JP2023175785A - 炎症性状態の処置方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】炎症性状態を処置するための方法を提供する。
【解決手段】炎症性疾患、またはＩＬ－３３およびＩＬ－４のレベルの上昇に関連するもしくはそれらに一部起因する状態、特に炎症性肺疾患を処置するための方法を提供する。本発明の方法は、上記処置を必要とする対象に１つ以上の治療有効用量のＩＬ－３３アンタゴニストを単独で、または１つ以上の治療有効用量のＩＬ－４Ｒアンタゴニストと組み合わせて投与することを含む。ある特定の実施形態において、本発明の方法は、増強されたＩＬ－３３媒介シグナル伝達およびＩＬ－４媒介シグナル伝達によって一部媒介される任意の炎症性疾患または状態を処置するためのアンタゴニストの使用を含む。
【選択図】図４Ａ

Description

本発明は、炎症性状態を処置するための方法であって、それを必要とする対象に治療有効量のインターロイキン－３３（ＩＬ－３３）アンタゴニストを単独で、またはインターロイキン－４（ＩＬ－４）アンタゴニストと組み合わせて投与することを含む方法に関する。より具体的には、本発明は、治療有効量のインターロイキン－３３（ＩＬ－３３）抗体を単独で、またはインターロイキン－４Ｒ（ＩＬ－４Ｒ）抗体と組み合わせて投与することにより、炎症性もしくは閉塞性肺疾患または障害を処置することに関する。
炎症は、宿主による防御反応として開始されるが、しばしば全身性の病変をもたらし得る。先進国では、喘息、アレルギー、および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの炎症性肺疾患が増加しており、医療費に大きな影響をもたらしている。いくつかの炎症細胞およびそれらのメディエーターは、これらの疾患の発症および進行に関与している。ある特定の場合において、これらの疾患は、好酸球、好塩基球、肥満細胞、ＣＤ４＋Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞、グループ２自然リンパ球（ＩＬＣ２）、インターロイキン４（ＩＬ－４）および／またはＩＬ－１３誘導性マクロファージを伴った組織の浸潤、ならびに血清ＩｇＥ中の上昇およびサイトカインＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９、およびＩＬ－１３の増加を特徴とする、２型免疫の結果を反映する。
炎症性肺疾患で役割を果たすと考えられる１つのサイトカインは、アレルゲン、ウイルス、または煙などの傷害に応答して損傷した上皮組織によって放出される炎症誘導性サイトカインであるインターロイキン－３３（ＩＬ－３３）である。ＩＬ－３３は、Ｔヘルパー－２（Ｔｈ２）関連サイトカイン（例えば、ＩＬ－４）の産生を強力に引き起こすインターロイキン－１（ＩＬ－１）ファミリーのメンバーである。ＩＬ－３３は、線維芽細胞、肥満細胞、樹状細胞、マクロファージ、骨芽細胞、内皮細胞、および上皮細胞などの非常に様々な種類の細胞によって発現される。インターロイキン－３３（ＩＬ－３３）は、Ｔｏｌｌ様／インターロイキン－１受容体スーパーファミリーメンバーであるＳＴ２（「腫瘍形成抑制因子２（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ２）」と称されることもある）のリガンドであり、該ＳＴ２は、アクセサリータンパク質ＩＬ－１ＲＡｃＰ（「インターロイキン－１受容体アクセサリータンパク質」、総説については、例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３、特許文献１、特許文献２を参照のこと）と結合する。ＩＬ－３３によってＳＴ２／ＩＬ－１ＲＡｃＰが活性化されたとき、ＭｙＤ８８（骨髄分化因子８８）およびＴＲＡＦ６（ＴＮＦ受容体関連因子６）などの下流の分子を介してシグナル伝達カスケードが引き起こされ、特に、ＮＦκＢ（核因子－κＢ）の活性化をもたらす。ＩＬ－３３シグナル伝達は、本明細書に開示されている炎症性肺疾患を含む様々な疾患および障害における要因として関与している。（非特許文献３）。ＩＬ－３３シグナル伝達の阻害剤は、例えば、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８、および特許文献１９に記載されている。
インターロイキン－４（ＩＬ－４、Ｂ細胞刺激因子またはＢＳＦ－１としても知られる）はまた、アレルギー性およびＴヘルパー細胞２型（Ｔｈ２）極性化（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）炎症プロセスを駆動する重要なサイトカインとして関与している。ＩＬ－４は、Ｔ細胞、肥満細胞、顆粒球、巨核球、および赤血球の増殖刺激を含む広範囲の生物学的活性を有することが示されている。ＩＬ－４は、休止Ｂ細胞におけるクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体分子の発現を誘導し、刺激されたＢ細胞によってＩｇＥおよびＩｇＧ１アイソ
タイプの分泌を促進する。ＩＬ－４の生物学的活性は、ＩＬ－４に対する特異的細胞表面受容体によって媒介される。ヒトＩＬ－４受容体アルファ（ｈＩＬ－４Ｒ）（配列番号３４７）は、例えば、特許文献２０、特許文献２１、および特許文献２２に記載されている。ｈＩＬ－４Ｒに対する抗体は、特許文献２３、特許文献２４、および特許文献２５に記載されている。ｈＩＬ－４Ｒに対する抗体の使用方法は、特許文献２６、特許文献２７、特許文献２８、および特許文献２９に記載されている。
肺の炎症性疾患を処置するための現在の療法は、例えば喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を患っている患者における安全性および有効性の改善、特に増悪の軽減について大きな余地を残している。抗炎症薬および気管支拡張薬の多くの吸入用の組み合わせが利用可能であるにもかかわらず、多くの患者は増悪を経験し続けている。増悪は全身性コルチコステロイドの使用を必要とする場合があり、該コルチコステロイドはその免疫中和能力が広範であるゆえに有効であるが、骨量減少および感染症を含む望ましくない副作用を有する。いくつかの生物学的療法は、そのほとんどが単一の免疫メディエーターを標的としており、喘息およびＣＯＰＤについては開発の後期段階にある。しかしながら、炎症環境の複雑さゆえに、これらの薬剤はおそらくその使用が制限されるであろう。
したがって、炎症性肺疾患、例えば本明細書に記載されているものを処置および／または予防するための療法の新規な組み合わせについてのまだ満たされていない必要性が当該技術分野には存在している。
ＵＳ２０１０／０２６０７７０ ＵＳ２００９／００４１７１８ ＵＳ９，４５３，０７２ ＵＳ８１８７５９６ ＵＳ２０１３／１７３７３７６１ ＵＳ２０１４／０２１２４１２ ＵＳ２０１４／０２７１６５８ ＵＳ２０１４／０２７１６４２ ＵＳ２０１４／０００４１０７ ＷＯ２０１５／０９９１７５ ＷＯ２０１５／１０６０８０ ＷＯ２０１１／０３１６００ ＷＯ２０１４／１６４９５９ ＷＯ２０１４／１５２１９５ ＷＯ２０１３／１６５８９４ ＷＯ２０１３／１７３７６１ ＥＰ１７２５２６１ ＥＰ１０８１５９２１Ａ１ ＥＰ２８５０１０３Ａ２ 米国特許第５，５９９，９０５号 米国特許第５，７６７，０６５号 米国特許第５，８４０，８６９号 米国特許第５，７１７，０７２号 米国特許第７，１８６，８０９号 米国特許第７，６０５，２３７号 米国特許第５，７１４，１４６号 米国特許第５，９８５，２８０号 米国特許第６，７１６，５８７号 米国特許第９，２９０，５７４号
Ｋａｋｋａｒ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ－Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ７（１０）：８２７－８４０（２００８） Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２３：４７９－４９０（２００５） Ｌｉｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ－Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１０：１０３－１１０（２０１０）
本発明のある特定の態様によれば、炎症性疾患もしくは障害または炎症性疾患もしくは障害に関連する少なくとも１つの症状を処置するための方法であって、それを必要とする対象に治療有効量のインターロイキン－３３（ＩＬ－３３）アンタゴニストの１回以上の用量を単独で、もしくは治療有効量のインターロイキン－４（ＩＬ－４）アンタゴニストの１回以上の用量と組み合わせて投与すること、またはそれを必要とする患者にＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４αアンタゴニストを含む医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。一実施形態において、ＩＬ－４アンタゴニストと組み合わせたＩＬ－３３アンタゴニストの投与は、ＩＬ－３３アンタゴニスト単独またはＩＬ－４アンタゴニスト単独の投与で観察される治療有効性と比較して治療有効性の増強をもたらす。
ある特定の実施形態において、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＩＬ－３３シグナル伝達および／またはＩＬ－３３と細胞受容体（例えばＳＴ２）もしくは共受容体（ｃｏ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（例えば、ＩＬ－１ＲＡｃＰ）もしくはそれらの複合体との間の相互作用を阻止、減弱、または妨害することができる任意の薬剤である。上記のいずれも、ＩＬ－３３の少なくとも１つの生物学的活性を阻止または阻害し得る。
ある特定の実施形態において、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＩＬ－３３に結合しもしくはそれと相互作用し、ＩＬ－３３とその受容体ＳＴ２との相互作用を阻止し、ＳＴ２と共受容体ＩＬ１－ＲＡｃＰとの相互作用を妨げもしくは阻害し、またはシグナル伝達複合体の形成を妨げる抗体である。一実施形態において、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ヒトＩＬ－３３に結合するまたはそれと特異的に相互作用するモノクローナル抗体である。一実施形態において、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ヒトＩＬ－３３に結合するまたはそれと特異的に相互作用する受容体ベースのトラップ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂａｓｅｄ ｔｒａｐ）である。
一実施形態において、ＩＬ－４アンタゴニストは、インターロイキン－４受容体（ＩＬ－４Ｒ）アンタゴニストである。
一実施形態において、ＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、ＩＬ－４ＲαまたはＩＬ－４Ｒリガンドに結合しまたはそれらと相互作用し、１型および／または２型ＩＬ－４受容体の正常な生物学的シグナル伝達機能を阻害または減弱する任意の薬剤である。一実施形態において、ＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、ヒトＩＬ－４Ｒαに特異的に結合するモノクローナル抗体である。一実施形態において、ＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、ＩＬ－４Ｒαに結合し、Ｉ型またはＩＩ型受容体のいずれかを介したＩＬ－４およびＩＬ－１３媒介シグナル伝達の両方を阻止するモノクローナル抗体である。一実施形態において、ヒトＩＬ－４Ｒαに特異的に結合し、ＩＬ－４およびＩＬ－１３媒介シグナル伝達の両方を阻止するモノクローナル抗体は、デュピルマブ（ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）またはその生物学的等価物である。一実施形態において、炎症性障害または状態を処置する方法は、配列番号２７４／２
８２の重鎖可変領域／軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列対を有するＲＥＧＮ３５００、および配列番号３３７／３３８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を有するデュピルマブの組み合わせを使用することによって達成される。
一実施形態において、本発明の方法によって処置可能な炎症性疾患または障害は、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息およびＣＯＰＤオーバーラップ症候群（ＡＣＯＳ）、アトピー性皮膚炎、鼻ポリープ、アレルギー反応、慢性気管支炎、気腫、鼻ポリープを伴うまたは伴わない慢性鼻副鼻腔炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性肺炎、多発性硬化症、関節炎（変形性関節症、リウマチ性関節炎、および乾癬性関節炎）、アレルギー性鼻炎、線維症、好酸球性食道炎、血管炎、蕁麻疹、チャーグ・ストラウス症候群、炎症性疼痛、および乾癬からなる群から選択される。
一実施形態において、喘息は好酸球性喘息である。
一実施形態において、喘息は非好酸球性喘息である。
一実施形態において、喘息はアレルギー性喘息である。
一実施形態において、喘息は非アレルギー性喘息である。
一実施形態において、喘息は重症難治性喘息である。
一実施形態において、喘息はステロイド抵抗性喘息である。
一実施形態において、喘息はステロイド感受性喘息である。
一実施形態において、喘息はステロイド難治性喘息である。
一実施形態において、喘息は喘息増悪である。
一実施形態において、炎症性疾患または障害が緩和され、またはその重症度、持続期間、もしくは発生頻度について軽減され、あるいは炎症性疾患または障害に関連する少なくとも１つの症状が緩和され、またはその重症度、持続期間、もしくは発生頻度について軽減される。
一実施形態において、以下のパラメータのうちの任意の１つ以上によって測定した場合に、治療有効量のＩＬ－３３アンタゴニストの１回以上の用量を単独で、または治療有効量のＩＬ－４Ｒアンタゴニストの１回以上の用量と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することにより、治療有効性の増強がもたらされる：
ａ）組織試料中の好酸球、活性化Ｂ細胞、活性化ＣＤ８Ｔ細胞、もしくはＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞比のうちの１つ以上の頻度の減少、
ｂ）組織試料中のインターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１β）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－５（ＩＬ－５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、もしくは腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）レベルのうちの１つ以上の低下、または
ｃ）組織試料中のＩｌ４、ｌｌ５、Ｉｌ６、Ｉｌ９、Ｉｌ１３、Ｉｌ１ｒｌ１、Ｉｌ１３ｒａ２、ｔｎｆ、Ｔｇｆｂ１、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ１１、Ｃｃｌ２４、Ｃｏｌ１５ａ１、もしくはＣｏｌ２４ａ１のうちの１つ以上の遺伝子発現レベルの低下。
一実施形態において、さらに以下のうちの１つ以上によって測定した場合に、治療有効
量のＩＬ－３３アンタゴニストの１回以上の用量を単独で、または治療有効量のＩＬ－４Ｒアンタゴニストの１回以上の用量と組み合わせて、それ必要とする対象に投与することにより、治療有効性の増強がもたらされる：
ｄ）血清ＩｇＥレベルの低下、
ｅ）肺における杯細胞化生の減少、
ｆ）肺硬化の改善、または
ｇ）肺における上皮下繊維化の減少。
一実施形態において、組織試料は肺から得られる。
一実施形態において、組織試料は、肝臓、腎臓、心臓、または全血からなる群から選択される。ある特定の実施形態において、血球、血清、または血漿は、上記のパラメータのうちの１つ以上の測定に使用され得る。
一実施形態において、本発明の方法によって処置可能な慢性閉塞性肺疾患は、以下のうちの１つ以上：喘息、ウイルス性疾患、細菌感染、アレルゲンへの曝露、化学物質もしくは化学煙霧への曝露、または環境刺激物もしくは大気汚染への曝露によって増悪する。
関連する実施形態において、本発明の方法によって処置可能な喘息は、以下のうちの１つ以上：ウイルス性疾患、細菌感染、アレルゲンへの曝露、化学物質もしくは化学煙霧への曝露、または環境刺激物もしくは大気汚染への曝露によって増悪する。
ある特定の実施形態において、本発明の方法によって処置可能な喘息は、好酸球性喘息、非好酸球性喘息、ステロイド抵抗性喘息、およびステロイド感受性喘息からなる群から選択される。
一実施形態において、本発明の方法によって処置可能な慢性閉塞性肺疾患は、タバコの煙に起因し、またはタバコの煙によって一部増悪する。
一実施形態において、本発明の方法によって処置可能な慢性閉塞性肺疾患を患っている患者は、好酸球数の増加を示してもよいし、または示さなくてもよい。
一実施形態において、本発明の方法によって処置可能な喘息およびＣＯＰＤオーバーラップ症候群（ＡＣＯＳ）を患っている患者は、好酸球数の増加を示してもよいし、または示さなくてもよい。
本発明の第２の態様は、炎症性疾患もしくは障害または炎症性疾患もしくは障害に関連する少なくとも１つの症状を緩和するのに有用な有効量の１つ以上の追加の治療剤を、治療有効量のインターロイキン－３３（ＩＬ－３３）アンタゴニスト、例えばＩＬ－３３抗体またはＩＬ－３３トラップ、および治療有効量のインターロイキン－４（ＩＬ－４）アンタゴニスト、例えばデュピルマブなどのＩＬ－４Ｒ抗体、またはそれらの治療等価物と組み合わせて投与することによって、炎症性疾患もしくは障害または炎症性疾患もしくは障害に関連する少なくとも１つの症状を処置することを提供する。
一実施形態において、１つ以上の追加の治療剤は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド（例えば吸入コルチコステロイドまたはＩＣＳ）、長時間作用型β２アドレナリンアゴニスト（ＬＡＢＡ）、長時間作用型ムスカリンアンタゴニスト（ＬＡＭＡ）、気管支拡張薬、抗ヒスタミン薬、エピネフリン、鬱血除去薬、胸腺間質性リンホポエチン（ＴＳＬＰ）アンタゴニスト、ＩＬ－１アンタゴニスト、ＩＬ－８アンタゴニスト、ＩＬ－１３アンタゴニスト、ＩＬ－４アンタゴニスト、ＩＬ－４／ＩＬ－１３デ
ュアル（ｄｕａｌ）アンタゴニスト、ＩＬ－３３／ＩＬ－１３デュアルアンタゴニスト、ＩＬ－５アンタゴニスト、ＩＬ－６アンタゴニスト、ＩＬ－１２／２３アンタゴニスト、ＩＬ－２２アンタゴニスト、ＩＬ－２５アンタゴニスト、ＩＬ－１７アンタゴニスト、ＩＬ－３１アンタゴニスト、ＴＮＦ阻害剤、ＩｇＥ阻害剤、ロイコトリエン阻害剤、経口ＰＤＥ４阻害薬、メチルキサンチン、ネドクロミルナトリウム、クロモリンナトリウム、長時間作用型ベータ２アゴニスト、および別のＩＬ－３３アンタゴニスト（例えば、ＩＬ－３３に対する異なる抗体、異なるＩＬ－３３受容体ベースのトラップ、ＳＴ２アンタゴニスト（ＳＴ２に対する抗体を含む）、可溶性ＳＴ２受容体、もしくはＳＴ２以外の別のＩＬ－３３受容体に対するアンタゴニスト、もしくはＩＬ－１ＲＡｃＰアンタゴニスト（ＩＬ－１ＲＡｃＰに対する抗体を含む）、またはＩＬ－３３／ＳＴ２複合体と相互作用する抗体）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本発明は、中等度から重度の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を処置するための方法であって、例えば、吸入コルチコステロイド（ＩＣＳ）および／もしくは長時間作用型β２アドレナリンアゴニスト（ＬＡＢＡ）ならびに／または長時間作用型ムスカリンアンタゴニスト（ＬＡＭＡ）を含むバックグラウンド療法（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ）に加えて、ＩＬ－４Ｒアンタゴニスト（例えばデュピルマブ）およびＩＬ－３３アンタゴニスト（例えばＲＥＧＮ３５００）を共投与すること含む方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、「喘息コントロールの喪失（ｌｏｓｓ ｏｆ
ａｓｔｈｍａ ｃｏｎｔｒｏｌ）」（ＬＯＡＣ）事象の発生を低下する方法であって、喘息を患っている患者をＩＬ－３３アンタゴニスト（例えばＲＥＧＮ３５００）と組み合わせたＩＬ－４Ｒアンタゴニスト（例えばデュピルマブ）で処置することを含む方法を提供する。ある特定の実施形態において、ＩＬ－３３アンタゴニストと組み合わせたＩＬ－４Ｒアンタゴニストの使用は、ＩＬ－４Ｒアンタゴニスト単独またはＩＬ－３３アンタゴニスト単独のいずれかで投与するより有効な結果をもたらす。
関連する実施形態において、ＩＬ－４Ｒアンタゴニストと組み合わせたＩＬ－３３アンタゴニストの投与は、疾患によりまたは疾患もしくはアレルギーの原因物質により誘発される１型免疫応答の増加および／または２型免疫応答の低下をもたらす。
本発明の第３の態様は、線維性疾患もしくは障害または線維性疾患もしくは障害に関連する少なくとも１つの症状を処置するための方法であって、ＩＬ－３３に特異的に結合するＩＬ－３３アンタゴニスト（ＩＬ－３３抗体またはＩＬ－３３トラップ）およびＩＬ－４Ｒαまたはその抗原結合フラグメントに特異的に結合する抗体の組み合わせ、またはＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４αアンタゴニストを含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含み、線維性疾患または障害が緩和され、またはその重症度もしくは持続期間について軽減され、あるいは線維性疾患または障害に関連する少なくとも１つの症状が緩和され、またはその重症度、持続期間、もしくは発生頻度について軽減される、方法を提供する。一実施形態において、ＩＬ－４Ｒアンタゴニストと組み合わせたＩＬ－３３アンタゴニストでの線維性疾患の処置は、線維性組織をその正常な状態に回復させることをもたらし得る。
一実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ－４Ｒα抗体と組み合わせたＩＬ－３３抗体またはＩＬ－３３トラップなどの本発明の抗ＩＬ－３３およびＩＬ－４Ｒアンタゴニストを投与することによって処置可能な線維性疾患または障害としては、肺線維症（例えば、特発性肺線維症、ブレオマイシン誘導性肺線維症、アスベスト誘導性肺線維症、および細気管支炎性閉塞症）、慢性喘息、急性肺損傷および急性呼吸窮迫に関連する線維症（例えば、細菌性肺炎誘導性線維症、外傷誘導性線維症、ウイルス性肺炎誘導性線維症、
人工呼吸器誘導性線維症、非肺性敗血症誘導性線維症（ｎｏｎ－ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓｅｐｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、および誤嚥誘導性線維症（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、珪肺症、放射線誘導性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ、これは一次喫煙または二次喫煙への曝露に関連し、該曝露によって一部引き起こされ、もしくは該曝露に起因し得る、またはそうではないこともあり得る）、強皮症、眼線維症、皮膚線維症（例えば、強皮症）、肝線維症（例えば、肝硬変、アルコール誘導性肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変、感染症またはウイルス誘導性肝線維症、自己免疫性肝炎、腎臓（腎）線維症、心臓線維症、アテローム性動脈硬化症、ステント再狭窄、および骨髄線維症が挙げられる。
本発明の第４の態様は、アレルギー反応を予防またはその重症度を軽減するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＩＬ－３３アンタゴニストの１回以上の用量を治療有効量のＩＬ－４Ｒアンタゴニストの１回以上の用量と組み合わせて投与することを含み、この組み合わせの投与は、ＩＬ－３３アンタゴニスト単独またはＩＬ－４Ｒアンタゴニスト単独の投与で観察される治療有効性と比較して、アレルギー反応を予防またはその重症度を軽減するための治療有効性の増強をもたらす、方法を提供する。ＩＬ－４Ｒアンタゴニストと組み合わせてＩＬ－３３アンタゴニストで処置された対象は、ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストの組み合わせまたはこれらのアンタゴニストを含む組成物の投与後に、アレルゲンに対する感受性の低下もしくはアレルギー反応の軽減を示し得、またはアレルゲンに対する感受性もしくはアレルギー反応もしくはアナフィラキシー応答を経験し得ない。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストは、ヒトＩＬ－３３に結合するまたはそれと特異的に相互作用する、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－３３とＳＴ２との相互作用を阻止し得、またはＩＬ－３３のＳＴ２受容体への低親和性結合を可能にし得る。そうした際には、ＳＴ２はＩＬ－１ＲＡｃＰと相互作用することを妨げられ得る。したがって、本発明のＩＬ－３３抗体は、特に、ＩＬ－３３媒介シグナル伝達を阻害すること、ならびにＩＬ－３３活性および／もしくはＩＬ－３３シグナル伝達によって引き起こされるまたはこれらに関連する疾患および障害を処置することに有用である。
一実施形態において、ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、アレルゲン誘導性肺炎症を有する哺乳動物に投与されたときに、好酸球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞集団中のＳＴ２＋／ＣＤ４＋細胞のうちの１つ以上の頻度を低減するか、または肺におけるＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞比を低減する。
一実施形態において、ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、アレルゲン誘導性肺炎症を有する哺乳動物に投与されたとき、肺のＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ１１、Ｃｃｌ２４、またはＭＣＰ－１のうちの１つ以上の発現レベルを低下させる。
一実施形態において、ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、アレルゲン誘導性肺炎症を有する哺乳動物に投与されたとき、肺の血清ＩｇＥレベル、杯細胞化生、または上皮コラーゲンの厚さを減少させる。
ある特定の実施形態において、本発明の方法で使用され得るヒトＩＬ－３３に特異的に結合するＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、
２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、および３０８からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列内に含有される３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、および３１６からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含む。
ある特定の実施形態において、本発明の方法で使用され得るヒトＩＬ－３３に特異的に結合するＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、および３０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、またはそれらと実質的に類似する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
ある特定の実施形態によれば、本発明の方法で使用するための抗ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、および３１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、またはそれらと実質的に類似する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
ある特定の実施形態によれば、本発明の方法で使用するための抗ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、および３０８／３１６からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列対を含む。
ある特定の実施形態によれば、本発明の方法で使用するための抗ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、および３１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン、またはそれらと実質的に類似する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列と、配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、および３２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメイン、またはそれらと実質的に類似する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列と、を含む。
ある特定の実施形態によれば、本発明の方法で使用するための抗ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８／１６、２４／３２、４０／４８、５６／６４、７２／８０、８８／９６、１０４／１１２、１２０／１２８、１３６／１４４、１５２／１６０、１６８／１７６、１８４／１９２、２００／２０８、２１６／２２４、２３２／２４０、２４８／２５６、２６４／２７２、２８０／２８８、２９６／３０４、および３１４／３２２からなる群から選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。
ある特定の実施形態によれば、本発明の方法で使用するための抗ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、および３１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン、またはそれらと実質的に類似する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列と、配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、および３１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン、またはそれらと実質的に類似する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列と、配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、および３１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン、またはそれらと実質的に類似する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列と、配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、および３２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメイン、またはそれらと実質的に類似する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列と、を含む。
本発明の方法で使用され得るある特定の非限定的で例示的な抗ＩＬ－３３抗体および抗原結合フラグメントは、配列番号４－６－８－１２－１４－１６（例えば、Ｈ１Ｍ９５５９Ｎ）、２０－２２－２４－２８－３０－３２（例えば、Ｈ１Ｍ９５６６Ｎ）、３６－３８－４０－４４－４６－４８（例えば、Ｈ１Ｍ９５６８Ｎ）、５２－５４－５６－６０－６２－６４（例えば、Ｈ４Ｈ９６２９Ｐ）、６８－７０－７２－７６－７８－８０（例えば、Ｈ４Ｈ９６３３Ｐ）、８４－８６－８８－９２－９４－９６（例えば、Ｈ４Ｈ９６４０Ｐ）、１００－１０２－１０４－１０８－１１０－１１２（例えば、Ｈ４Ｈ９６５９Ｐ）、１１６－１１８－１２０－１２４－１２６－１２８（例えば、Ｈ４Ｈ９６６０Ｐ）、１３２－１３４－１３６－１４０－１４２－１４４（例えば、Ｈ４Ｈ９６６２Ｐ）、１４８－１５０－１５２－１５６－１５８－１６０（例えば、Ｈ４Ｈ９６６３Ｐ）、１６４－１６６－１６８－１７２－１７４－１７６（例えば、Ｈ４Ｈ９６６４Ｐ）、１８０－１８２－１８４－１８８－１９０－１９２（例えば、Ｈ４Ｈ９６６５Ｐ）、１９６－１９８－２００－２０４－２０６－２０８（例えば、Ｈ４Ｈ９６６６Ｐ）、２１２－２１４－２１６－２２０－２２２－２２４（例えば、Ｈ４Ｈ９６６７Ｐ）、２２８－２３０－２３２－２３６－２３８－２４０（例えば、Ｈ４Ｈ９６７０Ｐ）、２４４－２４６－２４８－２５２－２５４－２５６（例えば、Ｈ４Ｈ９６７１Ｐ）、２６０－２６２－２６４－２６８－２７０－２７２（例えば、Ｈ４Ｈ９６７２Ｐ）、２７６－２７８－２８０－２８４－２８６－２８８（例えば、Ｈ４Ｈ９６７５Ｐ）、２９２－２９４－２９６－３００－３０２－３０４（例えば、Ｈ４Ｈ９６７６Ｐ）、および３１０－３１２－３１４－３１８－３２０－３２２（Ｈ１Ｍ９５６５Ｎ）からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む。
ある特定の実施形態によれば、例えば炎症状態を処置するための本発明の方法で使用するための抗ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２
０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、および３０８／３１６からなる群から選択される重鎖可変領域および軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列内に含有される重鎖および軽鎖ＣＤＲドメインを含む。ＨＣＶＲアミノ酸配列およびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および技術は、当該技術分野において周知であり、それらを使用して、本明細書に開示される特定のＨＣＶＲアミノ酸配列および／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定することができる。ＣＤＲの境界を同定するために使用可能な例示的な規則には、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義が含まれる。一般的には、Ｋａｂａｔ定義は配列の可変性に基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造ループ領域の位置に基づいており、ＡｂＭ定義はＫａｂａｔのアプローチとＣｈｏｔｈｉａのアプローチの間の折衷案である。例えば、Ｋａｂａｔ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，」Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（１９９７）、およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：９２６８－９２７２（１９８９）を参照のこと。抗体内のＣＤＲ配列を同定するために、公開データベースも利用可能である。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２７４／２８２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む。
関連する実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３抗体または抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号２７６－２７８－２８０－２８４－２８６－２８８のＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのヒトインターロイキン－３３（ＩＬ－３３）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号２７４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、および（ｂ）配列番号２８２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２７４／２８２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、水素／重水素交換により決定されるように、配列番号３４９の約１位～約１２位の範囲のアミノ酸配列、および／または配列番号３４９の約５０位～約９４位の範囲のアミノ酸配列と相互作用する。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、水素／重水素交換により決定されるように、配列番号３４８の約１１２位～約１２３位の範囲のアミノ酸配列、および／または配列番号３４８の約１６１位～約２０５位の範囲のアミノ酸配列と相互作用する。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、水素／重水素交換によって決定されるように、配列番号３５０のアミノ酸配列もしくは配列番号３５１のアミノ酸配列のいずれか、または配列番号３５０および３５１の両方と相互作用する。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－３３への結合について、配列番号２７４／２８２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と競合する。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２７４／２８２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と同じＩＬ－３３上のエピトープに結合する。
第５の態様において、本発明は、本発明の方法で使用される抗ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を保有する組換え発現ベクター、およびそのようなベクターが導入された宿主細胞もまた、抗体の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって、および産生された抗体を回収することによって、抗体を産生する方法と同様に本発明に包含される。
一実施形態において、本発明は、配列番号１、１７、３３、４９、６５、８１、９７、１１３、１２９、１４５、１６１、１７７、１９３、２０９、２２５、２４１、２５７、２７３、２８９、および３０７からなる群から選択される核酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＨＣＶＲを含む、ヒトＩＬ－３３に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを使用する方法を提供する。
本発明はまた、配列番号９、２５、４１、５７、７３、８９、１０５、１２１、１３７、１５３、１６９、１８５、２０１、２１７、２３３、２４９、２６５、２８１、２９７、および３１５からなる群から選択される核酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＬＣＶＲを含む、ヒトＩＬ－３３に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを使用する方法を提供する。
