Нів Нів Нів Нів Нів 165 «2105 307 «2115 354 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 307 саддеЕсассеЕ Едааддадес єддЕсссдсд сеЕддЕдааас ссасададад ссеЕсасодстдд 60 ассЕдсессд Єсесссуддаєсеє сеєсасссадс ааєдеЕсадаа Єоддуєдеєдад сеЕддаєссдЯяє 120 бо садеЕссссад ддааддсссї ддадеддсьЕ дсасасавєеєс єсссдааєда сдаааааєсс 180 басассасає сеЕСсЕдаадас саддсесасс аєсеЕссаадуд асассеєссад аадссаддед 240 дЕссЕвбасса Єдассудасає ддасссрддд дасасадсса сагаєвтассд Едсасддатба 300 сддаасссдд ссеЕссааєсса ссддддсессад ддаассстдда Ссассдсссс ссса 354 «2105 308 «211» 118 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 308 біп Маї ТПпг Гей Ппув бі бек с1іу Рго Уаі Ггецй Уа1! Ппув Рго ТПг с1ц 1 2 10 15 зек Гпеп ТПг Гей ТПг Сув бек Уа1! бек біу Рре бек Гей бек Авп Уаї

Акуд Меє сіу Уаї бек Тгр І1е Акд біп бек Рго сіу Ппув Аїа Гей сіц

ТЕр геш Аїа Нів І1їе Рібе бБег АвБп Авр біц пуб бек Тукг ТПг ТпПг 5ег 20 50 З бо

Тецшп Гув ТПг Агуд Гей ТпПг Іїе бек Гув Авр ТПг бБег Агд бек біп Уаї 65 70 75 80

Уаї Гей ТпПг Меє ТПг Авр Меєс Авр Рго сіу Авр ТПг Аза ТПг Туг Туг 85 90 95 25 Сув Аїа Агуд Іїе Агд Авп тей Аїа Рібе АБп Туг Тер с1у біп с1у Тіг 100 105 110 їеч Ма! ТПг Уаї бек 5ег 115

Зо «2105 309 «2115 30 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність

З5 «2205 «223» Штучна «4005 309 40 ддасєсссас Есадеааєдс бадааєдачЧеі 30 «2105 310 «211» 10 «212» БІЛОК 45 «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 310 б1у Рпе бек Гей Бек Авп Уаі Агуд Меє СЩ1У 1 2 10 «2105 311 «2115 21 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «2205 «223» Штучна

«4005 311 аг єсда аєдасддаааа а 21 «2105 312 «2115 7 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 312

І1е Робе бБег АвБп Авр б1ц Гу 1 2 «2105» 313 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 313 дсасддаєас ддаасеЕсуддс сЕсЕааєсас 30 «2105» 314

Зо «2115 10 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 314

Аза Акуд ч1І1е Агд АБп Тец Азїа Рібе Авп Туг 1 2 10 «2105» 315 «2115» 339 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Штучна «4005 315 часеЕєсудєда Єдасссадес Ессадасссс сеЕддсЕдЕдЕ сЕСЕдДуддсда дадддссасс 60 аєсаасєдса адсссадсса дадедЕдеЕва сасадудсєсса дсааєсаадаа ссасеЕсадсе 120 бддбаєсадс адаадссадуд асадссессє аассеЕдсєса Есгасесдддес аєстасссод 180 чааєссдддад Есссєдассу асеєсадеддс адсуддудєссд ддасадаврсе сасссссасс 240 аєсадсадсс гдсаддсєда адаєдесддадса деЕЕсаєстасе деЕсадсааса Егаєоодсасе 300 сраєєвасее єсуддсссвдуд дассааадсуд даєаєсааа 339 «2105 316 «2115 113 бо «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність

«223» Штучна «4005» 316

Авр Рпе Уаї Меєсє ТіПг біп бек Рго Авр бек Те Аї1а Уаі бек їеш Ш0Щ1У 1 2 10 15 бі Агуд Аза ТПг о І1їе А5п о Сув Ппув бБег Бек біп бек Уаії Іецп Нів Аг4д 20 25 30 зек Бек Авп Гув АБп о Туг Гей Аїа Тер Туг біп сбіп пув Рго с1і1у сіп 35 40 45

Ркго Рго АвБп Тец ІТец І1е Туг Тгр А1їа бек ТПг Агуд біц бек сбі1у Уаї 50 З бо

Рго Авр Агуд Робе бек біу бек біу бек бі1у ТПг Авр Рпе ТПг Гей ТЕГ 65 70 75 80

І1е бек бек ІТец біп Аї1а бій Авр Уаі Аза Уаї Тук Тук Сув біп сіп 85 90 95

Тук Тук с1іу ТБПкг Гец Робе ТПг Рбе сіу Рго біу ТПг Гув Уаі АвБр Ше 100 105 110

Тув «2105» 317 «2115 36 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 317 сачдзадсдсдс Сасасаддсс садсаасаад аастас 36

З5 «2105» 318 «2115 12 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 318 біп бек Уаії Гей Нів Агуд бек Бек Авп Гув Авп о Туг 1 2 10 «2105 319 «2115 9 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 319

Єдаддсаєсе З «2105 320 бо «2115 З «212» БІЛОК

«2135 Штучна послідовність «223» Штучна «4005 320

ТЕр Аїа 5ег 1 «2105 321 «2115 27 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна «4005 321 садсаасасе аєддсасесе ассасе 27 «2105 322 «2115 9 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Штучна

Зо «4005 322 біп бі1іп Тук Тук с1у ТпПг Гей Рпе ТПг 1 5

З5 «2105 323 «2115 537 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність 40 «2205 «223» пП5тТ2-пЕС «4005 323

Тпув Рпе бек Ппув біп Бек Тер сіу Гец біц АвБп біц Аза їеп Іїе Уаї1ї 45 1 2 10 15

Акуд Сув Рго Агд біп б1у Гпув Ркго бек Тук ТПг Уаі Авр Тер Тук Тукг 20 25 30 зек біп ТБПг АвБп оГув бек І1е Рго ТПг біп бій Агуд Авп Агуд Уа1ї РБе

А1а бек с1у біп Гецшп Гешп Ппув Рпе Гей Рго Аїа А1ї1а Уаії Аїа Авр 5ег 50 55 бо сб1у І1е Тук ТПг Сув Іїе Уаі1і Акуд бек Рго ТПг Рпе Авп Агд ТПг с1Уу 65 70 75 80

Тук Аїа Авп Уа! ТПг І1е Тук пув Мпув біп бек Авр Сув Авп Уа1ї Рго 85 90 95

Авр Тук Гей Меєсє Туг бек ТПг Уаї бек біу бек біп Ппув Авп бек Гув 100 105 110

ІТІе Тук Сув Рго ТПг І1е Авр їецйц Туг АБп Тгр ТПг АїТа Рго Гей сіц 115 120 125 бо Тер Рпе Ппув Авп Сув біп Аза Гей біп сіу бек Агуд Туг Агд Аїа Нів 130 135 140

Тпув бек Рпе Гей Уаі Іїе Авр Авп Уаі Меє ТПг сій Авр Аза Сс1у Авр 145 150 155 160

Тук ТпПкЕ Сув Ппув Рбе І1е Ні АвБп о біц Авп біу Аза АвБп Тук бек Уаї 165 170 175

ТПгЕ Аза ТПг Акуд бек Рпе ТПг оУаії Ппув Авр бій біп сб1у Роре бек Іец 180 185 190

Рпе Рго Уаі І1ї1е сб1у Аза Рго Аза біп АБп о біп Іїе пув бі Уа1 сіц 195 200 205

ІІе с1у Ппув Авп Аза АБп Гей ТПг Сув бек Аї1а Сув Рпе с1у пув Щ1У 210 215 220

ТпПг біп Рбе Гец Аїа Аза Уаії Гей Тер біп Тец АвБп о бі1іу ТПг Ппув Ше 225 230 235 240

ТПЕ Авр Рпе сіу біц Рго Агд Іїе сіп біп біц біц б1у б1п АБп сіп 245 250 255 зек Рпе бек Авп о сб1у Гецп Аїа Сув Гей Авр Мес Уаії Гей Агуд Іїе А1а 260 265 270

Авр Уаі1 пув біц біцш Авр Гей Гец Іец біп Тугк Авр Сув Гей Аїа Гей 275 280 285

Авп о Гей Нів сіу Іец Агуд Агкуд Нів ТПг о Уаії Агд Гей бек Агуд Пув Авп 290 295 300

Рго Іїе Авр Нів Нів бек Авр Гув ТПг Нів ТПг о Сув Рго Рго Сув Рго 305 310 315 320

Аза Ркго бій Гец Гец біу б1і1у Рго бек Уаі! РпПе Гей Рпе Рго Рго Гув 325 330 335

Рго Ппув Авр ТПг Гей Меє І1їе бек Акуд ТПг Рго біц Уа1і ТПг Сув Уаї 340 345 350

Уаї Уаї Авр Уа1 Бек Нів біц Авр Рго сіц Уаї пуб Ропе АБвБп Тгр Туг 355 3З6о 365

Уаї Авр сі1у Уа1і сій Уа1ї Нібв Авп Аза пуб ТПг пуб Рго Агд сбіц сі

Зо 370 375 380 біп Тук Авп о бБег ТПг Туг Агуд Уаі Уа1і Бек Уа1! Ггецй ТБПг Уаї Іец Нів 385 390 395 400 біп Авр Тер Гей Авп сб1іу пув бій Тук Ппув Сув Пув Уаї Бек Авп Гув 405 410 415

А1їа Гей Рго Аїа Рго Іїе сій Ппув ТПг І1їе бек Ппув Аїа пув с1у сіп 420 425 430

Рго Агд біц Рго біп Маї Тук ТБПг Іец Рго Рго Бек Агуд Авр сіц Гей 435 440 445

ТПЕ Ппув Авп обіп Уаї бек ІТец ТПг Сув Пец Уаії пув б1у Рпе Туг Рго 450 455 460 зек Авр І1е Аїа Уаі бій Тер біц бек АБп б1у біп Рго бій Авп Авп 465 470 475 480

Тук Ппув ТПг Тбг Рго Рго Уаії Гей Авр бег Авр біу бек Рпе РПе Гей 485 490 495

Тук Бек Ппув Гесй ТПг Уаії Авр Гпув бек Агд Ткгр біп сбіп с1у Авп Уаї1! 500 505 510

Рпе бек Сув бек Уаії Меє Нів біц Аза Іїецй Нів АвБп Нів Тук ТПкг сіп 515 520 525

Тпув бек Гей бек Гей бек Рго с1УуУу Гув 530 535 «2105 324 «2115 543 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» пП5тТ2-юЕс 60 «4005 324

Тпув Рпе бек Ппув біп Бек Тер с1іу Гей бійш Авп сій Аїа їец І1е Уаї 1 5 10 15

Акуд Сув Рго Агд біп б1у Гпув Ркго бек Тук ТПг Уаі Авр Тер Тук Тукг 20 25 30 зек біп ТБг Авп оПпув бек І1їе Рго ТПг біп бій Агуд Авп Акуд Уа1ї! РБбе 35 40 45

Аза бек сіу біп ІТецшц ІТец Гув Рбе Іецш Рго Аї1а Аїа Уаі Аїа Авр 5ег 50 55 бо сб1у І1е Тук ТПг Сув Іїе Уаі Акуд Бек Рго ТПг Рпе Авп Агд ТПг с1Уу 65 70 75 80

Тук Аїа Авп Уа! ТПг І1е Тук пув Мпув біп бек Авр Сув Авп Уа1ї Рго 85 90 95

Авр Тук Гей Меєсє Туг бек ТПг Уаї бек біу бек біп Ппув Авп бек Гув 100 105 110

Іїе Тук Сув Рго ТПг Іїе Ар Гей Туг Авп Тгр ТПг Аїа Рго Іеч с1ци 115 120 125

ТЕр Рпе пув Авп Сув біп Аїа Гей сбіп сіу бек Агуд Туг Агд Азїа Нів 130 135 140

Тпув бек Рпе Гей Уаі Іїе Авр Авп Уаі Меє ТПг сій Авр Аза Сс1у Авр 145 150 155 160

Тук ТпПкЕ Сув Ппув Ропе І1е Ні Авп біц Авп біу Аза АвБп Тук бек Уаї 165 170 175

ТПгЕ АТа ТПг Агуд бек Робе ТПг Уа1! пув Авр біц біп б1у Рпе бек Іецй 180 185 190

Рпе Рго Уаі! Іїе сб1у Аза Рго Аїа сіп АвБп о біц І1е Ппув сі Уа1ї с1іц 195 200 205

ІІе с1у Мпув Авп Аза АвБп о Тецп ТПг Сув бек Аї1а Сув Рпе с1у гув 0Щ1У 210 215 220

ТпПг біп Рбе Гец Аїа Аза Уаії Гей Тер біп Тец АвБп о бі1іу ТПг Ппув Ше

Зо 225 230 235 240

ТПЕ Авр Рпе сіу біц Рго Агд І1е сбіп біп бі бій с1у біп Авп біп 245 250 255 зек РПе бБекг Авп біу Іїейп Аїа Суб Іецй Авр Меє Уаі Гей Агуд Ії1е Аї1а 260 265 270

Авр Уаї пув бій біцш Авр Гей Гецп Гей сбіп Туг Авр Сув Гей Аїа Гей 275 280 285

Авп о Гей Нів сіу Іец Агуд Акуд Нів ТПг о Уаії Агд Гей бек Агуд Пув Авп 290 295 300

Рго І1їе Авр Нів Нів бек бій Рго Агуд біу Рго ТПг Іїе Ппув Рго Сув 305 310 315 320

Ркго Рго Сув їув Сув Рго Аза Рго АБп їецп Гей сіу с1іу Рго бек Уаї 325 330 335

Рпе Іїе Рібе Рго Рго Пув І1е Гпув Авр Уа! Іеип Меє Іїе 5Бег Іец 5ег 340 345 350

Рго Іїе Уа1і! ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уа1ї! бек біц Авр Авр Рго Авр 355 3З6о 365

Уаї біп Іїе Бек Тер Робе Уаії Авп Авп Уаі! сіц Уаї Нів ТПг Аза сіп 370 375 380

ТПЕ біп ТБкЕ Нів Агкуд біц Авр о Туг Авп о бег ТПг Іец Агуд Уаї Уа1ї 5ег 385 390 395 400

