ES2431929T3 - Composiciones y procedimientos para el diagnóstico y el tratamiento de tumores - Google Patents

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Heidi S. Phillips
Paul Polakis
Susan D. Spencer
Mickey P. Williams
Thomas D. Wu
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Abstract

Un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo que se une al polipéptidoantigénico diana asociado a tumores 193 (TAT193) de SEQ ID NO:62 para uso en un procedimiento de tratamientoo prevención del cáncer de mama, en que el procedimiento comprende la inhibición del crecimiento de una célulatumoral de mama que expresa en exceso dicho polipéptido TAT193, en comparación con una célula de mama notumoral, en que el anticuerpo se selecciona del grupo que consta de anticuerpos dirigidos contra TAT193 yfragmentos de unión a antígenos de los mismos, en que dicho anticuerpo dirigido contra TAT193 se conjuga con unmaitansinoide, una caliqueamicina o un agente inhibidor del crecimiento que se selecciona del grupo que consta deinhibidores de topoisomerasa II, taxanos, agentes alquilantes de ADN, vincristina, etopósido, ara-C, doxorrubicina,epirrubicina, daunorrubicina, bleomicina, tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, paclitaxel ydocetaxel.

Description

Composiciones y procedimientos para el diagnostico y el tratamiento de tumores. 5 CAMPO DE LA INVENCION
[0001] La presente invencion se dirige a composiciones de sustancias utiles para el diagnostico y el tratamiento de tumores en mamiferos y a procedimientos para el uso de estas composiciones de sustancias para estos fines.
10 ANTECEDENTES DE LA INVENCION [0002] Los tumores malignos (canceres) son la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos despues de las enfermedades cardiacas (Boring y col., CA Cancel, J. Clin. 43: 7 (1993)). El cancer se caracteriza
15 por el aumento del numero de celulas anormales o neoplasicas derivadas de un tejido normal que proliferan para formar una masa tumoral, la invasion de los tejidos adyacentes por estas celulas tumorales neoplasicas y la generacion de celulas malignas que eventualmente se propagan por medio del sistema circulatorio o linfatico a los ganglios linfaticos regionales y a lugares distantes a traves de un proceso denominado metastasis. En un estado canceroso, una celula prolifera en condiciones en las que las celulas normales no crecerian. El cancer se manifiesta
20 en una amplia diversidad de formas, caracterizadas por distintos grados de invasividad y agresividad. [0003] En un intento de descubrir dianas celulares eficaces para el diagnostico y el tratamiento del cancer, los investigadores han perseguido la identificacion de polipeptidos transmembranales u asociados a la membrana de cualquier otra forma, que se expresen especificamente en la superficie de uno o mas tipos concretos de celulas
25 cancerosas, en comparacion con una o mas celulas normales no cancerosas. A menudo, tales polipeptidos asociados a la membrana se expresan mas abundantemente en la superficie de las celulas cancerosas en comparacion con la superficie de las celulas no cancerosas. La identificacion de tales polipeptidos antigenicos de la superficie celular asociados con tumores ha dado lugar a la capacidad de reconocer especificamente celulas cancerosas como diana para su destruccion por medio de tratamientos a base de anticuerpos. A este respecto, se
30 senala que el tratamiento a base de anticuerpos ha demostrado ser muy eficaz en el caso de ciertos canceres. Por ejemplo, HERCEPTIN® y RITUXAN® (ambos de Genentech Inc., South San Francisco, California) son anticuerpos usados con exito para el tratamiento del cancer de mama y del linfoma no Hodgkin, respectivamente. Mas especificamente, HERCEPTIN® es un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se une selectivamente al dominio extracelular del receptor 2 del factor de crecimiento epidermico humano (HER2), un
35 protooncogen. En el 25-30 % de los canceres de mama primarios se observa una expresion en exceso de la proteina HER2. RITUXAN® es un anticuerpo monoclonal quimerico murino/humano obtenido por ingenieria genetica y dirigido contra el antigeno CD20 que se encuentra en la superficie de los linfocitos B normales y malignos. Estos dos anticuerpos se producen de manera recombinante en celulas CHO.
40 [0004] En otro intento de descubrir dianas celulares eficaces para el diagnostico y el tratamiento del cancer, los investigadores han perseguido la identificacion de (1) polipeptidos no asociados con la membrana producidos especificamente por uno o mas tipos concretos de celulas cancerosas en comparacion con uno o mas tipos concretos de celulas normales no cancerosas, (2) polipeptidos producidos por celulas cancerosas con un nivel de expresion significativamente superior al de una o mas celulas normales no cancerosas o (3) polipeptidos cuya
45 expresion se limita especificamente solo a un unico (o un numero muy limitado de diferentes) tipo(s) de tejido, tanto en un estado canceroso como no canceroso (por ejemplo, tejido de prostata normal y tejido tumoral de prostata). Tales polipeptidos pueden permanecer localizados intracelularmente o pueden ser secretados por la celula cancerosa. Ademas, tales polipeptidos pueden ser expresados, no por la celula cancerosa en si misma, sino mas bien por celulas que producen y/o secretan polipeptidos con un efecto estimulante o de aumento del crecimiento
50 sobre las celulas cancerosas. Tales polipeptidos secretados son frecuentemente proteinas que proporcionan a las celulas cancerosas una ventaja de crecimiento sobre las celulas normales e incluyen, por ejemplo, factores angiogenicos, factores de adhesion celular, factores de crecimiento y similares. Es de esperar que la identificacion de antagonistas de tales polipeptidos no asociados a la membrana sirva para la obtencion de agentes terapeuticos eficaces para el tratamiento de tales canceres. Ademas, la identificacion del patron de expresion de tales
55 polipeptidos seria util para el diagnostico de canceres concretos en mamiferos. [0005] A pesar de los avances anteriormente identificados en el tratamiento del cancer en mamiferos, existe una gran necesidad de agentes de diagnostico y tratamiento adicionales, capaces de detectar la presencia de tumores en un mamifero e inhibir eficazmente el crecimiento celular neoplasico, respectivamente. Por consiguiente,
un objetivo de la presente invencion es la identificacion de: (1) polipeptidos asociados a la membrana celular que se expresen mas abundantemente en uno o mas tipos de celulas cancerosas en comparacion con celulas normales u otros tipos de celulas cancerosas diferentes, (2) polipeptidos no asociados a la membrana producidos especificamente por uno o mas tipos concretos de celulas cancerosas (o por otras celulas que producen polipeptidos 5 con un efecto estimulante del crecimiento de las celulas cancerosas), en comparacion con uno o mas tipos concretos de celulas normales no cancerosas, (3) polipeptidos no asociados a la membrana producidos por celulas cancerosas con un nivel de expresion significativamente superior al de una o mas celulas normales no cancerosas o (4) polipeptidos cuya expresion se limite especificamente solo a un unico (o un numero muy limitado de diferentes) tipo(s) de tejido, tanto en un estado canceroso como no canceroso (por ejemplo, tejido de prostata normal y tejido 10 tumoral de prostata) y el uso de estos polipeptidos, y los acidos nucleicos que los codifican, para producir composiciones de sustancias utiles en el tratamiento terapeutico y en la deteccion diagnostica del cancer en mamiferos. Tambien es un objetivo de la presente invencion la identificacion de polipeptidos asociados a la membrana celular, secretados o intracelulares, cuya expresion se limite a un unico o a un numero muy limitado de tejidos y el uso de estos polipeptidos, y los acidos nucleicos que los codifican, para producir composiciones de
15 sustancias utiles en el tratamiento terapeutico y en la deteccion diagnostica del cancer en mamiferos.
RESUMEN DE LA INVENCION
A. Realizaciones
20 [0006] En la presente memoria descriptiva, los solicitantes describen por primera vez la identificacion de diversos polipeptidos celulares (y los acidos nucleicos que los codifican o fragmentos de los mismos) que se expresan en la superficie de uno o mas tipos de celulas cancerosas o son expresados por estos en mayor grado que sobre la superficie de uno o mas tipos de celulas normales no cancerosas o son expresados por estos.
25 Alternativamente, tales polipeptidos son expresados por celulas que producen y/o secretan polipeptidos con un efecto estimulante o de aumento del crecimiento sobre las celulas cancerosas. De nuevo, alternativamente, puede que tales polipeptidos no sean expresados en exceso por las celulas tumorales en comparacion con las celulas normales del mismo tipo de tejido, sino que mas bien pueden ser expresados especificamente tanto por las celulas tumorales como por las celulas normales de solo un unico tipo o de un numero muy limitado de tipos de tejido
30 (preferentemente, tejidos no esenciales para la vida, por ejemplo, prostata, etc.). Todos los polipeptidos anteriores se denominan en este documento polipeptidos antigenicos diana asociados a tumores (polipeptidos 'TATquot;) y se espera que sirvan como dianas eficaces para el tratamiento y el diagnostico del cancer en mamiferos.
[0007] Por consiguiente, la presente descripcion se refiere a una molecula de acido nucleico aislada con una
35 secuencia nucleotidica que codifica un polipeptido antigenico diana asociado a tumores o un fragmento del mismo (un polipeptido 'TATquot;).
[0008] En ciertos aspectos, la molecula de acido nucleico aislada comprende una secuencia nucleotidica con al menos aproximadamente el �0 % de identidad de secuencia de acido nucleico, alternativamente al menos 40 aproximadamente el �1 %, 2 %, �3 %, 4 %, �5 %, 6 %, 7 %, %, �9 %, 90 %,91 %,92 %,93%, 94 %,95 %, 96 %, 97 %, 9� %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencia de acido nucleico con (a) una molecula de ADN que codifica un polipeptido TAT de longitud completa con una secuencia aminoacidica segun se desvela en este documento, una secuencia aminoacidica de un polipeptido TAT sin el peptido senal segun se desvela en este documento, un dominio extracelular de un polipeptido TAT transmembranal, con o sin el peptido senal, segun se
45 desvela en este documento o cualquier otro fragmento definido especificamente de una secuencia aminoacidica de un polipeptido TAT de longitud completa segun se desvela en este documento o (b) el complemento de la molecula de ADN de (a).
[0009] En otros aspectos, la molecula de acido nucleico aislada comprende una secuencia nucleotidica con al
50 menos aproximadamente el �0 % de identidad de secuencia de acido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente el �1 %, 2 %, �3 %, 4 %, �5 %, 6 %, 7 %, %, �9 %, 90 %,91 %,92 %,93%, 94 %,95 %, 96 %, 97 %, 9� %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencia de acido nucleico con (a) una molecula de ADN que comprende la secuencia codificante de un ADNc de un polipeptido TAT de longitud completa segun se desvela en este documento, la secuencia codificante de un polipeptido TAT sin el peptido senal segun se desvela en este
55 documento, la secuencia codificante de un dominio extracelular de un polipeptido TAT transmembranal, con o sin el peptido senal, segun se desvela en este documento o la secuencia codificante de cualquier otro fragmento definido especificamente de la secuencia aminoacidica del polipeptido TAT de longitud completa segun se desvela en este documento o (b) el complemento de la molecula de ADN de (a).
[0010] En otros aspectos, la presente descripcion se refiere a una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotidica con al menos aproximadamente el �0 % de identidad de secuencia de acido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente el 1 %, �2 %, �3 %, 4 %, 5 %, �6 %, �7 %, %, 9 %, 90 %, 91 %,92 %, 93 %, 94%, 95 %, 96 %, 97 %, 9� %,99 % o el 100 % deidentidad de secuencia de acido
5 nucleico con (a) una molecula de ADN que codifica el mismo polipeptido maduro codificado por la region codificante de longitud completa de cualquiera de los ADNc de proteinas humanas depositados en la coleccion ATCC segun se desvelan en este documento o (b) el complemento de la molecula de ADN de (a).
[0011] Otro aspecto de la presente descripcion se refiere a una molecula de acido nucleico aislada que
10 comprende una secuencia nucleotidica que codifica un polipeptido TAT cuyo dominio transmembranal esta delecionado o cuyo dominio transmembranal esta inactivado o que es complementaria de dicha secuencia nucleotidica codificante, en que el(los) dominio(s) transmembranal(es) de dicho(s) polipeptido(s) se desvelan en este documento. Por lo tanto, se contemplan los dominios extracelulares solubles de los polipeptidos TAT descritos en este documento.