本発明はまた、配列番号７、２３、３９、５５、７１、８７、１０３、１１９、１３５、１５１、１６７、１８３、１９９、２１５、２３１、２４７、２６３、２７９、２９５、および３１３からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号１５、３１、４７、６３、７９、９５、１１１、１２７、１４３、１５９、１７５、１９１、２０７、２２３、２３９、２５５、２７１、２８７、３０３、および３２１からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によりコードされるＬＣＤＲ３ドメインと、を含む、ヒトＩＬ－３３に特異的に結合する抗体または抗体の抗原結合フラグメントを使用する方法を提供する。
本発明はまた、配列番号３、１９、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７、１６３、１７９、１９５、２１１、２２７、２４３、２５９、２７５、２９１、および３０９からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＨＣＤＲ１ドメインと、配列番号５、２１、３７、５３、６９、８５、１０１、１１７、１３３、１４９、１６５、１８１、１９７、２１３、２２９、２４５、２６１、２７７、２９３、および３１１からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によりコードされるＨＣＤＲ２ドメインと、配列番号１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、
１２３、１３９、１５５、１７１、１８７、２０３、２１９、２３５、２５１、２６７、２８３、２９９、および３１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によりコードされるＬＣＤＲ１ドメインと、配列番号１３、２９、４５、６１、７７、９３、１０９、１２５、１４１、１５７、１７３、１８９、２０５、２２１、２３７、２５３、２６９、２８５、３０１、および３１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によりコードされるＬＣＤＲ２ドメインと、をさらに含む、ヒトＩＬ－３３に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを使用する方法を提供する。
ある特定の実施形態によれば、本発明の方法は、配列番号１および９（例えば、Ｈ１Ｍ９５５９Ｎ）、配列番号１７および２５（例えば、Ｈ１Ｍ９５６６Ｎ）、配列番号３３および４１（例えば、Ｈ１Ｍ９５６８Ｎ）、配列番号４９および５７（例えば、Ｈ４Ｈ９６２９Ｐ）、配列番号６５および７３（例えば、Ｈ４Ｈ９６３３Ｐ）、配列番号８１および８９（例えば、Ｈ４Ｈ９６４０Ｐ）、配列番号９７および１０５（例えば、Ｈ４Ｈ９６５９Ｐ）、配列番号１１３および１２１（例えば、Ｈ４Ｈ９６６０Ｐ）、配列番号１２９および１３７（例えば、Ｈ４Ｈ９６６２Ｐ）、配列番号１４５および１５３（例えば、Ｈ４Ｈ９６６３Ｐ）、配列番号１６１および１６９（例えば、Ｈ４Ｈ９６６４Ｐ）、配列番号１７７および１８５（例えば、Ｈ４Ｈ９６６５Ｐ）、配列番号１９３および２０１（例えば、Ｈ４Ｈ９６６６Ｐ）、配列番号２０９および２１７（例えば、Ｈ４Ｈ９６６７Ｐ）、配列番号２２５および２３３（例えば、Ｈ４Ｈ９６７０Ｐ）、配列番号２４１および２４９（例えば、Ｈ４Ｈ９６７１Ｐ）、配列番号２５７および２６５（例えば、Ｈ４Ｈ９６７２Ｐ）、配列番号２７３および２８１（例えば、Ｈ４Ｈ９６７５Ｐ）、配列番号２８９および２９７（例えば、Ｈ４Ｈ９６７６Ｐ）、または配列番号３０７および３１５（Ｈ１Ｍ９５６５Ｎ）の核酸配列によってコードされる重鎖および軽鎖のＣＤＲ配列を含む、ヒトＩＬ－３３に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの使用を提供する。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストは、ＩＬ－３３受容体ベースのトラップ、例えば本明細書に記載されるものである（図１を参照のこと）。
一実施形態において、ＩＬ－３３受容体ベースのトラップは、多量体化ドメイン（Ｍ）に結合された第１のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ１）を含み、Ｄ１はＳＴ２タンパク質のＩＬ－３３結合部分を含む。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３トラップは、Ｄ１および／またはＭに結合された第２のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ２）をさらに含み、Ｄ２はＩＬ－１ＲＡｃＰタンパク質の細胞外部分を含む。一実施形態において、Ｄ１はＭのＮ末端に結合されている。一実施形態において、Ｄ１はＭのＣ末端に結合されている。一実施形態において、Ｄ２はＭのＮ末端に結合されている。一実施形態において、Ｄ２はＭのＣ末端に結合されている。一実施形態において、Ｄ１はＤ２のＮ末端に結合され、Ｄ２はＭのＮ末端に結合されている。
一実施形態において、Ｄ１は、配列番号３２８もしくは３２９のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、Ｄ２は、配列番号３３０もしくは３３１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストは、第
１の多量体化ドメイン（Ｍ１）に結合された第１のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ１）、および第２の多量体化ドメイン（Ｍ２）に結合された第２のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ２）を含み、Ｄ１ドメインおよび／またはＤ２ドメインは、ＳＴ２およびＩＬ－１ＲＡｃＰからなる群から選択される受容体のＩＬ－３３結合部分を含む。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストは、Ｄ１またはＭ１のいずれかに結合された第３のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ３）を含み、Ｄ３は、ＳＴ２およびＩＬ－１ＲＡｃＰからなる群から選択される受容体のＩＬ－３３結合部分を含む。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストは、Ｄ２またはＭ２のいずれかに結合された第４のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ４）を含み、Ｄ４は、ＳＴ２およびＩＬ－１ＲＡｃＰからなる群から選択される受容体のＩＬ－３３結合部分を含む。
一実施形態において、Ｄ１はＭ１のＮ末端に結合され、Ｄ２はＭ２のＮ末端に結合されている。
一実施形態において、Ｄ３はＤ１のＮ末端に結合されている。
一実施形態において、Ｄ３はＭ１のＣ末端に結合されている。
一実施形態において、Ｄ４はＤ２のＮ末端に結合されている。
一実施形態において、Ｄ４はＭ２のＣ末端に結合されている。
一実施形態において、Ｄ３はＤ１のＮ末端に結合され、Ｄ１はＭ１のＮ末端に結合され、Ｄ４はＤ２のＮ末端に結合され、Ｄ２はＭ２のＮ末端に結合されている。
一実施形態において、Ｄ３はＤ４と同一または実質的に同一であり、Ｄ１はＤ２と同一または実質的に同一である。
一実施形態において、Ｄ３およびＤ４はそれぞれ、ＳＴ２タンパク質のＩＬ－３３結合部分を含み、Ｄ１およびＤ２はそれぞれ、ＩＬ－１ＲＡｃＰタンパク質の細胞外部分を含む。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３トラップは、配列番号３２３、３２４、３２５、３２６、および３２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－４アンタゴニストは、インターロイキン－４受容体（ＩＬ－４Ｒ）アンタゴニストである。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、ＩＬ－４Ｒαに結合し、ＩＬ－４および／またはＩＬ－１３と１型または２型ＩＬ－４受容体との相互作用を妨げる抗体またはその抗原結合フラグメントである。
関連する実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－４および／またはＩＬ－１３と１型および２型ＩＬ－４受容体の両方との相互作用を妨げる。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、ヒトＩＬ－４Ｒαに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのヒトＩＬ－４Ｒαに特異的に結合するモノクローナル抗体は、デュピルマブまたはその生物学的等価物である。
ある特定の実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３３５または配列番号３３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）、および配列番号３３６または配列番号３３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む。
関連する実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、３つのＨＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）ならびに３つのＬＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１は配列番号３３９のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号３４０のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号３４１のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号３４２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号３４３のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３は配列番号３４４のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３３５または配列番号３３７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、および配列番号３３６または配列番号３３８のアミノ酸を含むＬＣＶＲを含む。
一実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３３５／３３６または配列番号３３７／３３８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
関連する実施形態において、本発明の方法で使用するためのＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、デュピルマブ（配列番号３３７／３３８）またはその生物学的等価物である。
ある特定の実施形態において、ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストは別々の製剤で投与される。
ある特定の実施形態において、ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、それを必要とする患者に投与するために共製剤化される（ｃｏ－ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）。
ある特定の実施形態において、ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、対象に皮下、静脈内、筋肉内、または鼻腔内投与される。
本発明のＩＬ－３３およびＩＬ－４Ｒ抗体は、完全長（例えば、ＩｇＧ１抗体もしくはＩｇＧ４抗体）であることができ、または抗原結合部分（例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、もしくはｓｃＦｖフラグメント）のみを含んでいてもよく、かつ機能性に影響するように、例えば、残存するエフェクター機能を取り除くように修飾されていてもよい（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５－１９３３）。
一実施形態において、ヒトインターロイキン－３３またはヒトＩＬ－４Ｒに特異的に結
合する抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体として単離される。
第６の態様において、本発明は、ＩＬ－３３に特異的に結合する組換えヒト抗体もしくはそのフラグメントまたはトラップ、あるいはＩＬ－４Ｒに特異的に結合する抗体、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。関連する態様において、本発明は、抗ＩＬ－３３抗体もしくはＩＬ－３３トラップまたはＩＬ－４Ｒと特異的に結合する抗体、および１つ以上の追加の治療剤の組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態において、１つ以上の追加の治療剤は、ＩＬ－３３アンタゴニストおよび／またはＩＬ－４Ｒアンタゴニストのいずれかまたは両方と有利に組み合わされる任意の薬剤である。ＩＬ－３３アンタゴニストおよび／またはＩＬ－４Ｒアンタゴニストと有利に組み合わせることができる例示的な薬剤としては、ＩＬ－３３活性および／もしくはＩＬ－４活性を阻害する他の薬剤（他の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ペプチド阻害剤、小分子アンタゴニストなど）、ならびに／またはＩＬ－３３もしくはＩＬ－４もしくはＩＬ－４Ｒと直接結合しないが、なおもＩＬ－３３もしくはＩＬ－４媒介シグナル伝達を妨害、阻止、または減弱する薬剤が挙げられるが、限定するものではない。一実施形態において、１つ以上の追加の治療剤は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド（例えば吸入コルチコステロイド）、気管支拡張薬、抗ヒスタミン薬、エピネフリン、鬱血除去薬、胸腺間質性リンパ球性新生因子（ＴＳＬＰ）アンタゴニスト、ＩＬ－１アンタゴニスト、ＩＬ－８アンタゴニスト、ＩＬ－１３アンタゴニスト、異なるＩＬ－４アンタゴニスト、ＩＬ－４／ＩＬ－１３デュアルアンタゴニスト、ＩＬ－３３／ＩＬ－１３デュアルアンタゴニスト、ＩＬ－５アンタゴニスト、ＩＬ－６アンタゴニスト、ＩＬ－１２／２３アンタゴニスト、ＩＬ－２２アンタゴニスト、ＩＬ－２５アンタゴニスト、ＩＬ－１７アンタゴニスト、ＩＬ－３１アンタゴニスト、ＴＮＦ阻害剤、ＩｇＥ阻害剤、ロイコトリエン阻害剤、経口ＰＤＥ４阻害剤、メチルキサンチン、ネドクロミルナトリウム、クロモリンナトリウム、長時間作用型ベータ２アゴニスト（ＬＡＢＡ）、長時間作用型ムスカリンアンタゴニスト（ＬＡＭＡ）、吸入コルチコステロイド（ＩＣＳ）、および別のＩＬ－３３アンタゴニストもしくはＩＬ－４アンタゴニストまたはＩＬ－３３もしくはＩＬ－４もしくはＩＬ－４Ｒに対する異なる抗体、ならびに別のＩＬ－３３アンタゴニストからなる群から選択され得る。
ある特定の実施形態において、サイトカインアンタゴニストは、サイトカイン自体もしくはそのサイトカインの受容体のいずれか、またはサイトカインおよびその受容体（複数可）の両方を含む複合体と相互作用する、小分子阻害剤（合成または天然由来）またはタンパク質（例えば抗体）であり得る。本発明の抗ＩＬ－３３抗体および／またはＩＬ－４Ｒ抗体を伴う追加の併用療法および共製剤は、本明細書の別の箇所に開示されている。
さらに別の態様において、本発明は、抗ＩＬ－３３アンタゴニスト（ＩＬ－３３抗体もしくはＩＬ－３３トラップなど）およびＩＬ－４Ｒ抗体または本発明の１つ以上の抗体の抗原結合部分を用いて、ＩＬ－３３および／またはＩＬ－４シグナル伝達活性を阻害するための治療方法であって、治療有効量のＩＬ－３３抗体またはＩＬ－３３トラップを含む医薬組成物を単独で、またはＩＬ－４Ｒ抗体または本発明の１つ以上の抗体の抗原結合フラグメントと組み合わせてのいずれかで投与することを含む、治療方法を提供する。 処置される障害は、ＩＬ－３３および／またはＩＬ－４シグナル伝達によって改善、寛解（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｄ）、阻害、または予防される任意の疾患または状態である。本発明の抗ＩＬ－３３および／またはＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、一緒に使用される場合、ＩＬ－３３とＩＬ－３３結合パートナーとの間の相互作用およびＩＬ－４とＩＬ－４結合パートナーとの間の相互作用を阻止するように機能し得、またはそうでなければ、ＩＬ－３３およびＩＬ－４の両方のシグナル伝達活性を阻害する。一実施形態において、ＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、ＩＬ－４Ｒαに結合し、そうした際にはＩ型またはＩＩ型受容体のいずれかを介してＩＬ－４およびＩＬ－１３シグナル伝達の両方を妨げる抗体である。
一実施形態において、ＩＬ－４Ｒαアンタゴニストは、デュピルマブまたはその生物学的等価物である。ＩＬ－４およびＩＬ－１３の両方に対するデュピルマブの二重の阻止活性を考慮すると、本発明のＩＬ－３３アンタゴニストと組み合わせて使用された場合、併用療法計画は、炎症中に起こり得るＩＬ－４、ＩＬ－１３、およびＩＬ－３３シグナル伝達経路を介するシグナル伝達に一部起因する望ましくない炎症活性の阻害の増強をもたらすと考えられる。
一実施形態において、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＩＬ－３３に特異的に結合して、ＩＬ－３３およびその受容体ＳＴ２（ＩＬ１ＲＬ１としても知られる）との相互作用を阻止する抗体またはその抗原結合フラグメントである。
一実施形態において、ＩＬ－３３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、および３０８からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列内に含有される３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を含み、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、および３１６からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む。
一実施形態において、ＩＬ－３３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、および３０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。
一実施形態において、ＩＬ－３３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、および３１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。
一実施形態において、ＩＬ－３３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（ａ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、および３１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメインと、
（ｂ）配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、および３１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメインと、
（ｃ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、および３１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメインと、
（ｄ）配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、および３１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメインと、
（ｅ）配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、および３２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメインと、
（ｆ）配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０
、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、および３２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインと、を含む。
一実施形態において、ＩＬ－３３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、および３０８／３１６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
本発明はまた、患者におけるＩＬ－３３および／もしくはＩＬ－４の活性もしくはシグナル伝達に関連するまたはそれらによって引き起こされる疾患または障害の処置のための医薬の製造における、ＩＬ－３３アンタゴニストの単独の使用またはＩＬ－４Ｒアンタゴニストと組み合わせた使用を含む。一実施形態において、患者におけるＩＬ－３３活性および／もしくはＩＬ－４活性に関連するまたはこれらによって引き起こされる疾患または障害は、喘息（好酸球性または非好酸球性）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息およびＣＯＰＤオーバーラップ症候群（ＡＣＯＳ）、アトピー性皮膚炎、鼻ポリープ、アレルギー反応、慢性気管支炎、気腫、鼻ポリープを伴うまたは伴わない慢性鼻副鼻腔炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性肺炎、多発性硬化症、関節炎（変形性関節症、リウマチ性関節炎、および乾癬性関節炎）、アレルギー性鼻炎、線維症、好酸球性食道炎、血管炎、蕁麻疹、チャーグ・ストラウス症候群、炎症性疼痛、および乾癬からなる群から選択される炎症性疾患または障害である。本発明はまた、炎症性疾患もしくは障害または炎症性の疾患もしくは障害の少なくとも１つの症状の処置に使用するための、治療有効量のＩＬ－４Ｒアンタゴニストと組み合わせた治療有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを含み、ＩＬ－４Ｒアンタゴニストと組み合わせたＩＬ－３３アンタゴニストの投与は、ＩＬ－３３アンタゴニスト単独またはＩＬ－４Ｒアンタゴニスト単独の投与で観察されるものと比較して治療有効性の増強をもたらす。本明細書で論じている方法のいずれも、その方法に関して論じている疾患、障害、および／または症状を処置するための、またはそれらの処置のためのＩＬ－３３および／またはＩＬ－４Ｒアンタゴニスト（例えば抗体）の使用も包含する。
他の実施形態は、後述の詳細な説明の精査から明らかとなるでなろう。
ＩＬ－３３アンタゴニストの個々の成分の互いに対する４つの例示的配置を示す。パネルＡは、第１のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ１）が第１の多量体化ドメイン（Ｍ１）のＮ末端に結合され、第２のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ２）が第２の多量体化ドメイン（Ｍ２）のＮ末端に結合されている配置を示している。Ｄ１およびＤ２が異なるＩＬ－３３結合タンパク質に由来することを示すために、Ｄ１は白囲いとして示され、Ｄ２は黒囲いとして示される。パネルＢは、第１のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ１）が第１の多量体化ドメイン（Ｍ１）のＮ末端に結合され、第２のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ２）が第２多量体化ドメイン（Ｍ２）のＣ末端に結合されている配置を示している。Ｄ１およびＤ２が異なるＩＬ－３３結合タンパク質に由来することを示すために、Ｄ１は白囲いとして示され、Ｄ２は黒囲いとして示される。パネルＣおよびＤは、４つのＩＬ－３３結合ドメインであるＤ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４を含む配置を示している。これらの配置において、Ｄ３－Ｄ１－Ｍ１およびＤ４－Ｄ２－Ｍ２は直列に結合され、Ｄ３はＤ１のＮ末端に結合され、Ｄ１はＭ１のＮ末端に結合され、Ｄ４はＤ２のＮ末端に結合され、Ｄ２はＭ２のＮ末端に結合されている。パネルＣにおいて、Ｄ３およびＤ４は互いに同一または実質的に同一であり、Ｄ１およびＤ２は互いに同一または実質的に同一である。パネルＤにおいて、Ｄ１およびＤ４は互いに同一または実質的に同一であり、Ｄ３およびＤ２は互いに同一または実質的に同一である。 ＨＤＭ曝露により、ＩＬ－３３、ＩＬ－４、およびＩＬ－４Ｒα三重ヒト化マウスおよび野生型マウスの肺において活性化好酸球の同様の増加が誘導されることを示している。統計的有意性は、テューキーの多重比較検定を用いた二元配置分散分析によって決定された。統計的有意差を示すために以下の記号を使用した：「＊」アスタリスクは、同じ遺伝子型の生理食塩水曝露マウスとＨＤＭ曝露マウスとの間の比較を表し、「＆」アンパサンド記号は、それぞれの生理食塩水曝露マウスまたはＨＤＭ曝露野生型マウス群との比較を表す。記号の数値が増えると、有意性が増すことを示している：１ｘ＝ｐ≦０．０５；２ｘ＝ｐ≦０．０１；３ｘ＝ｐ≦０．００１；４ｘ＝ｐ≦０．０００１。略語：ＷＴ＝野生型。全てのマウスは混合Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ／１２９Ｓ６ＳｖＥｖＴａｃバックグラウンドのものであった。 ＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブの組み合わせの投与が、ＨＤＭ曝露誘導相対肺重量の増加を阻止することを示す。相対肺重量は、体重（ｇ）に対する肺湿重量（ｍｇ）の比として表される。統計的有意性は、ダンの多重比較事後検定を用いたクラスカル・ウォリスの一元配置分散分析によって決定された。統計的有意差を示すために以下の記号を使用した：「＊」アスタリスクは、全ての１９週間ＨＤＭ曝露群の間の比較を表し、「＃」ハッシュタグは、生理食塩水に曝露された未処置動物と全ての他の群との比較を示す。記号の数値が増えると、有意性が増すことを示している：１ｘ＝ｐ≦０．０５；２ｘ＝ｐ≦０．０１；３ｘ＝ｐ≦０．００１。略語：ｗｋ＝週、ＩｇＧ４Ｐ＝アイソタイプ対照抗体ＲＥＧＮ１９４５。 ＨＤＭ曝露誘導性の肺好酸球性浸潤に対するＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブの単独または組み合わせでの効果を示す。統計的有意性は、ダンの多重比較事後検定を用いたクラスカル・ウォリスの一元配置分散分析によって決定された。統計的有意差を示すために以下の記号を使用した：「＊」アスタリスクは、全ての１９週間ＨＤＭ曝露群の間の比較を表し、「＃」ハッシュタグは、生理食塩水に曝露された未処置動物と全ての他の群との比較を示し、「＋」プラス記号は、１１週間のＨＤＭ曝露未処置動物と全て他の群との比較を示す。記号の数値が増えると、有意性が増すことを示している：１ｘ＝ｐ≦０．０５；２ｘ＝ｐ≦０．０１；３ｘ＝ｐ≦０．００１；４ｘ＝ｐ≦０．０００１。略語：ｗｋ＝週、ＩｇＧ４Ｐ＝アイソタイプ対照抗体ＲＥＧＮ１９４５。 ＨＤＭ曝露誘導性の肺好酸球性浸潤に対するＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブの単独または組み合わせでの効果を示す。統計的有意性は、ダンの多重比較事後検定を用いたクラスカル・ウォリスの一元配置分散分析によって決定された。統計的有意差を示すために以下の記号を使用した：「＊」アスタリスクは、全ての１９週間ＨＤＭ曝露群の間の比較を表し、「＃」ハッシュタグは、生理食塩水に曝露された未処置動物と全ての他の群との比較を示し、「＋」プラス記号は、１１週間のＨＤＭ曝露未処置動物と全て他の群との比較を示す。記号の数値が増えると、有意性が増すことを示している：１ｘ＝ｐ≦０．０５；２ｘ＝ｐ≦０．０１；３ｘ＝ｐ≦０．００１；４ｘ＝ｐ≦０．０００１。略語：ｗｋ＝週、ＩｇＧ４Ｐ＝アイソタイプ対照抗体ＲＥＧＮ１９４５。 ＲＥＧＮ３５００が単独でまたはデュピルマブとの組み合わせで、ＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＨＤＭ曝露誘導性の肺浸潤を阻止することを示す。統計的有意性は、テューキーの多重比較事後検定を用いた一元配置分散分析によって決定された。統計的有意差を示すために以下の記号を使用した：「＊」アスタリスクは、全ての１９週間ＨＤＭ曝露群の間の比較を表し、「＃」ハッシュタグは、生理食塩水に曝露された未処置動物と全ての他の群との比較を示し、「＋」プラス記号は、１１週間のＨＤＭ曝露未処置動物と全て他の群との比較を示す。記号の数値が増えると、有意性が増すことを示している：１ｘ＝ｐ≦０．０５；２ｘ＝ｐ≦０．０１；３ｘ＝ｐ≦０．００１；４ｘ＝ｐ≦０．０００１。略語：ｗｋ＝週、ＩｇＧ４Ｐ＝アイソタイプ対照抗体ＲＥＧＮ１９４５。 ＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブの組み合わせの投与が、好中球浸潤の指標であるＭＰＯ肺タンパク質レベルのＨＤＭ曝露誘導性の増加を阻止することを示す。統計的有意性は、ダンの多重比較事後検定を用いたクラスカル・ウォリスの一元配置分散分析によって決定された。統計的有意差を示すために以下の記号を使用した：「＊」アスタリスクは、全ての１９週間ＨＤＭ曝露群の間の比較を表し、「＃」ハッシュタグは、生理食塩水に曝露された未処置動物と全ての他の群との比較を示す。記号の数値が増えると、有意性が増すことを示している：１ｘ＝ｐ≦０．０５；２ｘ＝ｐ≦０．０１；３ｘ＝ｐ≦０．００１。略語：ｗｋ＝週、ＩｇＧ４Ｐ＝アイソタイプ対照抗体ＲＥＧＮ１９４５。 肺ＩＬ－５およびＩＬ－６タンパク質レベルのＨＤＭ曝露誘導性の増加についてのＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブの単独または組み合わせの効果を示す。肺（右肺の前葉および中葉）を採取し、ＩＬ－５（Ａ）およびＩＬ－６（Ｂ）タンパク質レベルをマルチプレックスイムノアッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）によって測定した。肺組織のＩＬ－５およびＩＬ－６タンパク質レベルは、肺葉当たりのタンパク質量（ｐｇ）として表される。統計的有意性は、ダンの多重比較事後検定を用いたクラスカル・ウォリスの一元配置分散分析によって決定された。統計的有意差を示すために以下の記号を使用した：「＊」アスタリスクは、全ての１９週間ＨＤＭ曝露群の間の比較を表し、「＃」ハッシュタグは、生理食塩水に曝露された未処置動物と全ての他の群との比較を示す。記号の数値が増えると、有意性が増すことを示している：１ｘ＝ｐ≦０．０５；２ｘ＝ｐ≦０．０１；３ｘ＝ｐ≦０．００１。略語：ｗｋ＝週、ＩｇＧ４Ｐ＝アイソタイプ対照抗体ＲＥＧＮ１９４５。 肺ＩＬ－５およびＩＬ－６タンパク質レベルのＨＤＭ曝露誘導性の増加についてのＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブの単独または組み合わせの効果を示す。肺（右肺の前葉および中葉）を採取し、ＩＬ－５（Ａ）およびＩＬ－６（Ｂ）タンパク質レベルをマルチプレックスイムノアッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）によって測定した。肺組織のＩＬ－５およびＩＬ－６タンパク質レベルは、肺葉当たりのタンパク質量（ｐｇ）として表される。統計的有意性は、ダンの多重比較事後検定を用いたクラスカル・ウォリスの一元配置分散分析によって決定された。統計的有意差を示すために以下の記号を使用した：「＊」アスタリスクは、全ての１９週間ＨＤＭ曝露群の間の比較を表し、「＃」ハッシュタグは、生理食塩水に曝露された未処置動物と全ての他の群との比較を示す。記号の数値が増えると、有意性が増すことを示している：１ｘ＝ｐ≦０．０５；２ｘ＝ｐ≦０．０１；３ｘ＝ｐ≦０．００１。略語：ｗｋ＝週、ＩｇＧ４Ｐ＝アイソタイプ対照抗体ＲＥＧＮ１９４５。 ＲＥＧＮ３５００が単独またはデュピルマブとの組み合わせが、循環（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）ＳＡＡタンパク質レベルのＨＤＭ曝露誘導性の増加を阻止することを示している。最後の抗体注射の４日後、全血を心臓穿刺により採取し、血清を単離した。循環ＳＡＡタンパク質レベルを市販のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。循環ＳＡＡタンパク質レベルは、血清１ｍＬ当たりのＳＡＡタンパク質量（μｇ）として表される。統計的有意性は、ダンの多重比較事後検定を用いたクラスカル・ウォリスの一元配置分散分析によって決定された。統計的有意差を示すために以下の記号を使用した：「＊」アスタリスクは、全ての１９週間ＨＤＭ曝露群の間の比較を表し、「＃」ハッシュタグは、生理食塩水に曝露された未処置動物と全ての他の群との比較を示す。記号の数値が増えると、有意性が増すことを示している：１ｘ＝ｐ≦０．０５；２ｘ＝ｐ≦０．０１；３ｘ＝ｐ≦０．００１。略語：ｗｋ＝週、ＩｇＧ４Ｐ＝アイソタイプ対照抗体ＲＥＧＮ１９４５。 ＨＤＭ曝露に応じて、循環ＩｇＥタンパク質レベルが増加することを示す。全血を心臓穿刺により採取し、血清を単離した。循環ＩｇＥタンパク質レベルを市販のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。循環ＩｇＥタンパク質レベルは、血清１ｍＬ当たりのＩｇＥタンパク質量（μｇ）として表される。統計的有意性は、ダンの多重比較事後検定を用いたクラスカル・ウォリスの一元配置分散分析によって決定された。統計的有意差を示すために以下の記号を使用した：「＊」アスタリスクは、全ての１９週間ＨＤＭ曝露群の間の比較を表し、「＃」ハッシュタグは、生理食塩水に曝露された未処置動物と全ての他の群との比較を示す。記号の数値が増えると、有意性が増すことを示している：１ｘ＝ｐ≦０．０５；２ｘ＝ｐ≦０．０１；３ｘ＝ｐ≦０．００１。略語：ｗｋ＝週、ＩｇＧ４Ｐ＝アイソタイプ対照抗体ＲＥＧＮ１９４５。
本発明を説明する前に、本発明は、特定の方法および説明される実験条件が変わり得るので、このような方法および条件に制限されないことは理解されることになっている。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、本明細書で使用する用語はある特定の実施形態のみを説明するためのものであり、制限されることを企図するものではないことも理解すべきである。
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」との用語は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本発明で使用する場合、「約１００」との表現は、９９および１０１、ならびにその間の全値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
本明細書に説明されるものと類似のまたは等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから説明する。本明細書で言及される特許、出願、および非特許刊行物は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
定義
本明細書で使用される「インターロイキン－３３」、「ＩＬ－３３」または同様の用語は、ヒトＩＬ－３３タンパク質を指し、２７０アミノ酸の、プロセシングされていない全長ＩＬ－３３（例えば、配列番号３４８またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号０９５７６０）、および細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＩＬ－３３（例えば、全長タンパク質のアミノ酸残基１１２～２７０を含有する配列番号３４９を参照のこと）を包含する。ＩＬ－３３の他のプロセシングされた形態は、Ｌｅｆｒａｎｃａｉｓ， ｅｔ．ａｌ．（Ｌｅｆｒａｎｃａｉｓ，ｅｔ ａｌ．，（２０１２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９（５）：１６９３－１６７８）に記載されている。この用語はまた、ＩＬ－３３の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント（例えば、Ｈｏｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，（２０１１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６（２２）：２００７８－２００８６またはを参照のこと）、またはＩＬ－３３の任意の他のアイソフォーム、例えば、ＷＯ２０１６／１５６４４０に記載されているものなどを包含する。本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド、およびタンパク質フラグメントについての全ての言及は、非ヒト種由来であることが明確に特定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質フラグメントのヒト型を指すことを意図している。
本明細書で使用される場合、「ＩＬ－３３アンタゴニスト」との表現は、ＩＬ－３３シグナル伝達および／または、ＩＬ－３３と、細胞表面受容体（例えば、ＩＬ１ＲＬ１としても知られるＳＴ２）もしくは共受容体（例えば、ＩＬ１－ＲＡｃＰ）またはそれらの複合体と、の間の相互作用を阻止、減弱、または妨害することができる任意の薬剤を意味する。例えば、「ＩＬ－３３阻害剤」または「ＩＬ－３３ブロッカー」とも称する「ＩＬ－３３アンタゴニスト」は、以下のいずれかを含む：（１）ＩＬ－３３に結合するもしくはこれと相互作用する薬剤、または（２）ＩＬ－３３受容体に結合するもしくはこれと相互作用する薬剤（「腫瘍形成抑制因子」または「ＳＴ２」と称される場合があり、「ＩＬ１ＲＬ１」としても知られる）、または（３）ＩＬ－３３共受容体（インターロイキン－１受容体アクセサリータンパク質もしくはＩＬ１－ＲＡｃＰ）に結合するもしくはこれと相互作用する薬剤、または（４）ＩＬ－３３／ＳＴ２の複合体に結合する薬剤、あるいは（５）ＳＴ２／ＩＬ－１ＲＡｃＰに結合するもしくはこれと相互作用する薬剤。上記のいずれも、限定するものではないが、ＩＬ－３３がその受容体／共受容体複合体に結合した際
に生じる生物学的シグナル伝達機能などのＩＬ－３３の少なくとも１つの生物学的活性を阻害または減弱をもたらし得る。
一実施形態において、「ＩＬ－３３アンタゴニスト」は、ＩＬ－３３に特異的に結合しまたはこれと相互作用し、ＩＬ－３３がＳＴ２に結合することを妨げ、そうした際にはＳＴ２と共受容体ＩＬ－１ＲＡｃＰとの相互作用を妨げる抗体である。一実施形態において、「ＩＬ－３３アンタゴニスト」は、ＳＴ２またはＳＴ２／ＩＬ－１ＲＡｃＰ複合体のいずれかに特異的に結合し、ＩＬ－３３がＳＴ２またはＳＴ２／ＩＬ１－ＲＡｃＰ受容体複合体に結合することを妨げる抗体である。一実施形態において、「ＩＬ－３３アンタゴニスト」は、ＩＬ－３３／ＳＴ２複合体に結合し、次いでＳＴ２とＩＬ－１ＲＡｃＰ共受容体との相互作用を妨げる抗体である。一実施形態において、「ＩＬ－３３アンタゴニスト」は、ＩＬ－３３に結合し、ＳＴ２への低親和性結合を可能にし得る抗体であるが、同時に、そのような低親和性結合は、ＳＴ２と受容体ＩＬ－１ＲＡｃＰとのその後の相互作用を妨げ得る。