А1їа Гей Рго І1е біп Нів біп Авр Тгр Меє бек с1іу пув біц Рпе Гу 405 410 415

Сув Кпув Маії Авп Авп о Гпув Авр Гей Рго Аїа Рго Іїе сіц Агд ТПг І1е 420 425 430 зек Ппув Ркго Пув сі1у бек Уаі Агуд Аїа Ркго сбіп Уа! Тугк Уаї Гей Рго 435 440 445

Рго Рго біц біц біц Меє ТПг о гув пув біп Уаї ТПг Гей ТПг Сув Меє 450 455 460

Уаї ТПпгЕ Авр Рпе Меє Рго сіц Авр Іїе Тук Уаї бій Тер ТПг Авп Авп бо 465 470 475 480 сб1у пув ТПпг бій Гей Авп о Туг Гпув Авп о ТпПг бій Рго Уаї Гей Авр 5ег

485 490 495

Авр сіу бек Тук РПе Меє Тук бек пуб Іец Агкд Уа1 сій пув Гув Авп 500 505 510

ТЕр Уаі1 бій Агуд Авп обег Тукг бек Сув бек Уаії Уаії Нів біп с1Уу Гей 515 520 525

Нів Ап Нів Нів ТПг ТБг пуб бек Рібе бБег Агуд ТПг Рго с1у Гув 530 535 540 «2105 325 «211» 884 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» пП5Т2-ПІГ1ВАСР-АШЕсС «4005 325

Тпув Рпе бек Ппув біп Бек Тер с1іу Гей бійш Авп сій Аїа їец І1е Уаї 1 2 10 15

Акуд Сув Рго Агд біп б1у Гпув Ркго бек Тук ТПг Уаі Авр Тер Тук Тукг 20 25 30 зек біп ТБг АвБп оГув бек І1ї1е Рго ТПг біп бій Агуд Авп Агуд Уа1 Ре 35 40 45

А1а бек с1у біп Гецшп Гешп Ппув Рпе Гей Рго Аїа А1ї1а Уаії Аїа Авр 5ег 50 55 бо сб1у І1е Тук ТПг Сув Іїе Уаі Акуд Бек Рго ТПг Рпе Авп Агд ТПг с1Уу 65 70 75 80

Тук Аїа Авп Уа! ТПг І1е Тук пув Мпув біп бек Авр Сув Авп Уа1ї Рго

Зо 85 90 95

Авр Тук Гей Меєсє Туг бек ТПг Уаї бек біу бек біп Ппув Авп бек Гув 100 105 110

ІТІе Тук Сув Рго ТПг І1е Авр їецйц Туг АБп Тгр ТПг АїТа Рго Гей сіц 115 120 125

Тер Рпе Ппув Авп Сув біп Аза Ге сбіп сіу бек Агуд Туг Агд Аїа Нів 130 135 140

Тпув бек Рпе Гей Уаі Іїе Авр Авп Уаі Меє ТПг сій Авр Аза Сс1у Авр 145 150 155 160

Тук ТпПкЕ Сув Ппув Ропе І1е Ні Авп біц Авп біу Аза АвБп Тук бек Уаї 165 170 175

ТПгЕ АТа ТПг Агуд бек Робе ТПг Уа1! пув Авр біц біп б1у Рпе бек Іецй 180 185 190

Рпе Рго Уаі І1ї1е сб1у Аза Рго Аїа біп АБп о біп Іїе Ппув бі Уа1 сій 195 200 205

Іїе с1у Ппув АвБп Азїа Авп Гей ТПг о Сув бек Аїа Суб Рпе с1у Гув 01У 210 215 220

ТпПг біп Рбе Гец Аїа Аїа Уаії Гей Тер біп Гец АвБп о біу ТПг Гув І1е 225 230 235 240

ТПЕ Авр Рпе сіу біц Рго Агд Іїе сіп біп біц біц б1у б1п АБп сіп 245 250 255 зек РПе бБекг Авп біу Іїейп Аїа Суб Іец Авр Меє Уаії Гей Агу І1їе А1а 260 265 270

Авр Уаі1 пув біц біцш Авр Гей Гец Іец біп Тугк Авр Сув Гей Аїа Гей 275 280 285

Авп оГечп Нів біу Гей Агуд Акуд Ні ТпПг Уа1і Агуд Гей бек Аг ГПув Авп 290 295 300

Рго Іїе Авр Нів Нів бек бек біц Агд Сув Авр Авр Тгр о1у Гей Авр 305 310 315 320

ТпПЕ Меє Акуд сіп І1е біп Уаі Рбе сіц Авр біц Рго Аї1а Агуд І1е Гув 60 325 330 335

Сув Ркго Гей Рпе сі Нів Рпе Гей Ппув Рпе Авп Туг бек ТПг АїТа Нів

340 345 350 зек Аїа сіу Іїецшп ТПг ІТейп І1е Ткр Туг Тер ТПпг Агд біп АвБр Агд Авр 355 3З6о 365

Тец бій бій Рго Іїе Авп Рбе Агуд Гей Рго сій Авп Агуд І1е бек Гув 370 375 380 бі гув Авр Уаі Гей Тер Рпбе Агуд Рго ТПг Гей Ггец АБп Авр ТПг с01У 385 390 395 400

АвпоТук ТПг Сув Меє ІТец Агуд Авп о ТПг Тпг Туг Сув Бек Ппув Уа1 Аї1а 405 410 415

Рпе Рго Гей бій Уаї Уаї сіп пув Авр бек Сув Рре Авп бек Рго Меє 420 425 430

Тув Гей Рго Уаії Нів Ппув Гей Туг Іїе бій Тук сіу І1е сбіп Агд І1е 435 440 445

ТПЕ Сув Рго Авп Уаі Авр біу Тук РіПе Рго бек бек Уа1 пуб Рго ТЕПг 450 455 460

ІТІе ТБПг Тер Тук Меє б1у Сув Тук Гув І1ї1е сбіп Авп Рпе Авп Авп Уаї 465 470 475 480

ІТ1е Рго біц сіу Меє АБп Гей бек Роре Іїецй І1ї1е Аза Гец І1е 5ег Авп 485 490 495

Авп об1іу Авп Туг ТПг Сув Уа1ї Уаї ТПг Тук Рго б1ц АвБп с01у Акд ТОК 500 505 510

Рпе Нів Гпец ТПг Агуд Тпг Гей Тс Уаї Гуз Уа1! Уаї сіу Бек Рго Гу 515 520 525

Ап Аза Уаї Рго Ркго Уаі І1е Нібв бек Рго АвБп Авр Нів Уаі1 Уа1ї Туг 530 535 540 бі гув бій Рго с1у біш бій Гей Гей Іїе Ркго Сув ТПг Уаї Тук РПе 545 550 555 560 зек Рпе Пец Месє Авр бек Агуд АБп о біц Уа! Тер Тгр ТПпг І1е Ар Щ1У 565 570 575

Зо Пув Пув Рго Авр Авр І1е ТПг І1їе Авр Уаі ТПг І1їе АБп біц бек І1е 580 585 590 зек Нів бБег Агд ТПг біп АвБр біц ТПг Агуд ТпПгс сбіп ч1І1е Гей бек І1е 595 бо 605

Тпув Кпув Уаї ТПг бек бій Авр Гей Гпув Агд бек Тук Уаї Сув Нів Аїа 610 615 620

Акуд бБег Аїа пув біу бішц Маі Аїа пуб Аїа Аза Гув Уаї Ппув сбіп Гув 625 630 635 640

Уаї Рго Аза Рго Акуд Туг ТПг Уаі1і сіц бек б1у бій Рго Агд с1у Ркго 645 650 655

ТПЕ Іїе Ппув Ркго Сув Рго Рго Сув Ппув Сув Рго Аза Рго Авп Ге Іец 6бво 665 670 бі1у б1у Рго Бек Уаі Рпе Іїе Рпе Рго Рго пуб І1е Гув Авр Уаї1ї Ієц 675 68 685

Меє Іїе бек Гей бек Рго І1ї1е Уа1 ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 690 695 700 бі Авр Авр Рго Авр Уаі сіп Іїе бек Тер Робе Уаі! АвБп АвБп Уа1і с1и 705 710 715 720

Уаї Нів ТПг Аїа сбіп ТБбг біп Тпг Нів Агуд біц Авр о Туг АБп бек ТПг 725 730 735

Те Акуд Уаї Уаї бек Аїа Гей Рго Іїе сіп Нів біп Авр Тгр Меє 5ег 740 745 750 с1у гув бій Рпе Ппув Сув Ппув Уаі Авп Авп пуб Авр Гей Рго Аїа Рго 755 760 765

І1е сбіц Акуд Тс І1е бек Гпув Рго Ппув сіу Бек Уаі Агд Аза Рго сіп 770 775 780

Уаї Тук Уаії гей Рго Рго Рго бі біш біц Меє ТПг пуб пуб біп Уаї 785 790 795 800

ТПЕ Гей ТПг Сув Меєсє Уа! ТБПг Авр Рпе Меє Рго бій Авр І1їе Тук Уаї 805 810 815 бо бій Тер ТЕ Авп о Авп с1у Пув ТБг бій Гей Авп Тук ГПув АБп о ТПгЕ с1ци 820 825 830

Рко Уаії Гец Авр бБег Авр біу Бек Тук РПпе Меє Тук бек Гпув Іец Агд 835 840 845

Уаї бі Ппув Ппув Авп Тер Уаі бій Агуд Авп обег Тукг бек Сув бек Уаї 850 855 860

Уа1ї Нів сбіц с1у Гей Нів АвБп о Нів Нів ТПг ТПг пуб бек Рпе бег Агд 865 870 875 880

ТПЕ Рго с1у ГПув «2105» 326 «211» 880 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» тібТ2-юЮІТ1ВАсСР-АШЕсС «4005 326 зек Ппув бек бек Тгр с1іу Гей бій Авп бій Аїа Гецп І1їе Уа1і Аг Сув 1 5 10 15

Рго біп Агуд біу Агд бек ТПг Тук Ркго Уаі бій Тер Туг Тук Бек Авр 20 25 30

ТПЕ Авп бій бек Іїе Рго ТПг біп пуб Агуд АБп Агуд І1е Рпе Уа1ї 5ег

Акуд Авр Агуд Гец Ту Рбпе Гей Рго Аї1а Агкгуд Уаі бій Авр Бек с1у Те бо

Тук Аїа Сув Уа1і І1їе Агкд Бек Рго Авп Гец АвБп о Гув5 ТПг б1у Тук Ієц 65 70 75 80

Зо Авп оУаї ТПг Іїе Нів пуб Ппув Рго Рго бек Сув АБп І1е Рго Авр Туг 85 90 95

Тецп Меє Тук бек ТПг Уаі Агуд сіу Бек Авр Пув Авп Рпе пуб І1е ТЕПг 100 105 110

Сув Ркго ТПг Іїе Авр Гей Туг Авп Тгр ТПг Аїа Рго Уаї біп Тгр РБПе

З5 115 120 125

Тув Авп оСув Ппув Аза Гей біп бій Рго Агуд Рпе Агуд Аза Нів Агд 5ег 130 135 140

Тук гейш Рпе Іїе Авр Авп Уа! ТПг Нів Авр Авр біц б1у Авр Тугє ТПг 145 150 155 160 40 Сув біп Рпе ТПг Нів Аза бій Авп б1іу ТПг Авп Туг І1е Уаї ТПг Аїа 165 170 175

ТПгЕ Агуд бек Рпе ТПг Уаії біцш сій пув біу Рре бек Меє Рпе Рго Уаї 180 185 190

І1е ТБЕ АвБп оРго Рго Туг АБп Ні ТПпг Меє сій Уаі бій І1е с1у Гпув 45 195 200 205

Рго Аїа бек І1е Аїа Сув Бек Аїа Суб Рпе с1у Ппув с1іу Бек Нів Ріє 210 215 220

Тец А1а Авр Уаі Гей Тер біп І1їе Авп Гпув ТПг Уаі1і! Уаї с1у Авп РіПе 225 230 235 240 50 сі1у бій Аза Агд І1їе сбіп бій біц бій б1у Агд АвБп бій бек бек 5ег 245 250 255

Авп о Авр о Меєсє Авр Суб ІТецй ТПг бек Уаі Іецйп Агд І1їе ТПг с1і1у Уа1 ТЕПг 260 265 270 біш ув Авр Гей бек Гей сій Туг Авр Сув Гей Аїа Гец АБп Іецй Нів 55 275 280 285 сі1у Меє І1е Акуд Нів ТПг Іїе Агуд Гей Агуд Агуд пуб біп Рго І1е Авр 290 295 300

Нів Агуд бек бій Агуд Сув Авр Авр Тер біу Гец Авр ТПг Меє Агд сіп 305 310 315 320 бо Іїе сіп Уаі! Ррбе сб1іцш Авр сій Рго Аза Акуд І1е Ппув Сув Рго ІТей Ріе 325 330 335 біц Нів Рпе Гей Ппув Туг Авп о Туг Бек ТПг Аїа Нів бек бек С1Уу Іей 340 345 350

ТПЕ гейш Іїе Тер Туг Тгр ТПг Агуд біп Авр Агд АвБр Тец бій сій Рго 355 3З6о 365

І1е Авп Рібе Агуд Гей Рго бій Авп Акуд І1е бек Ппув сій Пув Авр Уаї 370 375 380

Тецп Тер Рпе Агуд Рго ТПг Гей Гей Авп Авр ТПг с1у Авп о Тукє Тс Сув 385 390 395 400

Меє гей Агуд Авп оТпг ТБг Тук Сув бек Ппув Уаі Аза Рпе Рго еп сіци 405 410 415

Уаї Уа1ії біп пув Авр бек Сув Рпе Авп бБег Аза Месє Агд Робе Рго Уаї 420 425 430

Нів Ппув Меє Туг Іїе біц Ні сіу Іїе Нів пув І1е ТПг Сув Рго Авп 435 440 445

Уа1 Авр сб1іу Тук Рібе Рго бек бек Уаі! Ппув Рго бек Уаї ТПг Тер Туг 450 455 460 пув б1у Сув ТПг бі Іїе Уаі1 Авр Рпе Нів А5п Уаі Гей Рго сбіц с1Уу 465 470 475 480