15 [0012] En otros aspectos, en este documento se describen moleculas de acido nucleico aisladas que hibridan con (a) una secuencia nucleotidica que codifica un polipeptido TAT con una secuencia aminoacidica de longitud completa segun se desvela en este documento, una secuencia aminoacidica de un polipeptido TAT sin el peptido senal segun se desvela en este documento, un dominio extracelular de un polipeptido TAT transmembranal, con o
20 sin el peptido senal, segun se desvela en este documento o cualquier otro fragmento definido especificamente de la secuencia aminoacidica de un polipeptido TAT de longitud completa segun se desvela en este documento o (b) el complemento de la secuencia nucleotidica de (a). A este respecto, se describen fragmentos de la secuencia codificante de un polipeptido TAT de longitud completa o el complemento de la misma segun se desvelan en este documento, que pueden usarse, por ejemplo, como sondas de hibridacion utiles, por ejemplo, como sondas de
25 diagnostico, sondas de oligonucleotidos no codificantes, o para codificar fragmentos de un polipeptido TAT de longitud completa que pueden codificar opcionalmente un polipeptido que comprende un sitio de union para un anticuerpo dirigido contra el polipeptido TAT, un oligopeptido de union a TAT u otra molecula organica pequena que se une a un polipeptido TAT. Tales fragmentos de acido nucleico tienen normalmente una longitud de al menos aproximadamente cinco nucleotidos, alternativamente una longitud de al menos aproximadamente seis, siete, ocho,
30 nueve, diez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 1 �, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 2 , 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, �0, 5, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 1� 0, 1 5, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 2 0, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 3 0, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 4�0, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 5�0, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 6 0, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 7 0, 790, 00, �10, �20, �30, 40, �50, 60,
35 �70, 0, �90, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 9 0, 990 o 1000 nucleotidos, en que, en este contexto, el termino 'aproximadamentequot; significa la longitud de la secuencia nucleotidica indicada mas o menos el 10 % de dicha longitud indicada. Se senala que es posible determinar nuevos fragmentos de una secuencia nucleotidica codificante de un polipeptido TAT de manera rutinaria por alineamiento de la secuencia nucleotidica codificante del polipeptido TAT con otras secuencias nucleotidicas conocidas por medio de cualquiera de una serie de programas bien
40 conocidos de alineamiento de secuencias y mediante la determinacion de que fragmento(s) de la secuencia nucleotidica codificante del polipeptido TAT es(son) nuevo(s). En este documento se contemplan todos estos fragmentos nuevos de secuencias nucleotidicas codificantes de polipeptidos TAT. Tambien se contemplan los fragmentos de polipeptidos TAT codificados por estos fragmentos de moleculas nucleotidicas, preferentemente aquellos fragmentos de polipeptidos TAT que comprenden un sitio de union para un anticuerpo dirigido contra TAT,
45 un oligopeptido de union a TAT u otra molecula organica pequena que se une a un polipeptido TAT.
[0013] En otro aspecto, la presente descripcion se refiere a polipeptidos TAT aislados codificados por cualquiera de las secuencias de acido nucleico aisladas identificadas anteriormente en este documento.
50 [0014] En cierto aspecto, la presente descripcion se refiere a un polipeptido TAT aislado que comprende una secuencia aminoacidica con al menos aproximadamente el �0 % de identidad de secuencia aminoacidica, alternativamente al menos aproximadamente el 1 %, �2 %, �3 %, �4 %, �5 %, �6 %, 7 %, %, �9 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 9 %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencia aminoacidica con un polipeptido TAT con una secuencia aminoacidica de longitud completa segun se desvela en este documento, una
55 secuencia aminoacidica de un polipeptido TAT sin el peptido senal segun se desvela en este documento, un dominio extracelular de una proteina con un polipeptido TAT transmembranal, con o sin el peptido senal, segun se desvela en este documento, una secuencia aminoacidica codificada por cualquiera de las secuencias de acido nucleico desveladas en este documento o cualquier otro fragmento definido especificamente de una secuencia aminoacidica de un polipeptido TAT de longitud completa segun se desvela en este documento.
[0015] En otro aspecto mas, la presente descripcion se refiere a un polipeptido TAT aislado que comprende una secuencia aminoacidica con al menos aproximadamente el �0 % de identidad de secuencia aminoacidica, alternativamente al menos aproximadamente el 1 %, �2 %, �3 %, �4 %, �5 %, �6 %, 7 %, %, �9 %, 90 %, 91
5 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 9� % o el 99 % de identidad de secuencia aminoacidica con una secuencia aminoacidica codificada por cualquiera de los ADNc de proteinas humanas depositados en la coleccion ATCC segun se desvelan en este documento.
[0016] En un aspecto especifico, la presente descripcion se refiere a un polipeptido TAT aislado sin la
10 secuencia senal N-terminal y/o sin la metionina inicial y codificado por una secuencia nucleotidica que codifica una secuencia aminoacidica tal segun se describe anteriormente en este documento. En este documento se describen tambien procedimientos para la produccion del mismo, en que dichos procedimientos comprenden el cultivo de una celula huesped que comprende un vector que comprende la molecula de acido nucleico codificante apropiada en condiciones adecuadas para la expresion del polipeptido TAT y la recuperacion del polipeptido TAT del cultivo
15 celular.
[0017] Otro aspecto de la presente descripcion se refiere a un polipeptido TAT aislado cuyo dominio transmembranal esta delecionado o cuyo dominio transmembranal esta inactivado. En este documento se describen tambien procedimientos para la produccion de los mismos, en que dichos procesos comprenden el cultivo de una
20 celula huesped que comprende un vector que comprende la molecula de acido nucleico codificante apropiada en condiciones adecuadas para la expresion del polipeptido TAT y la recuperacion del polipeptido TAT del cultivo celular.
[0018] En otros aspectos, la presente descripcion se refiere a vectores que comprenden el ADN que codifica
25 cualquiera de los polipeptidos descritos en este documento. Tambien se describen celulas huesped que comprenden cualquiera de tales vectores. A modo de ejemplo, las celulas huesped pueden ser celulas CHO, celulas de E. coli o celulas de levadura. Ademas se describe un procedimiento para la produccion de cualquiera de los polipeptidos descritos en este documento, el cual comprende el cultivo de las celulas huesped en condiciones adecuadas para la expresion del polipeptido deseado y la recuperacion del polipeptido deseado del cultivo celular.
30 [0019] En otros aspectos, la presente descripcion se refiere a polipeptidos quimericos aislados que comprenden cualquiera de los polipeptidos TAT descritos en este documento, fusionados con un polipeptido heterologo (distinto de TAT). Un ejemplo de tales moleculas quimericas comprende cualquiera de los polipeptidos TAT descritos en este documento fusionado con un polipeptido heterologo como, por ejemplo, una etiqueta epitopica
35 o una region Fc de una inmunoglobulina.
[0020] En una realizacion, la invencion se refiere a un anticuerpo que se une, preferentemente de manera especifica, a cualquiera de los polipeptidos descritos anteriormente o a continuacion. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humanizado, un 40 anticuerpo de cadena sencilla o un anticuerpo que inhibe competitivamente la union de un anticuerpo dirigido contra un polipeptido TAT o su epitopo antigenico respectivo. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion se conjugan con un agente inhibidor del crecimiento o un agente citotoxico que es un maitansinoide o una caliqueamicina, segun se define en las reivindicaciones. Los anticuerpos pueden producirse opcionalmente en celulas CHO o celulas bacterianas y preferentemente inducen la muerte de la celula a la que se unen. Para fines de
45 diagnostico, los anticuerpos pueden marcarse de manera detectable, fijarse a un soporte solido o algo similar.
[0021] En otros aspectos, la invencion se refiere a vectores que comprenden el ADN que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento. Tambien se describen celulas huesped que comprenden cualquiera de tales vectores. A modo de ejemplo, las celulas huesped pueden ser celulas CHO, celulas de E. coli o celulas de
50 levadura. Ademas se describe un procedimiento para la produccion de cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento, el cual comprende el cultivo de las celulas huesped en condiciones adecuadas para la expresion del anticuerpo deseado y la recuperacion del anticuerpo deseado del cultivo celular.
[0022] En este documento tambien se describen oligopeptidos ('oligopeptidos de union a TATquot;) que se unen,
55 preferentemente de manera especifica, a cualquiera de los polipeptidos TAT descritos anteriormente o a continuacion. Opcionalmente, los oligopeptidos de union a TAT pueden conjugarse con un agente inhibidor del crecimiento o un agente citotoxico como una toxina, incluidos, por ejemplo, un maitansinoide o una caliqueamicina, un antibiotico, un isotopo radiactivo, una enzima nucleolitica o similares. Los oligopeptidos de union a TAT pueden producirse opcionalmente en celulas CHO o celulas bacterianas y preferentemente inducen la muerte de la celula a la que se unen. Para fines de diagnostico, los oligopeptidos de union a TAT pueden marcarse de manera detectable, fijarse a un soporte solido o algo similar.
[0023] En este documento tambien se describen vectores que comprenden el ADN que codifica cualquiera de
5 los oligopeptidos de union a TAT descritos en este documento. Tambien se describen celulas huesped que comprenden cualquiera de tales vectores. A modo de ejemplo, las celulas huesped pueden ser celulas CHO, celulas de E. coli o celulas de levadura. Ademas se describe un procedimiento para la produccion de cualquiera de los oligopeptidos de union a TAT descritos en este documento, el cual comprende el cultivo de las celulas huesped en condiciones adecuadas para la expresion del oligopeptido deseado y la recuperacion del oligopeptido deseado del
10 cultivo celular.
[0024] En este documento tambien se describen moleculas organicas pequenas ('moleculas organicas de union a TATquot;) que se unen, preferentemente de manera especifica, a cualquiera de los polipeptidos TAT descritos anteriormente o a continuacion. Opcionalmente, las moleculas organicas de union a TAT pueden conjugarse con un
15 agente inhibidor del crecimiento o un agente citotoxico como una toxina, incluidos, por ejemplo, un maitansinoide o una caliqueamicina, un antibiotico, un isotopo radiactivo, una enzima nucleolitica o similares. Preferentemente, las moleculas organicas de union a TAT inducen la muerte de la celula a la que se unen. Para fines de diagnostico, las moleculas organicas de union a TAT pueden marcarse de manera detectable, fijarse a un soporte solido o algo similar.
20 [0025] La presente descripcion se refiere a una composicion de sustancias que comprende un polipeptido TAT segun se describe en este documento, un polipeptido TAT quimerico segun se describe en este documento, un anticuerpo dirigido contra TAT segun se describe en este documento, un oligopeptido de union a TAT segun se describe en este documento o una molecula organica de union a TAT segun se describe en este documento, en
25 combinacion con un vehiculo y, en otra realizacion, un anticuerpo dirigido contra TAT conjugado, segun se define en las reivindicaciones. Opcionalmente, el vehiculo es un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
[0026] En otra realizacion mas, la presente descripcion se refiere a un articulo de fabricacion que comprende un envase y una composicion de sustancias contenida en el envase, en que la composicion de sustancias puede 30 comprender un polipeptido TAT segun se describe en este documento, un polipeptido TAT quimerico segun se describe en este documento, un anticuerpo dirigido contra TAT segun se describe en este documento, un oligopeptido de union a TAT segun se describe en este documento o una molecula organica de union a TAT segun se describe en este documento o segun se definen en las reivindicaciones. El articulo puede comprender opcionalmente ademas una etiqueta pegada al envase o un prospecto incluido con el envase que se refiere al uso
35 de la composicion de sustancias para el tratamiento terapeutico o la deteccion diagnostica de un tumor.
[0027] Otra realizacion de la presente invencion se dirige al uso de un anticuerpo dirigido contra el polipeptido TAT conjugado, segun se describe en este documento, para la preparacion de un medicamento util para el tratamiento de una dolencia que responde al anticuerpo dirigido contra el polipeptido TAT conjugado segun se define
40 en las reivindicaciones.
B. Realizaciones adicionales
[0028] Algunos aspectos de la presente invencion, segun se definen en las reivindicaciones, se refieren a un
45 procedimiento para la inhibicion del crecimiento de una celula que expresa un polipeptido TAT, en que el procedimiento comprende la puesta en contacto de la celula con un anticuerpo, un oligopeptido o una molecula organica pequena que se une al polipeptido TAT y en que la union del anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica al polipeptido TAT causa la inhibicion del crecimiento de la celula que expresa el polipeptido TAT. Preferentemente, la celula es una celula cancerosa y la union del anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica
50 al polipeptido TAT causa la muerte de la celula que expresa el polipeptido TAT. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo de cadena sencilla. Los anticuerpos, los oligopeptidos de union a TAT y las moleculas organicas de union a TAT empleadas en los procedimientos pueden conjugarse opcionalmente con un agente inhibidor del crecimiento
o un agente citotoxico como una toxina, incluidos, por ejemplo, un maitansinoide o una caliqueamicina, un
55 antibiotico, un isotopo radiactivo, una enzima nucleolitica o similares. Los anticuerpos y oligopeptidos de union a TAT empleados en los procedimientos pueden producirse opcionalmente en celulas CHO o en celulas bacterianas.