「ＩＬ－３３アンタゴニスト」はまた、可溶性ＳＴ２受容体またはＩＬ－３３受容体ベースのトラップなどの薬剤、例えば、本明細書に記載されＵＳ２０１４／０２７１６４２に開示されているものであり得る。ＩＬ－３３媒介シグナル伝達を阻止する任意の薬剤は「ＩＬ－３３アンタゴニスト」とみなされる。「ＩＬ－３３アンタゴニスト」は、有機小分子、抗体もしくはそのフラグメントなどのタンパク質、または可溶性ＩＬ－３３受容体ベースのトラップ（本明細書中に記載される）、またはアンチセンス分子もしくはｓｉＲＮＡなどの核酸であり得る。本明細書で使用される場合、「ＩＬ－３３に結合する抗体」または「抗ＩＬ－３３抗体」には、ヒトＩＬ－３３タンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントに結合する抗体およびその抗原結合フラグメント（配列番号３４８、３４９、３５０、および３５１を参照のこと）が含まれる。
本明細書で使用される「インターロイキン－４受容体」または「ＩＬ－４Ｒ」との表現は、配列番号３４７のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ－４Ｒα受容体を指す。
本明細書で使用される場合、「ＩＬ－４Ｒアンタゴニスト」（本明細書では「ＩＬ－４Ｒ阻害剤」、「ＩＬ－４Ｒαアンタゴニスト」、「ＩＬ－４Ｒブロッカー」、「ＩＬ－４Ｒαブロッカー」などとも称する）は、ＩＬ－４ＲαまたはＩＬ－４Ｒリガンドに結合しまたはこれらと相互作用し、１型および／または２型ＩＬ－４受容体の正常な生物学的シグナル伝達機能を阻害または減弱する任意の薬剤である。１型ＩＬ－４受容体は、ＩＬ－４Ｒα鎖およびγｃ鎖を含む二量体受容体である。２型ＩＬ－４受容体は、ＩＬ－４Ｒα鎖およびＩＬ－１３Ｒα１鎖を含む二量体受容体である。１型ＩＬ－４受容体は、ＩＬ－４と相互作用し、ＩＬ－４によって刺激される一方、２型ＩＬ－４受容体は、ＩＬ－４およびＩＬ－１３の両方と相互作用し、ＩＬ－４およびＩＬ－１３の両方によって刺激される。したがって、本発明の方法で使用することができるＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、ＩＬ－４媒介シグナル伝達、ＩＬ－１３媒介シグナル伝達、またはＩＬ－４およびＩＬ－１３媒介シグナル伝達の両方を阻止することによって機能し得る。したがって、本発明のＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、ＩＬ－４および／またはＩＬ－１３と１型または２型受容体との相互作用を妨げ得る。ＩＬ－４Ｒアンタゴニスト分類の非限定的な例には、小分子ＩＬ－４Ｒ阻害剤、抗ＩＬ－４Ｒアプタマー、ペプチドベースのＩＬ－４Ｒ阻害剤（例えば、「ペプチボディ」分子）、「レセプターボディ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｏｄｙ）」（例えば、ＩＬ－４Ｒ成分のリガンド結合ドメインを含む工学操作された分子）、およびヒトＩＬ－４Ｒαに特異的に結合する抗体または抗体の抗原結合フラグメントが含まれる。本明細書で使用される場合、ＩＬ－４Ｒアンタゴニストはまた、ＩＬ－４および／またはＩＬ－１３に特異的に結合する抗原結合タンパク質が含まれる。
本明細書で使用される場合、「抗体」との用語は、特定の抗原（例えばＩＬ－３３もしくはＩＬ－４Ｒ）に特異的に結合するまたはこれと相互作用する、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。「抗体」との用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称する、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。本発明の異なる実施形態において、抗ＩＬ－３３抗体（もしくはその抗原結合部分）または抗ＩＬ－４Ｒ抗体のＦＲは、ヒト生殖細胞系列の配列と同一であってもよく、または天然でもしくは人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
本明細書で使用される「抗体」との用語はまた、完全抗体分子の抗原結合フラグメントを含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」および同様の用語は、本明細書で使用される場合、天然の、酵素処理で入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗体結合フラグメントは、例えば、抗体可変ドメインおよび場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現に関連するタンパク質消化技術または組換え遺伝子操作技術などの任意の適切な標準的技術を用いて、完全抗体分子から誘導され得る。このようなＤＮＡは既知であり、および／または例えば市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ－抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを適切な立体配置に配置し、またはコドンを導入し、システイン残基を生成し、アミノ酸を修飾、付加もしくは欠失などするために、化学的にまたは分子生物学技術を用いて配列決定および操作され得る。
抗体結合フラグメントの非限定例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント、（ｉｖ）Ｆｖフラグメント、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または拘束ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の工学操作された分子もまた、本明細書で使用する「抗原結合フラグメント」の表現内に包含される。
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むことになっている。可変ドメインは、任意の大きさまたはアミノ酸組成物であり得、概して、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているかまたは１つ以上のフレームワーク配列とともにインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと結合したＶＨドメインを有する抗体結合フラグメントにおいて、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、任意の適切な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は二量体であり、Ｖ
Ｈ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＬ二量体を含んでもよい。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを含有し得る。
ある特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインへ共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見出すことができる可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的立体配置としては、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが挙げられる。先に列挙した例示的な立体配置のいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインの任意の立体配置において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結されていてもよく、または完全もしくは部分的ヒンジ領域もしくはリンカー領域によって連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の結合をもたらす少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれより多数の）アミノ酸からなり得る。そのうえ、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いとのおよび／または１つ以上の単量体ＶＨドメインもしくはＶＬドメイン（例えば、ジスルフィド結合（複数可）により）との非共有結合において、先に列挙した可変ドメイン立体配置および定常ドメイン立体配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
完全抗体分子と同様に、抗体結合フラグメントは、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含むことになっており、各可変ドメインは、別個の抗原へまたは同じ抗原上の異なるエピトープへ特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む任意の多重特異性抗体フォーマットは、当該技術分野で利用可能な通例の技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合フラグメントとの関連で使用に適合し得る。例えば、本発明は、二重特異性抗体の使用を含む方法を含み、該二重特異性抗体では、免疫グロブリンの一方の腕が、ＩＬ－４ＲαもしくはそのフラグメントまたはＩＬ－３３もしくはそのフラグメントに特異的な免疫グロブリンであり、免疫グロブリンの他方の腕が、第２の治療標的に特異的であるかまたは治療部分に結合されている。本発明との関連で使用することができる例示的な二重特異性フォーマットとしては、例えば、ｓｃＦｖベースのまたはダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クワドローマ（Ｑｕａｄｒｏｍａ）、ノブズ－イントゥ－ホールズ（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブズ－イントゥ－ホールズを有する共通軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性フォーマットが挙げられるが、限定するものではない（上述のフォーマットの総説については、例えばＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ４：６，１－１１、およびこの中で引用されている参考文献を参照のこと）。二重特異性抗体は、ペプチド／核酸結合を用いて構築することもでき、例えば、直交化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して、部位特異的抗体－オリゴヌクレオチド複合体を生成し、これが次に、規定される組成物、原子価および幾何学的形状を有する多量体複合体へと自己集合する。（例えば、Ｋａｚａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：Ｄｅｃ．４，２０１２］を参照のこと）。
本発明のある特定の実施形態において、本発明の抗ＩＬ－３３抗体およびＩＬ－４Ｒ抗
体はヒト抗体である。「ヒト抗体」との用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むよう企図される。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボでの体細胞突然変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」との用語は、別の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列へと移植された抗体を含むことを意図するものではない。この用語は、非ヒト哺乳類において、または非ヒト哺乳類の細胞において組換え産生された抗体を含む。この用語は、ヒト対象から単離された、またはヒト対象において生成された抗体を含むよう企図されるものではない。
本発明の抗体は、いくつかの実施形態において、組換えヒト抗体であり得る。本明細書で使用される「組換えヒト抗体」との用語は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体などの組換え手段によって調製、発現、作成、または単離された全てのヒト抗体（後述）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（後述）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作成、または単離された抗体を含むことを意図する。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。ある特定の実施形態において、しかしながら、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニック動物が使用される場合は、インビボ体細胞突然変異誘発）を受け、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し関連してはいるが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
ヒト抗体は、ヒンジの不均一性に関連する２つの形態で存在することができる。一形態において、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されている約１５０～１６０ｋＤａの安定な四本鎖構築物を含む。第２の形態において、二量体は鎖間ジスルフィド結合を介して連結されておらず、共有結合した軽鎖と重鎖からなる約７５～８０ｋＤａの分子が形成される（半抗体）。これらの形態は、親和性精製後でさえも分離することが極めて困難であった。
様々な無傷のＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造上の相違によるが、それに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における１個のアミノ酸置換により、ヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて典型的に観察されるレベルにまで第２の形態の出現を有意に減少させることができる（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３０：１０５）。本発明は、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域に１つ以上の変異を有する抗体を包含し、例えば産生において、所望の抗体形態の収率を改善するのに望ましい場合がある。
本発明の抗体は単離された抗体であり得る。本明細書で使用される「単離された抗体」は、同定された抗体、およびその天然環境の少なくとも１つの成分から分離および／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が天然に存在するかもしくは天然に産生される組織または細胞から分離または除去された抗体は、本発明の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体はまた、組換え細胞内の原位置の抗体を含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製または単離工程を受けている抗体である。ある特定の実施形態によると、単離された抗体は他の細胞性物
質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
本発明は、抗ＩＬ－３３抗体およびＩＬ－４Ｒ抗体を中和および／または阻止することを含む。本明細書で使用される「中和」または「阻止」抗体は、標的分子、例えばＩＬ－３３またはＩＬ－４Ｒのいずれかへの結合が、（ｉ）標的分子とその受容体（ＩＬ－３３抗体の場合）またはそのリガンド（ＩＬ－４Ｒ抗体の場合）のいずれかとの間の相互作用を妨げ、および／または（ｉｉ）標的分子の少なくとも１つの生物学的機能、例えばシグナル伝達の阻害をもたらす抗体を指す。ＩＬ－３３またはＩＬ－４Ｒ中和または阻止抗体によって引き起こされる阻害は、阻害が適切なアッセイを使用して検出可能である限り、完全である必要はない。
本明細書に開示される抗体は、抗体が由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域において１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含み得る。このような変異は、本明細書中に開示するアミノ酸配列を、例えば公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合フラグメントを含み、ここで、１つ以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）に変異し、もしくは別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）に変異し、または対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に変異する（このような配列変化を本明細書では纏めて、「生殖系列変異」と称する）。当業者は、本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異またはそれらの組み合わせを含む多くの抗体および抗体結合フラグメントを容易に産生することができる。ある特定の実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基は全て、抗体が由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと再び変異する。他の実施形態において、ある特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基はＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、もしくは変異した残基はＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に認められ、または変異した残基は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内にのみ認められる。他の実施形態において、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）の１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へ変異する。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持され、または異なる生殖系列配列の対応する残基へ変異する。いったん得られれば、１つ以上の生殖系列変異を含有する抗体および抗体結合フラグメントは、結合特異性の改善、結合親和性の増加、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または増強（場合によって）、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な方法で得られる抗体および抗体結合フラグメントは、本発明の範囲内に包含される。
本発明はまた、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む抗体を含む。例えば、本発明は、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば１０個以下、８個以下、６個以下、または４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗体を含む。
「エピトープ」との用語は、パラトープとして既知の抗体分子の可変領域における特異
的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は２つ以上のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域へ結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体配座または線状のいずれかであってもよい。立体配座エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。特定の状況において、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
「実質的な同一性」または「実質的に同一である」との用語は、核酸またはそのフラグメントを指す場合、別の核酸（またはその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入または欠失と最適に整列した場合、以下に考察するように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなど、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定される場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、ある特定の場合において、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
ポリペプチドへ適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似の」との用語は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列した場合、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないことになっている。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換だけ互いに異なる場合、配列同一性の割合または類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照のこと。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）含硫側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。
ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも呼ばれ、典型的には配列分析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾へ割り当てられた類似の測定値を用いて類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定するための既定パラメータとともに使用するこ
とができるＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ第６．１版におけるプログラムである、既定パラメータまたは推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列の間の最良重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上述）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを用いるコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照のこと。
本明細書で使用される「疾患または障害」は、本発明のＩＬ－３３およびＩＬ－４アンタゴニストで処置可能な任意の状態である。本明細書で使用される「炎症性疾患または障害」は、病変が全体的にまたは一部、例えば免疫系細胞の数の変化、移動速度の変化、または活性化の変化に起因する疾患、障害、または病理学的状態を指す。免疫系細胞には、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球もしくはマクロファージ、自然リンパ球、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞、ミクログリア、ＮＫ細胞、好中球、好酸球、肥満細胞、または免疫学に特異的に関連する任意の他の細胞、例えばサイトカイン産生内皮細胞もしくは上皮細胞が含まれる。本明細書で使用される場合、一実施形態において、「炎症性疾患または障害」とは、喘息（ステロイド抵抗性喘息、ステロイド感受性喘息、好酸球性喘息、または非好酸球性喘息を含む）、アレルギー、アナフィラキシー、多発性硬化症、炎症性腸疾患（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ、これは一次喫煙または二次喫煙への曝露に関連し、該曝露によって一部引き起こされ、もしくは該曝露に起因し得る、またはそうではないこともあり得る）、喘息およびＣＯＰＤオーバーラップ症候群（ＡＣＯＳ）、好酸球性食道炎、慢性気管支炎、気腫、鼻ポリープを伴うまたは伴わない慢性鼻副鼻腔炎、狼瘡、アトピー性皮膚炎、乾癬、強皮症および他の線維性疾患、シェーグレン症候群、血管炎（ベーチェット病、巨細胞性動脈炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、およびチャーグ・ストラウス症候群）、炎症性疼痛、ならびに関節炎からなる群から選択される免疫障害または症状である。一実施形態において、関節炎は、リウマチ性関節炎、変形性関節症、および乾癬性関節炎からなる群から選択される。
一実施形態において、「炎症性疾患または障害」は、１型応答および／または２型応答を含む免疫障害または状態である。
「１型免疫応答」は、Ｔヘルパー１（ＴＨ１）細胞およびＴＨ１７細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、グループ１およびグループ３の自然リンパ球（ＩＬＣ）、および免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、ＩｇＡおよび特異的ＩｇＧ抗体クラス、ならびに例えばＴＮＦ、ＩＬ－１β、およびＩＬ－６を含むサイトカインによって定義される。このエフェクター応答は、細菌、ウイルス、真菌、および原生動物を含む多くの微生物に対する免疫を媒介する。１型免疫の構成要素はまた、腫瘍免疫監視を維持するのに役立つ。
「２型免疫応答」は、ＣＤ４＋Ｔヘルパー２（ＴＨ２）細胞、グループ２の自然リンパ球（ＩＬＣ）、好酸球、好塩基球、肥満細胞、ＩＬ－４および／またはＩＬ－１３活性化マクロファージ、ＩｇＥ抗体サブクラス、ならびに例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、胸腺ストロマリンホポエチン、ＩＬ－２５、およびＩＬ－３３を含むサイトカインを特徴とする。２型免疫は、バリア防御（ｂａｒｒｉｅｒ ｄｅｆｅｎｓｅ）を強化することによって、大きな細胞外寄生体に対する保護を提供する。２型免疫応答の構成要素はまた、代謝恒常性を維持し、傷害後の組織リモデリングを促進するのを助ける
。この種の応答はまた、アレルゲンに応答して開始され得る。
本明細書で使用される「ＩＬ－３３媒介シグナル伝達を阻害または減弱する」との語句は、ＩＬ－３３が本明細書に記載のＩＬ－３３抗体またはＩＬ－３３トラップなどのアンタゴニスの非存在下でＳＴ２およびＩＬ－１ＲＡｃＰを介してシグナル伝達を刺激する程度と比較して、本明細書に記載のＩＬ－３３抗体またはＩＬ－３３トラップなどのアンタゴニストの存在下で減弱される、ＩＬ－３３がその受容体、ＳＴ２、および共受容体ＩＬ－１ＲＡｃＰを介してシグナル伝達を刺激する程度を指す。本明細書で使用される「ＩＬ－４Ｒ媒介シグナル伝達を阻害または減弱する」との語句は、ＩＬ－４が本明細書に記載のＩＬ－４またはＩＬ－４Ｒ抗体などのアンタゴニストの非存在下で１型および／または２型ＩＬ－４受容体を介してシグナルを介してシグナル伝達を刺激する程度と比較して、本明細書に記載のＩＬ－４またはＩＬ－４Ｒ抗体などのアンタゴニストの存在下で減弱される、ＩＬ－４が１型および／または２型ＩＬ－４受容体を介してシグナル伝達を刺激する程度を指す。阻害の程度を調べるために、試料を潜在的な阻害剤／アンタゴニストで処理し、阻害剤／アンタゴニストで処理しない対照試料と比較する。対照試料、すなわちアンタゴニストで処理しないものには、相対活性値１００％を割り当てる。対照と比較した活性値が約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、または２０％未満である場合、阻害が達成される。阻害の評価項目は、所定の量または割合の、例えば、サイトカインの放出などの炎症または細胞脱顆粒、分泌、もしくは活性化の指標を含み得る。ＳＴ２およびＩＬ－１ＲＡｃＰを介するＩＬ－３３シグナル伝達の阻害は、当業者に既知のものなどのインビトロアッセイでＩＬ－３３シグナル伝達についてアッセイすることによって決定することができる。さらに、インビボアッセイを使用して、分子がＩＬ－３３のアンタゴニストであるかどうかを決定することができる。例えば、インビボアッセイを使用して、ヒトＩＬ－３３の発現に関してホモ接合性である（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）アレルゲン感作動物の肺炎症についてのＩＬ－３３に対する抗体の効果を評価することができる。動物をアレルゲンで感作した後、動物の一部を本発明の抗ＩＬ－３３抗体または陰性アイソタイプ対照抗体のいずれかで処置する。その後、動物を犠牲死させ、細胞浸潤物の評価およびサイトカイン測定（ＩＬ－４およびＩＬ－５）のために肺を採取する。アンタゴニストとして有効であるＩＬ－３３抗体は、肺の炎症細胞の減少傾向、ならびにＩＬ－４およびＩＬ－５などのサイトカインの減少傾向を示すはずである。インビトロまたはインビボでＩＬ－４が１型および／または２型受容体に結合された後にシグナル伝達を阻止するＩＬ－４Ｒアンタゴニストの能力を評価するために、同様のアッセイを行うことできる。さらに、ＩＬ－３３アンタゴニスト単独、ＩＬ－４もしくはＩＬ－４Ｒアンタゴニスト単独のいずれかを使用することの効果、またはＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４もしくはＩＬ－４Ｒアンタゴニストの両方の組み合わせを一緒に使用することの効果を比較するために、上記のアッセイのいずれかを改変してもよい。
別の態様において、本発明は、喘息もしくはＣＯＰＤの発生率もしくは再発または喘息もしくはＣＯＰＤの増悪の減少を必要とする対象において、喘息もしくはＣＯＰＤの発生率もしくは再発または喘息もしくはＣＯＰＤの増悪を減少させるための方法であって、インターロイキン－４受容体（ＩＬ－４Ｒ）アンタゴニストを含む医薬組成物をＩＬ－３３アンタゴニストを含む医薬組成物と組み合わせて対象に投与することを含む方法を提供する。本明細書で使用される場合、「喘息またはＣＯＰＤの増悪」との表現は、喘息またはＣＯＰＤの１つ以上の症状または兆候の重症度および／もしくは頻度ならびに／または持続期間の増加を意味する。「喘息またはＣＯＰＤの増悪」はまた、喘息またはＣＯＰＤの治療的介入（例えば、ステロイド処置、吸入コルチコステロイド処置、入院など）を必要とするまたはそれによって処置可能である対象の呼吸器健康状態の任意の悪化を含む。
喘息またはＣＯＰＤの増悪の「発生率または再発の減少」とは、本発明の医薬組成物を
受けた対象が、処置前よりも処置後において喘息またはＣＯＰＤの増悪が少ないこと（すなわち、少なくとも１つの増悪の減少）、または本発明の医薬組成物による処置の開始後少なくとも４週間（例えば、４、６、８、１２、１４週間、またはそれ以上）、喘息またはＣＯＰＤの増悪を経験しないことを意味する。あるいは、喘息またはＣＯＰＤの増悪の「発生率または再発の減少」とは、本発明の医薬組成物の投与後に、本発明の医薬組成物を受けていない対象と比較して、対象が喘息またはＣＯＰＤの増悪を経験する可能性が少なくとも１０％（例え、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはそれ以上）減少することを意味する。
本明細書で使用される「線維性疾患または障害」は、組織または臓器中の過剰な線維性結合組織を含む状態を指す。「線維症」とは、組織損傷に対する応答としての結合組織による瘢痕形成および細胞外マトリックスの過剰産生を含む病理過程を指す。本明細書で使用される場合、本発明の抗ＩＬ－３３およびＩＬ－４Ｒアンタゴニストを投与することによって処置可能な例示的な「線維性疾患または障害」としては、肺線維症（例えば、特発性肺線維症、ブレオマイシン誘導性肺線維症、アスベスト誘導性肺線維症、および細気管支炎性閉塞症）、慢性喘息、急性肺損傷および急性呼吸窮迫に関連する線維症（例えば、細菌性肺炎誘導性線維症、外傷誘導性線維症、ウイルス性肺炎誘導性線維症、人工呼吸器誘導性線維症、非肺性敗血症誘導性線維症、および誤嚥誘導性線維症）、珪肺症、放射線誘導性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ、これは一次喫煙または二次喫煙への曝露に関連し、該曝露によって一部引き起こされ、もしくは該曝露に起因し得る、またはそうではないこともあり得る）、強皮症、眼線維症、皮膚線維症（例えば、強皮症）、肝線維症（例えば、肝硬変、アルコール誘導性肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変、感染症またはウイルス誘導性肝線維症、自己免疫性肝炎、腎臓（腎）線維症、心臓線維症、アテローム性動脈硬化症、ステント再狭窄、および骨髄線維症が挙げられる。喘息およびＣＯＰＤは一般に炎症状態であると考えられているが、それぞれがまた線維性疾患の性質を示すことが知られている。
処置または療法、例えばＩＬ－３３アンタゴニスト（例えばＩＬ－３３もしくはＳＴ２結合アンタゴニスト）またはＩＬ－４アンタゴニストを含む処置に対する患者の「応答」または患者の「応答性」とは、処置からまたは処置の結果として、ＩＬ－３３により媒介される障害（例えば、喘息、ＣＯＰＤ、ＡＣＯＳ、鼻ポリープ、または肺線維症、例えば特発性肺線維症）のリスクがあるまたはその障害を有する患者にもたらされる臨床的または治療的利益を指す。そのような利益には、アンタゴニストによる処置からのまたはその処置の結果としての細胞性もしくは生物学的応答、完全奏効（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、部分奏効、安定した疾患（進行もしくは再発なし）、または患者の晩期再発を伴う応答が含まれる。当業者は容易に、患者が応答性であるかどうかを決定するための立場にあるであろう。例えば、ＩＬ－３３アンタゴニストおよび／またはＩＬ－４アンタゴニストを含む処置に応答する喘息を患っている患者は、以下の例示的症状：反復性呼気性喘鳴、咳、呼吸困難、胸部圧迫感、夜間に発症もしくは悪化する症状、冷気によって引き起こされる症状、運動またはアレルゲンへの曝露のうちの１つ以上において観察可能および／または測定可能な減少または非存在を示し得る。
さらに、「治療有効性の増強」は、ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストの組み合わせによる処置が、ＩＬ－３３アンタゴニストまたはＩＬ－４Ｒアンタゴニストを単独で使用した場合に達成される結果と比較した場合に、疾患もしくは障害の少なくとも１つの症状の有意な改善、または本明細書で測定されるような生物学的パラメータ（例えば、肺炎症、サイトカイン放出など）のうちの少なくとも１つの改善をもたらすかどうかを評価することによって決定され得る。本出願に記載される有効性の生物学的測定のいずれも、治療有効性またはその増強を決定するために使用することができる。
ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニスト
本発明の方法は、炎症性疾患または障害を患っている患者に治療有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを治療有効量のＩＬ－４Ｒアンタゴニストと組み合わせて投与することを含む。
ＩＬ－３３アンタゴニスト
「ヒトインターロイキン－３３」もしくは「ヒトＩＬ－３３」もしくは「ｈＩＬ－３３」または「ＩＬ－３３」との用語は、２７０アミノ酸の完全長のプロセシングされていないＩｌ－３３（例えば、配列番号３４８もしくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｏ９５７６０を参照のこと）またはその生物学的に活性なフラグメント、および細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＩＬ－３３（例えば、全長タンパク質のアミノ酸残基１１２～２７０を含有する配列番号３４９を参照のこと）を指す。この用語はまた、ＩＬ－３３の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント（例えば、Ｈｏｎｇ，ｅｔ． ａｌ．，（２０１１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６（２２）：２００７８－２００８６を参照のこと）、対立遺伝子バリアント、またはＩＬ－３３の任意の他のアイソフォーム、例えば、ＷＯ２０１６／１５６４４０に記載されている酸化型または還元型のＩＬ－３３を包含する。本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは本発明のＩＬ－３３トラップによって中和、阻害、阻止、排除、減弱、低減、または妨害され得るＩＬ－３３の活性としては、ＩＬ－３３受容体により媒介されるシグナル伝達の阻害またはＩＬ－３３により媒介される炎症の阻害が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ＩＬ－３３アンタゴニスト」（本明細書中で「ＩＬ－３３阻害剤」または「ＩＬ－３３ブロッカー」などとも称する）は、ＩＬ－３３とその結合パートナーのうちの１つ以上との相互作用を阻害し、そうした際にはＩＬ－３３媒介シグナル伝達を阻害し得る任意の薬剤である。例えば、「ＩＬ－３３アンタゴニスト」は、ＩＬ－３３、もしくは「腫瘍形成抑制因子」（「ＳＴ２」）と称するＩＬ－３３受容体、もしくは「インターロイキン－１受容体アクセサリータンパク質（「ＩＬ－１ＲＡｃＰ」）と称するＩＬ－３３受容体、またはＩＬ－３３／ＳＴ２もしくはＳＴ２／ＩＬ－１ＲＡｃＰのいずれかの複合体と結合しまたはそれらと相互作用し得、そうした際にはＩＬ－３３媒介シグナル伝達を阻害し得る。
ＩＬ－３３アンタゴニスト分類の非限定的な例としては、小分子ＩＬ－３３阻害剤、もしくは受容体アンタゴニスト、またはＩＬ－３３もしくはＩＬ－３３受容体もしくは共受容体のいずれかをコードする核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはクラスター化され規則的に間隔が空いた短鎖反復回文配列ＲＮＡ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ ＲＮＡ）（ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＭａｌｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３９：８２３－２６，２０１３）に記載されるようなｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を有する一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む）が挙げられる。他のＩＬ－３３アンタゴニストには、ＩＬ－３３受容体（例えばＳＴ２）のリガンド結合部分、ＩＬ－３３結合足場分子（例えばＤＡＲＰｉｎｓ、ＨＥＡＴリピートタンパク質、ＡＲＭリピートタンパク質、テトラトリコペプチドリピートタンパク質、フィブロネクチンベースの足場構築物、および天然に存在する反復タンパク質ベースの他の足場など［例えば、Ｂｏｅｒｓｍａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２０１１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８４９－８５７、およびこの中で引用されている参考文献を参照のこと］）、ならびに抗ＩＬ－３３アプタマーまたはその一部が含まれる。
ＩＬ－３３抗体
ある特定の実施形態によれば、本発明との関連で使用することができるＩＬ－３３アンタゴニストまたは阻害剤は、ヒトＩＬ－３３に特異的に結合する抗ＩＬ－３３抗体または抗体の抗原結合フラグメントである。本明細書に記載の方法で使用するための例示的な抗ＩＬ－３３抗体のアミノ酸配列識別子は表１に示され、これらのＩＬ－３３抗体をコードする核酸配列識別子は表２に示される。
一実施形態においては、本発明の方法で使用するための本明細書に記載される抗ＩＬ－３３抗体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ９，４５３，０７２に開示されている。