Ме АвБп Гей бек Рпе РібПе І1ї1е Рго Гей Уаї бек Авп АвБп б1у Авп Туг 485 490 495

ТПЕ Сув Уа1 Уа1! ТБг Тукг Рго бій Авп біу Агд ІТецй Рпе Нів Іец ТПг 500 505 510

Акуд Тпг Уаї ТБг Уаї Гуз Уаї Уаї сбі1у бек Рго Ппув Авр Аїа Гей Рго 515 520 525

Рго сіп І1е Тук Бек Рго Авп Авр Акуд Уаі! Уаї Тук сій пув бій Рго 530 535 540 сі1у бій бій Гей Уаі Іїе Рго Сув Ппув Уа1 Тук Рпе бек РоПе І1е Меє 545 550 555 560

Авр Бек Нів АвБп о біц УМаї Тер Тгр ТПг І1е Авр с1у Ппув Ппув Рго Авр

Зо 565 570 575

Авр Уа1 ТПг Уаї Авр І1е ТПг І1е АБп бій бек Уа1і Бек Тукг Бек бег 580 585 590

ТПЕ біш Авр бій ТБг Агуд ТБ біп І1е Гец бек І1е Гув Гув Уа1і ТПпг 595 бо 605

Рго бій Авр Гей Агуд Агуд Ап о Тук Уаі Сув Нів Аза Агд Авп ТПг Гуз 610 615 620 с1у 611 Аза сій сбіп Аза Аїа Ппув Уаі Ппув біп пув Уаії І1е Рго Рго 625 630 635 640

Акуд Тук ТПг Уаї біц бек б1у біц Рго Агкуд б1у Рго ТПг Іїе Гпув Рго 645 650 655

Сув Ркго Рго Сув Пув Сув Рго Аза Рго Авп Гей Гей сіу с1іу Ркго 5ег 6бво 665 670

Уаї Рпе Іїе Рпе Рго Рго пуб Іїе пув Авр Уаії Гец Меє І1е бек Іецй 675 68 685 зек Рго І1іе Маї ТПкг Сув Уаії Уаї Уаі Авр Уаї Бек бій Авр Авр Рго 690 695 700

Авр Уа1 сіп І1е бек Тгр Рпе Уаії АвБп АвБп Уаі сій Уаі Нів ТПг Аїа 705 710 715 720 біп Тпг о біп ТпПс Нів Агуд бій Авр о Туг Авп бек ТПг Гец Агд Уа1ї! Уаї 725 730 735 зек Аїа Гец Рго І1е біп Нів біп Авр Тер Меє бек с1у Ппув бій Ре 740 745 750

Туз Сув Гпув Уаі Авп Авп пув Авр Гей Рго Аїа Рго Ії1е біц Агд ТЕП 755 760 765

І1їе бек Пув Рго Ппув сіу бек Уаі Акуд Аза Рго сіп Уаї Тук Уаї1ї Іеєц 770 775 780

Рго Рго Рго біц біц бій Меє Тс Гуз Гпув біп Уаі ТПг Гей ТПг Сув 785 790 795 800

Ме Уаї ТПг Авр Рпе Меє Рго бій Авр І1е Тук Уаі б1іцп Тер ТПг Авп 60 805 810 815

Авп осіу Мпув ТПг біц Тец Авп Тук Гув АвБп оТПг бій Рго Уа1і Гей Авр

820 825 830 зек Авр біу бек Тук Рпе Меє Тук бек Гув Гей Агуд Уа1і сій Ппув Гув 835 840 845

Ап оТер Уаії біц Агуд Авп обек Туг бек Сув бек Уаі Уаі НівБ бій щу 850 855 860

Тец Нів АвБп Нів Нів ТПг Тбг Ппув бек Рпе бек Агуд ТПг Рго б1у Гу 865 870 875 880 «2105 327 «2115» 876 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» пП5тТ2-ПІ1ВАСР-ПЕС «4005 327

Тпув Рпе бек Ппув біп Бек Тер с1іу Гей бійш Авп сій Аїа їец І1е Уаї 1 2 10 15

Акуд Сув Рго Агд біп б1у Гпув Ркго бек Тук ТПг Уаі Авр Тер Тук Тукг 20 25 30 зек біп ТБг АвБп оГув бек І1ї1е Рго ТПг біп бій Агуд Авп Агуд Уа1 Ре 35 40 45

А1а бек с1у біп Гецшп Гешп Ппув Рпе Гей Рго Аїа А1ї1а Уаії Аїа Авр 5ег 50 55 бо сб1у І1е Тук ТПг Сув Іїе Уаі Акуд Бек Рго ТПг Рпе Авп Агд ТПг с1Уу 65 70 75 80

Тук Аїа Авп Уа! ТПг І1е Тук пув Мпув біп бек Авр Сув Авп Уа1ї Рго

Зо 85 90 95

Авр Тук Гей Меєсє Туг бек ТПг Уаї бек біу бек біп Ппув Авп бек Гув 100 105 110

ІТІе Тук Сув Рго ТПг І1е Авр їецйц Туг АБп Тгр ТПг АїТа Рго Гей сіц 115 120 125

Тер Рпе Ппув Авп Сув біп Аза Ге сбіп сіу бек Агуд Туг Агд Аїа Нів 130 135 140

Тпув бек Рпе Гей Уаі Іїе Авр Авп Уаі Меє ТПг сій Авр Аза Сс1у Авр 145 150 155 160

Тук ТпПкЕ Сув Ппув Ропе І1е Ні Авп біц Авп біу Аза АвБп Тук бек Уаї 165 170 175

ТПгЕ АТа ТПг Агуд бек Робе ТПг Уа1! пув Авр біц біп б1у Рпе бек Іецй 180 185 190

Рпе Рго Уаі І1ї1е сб1у Аза Рго Аїа біп АБп о біп Іїе Ппув бі Уа1 сіц 195 200 205

Іїе с1у Ппув АвБп Азїа Авп Гей ТПг о Сув бек Аїа Суб Рпе с1у Гув 01У 210 215 220

ТпПг біп Рбе Гец Аїа Аза Уаії Гей Тер біп Тец АвБп о бі1іу ТПг Ппув Ше 225 230 235 240

ТПЕ Авр Рпе сіу біц Рго Агд Іїе сіп біп біц біц б1у б1п АБп сіп 245 250 255 зек РПе бБекг Авп біу Іїейп Аїа Суб Іецй Авр Меє Уаі Гей Агуд Ії1е Аї1а 260 265 270

Авр Уаі1 пув біц біцш Авр Гей Гец Іец біп Тугк Авр Сув Гей Аїа Гей 275 280 285

Авп оГечп Нів біу Гец Агуд Акуд Ні ТПг Уа1і Агуд Гей бек Агуд Тув Авп 290 295 300

Рго Іїе Авр Нів Нів бек бек біц Агд Сув Авр Авр Тгр о1у Гей Авр 305 310 315 320

ТпПЕ Меє Агуд сіп І1е біп Уаі Рбе сбіц Авр біц Рго Аї1а Агд І1е Гув 60 325 330 335

Сув Ркго Гей Рпе сі Нів Рпе Гей Ппув Рпе Авп Туг бек ТПг АїТа Нів

340 345 350 зек Аїа сіу Іїецшп ТПг ІТейп І1е Тгр Туг Тер ТПпг Агуд біп Авр Агд Авр 355 3З6о 365

Тец бій бій Рго Іїе Авп Рбе Агуд Гей Рго сій Авп Агуд І1е бек Гув 370 375 380 бі ув Авр Уаії Гей Тер Рпе Агуд Рго ТПг Гей Гей Авп Авр ТПг 01У 385 390 395 400

АвпоТук ТПг Сув Меє ІТец Агуд Авп о ТПг Тпг Туг Сув Бек Ппув Уа1 Аї1а 405 410 415

Рпе Рго Гей біц Уаї Уаї сіп пув Авр бек Сув Рре Авп бек Рго Мес 420 425 430

Тув Гей Рго Уаії Нів Ппув Гей Туг Іїе бій Тук сіу І1е сбіп Агд І1е 435 440 445

ТПЕ Сув Рго Авп Уаі Авр біу Тук РіПе Рго бек бек Уаії Гув Рго ТПг 450 455 460

ІТІе ТБПг Тер Тук Меє б1у Сув Тук Гув І1ї1е сбіп Авп Рпе Авп Авп Уаї 465 470 475 480

ІТ1е Рго біц сіу Меє АвБп Гей бек Роре Іїецй І1ї1е Аза Гей Іїе Бек Авп 485 490 495

Авп об1іу Авп Туг ТПг Сув Уа1ї Уаї ТПг Тук Рго б1ц АвБп с01у Акд ТОК 500 505 510

Рпе Нів пец ТПг Агуд Тпг Гей Тс о Уаї Ггув Уа1ї Уа1і с1у Бек Рго Гув 515 520 525

Ап Аза Уаї Рго Ркго Уаі І1е Нібв бек Рго АвБп Авр Нів Уаі1 Уа1ї Туг 530 535 540 бі гув бій Рго сіу біш бій Гей Гей Іїе Рго Сув ТПг Уаї Тук РБПе 545 550 555 560 зек Рпе Пец Месє Авр бек Агуд АБп о біц Уа! Тер Тгр ТПпг І1е Ар Щ1У 565 570 575

Зо Пув Пув Рго Авр Авр І1е ТПг Іїе Авр Уа! ТПг І1їе АвБп бій бек Іе 580 585 590 зек Нів бБег Агд ТПг біп АвБр біц ТПг Агуд ТпПгс сбіп ч1І1е Гей бек І1е 595 бо 605

Тпув Кпув Уаї ТПг бек бій Авр Гей Гпув Агуд бек Тук Уаї Сув Нів А1а 610 615 620

Акуд бБег Аїа пув біу бішц Маі Аїа пуб Аїа Аза Гув Уаї Ппув сбіп Гув 625 630 635 640

Уаї Рго Аза Рго Акуд Тукг ТПг Уа1і1 сій Авр пуб ТПг Нів ТпПг Сув Рго 645 650 655

Рго Сув Ркго Аїа Рго бій Гей Гей сіу біу Рго Бек Уаі Рпе Іецй Ріе 6бво 665 670

Ркго Рго Пув Рго Гу Авр ТПг Іец Меє І1ї1е бек Агуд ТПг Рго сіц Уаї 675 68 685

ТПг Сув Уа1 Уаї Уаї Авр Уаї бек Нів біц Авр Рго біцп Уаї пув РПе 690 695 700

АвпоТер Тук Уаії Авр б1у Уаі сіц Уаі Нів АвБп Аза Ппув ТПкгЕ Гпув Рго 705 710 715 720

Акуд бій бі біп Туг Авп бек ТПг Туг Агуд Уа1ї Уаї Бек Уаії Гей ТЕПг 725 730 735

Уаї ІГецп Ні сбіп Авр Тгр Гей Авп о сб1у Ппув сій Тук Пув Сув Ппув Уаї 740 745 750 зек Авп Гпув Аїа ІТецй Рго Аза Рго І1е біцп Ппув ТПг Іїе Бек Гпув А1а 755 760 765

Тпув б1у біп Рго Агуд бій Рго сбіп Уаі Тук ТПкг Гей Рго Рго бБег Агд 770 775 780

Авр бій Гей ТПг Губв Авп обіп Уаї бек Іїец ТПг Сув Геип Уаі Ггув С1У 785 790 795 800

Рпе Тукг Рго Бек Авр І1е Аї1а Уаі біцп Тер бій бек АвБп б1у сбіп Рго 805 810 815 бо січ Авп Авп о Тук Ппув ТБг ТБг Рго Рго Уаії Гей Авр бег Авр с1у 5ег 820 825 830

Рпе РібПе Гпец Тук бек Гув Гей ТПг Уаі Авр Гув Бек Агд Тер сбіп сіп 835 840 845 б1у Авп Уаії РПпе бек Сув бек Уаі Меє Нів сій Аза Гец Нів Авп Нів 850 855 860

Тук ТПпг біп Пув бек Гей бек Гей бек Рго с1іу Гув 865 870 875 «2105 328 «2115» 310 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» позаклітинний домен 5Т2 людини «4005 328

Тпув Рпе бек Ппув біп Бек Тер с1іу Гей бійш Авп сій Аїа їец І1е Уаї 1 5 10 15

Агуд Сув Рго Акуд біп б1іу Ппув Рго бек Туг ТПг Уаі Авр Тер Туг Туг 20 25 30 зек біп ТБг АвБп оГув бек І1ї1е Рго ТПг біп бій Агуд Авп Агуд Уа1 Ре 35 40 45

Аза бек сіу біп ІТецшц ІТец Гув Рбе Іецш Рго Аї1а Аїа Уаі Аїа Авр 5ег 50 З бо сб1у І1е Тук ТПг Сув Іїе Уаі Акуд Бек Рго ТПг Рпе Авп Агд ТПг с1Уу 65 70 75 80

Тук Аїа Авп Уа! ТПг І1е Тук пув Мпув біп бек Авр Сув Авп Уа1ї Рго 85 90 95

Зо Авр Тук Гей Меє Туг бек ТПг УМаії бек с1у бек бій Ппув Авп бек Тув 100 105 110

ІТІе Тук Сув Рго ТПг І1е Авр їецйц Туг АБп Тгр ТПг АїТа Рго Гей сіц 115 120 125

ТЕр Рпе пув Авп Сув біп Аїа Гей сбіп сіу бек Агуд Туг Агд Азїа Нів 130 135 140

Тпув бек Рпе Гей Уаі Іїе Авр Авп Уаі Меє ТПг сій Авр Аза Сс1у Авр 145 150 155 160

Тук ТпПкЕ Сув Ппув Ропе І1е Ні Авп біц Авп біу Аза АвБп Тук бек Уаї 165 170 175

ТПгЕ Аза ТПг Акуд бек Рпе ТПг оУаії Ппув Авр бій біп сб1у Роре бек Іец 180 185 190

Рпе Рго Уаі І1ї1е сб1у Аза Рго Аїа біп АБп о біп Іїе Ппув бі Уа1 сіц 195 200 205

ІІе с1у Ппув Авп Аза АБп Гей ТПг Сув бек Аї1а Сув Рпе с1у пув Щ1У 210 215 220

ТпПг біп Рбе Гец Аїа Аза Уаії Гей Тер біп Тец АвБп о бі1іу ТПг Ппув Ше 225 230 235 240

ТПЕ Авр Рпе сіу біц Рго Агд Іїе сіп біп біц біц б1у б1п АБп сіп 245 250 255 зек Рпе бек Авп о сб1у Гецп Аїа Сув Гей Авр Мес Уаії Гей Агуд Ії1їе А1а 260 265 270