[0029] Algunos aspectos de la presente invencion se refieren a un procedimiento para el tratamiento terapeutico de un mamifero con un tumor canceroso que comprende celulas que expresan un polipeptido TAT, en que el procedimiento comprende la administracion al mamifero de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo, un oligopeptido o una molecula organica pequena que se une al polipeptido TAT, lo que resulta en el eficaz tratamiento terapeutico del tumor. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo de cadena sencilla. Los
5 anticuerpos, los oligopeptidos de union a TAT y las moleculas organicas de union a TAT empleadas en los procedimientos pueden conjugarse opcionalmente con un agente inhibidor del crecimiento o un agente citotoxico como una toxina, incluidos, por ejemplo, un maitansinoide o una caliqueamicina, un antibiotico, un isotopo radiactivo, una enzima nucleolitica o similares. Los anticuerpos y oligopeptidos empleados en los procedimientos pueden producirse opcionalmente en celulas CHO o en celulas bacterianas.
10 [0030] En este documento se describe tambien un procedimiento para la determinacion de la presencia de un polipeptido TAT en una muestra sospechosa de contener el polipeptido TAT, en que el procedimiento comprende la exposicion de la muestra a un anticuerpo, un oligopeptido o una molecula organica pequena que se unen al polipeptido TAT y la determinacion de la union del anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica al polipeptido
15 TAT en la muestra, en que la presencia de tal union indica la presencia del polipeptido TAT en la muestra. Opcionalmente, la muestra puede contener celulas (que pueden ser celulas cancerosas) sospechosas de expresar el polipeptido TAT. Opcionalmente, el anticuerpo, el oligopeptido de union a TAT o la molecula organica de union a TAT empleados en el procedimiento pueden marcarse de manera detectable, fijarse a un soporte solido o algo similar.
20 [0031] En este documento tambien se describe un procedimiento para el diagnostico de la presencia de un tumor en un mamifero, en que el procedimiento comprende la deteccion del nivel de expresion de un gen que codifica un polipeptido TAT (a) en una muestra de prueba de celulas de tejido obtenidas de dicho mamifero y (b) en una muestra de control de celulas no cancerosas normales conocidas de mismo origen o tipo de tejido, en que un
25 mayor nivel de expresion del polipeptido TAT en la muestra de prueba en comparacion con la muestra de control indica la presencia de un tumor en el mamifero del que se obtuvo la muestra de prueba.
[0032] En este documento tambien se describe un procedimiento para el diagnostico de la presencia de un tumor en un mamifero, en que el procedimiento comprende (a) la puesta en contacto de una muestra de prueba que
30 comprende celulas de tejido obtenidas del mamifero con un anticuerpo, un oligopeptido o una molecula pequena que se unen a un polipeptido TAT y (b) la deteccion de la formacion de un complejo entre el anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica pequena y el polipeptido TAT en la muestra de prueba, en que la formacion de un complejo indica la presencia de un tumor en el mamifero. Opcionalmente, el anticuerpo, el oligopeptido de union a TAT o la molecula organica de union a TAT se marcan de manera detectable, se fijan a un soporte solido o algo similar y/o la
35 muestra de prueba de celulas de tejido se obtiene de un individuo sospechoso de tener un tumor canceroso.
[0033] En este documento tambien se describe un procedimiento para el tratamiento o la prevencion de un trastorno proliferativo celular asociado con la expresion o actividad alteradas, preferentemente aumentadas, de un polipeptido TAT. Preferentemente, el trastorno proliferativo celular es cancer y el antagonista del polipeptido TAT es
40 un anticuerpo dirigido contra el polipeptido TAT, un oligopeptido de union a TAT, una molecula organica de union a TAT o un oligonucleotido no codificante. El tratamiento o la prevencion eficaces del trastorno proliferativo celular pueden ser el resultado de la destruccion directa de las celulas que expresan un polipeptido TAT o de la inhibicion de su crecimiento, o de la antagonizacion de la actividad estimulante del crecimiento celular de un polipeptido TAT.
45 [0034] En este documento tambien se describe un procedimiento para la union de un anticuerpo, un oligopeptido o una molecula organica pequena a una celula que expresa un polipeptido TAT, en que el procedimiento comprende la puesta en contacto de la celula que expresa un polipeptido TAT con dichos anticuerpo, oligopeptido o molecula organica pequena en condiciones adecuadas para la union del anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica pequena a dicho polipeptido TAT y permitir la union entre estos.
50 [0035] Otras realizaciones de la presente invencion se dirigen al uso de un anticuerpo dirigido contra un polipeptido TAT conjugado en la preparacion de un medicamento util para (i) el tratamiento terapeutico de un cancer
o tumor o un trastorno proliferativo celular, segun se define en las reivindicaciones.
55 [0036] En este documento se describe un procedimiento para la inhibicion del crecimiento celular de una celula cancerosa, en que el crecimiento de dicha celula cancerosa depende al menos en parte del(de los) efecto(s) estimulante(s) del crecimiento de un polipeptido TAT (en que el polipeptido TAT puede ser expresado por la celula cancerosa misma o por una celula que produce uno o mas polipeptidos con un efecto estimulante del crecimiento sobre las celulas cancerosas), en que el procedimiento comprende la puesta en contacto del polipeptido TAT con un
anticuerpo, un oligopeptido o una molecula organica pequena que se unen al polipeptido TAT, con lo que se antagoniza la actividad estimulante del crecimiento del polipeptido TAT y, a su vez, se inhibe el crecimiento de la celula cancerosa. Preferentemente, el crecimiento de la celula cancerosa se inhibe completamente. Con aun mayor preferencia, la union del anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica pequena al polipeptido TAT induce la 5 muerte de la celula cancerosa. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo de cadena sencilla. Los anticuerpos, los oligopeptidos de union a TAT y las moleculas organicas de union a TAT empleados en los procedimientos pueden conjugarse opcionalmente con un agente inhibidor del crecimiento o un agente citotoxico como una toxina, incluidos, por ejemplo, un maitansinoide o una caliqueamicina, un antibiotico, un isotopo radiactivo, una enzima
10 nucleolitica o similares. Los anticuerpos y oligopeptidos de union a TAT empleados en los procedimientos pueden producirse opcionalmente en celulas CHO o en celulas bacterianas.
[0037] En este documento se describe un procedimiento para el tratamiento terapeutico de un tumor en un mamifero, en que el crecimiento de dicho tumor depende al menos en parte del(de los) efecto(s) estimulante(s) del 15 crecimiento de un polipeptido TAT, en que el procedimiento comprende la administracion al mamifero de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo, un oligopeptido o una molecula organica pequena que se unen al polipeptido TAT, lo que antagoniza la actividad estimulante del crecimiento de dicho polipeptido TAT y resulta en el eficaz tratamiento terapeutico del tumor. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo de cadena sencilla. Los
20 anticuerpos, oligopeptidos de union a TAT y moleculas organicas de union a TAT empleados en los procedimientos pueden conjugarse opcionalmente con un agente inhibidor del crecimiento o un agente citotoxico como una toxina, incluidos, por ejemplo, un maitansinoide o una caliqueamicina, un antibiotico, un isotopo radiactivo, una enzima nucleolitica o similares. Los anticuerpos y oligopeptidos empleados en los procedimientos pueden producirse opcionalmente en celulas CHO o en celulas bacterianas.
C. Otros aspectos
[0038] La invencion segun se define en las reivindicaciones se refiere a algunos de los siguientes aspectos descritos en este documento:
1. Un acido nucleico aislado con una secuencia nucleotidica con al menos el 0 % de identidad de secuencia de acido nucleico con:
(a)
una molecula de ADN que codifica la secuencia aminoacidica mostrada en la figura 62 (SEQ ID NO:62); 35
(b) una molecula de ADN que codifica la secuencia aminoacidica mostrada en la figura 62 (SEQ ID NO:62) sin su peptido senal asociado;
(c)
una molecula de ADN que codifica un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID 40 NO:62) con su peptido senal asociado;
(d) una molecula de ADN que codifica un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) sin su peptido senal asociado;
45 (e) la secuencia nucleotidica mostrada en la figura 6 (SEQ ID NO:6);
(f) la region codificante de longitud completa de la secuencia nucleotidica mostrada en la figura 6 (SEQ ID NO:6); o
(g) el complemento de (a), (b), (c), (d), (e) o (f). 50
2. Un acido nucleico aislado con:
(a) una secuencia nucleotidica que codifica la secuencia aminoacidica mostrada en la figura 62 (SEQ ID NO:62);
55 (b) una secuencia nucleotidica que codifica la secuencia aminoacidica mostrada en la figura 62 (SEQ ID NO:62) sin su peptido senal asociado;
(c)
una secuencia nucleotidica que codifica un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) con su peptido senal asociado;
(d)
una secuencia nucleotidica que codifica un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) sin su peptido senal asociado;
5 (e) la secuencia nucleotidica mostrada en la figura 6 (SEQ ID NO:6);
(f) la region codificante de longitud completa de la secuencia nucleotidica mostrada en la figura 6 (SEQ ID NO:6); o
(g) el complemento de (a), (b), (c), (d), (e) o (f). 10
3. Un acido nucleico aislado que hibrida con:
(a) un acido nucleico que codifica la secuencia aminoacidica mostrada en la figura 62 (SEQ ID NO:62);
15 (b) un acido nucleico que codifica la secuencia aminoacidica mostrada en la figura 62 (SEQ ID NO:62) sin su peptido senal asociado;
(c) un acido nucleico que codifica un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62)
con su peptido senal asociado; 20
(d) un acido nucleico que codifica un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) sin su peptido senal asociado;
(e)
la secuencia nucleotidica mostrada en la figura 6 (SEQ ID NO:6); 25
(f)
la region codificante de longitud completa de la secuencia nucleotidica mostrada en la figura 6 (SEQ ID NO:6); o
(g)
el complemento de (a), (b), (c), (d), (e) o (f).
30 4. El acido nucleico de 3, en que la hibridacion tiene lugar en condiciones astringentes.
5. El acido nucleico de 3 con una longitud de al menos cinco nucleotidos.
6. Un vector de expresion que comprende el acido nucleico de 1, 2 o 3. 35
7. El vector de expresion de 6, en que dicho acido nucleico esta unido operativamente a secuencias de control reconocidas por una celula huesped transformada con el vector.
�. Una celula huesped que comprende el vector de expresion de 7. 40
9.
La celula huesped de� que es una celula CHO, una celula de E. coli o una celula de levadura.
10.
Un procedimiento para la produccion de un polipeptido que comprende el cultivo de la celula huesped de en
condiciones adecuadas para la expresion de dicho polipeptido y la recuperacion de dicho polipeptido del cultivo 45 celular.
11. Un polipeptido aislado con al menos el �0 % de identidad de secuencia aminoacidica con:
(a)
el polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62); 50
(b) el polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) sin su peptido senal asociado;
(c)
un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) con su peptido senal asociado; 55 (d) un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) sin su peptido senal asociado;
(e)
un polipeptido codificado por la secuencia nucleotidica mostrada en la figura 6 (SEQ ID NO:6); o
(f)
un polipeptido codificado por la region codificante de longitud completa de la secuencia nucleotidica mostrada en
la figura 6 (SEQ ID NO: 6).
12. Un polipeptido aislado con: 5 (a) la secuencia aminoacidica mostrada en la figura 62 (SEQ ID NO:62);
(b) la secuencia aminoacidica mostrada en la figura 62 (SEQ ID NO:62) sin la secuencia de su peptido senal asociado;
10 (c) una secuencia aminoacidica de un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) con la secuencia de su peptido senal asociado;
(d) una secuencia aminoacidica de un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62)
sin la secuencia de su peptido senal asociado; 15
(e)
una secuencia aminoacidica codificada por la secuencia nucleotidica mostrada en la figura 6 (SEQ ID NO:6); o
(f)
una secuencia aminoacidica codificada por la region codificante de longitud completa de la secuencia nucleotidica
mostrada en la figura 6 (SEQ ID NO: 6). 20
13.
Un polipeptido quimerico que comprende el polipeptido de 11 o 12 fusionado con un polipeptido heterologo.
14.
El polipeptido quimerico de 13, en que dicho polipeptido heterologo es una etiqueta epitopica o una region Fc de
una inmunoglobulina. 25
15. Un anticuerpo aislado que se une a un polipeptido con al menos el �0 % de identidad de secuencia aminoacidica con:
(a)
el polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62); 30
(b) el polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) sin su peptido senal asociado;
(c)
un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) con su peptido senal asociado; 35 (d) un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) sin su peptido senal asociado;
(e) un polipeptido codificado por la secuencia nucleotidica mostrada en la figura 6 (SEQ ID NO:6); o
(f)
un polipeptido codificado por la region codificante de longitud completa de la secuencia nucleotidica mostrada en 40 la figura 6 (SEQ ID NO: 6).