ある特定の実施形態によれば、本発明の方法で使用される抗ＩＬ－３３抗体はＩＬ－３３に特異的に結合する。「特異的に結合する」またはそれに類する用語は、抗体またはその抗原結合フラグメントが、生理学的条件下で比較的安定である抗原と複合体を形成することを意味する。抗体が抗原に特異的に結合するかどうかを決定するための方法は当該技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。例えば、本発明との関連で使用されるＩＬ－３３を「特異的に結合する」抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合に、約１０００ｎＭ未満、約５００ｎＭ、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＫＤでＩＬ－３３またはその生物学的活性部分に結合する抗体を含む。しかしながら、ヒトＩＬ－３３に特異的に結合する単離された抗体は、他の（非ヒト）種由来のＩＬ－３３分子などの他の抗原に対する交差反応性を有し得る。
本発明のある特定の例示的な実施形態によれば、ＩＬ－３３アンタゴニストは、米国特許第９，４５３，０７２号および本明細書に開示の表１に示される抗ＩＬ－３３抗体のいずれかのアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある特定の実施形態において、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＵＳ９，４５３，０７２に記載される参照抗体の結合特性を有する抗ＩＬ－３３抗体である。ある特定の例示的な実施形態において、本発明の方法との関連で使用することができる抗ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）、および配列番号２８２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む。ある特定の実施形態によれば、抗ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、３つのＨＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）ならびに３つのＬＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１は配列番号２７６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号２７８のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号２８０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号２８４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号２８６のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３は配列番号２８８のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態において、抗ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２７４を含むＨＣＶＲおよび配列番号２８２を含むＬＣＶＲを含む。
一実施形態において、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＲＥＧＮ３５００と称するＩＬ－３３抗体であり、これは配列番号２７４のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲと、配列番号２８２のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲと、配列番号２７６－２７８－２８０のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２８４－２８６－２８８のアミノ酸配列をそれぞれ有する軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）と、を含む。
本明細書に記載される方法で使用することができる他の抗ＩＬ－３３抗体およびその抗原結合フラグメントは、ＥＰ１７２５２６１、ＵＳ８１８７５９６、ＷＯ２０１１／０３１６００、ＷＯ２０１５／０９９１７５、ＷＯ２０１５／１０６０８０（ＡＮＢ０２０）、ＵＳ２０１６／０１６８２４２、ＷＯ２０１６／０７７３８１、ＷＯ２０１６／０７７３６６、またはＷＯ２０１６／１５６４４０に開示され、これらはそれぞれ参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ＩＬ－３３トラップ
ある特定の実施形態によれば、本発明との関連で使用することができるＩＬ－３３アンタゴニストまたは阻害剤は、受容体ベースのＩＬ－３３トラップ、例えば本明細書に記載されているものなどである。
本明細書に記載のＩＬ－３３トラップは、ＳＴ２と命名されたＩＬ－３３受容体タンパク質のＩＬ－３３結合部分を含む、少なくとも１つのＩＬ－３３結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、ＩＬ－３３トラップは、ＩＬ－１受容体アクセサリータンパク質またはＩＬ－１ＲＡｃＰと命名されたＩＬ－３３共受容体の細胞外部分をさらに含む。ＩＬ－３３トラップはまた、トラップの様々な成分を互いに連結するように機能する少なくとも１つの多量体化成分を含有し得る。ＩＬ－３３トラップのさまざまな成分を以下に記載し、図１に示す。
一実施形態において、本発明の方法で使用するための本明細書に記載のＩＬ－３３トラップは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０２７１６４２およびＷＯ２０１４／１５２１９５に開示されている。
簡潔に述べると、ＩＬ－３３トラップは、多量体化ドメイン（Ｍ）に結合された第１のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ１）を含む。ある特定の実施形態において、本発明のＩＬ－３３アンタゴニストは、Ｄ１および／またはＭに結合された第２のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ２）を含む。ある特定の実施形態によれば、Ｄ１は、ＳＴ２タンパク質のＩＬ－３３結合部分を含む。ある特定の実施形態によれば、Ｄ２はＩＬ－１ＲＡｃＰタンパク質の細胞外部分を含む。
ＩＬ－３３トラップの個々の成分は、ＩＬ－３３に結合することができる機能性アンタゴニスト分子をもたらす様々な方法で互いに対して配置されてもよい。例えば、Ｄ１および／またはＤ２はＭのＮ末端に結合されていてもよい。他の実施形態において、Ｄ１および／またはＤ２はＭのＣ末端に結合されている。さらに他の実施形態において、Ｄ１はＤ２のＮ末端に結合され、Ｄ２はＭのＮ末端に結合され、その結果、ＮからＣ末端へと式Ｄ１－Ｄ２－Ｍで表されるアンタゴニスト分子の直列型融合がもたらされる。個々の成分の他の位置付けは、図１における本明細書の他の箇所に開示されている。
本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３トラップの非限定的な例は表３ａおよび３ｂに示され、「ｈＳＴ２－ｈＦｃ」、「ｈＳＴ２－ｍＦｃ」、「ｈＳＴ２－ｈＩＬ１ＲＡｃＰ－ｍＦｃ」、「ｈＳＴ２－ｈＩＬ１ＲＡｃＰ－ｈＦｃ」、および「ｍＳＴ２－ｍＩＬ１ＲＡｃＰ－ｍＦｃ」と命名されたＩＬ－３３トラップを含む。これらは、それぞれ配列番号３２３、３２４、３２５、３２６、および３２７に対応する。本発明は、本明細書に示される例示的なＩＬ－３３受容体ベースのトラップ（例えば、配列番号３２３、３２４、３２５、３２６、および３２７）のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有するＩＬ－３３受容体ベースのトラップを含む。
標準的な分子生物学的技術（例えば、組換えＤＮＡ技術）を使用して、本発明のＩＬ－３３トラップのいずれかまたはそのバリアントを構築することができる。
本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３トラップは、少なくとも１つのＩＬ－３３結合ドメイン（本明細書では、「Ｄ」または「Ｄ１」、「Ｄ２」などの命名で称することもある）を含む。ある特定の実施形態において、ＩＬ－３３結合ドメインはＳＴ２タンパク質のＩＬ－３３結合部分を含む。ＳＴ２タンパク質のＩＬ－３３結合部分は、ＳＴ２タンパク質の細胞外ドメインの全部または一部を含むかまたはそれらからなることができる。ある特定の実施形態において、ＳＴ２タンパク質はヒトＳＴ２タンパク質である。本明細書で使用される「ヒトＳＴ２タンパク質」とは、配列番号３５２としても示される、受託番号ＮＰ＿０５７３１６．３のアミノ酸１～５５６に示されるＳＴ２タンパク質を指す。ある特定の実施形態において、ＳＴ２タンパク質は、非ヒト種由来のＳＴ２タンパク質（例えば、マウスＳＴ２、サルＳＴ２など）である。ＳＴ２タンパク質の例示的なＩＬ－３３結合部分は、配列番号３２８のアミノ酸配列（ヒトＳＴ２の細胞外ドメインに対応、［ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０５７３１６．３のＫ１９－Ｓ３２８］）として本明細書に示されている。ＳＴ２タンパク質のＩＬ－３３結合部分の他の例は、配列番号３２９のアミノ酸配列（マウスＳＴ２の細胞外ドメインに対応、［ＮＣＢＩ受託番号Ｐ１４７１９のＳ２７－Ｒ３３２］）として本明細書に示されている。
ある特定の実施形態において、ＩＬ－３３結合ドメインはＩＬ－１ＲＡｃＰタンパク質の細胞外部分を含む。ある特定の実施形態において、ＩＬ－１ＲＡｃＰタンパク質はヒトＩＬ－１ＲＡｃＰタンパク質である。本明細書で使用される「ヒトＩＬ－１ＲＡｃＰタンパク質」は、配列番号３５３のアミノ酸配列を有するＩＬ－１ＲＡｃＰタンパク質を指す。ある特定の実施形態において、ＩＬ－１ＲＡｃＰタンパク質は、非ヒト種由来のＩＬ－１ＲＡｃＰタンパク質（例えば、マウスＩＬ－１ＲＡｃＰ、サルＩＬ－１ＲＡｃＰなど）である。ＩＬ－１ＲＡｃＰタンパク質の例示的な細胞外部分は、配列番号３３０のアミノ酸配列（ヒトＩＬ－１ＲＡｃＰの細胞外ドメインに対応、［ＮＣＢＩ受託番号Ｑ９ＮＰＨ３のＳ２１－Ｅ３５９］）として本明細書に示されている。ＩＬ－１ＲＡｃＰタンパク質の細胞外部分の別の例は、配列番号３３１のアミノ酸配列（マウスＩＬ－１ＲＡｃＰの細胞外ドメインに対応、［ＮＣＢＩ受託番号Ｑ６１７３０のＳ２１－Ｅ３５９］）として本明細書に示されている。
本発明は、本明細書に示される例示的なＩＬ－３３結合ドメイン成分のアミノ酸配列（例えば、配列番号３２８、３２９、３３０、および３３１）のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有するＤ１および／またはＤ２成分を含む、ＩＬ－３３トラップを含む。
本発明のＩＬ－３３アンタゴニストはまた、少なくとも１つの多量体化ドメイン（本明細書では略語「Ｍ」、「Ｍ１」、「Ｍ２」などと称することもある）を含む。一般に、本発明の多量体化ドメイン（複数可）は、ＩＬ－３３アンタゴニストの様々な成分（例えば、ＩＬ－３３結合ドメイン（複数可））を互いに連結するように機能する。本明細書で使用される場合、「多量体化ドメイン」は、同一もしくは類似の構造または構成の第２の多量体化ドメインと（共有的にまたは非共有的に）結合する能力を有する任意の高分子である。例えば、多量体化ドメインは、免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであり得る。多量体化ドメインの非限定的な例は、免疫グロブリンのＦｃ部分、例えばアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択されるＩｇＧのＦｃドメイン、ならびに各アイソタイプ群内の任意のアロタイプである。
本発明のＩＬ－３３アンタゴニストにおいて使用され得る非限定的な例示的多量体化ド
メインとしては、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号３３２）またはマウスＩｇＧ２ Ｆｃ（配列番号３３３）が挙げられる。本発明は、本明細書に示される例示的なＭ成分のアミノ酸配列（例えば、配列番号３３２または３３３）のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＭ成分を含む、ＩＬ－３３アンタゴニストを含む。
ある特定の実施形態において、本発明のＩＬ－３３アンタゴニストは、２つの多量体化ドメインＭ１およびＭ２を含み、ここでＭ１およびＭ２は互いに同一である。例えば、Ｍ１は特定のアミノ酸配列を有するＦｃドメインであり得、Ｍ２はＭ１と同じアミノ酸配列を有するＦｃドメインである。
本発明のＩＬ－３３アンタゴニストの個々の成分（例えば、Ｄ１、Ｄ２、Ｍなど）は、様々な方法で互いに対して配置し得る。上記の全ての配置構成の非限定的な例が図１に図示されている。
２つの多量体化ドメイン（Ｍ１およびＭ２）および４つのＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４）を含む本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３トラップの非限定的な実例も図１に示す（配置ＣおよびＤ）。
本発明のＩＬ－３３トラップの個々の成分（例えば、Ｄ１、Ｄ２、Ｍ１、Ｍ２など）は互いに直接結合されてもよいし（例えば、Ｄ１および／またはＤ２はＭなどに直接結合されてもよい）、あるいは、個々の成分はリンカー成分を介して互いに結合されてもよい（例えば、Ｄ１および／またはＤ２は個々の成分の間に位置付けられているリンカーを介してＭに結合されてもよく、Ｄ１はリンカーを介してＤ２に結合されてもよいなど）。１つの成分が別の成分に「結合される」と記載されている本明細書に開示される配置のいずれにおいても、（たとえ特にそのように表されていなくても）結合はリンカーを介することができる。本明細書中で使用される場合、「リンカー」は２つのポリペプチド成分を一緒に繋げる任意の分子である。
本発明の方法で使用するためのＩＬ－３３トラップの生物学的特徴は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０２７１６４２およびＷＯ２０１４／１５２１９５に記載されている。
他のＩＬ－３３アンタゴニスト
ＩＬ－３３および／またはその受容体（ＳＴ２および／またはＩＬ－１ ＲＡｃＰ）に結合して、リガンド－受容体相互作用を阻止するポリペプチドは、ＩＬ－３３アンタゴニストとみなされ、参照によりその全体が組み込まれるＷＯ２０１４／１５２１９５に記載されている。ＩＬ－３３アンタゴニストとして作用し、本発明の方法で使用し得る他の薬剤としては、イムノアドヘシン、ペプチボディ、および可溶性ＳＴ２、もしくはそれらの誘導体、抗ＩＬ－３３受容体抗体（例えば、抗ＳＴ２抗体、例えば、ＡＭＧ－２８２（Ａｍｇｅｎ）もしくはＳＴＬＭ１５（Ｊａｎｓｓｅｎ））、またはそれらの全体がそれぞれ参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／１１３８１３、ＷＯ２０１３／１７３７６１、ＷＯ２０１３／１６５８９４、ＵＳ８，４４４，９８７、またはＵＳ７，４５２，９８０に記載されている抗ＳＴ２抗体のいずれかが挙げられる。本発明の方法で使用するための他のＩＬ－３３アンタゴニストには、それぞれ参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１７３７６１またはＷＯ２０１３／１６５８９４に記載されているものなどのＳＴ２－Ｆｃタンパク質が含まれる。
ＩＬ－４Ｒアンタゴニスト
本明細書で使用される場合、「ＩＬ－４Ｒアンタゴニスト」（本明細書では「ＩＬ－４Ｒ阻害剤」、「ＩＬ－４Ｒαアンタゴニスト」、「ＩＬ－４Ｒブロッカー」、「ＩＬ－４Ｒαブロッカー」などとも称する）は、ＩＬ－４ＲαまたはＩＬ－４Ｒリガンドに結合または相互作用し、１型および／または２型のＩＬ－４受容体の正常な生物学的シグナル伝達機能を阻害または減弱する任意の薬剤である。本明細書で使用される「ヒトＩＬ－４Ｒ」または「ｈＩＬ－４Ｒ」との用語は、配列番号３４７のアミノ酸配列を有するＩＬ－４Ｒまたはその生物学的に活性なフラグメントを指す。１型ＩＬ－４受容体は、ＩＬ－４Ｒα鎖およびγｃ鎖を含む二量体受容体である。２型ＩＬ－４受容体は、ＩＬ－４Ｒα鎖およびＩＬ－１３Ｒα１鎖を含む二量体受容体である。１型ＩＬ－４受容体はＩＬ－４と相互作用し、ＩＬ－４によって刺激される一方、２型ＩＬ－４受容体はＩＬ－４およびＩＬ－１３の両方と相互作用し、それらの両方によって刺激される。したがって、本発明の方法で使用することができるＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、ＩＬ－４媒介シグナル伝達、ＩＬ－１３媒介シグナル伝達、またはＩＬ－４およびＩＬ－１３媒介シグナル伝達の両方を阻止することによって機能し得る。したがって、本発明のＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、ＩＬ－４および／またはＩＬ－１３と１型または２型受容体との相互作用を妨げ得る。
ＩＬ－４Ｒアンタゴニストの分類の非限定的な例には、小分子ＩＬ－４Ｒアンタゴニスト、ＩＬ－４Ｒの発現もしくは活性の核酸ベースの阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス）、ＩＬ－４Ｒと特異的に相互作用するペプチドベースの分子（例えば、ペプチボディ）、「レセプターボディ」（例えば、ＩＬ－４Ｒ成分のリガンド結合ドメインを含む工学操作された分子）、ＩＬ－４Ｒ結合足場分子（例えば、ＤＡＲＰｉｎ、ＨＥＡＴリピートタンパク質、ＡＲＭリピートタンパク質、テトラトリコペプチドリピートタンパク質、フィブロネクチンベースの足場構築物、および天然に存在するリピートタンパク質に基づく他の足場など［例えば、Ｂｏｅｒｓｍａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２０１１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８４９－８５７、およびこの中で引用されている参考文献を参照のこと］、ならびに抗ＩＬ－４Ｒアプタマーまたはその一部が含まれる。ある特定の実施形態によれば、本発明との関連で使用することができるＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、ヒトＩＬ－４Ｒに特異的に結合する抗ＩＬ－４Ｒ抗体または抗体の抗原結合フラグメントである。
一実施形態において、本発明の方法で使用するために本明細書に開示される抗ＩＬ－４Ｒ抗体はデュピルマブである（米国特許第７，６０５，２３７号、同第７，６０８，６９３号、および同第９，２９０，５７４号も参照のこと）。
抗ＩＬ－４Ｒ抗体
本発明のある特定の例示的実施形態によれば、ＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、ＩＬ－４Ｒαに特異的に結合する抗ＩＬ－４Ｒα抗体またはその抗原結合フラグメントである。「特異的に結合する」または同様の用語は、抗体またはその抗原結合フラグメントが、生理学的条件下で比較的安定である抗原と複合体を形成することを意味する。抗体が抗原に特異的に結合するかどうかを決定するための方法は当該技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。例えば、本発明との関連で使用されるＩＬ－４Ｒαを「特異的に結合する」抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合に、約１０００ｎＭ未満、約５００ｎＭ、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＫＤでＩＬ－４Ｒαまたはその生物学的活性部分に結合する抗体を含む。しかしながら、ヒトＩＬ－４Ｒαに特異的に結合する単離された抗体は、他の（非ヒト）種由来のＩＬ－４Ｒα分子などの他の抗原に対する交差反応性を有し得る。
本発明のある特定の例示的な実施形態によれば、ＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、米国特許第７，６０５，２３７号および同第７，６０８，６９３号に示される抗ＩＬ－４Ｒ抗体のアミノ酸配列のいずれかを含む、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗ＩＬ－４Ｒα抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある特定の実施形態において、ＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、本明細書でデュピルマブと称する参照抗体の結合特性を有する抗ＩＬ－４Ｒ抗体である（ＵＳ７，６０５，２３７およびＵＳ７，６０８，６９３を参照のこと）。ある特定の例示的な実施形態において、本発明の方法との関連で使用することができる抗ＩＬ－４Ｒα抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）、および配列番号３３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む。ある特定の実施形態によれば、抗ＩＬ－４Ｒα抗体またはその抗原結合フラグメントは、３つのＨＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）ならびに３つのＬＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１は配列番号３３９のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号３４０のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号３４１のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号３４２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号３４３のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３は配列番号３４４のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態において、抗ＩＬ－４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３３７を含むＨＣＶＲおよび配列番号３３８を含むＬＣＶＲを含む。さらに他の実施形態において、抗ＩＬ－４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３３５を含むＨＣＶＲおよび配列番号３３６を含むＬＣＶＲを含む。さらに他の実施形態において、抗ＩＬ－４Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３４５に示される重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列および配列番号３４６に示される軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を含む。ある特定の例示的な実施形態によれば、本発明の方法は、デュピルマブと称され当該技術分野で既知の抗ＩＬ－４Ｒα抗体またはその生物学的等価物の使用を含む。デュピルマブは、配列番号３３７のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲと、配列番号３３８のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲと、配列番号３３９－３４０－３４１のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３）と、配列番号３４２－３４３－３４４のアミノ酸配列をそれぞれ有する軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）と、を含む。
本発明の方法との関連で使用することができる他の抗ＩＬ－４Ｒα抗体としては、例えば、ＡＭＧ３１７と称されて当該技術分野で既知の抗体（Ｃｏｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，１８１（８）：７８８－７９６））、もしくはＭＥＤＩ９３１４、または米国特許第７，１８６，８０９号、米国特許第７，６０５，２３７号、米国特許第７，６３８，６０６号、米国特許第８，０９２，８０４号、米国特許第８，６７９，４８７号、もしくは米国特許第８，８７７，１８９号に示される抗ＩＬ－４Ｒα抗体のいずれかが挙げられる。
抗ＩＬ－４および／または抗ＩＬ－３３抗体のｐＨ依存特性
本発明の方法との関連で使用される抗ＩＬ－４ＲαおよびＩＬ－３３抗体は、ｐＨ依存性の結合特性を有し得る。例えば、本発明の方法で使用するための抗ＩＬ－４Ｒα抗体または抗ＩＬ－３３抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでそれぞれＩＬ－４ＲαまたはＩＬ－３３への結合の低下を示し得る。あるいは、本発明の抗ＩＬ－４Ｒα抗体または本発明の抗ＩＬ－３３抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでその抗原への結合の増強を示し得る。「酸性ｐＨ」との表現は、約６．２未満、例えば、約６．０、５．９５、５．９、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０、またはそれ未満のｐＨ値を含む。本明細書で使用される場合、「中性ｐＨ」との表現は、約７．０～約７．４のｐＨを意味する。「中性ｐＨ」との表現は、約７．０、７．
０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、および７．４のｐＨ値を含む。
ある特定の場合において、「中性ｐＨと比較した、酸性ｐＨでのＩＬ－４Ｒαへの結合の低下」または「中性ｐＨと比較した、酸性ｐＨでのＩＬ－３３への結合の低下」とは、中性ｐＨでのそれぞれＩＬ－４ＲαまたはＩＬ－３３に結合する抗体のＫＤ値に対する、酸性ｐＨでのそれぞれＩＬ－４ＲαまたはＩＬ－３３に結合する抗体のＫＤ値の比（またはその逆）に関して表される。例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明の目的のためには、抗体またはその抗原結合フラグメントが約３．０以上の酸性／中性ＫＤ比を示す場合、「中性ｐＨと比較した、酸性ｐＨでのＩＬ－４Ｒαへの結合の低下」または「中性ｐＨと比較した、酸性ｐＨでのＩＬ－３３への結合の低下」を示すとみなし得る。ある特定の例示的実施形態において、本発明の抗体または抗原結合の酸性／中性ＫＤ比は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、１００．０、またはそれ以上であり得る。
ｐＨ依存性結合特性を有する抗体は、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで特定の抗原への結合の低下（または増強）について抗体の集団をスクリーニングすることによって得ることができる。さらに、アミノ酸レベルでの抗原結合ドメインの修飾は、ｐＨ依存的特徴を有する抗体を産生し得る。例えば、抗原結合ドメイン（例えばＣＤＲ内）の１つ以上のアミノ酸をヒスチジン残基で置換することにより、中性ｐＨに対して酸性ｐＨで抗原結合が低下した抗体を得ることができる。本明細書で使用される場合、「酸性ｐＨ」との表現は６．０以下のｐＨを意味する。
併用療法で使用されるＩＬ－３３およびＩＬ－４Ｒアンタゴニストの生物学的効果
本発明は、炎症状態を処置するためのＩＬ－４Ｒアンタゴニストと組み合わせたＩＬ－３３アンタゴニストの使用を含む。一実施形態において、線維症および肺炎症の動物モデルにおける抗ＩＬ４Ｒ抗体と組み合わせた抗ＩＬ－３３抗体の使用は、それぞれの抗体を単独療法として単独で使用した場合に得られる結果と比較して効力の増強を示す。
例えば、本明細書に記載の動物モデル（肺炎症および線維症のイエダニ（ＨＤＭ）モデルと称する）では、肺におけるある特定のサイトカインのレベルが有意に上昇する。これには、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、およびＭＣＰ－１の上昇が含まれる。イエダニアレルゲンの投与後に、マウスの肺中のＩＬ－１３およびＴＮＦαレベルの増加傾向も見られた。しかしながら、このモデルで試験した場合、ＩＬ－３３抗体およびＩＬ－４Ｒ抗体の組み合わせの使用は、処置マウスの肺におけるサイトカインＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＩＬ－１β、ＭＣＰ－１、およびＴＮＦαのレベルの低下をもたらした。実施例４に示されるように、抗ＩＬ－３３抗体および抗ＩＬ－４Ｒ抗体との組み合わせで観察された肺サイトカインレベルに対する効果は、単独で使用した場合のいずれかの個々の抗体による処置よりも大きかった。
さらに、イエダニアレルゲンを受けたマウスでは、Ｉｌ４、Ｉｌ１３、Ｉｌ６、Ｃｃｌ２、Ｔｇｆｂ１、Ｉｌ１３ｒａ２、およびＣｏｌ２４ａ１を含むサイトカイン遺伝子、ケモカイン遺伝子、およびコラーゲン遺伝子のレベルが上昇した。このモデルでは、Ｉｌ５、Ｉｌ９、Ｃｃｌ１１、Ｃｃｌ２４、Ｔｎｆ、Ｉｌ１ｒｌ１、およびＣｏｌ１５ａ１のレベルの増加傾向が見られた。抗ＩＬ－３３抗体および抗ＩＬ－４Ｒ抗体の組み合わせで処置した場合、いずれかの抗体単独での処理によって観察されるレベルと比較して、Ｉｌ６、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ１１、およびＣｃｌ２４の発現が有意に減少した。マウスを抗ＩＬ－
３３抗体および抗ＩＬ－４Ｒ抗体で処置した場合、いずれかの抗体単独での処置と比較して、Ｉｌ４、Ｉｌ５、Ｉｌ１３、Ｉｌ９、Ｔｎｆ、Ｔｇｆｂ１、Ｉｌ１ｒｌ１、Ｉｌ１３ｒａ２、Ｃｏｌ１５ａ１、およびＣｏｌ２４ａ１の減少傾向も見られた。
イエダニモデルの肺細胞浸潤物について分析を行ったとき、抗ＩＬ－３３抗体および抗ＩＬ－４Ｒ抗体の組み合わせの使用に関連する別の生物学的効果が観察された。実施例４に示されるように、好酸球、活性化Ｂ細胞、活性化ＣＤ８細胞、ＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞比の頻度は、イエダニアレルゲンを受けたマウスにおいて有意により高かった。イエダニアレルゲンを与えたマウスの肺における活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の増加傾向も見られた。抗ＩＬ－３３抗体および抗ＩＬ－４Ｒ抗体の両方で処置したマウスでは、いずれかの抗体を単独で使用した場合に観察されるものと比較して、好酸球、活性化Ｂ細胞、活性化ＣＤ８細胞、ＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞比の頻度の減少傾向が見られた。
さらに、イエダニアレルゲンを受けたマウスは、それらの肺における杯細胞化生の増加も示す。同様に、このマウスモデルでは、肺硬化（肺胞腔における固体または液体材料の蓄積）および上皮下線維症（肺上皮下の過剰な間質性コラーゲン沈着）も増加した。抗ＩＬ－４Ｒ抗体と組み合わせた抗ＩＬ－３３抗体でのこれらのマウスの処置は、２つの抗体のいずれかを単独で使用した場合に観察される結果と比較して、杯細胞化生および上皮下コラーゲンの厚さの減少および肺硬化の有意な減少をもたらした。
イエダニアレルゲンを受けたマウスは、ＩｇＥの循環レベルの増加、およびイエダニ（ＨＤＭ）特異的ＩｇＧ１の増加傾向も示した。抗ＩＬ－３３抗体およびＩＬ－４Ｒ抗体の両方の投与は、これらの抗体のいずれかを単独で使用した場合に観察されるＩｇＥおよびＨＤＭ特異的ＩｇＧ１のレベルと比較して、血清ＩｇＥレベルの有意な減少およびＨＤＭ特異的ＩｇＧ１の減少傾向をもたらした。
炎症性肺障害または状態を処置する併用療法として使用するための本明細書に記載の抗体などのＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、ＩＬ－３３媒介シグナル伝達およびＩＬ－４Ｒ媒介シグナル伝達を阻害または減弱することができ、本明細書に記載のモデルで観察される生物学的特性、例えば、（１）アレルゲンへの曝露の結果として哺乳動物において上昇するサイトカイン、例えばＩＬ－４またはＩＬ－５のレベルの低下、（２）アレルゲン（例えば、イエダニ（ＨＤＭ））への急性または慢性の曝露に起因する肺炎症の阻害、（３）アレルゲン（例えば、イエダニ（ＨＤＭ））への急性または慢性の曝露に起因する細胞肺浸潤の減少、（４）複合的な肺肉眼病変の改善のうちの１つ以上を示し得る。
ＩＬ－３３媒介シグナル伝達またはＩＬ－４Ｒ媒介シグナル伝達の阻害は、細胞ベースのバイオアッセイで測定することができ、抗ＩＬ－３３抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは抗ＩＬ－４Ｒ抗体もしくはその抗原結合フラグメントが、ＩＬ－３３受容体またはＩＬ－４受容体およびＩＬ－３３結合またはＩＬ－４結合に応答して、検出可能なシグナルを産生するレポーター要素を発現する細胞中で生じるシグナルを阻害または低減することを意味する。例えば、本発明は、細胞ベースの阻止バイオアッセイで測定した場合に、ヒトＳＴ２を発現する細胞またはＩＬ－４受容体を発現する細胞において、それぞれ約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３５０ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２５０ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約９０ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約７０ｐＭ未満、約６０ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ、または約１０ｐＭ未満のＩＣ５０でＩＬ－３３媒介シグナル伝達またはＩＬ－４媒介シグナル伝達を阻止する抗体およびそ
の抗原結合フラグメントを含む。
本発明の抗体は、上述の生物学的効果のうちの１つ以上またはそれらの任意の組み合わせを示し得る。本発明の抗体の他の生物学的効果は、本明細書の実施例を含む本開示の精査から当業者に明らかであろう。ＩＬ－４アンタゴニストと組み合わせた他のＩＬ－３３アンタゴニストの使用は同様の効果を示し得る。
医薬組成物および投与
本発明は、本発明のＩＬ－３３アンタゴニストおよび／またはＩＬ－４Ｒアンタゴニストを含む医薬組成物を提供する。ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、別々の組成物中で製剤化されてもよいし、または１つの組成物中で共製剤化されてもよい。本発明の医薬組成物は、好適な担体、賦形剤、および改善された移動、送達、耐性などを提供する他の薬剤とともに製剤化される。多くの適切な製剤は、製薬化学者全員に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて認めることができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡなど）を含有する脂質（カチオン性またはアニオン性）、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト、水中油エマルションおよび油中水エマルション、エマルションカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１を参照のこと。
患者に投与される抗体の用量は、患者の年齢および体格、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変わり得る。好ましい用量は、典型的には体重または体表面積に従って計算される。本発明の抗体が成人患者におけるＩＬ－３３活性もしくはＩＬ－４に関連する状態または疾患を処置するために使用される場合、該抗体を通常は約０．０１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与で、より好ましくは約０．０２～約７、約０．０３～約５、または約０．０５～約３ｍｇ／ｋｇ体重で投与することが有利であり得る。状態の重症度に応じて、処置の頻度および期間を調整することができる。抗ＩＬ－３３抗体を投与するための有効投与量およびスケジュールは経験的に決定することができ、例えば、患者の経過を定期的な評価によってモニタリングし、それに応じて用量を調整することができる。さらに、投与量の種間スケーリングは、当該技術分野において周知の方法を用いて実施することができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。
種々の送達系が既知であり、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム封入、マイクロパーティクル、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシスである（例えば、Ｗｕ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照のこと）。導入方法には、皮内経路、経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、例えば、注入もしくはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚内層（ｌｉｎｉｎｇｓ）（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収による任意の好都合な経路によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身または局所であり得る。
本発明の医薬組成物は、標準的な針および注射器を用いて皮下にまたは静脈内に送達す
ることができる。加えて、皮下送達に関して、ペン送達装置は、本発明の医薬組成物を送達する上での適用を容易に有する。このようなペン送達装置は、再利用可能または使い捨て可能であり得る。再利用可能なペン送達装置は、概して、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを使用する。いったん、カートリッジ内の医薬組成物が全て投与され、カートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄することができ、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと容易に交換することができる。次に、ペン送達装置は再利用することができる。使い捨て可能ペン送達装置において、交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨て可能ペン送達装置は、この装置内の貯蔵器の中に保持された医薬組成物が事前に充填されている。いったん、貯蔵器が医薬組成物に関して空になると、装置全体が廃棄される。
数多くの再利用可能なペン送達装置および自動注射送達装置は、本発明の医薬組成物の皮下送達における応用を有する。例としては、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ｐｅｎ（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ｐｅｎ、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ｐｅｎ、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ｐｅｎ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ，ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ｐｅｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ
ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されず、ほんの数種類しか挙げていない。本発明の医薬組成物のおおよその送達での応用を有する使い捨て可能ペン型送達装置の例としては、いくつか例を挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注射器（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）、およびＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ ＩＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の状況において、医薬組成物は徐放系で送達することができる。一実施形態において、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照のこと）。別の実施形態において、ポリマー材料を使用することができる。Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ
ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。さらに別の実施形態において、徐放系を組成物の標的の近傍に配置することができ、それによって全身用量のほんの一部のみが必要となる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８を参照のこと）。他の徐放系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７－１５３３による総説で論じられている。
注射可能な調製物には、静脈内注射、皮下注射、皮内注射および筋肉内注射、点滴注入などのための剤形が含まれ得る。これらの注射可能な調製物は、公的に既知の方法によって調製され得る。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射用に従来通り使用される滅
菌水性媒体または油性媒体中に上述の抗体またはその塩を溶解、懸濁または乳化させることによって調製され得る。注射用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース含有等張液、および他の補助剤などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。油性媒体として、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが使用され、ベンジルベンゾエート、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。このように調製された注射は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
有利なことに、先に説明した経口または非経口での使用のための医薬組成物は、有効成分の用量に適合するのに適した単位用量の剤形へと調製される。そのような単位用量の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐薬などが挙げられる。前述の含有されるアンタゴニストの量は一般に、単位用量の剤形当たり約５～約５００ｍｇであり、特に注射の形態では、前述のアンタゴニストは約５～約１００ｍｇで含有されることが好ましく、他の剤形では約１０～約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
投与量
本発明の方法に従って対象に投与されるＩＬ－３３およびＩＬ－４Ｒアンタゴニストの量は、一般には治療有効量である。本明細書で使用される場合、「治療有効量」との語句は、ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストを組み合わせて使用する場合に、本明細書に記載されるような以下のうちの１つ以上に有意な変化をもたらすＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストの量を意味する、（ａ）炎症の予防、（ｂ）炎症の処置または重症度の軽減、（ｃ）肺における好酸球、活性化Ｂ細胞、活性化ＣＤ８Ｔ細胞、またはＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞比のうちの１つ以上の頻度の減少、（ｄ）インターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１β）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－５（ＩＬ－５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン１３（ＩＬ－１３）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）のうちの１つ以上の減少、（ｅ）肺におけるＩｌ４、ｌｌ５、Ｉｌ６、Ｉｌ９、Ｉｌ１３、Ｉｌ１ｒｌ１、Ｉｌ１３ｒａ２、ｔｎｆ、Ｔｇｆｂ１、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ１１、Ｃｃｌ２４、Ｃｏｌ１５ａ１、またはＣｏｌ２４ａ１のうちの１つ以上の遺伝子発現レベルの低下、（ｆ）血清ＩｇＥレベルの低下、（ｇ）肺における杯細胞化生の減少、または（ｈ）肺硬化の減少。ＩＬ－３３アンタゴニスト単独またはＩＬ－４Ｒアンタゴニストのいずれかの投与は、上記のパラメータのうちの１つ以上を用いて測定した場合に陽性の治療効果をもたらし得るが、ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストを組み合わせて使用すると、ＩＬ－３３アンタゴニスト単独またはＩＬ－４Ｒアンタゴニスト単独のいずれかでの単独療法を用いて観察されるものと比較して、それらパラメータのうちのいずれか１つ以上において有意な改善（例えば相加または相乗効果）を示す。
ＩＬ－３３アンタゴニストまたはＩＬ－４Ｒアンタゴニストの場合、治療有効量は、約０．０５ｍｇ～約６００ｍｇ、例えば、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、約１．０ｍｇ、約１．５ｍｇ、約２．０ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２７０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約２９０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３１０ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３３０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３７０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約３９０ｍｇ、約４
００ｍｇ、約４１０ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４３０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４７０ｍｇ、約４８０ｍｇ、約４９０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５１０ｍｇ、約５２０ｍｇ、約５３０ｍｇ、約５４０ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５６０ｍｇ、約５７０ｍｇ、約５８０ｍｇ、約５９０ｍｇ、または約６００ｍｇであり得る。ある特定の実施形態において、７５ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、または３００ｍｇのＩＬ－４Ｒアンタゴニストが、ＩＬ－３３アンタゴニストと組み合わせて対象に投与される。ある特定の実施形態において、７５ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、または３００ｍｇのＩＬ－３３アンタゴニストが、ＩＬ－４Ｒアンタゴニストと組み合わせて対象に投与される。
個々の用量に含有されるＩＬ－３３アンタゴニストまたはＩＬ－４Ｒアンタゴニストの量は、患者の体重キログラム当たりの抗体のミリグラム数（すなわち、ｍｇ／ｋｇ）で表すことができる。例えば、ＩＬ－３３アンタゴニストまたはＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量で患者に投与され得る。ある特定の実施形態において、ＩＬ－４ＲおよびＩＬ－３３アンタゴニストはそれぞれ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。
ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストの組み合わせは、対象に皮下、静脈内、筋肉内、または鼻腔内投与され得る。それらは同時または逐次投与され得る。
抗体の治療的使用
本発明者らが行ったマウスモデル系を用いた実験は、ＩＬ－３３およびＩＬ－４Ｒ拮抗作用の組み合わせによって処置、予防、および／または寛解することができる様々な疾患および状態の同定に資するものであった。例えば、肺炎症および線維症のイエダニモデルにおいて、ＩＬ－３３抗体およびＩＬ－４Ｒ抗体の組み合わせで処置することにより、それぞれの抗体を単独療法として単独で使用したときに得られる効果と比較して、肺におけるサイトカインレベルの減少、肺における肺細胞浸潤物（好酸球、活性化Ｂ細胞、活性化ＣＤ８陽性細胞、ＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞比）の減少、ならびに肺硬化および上皮下線維症の改善がもたらされた。
本発明の抗体は、特に、ＩＬ－３３発現およびＩＬ－４発現、シグナル伝達、もしくは活性に関連するまたはそれらによって媒介される任意の疾患または障害、あるいはＩＬ－３３とＩＬ－３３受容体（例えばＳＴ２）との間の相互作用を阻止することにより、もしくはＩＬ－４とＩＬ－４受容体との間の相互作用を阻止することにより、またはＩＬ－３３およびＩＬ－４の活性および／もしくはシグナル伝達を阻害することにより処置可能な任意の疾患または障害の処置、予防、および／または寛解に有用である。ある特定の実施形態において、ＩＬ－４Ｒアンタゴニストは、ＩＬ－４Ｒαに結合しまたはこれと相互作用し、その際にはＩＬ－４Ｒ１型および２型受容体を介してＩＬ－４およびＩＬ－１３シグナル伝達経路の両方を阻止する抗体である。したがって、この二重のＩＬ－４およびＩＬ－１３アンタゴニストをＩＬ－３３アンタゴニストと組み合わせて使用すると、３つ全てのシグナル伝達経路により一部媒介される炎症状態を有する患者に投与された場合、さらなる臨床的利益を提供し得る。例えば、本発明は、喘息（アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、重症難治性喘息、喘息増悪、ステロイド抵抗性もしくはステロイド難治性喘息、ステロイド感受性喘息、好酸球性喘息または非好酸球性喘息など）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）およびＣＯＰＤの増悪、喘息およびＣＯＰＤオーバーラップ症候群（ＡＣＯＳ）、慢性気管支炎、気腫、過敏性肺炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、乾癬、アレルギー、アレルギー性鼻炎、鼻ポリープを伴うまたは伴わない慢性鼻副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アナフィラキシー、心血管疾患、中枢神経系疾患、疼痛（炎症性疼痛を含む）、関節炎（例えば、リウマチ性関節炎、変形性関節症、乾癬性関節炎など）、巨細胞性動脈炎、
血管炎（ベーチェット病およびチャーグ・ストラウス症候群）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、多発性硬化症、炎症性腸障害（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）、狼瘡、シェーグレン症候群、ならびにＩＬ－３３および／またはＩＬ－４シグナル伝達によって一部媒介される他の炎症性疾患または障害を処置するための方法を提供する。
本発明の抗体はまた、１つ以上の線維性疾患または障害の処置、予防、および／または寛解に有用である。本発明の抗ＩＬ－３３およびＩＬ－４Ｒアンタゴニストを投与することによって処置可能な例示的な線維性疾患または障害としては、肺線維症（例えば、特発性肺線維症、ブレオマイシン誘導性肺線維症、アスベスト誘導性肺線維症、および閉塞性細気管支炎症候群）、急性肺損傷および急性呼吸窮迫に関連する線維症（例えば、細菌性肺炎誘導性線維症、外傷誘導性繊維症、ウイルス性肺炎誘導性線維症、人工呼吸器誘導性線維症、非肺性敗血症誘導性線維症、および誤嚥誘導性線維症）、珪肺症、放射線誘導性線維症、強皮症、眼線維症、皮膚線維症（例えば、強皮症）、肝線維症（例えば、肝硬変、アルコール誘導性肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変、感染症またはウイルス誘導性肝線維症、自己免疫性肝炎、腎臓（腎）線維症、心臓線維症、アテローム性動脈硬化症、ステント再狭窄、ならびに骨髄線維症が挙げられる。
本明細書に記載される処置方法との関連において、抗ＩＬ－３３抗体およびＩＬ－４Ｒ抗体は、一緒に（すなわち、唯一の治療計画として）、または１つ以上の追加の治療剤（この例は本明細書の他の箇所に記載されている）と組み合わせて投与されてもよい。
併用療法
本発明は、本明細書に記載される抗ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストのいずれかを１つ以上の追加の治療活性成分と組み合わせて含む組成物および治療用製剤の使用、ならびにそのような組み合わせを処置が必要な対象に投与することを含む処置方法を含む。本明細書で使用される場合、「組み合わせて」との表現は、追加の治療剤が、ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストを含む医薬組成物の前、後、またはそれと同時に投与されることを意味する。「組み合わせて」との用語はまた、ＩＬ－４ＲアンタゴニストおよびＩＬ－３３アンタゴニスト、ならびに１つ以上の追加の治療剤の逐次または同時投与を含む。本発明は、本発明のＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストが追加の治療活性成分（複数可）のうちの１つ以上とともに共製剤化された医薬組成物を含む。
例えば、ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストを含む医薬組成物の「前」に投与される場合、追加の治療剤は、ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストを含む医薬組成物の投与の約７２時間前、約６０時間前、約４８時間前、約３６時間前、約２４時間前、約１２時間前、約１０時間前、約８時間前、約６時間前、約４時間前、約２時間前、約１時間前、約３０分前、約１５分前、または約１０分前に投与され得る。ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストを含む医薬組成物の「後」に投与される場合、追加の治療剤は、ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストを含む医薬組成物の投与の約１０分後、約１５分後、約３０分後、約１時間後、約２時間後、約４時間後、約６時間後、約８時間後、約１０時間後、約１２時間後、約２４時間後、約３６時間後、約４８時間、約６０時間後、または約７２時間後に投与され得る。ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストを含む医薬組成物と「同時に」またはこれとともに投与することは、追加の治療剤が、対象に別々の剤形で、ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストを含む医薬組成物の投与の５分未満以内（前、後、または同時）に投与されるか、または追加の治療剤とＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストとの両方を含む単一の組み合わせ投与製剤として対象に投与されることを意味する。
追加の治療剤は、例えば、別のＩＬ－３３アンタゴニスト、別のＩＬ－４Ｒアンタゴニスト、ＩＬ－１アンタゴニスト（例えば、ＵＳ６，９２７，０４４に示されるＩＬ－１アンタゴニストを含む）、ＩＬ－６アンタゴニスト、ＩＬ－６Ｒアンタゴニスト（例えば、ＵＳ７，５８２，２９８に示される抗ＩＬ－６Ｒ抗体を含む）、ＩＬ－１３アンタゴニスト、ＴＮＦアンタゴニスト、ＩＬ－８アンタゴニスト、ＩＬ－９アンタゴニスト、ＩＬ－１７アンタゴニスト、ＩＬ－５アンタゴニスト（例えば、メポリズマブまたはＮＵＣＡＬＡ（登録商標））、ＩｇＥアンタゴニスト（例えば、オマリズマブまたはＸＯＬＡＩＲ（登録商標））、ＣＤ４８アンタゴニスト、ＩＬ－３１アンタゴニスト（例えば、ＵＳ７，５３１，６３７に示されるものを含む）、胸腺間質性リンホポエチン（ＴＳＬＰ）アンタゴニスト（例えば、ＵＳ２０１１／０２７４６８に示されるものを含む）、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）、抗生物質、コルチコステロイド（吸入コルチコステロイドまたはＩＣＳを含む）、長時間作用型β２アドレナリンアゴニスト（ＬＡＢＡ）、長時間作用型ムスカリンアンタゴニスト（ＬＡＭＡ）、タクロリムス、ピメクロリムス、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、クロモリンナトリウム、プロテイナーゼ阻害剤、抗ヒスタミン薬、またはそれらの組み合わせであり得る。
投与計画
本発明のある特定の実施形態によれば、ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニスト（またはＩＬ－３３アンタゴニスト、ＩＬ－４Ｒアンタゴニスト、および本明細書に言及されている追加の治療活性剤のいずれかの組み合わせを含む医薬組成物）の複数回用量を規定の時間経過にわたって対象に投与し得る。本発明のこの態様による方法は、本発明のＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストの複数回用量を対象に逐次投与することを含む。本明細書で使用される場合、「逐次投与する」とは、ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストの各用量が、所定の間隔（例えば、数時間、数日間、数週間または数ヶ月間）により隔てられた異なる時点、例えば、異なる日に対象に投与されることを意味する。本発明には、ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストの１回の１次用量、続いてＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストの１回以上の２次用量、続いて任意選択によりＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストの１回以上の３次用量を患者に逐次投与することを含む方法が含まれる。
「１次用量」、「２次用量」、および「３次用量」との用語は、本発明のＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストの投与の時系列を指す。したがって、「１次用量」とは、処置計画の開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも称する）であり、「２次用量」とは、１次用量後に投与される用量であり、「３次用量」とは、２次用量後に投与される用量である。１次用量、２次用量、および３次用量は全て、同じ量のＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストを含有し得るが、一般には投与頻度の点から互いに異なり得る。しかしながら、ある特定の実施形態において、１次用量、２次用量、および／または３次用量に含有されるＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストの量は、処置経過の間、互いに変動する（例えば、適宜上下に調整される）。ある特定の実施形態において、２回以上（例えば、２回、３回、４回、または５回）の用量が処置計画の開始時において「負荷用量（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｏｓｅ）」として投与され、続いてより低い頻度に基づいて投与される後続用量（例えば、「維持用量」）が投与される。
本発明のある特定の例示的な実施形態において、各２次用量および／または３次用量は、直前の投与の１～２６週間後（例えば、１、１・１／２、２、２・１／２、３、３・１／２、４、４・１／２、５、５・１／２、６、６・１／２、７、７・１／２、８、８・１／２、９、９・１／２、１０、１０・１／２、１１、１１・１／２、１２、１２・１／２
、１３、１３・１／２、１４、１４・１／２、１５、１５・１／２、１６、１６・１／２、１７、１７・１／２、１８、１８・１／２、１９、１９・１／２、２０、２０・１／２、２１、２１・１／２、２２、２２・１／２、２３、２３・１／２、２４、２４・１／２、２５、２５・１／２、２６、２６・１／２週間後、またはそれ以上後）に投与される。本明細書で使用する「直前の投与」との語句は、複数回投与の系列において、投薬の介入をせずに系列中の次の用量の投与前に患者に投与されるＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストの投薬を意味する。
本発明のこの態様による方法は、ＩＬ－３３アンタゴニストおよびＩＬ－４Ｒアンタゴニストの任意の回数の２次用量および／または３次用量を患者に投与することを含み得る。例えば、ある特定の実施形態において、単回の２次用量のみが患者に投与される。他の実施形態において、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の２次用量が患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態において、単回の３次用量のみが患者に投与される。他の実施形態において、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の３次用量が患者に投与される。
複数回の２次用量を含む実施形態において、各２次用量は他の２次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各２次用量は、直前の投与の１～２週間後または１～２ヶ月後に患者に投与されてもよい。同様に、複数回の３次用量を含む実施形態において、各３次用量は他の３次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各３次用量は、直前の投与の２～１２週間後に患者に投与されてもよい。本発明のある特定の実施形態において、２次用量および／または３次用量が患者に投与される頻度は、処置計画の経過にわたって変わり得る。投与頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師によって処置過程の間に調整され得る。
本発明は、２～６回の負荷用量が患者に第１の頻度（例えば、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回など）で投与され、続いてより少ない頻度に基づく２回以上の維持用量が患者に投与される、投与計画を含む。例えば、本発明のこの態様によれば、負荷用量が月に１回の頻度で投与される場合、維持用量は６週間に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回などで患者に投与されてもよい。
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすことの範囲を制限するよう企図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はしてきたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の記載がない限り、部分は重量部分であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
実施例１．ヒトＩＬ－３３に対するヒト抗体の生成
ヒト抗ＩＬ－３３抗体を米国特許第９，４５３，０７２号に記載のように生成した。表１は、選択された抗ＩＬ－３３抗体およびそれらの対応する抗体識別子の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列対ならびにＣＤＲ配列を示す。表２は、選択された抗ＩＬ－３３抗体およびそれらの対応する抗体識別子の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列対ならびにＣＤＲ配列をコードする核酸配列を示す。
Figure 2023175785000002
Figure 2023175785000003
抗体は、典型的には以下の命名法に従って本明細書中で言及される：Ｆｃ接頭語（例えば、「Ｈ１Ｍ」または「Ｈ４Ｈ」）、続いて数値識別子（例えば、表１に示す「９５５９」、「９５６６」、または「９６２９」）、続いて「Ｐ」または「Ｎ」接尾語）。したがって、この命名法によれば、抗体は、本明細書において、例えば「Ｈ１Ｍ９５５９Ｎ」、「Ｈ１Ｍ９５６６Ｎ」、「Ｈ４Ｈ９６２９Ｐ」などと言及され得る。本明細書に使用される抗体名のＨ１ＭおよびＨ４Ｈの接頭語は、抗体の特定のＦｃ領域アイソタイプを示す。例えば、「Ｈ１Ｍ」抗体はマウスＩｇＧ１ Ｆｃを有するのに対し、「Ｈ４Ｈ」抗体はヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有する。当業者によって理解されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体へ変換することができる（例えば、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ４を有する抗体へ変換することができる、など）が、いずれの事象においても、表１に示す数値識別子によって示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は同じままであることになっており、結合特性はＦｃドメインの性質にかかわらず、同一または実質的に類似であると期待される。
実施例２：ＩＬ－３３アンタゴニスト（ＩＬ－３３トラップ）の構築
ヒト抗ＩＬ－３３トラップを米国特許公開第２０１４／０２７１６４２号に記載のように生成した。表３ａはＩＬ－３３トラップの種々の成分に対するアミノ酸配列識別子の概要を示し、表３ｂはトラップの全長アミノ酸配列を示す。
標準的な分子生物学的技術を用いて、本発明の５つの異なる例示的なＩＬ－３３アンタゴニストを構築した。第１のＩＬ－３３アンタゴニスト（ｈＳＴ２－ｈＦｃ、配列番号３
２３）は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（配列番号３３２）のＮ末端に、Ｃ末端において融合されたヒトＳＴ２の可溶性細胞外領域（配列番号３２８）からなる。第２のＩＬ－３３アンタゴニスト（ｈＳＴ２－ｍＦｃ、配列番号３２４）は、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ領域（配列番号３３３）のＮ末端に、Ｃ末端において融合されたヒトＳＴ２の可溶性細胞外領域（配列番号３２８）からなる。第３のＩＬ－３３アンタゴニスト（ｈＳＴ２－ｈＩＬ１ＲＡｃＰ－ｍＦｃ、配列番号３２５）は、そのＮ末端においてヒトＳＴ２（配列番号３２８）、続いてヒトＩＬ－１ＲＡｃＰの細胞外領域（配列番号３３０）、続いてそのＣ末端においてマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ（配列番号３３３）を有する直列型融合からなる。第４のＩＬ－３３アンタゴニスト（ｍＳＴ２－ｍＩＬ１ＲＡｃＰ－ｍＦｃ、配列番号３２６）は、そのＮ末端においてマウスＳＴ２（配列番号３２９）、続いてマウスＩＬ－１ＲＡｃＰの細胞外領域（配列番号３３１）、続いてそのＣ末端においてマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ（配列番号３３３）を有する直列型融合からなる。第５のＩＬ－３３アンタゴニスト（ｈＳＴ２－ｈＩＬ１ＲＡｃＰ－ｈＦｃ、配列番号３２７）は、そのＮ末端において配列番号３２８のヒトＳＴ２、続いてヒトＩＬ－１ＲＡｃＰの細胞外領域（配列番号３３０）、続いてそのＣ末端においてヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号３３２）を有する直列型融合からなる。表３ａは、異なるＩＬ－３３アンタゴニストおよびそれらの成分部分の概要を示す。表３ｂは、ＩＬ－３３アンタゴニストのアミノ酸配列およびそれらの成分部分を示す。
Figure 2023175785000004
Figure 2023175785000005
Figure 2023175785000006
Figure 2023175785000007
Figure 2023175785000008
実施例３：ＩＬ－４Ｒアンタゴニスト抗体
ヒト抗ＩＬ－４Ｒ抗体を米国特許第７，６０８，６９３号に記載のように生成した。以下の実施例で使用した例示的なＩＬ－４Ｒ抗体は、マウスＩＬ－４Ｒに特異的なマウス抗体であり、以下のアミノ酸配列：配列番号３３５を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および配列番号３３６を含む軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＲ）を有する。デュピルマブと称するヒト抗ＩＬ－４Ｒ抗体は、ヒトＩＬ－４Ｒαに特異的に結合し、配列番号３３７を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、配列番号３３８を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、配列番号３３９を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）と、配列番号３４０を含むＨＣＤＲ２
と、配列番号３４１を含むＨＣＤＲ３と、配列番号３４２を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）と、配列番号３４３を含むＬＣＤＲ２と、配列番号３４４を含むＬＣＤＲ３と、を含む。デュピルマブの全長重鎖は配列番号３４５として示され、全長軽鎖は配列番号３４６として示される。
実施例４：肺炎症におけるＩＬ－３３の役割を研究するための慢性イエダニ（ＨＤＭ）誘導性線維症および重肺炎症モデルー抗ＩＬ－３３抗体、ＩＬ－４Ｒ抗体、または両方の組み合わせの効果の比較
慢性炎症性気道疾患は、主にアレルゲンまたは他の病原体への反復した曝露による気道炎症の再発エピソードの結果である。ヒトでは、そのような慢性的な傷害により、免疫細胞による肺浸潤、サイトカイン産生の増加、粘液産生、およびコラーゲン沈着を含む多様な病変が誘導される（Ｈｉｒｏｔａ，（２０１３）Ｃｈｅｓｔ．Ｓｅｐ；１４４（３）：１０２６－３２．；Ｐｏｓｔｍａ，（２０１５），Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，Ｓｅｐ２４；３７３（１３）：１２４１－９）。炎症性サイトカインおよび免疫細胞浸潤のこの増加は、激しい気道リモデリングを伴い、気道狭窄、アレルゲンまたは病原体などの吸入誘発剤への過敏症、気道閉塞、および肺機能の喪失を引き起こす。
関連するインビボモデルでの抗ＩＬ－３３阻害の効果を決定するために、慢性イエダニ抽出物（ＨＤＭ）誘導性線維症および重度肺炎症ならびにリモデリング研究を、マウスＩＬ－３３の代わりにヒトＩＬ－３３の発現に関してホモ接合性であるマウス（ＩＬ－３３ＨｕｍＩｎマウス；米国特許公開第２０１５／０３２００２１号および同第２０１５／０３２００２２号を参照のこと）で行った。慢性的なＨＤＭ抽出物曝露は重度肺炎症を誘導し、有意な細胞浸潤、サイトカイン発現、およびリモデリングをもたらす。抗ＩＬ－３３抗体、抗マウスＩＬ－４Ｒα抗体、または両方の組み合わせの効果をこのモデルで比較した。この研究で使用される抗マウスＩＬ－４Ｒα抗体はＭ１Ｍ１８７５Ｎと命名され、配列番号３３５／３３６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。この研究で使用された抗ＩＬ－３３抗体はＨ４Ｈ９６７５Ｐと命名され、配列番号２７４／２８２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
ＩＬ－３３ＨｕｍＩｎマウスに、２０μＬの１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した５０μｇのイエダニ抽出物（ＨＤＭ；Ｇｒｅｅｒ、＃ＸＰＢ７０Ｄ３Ａ２．５）または２０μＬの１×ＰＢＳを週当たり３日間、１５週間のいずれかで鼻腔内投与した。ＩＬ－３３ＨｕｍＩｎマウスの第２の対照群に、２０μＬの１×ＰＢＳで希釈した５０μｇのＨＤＭ抽出物を週当たり３日間、１１週間投与し、抗体処置の開始時における疾患の重症度を評価した。４群のＨＤＭチャレンジマウスに、２５ｍｇ／ｋｇの抗ＩＬ－３３抗体Ｈ４Ｈ９６７５Ｐ、抗マウスＩＬ－４Ｒα抗体Ｍ１Ｍ１８７５Ｎ、両方の抗体の組み合わせ、またはアイソタイプ対照抗体のいずれかを、ＨＤＭチャレンジの１１週間後から開始してＨＤＭチャレンジの終了まで（４週間の抗体処置）、週当たり２回皮下注射した。研究の１０８日目に全てのマウスを犠牲死させ、それらの肺を採取した。マウス群に対する実験的投与および処置プロトコルを表４に示す。
Figure 2023175785000009
サイトカイン分析のための肺の採取：
重要なメディエーター、例えば、プロトタイプ（ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃ）２型サイトカインＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－１３、ならびにＩＬ－１βまたはＴＮＦαなどの１型免疫応答の特性をより示すサイトカインの肺レベルの上昇が、ヒトの肺疾患の発症に関与している（Ｇａｎｄｈｉ，（２０１６）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｊａｎ；１５（１）：３５－５０．；Ｂａｒｎｅｓ，（２００８），Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｍａｒ；８（３）：１８３－９２）。これらの炎症性サイトカインの肺レベルを本研究で測定した。
放血後、各マウスから右肺の前葉および中葉を取り出し、１×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃８７７８６）を補充した組織タンパク質抽出試薬（１×Ｔ－ＰＥＲ試薬、Ｐｉｅｒｃｅ、＃７８５１０）の溶液を含有する菅に入れた。全てのさらなる工程を氷上で行った。Ｔ－ＰＥＲ試薬（プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する）の体積を、１：７（ｗ／ｖ）の組織対Ｔ－ＰＥＲ比に適合するように各試料について調整した。ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ＃８５３００）を用いて、肺試料を機械的に破砕した。得られた溶解物を遠心分離して、細片をペレット化した。可溶性タンパク質抽出物を含有する上清を新しい管に移し、さらなる分析まで４℃で保存した。
Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて、肺タンパク質抽出物中の総タンパク質含有量を測定した。このアッセイのために、１０μＬの希釈抽出物試料を９６ウェルプレートに２つ組でプレーティングし、２００μＬの１×Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏｒａｄ、＃５００－０００６）と混合した。１×Ｔ－Ｐｅｒ試薬中７００μｇ／ｍＬで開始するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ、＃Ａ７９７９）の階段希釈物を、抽出物のタンパク
質濃度を決定するための標準として用いた。室温で５分間インキュベートした後、５９５ｎｍの吸光度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで測定した。ＢＳＡ標準に基づく総肺抽出物タンパク質含有量を決定するためのデータ分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを用いて行った。
肺タンパク質抽出物中のサイトカイン濃度は、Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ１（マウス）マルチプレックスイムノアッセイキット（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｋ１５０４８Ｇ－２）およびカスタムマウス６ｐｌｅｘ Ｍｕｌｔｉ－Ｓｐｏｔ（登録商標）イムノアッセイキット（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｋ１５２Ａ４１－４）を使用して製造業者の指示に従って測定した。簡潔に述べると、５０μＬ／ウェルの較正物質（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）および試料（希釈液４１中で希釈）を、捕捉抗体でプレコーティングし、かつ７００ｒｐｍで２時間振盪しながら室温でインキュベートしたプレートに加えた。次いで、プレートを０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０を含有する１×ＰＢＳで３回洗浄し、続いて希釈液４５中で希釈にした２５μＬの検出抗体溶液を加えた。振盪しながら室温で２時間インキュベーションした後、プレートを３回洗浄し、１５０μＬの２×Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒを各ウェルに加えた。電気化学発光をＭＳＤ Ｓｐｅｃｔｏｒ（登録商標）機器で直ちに読み取った。データ分析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて行った。
各群の全てのマウス由来の肺総タンパク質抽出物中の各サイトカイン濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにより測定した抽出物の総タンパク質含有量に対して標準化し、表５に示されるように、総肺タンパク質１ｍｇ当たりのサイトカインの平均ｐｇ（ｐｇ／ｍｇ肺タンパク質、±ＳＤ）として各群について表した。
肺サイトカイン分析：
表５に示されるように、ＨＤＭを１５週間受け、アイソタイプ対照抗体で処置されたまたは処置されていないＩＬ－３３ＨｕｍＩｎマウスの肺で放出されたサイトカインおよびケモカインＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、およびＭＣＰ－１のレベルは、１×ＰＢＳ単独でチャレンジしたＩＬ－３３ＨｕｍＩｎマウスよりも有意に高かった。同様に、１５週間ＨＤＭを受けたＩＬ－３３ ＨｕｍＩｎマウスの肺でサイトカインＩＬ－１３およびＴＮＦαの放出の増加傾向が見られた。対照的に、慢性的ＨＤＭチャレンジの最後の４週間中に抗ＩＬ－３３抗体および抗マウスＩＬ－４Ｒα抗体の組み合わせで処置したＩＬ－３３ ＨｕｍＩｎマウスの肺におけるＩＬ－６、ＩＬ－１３、およびＭＣＰ－１のレベルは、この期間中にアイソタイプ対照抗体とともにＨＤＭを投与したＩＬ－３３ＨｕｍＩｎマウスと比較して有意に減少した。慢性的ＨＤＭチャレンジの最後の４週間中に抗ＩＬ－３３抗体および抗マウスＩＬ－４Ｒα抗体の組み合わせで処置したＩＬ－３３
ＨｕｍＩｎマウスでのＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１β、およびＴＮＦαの肺レベルは、この期間中にアイソタイプ対照抗体とともにＨＤＭを投与されたＩＬ－３３ＨｕｍＩｎマウスと比較して低下傾向が見られた。抗ＩＬ－３３抗体および抗マウスＩＬ－４Ｒα抗体の組み合わせで観察された肺サイトカインに対する効果は、いずれかの個々の抗体単独での処置よりも大きかった。
Figure 2023175785000010
遺伝子発現分析のための肺の採取
放血後、各マウスから右肺の副葉を取り出し、４００μＬのＲＮＡ Ｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ、＃ＡＭ７０２０）を含有する管に入れ、処理まで－２０℃で保存した。組織を