Авр Уаі1 пув біц біцш Авр Гей Гец Іец біп Тугк Авр Сув Гей Аїа Гей 275 280 285

Авп о Гей Нів сіу Іец Агуд Акуд Нів ТПг о Уаії Агд Гей бек Агуд Пув Авп 290 295 300

Рго Іїе Ар Нів Нів 5ег 305 310 60 «2105 329 «2115 306

«212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» позаклітинний домен 5Т2 миші «4005 329 зек Мпув бек бек Тгр бі1у Гей біц АБп бій Аза Гей Іїе Уа1 Аг9д Сув 1 5 10 15

Рго біп Акуд б1іу Агуд бек ТПг Тук Рго Уаі бій Тер Туг Тук 5Бек Авр 20 25 30

ТПЕ Авп біц бек Іїе Рго ТПг сбіп пув Агуд АБп Агуд І1е Рпе Уа1ї 5ег 35 40 45

Акуд Авр Агуд Гец Ту Робпе Гей Рго Аї1а Агуд Уаі сій Авр бег с1у І1е 50 З бо

Тук Аїа Сув Уа1і І1їе Агкд Бек Рго Авп Гец АвБп о Гув5 ТПг б1у Тук Ієц 65 70 75 80

Авп оУа1 ТЕ Іїе Нів пуб Гпув Рго Рго Бек Сув Ап І1е Рго Авр Туг 85 90 95

Тем Меє Тук бек ТпПг Уа1і Агкуд сіу бек Авр Пув Ап Ріпе Гуз І1е ТіПг 100 105 110

Сув Ркго ТПг Іїе Авр Гей Туг АвБп Тер ТПг Аза Рго Уаі біп Тгр РПе 115 120 125

Тув Авп оСув Ппув Аза Гей біп бій Рго Агуд Рпе Агуд Аза Нів Агд 5ег 130 135 140

Тук гейш Рпе Іїе Авр АвБп Уа! ТПг Нів Авр Авр бій с1у Авр Тук ТЕГ 145 150 155 160

Сув біп Рпе ТПг Нів Аза бій Авп с1іу ТПг Ап о Туг І1ї1е Уаї ТПг А1а 165 170 175

Зо ТПгЕ Агуд Бек Рпе ТПг Уаії бі бій Ппув біу Рпе Бек Меє Робе Рго Уаї 180 185 190

І1е ТБЕ АвБп оРго Рго Туг АБп Ні ТПпг Меє сій Уаі бій І1е с1у Гпув 195 200 205

Рго Аїа бек І1е Аїа Сув Бек Аза Сув Рпе сіу Ппув сіу бек Нів РБПе 210 215 220

Тец А1а Авр Уаі Гей Тер біп І1їе Авп Гпув ТПг Уаі1і! Уаї с1у Авп РіПе 225 230 235 240 сб1у 611 Аза Агуд І1е сбіп біц бій сбіц б1у Агд АвБп бій бек бек 5бег 245 250 255

Авп о Авр о Меє Авр о Сув Гей ТПг бек Уаі Гей Агуд І1е ТПк с1у Уа1 ТЕГ 260 265 270 біш ув Авр Гей бек Гей бій Туг Авр Сув Іец Аза Іецп Авп Гей Нів 275 280 285 сі1у Меє І1е Акуд Нів ТПг Іїе Агуд Гей Агуд Агуд пуб біп Рго І1е Авр 290 295 300

Нів Аг4д 305 «2105 330 «2115 339 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» позаклітинний домен 5Т2 ІЛ 1РАСР людини «4005 330 зек біц Акд Суб Авр Авр Тгр біу Іецй Авр ТПг Меє Агуд сбіп І1е сіп 60 1 2 10 15

Ууаї Рпе бій Авр бій Рго Аза Агуд Іїе Ппув Сув Рго Гец Рое б1іц Нів

20 25 30

Рпе Гей пуб Рібе Авп о Тугк бек ТПг Аза Ні бек Аза с1у Гей ТПг Іец 35 40 45

І1е Тер Туг Тгр ТПг Агуд біп АвБр Агуд АвБр Те сій бій Рго І1їе Авп 50 З бо

Рпе Агд Гец Рго біц АБп Агуд І1е бек Ггув бій Ппув Авр Уа1і Іецй Тгр 65 70 75 80

Рпе Агуд Рго ТПг Іец Гей Авп Авр о ТПг о б1і1у АвБп Туг ТПг Сув Меє Гей 85 90 95

Агуд Авп о ТВПг ТБг Тукг Сув Бек Ппув Уаі Аза Рібе Рго Гей сій Уа1! Уаї 100 105 110 біп Ггув Авр бек Сув Рпе Авп бек Рго Меє Гпув Гей Рго Уаії Нів Гув 115 120 125

Тец Тук І1е сі Тук с1у Іїе сіп Агуд Іїе ТПкг Сув Рго Авп Уаі Авр 130 135 140 б1і1у Тук Рпе Рго Бек Бек Уа1 Ппув Рго ТПг Іїе ТПг Тер Тук Меє 1У 145 150 155 160

Сув Тук Гув Іїе біп Авп Рпе Авп Авп Уаі Іїе Рго сіц сіу Меє Авп 165 170 175

Тен бек Рре Гецп І1їе Аїа Гей І1їе бБег АБп Авп с1у Авп Туг ТПкг Сув 180 185 190

Уаї Уаї ТПг Тук Рго біц Авп сбіу Акуд ТБг Робе Нів Іецй ТПг Агд ТПг 195 200 205

Тецп ТПпг Уаї Ппув Уаі1ї Уа1 сіу Бек Рго Пув Авп Аза Уаї Рго Рго Уаї 210 215 220

ІТ1е Нів бек Рго АвБп Авр Нів Уаі! Уаії Тук бій пув бій Рго сі1у сіц 225 230 235 240 біш ТГешп Гей Іїе Рго Сув ТПг Уа1і Тук Рпе бек Рпе Гей Меєс Авр 5ег 245 250 255

Зо Агуд Авп осі Уаї! Тер Тер ТпПг І1е Авр с1у Ппув пуб Рго Авр АБр І1е 260 265 270

ТПЕ І1їе Авр Уа1! ТБПг І1їе АвБп сій бек І1е бБег Нів Бек Агд ТПг с1ци 275 280 285

Авр бій ТБг Агуд Тс біп І1е Гец бек І1е Гув Ппув Уаі ТПг бек с1іц 290 295 300

Авр Гей пуб Агд бек Тук Уаії Сув Ні5 Аза Агуд бек Аїа Ггув сіу сіц 305 310 315 320

Ууаї Аза пув Аїа Аїа Ппув Уаії пув біп пув Уаі Рго А1їа Рго Агд Туг 325 330 335

ТПгЕ Уаї сі1ц «2105 331 «2115 339 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» позаклітинний домен ІЛ 1РАСР миші «4005 331 зек біц Акд Суб Авр Авр Тгр біу Іецй Авр ТПг Меє Агуд сбіп І1е сіп 1 5 10 15

Уа1ї Рпе біц Авр сій Рго Аїа Акуд І1е Ппув Сув Рго Тїей Рпе сій Нів 20 25 30

Рпе Гей Ппув Тукг Авп оТук бек ТПг Аїа Нів бек бек с1у Гей ТПг Ієец 35 40 45

І1е Тер Туг Тгр ТПг Агуд біп АвБр Агуд Ар Те сій бій Рго І1їе Авп 60 50 З бо

Рпе Агд Гец Рго біц АБп Агуд І1е бек Ггув бій Ппув Авр Уа1і Іецй Тгр

65 70 75 80

Рпе Агуд Рго ТПг Іец Гей Авп Авр о ТПг о б1і1у АвБп Туг ТПг Сув Меє Гей 85 90 95

Акуд АвпоТБг Тс Тує Сув бек пув Уаі Аза Рпе Рго Гей бій Уа1 Уаї 100 105 110 біп Ггув Авр бек Сув Рпе Авп бБег Аїа Меє Акуд РібПе Рго Уаії! Нів Гув 115 120 125

Меє Ту І1їе сбіш Нів сіу Іїе Нів Ппув І1е ТБПг Суб Рго Авп Уаі1ї Авр 130 135 140 сіу Тук Рре Рго бек бек Уа1! Пув Рго бек Уаі ТПг Тгр Туг гув Щ1У 145 150 155 160

Сув ТПпг бій Іїе Уаі Авр Рпе Нів Авп Уаі Гей Рго сіц сіу Меє Авп 165 170 175

Тецп бек Рпе Рпе Іїе Рго Гей Уаі Бек Авп Авп сіу Авп Тукє ТПг Сув 180 185 190

Уаї Уаї ТПгЕ Тук Рго біц Авп сбіу Акд Гей Рібе Нібв Іецй ТПг Агд ТПг 195 200 205

Уаї ТПпг Уаї пув Уа1 Уаї сіу Бек Ркго пуб Авр Аза Іецй Рго Рго сіп 210 215 220

ІТїе Тук бек Рго АБп Авр Акуд Уаї Уаі Туг бій Ппув бій Рго с1і1у сіц 225 230 235 240 сбіш Геп Маї Іїе Рго Сув Ппув Уа1і Тук Рпе бек Рпе І1їе Меєс Авр 5ег 245 250 255

Нів Авп бій Уа1ї Тер Тгр ТПг Іїе Авр біу Гпув пув Рго Авр Авр Уаї 260 265 270

ТпПЕ Уа1ї Авр Іїе ТБПг І1їе АвБп сій бек Уаії бек Туг бек бек ТПг с1и 275 280 285

Авр бій ТБг Агуд Тс біп І1е Гец бек І1е Гув Ппув Уаі ТПг Рго с1іц 290 295 300

Зо Авр Геї Агкуд Агуд АвБп оТук Уаї Сув Нів Аза Агуд АБп о ТПг пув с1у сій 305 310 315 320

А1їа сій біп Аїа Аза їув Уаї Ппув біп Гуз Маії Іїе Рго Рго Агд Туг 325 330 335

ТПгЕ Уаї сі1ц

З5 «2105 332 «2115 227 40 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Ес Ідбі людини 45 «4005 332

Авр пув ТПг Нів ТБг Суб Рго Рго Суб Рго Аї1а Рго сій Гей Іеш 0Щ1У 1 5 10 15 б1у Ркго Бек Уаі Рпе Гей Рпе Рго Рго Ппув Рго Пув Авр ТПг Іец Меє 50 20 25 30

ІТ1е бек Агд ТПг Рго бій Уаі ТПг Сув Уаії Уа1і Уаі Авр Уа1і1 бек Нів бі Авр Рго сій Уаі Ппув Рпе Авп Тгр Туг Уаі1 Авр сіу Уаї сіц Уаї бо 55 Нів Авп Аїа Пув ТПг Гпув Рго Агуд бій бій біп Туг АБп бек ТПг Туг 65 70 75 80

Акуд Уа1 Уаї бек Уаії Іец ТПг Уаї Іец Ні біп Авр Тгр Гей А5Бп 1У 85 90 95

Тпув бій Тук Ппув Сув Ппув Уа1 Бек Авп пув Аїа Гей Рго Аза Рго І1е 60 100 105 110 біш Гув ТПг Іїе Бек Ппув Аїа Ппув с1у біп Рго Агд біц Рго Сбіп Уаї

115 120 125

Тук ТпПкЕ Гей Рго Рго бБег Агд Авр бій Гец ТПг Тубв АБп обіп Уаї 5ег 130 135 140

Тецп ТПпкг Сув Геп Уаії Ппув сіу Рпе Туг Рго Бек Авр Ії1е Аїа Уа1ї сій 145 150 155 160

ТЕр бі Бек Авп сбіу біп Рго бій Авп Авп Туг Гув ТПг ТпПг Рго Рго 165 170 175

Уаї Гей Авр Бек Авр сіу бек РПпе РпПе Гей Тукг бек пув Гей ТПг Уаї 180 185 190

Авр Пув бек Агкуд Тгр біп біп б1іу Авп Уа1! Рібе бек Сув бек Уа1 Меє 195 200 205

Нів біц Аїа Гей Нів Авп о Нів Тук ТПг біп Гпув бек Тецй бек Іец 5ег 210 215 220

Ркго с1у Пув 225 «2105 333 «2115 233 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Ес Ідб2а миші «4005 333 біц Рго Акуд сіу Рго ТПг Іїе Ппув Рго Сув Рго Рго Сув Пув Сув Ркго 1 5 10 15

Аза Рго Авп Гец Іец бі1іу бі1у Ркго бек Уаі Рпе І1їе Рпе Рго Рго Гув

Зо 20 25 30

ІТ1е пув Авр Уаі! Іец Меє Іїе бек ІТец бек Рго Іїе Уа1і ТПг Сув Уаї

Уаї Уаії Авр Уа1 Бек бій Авр Авр Рго Авр Уаі біп І1е бек Тгр Ріє бо 35 Уа1 АвБп Авп Уаі сій Уаї Нів ТПг АзТа сбіп ТПг біп Тег Ніб Агуд сі 65 70 75 80

Авр Тук Авп бек ТПг ІТецй Агуд Уа! Уаії бек Аїа Гей Рго Іїе сіп Нів 85 90 95 біп Авр Тер Меє бек с1у пув сій Рпе Ппув Сув пув Уаії Авп Авп о Гув 40 100 105 110

Авр Гей Рго Аза Рго І1е бій Акуд Тс І1е бек Ппув Рго Ппув біу вег 115 120 125

Уаї Акуд Аза Рго сіп Уа1ї Тук Уаі1 Гей Рго Рго Рго бі бій сі Меє 130 135 140 45 ТПЕ Ппув Ппув біп Ма! ТПг Гецп ТПг Сув Меє Уа1! ТПг Авр Рре Меє Рго 145 150 155 160 бі Авр І1е Тук Уаі бій Тер ТПг Авп Авп сб1іу пув ТБг бі Гей Авп 165 170 175

Тук Ппув Авп о ТПг біц Рго Уаії Гей Авр бег Авр біу бек Тук Роіе Меєс 50 180 185 190

Тук Бек Гпув Гей Агуд Уаії біцш пув пув Авп Тгр Уаі бій Агд Авп 5ег 195 200 205

Тук Бек Сув бек Уаї Уаії Ні сіц сіу Іец Нів АвБп Нів Нів ТіПг ТЕП 210 215 220 55 пув бек Рре бек Агуд ТПг Рго с1іу Гуз 225 230 «2105 334 60 «2115» 167 «212» БІЛОК