16. Un anticuerpo aislado que se une a un polipeptido con:
(a)
la secuencia aminoacidica mostrada en la figura 62 (SEQ ID NO:62); 45
(b) la secuencia aminoacidica mostrada en la figura 62 (SEQ ID NO:62) sin la secuencia de su peptido senal asociado;
(c)
una secuencia aminoacidica de un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) 50 con la secuencia de su peptido senal asociado;
(d) una secuencia aminoacidica de un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) sin la secuencia de su peptido senal asociado;
55 (e) una secuencia aminoacidica codificada por la secuencia nucleotidica mostrada en la figura 6 (SEQ ID NO:6); o
(f) una secuencia aminoacidica codificada por la region codificante de longitud completa de la secuencia nucleotidica mostrada en la figura 6 (SEQ ID NO: 6).
17. El anticuerpo de 15 o 16 que es un anticuerpo monoclonal.
1� . El anticuerpo de 15 o 16 que es un fragmento de anticuerpo.
5 19. El anticuerpo de 15 o 16 que es un anticuerpo quimerico o humanizado.
20. El anticuerpo de 15 o 16 que esta conjugado con un agente inhibidor del crecimiento.
21.
El anticuerpo de 15 o 16 que esta conjugado con un agente citotoxico. 10
22. El anticuerpo de 21, en que el agente citotoxico se selecciona del grupo que consta de toxinas, antibioticos, isotopos radiactivos y enzimas nucleoliticas.
23.
El anticuerpo de 21, en que el agente citotoxico es una toxina. 15
24. El anticuerpo de 23, en que la toxina se selecciona del grupo que consta de maitansinoide y caliqueamicina.
25. El anticuerpo de 23, en que la toxina es un maitansinoide. 20 26. El anticuerpo de 15 o 16 que se produce en bacterias.
27. El anticuerpo de 15 o 16 que se produce en celulas CHO.
2�. El anticuerpo de 15 o 16 que induce la muerte de la celula a la que se une. 25
29.
El anticuerpo de 15 o 16 que esta marcado de manera detectable.
30.
Un acido nucleico aislado con una secuencia nucleotidica que codifica el anticuerpo 15 o 16.
30 31. Un vector de expresion que comprende el acido nucleico de 30 unido operativamente a secuencias de control reconocidas por una celula huesped transformada con el vector.
32. Una celula huesped que comprende el vector de expresion de 31. 35 33. La celula huesped de 32 que es una celula CHO, una celula de E. coli o una celula de levadura.
34. Un procedimiento para la produccion de un anticuerpo que comprende el cultivo de la celula huesped de 32 en condiciones adecuadas para la expresion de dicho anticuerpo y la recuperacion de dicho anticuerpo del cultivo celular.
55. Una composicion de sustancias que comprende:
(a)
el polipeptido de 11; 45 (b) el polipeptido de 12;
(c) el polipeptido quimerico de 13;
(d)
el anticuerpo de 15; o 50
(e) el anticuerpo de 16.
56. La composicion de sustancias de 55, en que dicho vehiculo es un vehiculo farmaceuticamente aceptable. 55 57. Un articulo de fabricacion que comprende:
(a)
un envase; y
(b)
la composicion de sustancias de 55 contenida en dicho envase.
5� . El articulo de fabricacion de 57 que ademas comprende una etiqueta pegada a dicho envase o un prospecto incluido con dicho envase, que se refiere al uso de dicha composicion de sustancias para el tratamiento terapeutico
o la deteccion diagnostica de un cancer. 5
59. Un procedimiento para la inhibicion del crecimiento de una celula que expresa una proteina con al menos el �0 % de identidad de secuencia aminoacidica con:
(a)
el polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62); 10
(b) el polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) sin su peptido senal asociado;
(c)
un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) con su peptido senal asociado; 15 (d) un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) sin su peptido senal asociado;
(e)
un polipeptido codificado por la secuencia nucleotidica mostrada en la figura 6 (SEQ ID NO:6); o
(f)
un polipeptido codificado por la region codificante de longitud completa de la secuencia nucleotidica mostrada en
20 la figura 6 (SEQ ID NO: 6), en que dicho procedimiento comprende la puesta en contacto de dicha celula con un anticuerpo, un oligopeptido o una molecula organica que se unen a dicha proteina, en que la union de dichos anticuerpo, oligopeptido o molecula organica a dicha proteina causa una inhibicion del crecimiento de dicha celula.
60. El procedimiento de 59, en que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 25
61.
El procedimiento de 59, en que dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.
62.
El procedimiento de 59, en que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimerico o humanizado.
30 63. El procedimiento de 59, en que dichos anticuerpo, oligopeptido o molecula organica estan conjugados con un agente inhibidor del crecimiento.
64. El procedimiento de 59, en que dichos anticuerpo, oligopeptido o molecula organica estan conjugados con un
agente citotoxico. 35
65. El procedimiento de 64, en que dicho agente citotoxico se selecciona del grupo que consta de toxinas, antibioticos, isotopos radiactivos y enzimas nucleoliticas.
66. El procedimiento de 64, en que el agente citotoxico es una toxina. 40
67. El procedimiento de 66, en que la toxina se selecciona del grupo que consta de maitansinoide y caliqueamicina.
6�.
El procedimiento de 66, en que la toxina es un maitansinoide. 45 69. El procedimiento de 59, en que dicho anticuerpo se produce en bacterias.
70. El procedimiento de 59, en que dicho anticuerpo se produce en celulas CHO.
71.
El procedimiento de 59, en que dicha celula es una celula cancerosa. 50
72.
El procedimiento de 71, en que dicha celula cancerosa se expone ademas a un tratamiento de radiacion o a un agente quimioterapeutico.
73.
El procedimiento de 71, en que dicha celula cancerosa se selecciona del grupo que consta de una celula de
55 cancer de mama, una celula de cancer colorrectal, una celula de cancer de pulmon, una celula de cancer de ovario, una celula de cancer del sistema nervioso central, una celula de cancer de higado, una celula de cancer de vejiga, una celula de cancer pancreatico, una celula de cancer cervical, una celula de melanoma y una celula de leucemia.
74.
El procedimiento de 71, en que dicha proteina es expresada mas abundantemente por dicha celula cancerosa
que por una celula normal del mismo origen tisular.
75.
El procedimiento de 59 que causa la muerte de dicha celula.
5 76. El procedimiento de 59, en que dicha proteina tiene la secuencia aminoacidica segun se muestra en (a) a (f).
77. Un procedimiento para el tratamiento terapeutico de un mamifero con un tumor canceroso que comprende celulas que expresan una proteina con al menos el �0 % de identidad de secuencia aminoacidica con:
10 (a) el polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62);
(b) el polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) sin su peptido senal asociado;
(c) un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) con su peptido senal asociado; 15
(d)
un dominio extracelular del polipeptido mostrado en la figura 62 (SEQ ID NO:62) sin su peptido senal asociado;
(e)
un polipeptido codificado por la secuencia nucleotidica mostrada en la figura 6 (SEQ ID NO:6); o
20 (f) un polipeptido codificado por la region codificante de longitud completa de la secuencia nucleotidica mostrada en la figura 6 (SEQ ID NO: 6), en que dicho procedimiento comprende la administracion a dicho mamifero de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo, un oligopeptido o una molecula organica que se unen a dicha proteina, con lo que se trata eficazmente a dicho mamifero.
25 7�. El procedimiento de 77, en que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
79. El procedimiento de 77, en que dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.
�0.
El procedimiento de 77, en que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimerico o humanizado. 30
�1. El procedimiento de 77, en que dichos anticuerpo, oligopeptido o molecula organica estan conjugados con un agente inhibidor del crecimiento.
�2.
El procedimiento de 77, en que dichos anticuerpo, oligopeptido o molecula organica estas conjugados con un 35 agente citotoxico.
�3. El procedimiento de 2, en que dicho agente citotoxico se selecciona del grupo que consta de toxinas, antibioticos, isotopos radiactivos y enzimas nucleoliticas.
40 �4. El procedimiento de �2, en que el agente citotoxico es una toxina.
�5. El procedimiento de �4, en que la toxina se selecciona del grupo que consta de maitansinoide y caliqueamicina.
�6. El procedimiento de �4, en que la toxina es un maitansinoide. 45
�7. El procedimiento de 77, en que dicho anticuerpo se produce en bacterias. ��. El procedimiento de 77, en que dicho anticuerpo se produce en celulas CHO.
50 �9. El procedimiento de 77, en que dicho tumor se expone ademas a un tratamiento de radiacion o a un agente quimioterapeutico.
90. El procedimiento de 77, en que dicho tumor es un tumor de mama, un tumor colorrectal, un tumor de pulmon, un
tumor de ovario, un tumor del sistema nervioso central, un tumor de higado, un tumor de vejiga, un tumor 55 pancreatico un tumor cervical.
91.
El procedimiento de 77, en que dicha proteina es expresada mas abundantemente por las celulas cancerosas de dicho tumor que por una celula normal del mismo origen tisular.
92.
El procedimiento de 77, en que dicha proteina tiene la secuencia aminoacidica segun se muestra en (a) a (f).
[0039] Otras realizaciones mas de la presente invencion seran evidentes para el experto en la tecnica al leer la presente memoria descriptiva. 5 BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
[0040] La figura 6 muestra la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO:6) de un ADNc de TAT193, en que SEQ ID NO:6 es un clon denominado en este documento 'DNA96964quot;.
10 [0041] La figura 62 muestra la secuencia aminoacidica (SEQ ID NO:62) derivada de la secuencia codificante de SEQ ID NO:6 mostrada en la figura 6.
DESCRIPCION DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS 15
I. Definiciones
[0042] Los terminos 'polipeptido TATquot; y 'TATquot;, segun se usan en este documento y cuando van inmediatamente seguidos de una designacion numerica, se refieren a diversos polipeptidos, en que la designacion 20 completa (es decir, TAT/numero) se refiere a secuencias polipeptidicas especificas segun se describen en este documento. Los terminos 'polipeptido TAT/numeroquot; y 'TAT/numeroquot;, en que el termino 'numeroquot; se proporciona como una designacion numerica real, segun se usan en este documento, abarcan polipeptidos de secuencia nativa, variantes polipeptidicas y fragmentos de polipeptidos de secuencia nativa y de variantes polipeptidicas (que se definen mas detalladamente en este documento). Los polipeptidos TAT descritos en este documento pueden 25 aislarse de diversas fuentes, como de tipos de tejido humano o de otra fuente o prepararse por procedimientos recombinantes o sinteticos. El termino 'polipeptido TATquot; se refiere a cada polipeptido TAT/numero individual desvelado en este documento. Todas las descripciones en esta memoria descriptiva que se refieren al 'polipeptido TATquot; se refieren a cada uno de los polipeptidos individualmente, asi como conjuntamente. Por ejemplo, las descripciones de la preparacion de, purificacion de, derivacion de, formacion de anticuerpos dirigidos contra,
30 formacion de oligopeptidos de union a TAT dirigidos contra, formacion de moleculas organicas de union a TAT dirigidas contra, administracion de, composiciones que contienen, tratamiento de una enfermedad con, etc., corresponden a cada polipeptido de la invencion individualmente. El termino 'polipeptido TATquot; tambien incluye variantes de los polipeptidos TAT/numero desvelados en este documento.
35 [0043] Un 'polipeptido TAT de secuencia nativaquot; comprende un polipeptido con la misma secuencia aminoacidica que el correspondiente polipeptido TAT derivado de la naturaleza. Tales polipeptidos TAT de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por procedimientos recombinantes o sinteticos. El termino 'polipeptido TAT de secuencia nativaquot; abarca especificamente formas truncadas o secretadas de origen natural del polipeptido TAT especifico (por ejemplo, una secuencia de un dominio extracelular), formas
40 variantes de origen natural (por ejemplo, formas de corte y empalme alternativo) y variantes alelicas de origen natural del polipeptido. En ciertas realizaciones de la invencion, los polipeptidos TAT de secuencia nativa desvelados en este documento son polipeptidos de secuencia nativa de longitud completa que comprenden las secuencias aminoacidicas de longitud completa mostradas en las figuras adjuntas. Los codones de inicio y parada (si se indican) se muestran en las figuras en letra negrita y subrayados. Los restos de acido nucleico indicados como 'Nquot; en las
45 figuras adjuntas son cualquier resto de acido nucleico. Sin embargo, aunque los polipeptidos TAT desvelados en las figuras adjuntas se muestran comenzando con restos de metionina, designados en las figuras de este documento por la posicion aminoacidica 1, es concebible y posible que otros restos de metionina localizados por delante o por detras de la posicion aminoacidica 1 en las figuras puedan ser empleados como el resto aminoacidico de inicio para los polipeptidos TAT.