ＴＲＩｚｏｌ中でホモジナイズし、クロロホルムを相分離に用いた。全てのＲＮＡを含有する水相を、ＭａｇＭＡＸ（商標）－９６ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、＃ＡＭ１８３９）を用いて、製造業者の仕様書に従って精製した。ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）ＤＮａｓｅ ＢｕｆｆｅｒおよびＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅを用いて、上記のＭａｇＭＡＸキットから、ゲノムＤＮＡを取り出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１１７５５５００）を用いて、ｍＲＮＡ（２．５μｇ以下）をｃＤＮＡに逆転写した。 ｃＤＮＡを２ｎｇ／μＬに希釈し、１０ｎｇのｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃４３６９５４２）および関連するプローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；マウスＢ２ｍ：Ｍｍ００４３７７６２＿ｍ１；マウスＩｌ４：Ｍｍ００４４５２５９＿ｍ１；マウスＩｌ５：Ｍｍ００４３９６４６＿ｍ１；マウスＩｌ１３：Ｍｍ００４３４２０４＿ｍ１；マウスＩｌ９：Ｍｍ００４３４３０５＿ｍ１；マウスＩｌ６：Ｍｍ００４４６１９０＿ｍ１；マウスＣｃｌ２：Ｍｍ００４４１２４２＿ｍ１；マウスＣｃｌ１１：Ｍｍ００４４１２３８＿ｍ１ ；マウスＣｃｌ２４：Ｍｍ００４４４７０１＿ｍ１；マウスＴｎｆ：Ｍｍ００４４３２５８＿ｍ１；マウスＴｇｆｂ１：Ｍｍ０１１７８８２０＿ｍ１；マウスＩｌ１ｒｌ１：Ｍｍ００５１６１１７＿ｍ１；マウスＩｌ１３ｒａ２：Ｍｍ００５１５１６６＿ｍ１；マウスＣｏｌ１５ａ１：Ｍｍ００４５６５８４＿ｍ１；マウスＣｏｌ２４ａ１：Ｍｍ０１３２３７４４＿ｍ１；）を用いて、ＡＢＩ ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して増幅した。ｃＤＮＡ投入量の差を標準化するために、Ｂ２ｍを内部対照遺伝子として使用した。全試料の標準化のために使用した参照群を群１の試料の平均とした（「１×ＰＢＳチャレンジ」）。表６に示されるように、各遺伝子の発現を同じ試料内のＢ２ｍ発現に対して標準化し、参照群のその標準化された発現と比較して表した（平均±ＳＤ）。
肺遺伝子発現分析
表６に示されるように、１５週間ＨＤＭを受け、アイソタイプ対照抗体で処置されたまたは処置されていないＩＬ－３３ＨｕｍＩｎマウスの肺におけるサイトカイン、ケモカイン、およびコラーゲン遺伝子Ｉｌ４、Ｉｌ１３、Ｉｌ６、Ｃｃｌ２、Ｔｇｆｂ１、Ｉｌ１３ｒａ２、およびＣｏｌ２４ａ１の発現レベルは、１×ＰＢＳ単独でチャレンジしたＩＬ－３３ ＨｕｍＩｎマウスと比較して有意に増加した。同様に、１５週間ＨＤＭを摂取したＩＬ－３３ ＨｕｍＩｎマウスの肺では遺伝子Ｉｌ５、Ｉｌ９、Ｃｃｌ１１、Ｃｃｌ２４、Ｔｎｆ、Ｉｌ１ｒｌ１、およびＣｏｌ１５ａ１の発現の増加傾向が見られた。
対照的に、慢性的ＨＤＭチャレンジの最後の４週間中に抗ＩＬ－３３抗体および抗マウスＩＬ－４Ｒα抗体の組み合わせで処置したＩＬ－３３ ＨｕｍＩｎマウスでのＩｌ６、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ１１、およびＣｃｌ２４のレベルは、この期間中にアイソタイプ対照抗体とともにＨＤＭを投与したＩＬ－３３ＨｕｍＩｎマウスと比較して有意に減少した。対照的に、慢性的ＨＤＭチャレンジの最後の４週間中に抗ＩＬ－３３抗体および抗マウスＩＬ－４Ｒα抗体の組み合わせで処置したマウスでのＩｌ４、Ｉｌ５、Ｉｌ１３、Ｉｌ９、Ｔｎｆ、Ｔｇｆｂ１、Ｉｌ１ｒｌ１、Ｉｌ１３ｒａ２、Ｃｏｌ１５ａ１、およびＣｏｌ２４ａ１の発現レベルは、この期間中にアイソタイプ対照抗体とともにＨＤＭを投与したＩＬ－３３ＨｕｍＩｎマウスと比較して低下する傾向が見られた。抗ＩＬ－３３抗体および抗マウスＩＬ－４Ｒα抗体の組み合わせで観察された遺伝子発現に対する効果は、いずれかの個々の抗体単独による処置よりも大きかった。
Figure 2023175785000011
Figure 2023175785000012
肺細胞浸潤物分析のための肺の採取
免疫細胞による肺浸潤は、喘息およびＣＯＰＤを含む複数の気道炎症性疾患で観察される。好中球性肺炎症は、喘息患者における肺機能の低下および重度の組織リモデリングと
関連し（Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ．ａｌ．， （２０１２），Ｎａｔ Ｍｅｄ １８（５）：７１６－７２５）、ＣＯＰＤ患者における肺損傷の増加と関連している（Ｍｅｉｊｅｒ，
ｅｔ．ａｌ．，（２０１３），Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１１）：１０５５－１０６８）。好酸球性肺炎症は、アトピー性疾患において通常見られる２型炎症の顕著な特徴である（Ｊａｃｏｂｓｅｎ， ｅｔ．ａｌ．，（２０１４），Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．，Ａｌｌｅｒｇｙ，４４（９）：１１１９－１１３６）。ヒトでは、肉芽腫性肺疾患および他の慢性炎症状態を有する患者において高ＣＤ４／ＣＤ８比が観察される（Ｃｏｓｔａｂｅｌ， ｅｔ．ａｌ．，（１９９７），Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．１０（１２）：２６９９－２７００；Ｇｕｏ，ｅｔ．ａｌ．，（２０１１），Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，４８（Ｐｔ４）：３４４－３５１）。本研究ではフローサイトメトリーを使用し、ＨＤＭ曝露マウスの肺での細胞浸潤のレベルを決定した。
放血後、各マウスから右肺の尾葉を取り出し、約２～３ｍｍのサイズの立方体に切り刻み、次いでハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ、＃１４０２５）中で希釈された２０μｇ／ｍＬ ＤＮＡｓｅ（Ｒｏｃｈｅ、＃１０１０４１５９００１）および０．７Ｕ／ｍＬ Ｌｉｂｅｒａｓｅ ＴＨ （Ｒｏｃｈｅ、＃０５４０１１５１００１）の溶液を含有する管に入れ、これを３７℃の水浴中で２０分間インキュベートし、５分毎にボルテックスした。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、Ｇｉｂｃｏ、＃１５５７５）を１０ｍＭの最終濃度で加えることにより、反応を停止させた。各肺をｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ破砕装置（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０－０９５－９３７）を用いて破砕し、次いで７０μｍフィルターを通して濾過し、遠心分離した。得られた肺ペレットを１ｍＬの１×赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ、＃Ｒ７７５７）に再懸濁化して、赤血球を除去した。室温で３分間インキュベートした後、３ｍＬの１×ＤＭＥＭを加えて赤血球溶解緩衝液を不活化した。次いで細胞懸濁液を遠心分離し、得られた細胞ペレットを５ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液（ａｕｔｏＭＡＣＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０－０９１－２２１）に再懸濁化した。再懸濁化した試料を７０μｍフィルターを通して濾過し、１ウェル当たり１×１０６細胞を９６ウェルのＶ底プレートでプレーティングした。次いで細胞を遠心分離し、ペレットを１×ＰＢＳ中で洗浄した。２回目の遠心分離後、細胞ペレットを１×ＰＢＳ中で１：５００に希釈した１００μＬのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｂｌｕｅ Ｄｅａｄ
Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ｌ２３１０５）に再懸濁化して細胞生存度を決定し、遮光しながら室温で２０分間インキュベートした。１×ＰＢＳ中で１回洗浄した後、細胞を１０μｇ／ｍＬの精製ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（クローン：２．４Ｇ２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５３１４２）を含有するＭＡＣＳ緩衝液中で４℃で１０分間インキュベートした。次いで、遮光しながら、細胞をＭＡＣＳ緩衝液で希釈した適切な２×抗体混合物（表７に記載）中で４℃で３０分間インキュベートした。抗体のインキュベーション後、細胞をＭＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、ＢＤ ＣｙｔｏＦｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５４６５５）中に再懸濁化し、次いで遮光しながら４℃で１５分間インキュベートした。続いて細胞を洗浄し、ＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁化し、次いでフローサイトメトリーによる細胞浸潤物の分析のためにＢＤ ＦＡＣＳ菅（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃３５２２３５）に移した。
ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞をそれぞれ、生きている細胞ＣＤ４５＋、ＳＳＣＬｏ、ＦＳＣＬｏ、ＣＤ３＋、ＣＤ１９－、ＣＤ４＋、ＣＤ８－、および生きている細胞ＣＤ４５＋、ＳＳＣＬｏ、ＦＳＣＬｏ、ＣＤ３＋、ＣＤ１９－、ＣＤ４－、ＣＤ８＋として定義した。活性化ＣＤ４Ｔ細胞を生きている細胞ＣＤ４５＋、ＳＳＣＬｏ、ＦＳＣＬｏ、ＣＤ３＋、ＣＤ１９－、ＣＤ４＋、ＣＤ８－、およびＣＤ６９＋として定義した。活性化ＣＤ８Ｔ細胞を生きている細胞ＣＤ４５＋、ＳＳＣＬｏ、ＦＳＣＬｏ、ＣＤ３＋、ＣＤ１９－、ＣＤ４－、ＣＤ８＋、およびＣＤ６９＋として定義した。活性化Ｂ細胞を生きている細胞Ｃ
Ｄ４５＋、ＳＳＣＬｏ、ＦＳＣＬｏ、ＣＤ３－、ＣＤ１９＋、およびＣＤ６９＋として定義した。ＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を生きている細胞ＣＤ４５＋、ＳＳＣＬｏ、ＦＳＣＬｏ、ＣＤ３＋、ＣＤ１９－、ＳＴ２＋およびＣＤ４＋として定義した。好酸球を生きているＣＤ４５＋、ＧＲ１－、ＣＤ１１ｃｌｏ、ＳｉｇｌｅｃＦｈｉとして定義した。肺胞マクロファージを生きているＣＤ４５＋、ＧＲ１－、ＣＤ１１ｃＨｉ、ＳｉｇｌｅｃＦｈｉとし定義した。活性化細胞のデータを親集団（ＣＤ４、±ＳＤ）内の活性化細胞（ＣＤ６９＋）の頻度として表す。ＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のデータをＴ細胞（生きている細胞ＣＤ４５＋、ＳＳＣＬｏ、ＦＳＣＬｏ、ＣＤ３＋およびＣＤ１９－として定義された）の頻度として表す。好酸球および肺胞マクロファージのデータを生きている細胞の頻度として表す。ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞比を生きている集団内のＣＤ８Ｔ細胞の頻度に対するＣＤ４Ｔの頻度の比として計算する。全データを表８に示す。
Figure 2023175785000013
肺細胞浸潤分析：
表８に示されるように、ＨＤＭを１５週間受け、アイソタイプ対照抗体で処置されたまたは処置されていないＩＬ－３３ＨｕｍＩｎマウスの肺での好酸球、活性化Ｂ細胞、活性化ＣＤ８細胞、ＳＴ２＋Ｃｄ４＋Ｔ細胞およびＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞比の頻度は、１×ＰＢＳ単独でチャレンジしたＩＬ－３３ ＨｕｍＩｎマウスにおけるよりも有意に高かった。同様に、１５週間ＨＤＭを受けたＩＬ－３３ ＨｕｍＩｎマウスの肺において活性化ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度の増加傾向が見られた。アイソタイプ対照抗体処置の非存在下または存在下で１５週間ＨＤＭを受けたＩＬ－３３ ＨｕｍＩｎマウスの肺では、フローサイトメトリーにより検出した肺胞マクロファージの頻度の減少傾向が見られた。肺胞マクロファージの頻度は、慢性的ＨＤＭチャレンジの最後の４週間中に抗ＩＬ－３３抗体および抗マウスＩＬ－４Ｒα抗体の組み合わせで処置したＩＬ－３３ ＨｕｍＩｎマウスの肺で、この期間中にアイソタイプ対照抗体とともにＨＤＭを投与したＩＬ－３３ＨｕｍＩｎマウスと比較して有意に増加した。同様に、慢性的ＨＤＭチャレンジの最後の４週間中に抗ＩＬ－３３抗体および抗マウスＩＬ－４Ｒα抗体の組み合わせで処置されたマウスの肺では、好酸球、活性化ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、ＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびにＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞比の頻度の減少傾向が見られた。抗ＩＬ－３３抗体および抗マウスＩＬ－４Ｒα抗体の組み合わせで観察される肺での好酸球、肺胞マクロファージ
、活性化ＣＤ８ Ｔ細胞、ＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ４／ＣＤ８比の頻度に対する効果は、いずれかの個々の抗体単独での処置よりも大きい効果の傾向を示した。
Figure 2023175785000014
病理組織診断（ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）の定量化のための肺の採取：
このモデルで観察される炎症パターンは、杯細胞化生の徴候、上皮下コラーゲン沈着の増加、および顕著な肺硬化を有する、ＨＤＭに曝露された肺における広範かつ重度の構造変化を伴う。これらの病変は、肺機能の低下および気道過敏性をもたらすヒト炎症性呼吸器疾患の既知の特徴である（Ｊａｍｅｓ，（２００７）Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ．，Ｊｕｌ；３０（１）：１３４－５５；Ｊｅｏｎｇ，（２００７）Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃｓ Ｍａｙ－Ｊｕｎ；２７（３）：６１７－３７）。
放血後、左肺を取り出し、１×リン酸緩衝生理食塩水中の４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、＃ＢＭ－１５５）の３ｍＬ溶液を含有するプレートに入れ、室温で３日間保存した。次に肺試料をブロットドライし（ｂｌｏｔｔｅｄ ｄｒｙ）、組織学的分析のために７０％エタノールを含有する菅に移した。試料をパラフィン包埋、切片化、および過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）またはヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のためにＨｉｓｔｏｓｅｒｖ、Ｉｎｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）に送った。
杯細胞化生の定量化：
杯細胞化生および粘液過剰分泌は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、および嚢胞性線維症を含む多くの肺疾患の顕著な特徴である（Ｂｏｕｃｈｅｒａｔ，（２０１３）Ｅｘｐ Ｌｕｎｇ Ｒｅｓ．２０１３Ｍａｙ－Ｊｕｎ；３９（４－５）：２０７－１６）。過剰な粘液産生は気道閉塞を引き起こし、肺機能、健康関連の生活の質、増悪、入院、およびヒトの死亡率などのいくつかの重要な結果に影響を与える（Ｒａｍｏｓ，ＦＬ，ｅｔ．ａｌ．，（２０１４），Ｉｎｔ Ｊ Ｃｈｒｏｎ Ｏｂｓｔｒｕｃｔ Ｐｕｌｍｏｎ Ｄｉｓ，Ｊａｎ． ２４；９：１３９－１５０）。ＰＡＳ陽性杯細胞および総上皮細胞を主気管支のミリメートル長で計数した。表９に示されるように、杯細胞化生を気管支上皮の１ミリメートル中のＰＡＳ陽性細胞の頻度として表す（％、±ＳＤ）。
肺硬化の定量化：
「肺硬化」は、肺胞空間における固体または液体材料の蓄積として定義される。肺硬化は、細胞浸潤、過形成、および粘液産生の組み合わせを反映し得る複合的評価項目であり、ここでは肉眼病変の測定として使用する。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して、モバットペンタクローム染色されたパラフィン包埋肺切片上で、結晶体によって占められる肺面積の割合を定量化した。粒子分析機能を使用して、切片の総肺面積および切片の硬化面積を測定した。表９に示されるように、肺硬化面積の割合は両方の測定値の比によって与えられる。
上皮下線維症の定量化
「上皮下線維症」は、肺上皮下の過剰な間質性コラーゲン沈着として定義される（Ｒｅｄｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ．ａｌ．，（１９９７），Ｔｈｏｒａｘ， Ａｐｒｉｌ；５２（４）：３１０－３１２）。上皮下線維症の増加は、ヒトの喘息と特異的に関連することが報告されている（Ｂｏｕｌｅｔ， ｅｔ．ａｌ．，（１９９７）Ｃｈｅｓｔ， Ｊｕｌｙ；１１２（１）：４５－５２；Ｊａｍｅｓ，ＡＬ ａｎｄ Ｗｅｎｚｅｌ，Ｓ．，（２００７），Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ，Ｊｕｌｙ， ３０（１）：１３４－１５５）。本モデルでは、ＨａＬｏソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ、ＮＭ）を使用して、マッソントリクローム色染色されたパラフィン包埋肺切片上で上皮下線維症を測定した。「層厚」ツールを使用して、気管支上皮下のコラーゲン層の厚さを、主気管支１ミリメートルにわたって約３０μｍの間隔で複数回記録した。表９に示されるように、上皮下線維症を上皮下のコラーゲン層の平均厚さ（μｍ、±ＳＤ）として表す。
肺病理組織診断の分析
表９に示されるように、１５週間ＨＤＭを受け、アイソタイプ対照抗体で処理したまた
は処置していないＩＬ－３３ ＨｕｍＩｎマウスの肺において、１×ＰＢＳ単独でチャレンジしたＩＬ－３３ ＨｕｍＩｎと比較して、杯細胞化生の増加傾向が見られた。同様に、１５週間ＨＤＭを受けたＩＬ－３３ ＨｕｍＩｎマウスでは、肺硬化および上皮下コラーゲン厚が有意に増加した。
対照的に、慢性的ＨＤＭチャレンジの最後の４週間中に抗ＩＬ－３３抗体および抗マウスＩＬ－４Ｒα抗体の組み合わせで処置したＩＬ－３３ ＨｕｍＩｎマウスの肺では、この期間中にアイソタイプ対照抗体とともにＨＤＭを投与したＩＬ－３３ＨｕｍＩｎマウスと比較して、杯細胞化生および上皮下コラーゲン厚の減少傾向ならびに肺硬化の有意な減少傾向が見られた。抗ＩＬ－３３抗体および抗マウスＩＬ－４Ｒα抗体の組み合わせで観察された杯細胞化生、肺硬化、および上皮下コラーゲン厚に対する効果は、いずれかの個々の抗体単独での処置よりも有効性が高くなる傾向を示した。
Figure 2023175785000015
ＩｇＥおよびＨＤＭ特異的ＩｇＧ１レベル測定のための血清の採取：
各マウスについて血清試料中の総ＩｇＥ濃度を決定するために、サンドイッチＥＬＩＳＡ ＯＰＴＥＩＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５５２４８）を製造業者の指示に従って使用した。血清試料を希釈し、９６ウェルプレート上にコーティングした抗ＩｇＥ捕捉抗体とともにインキュベートした。ビオチン化抗マウスＩｇＥ二次抗体により、総ＩｇＥを検出した。精製西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識マウスＩｇＥを標準として使用した。クロマゲン３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＢＤＯＰＴＥＩＡ基質試薬セット、ＢＤ、＃５５５２１４）を使用してＨＲＰ活性を検出した。次いで、１Ｍ硫酸の停止溶液を加え、４５０ｎｍにおける吸光度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで測定した。Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用して、データ分析を行った。表１０に示される
ように、各実験群の血清中の循環ＩｇＥレベルの平均量はｎｇ／ｍＬ（±ＳＤ）として表される。
各マウス由来の血清試料中のＨＤＭ特異的ＩｇＧ１レベルを決定するために、ＥＬＩＳＡを利用した。ＨＤＭ（Ｇｒｅｅｒ、＃ＸＰＢ７０Ｄ３Ａ２．５）をコーティングしたプレートを段階希釈したマウス血清試料とともにインキュベートし、続いてラット抗マウスＩｇＧ１－ＨＲＰに結合された抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５９６２６）とともにインキュベートした。全ての試料をＴＭＢ溶液で展開し、上記のように分析した。血清中の循環ＩｇＧ１の相対レベルは力価単位として表される（力価単位は、測定されたＯＤに、バックグラウンドの２倍を超えるＯＤ４５０を達成するのに必要な希釈係数を掛けることによって計算した）。表１０に示されるように、各実験群の血清中の平均循環ＨＤＭ特異的ＩｇＧ１レベルは力価×１０６（±ＳＤ）として表される。
ＩｇＥおよびＨＤＭ特異的ＩｇＧ１の循環レベルの分析
表１０に示されるように、１５週間ＨＤＭを受け、アイソタイプ対照抗体で処置されたまたは処置されていないＩＬ－３３ＨｕｍＩｎマウスの血清では、１×ＰＢＳ単独でチャレンジしたＩＬ－３３ＨｕｍＩｎマウスと比較して、ＩｇＥの循環レベルが有意に増加した。同様に、１５週間ＨＤＭを受けたＩＬ－３３ ＨｕｍＩｎマウスの血清では循環ＨＤＭ特異的ＩｇＧ１のレベルの増加傾向が見られた。対照的に、慢性的ＨＤＭチャレンジの最後の４週間中に抗ＩＬ－３３抗体および抗マウスＩＬ－４Ｒα抗体の組み合わせで処置したＩＬ－３３ ＨｕｍＩｎマウスの血清では、アイソタイプ対照抗体とともにＨＤＭを投与されたＩＬ－３３ＨｕｍＩｎマウスと比較して、ＩｇＥの循環レベルの有意な減少およびＨＤＭ特異的ＩｇＧ１の循環レベルの減少傾向が見られた。
Figure 2023175785000016
重度の混合炎症との関連で開始されたＨ４Ｈ９６７５Ｐおよび抗ｍＩＬ－４Ｒα処置の組み合わせは、測定された全ての炎症パラメータを改善し、ほとんどをベースラインレベルまで低下させる。さらに、複合的肺肉眼病変、杯細胞化生、肺細胞浸潤、およびサイトカインレベルを含む最も悪性の評価項目のいくつかで相加効果が観察される。したがって、両方の経路を同時に阻止することは、重度の混合炎症および組織病変との関連で複数の炎症メディエーターに影響を与え、複数のパラメータをベースラインへと標準化する可能性を有する。
実施例５：水素重水素交換によるＩＬ３３へのＨ４Ｈ９６７５Ｐ結合エピトープマッピング
抗ＩＬ３３抗体Ｈ４Ｈ９６７５Ｐによって認識されるヒトＩＬ３３のエピトープを決定するために、ヒトＩＬ３３と共複合体形成された抗体について水素－重水素（Ｈ／Ｄ）交換研究を行った。実験のために、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを伴って発現される組換えヒトＩＬ３３（配列番号３５６）を使用した。Ｈ／Ｄ交換方法の一般的説明は、Ｅｈｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９ ａｎｄ Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａに示されている。Ｈ／Ｄ交換実験は統合型Ｗａｔｅｒｓ ＨＤＸ／ＭＳプラットフォーム上で行われ、これは重水素標識のためのＬｅａｐｔｅｃ ＨＤＸ ＰＡＬシステム、試料消化および充填のためのＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｍ－Ｃｌａｓｓ（Ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｎａｇｅｒ）、分析用カラム勾配のためのＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｍ－Ｃｌａｓｓ（μＢｉｎａｒｙ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｎａｇｅｒ）、および消化ペプチド質量測定のためのＳｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓｉ質量分析計からなる。
標識溶液をｐＤ７．０（ｐＨ６．６に相当）のＤ２Ｏ中１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液で調製した。重水素標識のために、３．８μＬのｈＩＬ３３－ＭＭＨ（９６ｐｍｏｌ／μＬ）または１：１のモル比で抗体と予め混合したｈＩＬ３３－ＭＭＨを、５６．２μＬのＤ２Ｏ標識溶液とともに様々な時間（２分間、１０分間、重水素化されていない対照＝０秒間）インキュベートした。５０μＬの試料を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．５）中の予め冷却した０．２Ｍ ＴＣＥＰ、６Ｍグアニジンクロリド（クエンチ緩衝液）５０μＬに移すことによって重水素化をクエンチし、混合試料を１．０℃で２時間インキュベートした。次に、クエンチした試料をオンライン（ｏｎｌｉｎｅ）のペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化のためにＷａｔｅｒｓ ＨＤＸ Ｍａｎａｇｅｒに注入した。消化されたペプチドは０℃でＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ、２．１ｘ５ｍｍ ＶａｎＧｕａｒｄプレカラム上に捕捉され、５％～４０％Ｂ（移動相Ａ：水中０．１％ギ酸、移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％ギ酸）の９分間の勾配分離を用いてＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７－μｍ、１．０ｘ５０ｍｍカラムに溶出した。質量分析計を３７Ｖのコーン電圧、０．５秒のスキャン時間、および５０～１７００Ｔｈの質量／電荷範囲に設定した。
ｈＩＬ３３－ＭＭＨ由来のペプチドを同定するために、非重水素化試料由来のＬＣ－ＭＳＥデータを処理し、Ｗａｔｅｒｓ ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｒｖｅｒ（ＰＬＧＳ）ソフトウェアにより、ヒトＩＬ３３、ペプシン、およびそれらのランダム化配列を含むデータベースに対して検索した。同定されたペプチドをＤｙｎａｍＸソフトウェアにインポートし、２つの基準：１）１アミノ酸当たりの最小産物：０．３、および２）反復ファイル閾値（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｉｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）：３によりフィルタリングした。次いで、ＤｙｎａｍＸソフトウェアにより、複数時点にわたって各時点で３回反復しつつ、保持時間および高い質量精度（＜１０ｐｐｍ）に基づいて、各ペプチドの重水素取り込みが自動的に決定された。
ＭＳＥデータ取得と組み合わせたオンラインのペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ列を使用して、ｈＩＬ３３－ＭＭＨ由来の合計６８個のペプチドがｈ４Ｈ９６７５Ｐの非存在下または存在下で同定され、これは９５％の配列対象範囲を表す。Ｈ４Ｈ９６７５Ｐに結合した際、１１個のペプチドが重水素の取り込みを有意に減少し（質量中心（ｃｅｎｔｒｏｉｄ）デルタ値＞０．４ダルトン、ｐ値＜０．０５）、該ペプチドは表１１に列挙されている。記録されたペプチド質量は、３回の反復から得られた質量中心ＭＨ＋質量の平均値に対応する。配列番号３４９のアミノ酸１～１２および５０～９４に対応するこれらのペプチドは、Ｈ４Ｈ９６７５Ｐの結合によってより遅い重水素化速度を有した。これらの同定された残基はまた、Ｕｎｉｐｒｏｔ ｅｎｔｒｙＯ９５７６０（ＩＬ３３＿ヒト；配列番号３４８も参照のこと）によって定義される、ヒトＩＬ－３３の残基１１２～１２３および１６１～２０５に対応する。これらのデータは、抗体Ｈ４Ｈ９６７５ＰのＩＬ－３３中の結合領域を少なくとも部分的に定義する、配列番号３４８のアミノ酸残基１１２～１２３および１６１～２０５、または配列番号３４９のアミノ酸残基１～１２および５０～９４の裏付けを提供する。
Figure 2023175785000017
実施例６：ＩＬ－３３－、ＩＬ－４－およびＩＬ－４Ｒα－ヒト化マウスを用いたアレルゲン誘導性肺炎症の１９週間モデルにおける、ＩＬ－３３抗体（ＲＥＧＮ３５００）およびＩＬ－４Ｒ抗体（デュピルマブ）の単独または組み合わせの効果
ＩＬ－３３抗体単独、ＩＬ－４Ｒ抗体単独、または両方の抗体の組み合わせの効果を、マウスＩＬ－３３の代わりにヒトＩＬ－３３の発現に関してホモ接合性であるマウス（ＩＬ－３３ ＨｕｍＩｎマウス；米国特許公開第２０１５／０３２００２１号および同第２０１５／０３２００２２号を参照のこと）を用いて、上記の実施例４で最初に試験した。完全ヒト抗ＩＬ－３３抗体（ＲＥＧＮ３５００）、および抗マウスＩＬ－４Ｒα抗体、またはその両方の組み合わせをこのモデルで比較し、結果を実施例４に記載した。
ヒト抗ＩＬ－３３抗体（ＲＥＧＮ３５００）もヒト抗ＩＬ－４Ｒ抗体（デュピルマブ）もそれらのそれぞれのマウス標的タンパク質に結合しないので、マウスＩＬ－３３、ＩＬ－４、およびＩＬ－４Ｒαの外部ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）を対応するヒト配列（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕＩｌ３３ｈｕ／ｈｕ）で置換した遺伝子改変マ
ウスを生成した。Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕＩｌ３３ｈｕ／ｈｕマウス系統を、４週間のＨＤＭ曝露誘導性肺炎症モデルを用いて、ＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブ投与の効果を研究するためのツールとして検証した。このモデルで、好酸球性肺浸潤評価によって評価したところ、ＨＤＭ曝露Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕＩｌ３３ｈｕ／ｈｕマウスは野生型マウスと同様の免疫応答を示した。
ＩＬ－３３およびＩＬ－４／ＩＬ－１３経路の同時阻止が、いずれかの経路単独の阻止よりも肺炎症に対して大きな影響を及ぼし得るかどうかを決定するために、下記の試験を行った。この研究では、Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕＩｌ３３ｈｕ／ｈｕマウスを１９週間にわたりＨＤＭまたは生理食塩水に鼻腔内（ＩＮ）曝露した。Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕＩｌ３３ｈｕ／ｈｕマウスの対照群を１１週間のＨＤＭ曝露後に犠牲死させ、抗体処置の開始時における疾患の重症度を評価した。１９週間ＨＤＭ曝露マウスは、抗体処置を受けなかったか、または１２週～１９週のＨＤＭ曝露中に皮下（ＳＣ）抗体注射を週２回、合計８週間および１６用量受けたかのいずれかであった。以下の抗体を１１ｍｇ／ｋｇの最終タンパク質用量で投与した：（ａ）１１ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体、（ｂ）１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ３５００＋１０ｍｇ／ｋｇアイソタイプ対照抗体（ｃ）１０ｍｇ／ｋｇのデュピルマブ＋１ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体、または（ｄ）１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ３５００＋１０ｍｇ／ｋｇのデュピルマブ。ＨＤＭ曝露マウスに対するＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブ処置の単独または組み合わせの効果を、以下の気道炎症の病理学的マーカーについて評価した：
－肉眼病変（相対肺重量）
－１型炎症性細胞（好中球、好中球マーカーミエロペルオキシダーゼ［ＭＰＯ］の肺タンパク質レベルによって定量化）および２型炎症性細胞（全ての活性化［ＣＤ１１ｃＨｉ］好酸球およびＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞による肺組織浸潤、フローサイトメトリーによって定量化）による肺組織浸潤
－炎症性サイトカイン肺タンパク質レベル（ヒトＩＬ－４およびマウスＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＧＲＯα、およびＭＣＰ－１、イムノアッセイにより定量化）
－炎症の全身性マーカーである血清アミロイドＡ［ＳＡＡ］タンパク質の循環レベル（イムノアッセイにより定量化）
材料および方法
試験システム
ＩＬ－３３、ＩＬ－４、およびＩＬ－４Ｒα外部ドメインヒト化マウス
ＲＥＧＮ３５００もデュピルマブも、それぞれマウスＩＬ－３３またはマウスＩＬ－４Ｒαに結合しない。したがって、ＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブを協同しておよび組み合わせて試験するために、マウスＩＬ－３３、ＩＬ－４、およびＩＬ－４Ｒαの外部ドメインを対応するヒト配列（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕＩｌ３３ｈｕ／ｈｕ）で置換した遺伝子改変マウスを生成した。この三重ヒト化マウス系統は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）技術（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ， ＤＭ， ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３），Ｊｕｎ；２１（６）：６５２－９，Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ，ＷＴ，ｅｔ ａｌ．
Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７）Ｊａｎ；２５（１）：９１－９）を用いて、上記で特徴付けしたＩＬ－４／ＩＬ－４Ｒα外部ドメイン－ヒト化マウス系統Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕと上記で特徴付けしたＩＬ－３３－ヒト化株Ｉｌ３３ｈｕ／ｈｕとを交配することにより生成した。
肺炎症マウスモデル
マウス肺炎症モデルは、イエダニアレルゲンの供給源として作用するＨＤＭ抽出物（Ｊｏｈｎｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉ
ｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；（２００４）Ｆｅｂ１；１６９（３）：３７８－８５），ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｉｎｄｏｏｒ ａｌｌｅｒｇｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ （Ｃａｌｄｅｒｏｎ， ｅｔ ａｌ．，（２０１５），Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｌｌｅｒｇｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｈｏｕｓｅ ｄｕｓｔ ｍｉｔｅｓ：Ｗｈａｔ ｄｏ ｗｅ ｒｅａｌｌｙ ｋｎｏｗ？Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５Ｊｕｌ；１３６（１）：３８－４８））への反復鼻腔内（ＩＮ）曝露を用いた。ＨＤＭへの慢性的な曝露は、重度の肺細胞浸潤、サイトカイン発現、およびリモデリングをもたらす重度の肺炎症を誘導すると報告されている。特に、ＨＤＭに慢性的に曝露されたマウスは、１型および２型炎症細胞（それぞれ好中球および好酸球）による組織浸潤などの混合１型／２型表現型の肺炎症、血清ＩｇＥの増加、血清ＨＤＭ特異的ＩｇＧ１の増加、ならびにＩＬ－５およびＩＬ－１３などの２型炎症性サイトカインの誘導を示す（Ｊｏｈｎｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．（２００４），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；Ｆｅｂ１；１６９（３）：３７８－８５；Ｊｏｈｎｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．（２０１１）．ＰｌｏＳ ＯＮＥ．Ｊａｎ２０；６（１）：ｅ１６１７５；Ｌｌｏｐ－Ｇｕｅｖａｒａ， ｅｔ ａｌ．，（２００８），ＰｌｏＳ ＯＮＥ，Ｊｕｎ１１；３（６）：ｅ２４２６）。
実験計画
４週間のＨＤＭ曝露誘導性肺炎症モデル
表１２に示される遺伝子型の雌マウスを、遺伝子型当たりそれぞれ２つの群に無作為に分けた。２０μＬの生理食塩水溶液で希釈した生理食塩水（２０μＬ）または５０μｇのＨＤＭを、週当たり３回、４週間ＩＮ投与した。全てのマウス系統は混合Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ／１２９Ｓ６ＳｖＥｖＴａｃバックグラウンドであった。最後の曝露から４日後にマウスを犠牲死させ、肺を採取し、好酸球性肺浸潤を決定した。
Figure 2023175785000018
１９週間のＨＤＭ曝露誘導肺炎症モデル
この研究で使用したＩｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕＩｌ３３ｈｕ／ｈｕマウスは混合バックグランドＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（７２％）／１２９Ｓ６ＳｖＥｖＴａｃ（２８％）であり、雌マウスを７つの別々の群に無作為に分けた。各群のマウスのＨＤＭ曝露および処置または対照投与プロトコルは表１３に示される。２０μＬの生理食塩水溶液で希釈した生理食塩水（２０μＬ）または５０μｇのＨＤＭを、週当たり３回、１９週間
ＩＮ投与した。Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕＩｌ３３ｈｕ／ｈｕマウスの対照群を１１週間のＨＤＭ曝露後に犠牲死させ、抗体処置の開始時の疾患重症度を評価した。表１３に示されるように、１９週間ＨＤＭ曝露マウスは、抗体処置を受けなかったか、または１２週～１９週の間にＨＤＭ曝露の皮下（ＳＣ）注射を週２回、合計１６回の抗体用量を受けたかのいずれかであった。簡潔に述べると、以下の抗体を１１ｍｇ／ｋｇの最終タンパク質用量で投与した：１１ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体（群Ｄ）、１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ３５００＋１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体（群Ｅ）、１０ｍｇ／ｋｇのデュピルマブ＋１ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体（群Ｆ）、または１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ３５００＋１０ｍｇ／ｋｇのデュピルマブ（群Ｇ）。この文書の目的のためには、二重の抗体処置群（Ｄ～Ｇ）は治療用抗体（ＲＥＧＮ３５００および／またはデュピルマブ）によってのみ同定される。最後のＩＮ曝露および抗体注射の４日後である研究の１３４日目に、全てのマウスを犠牲死させ、心臓穿刺により血液を採取し、分析のために肺を採取した。
Figure 2023175785000019
マウスの管理
各実験の全期間について、動物を標準条件下でＲｅｇｅｎｅｒｏｎ動物施設に収容したままとし、研究に供する前に少なくとも７日間馴化させた。全ての動物実験は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎの施設内動物管理使用委員会のガイドラインに従って実施した。
特定手順
相対肺重量測定
犠牲死の前に終末体重測定値を記録した。放血後、各マウスの左肺を取り出し、４％パラホルムアルデヒド溶液を含有する管に入れた。各マウスの左肺の湿重量をＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓｉｃ ＭＳスケールで記録した。相対肺重量を決定するために、肺湿重量を体重で割ることにより体重（ｇ）に対する肺湿重量（ｍｇ）の比を計算した。