«2135 Штучна послідовність «223» М.тТавсісшіагків ІЛ-33-6Нів «4005 334 зек Іїе ТПг сі1іу І1е бек Рго І1е ТПг бій бек Гей Аза бБег Гей б5ег 1 5 10 15

ТПЕ Тук Авп Авр біп бег І1е ТПг Рбе Аїа їец біц Авр бій бек Туг 20 25 30 сбіш І1е Тук Уаі бій Авр Гей Ппув Пув Авр о Ппув пуб пуб Авр о Тув Уаї 35 40 45

Тецп Гей бек Туг Тук бі Бек сбіп Нів Рго бек бек біц бек б1у Авр 50 55 бо сіу Маі Авр с1іу Ппув Меє Гей Меє Уаї ТПг Гей бек Ркго ТПг Ппув Авр 65 70 75 80

Рпе Тер Гец біп Аз1а Авп Авп Гуз бі Нів бек Уаі сій Гей Нів Гув 85 90 95

Сув б1п Гпув Рго Гей Рго Авр сіп Аза Рпе Рпе Уа1і Гей Нібв Авп Агд 100 105 110 зек Рпе Авп Сув Уаі! бек Рпе біц Суб Гув ТПг Авр Рго сіу Уа1 Ре 115 120 125

ІІе сі1у Уаї пуб Авр АвБп о Нів Іец Аза Іїецй І1е Ппув Уаі Авр Тук 5ег 130 135 140 сій Авп о Гец сіу бек бій АвБп І1їе Гей Рпе Ппуб5 Гей бек бій І1е Гей 145 150 155 160 сій Нів Нів Нів Нів Нів Нів 165

Зо «2105 335 «2115» 117 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність

З5 «220» «223» сурогатне ІЛ-4В Ат НСУВ-миші «4005 335 бі Маї біп Гей біп біп бек с1іу Рго біц Гей Уа! пуб Рго с1у А1а 40 1 2 10 15 зек Уаії Акд Меє бек Сув Гув Аза бек біу Тук ТПг Рпе ТПг Авр Туг 20 25 30

Ап отІ1е Нів Тер Уаі пув біп бек Ні бі1у Ппув Бек Гей бі Тер Те 45 сіу Тук І1е Тук Рго Авп Авп о б1іу Авр АБп о біу Туг Авп біп Ппув РБГе бо

Акуд с1і1у пув Аза ТБПг Іец ТПг Уаї Авр Гув бек бек Бек ТПг Аїа Туг 65 70 75 80

Меє бій Ггец Агуд Бек Гей ТПг Бек Авр Авр бБег Аїа Уаї! Тук Тук Сув 50 85 90 95

Аза Акуд с1у Агд Тец Агуд Тук Ррбе Авр Уа! Тер с1у ТПг о1у ТПкг ТК 100 105 110

Уа1ї1 ТрПг Уаї бек 5ег 115 55 «2105 336 «2115 111 «212» БІЛОК 6о0 «213» Штучна послідовність

«223» сурогатне ІЛ-4В Ат ІСУВ-миші «4005 336

АвБп очІ1е Уаі Іїей ТПг сбіп бек Рго Аїа бБег гейш Аїа Уа1і бек Іешц 01У 1 5 10 15 біп Агуд Аза ТПг о І1їе Бек Сув Агуд Аза Бек бій бек Уаії Авр Авп Туг 20 25 30 бі1у Нів Бек Рпе Меє Нів Тер Тук сбіп біп Гув Рго б1у біп Рго Рго 35 40 45 ув Тецп Гей Іїе Туг гейш Аїа Бек Авп Гей бій бек сіу Уаї Рго А1а 50 55 бо

Акуд Рпе бек біу бек біу Бек Агуд ТПг Авр Рпе ТПг Гей ТПг Іецй Авр 65 70 75 80

Рго Уаі біц Азїа АБр Авр Аїа Аза ТПг Туг Тук Сув біп сбіп Туг Авп 85 90 95 бішц Авр Рго Рго ТПг Рпе сіу бек біу ТПг Гув ІТеп бій І1е Гув 100 105 110 «2105 337 «2115» 124 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Дупілумаб НСУВ «4005 337

Зо сій Уаї сбіп Геп Уаії бій бек сбіу сб1у с1у Гей бій сбіп Рго с1у с1Уу 1 5 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув Аї1а сіу бек бі1у Рпе ТПг Рпе Агуд Авр Туг 20 25 30

Аза Меє ТБПг Тер Уаі Агуд біп Аза Рго б1у Ппув с1у Гей бі Тгр Уаї

З5 35 40 45 зек бек І1е бек біу бек с1іу бі1у Авп ТПг Туг Туг Аїа Авр бек Уаї 50 55 бо пув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе Бек Агуд Авр Авп Бек Гув Ап о ТПг Іец Туг 65 70 75 80

Тен біп Мес Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТПг Аїа Уа1ї! Тук Тук Сув 85 90 95

Аза пув Авр Агд Тец бек І1е ТБПг І1е Агуд Рго Агуд Туг Тук С1Уу Іей 100 105 110

Авр Уа1 Тер сіу біп б1у ТПг ТБг Уа1і ТПг Уаї 5ег 115 120 «2105 338 «2115 112 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Дупілумаб ГСУВ «4005 338

Авр І1ї1е Уаї Меєсє ТПг біп бек Рго Іїец бек ТГецйп Рго Уаі ТПг Рго Щ1У 1 5 10 15 біц Ркго Аїа бек Іїе Бек Сув Агуд Бек Бек біп бек Гей Гец Туг б5ег 60 20 25 30

ІТІе с1у Тук Авп Тук ІТецй Авр Тр Туг Іецп біп Ппув Бек сб1і1у біп б5ег

35 40 45

Ркго сбіп Гец Іїец І1е Тук Гей біу Бек АБп Агуд Аза Бек сіу Уа1і Рго 50 55 бо

Авр Агуд Робе бек біу бек біу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Гей ув І1е 65 70 75 80 зек Агуд Уаі біц Азїа бій Авр Уа1і сб1у Рпе Туг Тугк Сув Меє сіп Аї1а 85 90 95

Тец біп ТПг Рго Туг ТПг Рбе сіу сбіп сіу ТБбПкг Ппув Гец біц І1е Гув 100 105 110 «2105» 339 «2115 8 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Дупілумаб НСОВІ1 «4005 339 б1у Рпе ТПг Рпе Агуд Авр Туг Аїа 1 5 «2105 340 «2115 8 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність

Зо «2205 «223» Дупілумаб НСОВ2 «4005 340

І1е бек біу бек б1у б1у АБп Тс 1 5 «2105 341 «2115 18 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Дупілумаб НСОВЗ «4005 341

Аза пув Авр Агд Тец бек І1е ТБПг І1е Агуд Рго Агуд Туг Тук с01У Іец 1 5 10 15

Авр Уаї «2105 342 «2115 11 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Дупілумаб ПСОВІ1 60 «4005 342 біп бек Гей Гей Туг Бек Іїе с1у Тук Авп Туг 1 5 10 «2105 343 «2115 З «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Дупілумаб ПСОВ2 «4005 343

Тец б1у 5ег 1 «2105» 344 «2115 9 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Дупілумаб ПСОВЗ «4005 344

Меє сіп Аза Гей сбіп ТБбг Рго Тук ТЕГ 1 5

Зо «2105» 345 «211» 451 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність

З5 «2205 «223» Важкий ланцюг дупілумаба «4005 345 сій Маї сбіп Гецп Уаі сій бек с1іу сбіу сб1у Геп сій біп Рго б1у СШ1У 1 5 10 15 зек Гей Агд Іїец бек Сув Аї1а сіу бек бі1у Рпе ТПг Рпе Агуд Авр Туг 20 25 30

Аза Меє ТБПг Тер Уаі Агуд біп Аза Рго б1у Ппув с1у Гей бій Тер Уаї 35 40 45 зек бек І1е бек біу бек с1іу бі1у Авп ТПг Туг Туг Аїа Авр бек Уаї бо

Тпув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе бек Агуд Авр Авп бек ГПув Ап о ТПг Іец Туг 65 70 75 80 50 Тен біп Мес Авп бек Гей Агуд Аїа бій Авр ТПг Аїа Уа1ї! Тук Тук Сув 85 90 95

Аза пув Авр Агд Тец бек І1е ТБПг І1е Агуд Рго Агуд Туг Тук с01У Іец 100 105 110

Авр Уа1 Тер біу біп б1у ТПг ТБг Уа1ії ТПг Уаї бек Бек Аїа Бек ТЕПг 55 115 120 125

Тпув б1у Рго Бек Уаі Рпе Рго Гей Аза Рго Сув Бек Агуд бек ТПг 5ег 130 135 140 біц бек ТпПг Аза Аїа Геш сіу Сув Геш Уаі Ппув Авр Туг Робе Рго бій 145 150 155 160 бо Рго Уаії ТіПг Уаї Бек Тер Авп бек с1у Аїа Гей ТПг бек с1у Уаї Нів 165 170 175

ТПЕ Рпе Рго Аза Уаї Гец біп бек бек біу Гец Тук бек ТІГецй бек 5бег 180 185 190

Уаї Уаї ТПг Уа1 Рго Бек бек Бек Ге с1іу ТПг Ппув ТПг Тук ТіК Сув 195 200 205

Авп оУаії Авр о Нів Ппув Рго бек Авп ТПг о пув Маії Авр Гуз Ак Уа1! сіц 210 215 220 зек Мпув Тук біу Ркго Рго Сув Рго Рго Суб Рго Аза Рго бій РПе ГІец 225 230 235 240 бі1у б1у Рго Бек Уаі Рпе Гей Рпе Рго Рго Ппув Рго Пув Авр ТіПг Іецй 245 250 255

Меє Іїе Бек Агуд ТПг Рго біц Уа1 ТПг Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уаї 5ег 260 265 270 біп бій Авр Рго бі Уаі біп Рпе Авп Тгр Тук Уаі Авр сіу Уаі с1и 275 280 285

Уа1ї1 Нів АвБп Аїа Пув ТПг пуб Рго Агд бій бій біп Рбе АвБп бек ТПг 290 295 300

Тук Агуд Уа1 Уаї бек Уаії Іецп ТБПг Уаї Іец Нів біп Авр Тгр Гей Авп 305 310 315 320 с1у гув бій Тук Ппув Сув Ппув Уа1і Бек Авп Ппув сіу Гей Рго бек в5ег 325 330 335

І1е сіц пув ТБПг І1е бек Гув Аїа їув бі1у бі1іп Рго Агуд бій Рго сіп 340 345 350

Уаї Тук ТПгЕ Гей Рго Рго бек біп біш біц Меє ТБПг пуб Авп біп Уаї 355 3З6о 365 зек Геп ТПг Сув Гецп Уаї Ппув с1у Рпе Туг Рго Бек Авр І1їе Аїа Уаї 370 375 380 бі Тер бій Бек Авп б1іу біп Рго бій Авп Авп о Тук пуб ТПг Тк Рго 385 390 395 400

Рко Уаії Гец Авр бБег Авр біу бек РПе Рпе Гей Туг Бек Агд Гей ТЕПг

Зо 405 410 415

Уаї Авр Ппув Бек Агуд Тер сбіп бі сб1у Авп Уа1 Ріе бек Сув бек Уаї 420 425 430

Меє Нів сі Аїа Ггецй Нів Авп о Нів Тук ТПг біп пуб бек Гецй бек Іец 435 440 445

Бек Геч с1У 450 «210» 346 «2115» 219 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Легкий ланцюг дупилумабу «4005» 346

Авр І1ї1е Уаї Меєсє ТПг біп бек Рго Гец бек Гей Рго Уа1і ТПг Рго 01Уу 1 5 10 15 бій Рго Аїа Бек І1їе бек Сув Акуд бек бек біп бек Гемп ІГецй Туг 5ег 20 25 30

ІТІе с1у Тук Авп Тук Тецй Авр Тр Туг Іец біп пув бек біу біп б5ег 35 40 45

Ркго сбіп Гец Іїец І1е Тук Гей біу Бек АБп Агуд Аза Бек сіу Уа1і Рго 50 З бо

Авр Агуд Робе бек біу бек біу бек біу ТПг Авр Робе ТПг Гец Гув І1е 65 70 75 80 зек Агуд Уаі біц Азїа бій Авр Уа1і сб1у Рпе Туг Тугк Сув Меє сіп Аї1а 85 90 95 бо Тем біп ТПЕ Рго Тук ТПг Рре сіу біп с1іу ТБг Гув Геп сі І1е Туз 100 105 110

Акуд ТВП Уаії Аза Аза Ркго бек Уа! Рпе І1е Рпе Рго Рго бБег Авр с1ц 115 120 125 біп Гей Гпув Бек с1у ТПг Аїа бек Уаї Уаї Суб Іїец Тецй Авп Авп Ріе 130 135 140

Тук Рго Агуд бій Аїа Ппуз УМаії біп Тер пув Уаі Авр АБп Азїа Гей сіп 145 150 155 160 зек сб1у Авп бек біп бій бек Уаі ТпПг бі біп Авр бек пуб Авр б5ег 165 170 175

ТПЕ Тук Бек Гей бек бек ТПг Гей ТПг Гец бек їув Аза АБр Тук с1и 180 185 190

Тпув Нів Гпув Уаї Туг Аїа Сув бій Уаї ТіПг Нів біп б1у Гей бек 5бег 195 200 205

Рко Уаї ТіПг пуб бек Рпе АБп Агуд сбі1у бій Сув 210 215 «2105» 347 «2115 207 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» ІЛ-4Вальфа людини «4005 347

Меє пув Уаі гей сбіп бій Рго ТПг Сув Уаї бек Авр Туг Меє бек Ше 1 5 10 15 зек ТПг Сув біц Ткр ув Меє Авп обіу Рго ТПг Авп Сув Бек ТПг сіц 20 25 30

Зо Тем Агуд Ге Гецп Тук біп Гей Уа! Рібе Гец Гей бек біц Аїа Нів Тіг

Сув І1е Рго бій Авп Авп сіу сіу Аїа сіу Сув Уа1 Сув Нів Іец Іей бо

Меє Авр Авр Уа1 Уа1 бек Аза Авр Ап Тут ТПг Іец Авр Іец Тгр Аїа 35 65 70 75 80 сбі1у біп біп Гей Гей Тер пув сіу Бек Рпе Ппув Рго бек біц Нів Уаї 85 90 95