50 [0044] El 'dominio extracelularquot; del polipeptido TAT o 'DECquot; se refiere a una forma del polipeptido TAT esencialmente sin los dominios transmembranal ni citoplasmico. Generalmente, un DEC de un polipeptido TAT tendra menos del 1 % de tales dominios transmembranal y/o citoplasmico y, preferentemente, tendra menos del 0,5 % de tales dominios. Se entendera que cualquier dominio transmembranal identificado para los polipeptidos TAT de
55 la presente invencion se habra identificado siguiendo los criterios empleados de manera rutinaria en la tecnica para la identificacion de ese tipo de dominio hidrofobo. Los limites exactos de un dominio transmembranal pueden variar, pero lo mas probable es que las variaciones no incluyan mas de cinco aminoacidos a cada uno de los extremos del dominio segun se identifica inicialmente en este documento. Por lo tanto, opcionalmente, un dominio extracelular de un polipeptido TAT puede contener desde aproximadamente cinco aminoacidos o menos a cada lado del limite entre el dominio transmembranal y el dominio extracelular, segun se identifica en los ejemplos o en la memoria descriptiva, y tales polipeptidos, con o sin el peptido senal asociado, y los acidos nucleicos que los codifican se contemplan en la presente invencion.
5 [0045] La localizacion aproximada de los 'peptidos senalquot; de los diversos polipeptidos TAT desvelados en este documento puede mostrarse en la presente memoria descriptiva y/o en las figuras adjuntas. Sin embargo, se senala que el limite C-terminal de un peptido senal puede variar, pero lo mas probable es que la variacion no incluya mas de aproximadamente cinco aminoacidos a cada lado del limite C-terminal del peptido senal segun se define inicialmente en este documento, en que el limite C-terminal del peptido senal puede identificarse siguiendo los
10 criterios empleados de manera rutinaria en la tecnica para la identificacion de ese tipo de elemento de secuencia aminoacidica (por ejemplo, Nielsen y col., Prot. Eng. 10: 1-6 (1997) y von Heinje y col., Nucl. Acids Res. 14: 46�34690 (19� 6)). Ademas, tambien se reconoce que, en algunos casos, la escision de una secuencia senal de un polipeptido secretado no es enteramente uniforme, lo que resulta en mas de una especie secretada. Estos polipeptidos maduros, cuya secuencia senal se escinde dentro de no mas de cinco aminoacidos a cada lado del
15 limite C-terminal del peptido senal segun se identifica en este documento, y los polinucleotidos que los codifican se contemplan en la presente invencion.
[0046] Una 'variante de polipeptido TATquot; significa un polipeptido TAT, preferentemente un polipeptido TAT activo, segun se define en este documento, con al menos el �0 % de identidad de secuencia aminoacidica con una 20 secuencia de un polipeptido TAT de secuencia nativa de longitud completa segun se desvela en este documento, una secuencia de un polipeptido TAT sin el peptido senal segun se desvela en este documento, un dominio extracelular de un polipeptido TAT, con o sin el peptido senal, segun se desvela en este documento o cualquier otro fragmento de una secuencia de un polipeptido TAT de longitud completa segun se desvela en este documento (como aquellos codificados por un acido nucleico que representa solo una porcion de la secuencia codificante 25 completa de un polipeptido TAT de longitud completa). Tales variantes de polipeptidos TAT incluyen, por ejemplo, polipeptidos TAT en los que se anaden o delecionan uno o mas restos aminoacidicos en los extremos N o C de la secuencia aminoacidica nativa de longitud completa. Generalmente, una variante de un polipeptido TAT tendra al menos aproximadamente el �0 % de identidad de secuencia aminoacidica, alternativamente al menos aproximadamente el �1 %, 2 %, �3 %, 4 %, �5 %, 6 %, 7 %, %, �9 %, 90 %,91 %,92 %,93%, 94 %,95 %, 30 96 %, 97 %, 9 % o el 99 % de identidad de secuencia aminoacidica con una secuencia de un polipeptido TAT de secuencia nativa de longitud completa segun se desvela en este documento, una secuencia de un polipeptido TAT sin el peptido senal segun se desvela en este documento, un dominio extracelular de un polipeptido TAT, con o sin el peptido senal, segun se desvela en este documento o cualquier otro fragmento definido especificamente de una secuencia de un polipeptido TAT de longitud completa segun se desvela en este documento. Generalmente, las 35 variantes de polipeptidos TAT tienen una longitud de al menos aproximadamente 10 aminoacidos, alternativamente una longitud de al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 0, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 1�0, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 2 0, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 3 0, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 4 0, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 5 0, 590, 600 aminoacidos o mas. Opcionalmente, las variantes de polipeptidos TAT no tendran mas de una sustitucion conservadora de
40 aminoacidos en comparacion con la secuencia nativa del polipeptido TAT, alternativamente, no mas de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones conservadoras de aminoacidos en comparacion con la secuencia nativa del polipeptido TAT.
[0047] El 'porcentaje ( %) de identidad de secuencia aminoacidicaquot; con respecto a las secuencias de
45 polipeptidos TAT identificadas en este documento se define como el porcentaje de restos aminoacidicos en una secuencia candidata que son identicos a los restos aminoacidicos de la secuencia del polipeptido TAT especifico, despues de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para conseguir el maximo porcentaje de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitucion conservadora como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia aminoacidica puede conseguirse de
50 diversos modos conocidos en la tecnica, por ejemplo, mediante el uso de programas informaticos disponibles publicamente como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la tecnica pueden determinar los parametros apropiados para medir el alineamiento, incluidos los algoritmos necesarios para conseguir el maximo alineamiento en la totalidad de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los fines de este documento, los valores del porcentaje de identidad de secuencia aminoacidica se generan mediante el
55 programa informatico de comparacion de secuencias ALIGN-2, en que el codigo fuente completo para dicho programa ALIGN-2 se proporciona en la tabla 1 a continuacion. El programa informatico de comparacion de secuencias ALIGN-2 ha sido creado por Genentech Inc. y el codigo fuente mostrado en la tabla 1 a continuacion ha sido presentado con la documentacion del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los EE. UU. (U.S. Copyright Office), Washington D.C., 20559, donde esta registrado como U.S. Copyright Registration No.
TXU5100�7. El programa ALIGN-2 esta disponible publicamente a traves de Genentech, Inc., South San Francisco, California, EE. UU., o puede compilarse a partir del codigo fuente proporcionado en la tabla 1 a continuacion. El programa ALIGN-2 debe compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.OD digital. Todos los parametros para la comparacion de secuencias quedan fijados por el programa ALIGN-2 y no
5 varian.
[0048] En las situaciones en las que se emplea ALIGN-2 para la comparacion de secuencias aminoacidicas, el porcentaje de identidad de secuencia aminoacidica de una secuencia aminoacidica dada A con respecto a una secuencia aminoacidica dada B (lo que puede expresarse alternativamente como una secuencia aminoacidica dada
10 A que tiene o comprende un cierto porcentaje de identidad de secuencia aminoacidica con respecto a una secuencia aminoacidica dada B) se calcula de la manera siguiente:
100 veces la fraccion X/Y
15 en que X es el numero de restos aminoacidicos identificados como correspondencias identicas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en el alineamiento de A y B realizado por el programa y en que Y es el numero total de restos aminoacidicos en B. Se apreciara que cuando la longitud de la secuencia aminoacidica A no es igual a la longitud de la secuencia aminoacidica B, el porcentaje de identidad de secuencia aminoacidica de A con respecto a B no sera igual al porcentaje de identidad de secuencia aminoacidica de B con respecto a A. Como
20 ejemplos de calculos del porcentaje de identidad de secuencia aminoacidica mediante este procedimiento, las tablas 2 y 3 muestran como calcular el porcentaje de identidad de secuencia aminoacidica de la secuencia aminoacidica denominada 'proteina de comparacionquot; con respecto a la secuencia aminoacidica denominada 'TATquot;, en que 'TATquot; representa la secuencia aminoacidica de un hipotetico polipeptido TAT de interes, la 'proteina de comparacionquot; representa la secuencia aminoacidica de un polipeptido con el que se compara el polipeptido quot;TATquot; de interes y 'Xquot;,
25 'Yquot; y 'Zquot; representan, respectivamente, diferentes restos aminoacidicos hipoteticos. A menos que se indique especificamente lo contrario, todos los valores de porcentaje de identidad de secuencia aminoacidica usados en este documento se obtienen segun se describe en el parrafo inmediatamente precedente por medio del programa informatico ALIGN-2.
30 [0049] Un 'polinucleotido variante de TATquot; o una 'secuencia de acido nucleico variante de TATquot; indican una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido TAT, preferentemente un polipeptido TAT activo, segun se define en este documento y con al menos el �0 % de identidad de secuencia de acido nucleico con una secuencia nucleotidica que codifica la secuencia de un polipeptido TAT de secuencia nativa de longitud completa segun se desvela en este documento, una secuencia de un polipeptido TAT de secuencia nativa de longitud completa sin el 35 peptido senal segun se desvela en este documento, un dominio extracelular de un polipeptido TAT, con o sin el peptido senal, segun se desvela en este documento o cualquier otro fragmento de una secuencia de un polipeptido TAT de longitud completa segun se desvela en este documento (como aquellos codificados por un acido nucleico que representa solo una porcion de la secuencia codificante completa de un polipeptido TAT de longitud completa). Generalmente, un polinucleotido variante de TAT tendra al menos aproximadamente el �0 % de identidad de 40 secuencia de acido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente el �1 %, �2 %, �3 %, 4 %, �5 %, �6 %, �7 %, %, �9 %, 90 %,91 %, 92%,93 %, 94 %, 95 %,96 %, 97 %, 9 %o el 99 % deidentidad de secuenciade acido nucleico con una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia de un polipeptido TAT de secuencia nativa de longitud completa segun se desvela en este documento, una secuencia de un polipeptido TAT de secuencia nativa de longitud completa sin el peptido senal segun se desvela en este documento, un dominio
45 extracelular de un polipeptido TAT, con o sin el peptido senal, segun se desvela en este documento o cualquier otro fragmento de una secuencia de un polipeptido TAT de longitud completa segun se desvela en este documento. Las variantes no abarcan la secuencia nucleotidica nativa.
[0050] Generalmente, los polinucleotidos variantes de TAT tienen una longitud de al menos aproximadamente
50 cinco nucleotidos, alternativamente una longitud de al menos aproximadamente seis, siete, ocho, nueve, diez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 1 �, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 2�, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 0, �5, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 1�0, 1�5, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 2�0, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 3 0, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 4�0, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 5�0, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670,
55 6�0, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 7 0, 790, �00, �10, 20, �30, 40, �50, �60, �70, 0, �90, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 9 0, 990 o 1.000 nucleotidos, en que en este contexto, el termino 'aproximadamentequot; significa la longitud de la secuencia nucleotidica indicada mas o menos el 10 % de dicha longitud indicada.
[0051] El 'porcentaje ( %) de identidad de secuencia de acido nucleicoquot; con respecto a las secuencias de acido nucleico que codifican TAT identificadas en este documento se define como el porcentaje de nucleotidos en una secuencia candidata que son identicos a los nucleotidos de la secuencia de acido nucleico de TAT de interes, despues de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para conseguir el maximo porcentaje de 5 identidad de secuencia. El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de acido nucleico puede conseguirse de diversos modos conocidos en la tecnica, por ejemplo, mediante el uso de programas informaticos disponibles publicamente como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Sin embargo, para los fines de este documento, los valores del porcentaje de identidad de secuencia de acido nucleico se generan mediante el programa informatico de comparacion de secuencias ALIGN-2, en que el codigo fuente 10 completo para dicho programa ALIGN-2 se proporciona en la tabla 1 a continuacion. El programa informatico de comparacion de secuencias ALIGN-2 ha sido creado por Genentech Inc. y el codigo fuente mostrado en la tabla 1 a continuacion ha sido presentado con la documentacion del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los EE. UU. (U.S. Copyright Office), Washington D.C., 20559, donde esta registrado como U.S. Copyright Registration No. TXU5100�7. El programa ALIGN-2 esta disponible publicamente a traves de Genentech, Inc., South San Francisco,
15 California, EE. UU., o puede compilarse a partir del codigo fuente proporcionado en la tabla 1 a continuacion. El programa ALIGN-2 debe compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.OD digital. Todos los parametros para la comparacion de secuencias quedan fijados por el programa ALIGN-2 y no varian.