細胞肺浸潤物の分析
放血後、各マウスから右肺の尾葉を取り出し、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で希釈した２０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩおよび０．７Ｕ／ｍＬのＬｉｂｅｒａｓｅＴＨの溶液を含有する菅に入れ、約２～３ｍｍのサイズの小片に切った。次いで、小さく角切りにした肺葉を含有する菅を３７℃の水浴中で２０分間インキュベートした。エチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を最終濃度１０ｍＭで加えることによって反応を停止させた。次いで、試料をｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃ菅に移した。次いで、２ｍＬのａｕｔｏＭＡＣＳ緩衝液を加え、続いてｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）破砕装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して試料を破砕し、単一細胞懸濁液を形成した。次いで、菅を遠心分離し、得られたペレットを４ｍＬの１×赤血球溶解緩衝液中で再懸濁化して、赤血球を溶解した。室温で３分間インキュベートした後、２．５倍体積の１×ＤＰＢＳを加えて赤血球溶解緩衝液を不活化した。次いで、細胞懸濁液を遠心分離し、得られた細胞ペレットを１ｍＬのＤＰＢＳに再懸濁化した。再懸濁化した試料をそれぞれ５０μｍカップ型フィルコンを通して濾過し、２ｍＬのディープウェルプレートに移した。プレートを４００×ｇで４分間遠心分離し、各試料を１ｍＬのＤＰＢＳ中で再懸濁化した。１ウェル当たり約１．５×１０６細胞を９６ウェルＵ底プレートでプレーティングした。次いで細胞を遠心分離し、細胞ペレットを１×ＤＰＢＳ中１：５００に希釈した１００μＬのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎに再懸濁化して、細胞生存率を決定した。遮光しながら、細胞を生存性色素（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ）とともに室温で１５分間インキュベートした。１×ＤＰＢＳ中で１回洗浄した後、細胞を５０μＬのａｕｔｏＭＡＣＳ緩衝液中で１：５０に希釈した精製ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２Ｆｃ Ｂｌｏｃｋとともに４℃で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を、遮光しながら、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ緩衝液（表１４に記載）で希釈した適切な２×抗体混合物中で４℃で３０分間インキュベートした。抗体のインキュベーション後、細胞をａｕｔｏＭＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、１×ＤＰＢＳ中１：４に希釈したＢＤ ＣｙｔｏＦｉｘ中に再懸濁化し、次いで遮光しながら４℃で１５分間インキュベートした。続いて細胞を洗浄し、ａｕｔｏＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁化した。次いで細胞懸濁液を、ＡｃｒｏＰｒｅｐ Ａｄｖａｎｃｅ ９６フィルタープレート３０～４０μｍを通して新しいＵ底プレートに濾過した。試料データは、ＨＴＳアタッチメント（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０細胞分析器で取得した。ＦｌｏｗＪｏ Ｘソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、ＯＲ）を用いてデータ分析を行い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、ＣＡ）を用いて統計分析を行った。
好酸球のゲーティング（Ｇａｔｉｎｇ）戦略（総活性化）
好酸球を無傷の、単一の、生きている細胞（低ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存性色素シグナル）ＣＤ４５＋、Ｆ４／８０＋、Ｌｙ６Ｇ－、ＳｉｇｌｅｃＦ＋として定義した。好酸球についてのデータを生きている細胞の頻度として表した。好酸球集団内において、活性化好酸球を無傷の、単一の、生きているＣＤ４５＋、Ｆ４／８０＋、Ｌｙ６Ｇ－、ＳｉｇｌｅｃＦ＋、ＣＤ１１ｃＨｉとして定義し、全好酸球の頻度として表した。
ＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するゲーティング戦略
ＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を無傷の、単一の、生きているＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ１９－、ＣＤ４＋、ＣＤ８－、ＳＴ２＋として定義した。ＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞についてのデータをＣＤ４＋Ｔ細胞（無傷の、単一の、生きているＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ１９－、ＣＤ４＋、ＣＤ８－）の頻度として表した。
Figure 2023175785000020
肺タンパク質濃度の測定
放血後、各マウスから右肺の前葉および中葉を取り出し、秤量し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した組織タンパク質抽出試薬（Ｔ－ＰＥＲ）の溶液を含有する管に入れた。最終の１：８（ｗ／ｖ）肺組織重量対Ｔ－ＰＥＲ体積比を達成するために、組織１ｍｇ当たり８μＬのＴ－ＰＥＲ溶液（プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する）を加えた。肺試料をＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩを用いて機械的にホモジナイズした。得られた溶解物を遠心分離して細片をペレット化した。可溶性タンパク質抽出物を含有する上清を新しい管に移し、さらなる分析まで４℃で保存した。サイトカインおよびＭＰＯ濃度を調べた葉当たりのタンパク質の総量（それぞれｎｇ／肺葉およびμｇ／肺葉）として表した。
サイトカインマルチプレックスイムノアッセイ
肺タンパク質抽出物中のマウスサイトカイン（ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２ｐ７０、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＧＲＯα、およびＭＣＰ－１）濃度を、マルチプレックスイムノアッセイキット（カスタムマウス１０－プレックス、ＭＳＤ）を使用して製造業者の指示に従って測定した。簡潔に述べると、肺ホモジネート試料を希釈し、捕捉抗体でプレコーティングしたプレート上でインキュベートした。製造業者によって提供されたタンパク質較正物質を標準として使用した。ホモジネート中のサイトカインを、Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒとともにインキュベートしたタグを有する検出抗体によって検出した。電気化学発光を直ちにＭＳＤ Ｓｐｅｃｔｏｒ（登録商標）機器で読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、データ分析を行った。各アッセイの線形範囲内の標準の最低濃度は、それぞれのサイトカインについてのアッセイの定量化下限（ＬＬＯＱ）として定義した。試験した個々のサイトカインのＬＬＯＱ値は以下の通りであった：ＩＩＦＮγ＝０．２ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ－１β＝１．６ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ－５＝０．２ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ－６＝１．４ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ－１２ｐ７０＝１２５．８ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ－１３＝２４．４ｐｇ／ｍＬ、ＧＲＯα：０．５ｐｇ／ｍＬ、ＭＣＰ－
１＝９．８ｐｇ／ｍＬ、ＴＮＦα＝２．４ｐｇ／ｍＬ。
ヒトＩＬ－４ＥＬＩＳＡ
肺タンパク質抽出物中のヒトＩＬ－４濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡキットを使用して製造業者の指示に従って測定した（Ｈｕｍａｎ ＩＬ－４ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。簡潔に述べると、肺ホモジネートを希釈し、抗ヒトＩＬ－４捕捉抗体でプレコーティングした９６ウェルプレート上でインキュベートした。精製ヒトＩＬ－４を標準として使用した。捕捉されたヒトＩｌ－４は、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩＬ－４検出抗体を用いて検出された。ＨＲＰ活性をクロマゲン３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して検出した。次いで停止溶液を加え、４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ４５０）をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、データ分析を行った。アッセイの線形範囲内の標準の最低濃度は、アッセイのＬＬＯＱ＝３１．２５ｐｇ／ｍＬとして定義した。
ＭＰＯ ＥＬＩＳＡ
肺タンパク質抽出物中のＭＰＯ濃度は、サンドイッチＥＬＩＳＡキットを使用して製造者の指示に従って測定した（マウスＭＰＯ ＥＬＩＳＡ キット、Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。簡潔に述べると、肺ホモジネートを希釈し、抗ＭＰＯ捕捉抗体でプレコーティングした９６ウェルプレート上でインキュベートした。精製マウスＭＰＯを標準として使用した。捕捉されたＭＰＯをビオチン化抗マウスＭＰＯ検出抗体を用いて検出した。精製ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを用いて、ビオチン化抗マウスＭＰＯを検出した。ＨＲＰ活性をクロマゲン３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて検出した。次いで停止溶液を加え、４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ４５０）をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、データ分析を行った。アッセイの線形範囲内の標準の最低濃度は、アッセイのＬＬＯＱ＝１５６．３ｎｇ／ｍＬとして定義した。
血清採取
試験終了時に心臓穿刺により、全血をＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ菅に採取した。室温で少なくとも３０分間静置することにより、血液を凝固させた。凝固した血液および細胞を、４℃で１０分間、１８，０００ｘｇで遠心分離することによりペレット化した。血清と呼ばれる得られた上清を清潔なポリプロピレンプレートに移し、下記のように循環抗体レベルを決定するために使用した。
ＥＬＩＳＡによる血清中のＳＡＡレベルの決定
各マウスの血清試料中の総ＳＡＡ濃度は、市販のイムノアッセイ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して製造業者の指示書に従って決定した。簡潔に述べると、血清試料を希釈し、モノクローナル抗マウスＳＡＡ捕捉抗体で事前にコーティングした９６ウェルプレート上でインキュベートした。組換えマウスＳＡＡを標準として使用した。捕捉されたＳＡＡは、ＨＲＰ結合ポリクローナル抗マウスＳＡＡ検出抗体を用いて検出された。比色ＨＲＰ基質ＴＭＢを用いて、ＨＲＰ活性を検出した。次いで希塩酸の停止溶液を添加え、ＯＤ４５０をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで測定した。各試料について血清中の循環ＳＡＡの濃度をｎｇ／ｍＬとして決定し、μｇ／ｍＬとしてグラフ化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、データ分析を行った。アッセイの線形範囲内の標準の最低濃度は、アッセイのＬＬＯＱ＝３１．２ｎｇ／ｍＬとして定義した。
ＥＬＩＳＡによる血清ＩｇＥ濃度の決定
各マウスの血清試料中の総ＩｇＥ濃度は、比色サンドイッチＥＬＩＳＡ ＯＰＴＥＩＡキットを使用して製造業者の指示に従って決定した。簡潔に述べると、血清試料を希釈し、抗ＩｇＥ捕捉抗体で事前にコーティングした９６ウェルプレート上でインキュベートした。精製マウスＩｇＥを標準として使用した。捕捉されたＩｇＥをビオチン化抗マウスＩｇＥ検出抗体を用いて検出した。精製ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを用いてビオチン化抗マウスＩｇＥを検出した。ＴＭＢを用いてＨＲＰ活性を検出した。次いで２Ｎ硫酸の停止溶液を加え、ＯＤ４５０をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで測定した。各試料の血清中の循環ＩｇＥの濃度はμｇ／ｍＬとして表した。データ分析をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて行った。アッセイの線形範囲内の標準の最低濃度は、アッセイのＬＬＯＱ＝７８．１５ｎｇ／ｍＬとして定義した。
ＥＬＩＳＡによる血清ＨＤＭ特異的ＩｇＧ１レベルの測定
血清試料中のＨＤＭ特異的ＩｇＧ１のレベルを決定するために、比色ＥＬＩＳＡアッセイを開発した。プレートを、４℃で一晩、４μｇ／ｍＬ濃度のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のＨＤＭでコーティングし、洗浄し、室温で１時間ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡの溶液で阻止し、段階希釈したマウス血清試料とともにインキュベートした。室温で１時間後、プレートを洗浄し、プレート上で捕捉されたＩｇＧ１抗体を、ラット抗マウスＩｇＧ１ ＨＲＰ結合抗体とともに室温で１時間インキュベートすることによって検出した。ＴＭＢを用いてＨＲＰ活性を検出した。次いで、２Ｎ硫酸の停止溶液を加え、ＯＤ４５０をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５プレートリーダーで測定した。血清中のＩｇＧ１の相対レベルを力価単位として表した。力価単位は、測定されたＯＤ４５０に、バックグラウンドＯＤ４５０の２倍を超えるＯＤ４５０の読み取りを達成するのに必要な希釈係数を掛けることによって計算した。データ分析をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて行った。アッセイに使用された最低希釈係数は、アッセイのＬＬＯＱ＝１００として定義した。
ＥＬＩＳＡによるヒト標的特異的ＩｇＧ４抗体レベルの決定
各マウスの血清試料中のヒト抗体（ＲＥＧＮ ３５００、デュピルマブ、またはＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照）の濃度を、ヒトＩｇＧ４抗体を検出するために開発された比色サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて決定した。マイクロタイターウェルを、測定されるヒト抗体に特異的な抗原、すなわちＲＥＧＮ３５００を捕捉するためのヒトＩＬ－３３（ＲＥＧＮ３９３１）、ＲＥＧＮ６６８を捕捉するためのヒトＩＬ－４Ｒα（ＲＥＧＮ５６０）、ＲＥＧＮ１９４５を捕捉するためのＮａｔｕｒａｌ Ｆｅｌ ｄ１により、２μｇ／ｍＬの濃度で４℃で一晩ＰＢＳ中でコーティングした。ウェルをＤＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、ＤＰＢＳ中５％ＢＳＡの溶液で室温で３時間阻止し、段階希釈したマウス血清試料または段階希釈した較正用標準物とともにインキュベートした。精製抗体（ＲＥＧＮ３５００、ＲＥＧＮ６６８、およびＩｇＧ４Ｐ対照抗体）を、血清中のそれぞれの抗体濃度の較正および定量化のための標準として使用した。室温で１時間後、プレートを７回洗浄し、プレート上に捕捉されたヒトＩｇＧ４をビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ４特異的モノクローナル抗体を用いて検出し、続いてポリＨＲＰストレプトアビジン複合体とともにインキュベートした。ＴＭＢ基質を使用して製造業者の指示書に従って、ＨＲＰ活性を検出した。１０分後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマルチモードプレートリーダーを用いて吸光度を４５０ｎｍで測定した。較正に使用される最低濃度（０．００２μｇ／ｍＬ）の標準（ＲＥＧＮ３５００、ＲＥＧＮ６６８、またはＩｇＧ４Ｐ対照抗体）は、このアッセイのＬＬＯＱとして定義した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣＡ）を用いてデータ分析を行った。各試料の血清中のヒト抗体の濃度をμｇ／ｍＬとして表した。
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣＡ）を用いて統計分析を行った。
４週間のＨＤＭ曝露モデルにおけるＩＬ－３３、ＩＬ－４、およびＩＬ－４Ｒαヒト化マウスの特性評価からのデータの統計分析
二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて多重比較のためのテューキーの事後検定によって、結果を解釈した。ｐ≦０．０５の場合、差異は統計的に有意であるとみなした。
１９週間のＨＤＭ曝露誘導肺炎症モデルにおけるＲＥＧＮ３５００／デュピルマブ処置からのデータの統計分析
データの正規性をシャピロ・ウィルク検定を使用して評価した。データが正規性検定に合格し、異なる群の標準偏差がブラウン・フォーサイス検定により評価したときに互いに統計的に異ならなかった場合において、一元配置分散分析により、続いて多重比較のテューキーの事後検定により、結果を解釈した。データが正規性検定に合格しなかった場合または標準偏差が有意に異なっていた場合には、クラスカル・ウォリス検定、続いてダンの多重比較検定を使用して、結果を解釈した。ｐ≦０．０５の場合、差異は統計的に有意であるとみなした。
結果
ＩＬ－３３、ＩＬ－４、およびＩＬ－４Ｒα外部ドメインヒト化マウスの特性評価
野生型マウス、Ｉｌ３３ｈｕ／ｈｕ－およびＩｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ単一ヒト化マウス、Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕ二重ヒト化マウス、およびＩｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕＩｌ３３ｈｕ／ｈｕ三重ヒト化マウスを、生理食塩水またはＨＤＭに週当たり３回、４週間ＩＮ曝露した。最後の曝露から４日後にマウスを犠牲死させ、肺を採取して、高ＣＤ１１ｃ発現によって同定された活性化好酸球による肺浸潤を評価した。個々のマウスデータおよび統計的分析は図２に提供される。三重ヒト化Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕＩｌ３３ｈｕ／ｈｕマウスは、４週間のＨＤＭ曝露後の肺組織における活性化好酸球の頻度の有意な増加によって示されるように、野生型マウスと同様、ＨＤＭに強い反応を示した。Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕＩｌ３３ｈｕ／ｈｕマウスおよび野生型マウスはまた、ＨＤＭ曝露非存在下（生理食塩水曝露対照マウス）での肺組織における活性化好酸球と同様の頻度を示した。Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ単一ヒト化マウスを除いて、ＨＤＭ曝露野生型マウスと、試験されたヒト化マウス系統のいずれかに由来するＨＤＭ曝露マウスと、を比較して、統計学的な有意差は観察されなかった。Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕマウスの活性化好酸球性肺浸潤の割合において統計的に有意なＨＤＭ曝露誘導性の増加がないということは、マウスＩＬ－４がヒトＩＬ－４Ｒα受容体を介してシグナル伝達しないという事実に起因すると思われる。一方、ヒトＩＬ－３３は、マウス受容体複合体（ＲＥＧＮ３５００－ＭＸ－１６０６９）を介してシグナル伝達することが示されている。さらに、生理食塩水曝露野生型マウスと、試験されたヒト化マウス系統のいずれかに由来する生理食塩水曝露マウスと、を比較しても、統計的有意差は観察されなかった。これらの知見は、Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕＩｌ３３ｈｕ／ｈｕマウス系統をＨＤＭ曝露誘導性肺炎症のマウスモデルとして使用することの有効性を確認するものである。
１９週間のＨＤＭ曝露マウスにおけるＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブ処置の効果
Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕＩｌ３３ｈｕ／ｈｕマウスを、週当たり３回、１１週間または１９週間にわたり生理食塩水またはＨＤＭにＩＮ曝露した。１９週間のＨＤＭ曝露マウスの４つの群について、１２週～１９週の間に週２回のＳＣ注射を行い、他の全ての群は処置を受けなかった（なし、淡灰色囲い）。以下のように、抗体を単独でまたは組み合わせて１１ｍｇ／ｋｇの最終タンパク質用量で投与した：１１ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体、１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ３５００＋１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ
対照抗体、１０ｍｇ／ｋｇのデュピルマブ＋１ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体、または１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ３５００＋１０ｍｇ／ｋｇのデュピルマブ。１１週間の曝露後に１コホートのマウスを犠牲死させ（１１週間曝露群）、抗体処置の開始時の炎症プロファイルを決定した。最後の曝露および抗体注射の４日後である１３４日目（１９週間曝露群）に、他の４つのコホートを犠牲死させた。血清単離のために全血を心臓穿刺によって採取し、肺をさらなる分析のために採取した。特に注記しない限り、全ての群は同じ系統のマウス（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕＩｌ３３ｈｕ／ｈｕ）を含むものであった。
肉眼肺病変の分析
相対肺重量は、生理食塩水曝露対照マウスと比較して、１９週間のＨＤＭ曝露マウスにおいて有意に増加した（図３）。これはおそらく、細胞浸潤、コラーゲン沈着、筋肥大、および粘液産生の増加によると思われる。ＨＤＭ曝露マウスにおいて、ＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブの組み合わせ投与は、アイソタイプ対照抗体を投与したマウスと比較して、ＨＤＭ曝露誘導性の相対肺重量増加を有意に阻止した（図３）。相対肺重量の減少傾向は、ＲＥＧＮ３５００単独で投与したＨＤＭ曝露マウスでも観察された。
肺細胞浸潤物の分析
最後の抗体注射の４日後にマウスの肺を採取し、好酸球のフローサイトメトリー分析のために、右肺の尾葉を破砕して単一細胞懸濁液とした。好酸球を無傷の、単一の、生きているＣＤ４５＋、Ｆ４／８０＋、Ｌｙ６Ｇ－、ＳｉｇｌｅｃＦ＋と定義し、活性化好酸球をＣＤ１１ｃＨｉとさらに定義した。活性化好酸球による肺浸潤は、（Ａ）における総肺好酸球の頻度（％）として報告され、総肺好酸球浸潤は、生（無傷、単一、生きている）細胞における総肺好酸球の頻度（％）として報告された。
総活性化肺好酸球（図４Ａおよび４Ｂ）および肺ＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は無傷、単一、生きているＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ１９－、ＣＤ４＋、ＣＤ８－、ＳＴ２＋として定義され、ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度として報告した）（図５）を検出するためのフローサイトメトリーによって測定した際に、または好中球のマーカーとしての肺ＭＰＯタンパク質レベルを検出するためのイムノアッセイによって評価した（ＭＰＯタンパク質レベルは酵素結合免疫吸着検定法により測定した）際に、生理食塩水曝露対照マウスと比較して、１９週間のＨＤＭ曝露により、細胞肺浸潤は有意に増加した。肺ＭＰＯタンパク質レベルは、肺葉当たりのＭＰＯタンパク質量（μｇ）として表される（図６）。
いずれかの抗体単独の投与でなく、１９週間のＨＤＭ曝露マウスにおけるＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブの組み合わせ投与は、アイソタイプ対照抗体の投与と比較して、活性化好酸球による肺浸潤のレベルを有意に低下させた。特に、ＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブを組み合わせて投与したマウスにおける活性化好酸球による肺浸潤のレベルはまた、１１週間のＨＤＭ曝露誘導レベルと比較して有意に減少し、このレベルは処置の開始に対応する（図４Ａ）。いずれかの抗体単独の投与は有意な効果をもたらさなかったが、活性化好酸球による肺浸潤の減少傾向がデュピルマブ投与マウスで観察された。ＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブを組み合わせて投与したＨＤＭ曝露マウスもまた、総好酸球によるＨＤＭ誘導性肺浸潤の減少傾向を示した（図４Ｂ）。
ＲＥＧＮ３５００を単独でまたはデュピルマブと組み合わせて投与された１９週間のＨＤＭ曝露マウスでは、ＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞による肺浸潤のレベルが、アイソタイプ対照投与マウスのレベルと比較して、および処置開始時における１１週間のＨＤＭ曝露誘導性のレベルと比較して、有意に低下した（図５）。同様の浸潤阻止（１．０２倍以内の平均頻度）がＲＥＧＮ３５００単独およびデュピルマブとの組み合わせで観察され、この病変は主にＩＬ－３３によって引き起こされることを示している。
好酸球浸潤と同様に、ＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブの組み合わせ投与は、いずれかの抗体単独よりも好中球肺浸潤の阻止について強い効果を示した。好中球浸潤のマーカーであるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の肺タンパク質レベルのＨＤＭ曝露誘導性の増加は、アイソタイプ対照と比較して、ＲＥＧＮ３５００とデュピルマブの組み合わせ投与によって有意に阻止された（図６）。いずれかの抗体を単独で投与しても有意な効果はもたらさなかったが、ＲＥＧＮ３５００投与マウスでは肺ＭＰＯタンパク質レベルの低下傾向が観察された。
肺組織サイトカインレベル分析
肺タンパク質レベル（葉当たりの総タンパク質）に対するＨＤＭ曝露および抗体処置の効果を、マウスサイトカインＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２ｐ７０、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＧＲＯα、およびＭＣＰ－１、ならびにヒトサイトカインｈＩＬ－４について評価した。
肺（右肺の前葉および中葉）を採取し、示されたマウスサイトカインのタンパク質レベルをマルチプレックスイムノアッセイにより測定した。市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、ヒトＩＬ－４タンパク質レベル（ｈＩＬ－４）を検出した。ＩＬ－５（図７Ａ）およびＩＬ－６（図７Ｂ）タンパク質レベルをマルチプレックスイムノアッセイにより測定した。肺組織サイトカインタンパク質レベルを肺葉当たりのタンパク量（ｐｇ）として計算した。淡黄色から濃青色までの範囲の相対サイトカインを示すために、偽色ヒートマップ（ここでは示していない）を生成した。相対肺サイトカインレベルの尺度は、各別のサイトカインについての平均肺タンパク質レベルの最低記録および最高記録をそれぞれ、０％（淡黄色）および１００％（濃青色）と定義することによって作成した。相対的肺サイトカインタンパク質レベル（％）をヒートマップにおいて数値および色で示した。統計的有意性は、ダンの多重比較事後検定を用いたクラスカル・ウォリスの一元配置分散分析によって決定された。
ＩＬ－１２ｐ７０の結果は、全てのグループで定量化下限を下回っており、したがってここでは報告しない。
８つのサイトカイン（ｈＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＧＲＯα、およびＭＣＰ－１）は、生理食塩水曝露対照マウスと比較して、１９週間のＨＤＭ曝露に応答した肺タンパク質レベルの有意な増加を示した。ＩＦＮγのみが、生理食塩水曝露対照マウスと比較して、１９週間のＨＤＭ曝露に応答した肺タンパク質レベルの有意な増加を示さず、ＩＦＮγレベルも、アイソタイプ対照抗体を投与した１９週間のＨＤＭ曝露マウスと比較して、治療用抗体の投与により影響を受けなかった。５つのサイトカイン（ｈｌｌ－４、ＩＬ－６、ＴＮＦα、ＧＲＯα、およびＭＣＰ－１）の肺タンパク質レベルのＨＤＭ曝露誘導による増加は、アイソタイプ対照抗体投与マウスと比較して、ＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブの組み合わせ投与によって有意に阻止されたが、いずれかの抗体単独の投与では阻止されなかった。
別の２つのＨＤＭ曝露応答性サイトカイン（ＩＬ－５およびＩＬ－１β）は、アイソタイプ対照抗体投与マウスと比較して、ＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブの組み合わせ処置による阻止の傾向を示し、それぞれ８３％および７８％の肺タンパク質レベルの低下があった（図７Ａおよび７Ｂ）。個々の抗体の投与は、ＩＬ－５およびＩＬ－１βレベルの減少があまり顕著ではない傾向をもたらした。
炎症の全身性マーカーＳＡＡの分析
最後の曝露および抗体注射の４日後に、全血を心臓穿刺によって採取し、血清を単離し
た。循環ＳＡＡタンパク質レベルを市販のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。循環ＳＡＡタンパク質レベルは、血清１ｍＬ当たりのＳＡＡタンパク質量（μｇ）として表される。全身性炎症ＳＡＡマーカーの循環タンパク質レベルは、生理食塩水曝露対照マウスと比較して、１９週間のＨＤＭ曝露マウスでは有意に増加した（図８）。
循環ＳＡＡレベルのＨＤＭ曝露誘導による増加は、ＲＥＧＮ３５００を単独でまたはデュピルマブと組み合わせて投与したマウスでは有意に低下したが（図８）、デュピルマブ単独投与マウスでは循環ＳＡＡレベルの減少傾向が観察された。
ＨＤＭ曝露後の体液性アレルギー反応の定量化
最後の曝露および抗体注射の４日後に、全血を心臓穿刺によって採取し、血清を単離した。循環ＩｇＥタンパク質レベルを市販のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。循環ＩｇＥタンパク質レベルは、血清１ｍＬ当たりのＩｇＥタンパク質量（μｇ）として表される。
研究終了時（１３４日目）における循環ＩｇＥ（図９）およびＨＤＭ特異的ＩｇＧ１（表１５）のレベルによって評価されるように、体液性アレルギー反応はＨＤＭ曝露によって誘発された。
ＩｇＥの循環タンパク質レベルは、生理食塩水曝露対照マウスと比較して、１９週間のＨＤＭ曝露マウスでは有意に増加した（図９）。循環ＨＤＭ特異的ＩｇＧ１の平均力価は、生理食塩水曝露対照マウスにおける１．１４Ｅ＋０２から１９週間のＨＤＭ曝露マウスにおける１．３７Ｅ＋０６～２．４３Ｅ＋０６の範囲のレベルまで増加した（表１５）。ＲＥＧＮ３５００、デュピルマブ、または組み合わせ処置の統計的に有意な効果はこれらの評価項目のいずれでも観察されなかったが、ＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブの組み合わせ投与されたマウスでは血清ＩｇＥレベルの低下傾向が観察された。
Figure 2023175785000021
ヒト抗体の血清中濃度の定量化
ヒトＩｇＧ４Ｐ抗体（ＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照、ＲＥＧＮ３５００、およびデュピルマブ）の血清中濃度を、最後の抗体投与の４日後である研究終了時（１３４日目）において標的特異的抗ヒトＩｇＧ４ＥＬＩＳＡによって決定した。ヒトＩｇＧ４抗体の平均濃度を表１６に概説する。
Figure 2023175785000022
概要
生理食塩水のみに曝露された対照マウスと比較して、１９週間ＨＤＭに曝露されたマウスは、未処置のままのときまたはＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照抗体の投与後において、１４の測定された炎症病理学的マーカーのうちの１つ（肺ＩＦＮγレベル）を除く全てで増加を示した。
ＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブの組み合わせ投与は、アイソタイプ対照抗体と比較して、１３の試験されたＨＤＭ曝露応答性評価項目うちの１０（相対肺重量、活性化好酸球、好中球［ＭＰＯレベル］、およびＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞による肺浸潤、サイトカインｈＩＬ－４、ＩＬ－６、ＴＮＦα、ＧＲＯα、およびＭＣＰ－１のタンパク質レベル、ならびにＳＡＡの血清レベル）を有意に阻止した。さらに、活性化好酸球およびＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞による肺浸潤のレベルは、抗体処置の開始に相当する、１１週間のＨＤＭ曝露マウスで観察されたレベルを下回るレベルまで有意に減少した。デュピルマブ単独の投与は、このモデルにおける１３の試験されたＨＤＭ曝露応答性評価項目のいずれも有意に阻止しなかったが、ＲＥＧＮ３５００単独の投与は２つの試験評価項目：ＳＴ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞肺浸潤および循環ＳＡＡレベルを有意に阻止した。これら２つの評価項目について、ＲＥＧＮ３５００単独によって媒介される阻止はデュピルマブと組み合わせたＲＥＧＮ３５００により媒介される阻止と同様であり、これらの病理学的マーカーが主にＩＬ－３３によって引き起こされることを示唆している。
ＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブの組み合わせ投与は、統計学的有意性に達することなく、別の３つのＨＤＭ曝露応答性評価項目（好酸球による肺浸潤［合計］、サイトカインＩＬ－５およびＩＬ－１βの肺タンパク質濃度、ならびにＩｇＥの血清タンパク質レベル）を阻止する傾向を示した。これらのマーカーについて、ＲＥＧＮ３５００またはデュピルマブによる個々の抗体処置は概して、組み合わせ処置よりも弱い減少をもたらした。
全ての抗体処置群は、試験終了時における標的特異的ヒトＩｇＧ４抗体の検出可能な血清レベルと関連していた。治療用抗体を単独または組み合わせのいずれかで、週２回、８
週間投与したマウスでは、試験終了時において、ＲＥＧＮ３５００の平均血清濃度がそれぞれ１１．４±１０．１および１２．７±８．８μｇ／ｍＬであり、デュピルマブの平均血清濃度が８．０±１３．５および４８．９±２７．９μｇ／ｍＬであった。
結論として、Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕＩｌ３３ｈｕ／ｈｕマウスを用いた１９週間のＨＤＭ曝露誘導肺炎症モデルにおけるＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブとの組み合わせ処置は、いずれかの抗体単独での処置と比較して、試験された肺病変および炎症マーカーのほぼ全てについてより顕著な改善をもたらした。
結論
Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕＩｌ４ｈｕ／ｈｕＩｌ３３ｈｕ／ｈｕマウスを用いた１９週間のＨＤＭ曝露誘導肺炎症モデルにおけるＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブとの組み合わせ処置は、いずれかの抗体単独での処置と比較して、試験された肺病変および炎症マーカーのほぼ全てについてより顕著な改善をもたらした。
実施例７：中等度から重度のＣＯＰＤ患者において単独で使用される場合および併用療法として使用される場合のＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００またはデュピルマブの評価
研究設計
この研究は、中等度から重度の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の患者における、それぞれを単独で使用したときまたは組み合わせて使用したときのＩＬ－３３モノクローナル抗体（ＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００）、ＩＬ－４Ｒモノクローナル抗体（デュピルマブ、ＤＵＰＩＸＥＮＴ（登録商標）とも知られる）の有効性、安全性、および許容性を評価するための無作為化二重盲検プラセボ対照並行群の２４週間の概念実証研究である。
合計８３２人の対象がこの研究に参加する。この研究は４つの処置群からなり、第１処置群は抗ＩＬ－３３モノクローナル抗体（ＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００）単独を皮下投与（ＳＣ）した患者であり、第２処置群は抗ＩＬ－４Ｒモノクローナル抗体（デュピルマブ）単独を皮下投与した患者であり、第３処置群はＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブの両方を皮下に共投与した患者であり、第４処置群はプラセボである。
処置群１の患者は、２週間毎に２４週間にわたりＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００の２回ＳＣ注射を受け、２週間毎に２４週間にわたり１回のＳＣ注射としてデュピルマブプラセボが共投与される。処置群２の患者は、２週間毎に２４週間にわたりデュピルマブの１回ＳＣ注射を受け、２週間毎に２４週間にわたり２回のＳＣ注射としてＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００プラセボが共投与される。処置群３の患者は、２週間毎に２４週間にわたりＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００の２回ＳＣ注射を受け、２週間毎に２４週間にわたり１回のＳＣ注射としてデュピルマブが共投与される。処置群４の患者は、２週間毎に２４週間にわたり、それぞれ２回および１回のＳＣ注射として投与される、ＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブに対する釣り合う用量のプラセボを受ける。
研究目的
この研究の主目的は、吸入コルチコステロイド（ＩＣＳ）、および／または長時間作用型β２アドレナリンアゴニスト（ＬＡＢＡ）、および／または長時間作用型ムスカリンアンタゴニスト（ＬＡＭＡ）のバックグラウンド療法（二重または三重療法）で処置された中等度から重度の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する患者における、呼吸機能の改善に対するインターロイキン３３抗体（ＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００）、インタ