ТПув Рго Агуд Аза Рго сіу Ап Гей ТПг Уа1і Нів ТПг Авп Уа! 5ег Авр 100 105 110 40 ТП Гецш Гей Гей ТПг Тгр бек АБп о Рго Тук Рго Рго АвБр Авп Тук Іец 115 120 125

Тук Ап Нів Гей ТПг Туг Аза Уаі1і Авп І1е Тгр бек бій АвБп Авр Рго 130 135 140

Аза Авр Ріпе Агуд І1е Тук АвБп Уа! ТПг Тук Те бій Рго Бек Гей Агд 45 145 150 155 160

І1е Аїа Аза бек ТПг ІТецп Ппув бек бі1у І1е бек Туг Агуд Аїа Аг9д Уаї 165 170 175

Акуд Аза Тгр Аїа біп Сув Тук Авп о ТПг ТПг Тер бек бій Тер бек Рго 180 185 190 50 зек ТПг Пув Тер Нів Авп бек Туг Акуд бій Рго Рпе сій сіп Нів 195 200 205 «2105» 348 55 «2115 270 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» бо «223» ПІЇ133 095760 (перед протеолітичною обробкою)

«4005» 348

Меє Гпув Рго Ппув Меє Ппув Тук Бек ТПг Авп о пув І1е бБекг ТПг А1тїа Гу 1 5 10 15

ТЕр пув Авп о ТПг АТїа бек їпув Аїа Гей Сув Рбе Гув5 Іец б1у Ппув бБег 20 25 30 біп бі1іп гув Аза пув біш Уа1 Сув Рго Меє Тук Рпе Меє пув Іец Агд 35 40 45 зек сіу Пец Меє І1е Гув Гпув біц Аїа Сув Тук Рпе Агд Агд бій ТЕГ 50 55 бо

ТПЕ Ппув Агуд Рго бек Гец Ппув ТПг б1у Агуд Пув Нів Пув Агуд Нів Іец 65 70 75 80

Уаї ге Аза Аїа Сув біп біп біп бек ТПг Уаі сбіц Сув Рпе Аїа РПе 85 90 95 сб1у І1е бек сіу Уаі біп пув Туг ТПг Агуд Аїа Гей Нів Авр бег 5ег 100 105 110

І1е ТПг сі1у І1е бек Рго І1е ТПг біцш Тук Гей Аза Бек Гей бек ТПг 115 120 125

Тук Авп Авр о біп бекг І1е ТПг Рбе Аїа Гец біц Авр бій бек Тук с1и 130 135 140

Іїе Тук Уа1! бій Авр Гецшп Ппув Пув Авр бій Гуз пуб Авр оГпув Уа1ї Іецй 145 150 155 160

Тец бек Тук Тук бі Бек біп Нів Рго Бек Ап бій бек С1у Авр 01У 165 170 175

Уаї Авр с1у Ппув Меє Гец Мес Уа1 ТПг Ггец бек Рго ТПг Гув Авр Ріе 180 185 190

ТЕр геш Нів Аза Авп АвБп о Гув сій Нів бек Уаії біцп ІГецп Нів Ппув Сув 195 200 205 біц Гпув Рго Гей Рго Авр сбіп Аза Рпе Рпе Уа1і Ггец Нібв Авп Меє Нів 210 215 220

Зо век Авп Сув Уаії бек Рпе сій Сув Пув ТПг Авр Рго сіу Уаі Рібе І1е 225 230 235 240 сі1у Маї ув Авр Авп Нів Гей Аза Гей Іїе Ппув Уа1і Авр бек бек бій 245 250 255

Авп о Гей Сув ТПг біц АвБп о І1е Гец Рбе їу5 Іец бек бій ТПг

З5 260 265 270 «2105» 349 «2115 159 40 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» ПІЇЗ33 шаєсиге РЕРТІРОЕ (після протеолітичної обробки) 45 «4005 349 зек Іїе ТПг сі1іу І1е бек Рго І1е ТПг біцп Тук Гей Аїа бБег Гей б5ег 1 5 10 15

ТПЕ Тук Авп Авр біп бег І1е ТПг Рбе Аїа їец біц Авр бій бек Туг 50 20 25 30 сбіш І1е Тук Уаі бій Авр Гей Ппув Ппув Авр бій пув пуб Авр о Тув Уаї

Тецп Гей бек Туг Тук бі Бек сбіп Нів Рго бек Авп біц бек б1у Авр бо 55 сіу Маі Авр с1іу Ппув Меє Гей Меє Уаї ТПг Гей бек Ркго ТПг Ппув Авр 65 70 75 80

Рпе Тер Гец Ні Аза АвБп АвБп Гуз б1іцп Нів бек Уаі сій Гей Нів Гув 85 90 95

Сув б1іп Гпув Рго Гей Рго Авр сіп Аїа Рпе Рпе Уаі! Гец Нів Авп Меє 60 100 105 110

Нів Бек Авп Сув Уаії бек Роре сій Сув Пув ТПг Авр Рго б1і1у Уаї РПе

115 120 125

ІІе сі1у Уаї пуб Авр АвБп о Нів Іец Аза Іїецй І1е Ппув Уаі Авр Бек 5ег 130 135 140 біц АБп о Гей Сув ТПг бій Авп о чІ1е Гей Рпе Ппув Гей бек біц ТЕПг 145 150 155 «2105 350 «2115 12 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Амінокислотні залишки 1-12 5ЕО І МО: 349; також відповідає залишкам 112-123 5БО ІРР МО: 348 (Опірго 095760) «4005 350 зек Іїе ТПг сі1іу І1е бек Рго І1е ТПг бій Тук Ієц 1 2 10 «2105 351 «2115 87 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Амінокислотні залишки 50-94 5ЕО І МО: 349; також відповідає залишкам

Зо 161-205 580 ІРР МО: 348 (Опірго 095760) «4005 351

І1е ТБ біц Тук Іїец Аза бек ІТец бек ТПг Туг Авп Авр біп бек І1е 1 2 10 15

ТПЕ Рпе Аїа Гей сіц Авр біц бек Тук біц І1е Тук Уаії б1цп Авр Гей 20 25 30

Туз Ггув Авр бій пув Ппув Авр оГпув Уаії Гей Гей бек Туг Тук біц б5ег 35 40 45 сбіп Нів Рго Бек Авп бій бек с1у Авр сбі1у Маії Авр с1і1у Ппув Меє Гейий 50 55 бо

Мен Уаї ТПг Гей бек Рго ТПг Ппув Авр Робе Тер Гец Ні Аза АБп АвБп 65 70 75 80 пув бі Нів Бек Уа1 сі Гей 85 «2105 352 «2115 556 «2125 БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» 5Т2 людини (Див. номер доступу СепВапк МР 057316) «4005 352

Меє сі1у Рпе Тер Іїе Ггец Аїа Іїе Гей ТПг І1їе Гец Меє Тук бек ТПг 1 5 10 15

Аза Аза пуб РібПе бек їпув біп бек Тгр б1у Те бій АвБп біц Аїа Гей бо 20 25 30

І1е Уаї Акд Суб Рго Агкд біп б1іу пуб Ркго Бек Туг ТПг Уа1 Авр Тгр

35 40 45

Тук Тук Бек біп ТБг Авп о Гув бек І1е Рго ТПг біп б1ц Агд АвБп Агд 50 55 бо

Уаї Рпе Аїа бек сіу біп Гец Гей пув Рібе Гец Рго Аї1а А1їа Уаї Аза 65 70 75 80

Авр Бек с1і1у І1е Тук ТПг Сув І1їе Уаі Агд Бек Рго ТПг Ропе Авп Агд 85 90 95

ТП б1у Тук Аза Авп Уа! ТПг Іїе Тук Ппув Ппув біп бек Авр Сув Авп 100 105 110

Уа1 Рго Авр Тук Геп Меєсє Туг бек ТПг Уаї бек біу бек бі Гпув Авп 115 120 125 зек Мпув І1е Тук Сув Рго ТПг І1е Авр ІТецй Туг АБп Тгр ТПг Аза Рго 130 135 140

Те бій Тер Рпе Ппув Авп Сув сбіп Аза Гей біп сіу Бек Агд Туг Агд 145 150 155 160

Аза Нів Ппув бек РбПе Іїец Уаі! І1е АвБр АБп Уаі Меє ТПг бій Авр Аї1а 165 170 175 б1у Авр Тук ТПг Сув Ппув Рпе Іїе Нів Ап бій Авп с1іу Аза АБп Туг 180 185 190 зек Уаі ТБг Аза ТрПг Агуд бек Рпе ТПг Уа1! Гуз Авр бій сіп с1у РіБе 195 200 205 зек Гей Рібе Рго Уаі І1їе с1у Аїа Рго Аї1а біп АБп бі Іїе Гпув сіц 210 215 220

Ууаї б1іш Іїе с1у пув Авп Аза Ап Гей ТПг Сув бек Аїа Сув Рпе ШУ 225 230 235 240

Тпув б1у ТПпг біп Рпе Геш Аїа Аза Уаії Гей Тер сіп Гей АвБп сб1іу Тіг 245 250 255 пуб І1е ТПпг Авр Рпе с1у бій Рго Агуд Іїе сбіп сіп сіц біц с1у сіп 260 265 270

Зо Авп обіп бек Рібе бБег Авп сіу Гецп Аїа Сув Гей Авр Меє Уаії Іеч Агд 275 280 285

І1е Аїа Авр Уаії пув бій бій АвБр Іец Іїецй Гей сіп Туг Авр Сув Іец 290 295 300

Аза гей Авп Гец Нів бі1іу Гей Агд Агуд Ні ТПг Уаі Агд Гей бБег Агд 305 310 315 320 ув АвБп о Рго Іїе Авр Нів Нів бек Іїе Туг Сув Іїе І1е Аза Уаї1ї Сув 325 330 335 зек Уаї Рібе Іец Меє Іїецй І1їе АвБп Уа! Іешп Уаії Іїе І1їе Гей Гпув Меє 340 345 350

Рпе Тер І1їе бій Аїа ТПг Гей Гей Тер Акуд АвБр чІ1е Аїа Ппув Рго Туг 355 3З6о 365

Тпув ТПг Агуд Авп о Авр о сб1іу Ппув Гей Туг Авр Аїа Тук Уаї Уаї Туг Ркго 370 375 380

Акуд АвпоТутг Ппув бек Бек ТПг Авр біу А1ї1а бек Агуд Уаі бі Нів Ре 385 390 395 400

Уаї Нів сбіп Іїе Гей Рго Авр Уаі Гей сій Авп Гув Сув б1у Тук ТПг 405 410 415

Тец Сув І1е Тук с1у Агуд Авр Меє Гей Рго сіу сій Авр Уаї Уаї ТЕПг 420 425 430

А1ї1а Уаї сій ТБг АБп о І1е Агуд пуб бек Акуд Агуд Ні І1їе Рпе І1еє Іецй 435 440 445

ТПЕ Рго біп Іїе ТБг Нів АвБп о пув сіц Рбе Аїа Ту бій біп сі Уаї 450 455 460

А1ї1а гей Нів Сув Аза Іїецй І1ї1е сбіп АБп Авр Аї1а Гуз Уаі Іїе тей Те 465 470 475 480 бі Меє сій Аза Гей бек бій Гей Авр Меє гей сіп Аза сіц Аїа Іей 485 490 495 біп Авр бек Гей сбіп Нів Гецй Меє Гпув Уаі сіп сіу ТБг І1е Гув5 Тгр 500 505 510 бо Агуд бій Авр Нів І1е Аза Авп Гпув Агуд бек Гей АБп бек пув Рібе Тгр 515 520 525 пув Нів Уаії Агуд Тук біп Меє Рго Уа1і Рго бек пуб І1е Рго Агд Гу 530 535 540

Аза бек бек Гец ТПг Рго Гей Аїа Аїа бі1іп Гув сіп 545 550 555 «2105 353 «2115 570 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220» «223» ІЛ-1РАСР людини (Див. номер доступу СепВапк О9МРНЗ) «4005 353

Меє ТПпг Гей гей Тер Сув Уаї Уа1 бек Гей Тук Роре Тук б1у І1е Гей 1 5 10 15 біп век Авр Аза бек бій Агуд Сув Авр Авр Тер сіу Гей Авр ТПг Меє 20 Агуд біп Іїе біп Уаії Рпрпе сій Авр бій Рго Аїа Агд чІ1е Ппув Сув Рго

Тецпц Рпе бій Нів Рпе Гей Ппув Рпе Авп Туг бек ТПг Аїа Нів бек А1а бо с1у Гей ТПпг Гей Іїе Тер Туг Тер ТПг Агуд біп Авр Агуд Авр Тец бій 25 65 70 75 80 біц Ркго І1їе Авп Рпе Агд Гей Рго бій Авп Агуд І1е бек пув б1іц Гув 85 90 95

Авр Уаі1і Гей Тер Роре Агуд Рго ТПг Іец Тец АвБп Авр ТПг о1у Авп Туг 100 105 110

Зо ТП Сув Меє Гей Агуд АБп о ТПг Тс Тук Сув бек Ппув Уаі Аза Ропе Рго 115 120 125

Тец бій Уаї Уаі сбіп пув Авр Бек Сув Рпе Авп бек Рго Меєсє Гув Іей 130 135 140

Ркго Уаї Нів пуб Іецй Ту Іїе сбіцш Тук б1у І1е сбіп Агуд І1їе ТПкг Сув 35 145 150 155 160

Ркго Авп о Уаі Авр біу Тук Рпе Рго бек бек Уаі Ппув Рго ТПг Ії1е ТЕГ 165 170 175

ТЕр Тук Меє сіу Сув Тук Гув І1їе біп Авп Робе АвБп АвБп Уаі І1е Рго 180 185 190 40 сі біу Мес Авп Гей бек Рібе Гей І1їе Аїа Гецп І1їе бег АБп АБп 01Уу 195 200 205

АвпоТук ТПг Сув Уаії Уаї ТПг Тук Рго біц Авп о б1у Агкд ТП Роре Нів 210 215 220

Тецп ТПг Агуд ТпПс Гей ТпПг о Уа1! пув Уаії Уа1і сіу Бек Рго пуб АБп А1а 45 225 230 235 240