20 [0052] En las situaciones en las que se emplea ALIGN-2 para la comparacion de secuencias de acidos nucleicos, el porcentaje de identidad de secuencia de acido nucleico de una secuencia de acido nucleico dada C con respecto a una secuencia de acido nucleico dada D (lo que puede expresarse alternativamente como una secuencia de acido nucleico dada C que tiene o comprende un cierto porcentaje de identidad de secuencia de acido nucleico con respecto a una secuencia de acido nucleico dada D) se calcula de la manera siguiente:
25 100 veces la fraccionW/Z
en que W es el numero de nucleotidos identificados como correspondencias identicas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en el alineamiento de C y D realizado por el programa y en que Z es el numero 30 total de nucleotidos en D. Se apreciara que cuando la longitud de la secuencia de acido nucleico C no es igual a la longitud de la secuencia de acido nucleico D, el porcentaje de identidad de secuencia de acido nucleico de C con respecto a D no sera igual al porcentaje de identidad de secuencia de acido nucleico de D con respecto a C. Como ejemplos de calculos del porcentaje de identidad de secuencia de acido nucleico mediante este procedimiento, las tablas 4 y 5 muestran como calcular el porcentaje de identidad de secuencia de acido nucleico de la secuencia de 35 acido nucleico denominada 'ADN de comparacionquot; con respecto a la secuencia de acido nucleico denominada 'ADN de TATquot;, en que el 'ADN de TATquot; representa una hipotetica secuencia de acido nucleico codificante de TAT de interes, el 'ADN de comparacionquot; representa la secuencia nucleotidica de una molecula de acido nucleico con la que se compara la molecula de acido nucleico quot;ADN de TATquot; de interes y 'Nquot;, quot;Lquot; y 'Vquot; representan, respectivamente, diferentes nucleotidos hipoteticos. A menos que se indique especificamente lo contrario, todos los valores de
40 porcentaje de identidad de secuencia de acido nucleico usados en este documento se obtienen segun se describe en el parrafo inmediatamente precedente por medio del programa informatico ALIGN-2.
[0053] En otras realizaciones, los polinucleotidos variantes de TAT son moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido TAT y que son capaces de hibridar, preferentemente en condiciones de hibridacion y lavado
45 astringentes, con secuencias nucleotidicas que codifican un polipeptido TAT de longitud completa segun se desvela en este documento. Los polipeptidos TAT variantes pueden ser aquellos que son codificados por un polinucleotido variante de TAT.
[0054] El termino 'region codificante de longitud completaquot;, cuando se usa en referencia a un acido nucleico
50 que codifica un polipeptido TAT, se refiere a la secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido TAT de longitud completa de la invencion (que a menudo se muestra entre codones de inicio y de parada, ambos incluidos, en las figuras adjuntas). El termino 'region codificante de longitud completaquot;, cuando se usa en referencia a un acido nucleico depositado en la coleccion ATCC, se refiere a la porcion codificante del polipeptido TAT del ADNc insertado en el vector depositado en la coleccion ATCC (que a menudo se muestra entre codones de inicio y de parada,
55 ambos incluidos, en las figuras adjuntas).
[0055] 'Aisladoquot;, cuando se usa para describir los diversos polipeptidos TAT desvelados en este documento, significa un polipeptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirian tipicamente con el uso diagnostico o terapeutico del polipeptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteinicos o no proteinicos. En realizaciones preferidas, el polipeptido se purificara (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia aminoacidica N-terminal o interna mediante un secuenciador de taza giratoria o (2) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras con azul de Coomassie o,
5 preferentemente, tincion con plata. El polipeptido aislado incluye el polipeptido in situ dentro de las celulas recombinantes, dado que al menos un componente del entorno natural del polipeptido TAT no estara presente. Sin embargo, generalmente, el polipeptido aislado se preparara mediante al menos una etapa de purificacion.
[0056] Un acido nucleico codificante de un polipeptido TAT u otro acido nucleico codificante de un polipeptido
10 'aisladoquot; es una molecula de acido nucleico que se ha identificado y separado de al menos una molecula de acido nucleico contaminante con la que normalmente esta asociada en la fuente natural del acido nucleico codificante del polipeptido. Una molecula de acido nucleico codificante de un polipeptido aislada es diferente de la forma o composicion en la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moleculas de acido nucleico codificantes de polipeptidos aisladas se distinguen de la molecula de acido nucleico codificante de un polipeptido especifica tal
15 como existe en las celulas naturales. Sin embargo, una molecula de acido nucleico codificante de un polipeptido aislada incluye las moleculas de acido nucleico codificantes del polipeptido contenidas en celulas que normalmente expresan el polipeptido, en que, por ejemplo, la molecula de acido nucleico tiene una localizacion cromosomica diferente que en las celulas naturales.
20 [0057] El termino 'secuencias de controlquot; se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresion de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huesped concreto. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de union a ribosomas. Se sabe que las celulas eucariotas utilizan promotores, senales de poiladenilacion y potenciadores.
25 [0058] Un acido nucleico esta 'unido operativamentequot; cuando esta colocado en una relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o una secuencia lider secretora esta unido operativamente al ADN de un polipeptido si se expresa como una preproteina que participa en la secrecion del polipeptido; un promotor o un potenciador esta unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la
30 transcripcion de la secuencia; o un sitio de union a ribosomas esta unido operativamente a una secuencia codificante si esta situado de manera que facilita la traduccion. Generalmente, 'unido operativamentequot; significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de una secuencia lider secretora, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La union se consigue por ligacion en sitios de restriccion convenientes. Si no existen tales sitios, se usan adaptadores o enlazantes oligonucleotidicos
35 sinteticos, de acuerdo con la practica convencional.
[0059] La 'astringenciaquot; de las reacciones de hibridacion puede ser determinada facilmente por el experto en la tecnica y, generalmente, es un calculo empirico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentracion de sal. En general, las sondas de mayor longitud requieren mayores temperaturas para una 40 hibridacion adecuada, mientras que las sondas de menor longitud necesitan menores temperaturas. Generalmente, la hibridacion depende de la capacidad de rehibridacion del ADN desnaturalizado cuando las hebras complementarias estan presentes en un entorno por debajo de su temperatura de fusion. Cuanto mayor sea el grado de homologia deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor sera la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se deduce que mayores temperaturas relativas tenderan a hacer las condiciones de
45 reaccion mas astringentes, mientras que menores temperaturas actuaran al contrario. Para detalles adicionales y explicaciones sobre la astringencia de las reacciones de hibridacion, vease Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
[0060] Las 'condiciones 'astringentesquot; o 'condiciones de alta astringenciaquot;, segun se definen en este
50 documento, pueden identificarse como aquellas que: (1) emplean baja fuerza ionica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M, dodecilsulfato de sodio al 0,1 % a 50 'C;
(2) emplean un agente desnaturalizante, como formamida, durante la hibridacion, por ejemplo, formamida al 50 % (v/v) con albumina de suero bovino al 0,1 %, Ficoll al 0,1 %, polivinilpirrolidona al 0,1 %, tampon de fosfato de sodio 50 mMapH6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato desodio 75 mMa42 'C;o(3) una hibridacion durante la
55 noche en una disolucion que emplea formamida al 50 %, 5x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,�), pirofosfato de potasio al 0,1 %, 5x disolucion de Denhardt, ADN de esperma de salmon sometido a ultrasonidos (50 !g/ml), SDS al 0,1 % y sulfato de dextrano al 10 % a 42 'C, con un lavado de 10 minutosa 42 'Cen0,2xSSC(cloruro desodio,citrato desodio) seguido de unlavado de altaastringenciade 10 minutos a base de 0,1x SSC con EDTA a 55 'C.
[0061] Las 'condiciones de astringencia moderadaquot; pueden identificarse segun se describen por Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 19 �9, e incluyen el uso de una disolucion de lavado y condiciones de hibridacion (por ejemplo, temperatura, fuerza ionica y porcentaje de SDS) 5 menos astringentes que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones de astringencia moderada es la incubacion durante la noche a37 'Cen una disolucion que comprende: formamida al 20 %, 5xSSC(NaCl150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x disolucion de Denhardt, sulfato de dextrano al 10 % y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmon roto desnaturalizado, seguida del lavado de los filtros en 1x SSC a aproximadamente 37-50 'C. El experto en la tecnica sabra como ajustar la temperatura, la fuerza ionica, etc., segun
10 sea necesario para acomodar factores como la longitud de la sonda y similares.
[0062] El termino 'etiquetado con un epitopoquot;, cuando se usa en este documento, se refiere a un polipeptido quimerico que comprende un polipeptido TAT o un anticuerpo dirigido contra TAT fusionado con un 'polipeptido etiquetaquot;. El polipeptido etiqueta tiene suficientes restos para proporcionar un epitopo contra el cual puede
15 producirse un anticuerpo, pero es suficientemente pequeno para no interferir con la actividad del polipeptido con el que esta fusionado. Preferentemente, el polipeptido etiqueta tambien es practicamente unico, de modo que el anticuerpo no presenta sustancialmente ninguna reaccion cruzada con otros epitopos. Los polipeptidos etiqueta adecuados tienen generalmente al menos seis restos aminoacidicos y normalmente entre aproximadamente ocho y 50 restos aminoacidicos (preferentemente, entre aproximadamente 10 y 20 restos aminoacidicos).
20 [0063] Los terminos 'activo/aquot; o 'actividadquot;, para los fines de este documento, se refieren a la(s) forma(s) de un polipeptido TAT que retiene(n) una actividad biologica y/o inmunologica del TAT nativo o de origen natural, en que una actividad 'biologicaquot; se refiere a una funcion biologica (inhibidora o estimulante) causada por un TAT nativo
o de origen natural, distinta de la capacidad de inducir la produccion de un anticuerpo dirigido contra un epitopo
25 antigenico que se encuentra en un TAT nativo o de origen natural y una actividad 'inmunologicaquot; se refiere a la capacidad de inducir la produccion de un anticuerpo dirigido contra un epitopo antigenico que se encuentra en un TAT nativo o de origen natural.
[0064] El termino 'antagonistaquot; se usa en el sentido mas amplio e incluye cualquier molecula que bloquea,
30 inhibe o neutraliza total o parcialmente una actividad biologica de un polipeptido TAT nativo desvelado en este documento. De manera similar, el termino 'agonistaquot; se usa en el sentido mas amplio e incluye cualquier molecula que mimetiza una actividad biologica de un polipeptido TAT nativo desvelado en este documento. Las moleculas agonistas o antagonistas adecuadas incluyen especificamente anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, fragmentos
o variantes de secuencia aminoacidica de polipeptidos TAT, peptidos, oligonucleotidos no codificantes, moleculas
35 organicas pequenas, etc. agonistas o antagonistas. Los procedimientos para la identificacion de agonistas o antagonistas de un polipeptido TAT pueden comprender la puesta en contacto de un polipeptido TAT con una molecula agonista o antagonista candidata y la medida de un cambio detectable en una o mas actividades biologicas asociadas normalmente con el polipeptido TAT.
40 [0065] 'Tratarquot; o 'tratamientoquot; o 'alivioquot; se refieren a la vez al tratamiento terapeutico y a medidas profilacticas
o preventivas, en que el objetivo es prevenir o retardar (aliviar) el estado patologico o trastorno tratados. Los individuos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno, asi como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en los que ha de prevenirse el trastorno. Un sujeto o un mamifero se 'trataquot; con exito con respecto a un cancer que expresa un polipeptido TAT si, despues de recibir una cantidad terapeutica de un 45 anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido de union a TAT o una molecula organica de union a TAT segun los procedimientos de la presente invencion, el paciente muestra una reduccion o ausencia observables y/o medibles de uno o mas de los siguientes: reduccion del numero de celulas cancerosas o ausencia de las celulas cancerosas; reduccion del tamano del tumor; inhibicion (es decir, retraso en cierta medida y preferentemente parada) de la infiltracion de celulas cancerosas en los organos perifericos, incluida la propagacion del cancer a tejidos blandos y 50 huesos; inhibicion (es decir, retraso en cierta medida y preferentemente parada) de la metastasis tumoral; inhibicion en cierta medida del crecimiento tumoral; y/o alivio en cierta medida de uno o mas de los sintomas asociados con el cancer especifico; reduccion de la morbilidad y la mortalidad y mejora de aspectos de calidad de vida. En la medida en que el anticuerpo dirigido contra TAT o el oligopeptido de union a TAT pueden prevenir el crecimiento y/o destruir las celulas cancerosas existentes, pueden ser citostaticos y/o citotoxicos. El paciente tambien puede percibir la
55 reduccion de estos signos o sintomas.