ーロイキン４受容体モノクローナル抗体（デュピルマブ）、およびその両方の共投与の効果をプラセボと比較して決定し比較することであり、気管支拡張薬投与後の１秒量（ＦＥＶ１）によって２４週間にわたって評価される。
副次的目的は、２４週間の処置にわたる、中等度から重度のＣＯＰＤ急性増悪（ＡＥＣＯＰＤ）の発生率につい、ＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００、デュピルマブ、およびその両方の共投与の効果をそれぞれプラセボと比較して評価することである。
別の副次的目的は、ＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００、デュピルマブ、およびその両方の共投与の効果を、それぞれプラセボと比較して、２４週間にわたる気管支拡張薬前の１秒量；２４週間にわたるベースラインから最初の中等度または重度ＡＥＣＯＰＤ事象までの期間；ＣＯＰＤの臨床症状の評価；安全性および許容性について評価することである。
組み入れ基準
研究のための組み入れ基準は以下の通りである：（１）中等度から重度の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する患者であること（気管支拡張薬投与後の１秒量（ＦＥＶ１）努力肺活量（ＦＶＣ）が７０％未満、および気管支拡張薬投与後の予測１秒率（ＦＥＶ１％）が８０％超、しかし３０％以下である）、（２）スクリーニング来院時１および来院時２／無作為化におけるＣＯＰＤ評価試験（ＣＡＴ）スコア１０以上の患者であること、（３）慢性気管支炎の徴候および症状（慢性咳の他の原因（例えば、胃食道逆流症、慢性鼻副鼻腔炎、気管支拡張症）を除外した患者におけるスクリーニングまでの年間で３ヶ月間の慢性湿性咳）の既往歴のある患者であること、（４）スクリーニング前の１年以内に中等度増悪２回以上または重度増悪１回以上の既往歴書面のある患者であること、（５）来院２／無作為選択前の３ヶ月間に標準治療バックグランド療法があり、スクリーニング来院１前の少なくとも１ヶ月間安定投薬されている（二重療法：長時間作用型βアゴニスト（ＬＡＢＡ）＋長時間作用型ムスカリンアンタゴニスト（ＬＡＭＡ）、もしくは吸入コルチコステロイド（ＩＣＳ）＋ＬＡＢＡ、もしくはＩＣＳ＋ＬＡＭＡ、または三重療法：ＩＣＳ＋ＬＡＢＡ＋ＬＡＭＡを含む）のいずれかを含む患者であること、（６）インフォームドコンセントについての書面に署名していること、ならびに（７）喫煙歴１０箱／年以上の現在または以前の喫煙者であること。
除外基準
この研究の除外基準は以下の通りである。（１）年齢が４０歳以下または７５歳超であること、（２）肥満度指数（ＢＭＩ）が１６未満の患者であること、（３）無作為選択前の６ヶ月以内にＣＯＰＤと診断された患者であること、（４）喘息の国際指針（ＧＩＮＡ）のガイドラインに従って、現在、喘息と診断されていること、（５）ＣＯＰＤ以外の重大な肺疾患（例えば、肺線維症、サルコイドーシス、間質性肺疾患、肺高血圧症、気管支拡張症、多発性血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症、二相性陽圧呼吸（Ｂｉｌｅｖｅｌ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ａｉｒｗａｙ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ）に対する顕著な睡眠時無呼吸など）または末梢好酸球数の増加に関連する別の診断された肺疾患または全身性疾患があること、（６）α－１抗トリプシン欠乏症の診断があること、（７）長期（１５時間超／日）酸素補給を必要とする進行性ＣＯＰＤがあること、（８）スクリーニング前４週間以内に中等度または重度ＣＯＰＤ事象の急性増悪を有する患者であること、（９）スクリーニング／来院１前の４週間以内またはスクリーニング期間中に上気道または下気道感染症を経験した患者であること、（１０）肺切除術または肺容量減少手術の既往歴または計画があること、（１１）生物学的薬剤に対する全身性過敏反応の既往歴のある患者であること。
実施例８．中等度から重度の喘息患者において単独で使用したときおよび併用療法として使用したときのＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００またはデュピルマブの評価
研究設計
この研究は、吸入ステロイド（ＩＣＳ）および長時間作用型β２アドレナリンアゴニスト（ＬＡＢＡ）療法ではよくコントロールされない中等度から重度の喘息患者における、ＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００、デュピルマブ（ＤＵＰＩＸＥＮＴ（登録商標）としても知られる）、ならびにＳＡＲ４４０３４０およびデュピルマブの共投与の有効性、安全性、および許容性を評価するための無作為化二重盲検プラセボ対照並行群の１２週間の概念実証研究である。
合計８００人の対象がこの研究に参加する。この試験は４つの処置群からなり、第１処置群は抗ＩＬ－３３モノクローナル抗体（ＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００）単独を皮下投与（ＳＣ）した患者であり、第２処置群は抗ＩＬ－４Ｒモノクローナル抗体（デュピルマブ）単独を皮下投与した患者であり、第３処置群はＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブの両方を皮下に共投与した患者であり、第４処置群はプラセボである。
処置群１の患者は、２週間毎に１２週間にわたり２回の皮下（ＳＣ）注射として投与されるＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００、および２週間毎に１２週間にわたり１回のＳＣ注射としてのデュピルマブプラセボの共投与を受ける。処置群２の患者は、２週間毎に１２週間にわたり１回のＳＣ注射として投与されるデュピルマブ、および２週間毎に１２週間にわたり２回のＳＣ注射としてのＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００プラセボの共投与を受ける。処置群３の患者は、２週間毎に１２週間にわたり２回のＳＣ注射として投与されるＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００、および２週間毎に１２週間にわたり１回のＳＣ注射として投与されるデュピルマブの共投与を受ける。処置群４の患者は、２週間毎に１２週間、それぞれ２回および１回のＳＣ注射として投与される、ＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００およびデュピルマブに対する釣り合う用量のプラセボを受ける。
研究目的
主な研究目的は、「喘息コントロールの喪失」（ＬＯＡＣ）事象の発生率の減少に対するデュピルマブを併用したまたは併用しないＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００の効果をプラセボと比較して評価することである。
副次的な研究目的は、１秒量（ＦＥＶ１）に対するＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００およびＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００とデュピルマブとの共投与の効果をプラセボと比較して評価することと、ＦＥＶ１に対するＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００とデュピルマブとの共投与の効果を、ＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００と比較しておよびデュピルマブと比較して評価することと、ＬＯＡＣの減少に対するＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００とデュピルマブとの共投与の効果をＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００単独およびデュピルマブ単独と比較して評価することと、単独およびデュピルマブとの共投与におけるＳＡＲ４４０３４０／ＲＥＧＮ３５００の安全性および耐容性を評価すること、である。
組み入れ基準
この研究のために以下の組み入れ基準を用いた：（１）喘息の世界死指針（ＧＩＮＡ）２０１６ガイドラインに基づいて、少なくとも１２ヶ月間喘息であるとの医師の診断を受けた成人患者（１８歳以上）であって、その患者の喘息が、以下の基準を有するＩＣＳ／ＬＡＢＡ併用療法で一部コントロールされるまたはコントロールされないこと：中用量から高用量までのコルチコステロイド（ＩＣＳ）吸入（１日２回（ＢＩＤ）の２５０ｍｃｇ／日以上のプロピオン酸フルチカゾン、もしくは最大２０００ｍｃｇ／日のプロピオン酸フルチカゾンの等効力（ｅｑｕｉｐｏｔｅｎｔ）ＩＣＳ１日投与量、または臨床的に匹敵
するもの）と、第２のコントローラーとしての長時間作用型βアゴニスト（ＬＡＢＡ）と、を組み合わせて、少なくとも３か月間、来院１前の１か月以上安定的に投薬する既存の処置、（２）気管支拡張薬投与前の１秒量（ＦＥＶ１）が５０％以上であるが、来院２／ベースライン時における予測正常値が８５％以下であること、（３）スクリーニング中に２～４パフ（２００～４００ｍｃｇ）のアルブテロール／サルブタモールまたはレバルブテロール／レボサルブタモールを投与した後に、ＦＥＶ１において少なくとも１２％および２００ｍＬの可逆性があること（患者が許容した場合、同じ来院中に３回以下の機会が、最大１２パフの緩和薬（ｒｅｌｉｅｖｅｒ ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）を用いて許容される）、来院１／スクリーニング前の６か月以内に２つの許容される肺活量測定評価を比較したときに、気管支拡張薬投与前のＦＥＶ１に２０％の変動性がある既往歴書面がある、または来院１／スクリーニング前の１２か月以内にメタコリンに対する陽性気道過敏性がこの組み入れ基準を満たすのに許容できると考えられること、（４）来院１前の１年以内に、以下の事象のいずれかを少なくとも１回は経験していなければならないこと：喘息を悪化させる全身用ステロイドによる処置（経口または非経口）、または喘息を悪化させる入院または緊急医療、（５）インフォームドコンセント書面に署名していること。
除外基準
この研究の除外基準は以下の通りである：（１）１８歳未満または７０歳超の（すなわち、スクリーニング来院時に７１歳に達している）患者であること、（２）肥満度指数（ＢＭＩ）が１６未満の患者であること、（３）肺機能を害し得る慢性肺疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患［ＣＯＰＤ］、または特発性肺線維症［ＩＰＦ］）があること、（４）生命を脅かす喘息（すなわち挿管（ｉｎｔｕｂａｔｉｏｎ）を必要とする重度の増悪）の既往歴があること、（５）ＩＭＰの評価を妨げる可能性がある併存疾患があること、（６）スクリーニング来院１前の４週間以内に以下の事象のいずれかを有する患者であること：喘息を悪化させる１回以上の全身用（経口または非経口）ステロイドバーストによる処置、または喘息を悪化させる入院または緊急医療があること、（７）喘息コントロール質問票５項目版（Ａｓｔｈｍａ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ ５－ｑｕｅｓｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ）（ＡＣＱ－５）スコアが来院２／無作為化時に１．２５未満または３．０超であること。スクリーニング期間中、４以下のＡＣＱ－５が許容されること、（８）来院１前の１３０日以内に抗免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）療法（例えば、オマリズマブ［Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）］を受けたか、あるいは、炎症性疾患または自己免疫疾患（例えば、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、原発性胆汁性肝硬変、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症など）およびその他の疾患を処置するために、来院１前の２か月以内または５半減期（５ｈａｌｆ－ｌｉｖｅｓ）以内に（どちらか長期の方）、他の生物学的療法（抗ＩＬ５ｍＡｂを含む）または全身性免疫抑制薬（例えば、メトトレキサート）を受けたこと、（９）生物学的薬剤に対する全身性過敏反応の既往歴のある患者であること、（１０）来院１前の２年以内に気管支サーモプラスティを受けたもしくは開始した患者、またはスクリーニング期間もしくは無作為化処置期間中に療法を開始することを計画している患者であること、（１１）現喫煙者または来院１前の６か月以内に禁煙したこと、（１２）１０箱／年を超える喫煙歴の元喫煙者であること。

Claims (69)

  1. 炎症性疾患もしくは障害または前記炎症性疾患もしくは障害に関連する少なくとも１つの症状を処置する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のインターロイキン－３３（ＩＬ－３３）アンタゴニストの１回以上の用量を治療有効量のインターロイキン－４受容体（ＩＬ－４Ｒ）アンタゴニストの１回以上の用量と組み合わせて投与することを含み、前記組み合わせの前記投与が、前記ＩＬ－３３アンタゴニスト単独または前記ＩＬ－４Ｒアンタゴニスト単独の投与で観察される治療有効性と比較して治療有効性の増強をもたらす、方法。
  2. 前記炎症性疾患もしくは障害が緩和され、または重症度、持続期間、もしくは発生頻度が軽減され、あるいは前記炎症性疾患もしくは障害に関連する少なくとも１つの症状が緩和され、または重症度、持続期間、もしくは発生頻度が軽減される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記炎症性疾患または障害が、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息およびＣＯＰＤオーバーラップ症候群（ＡＣＯＳ）、アトピー性皮膚炎、アレルギー反応、慢性気管支炎、気腫、鼻ポリープを伴うまたは伴わない慢性鼻副鼻腔炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性肺炎、多発性硬化症、関節炎（変形性関節症、リウマチ性関節炎、および乾癬性関節炎）、アレルギー性鼻炎、線維症、好酸球性食道炎、血管炎、蕁麻疹、チャーグ・ストラウス症候群、炎症性疼痛、および乾癬からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記慢性閉塞性肺疾患が、喘息、ウイルス性疾患、細菌感染、アレルゲンへの曝露、化学物質もしくは化学煙霧への曝露、または環境刺激物もしくは大気汚染への曝露のうちの１つ以上によって増悪する、請求項３に記載の方法。
  5. 前記喘息が、ウイルス性疾患、細菌感染、アレルゲンへの曝露、化学物質もしくは化学煙霧への曝露、または環境刺激物もしくは大気汚染への曝露のうちの１つ以上によって増悪する、請求項３に記載の方法。
  6. 前記喘息が、好酸球性喘息、非好酸球性喘息、ステロイド抵抗性喘息、またはステロイド感受性喘息である、請求項３または５に記載の方法。
  7. 前記慢性閉塞性肺疾患が、タバコの煙に起因し、またはタバコの煙により一部増悪する、請求項３または４に記載の方法。
  8. 前記炎症性疾患もしくは障害または前記炎症性疾患もしくは障害の少なくとも１つの症状を緩和するのに有用な有効量の１つ以上の追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記１つ以上の追加の治療剤が、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド、気管支拡張薬、抗ヒスタミン薬、エピネフリン、鬱血除去薬、胸腺間質性リンパ球性新生因子（ＴＳＬＰ）アンタゴニスト、ＩＬ－１アンタゴニスト、ＩＬ－８アンタゴニスト、ＩＬ－１３アンタゴニスト、異なるＩＬ－４アンタゴニスト、ＩＬ－４／ＩＬ－１３デュアルアンタゴニスト、ＩＬ－３３／ＩＬ－１３デュアルアンタゴニスト、ＩＬ－５アンタゴニスト、ＩＬ－６アンタゴニスト、ＩＬ－１２／２３アンタゴニスト、ＩＬ－２２アンタゴニスト、ＩＬ－２５アンタゴニスト、ＩＬ－１７アンタゴニスト、ＩＬ－３１アンタゴニスト、ＴＮＦ阻害剤、ＩｇＥ阻害剤、ロイコトリエン阻害剤、経口ＰＤＥ４阻害剤、メチルキサンチン、ネドクロミルナトリウム、クロモリンナトリウム、長時間
    作用型ベータ２アゴニスト（ＬＡＢＡ）、長時間作用型ムスカリンアンタゴニスト（ＬＡＭＡ）、吸入コルチコステロイド（ＩＣＳ）、および別のＩＬ－３３アンタゴニストからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 別のＩＬ－３３アンタゴニストが、ＩＬ－３３に対する異なる抗体、異なるＩＬ－３３受容体ベースのトラップ、ＳＴ２抗体、可溶性ＳＴ２受容体、ＳＴ２以外のＩＬ－３３受容体に対するアンタゴニスト、ＩＬ－１ＲＡｃＰアンタゴニスト、およびＩＬ－３３／ＳＴ２複合体と相互作用する抗体からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
  11. 線維性疾患もしくは障害または前記線維性疾患もしくは障害に関連する少なくとも１つの症状を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のインターロイキン－３３（ＩＬ－３３）アンタゴニストの１回以上の用量を治療有効量のインターロイキン－４受容体（ＩＬ－４Ｒ）アンタゴニストの１回以上の用量と組み合わせて投与することを含み、前記組み合わせの前記投与が、前記ＩＬ－３３アンタゴニスト単独または前記ＩＬ－４Ｒアンタゴニスト単独の投与で観察される治療有効性と比較して治療有効性の増強をもたらす、方法。
  12. 前記線維性疾患もしくは障害が緩和され、または重症度、持続期間、もしくは発生頻度が軽減され、あるいは前記線維性疾患もしくは障害に関連する少なくとも１つの症状が緩和され、または重症度、持続期間、もしくは発生頻度が軽減される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記線維性疾患または障害が肺線維性疾患または障害である、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記肺線維性疾患または障害が、特発性肺線維症、急性肺損傷または急性呼吸窮迫に関連する線維症、珪肺症、放射線誘導性線維症、ブレオマイシン誘導性肺線維症、アスベスト誘導性肺線維症、および閉塞性細気管支炎症候群からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. アレルギー反応の予防またはその重症度の軽減を必要とする対象においてそれを予防または軽減するための方法であって、治療有効量のＩＬ－３３アンタゴニストの１回以上の用量を治療有効量のＩＬ－４Ｒアンタゴニストの１回以上の用量と組み合わせて投与することを含み、前記組み合わせの前記投与が、前記ＩＬ－３３アンタゴニスト単独または前記ＩＬ－４Ｒアンタゴニスト単独の投与で観察される治療有効性と比較して、アレルギー反応を予防またはその重症度を軽減するための治療有効性の増強をもたらす、方法。
  16. 前記治療有効性の増強が、以下のパラメータのうちの任意の１つ以上によって測定される、請求項１、１１、または１５のいずれか一項に記載の方法：
    ａ）組織試料中の好酸球、活性化Ｂ細胞、活性化ＣＤ８Ｔ細胞、またはＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞比のうちの１つ以上の頻度の減少、
    ｂ）組織試料中のインターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１β）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－５（ＩＬ－５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）レベルのうちの１つ以上の低下、あるいは
    ｃ）組織試料中のＩｌ４、ｌｌ５、Ｉｌ６、Ｉｌ９、Ｉｌ１３、Ｉｌ１ｒｌ１、Ｉｌ１３ｒａ２、ｔｎｆ、Ｔｇｆｂ１、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ１１、Ｃｃｌ２４、Ｃｏｌ１５ａ１、および／またはＣｏｌ２４ａ１のうちの１つ以上の遺伝子発現レベルの低下。
  17. 前記治療有効性の増強が、以下のパラメータのうちの任意の１つ以上によってさらに測
    定される、請求項１６に記載の方法：
    ｄ）血清ＩｇＥレベルの低下、
    ｅ）肺における杯細胞化生の減少、
    ｆ）肺硬化の改善、または
    ｇ）肺における上皮下線維症の減少。
  18. 前記組織試料が肺、肝臓、腎臓、心臓、または全血から得られる、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記ＩＬ－４Ｒアンタゴニストと組み合わせた前記ＩＬ－３３アンタゴニストの投与が、前記疾患によりまたは前記疾患もしくはアレルギーの原因物質により誘発される１型免疫応答の増加および／または２型免疫応答の低下をもたらす、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記ＩＬ－４Ｒアンタゴニストが、ＩＬ－４Ｒαに結合し、ＩＬ－４および／またはＩＬ－１３と１型または２型ＩＬ－４α受容体との相互作用を妨げる抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. ＩＬ－４Ｒαに結合する前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＩＬ－４および／またはＩＬ－１３と１型および２型ＩＬ－４α受容体の両方との相互作用を妨げる、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記ＩＬ－４Ｒα抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号３３５または３３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）、および配列番号３３６または３３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. 前記ＩＬ－４Ｒα抗体またはその抗原結合フラグメントが、３つのＨＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）ならびに３つのＬＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含み、前記ＨＣＤＲ１が配列番号３３９のアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号３４０のアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ３が配列番号３４１のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１が配列番号３４２のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２が配列番号３４３のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ３が配列番号３４４のアミノ酸配列を含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記ＩＬ－４Ｒα抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号３３５または配列番号３３７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、および配列番号３３６または配列番号３３８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記ＩＬ－４Ｒα抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号３３５／３３６または配列番号３３７／３３８のいずれかのＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記ＩＬ－４Ｒαアンタゴニストが、デュピルマブまたはその生物学的等価物である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、ＩＬ－３３に特異的に結合し、ＩＬ－３３とＳＴ２との相互作用を阻止する抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  28. ＩＬ－３３に特異的に結合する前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、および３０８からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列内に含有される３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、および３１６からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含む、請求項１～１９または２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. ＩＬ－３３に特異的に結合する前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、および３０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、請求項１～１９または２７～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. ＩＬ－３３に特異的に結合する前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、および３１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、請求項１～１９または２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. ＩＬ－３３に特異的に結合する前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
    （ａ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、および３１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメインと、
    （ｂ）配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、および３１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメインと、
    （ｃ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、および３１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメインと、
    （ｄ）配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、および３１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメインと、
    （ｅ）配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、および３２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメインと、
    （ｆ）配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、および３２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインと、を含む、請求項１～１９または２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. ＩＬ－３３に特異的に結合する前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、および３０８／３１６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１～１９または２７～３１のいずれか
    一項に記載の方法。
  33. 前記ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントが、水素／重水素交換によって決定されるように、配列番号３４９の約１位～約１２位の範囲のアミノ酸配列、および／または配列番号３４９の約５０位～約９４位の範囲のアミノ酸配列と相互作用する、請求項１～１９または２７～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントが、水素／重水素交換によって決定されるように、配列番号３４８の約１１２位～約１２３位の範囲のアミノ酸配列、および／または配列番号３４８の約１６１位～約２０５位の範囲のアミノ酸配列と相互作用する、請求項１～１９または２７～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントが、水素／重水素交換によって決定されるように、配列番号３５０のアミノ酸配列、もしくは配列番号３５１アミノ酸配列のいずれか、または配列番号３５０および３５１の両方と相互作用する、請求項１～１９または２７～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記ＩＬ－３３抗体または抗原結合フラグメントが、配列番号２７４／２８２の重鎖可変領域／軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列対の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）および軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む、請求項１～１９または２７～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記ＩＬ－３３抗体または抗原結合フラグメントが、それぞれ配列番号２７６－２７８－２８０－２８４－２８６－２８８のＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項１～１９または２７～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. ヒトインターロイキン－３３（ＩＬ－３３）に特異的に結合する前記抗体または抗原結合フラグメントが、（ａ）配列番号２７４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、および（ｂ）配列番号２８２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、請求項１～１９または２７～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号２７４／２８２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体とＩＬ－３３への結合について競合する、請求項１～１９または２７～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記ＩＬ－３３抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号２７４／２８２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と同じＩＬ－３３上のエピトープに結合する、請求項１～１９または２７～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、多量体化ドメイン（Ｍ）に結合された第１のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ１）を含むＩＬ－３３トラップであり、Ｄ１がＳＴ２タンパク質のＩＬ－３３結合部分を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、Ｄ１および／またはＭに結合された第２のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ２）をさらに含むＩＬ－３３トラップであり、Ｄ２がＩＬ－１ＲＡｃＰタンパク質の細胞外部分を含む、請求項４１に記載の方法。
  43. Ｄ１がＭのＮ末端に結合されている、請求項４１に記載の方法。
  44. Ｄ１がＭのＣ末端に結合されている、請求項４１に記載の方法。
  45. Ｄ２がＭのＮ末端に結合されている、請求項４２に記載の方法。
  46. Ｄ２がＭのＣ末端に結合されている、請求項４２に記載の方法。
  47. Ｄ１がＤ２のＮ末端に結合され、Ｄ２がＭのＮ末端に結合されている、請求項４２に記載の方法。
  48. Ｄ１が、配列番号３２８もしくは３２９のアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の方法。
  49. Ｄ２が、配列番号３３０もしくは３３１のアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の方法。
  50. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、第１の多量体化ドメイン（Ｍ１）に結合された第１のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ１）および第２の多量体化ドメイン（Ｍ２）に結合された第２のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ２）を含むＩＬ－３３トラップであり、前記Ｄ１および／またはＤ２ドメインが、ＳＴ２およびＩＬ－１ＲＡｃＰからなる群から選択される受容体のＩＬ－３３結合部分を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、Ｄ１またはＭ１のいずれかに結合された第３のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ３）を含み、Ｄ３が、ＳＴ２およびＩＬ－１ＲＡｃＰからなる群から選択される受容体のＩＬ－３３結合部分を含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、Ｄ２またはＭ２のいずれかに結合された第４のＩＬ－３３結合ドメイン（Ｄ４）を含み、Ｄ４が、ＳＴ２およびＩＬ－１ＲＡｃＰからなる群から選択される受容体のＩＬ－３３結合部分を含む、請求項５１に記載の方法。
  53. Ｄ１がＭ１のＮ末端に結合され、Ｄ２がＭ２のＮ末端に結合されている、請求項５０に記載の方法。
  54. Ｄ３がＤ１のＮ末端に結合されている、請求項５１に記載の方法。
  55. Ｄ３がＭ１のＣ末端に結合されている、請求項５１に記載の方法。
  56. Ｄ４がＤ２のＮ末端に結合されている、請求項５１に記載の方法。
  57. Ｄ４がＭ２のＣ末端に結合されている、請求項５２に記載の方法。
  58. Ｄ３がＤ１のＮ末端に結合され、Ｄ１がＭ１のＮ末端に結合され、Ｄ４がＤ２のＮ末端に結合され、Ｄ２がＭ２のＮ末端に結合されている、請求項５２に記載の方法。
  59. Ｄ３がＤ４と同一または実質的に同一であり、Ｄ１がＤ２と同一または実質的に同一である、請求項５８に記載の方法。
  60. Ｄ３およびＤ４がそれぞれ、ＳＴ２タンパク質のＩＬ－３３結合部分を含み、Ｄ１およびＤ２がそれぞれ、ＩＬ－１ＲＡｃＰタンパク質の細胞外部分を含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、配列番号３２３、３２４、３２５、３２６、および３２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＩＬ－３３トラップである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、配列番号３２７のアミノ酸配列を含むＩＬ－３３トラップである、請求項１～１９または６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストおよび前記ＩＬ－４Ｒアンタゴニストが、それらを必要とする患者に別々の製剤で投与される、請求項１～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストおよび前記ＩＬ－４Ｒアンタゴニストが、それらを必要とする患者に投与する前に共製剤化される、請求項１～６２のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストおよび前記ＩＬ－４Ｒアンタゴニストが、前記対象に皮下、静脈内、筋肉内、または鼻腔内投与される、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、配列番号２７４の重鎖可変領域配列内に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）、および配列番号２８２の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列内に含有される３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含むモノクローナル抗体であり、前記ＩＬ－４Ｒアンタゴニストが、配列番号３３７の重鎖可変領域配列内に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）、および配列番号３３８の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列内に含有される３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含むモノクローナル抗体である、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、配列番号２７４／２８２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含むモノクローナル抗体であり、前記ＩＬ－４Ｒアンタゴニストが、配列番号３３７／３３８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含むモノクローナル抗体である、請求項１～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、それぞれ配列番号２７６－２７８－２８０のアミノ酸配列を有する３つのＨＣＤＲ（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３）、およびそれぞれ配列番号２８４－２８６－２８８のアミノ酸配列を有する３つのＬＣＤＲ（ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含むモノクローナル抗体であり、前記ＩＬ－４Ｒアンタゴニストが、それぞれ配列番号３３９－３４０－３４１のアミノ酸を有する３つのＨＣＤＲ（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３）、およびそれぞれ配列番号３４２－３４３－３４４のアミノ酸配列を有する３つのＬＣＤＲ（ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含むモノクローナル抗体である、請求項１～６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストがＲＥＧＮ３５００であり、前記ＩＬ－４Ｒアンタゴニストがデュピルマブである、請求項１～６８のいずれか一項に記載の方法。
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