Уаї Ркго Рго Уаі Іїе Нів бек Рго Авп Авр Нів Уаї Уаї Тук б1іц Гув 245 250 255 бі Ркго сб1у бій бій Гей Гей Іїе Рго Сув ТПг Уа! Тук Ріре бек РіПе 260 265 270 50 Тен Мес Авр Бек Агуд Авп о біц Уа! Тер Тер ТПг Іїе Авр с1Уу Ппув Гув 275 280 285

Рго Авр АвБр І1е ТПг І1їе Авр Уа! ТПг І1ї1е АБп сі Бек Ії1їе бек Нів 290 295 300 зек Агуд ТПг біц Авр бій ТПг Агуд Тс обіп ч1І1е Гей бек Іїе Ппув Гув 55 305 310 315 320

Уаї ТПпг Бек бій Авр Гей Гпув Агуд бек Тук Уаї Сув Нів Аз1а Агд 5ег 325 330 335

А1їа пув сіу біц Уаі Аїа ув Аїа Аза Гув Уаії Ппув біп пув Уа1 Рго 340 345 350 бо А1а Рго Акуд Туг ТПг Уаї сій Гецп Аза Сув сб1у Рпе с1у Аїа ТіПг Уаї 355 3З6о 365

Тецп Іїецп Уаї Уаї Іїе гейш Іїе Уа1ї Уаї Тук Нів Уа1 Тук Тер Гец с1ц 370 375 380

Меє Уаї гейш Рпе Туг Агуд Аїа Нів Рпе сіу ТПг Авр біцп ТП І1е Гей 385 390 395 400

Авр с1у пув бій Туг Авр І1їе Тук Уаії бек Туг А1а Агд АвБп Аза с1ци 405 410 415 бі бій бій Рпе Уаї Гей Гей ТПпг Гей Агуд сіу Уаі1і Гей біц АвБп бій 420 425 430

Рпе сіу Тук пув Іец Сув І1е Робе АвБр Агуд Авр бек Гей Рго сі1у щу 435 440 445

І1е Маї ТБг Авр біцш тп Гей бек Роре І1е біп Ппув Бек Агуд Агд Гей 450 455 460

Тец Маї Уаї Гей Бек Рго Авп Туг Уаі Гей сбіп сіу ТБбг біп Аїа Іей 465 470 475 480 їеч бій Гецп пув Аїа с1у Гей бій Авп Мес Аза бек Акуд б1у АБп Те 485 490 495

Ап оУаі1 Іїе Гец Уаії біп Тук пув Аїа Уаії пув бій ТПг пув Уаї1ї Гув 500 505 510 біш ТГешп пув Агкуд Аїа Ппув ТпПг Уаії Гей ТПг Уаі1і! Іїе пув Тер пув 01У 515 520 525 біш Гув бек Ппув Тук Рго біп с1іу Агуд Рпе Тер пуб біп Гец бСіп Уаї 530 535 540

Аза Меє Рго Уаї пуб пуб бек Рго Агуд Агуд бек бек бБег Авр бій сіп 545 550 555 560 с1у Гей бек Тук бек бек Тецй Пув Авп Уаї 565 570 «2105 354

Зо «211» 449 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220»

З5 «223» НС ОЕ Н4АНОб675Р «4005 354 бі Маї біп Ге Уаі сій бек с1у с1у Авп Тецп бій сбіп Рго б1у щу 1 5 10 15 40 зек Геп Акуд Гей бек Сув ТПг Аза бек біу Роре ТПг Рре бек Ак9д 5ег 20 25 30

Аза Меє Авп Тер Уаі Агуд Агуд Аза Рго б1у Ппув сіу Гец біц Тгр Уаї зек сіу І1е бек біу бек сб1іу б1у Агуд ТПг Туг Туг Аїа Авр бек Уаї 45 50 55 бо пув б1у Акуд Рпе ТПг Іїе Бек Агуд Авр Ап бек Тув АБп о ТПг Іец Туг 65 70 75 80

Тец біп Меє Авп бек Гей бек Аза бій Авр ТПг Аза Аза Тук Тук Сув 85 90 95

А1їа Ппув Авр бек Туг ТПг ТпПг бек Тер Тук сіу с1у Меє Авр Уаі1ї! Тер 100 105 110 сбі1у Нів сі1у ТПг ТпПг Уа1! ТПг Уаії Бек Бек Аза бек ТПг пув С1у Ркго 115 120 125 зек Уаії РіПе Рго Іец Аза Рго Суб Бек Агуд Бек ТПг бек біц бек ТПг 130 135 140

Аза Аїа Гец сіу Суб ІТец Маії Ппув Авр Тук Рпе Рго бій Рго Уа1 ТЕГ 145 150 155 160

Уаї Бек Тгр Авп бек сіу Аїа Гец ТПг бек бі1у Уаі Нів ТПг Робе Рго 165 170 175 бо А1їа Уаї Гей біп бек бек с1іу Гецп Тук бек Гей бек бек Уаі Уа1 ТПг 180 185 190

Уаї Ркго Бек Бек бек Гей сіу ТПг Гуз ТП Тук ТПг Сув Авп Уа1 Авр 195 200 205

Нів Ппув Рго Бек Авп ТПг Гуз Уаі1 Авр Гув Агд Уаі! бій бек пув Туг 210 215 220 с1у Рго Рго Сув Рго Рго Сув Рго Аза Рго бій Рібе Гей с1у с1Уу Ркго 225 230 235 240 зек Уаї Ріпе їец Рпбе Рго Рго Пув Рго Гув Авр ТПг Гей Меє І1їе 5ег 245 250 255

Акуд ТЕ Рго біц Уаі ТПг Сув Уаії Уа1і Уаі Авр Уа1і бек біп бій Авр 260 265 270

Ркго біц Уаії біп Рпбе АвБп Тгр Туг Уаі Авр сб1у Уаі сі Уа1ї Нів Авп 275 280 285

Аза Ппув ТПг пув Рго Акд бій бій біп Рпе Ап о бег ТПг Туг Агд Уаї 290 295 300

Уаї бек Маії Гей ТПг Уаї Ге Нів сіп Авр Тер тей АБп с1у Ппув с1и 305 310 315 320

Тук Ппув Сув Ппув Уаії бек Авп о Гув біу Гей Рго Бек Бек Іїе сіц Гув 325 330 335

ТПЕ Іїе Бек пув Аїа пув біу сбіп Рго Агд біц Рго біп Уаї Тугє ТПг 340 345 350

Тецп Рго Рго Бек біп біш біц Меє ТБг пув Авп о біп Уа! бек Ге ТПг 355 3З6о 365

Сув Ге Маї Ппув с1у Рпе Тукг Рго Бек Авр Іїе Аза Уаї сі Тгр с1ц 370 375 380 век Авп біу біп Рго бій Ап Авп Туг Ппув ТПг Тбкг Рго Рго Уаі1 Іец 385 390 395 400

Авр Бек Авр біу бек РПе Рпе Гец Туг бек Агд Тецй ТПг Уа1і Авр Гув 405 410 415 зек Агд Тер біп біц б1у Авп Уаі РпПе бек Сув Бек Уа1і Меє Нів сіц

Зо 420 425 430

А1їа гей Нів Авп о Нів Тук ТПг біп губ бек Тецйп бек Гей бек Ге 0Щ1У 435 440 445

Тув

З5 «2105 355 «2115» 214 «212» БІЛОК 40 «2135 Штучна послідовність «220» «223» ТС ОЕ Н4АНОб675Р 45 «4005 355

Авр І1е сбіп Месє ТПг біп бек Рго бек бек Уа! бек Аза Бек Уаі Щ1У 1 5 10 15

Авр Акуд Уаї ТПг І1е ТПг Сув Агуд Аза Бек біп сіу І1е Рібе бег Тгр 20 25 30 50 Тем Аїа Тгр Тук сбіп біп Гпув Ркго сбі1у Ппув Аїа Рго ГУу5 Іецй Гей Іе

Туг Аїа Аїа бек бек ІТец біп бек сіу Уаі Рго Бек Акд Ріе бег 01Уу бо зек сіу бек біу ТПг Авр Рпе ТПг Іецй ТПг І1ї1е бек Бек Гей сбіп Рго 55 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аїа Іїе Туг Тук Сув біп біп А1їа Авп бек Уаі Рго Ше 85 90 95

ТПЕ Рпе сіу сіп сіу ТБг Агд Гей сіц І1е Ггубв5 Агд ТПпг Уаі Аза Аїа 100 105 110 бо Рго Бек Уа1 Рібе І1е Рре Рго Рго бек Авр біц біп Гей Ппув бБег 1У 115 120 125

ТПг АТїа бек Уа1ї Уаї Сув Іїец Гей Авп Авп Робе Туг Рго Агд сій Аїа 130 135 140 пув Маї біп Тер пув Уаі Авр Авп Аза Гец біп бек б1у АвБп бек сіп 145 150 155 160 сій бек Уаії ТПг сій біп Авр бек Пув Авр бек ТПг Туг бек Гей 5ег 165 170 175 зек ТПг Гец ТПг Іец бек Гув Аза Авр Тук бій Ппув Нів Ппув Уаї Туг 180 185 190

Аза Сув біц Уаї ТПгЕ Ні біп сіу Іецй бек бек Рго Уа1і ТПг Ппув бег 195 200 205

Рпе Авп Агд сбіу б1іц Сув 210 «2105 356 «211» 166 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» ІЛ-З33 ЛЮДИНИ З НЕХА-НІВ ТЗГОМ (АМІНОКИСЛОТИ 112-270

НОМЕР ДОСТУПУ СЕМВАМК М. 095760) «4005 356

Меє бек Іїе ТпПкК с1у І1їе бек Рго І1е ТПг сій Туг Гецп Аїа бек Іецй 1 5 10 15 зек ТПг Туг Авп Авр о біп бек І1е ТПг Рпе Аї1а Гей бій Авр сій 5ег 20 25 30

Тук біц Іїе Тук Уаї біц Авр Гей пув Пув Авр обі Ппув Гпув Авр о Гув

Зо 35 40 45

Уаї Гей Гей Бек Тук Тук біц Бек біп Нів Рго бБег АвБп бій бек Ш1У 50 55 бо

Авр с1іу Маії Авр б1і1у Гпув Меє Гїец Меє Уаї ТПг Гей бек Ркго ТПг Гу 65 70 75 80

Авр Рпе Тер Темп Нів Аза Авп АБп о Ппув сій Нів бек Уаії сій Гечц Нів 85 90 95

Тпув Сув бій пув Рго Гей Рго Авр сіп Аїа Рібе Робе Уаї Іецй Нів Авп 100 105 110

Ме Нів Бек Авп Сув Уа1 бек Рпе бій Сув Пув ТПг Авр Рго Сіу Уаї 115 120 125

Рпе Іїе сі1у УМаї пув Авр АвБп Ніб Іец Аза Гей Іїе пуб Уаї Авр 5ег 130 135 140 зек біц Авп Тец Суб ТПг бій АвБп о І1е Іїецй Рпе Ппув Гей бек бій ТЕГ 145 150 155 160

Нів Нів Нів Нів Нів Нів

Claims (19)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб: (ї) лікування запального захворювання або розладу дихальних шляхів або легень суб'єкта; (і) лікування легеневого фіброзного захворювання або розладу у суб'єкта; або (ії) запобігання або зниження тяжкості алергічної реакції в дихальних шляхах або легенях суб'єкта; де спосіб включає введення суб'єкту, який потребує цього, однієї або більше доз терапевтично ефективної кількості антагоніста ІЇ/-33 в комбінації з однією або більше дозами терапевтично ефективної кількості антагоніста рецептора інтерлейкіну-4 (ІІ -4Н), де антагоніст ІЇ/-33 являє собою моноклональне антитіло, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (НСМК), що містить три ділянки важкого ланцюга, які визначають 60 комплементарність (НСОК), НСОКІ, НСОКЗО2 і НОСОК, які містять амінокислотні послідовності ЗЕО І МО: 276, 278 і 280, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга (І СУК), що містить три ділянки легкого ланцюга, які визначають комплементарність (СОМ), ГСОК1, І СОКЗ2 і І СОКУ, які містять амінокислотні послідовності БЕО ІЮО МО: 284, 286 і 288, відповідно, і де антагоніст ІІ -4К являє собою моноклональне антитіло, яке містить НСМЕК, що містить три НеСОК, НСОКІ1, НОСОК і НСОКЗ, які містять амінокислотні послідовності 5ЕО ІЮ МО: 339, 340 і 341, відповідно, і ГГ СМК, що містить три ГСОК, СОК1, І СО ії СОКУ, які містять амінокислотні послідовності зЕО ІЮ МО: 342, 343 і 344, відповідно.

2. Спосіб: (ї) лікування запального захворювання або розладу дихальних шляхів або легень суб'єкта; (і) лікування легеневого фіброзного захворювання або розладу у суб'єкта; або (ії) запобігання або зниження тяжкості алергічної реакції в дихальних шляхах або легенях суб'єкта; де спосіб включає введення суб'єкту, який потребує цього, однієї або більше доз терапевтично ефективної кількості антагоніста ІЇ/-33 в комбінації з однією або більше дозами терапевтично ефективної кількості антагоніста рецептора інтерлейкіну-4 (ІІ -4Н), де антагоніст ІЇ/-33 являє собою моноклональне антитіло, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (НСМК), що містить три ділянки важкого ланцюга, які визначають комплементарність (НСОК), НСОКІ, НСОК2 і НСОКЗ, які містять амінокислотні послідовності ЗЕО І МО: 276, 278 і 280, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга (І СУК), що містить три ділянки легкого ланцюга, які визначають комплементарність (СОМ), ГСОК1, І СОКЗ2 і І СОКУ, які містять амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮО МО: 284, 286 і 288, відповідно, і де антагоніст ІІ -4К являє собою моноклональне антитіло, яке містить НСМЕК, що містить три НеСОК, НСОКІ1, НОСОК і НСОКЗ, які містять амінокислотні послідовності 5ЕО ІЮ МО: 339, 340 і 341, відповідно, і ЇСМК , що містить три ГСОК, ІСОКІ, 1СОкК2 ії ІСОКЗ, які містять амінокислотні послідовності зЕО ІЮ МО: 342, 343 і 344, відповідно.

3. Спосіб за п. 1 або 2, де запальне захворювання або розлад дихальних шляхів або легень вибрано із групи, яка складається з: астми, хронічної обструктивної хвороби легень (СОРОБ), астми і поєднаного синдрому СОРО (АСОБ5), хронічного бронхіту, емфіземи, хронічного риносинуситу з або без поліпів носа, гіперчутливого пневмоніту й алергічного риніту.