[0066] Los parametros anteriores para evaluar el exito del tratamiento y la mejora de la enfermedad pueden medirse facilmente por procedimientos rutinarios conocidos por el medico. La eficacia del tratamiento del cancer puede medirse, por ejemplo, mediante la evaluacion del tiempo de progresion de la enfermedad (TTP) y/o la determinacion de la tasa de respuesta (RR). Para determinar la propagacion al hueso, la metastasis puede determinarse mediante pruebas de estadificacion y mediante exploracion osea y analisis del nivel de calcio y de otras enzimas. Tambien pueden llevarse a cabo exploraciones de TC para investigar la propagacion a la pelvis y a los ganglios linfaticos en la zona. Para investigar la metastasis en los pulmones y el higado se usan,
5 respectivamente, radiografias de torax y medidas de los niveles de enzimas hepaticas por procedimientos conocidos. Otros procedimientos rutinarios para monitorizar la enfermedad incluyen la ecografia transrectal (TRUS) y la biopsia con aguja transrectal (TRNB).
[0067] Para el cancer de vejiga, que es un cancer mas localizado, los procedimientos para determinar el
10 progreso de la enfermedad incluyen la evaluacion citologica urinaria por cistoscopia, la monitorizacion de la presencia de sangre en la orina, la visualizacion del tracto urotelial por ecografia o un pielograma intravenoso, tomografia computarizada (TC) y obtencion de imagenes por resonancia magnetica (IRM). La presencia de metastasis distantes puede evaluarse por TC del abdomen, radiografias de torax o gammagrafia del esqueleto.
15 [0068] La administracion 'cronicaquot; se refiere a la administracion del(los) agente(s) de manera continua, en oposicion a la manera de administracion unica, para mantener el efecto terapeutico (actividad) inicial durante un periodo de tiempo prolongado. La administracion 'intermitentequot; es un tratamiento que no se realiza consecutivamente sin interrupcion, sino que es mas bien de naturaleza ciclica.
20 [0069] Un 'mamiferoquot;, para el fin del tratamiento de un cancer, el alivio de sus sintomas o su diagnostico, se refiere a cualquier animal clasificado como mamifero, incluidos humanos, animales domesticos y de granja y animales del zoo, deportes o de compania, como perros, gatos, ganado vacuno, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferentemente, el mamifero es humano.
25 [0070] La administracion 'en combinacion conquot; uno o mas agentes terapeuticos incluye la administracion simultanea (coincidente) y consecutiva en cualquier orden.
[0071] Los 'vehiculosquot;, segun se usan en este documento, incluyen vehiculos, excipientes o estabilizantes farmaceuticamente aceptables que no son toxicos para la celula o mamifero expuestos a los mismos en las dosis y 30 concentraciones empleados. A menudo, el vehiculo fisiologicamente aceptable es una disolucion acuosa de pH tamponado. Algunos ejemplos de vehiculos fisiologicamente aceptables incluyen tampones, por ejemplo, de fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes, incluido el acido ascorbico; polipeptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez restos); proteinas como seroalbumina, gelatina o inmunoglobulinas; polimeros hidrofilos como polivinilpirrolidona; aminoacidos como glicina, glutamina, asparragina, arginina o lisina;
35 monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos, incluidas glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; alcoholes de azucar como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales como sodio; y/o tensioactivos no ionicos como TWEEN®, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS®.
[0072] Con 'fase solidaquot; o 'soporte solidoquot; se indica una matriz no acuosa a la que pueden adherirse o fijarse
40 un anticuerpo, un oligopeptido de union a TAT o una molecula organica de union a TAT de la presente invencion. Algunos ejemplos de fases solidas abarcadas en este documento incluyen aquellas formadas total o parcialmente por vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacaridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinilico y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase solida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificacion (por ejemplo, una columna de
45 cromatografia de afinidad). Este termino incluye tambien una fase solida discontinua de particulas discretas, como las descritas en la patente de los EE. UU. n'4.275.149.
[0073] Un 'liposomaquot; es una pequena vesicula compuesta de diversos tipos de lipidos, fosfolipidos y/o tensioactivos que es util para la administracion de un farmaco (como un polipeptido TAT, un anticuerpo dirigido
50 contra este o un oligopeptido de union a TAT) a un mamifero. Los componentes del liposoma se disponen normalmente en una formacion bicapa, similar a la disposicion de los lipidos en las membranas biologicas.
[0074] Una molecula 'pequenaquot; o molecula organica 'pequenaquot; se define en este documento como de un peso molecular inferior a aproximadamente 500 Da.
55 [0075] Una 'cantidad eficazquot; de un polipeptido, un anticuerpo, un oligopeptido de union a TAT, una molecula organica de union a TAT o un agonista o antagonista del mismo segun se desvela en este documento es una cantidad suficiente para llevar a cabo un fin expuesto especificamente. Una 'cantidad eficazquot; puede determinarse empiricamente de manera rutinaria en relacion con el fin expuesto.
[0076] El termino 'cantidad terapeuticamente eficazquot; se refiere a una cantidad de un anticuerpo, un polipeptido, un oligopeptido de union a TAT, una molecula organica de union a TAT u otro farmaco eficaz para 'tratarquot; una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamifero. En el caso del cancer, la cantidad terapeuticamente 5 eficaz del farmaco puede reducir el numero de celulas cancerosas; reducir el tamano del tumor; inhibir (es decir, retrasar en cierta medida y preferentemente parar) la infiltracion de celulas cancerosas en los organos perifericos; inhibir (es decir retrasar en cierta medida y preferentemente parar) la metastasis tumoral; inhibir en cierta medida el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierta medida uno o mas de los sintomas asociados con el cancer. Vease la definicion de 'tratarquot; en este documento. En la medida en que el farmaco puede prevenir el crecimiento y/o destruir
10 las celulas cancerosas existentes, puede ser citostatico y/o citotoxico.
[0077] Una 'cantidad inhibidora del crecimientoquot; de un anticuerpo dirigido contra TAT, un polipeptido TAT, un oligopeptido de union a TAT o una molecula organica de union a TAT es una cantidad capaz de inhibir el crecimiento de una celula, especialmente de una celula tumoral, por ejemplo, cancerosa, in vitro o in vivo. Una 'cantidad 15 inhibidora del crecimientoquot; de un anticuerpo dirigido contra TAT, un polipeptido TAT, un oligopeptido de union a TAT
o una molecula organica de union a TAT para el fin de inhibir el crecimiento celular neoplasico puede determinarse empiricamente de manera rutinaria.
[0078] Una 'cantidad citotoxicaquot; de un anticuerpo dirigido contra TAT, un polipeptido TAT, un oligopeptido de
20 union a TAT o una molecula organica de union a TAT es una cantidad capaz de causar la destruccion de una celula, especialmente de una celula tumoral, por ejemplo, cancerosa, in vitro o in vivo. Una 'cantidad citotoxicaquot; de un anticuerpo dirigido contra TAT, un polipeptido TAT, un oligopeptido de union a TAT o una molecula organica de union a TAT para el fin de inhibir el crecimiento celular neoplasico puede determinarse empiricamente de manera rutinaria.
25 [0079] El termino 'anticuerpoquot; se usa en el sentido mas amplio y abarca especificamente, por ejemplo, anticuerpos monoclonales dirigidos contra TAT individuales (incluidos agonistas, antagonistas y anticuerpos neutralizantes), composiciones de anticuerpos dirigidos contra TAT con especificidad poliepitopica, anticuerpos policlonales, anticuerpos dirigidos contra TAT de cadena sencilla y fragmentos de anticuerpos dirigidos contra TAT
30 (vease a continuacion), siempre que muestren la actividad biologica o inmunologica deseada. El termino 'inmunoglobulinaquot; (Ig) se usa en este documento de manera intercambiable con anticuerpo.
[0080] Un 'anticuerpo aisladoquot; es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirian con el 35 uso diagnostico o terapeutico del anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteinicos o no proteinicos. En las realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificara (1) hasta mas del 95 % en peso de anticuerpo, segun se determina por el metodo de Lowry y, con la maxima preferencia, hasta mas del 99 % en peso,
(2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia aminoacidica N-terminal o interna mediante un secuenciador de taza giratoria o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones
40 reductoras o no reductoras con azul de Coomassie o, preferentemente, tincion con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las celulas recombinantes, dado que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estara presente. Sin embargo, generalmente, el anticuerpo aislado se preparara mediante al menos una etapa de purificacion.
45 [0081] La unidad basica de un anticuerpo de cuatro cadenas es una glucoproteina heterotetramerica compuesta de dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas (un anticuerpo IgM consta de cinco de las unidades heterotetramericas basicas junto con un polipeptido adicional denominado cadena J y, por lo tanto, contiene diez sitios de union al antigeno, mientras que los anticuerpos IgA secretados pueden polimerizarse para formar ensambles polivalentes que comprenden de dos a cinco de las unidades basicas de cuatro cadenas
50 junto con la cadena J). En el caso de las IgG, la unidad de cuatro cadenas es en general de aproximadamente
150.000 Da. Cada una de las cadenas L esta enlazada a una cadena H por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H estan enlazadas entre si por uno o mas enlaces disulfuro, dependiendo del isotipo de la cadena H. Cada una de las cadenas H y L tiene tambien puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada una de las cadenas H tiene en el extremo N un dominio variable (VH) seguido de tres dominios constantes (CH)
55 en cada una de las cadenas a y y y de cuatro dominios CH en los isotipos ! y E. Cada una de las cadenas L tiene en el extremo N un dominio variable (VL) seguido de un dominio constante (CL) en el otro extremo. El VL esta alineado con el VH y el CL esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1). Se cree que restos aminoacidicos concretos forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada. El emparejamiento de un VH y un VL forma conjuntamente un unico sitio de union al antigeno. Para la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, vease, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, a edicion, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, EE. UU., 1994, pagina 71 y capitulo 6.
5 [0082] La cadena L de cualquier especie de vertebrado puede asignarse a uno o dos tipos claramente distintos, denominados K y A, sobre la base de las secuencias aminoacidicas de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia aminoacidica del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH), las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases o isotipos. Existen cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, con las cadenas pesadas denominadas a, 5, E, y y !, respectivamente. Las clases y y a se
10 dividen ademas en subclases sobre la base de diferencias relativamente menores en la secuencia y funcion del CH, por ejemplo, los humanos expresan las subclases siguientes: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.
[0083] El termino 'variablequot; se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre distintos anticuerpos. El dominio V posibilita la union del antigeno y define la 15 especificidad de un anticuerpo concreto para su antigeno concreto. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los 110 aminoacidos de extension de los dominios variables. En lugar de ello, las regiones V constan de tramos relativamente invariantes denominados regiones estructurales (FR) de 15-30 aminoacidos, separados por regiones mas cortas de extrema variabilidad denominadas 'regiones hipervariablesquot;, de una longitud de 9-12 aminoacidos cada una. Los dominios variables de las cadenas ligera y pesada nativas 20 comprenden cada uno cuatro FR, que en su mayor parte adoptan una configuracion de hoja �, conectadas por tres regiones hipervariables, las cuales forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de hoja �. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen proximas entre si por medio de las FR y, junto con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union al antigeno de los anticuerpos (vease Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service,
25 National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE. UU. (1991). Los dominios constantes no estan implicados directamente en la union del anticuerpo al antigeno, sino que presentan diversas funciones efectoras, como la participacion del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
[0084] El termino 'region hipervariablequot;, cuando se usa en este documento, se refiere a los restos
30 aminoacidicos de un anticuerpo que son responsables de la union al antigeno. La region hipervariable comprende generalmente los restos aminoacidicos de una 'region determinante de la complementariedadquot; o 'CDRquot; (por ejemplo, aproximadamente alrededor de los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 9-97 (L3) en el VL y aproximadamente alrededor de los restos 1-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el VH; Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE. UU. (1991)) y/o
35 los restos de un 'bucle hipervariablequot; (por ejemplo, los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el VL y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el VH; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (19 �7)).
[0085] El termino 'anticuerpo monoclonalquot;, segun se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que 40 comprenden la poblacion son identicos, excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en pequenas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son muy especificos, ya que se dirigen contra un unico sitio antigenico. Ademas, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un unico determinante en el antigeno. Ademas de por su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos 45 porque pueden sintetizarse sin estar contaminados con otros anticuerpos. El calificativo 'monoclonalquot; no ha de interpretarse como que se requiera la produccion del anticuerpo por un procedimiento concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales utiles en la presente invencion pueden prepararse por la metodologia del hibridoma descrita en primer lugar por Kholer y col., Nature 256: 495 (1975) o pueden preparase mediante procedimientos de ADN recombinante en bacterias o celulas eucariotas de animales o plantas (vease, por ejemplo, la patente de los
50 EE. UU. n'4.�16.567). Los 'anticuerpos monoclonalesquot; pueden aislarse tambien de bancos de anticuerpos en fagos mediante la tecnologia descrita en Clackson y col., Nature 352: 624-62� (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol. 222: 5 �1597 (1991), por ejemplo.