4. Спосіб за п. 1 або 2, де легеневе фіброзне захворювання або розлад вибрано із групи, яка Зо складається з: ідіопатичного легеневого фіброзу, фіброзу, пов'язаного з гострим пошкодженням легень або гострим респіраторним дистресом, силікозу, радіаційного фіброзу, блеоміцин- індукованого легеневого фіброзу або облітерувального синдрому бронхіоліту.

5. Спосіб за п. 3, де запальне захворювання або розлад являє собою астму.

б. Спосіб за п. 5, де астма посилюється одним або більше з таких чинників: вірусне захворювання, бактеріальна інфекція, вплив алергену, вплив хімічної речовини або хімічних парів або вплив подразника навколишнього середовища або забруднення повітря.

7. Спосіб за п. 5, де астма являє собою еозинофільну астму, нееозинофільну астму, стероїд- резистентну астму або стероїдчутливу астму.

8. Спосіб за п. 3, де запальне захворювання або розлад являє собою хронічну обструктивну хворобу легень (СОРОЮ).

9. Спосіб за п. 8, де хронічна обструктивна хвороба легень посилюється одним або більше з таких чинників: астма, вірусне захворювання, бактеріальна інфекція, вплив алергену, вплив хімічної речовини або хімічних парів або вплив подразника навколишнього середовища, або забруднення повітря.

10. Спосіб за п. 8, де хронічна обструктивна хвороба легень виникає в результаті або частково посилюється сигаретним димом.

11. Спосіб за будь-яким із пп. 1-10, де антагоніст І/-33 ії антагоніст І/-4К призначені для застосування в комбінації з одним або більше додатковими терапевтичними засобами, корисними для полегшення запального захворювання або розладу. БО

12. Спосіб за п. 11, де один або більше додаткових терапевтичних засобів вибрані з групи, яка складається з нестероїдного протизапального засобу (М5АЇ!Ю), кортикостероїду, бронхіального дилататора, антигістаміну, епінефрину, протинабрякового засобу, антагоніста тимального стромального лімфопоетину (Т5І Р), антагоніста ІІ -1, антагоніста ІІ -8, антагоніста 1-13, іншого антагоніста 1-4, подвійного антагоніста 1І-А4/ЛІ-13, | -ЗЗ/подвійного антагоніста 11-13, антагоніста 1-5, антагоніста 1ІЇ-6, антагоніста 1/-12/23, антагоніста 1І/-22, антагоніста ІІ -25, антагоніста 1-17, антагоніста 1-31, інгібітору ТМЕ, інгібітору ЧЕ, інгібітору лейкотрієну, перорального інгібітору РОЕ4, метилксантину, недокромілу натрію, кромоліну натрію, бета 2- агоніста тривалої дії (ГАВА), мускаринового антагоніста тривалої дії (ГАМА), інгаляційного кортикостероїду (ІС5) й іншого антагоніста 1-33.

13. Спосіб за п. 12, де інший антагоніст І/-33 вибраний із групи, яка складається з іншого антитіла до 1-33, пастки на основі іншого рецептора 1-33, антитіла 512, розчинного рецептора 512, антагоніста рецептора 1-33, відмінного від 512, антагоніста ІЇ/-1КАсР й антитіла, яке взаємодіє з комплексом 1--33/5тТ2.

14. Спосіб за будь-яким із пп. 1-13, де антагоніст ІІ-33 і антагоніст ІІ -4К знаходяться в окремих складах для введення суб'єкту, який потребує цього.

15. Спосіб за будь-яким із пп. 1-13, де антагоніст І-33 і антагоніст ІІ -4К приготовані разом для введення суб'єкту, який потребує цього.

16. Спосіб за будь-яким із пп. 1-15, де антагоніст І/-33 ії антагоніст І/-4К призначені для підшкірного, внутрішньовенного, внутрішньом'язового або інтраназального введення суб'єкту.

17. Спосіб за будь-яким із пп. 1-16, де антагоніст І-33 містить НСУК, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 274 або послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності зЕО ІЮ МО: 274, і ЇСМК, що містить амінокислотну послідовність ЗБЕО ІЮ МО: 282 або послідовність яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності зЕО ІЮ МО: 282.

18. Спосіб за будь-яким із пп. 1-17, де антагоніст ІЇ-4Е містить НСМК, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 337 або послідовність яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності зЕО ІЮ МО: 337, і ГСМУК, що містить амінокислотну послідовність ЗБЕО ІЮ МО: 338 або послідовність яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності зЕО ІЮ МО: 338.

19. Спосіб за будь-яким із пп. 1-18, де антагоніст І-33 містить НСУК, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 274, і І СМК, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 282, де антагоніст І-4АК містить НСМУК, що містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 337, і І СУ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 338. ГО 3 і соч нн ВВ ВВ ЇМ. Бак ку що . МІ в М Мо ! З і ши т о й . В Мі м мі м: с в

Фіг.

ще ше ех ; : хх ; ск МЕЖ З Ж Бе я | з як і 5 х ШшЖОО-- 5 : М г х сосен ; я ї М Ж Ж І і З ешК 1 ! І Ше ОВ : і і їх лу ї учні до о | ря г же оо 3 ; з : : От. « ще « і фе - ро ! ккжжфнкннки ей і : секодоюську сі ее У Фовблді беюфлннюї 0 ре ре Ка ко бак як ї- п Ж ДЕ ра р фон е : їжа сх Ж х, ск КО СН с ; Гкестозиці Ж НІ я ТК одесі НОВ вся з й я Бкстоннці зум ММ дове ЖЖ рено ВО сок ВОМ доро ЗМ Я ннненююняяй Ко Косеюєкичнясой ши нин Кссєюєєтюєстсняй ор ду олово дз. акме Я КК ким кокон Кх мой я У МЕ ся Варка» й ТК Важ ах ДОК дини Ді Де

Фіг. я З : ска, : : і фан ною на о отв ов п опо А Ак кового пан зач и ВО З Я а ще З звідесє г х 3 - | і х ке ; ї. ке сопе: ЕНН Ж чех ї | і В «хх З ї НЕ ее що ЩЕ | - їх мн о . е З КВК я х жа

- А. : о. чернх З З МОЯ і ? Ох З сх. і | Еш о. її яКовоки іх ооо сіті соккек дк КУМ охо Ом оо еюктрлхх зла ее вант екв пев : НІ МО НІНЕ ЕІ НО МО ЗБОВВаНеВе у Мк, 1 теж. З яЖ. із важ. ТНК; Ки: т МВ. Жюжанняі о : «из ВЕК бущемай 0 кеВ антннном: Кевде Нема не ще че звеМе АКБ

Фіг. З

А в щ фен нене Е Ж 4 ; фе Щ Є: і хх лекяфжнях о Я к :

5 . З : Ж х ! ; і о о. У : З ке сов . са В «БЕ : ВВЕ; КК МОМ о. о. і - як с КОКО КОВО КВК МЕ се Еш пк й в Є 3 пеефресн, ке ї ; і ее що ей шо» : о. Е - : . : КК НннннниХ в ча | о. о - Я ему : ККУ КОХ НМ не о шо . з. ПИТИ ШИ В х їх в ще Кв Женский вом ном нечи но ном ном тривав Баня тн. ТЕЖ, "БЕТВК. ЛчВЖ. БЕН. я ТІК Ярі шк тс ї ко ях ННІ . І соня МЕОВОНОЮ 0 НеАав КееМІюЮ НОМ Неща Ме Надає вро зщене че ків най (ріг. А вай ї х : тех вч ср ; ї т Ї хе я ; о. | 5 Ж : / Є ож ше ше ех в ве перех Б о о НН НН Ж :: ШІ ШЕ в п в. о Е ППІВКИИИОЙ ПЕКИ о -е ; о А кох ех ШІ. . с о. Ех ПШТШИПИИИЙ КАК ЕХ х 4 ї і ев. о. о х : квир ння ЗО : - | 8 я о. о се ок їх їх ох ХХХ с ЖЖ З ! скфех шах не -- . ж невоввя нойрох и

І . зе хо ШИ сов у с. ще Агент екю М | НЕ НО но ОМ НІ ВІНЯ Говивавюве мн леж. 1твж. як ТЕ. Я Тзяж. ОМ Мкуванню | ок ББОВОМО ймйуне веною ВНТЕТЛОВ: о Неве Нева Нева ке з «фцЯк 0 ИНА

Фіг. ав

ВО рн о ак Й ї- -- Я і» нини сш ве нн 4 ! ж І « Б-- Ж і ян ЕЕ ВЕН Е ве ВИ Ж щ У , ссуайв віх. кайф З шо ЖЕ я св я я ж й - ; Же | пи тк гля Х ПИШИ ППП ЯВИТИТИТИВ. ОВК я-е Бу ПИШИ ИИИИИИТИВ ПИЛИ ЕК Бо м ш ш. вч РЕ нен 0 ВХ и, КОСООЕЯ їм КЗ | поко 0 БО о. В е с ово о ОК З ей - ЯВКУ ПИШИ вки у ВІК ВЕЖУ 8 Е чо А панни ; 1 о. 5 ке вх ї х ВЕНУ є і Б ї ЕОООщО4 о Її. З У 3 сего думок, сяг ЦН з 55 су: г: рак пк п ШИ ном ном ном ном ном ном ітрняанеть: НК тяж Мк тео ях. Тож. Ток Й ях. п Ланки Й що оди ВЕОМУОЮ Фуврмай КОМІ ю ЗНЕНТНАОМ: ее Нема Кг кох зви чи ДУПЛІ тріг. 5 ж Ж Ж фенннннтнннтенентннннтснсоесотоенн зпннтюссстсн Ов» ЖЕ ВВЕ й КЕ 503 ш ї - ; БЕ З Ь ЖЕ ЕЕ : 5-5 ЩО що Ж (зе Ж х ме 5 5

В . : і дей о оф, 200- 53 т сов Зовні Ме 1 се на: В х ПК ще : ІЗ меня У п ме ОО кое Минтектювцї С ном ном ном ном пом ном ЕТриВатеть реч Таж 1. татюв. Толя. МЕтиЖ. зУтЖ. . ТИЖ. Пування ще за ВЕС Дупеяней 0 БЕеОюЗБе зонпном: беж Ноше Наші що зн" звибає УЛ хріг. 6

А ЯМ й а БИ і Ї ж ! Ї їх Ех ГУ з я ї Си 5 : ї ве зи ж Е 4

В.Я . ї ем ооо Уа в : З КОН БУ ! і : ОО ке ї ВИНИК в'я ПО Кг, і ' 0 пам : о - : ї п з хх з мот ююкююх ВКИЕе т т во с і с | . з НИ ПТК ШИК ах. Я о и: / щ ях Я КЕ КК МЕ У яр " МОЯ з Ко : хе т ШИНИ ВОВК КЕКВ момох з о. ї ПЕОщЖ 0 Кок ВЕК Сх З . : Ус Е У п. ; У сих 0 Доовефювню» не оон росою росою пооооефресос осот Киеві НІЖ Но Ім НІ не но т тома. ОХ ах ча Кк Хе їежкзшх Клще ІТОКЕЗИ Ох реак Тік. БЕЖ. БНЕЖ, ТИЖ, тет БНВК. Жеувжння | «зв ВЕОЗНУБО» Дефене нЕсВНЄ ЗЕНИК МеВ Мевае НЕБЕХ Я оре; ЗМ 0 еаев

Фіг. А З фун тютюну . ; 1 Ох я йЖ ака В з пиффня, і ща» і З ее З ек з ї У | ; и з ! в о ЗО бе Ж і ! о ї : і БЖ они. - З -щної пер : в Ме і ! «к ; ! БО сек се ї ! й ї Б і ї х ШИНИ 5 і ї З ; ї : НН осо

8: . Зя 5 З не дкмррккх і І йк . : ВИ 0 ї . ї ПЛИНИ ПИНИН х олег о кн дення скіни ЯК орнініжінчня рн «УМО омммюмимня мо ню І г Ди к Мнізвнаі 00 вв зе мом ним НЕ нак у 0 ке . г ке о на ді, НВКЕМеЮН ЧЕ жк І8 тик. «будшко и Кевх. ее, ТУТАЖ, Жкрання що . сне ВЕС Дю Веоаю ЗНЕНК Вкх Межа Немх КЕ зів? «виЗяи 0 еВукякаї

Фіг. 78

Бя НО о Денне няння ш ж Ж фонетично нене ; а ! зем фреееекектеето ооо жест циесететкткт с ронаннини | ЕЕ рн ' Хм 4 сефдссе ши ї же - а ї в ! 5 ; т й ! Ж зно ! о як ЖУК ХЖУМИ ві ТОК Ку х ФІШКИ Бу х ШИШКИ Це і МОН 5 Її о

5 с. 5 ! о : Є с ; МОМ коке во ЯМУ ОО о ШІ с щ

Ко . и БВ шк ши ша ке на

! в. о. х Дон У пед Ж НЕ ; вет ах я с су зе о Вк, КЕНЕ о сузаин НЕ не нош но нов зе Не ши : ліс ПЕ пода мой пори но но зим ВЕОМЗБОВ Дюна кЕОЮЗКЮ ВИПКЛНОМ 0 ЧещОЄ М Нащає ВТ зівсае зів? рема;

Фіг. 6 ї КК ооо ооо лап АЛ АККК КК ККккююкикю я Днннннненннентепнннннодннткнное шен Еш ! Е З - х а Ж ж 8 ЕЕ КУ ХЕ «Б пкн що 300» -- Е : т і я і 5 : Ж й 2 ее 00 - Ї хх ї Я НЕ : В х у і ННЯ З 5 5 сфе - і й мой і - і сфе я ї я 7 у Е со о, Ме ее я о. ! БО І о. ї і Ки ї Ще . ЕМ В ; зодВ ААдкАЛя КК КМ рвнвккх ооо Дюк Хан УВЕВИККК В ня щ- сш се сх г о зах кешу Як ко ЯН нем МЕНА НЕ не АЕН СКМ сн що зда затих хх «не Зк. ен йон іітяж. ТУЯ. РУТ. ТЕЖ. ТЯ ю Ва «ж НЕШКІООІ Диїнеюі АЕОМЕБОЇ днтятвюВА Векок Немає Неває Я ее о 0 еДнвука фіг. З