[0086] Los anticuerpos monoclonales en este documento incluyen anticuerpos 'quimericosquot;, en los que una
55 porcion de la cadena pesada y/o la cadena ligera es identica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie concreta o pertenecientes a una clase o subclase concreta de anticuerpos, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es identico u homologo a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, asi como a fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando muestren la actividad biologica deseada (vease la patente de los EE. UU. n' 4.�16.567; y Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA �1: 6 51-6 �55 (19�4)). Los anticuerpos quimericos de interes incluyen anticuerpos 'primatizadosquot; que comprenden secuencias de union a antigenos en el dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, monos del Viejo Mundo, simios, etc.) y secuencias de regiones constantes humanas.
5 [0087] Un anticuerpo 'intactoquot; es aquel que comprende un sitio de union a un antigeno, asi como una CL y al menos los dominios constantes de la cadena pesada CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes de secuencia aminoacidica de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo intacto tiene una o mas funciones efectoras.
10 [0088] Los 'fragmentos de anticuerposquot; comprenden una porcion de un anticuerpo intacto, preferentemente, la region de union al antigeno o la region variable del anticuerpo intacto. Algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (vease la patente de los EE. UU.n'5.641.�70, ejemplo2; Zapata ycol., Protein Eng. (10): 1057-1062 (1995)); moleculas de anticuerpode
15 cadena sencilla; y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
[0089] La digestion de anticuerpos con papaina produce dos fragmentos identicos de union al antigeno, denominados fragmentos 'Fabquot;, y un fragmento residual 'Fcquot;, una denominacion que refleja su capacidad de cristalizar facilmente. El fragmento Fab consta de una cadena L completa junto con el dominio de la region variable
20 de la cadena H (VH) y el primer dominio constante de una cadena pesada (CH1). Los fragmentos Fab son monovalentes con respecto a la union al antigeno, es decir, tienen un unico sitio de union al antigeno. El tratamiento de un anticuerpo con pepsina produce un unico fragmento de gran tamano F(ab')2 que corresponde aproximadamente a dos fragmentos Fab unidos por enlaces disulfuro, tiene una actividad divalente de union al antigeno y ademas es capaz de entrecruzar antigenos. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en que
25 tienen algunos restos adicionales en el extremo carboxilo del dominio CH1, incluidas una o mas cisteinas de la region bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominacion en este documento de un fragmento Fab' en el que el(los) resto(s) de cisteina de los dominios constantes porta(n) un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como parejas de fragmentos Fab' con cisteinas de bisagra entre ellos. Tambien se conocen otros acoplamientos quimicos de fragmentos de anticuerpos.
30 [0090] El fragmento Fc comprende las porciones del extremo carboxilo de las dos cadenas H, que se mantienen unidas por puentes disulfuro. Las funciones efectoras de los anticuerpos quedan determinadas por secuencias en la region Fc y esta region es tambien la parte reconocida por los receptores de Fc (FcR) que se encuentran en ciertos tipos de celulas.
35 [0091] 'Fvquot; es el minimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y union al antigeno. Este fragmento consta de un dimero de un dominio de la region variable de la cadena pesada y un dominio de la region variable de la cadena ligera en asociacion firme, no covalente. A partir del plegamiento de estos dos dominios se derivan seis bucles hipervariables (tres bucles de cada una de las cadenas H y L) que aportan los
40 restos aminoacidicos para la union al antigeno y confieren al anticuerpo la especificidad de union al antigeno. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR especificas para un antigeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antigeno, aunque con menor afinidad que el sitio de union completo.
45 [0092] Los 'Fv de cadena sencillaquot;, abreviados tambien como 'sFvquot; o 'scFvquot;, son fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL conectados en una sola cadena polipeptidica. Preferentemente, el polipeptido sFv comprende ademas un enlazante polipeptidico entre los dominios VH y VL que permite al sFV formar la estructura deseada para la union al antigeno. Para una revision de los sFv, vease Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pags.
50 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, cita posterior.
[0093] El termino 'diacuerposquot; se refiere a pequenos fragmentos de anticuerpos preparados mediante la construccion de fragmentos sFv (vease el parrafo precedente) con enlazantes de corta longitud (aproximadamente cinco a diez restos) entre los dominios VH y VL, de modo que se consigue el emparejamiento intercatenario, pero no
55 intracatenario de los dominios V, lo que resulta en un fragmento bivalente, es decir, un fragmento con dos sitios de union a un antigeno. Los diacuerpos biespecificos son heterodimeros de dos fragmentos sFv entrecruzados, en los que los dominios VH y VL de los dos anticuerpos estan presentes en distintas cadenas polipeptidicas. Los diacuerpos se describen con mas detalle, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y en Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-644� (1993).
[0094] Las formas 'humanizadasquot; de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de roedores) son anticuerpos quimericos que contienen una secuencia minima derivada del anticuerpo no humano. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que restos de una region 5 hipervariable del receptor se sustituyen por restos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), como raton, rata, conejo o primate no humano, con la deseada especificidad, afinidad y capacidad del anticuerpo. En algunos casos, se sustituyen restos de la region estructural (FR) de la inmunoglobulina humana por los correspondientes restos no humanos. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se llevan a 10 cabo para afinar el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos o al menos uno y tipicamente dos dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado comprendera tambien al menos una porcion de una region constante de una inmunoglobulina (Fc), tipicamente, la de una inmunoglobulina
15 humana. Para mas detalles, vease Jones y col., Nature 321: 522-525 (19� 6); Riechmann y col., Nature 332: 323-329 (19��); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
[0095] Un 'anticuerpo dependiente de la especiequot;, por ejemplo, un anticuerpo de mamifero dirigido contra una IgE humana, es un anticuerpo con una mayor afinidad de union por un antigeno de una primera especie de 20 mamifero que por un homologo de dicho antigeno de una segunda especie de mamifero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de la especie se 'une especificamentequot; a un antigeno humano (es decir, tiene una valor de afinidad de union (Kd) de no mas de aproximadamente 1 x 10-7 M, preferentemente de no mas de aproximadamente 1 x 10-�M y con la mayor preferencia de no mas de 1 x 10-9 M), pero tiene una afinidad de union por un homologo del antigeno de una segunda especie de mamifero no humana que es al menos aproximadamente 50 veces, o al
25 menos aproximadamente 500 veces o al menos aproximadamente 1.000 veces inferior a su afinidad de union por el antigeno humano. El anticuerpo dependiente de la especie puede ser de uno cualquiera de los diversos tipos de anticuerpos segun se definen anteriormente, pero preferentemente es un anticuerpo humanizado o humano.
[0096] Un 'oligopeptido de union a TATquot; es un oligopeptido que se une, preferentemente de manera
30 especifica, a un polipeptido TAT segun se describe en este documento. Los oligopeptidos de union a TAT pueden sintetizarse quimicamente mediante la metodologia de sintesis de oligopeptidos conocida o pueden prepararse y purificarse mediante tecnologia recombinante. Los oligopeptidos de union a TAT tienen normalmente una longitud de al menos aproximadamente cinco aminoacidos, alternativamente una longitud de al menos aproximadamente seis, siete, ocho, nueve, diez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 1 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 2�, 29, 30, 31, 32, 33, 34,
35 35, 36, 37, 3�, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 4�, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 5�, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 6 �, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 7 �, 79, 0, �1, �2, �3, 4, �5, 6, �7, �, �9, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 9 �, 99 o 100 aminoacidos o mas, en que tales oligopeptidos son capaces de unirse, preferentemente de manera especifica, a un polipeptido TAT segun se describe en este documento. Los oligopeptidos de union a TAT pueden identificarse sin excesiva experimentacion mediante tecnicas bien conocidas. A este respecto, se senala que las
40 tecnicas para el cribado de bancos de oligopeptidos para identificar oligopeptidos capaces de unirse de manera especifica a un polipeptido diana son bien conocidas en la tecnica (veanse, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. nos 5.556.762, 5.750.373, 4.70 .�71, 4.�33.092, 5.223.409, 5.403.4�4, 5.571.6� 9, 5.663.143; las publicaciones PCT nos WO �4/03506 y WO 4/03564; Geysen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA �1: 399�-4002 (19� 4); Geysen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2: 17�-1 �2 (19 �5); Geysen y col., en Synthetic Peptides as Antigens 130-149 (19�6);
45 Geysen y col., J. Immunol. Meth. 102: 259-274 (19 �7); Schoofs y col., J. Immunol. 140: 611-616 (19 ��), Cwirla, S. E. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA �7: 637� (1990); Lowman, H. B. y col., Biochemistry 30: 10�32 (1991); Clackson,
T. y col., Nature 352: 624 (1991); Marks, J. D. y col., J. Mol. Biol. 222: 5�1 (1991); Kang, A. S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ��: �363 (1991); y Smith, G. P. Current Opin. Biotechnol. 2: 66� (1991)).
50 [0097] Una 'molecula organica de union a TATquot; es una molecula organica distinta de un oligopeptido o un anticuerpo, segun se definen es este documento, que se une, preferentemente de manera especifica, a un polipeptido TAT segun se describe en este documento. Las moleculas organicas de union a TAT pueden identificarse y sintetizarse quimicamente mediante metodologia conocida (veanse, por ejemplo, las publicaciones PCT nos WO 00/00�23 y WO 00/395�5). Las moleculas organicas de union a TAT tienen normalmente un tamano
55 inferior a aproximadamente 2.000 Da, alternativamente un tamano inferior a aproximadamente 1.500, 750, 500, 250
o 200 Da, en que tales moleculas organicas que son capaces de unirse, preferentemente de manera especifica, a un polipeptido TAT segun se describe en este documento pueden identificarse sin excesiva experimentacion mediante tecnicas bien conocidas. A este respecto, se senala que las tecnicas para el cribado de bancos de moleculas organicas para identificar moleculas capaces de unirse a un polipeptido diana son bien conocidas en la tecnica
(veanse, por ejemplo, las publicaciones PCTnosWO00/00 23 yWO00/395� 5).
[0098] Un anticuerpo, un oligopeptido u otra molecula organica 'que se unenquot; a un antigeno de interes, por ejemplo, una diana antigenica polipeptidica asociada a un tumor, son aquellos que se unen al antigeno con 5 suficiente afinidad, de modo que el anticuerpo, el oligopeptido u otra molecula organica son utiles como agentes de diagnostico y/o terapeuticos para el reconocimiento especifico de una celula o tejido que expresa el antigeno, y no presentan una reaccion cruzada significativa con otras proteinas. En tales realizaciones, el grado de union del anticuerpo, el oligopeptido u otra molecula organica a una proteina 'no dianaquot; sera inferior a aproximadamente el 10 % de la union del anticuerpo, el oligopeptido u otra molecula organica a su proteina diana concreta segun se 10 determina por analisis de clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitacion (RIA). Con respecto a la union de un anticuerpo, un oligopeptido u otra molecula organica a una molecula diana, los terminos 'union especificaquot; o 'se une especificamente aquot; o es 'especifico paraquot; un polipeptido concreto o un epitopo en un polipeptido diana concreto significan una union que es mediblemente diferente de una interaccion inespecifica. La union especifica puede medirse, por ejemplo, mediante la determinacion de la union de una molecula en 15 comparacion con la union de una molecula de control, que generalmente es una molecula de estructura similar que no tiene actividad de union. Por ejemplo, la union especifica puede determinarse por competicion con una molecula de control que es similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana sin marcar. En este caso, se indica que existe una union especifica si la union de la diana marcada con una sonda es inhibida competitivamente por el exceso de diana sin marcar. Los terminos 'union especificaquot; o 'se une especificamente aquot; o 'es especifico paraquot; un polipeptido 20 concreto o un epitopo en un polipeptido diana concreto, segun se usan en este documento, pueden corresponder, por ejemplo, a una molecula con una Kd por la diana de al menos aproximadamente 10-4 M, alternativamente de al menos aproximadamente 10-5 M, alternativamente de al menos aproximadamente 10-6 M, alternativamente de al menos aproximadamente 10-7 M, alternativamente de al menos aproximadamente 10-�M, alternativamente de al menos aproximadamente 10-9 M, alternativamente de al menos aproximadamente 10-10 M, alternativamente de al
25 menos aproximadamente 10-11 M, alternativamente de al menos aproximadamente 10-12 M, o superior. En una realizacion, el termino 'union especificaquot; se refiere a la union en la que una molecula se une a un polipeptido concreto o un epitopo en un polipeptido concreto sin unirse sustancialmente a ningun otro polipeptido o epitopo de un polipeptido.
30 [0099] Un anticuerpo, un oligopeptido u otra molecula organica que 'inhiben el crecimiento de las celulas tumorales que expresan un polipeptido TATquot; o un anticuerpo, un oligopeptido u otra molecula organica 'inhibidores del crecimientoquot; son aquellos que resultan en una inhibicion medible del crecimiento de las celulas cancerosas que expresan o expresan en exceso el polipeptido TAT apropiado. El polipeptido TAT puede ser un polipeptido transmembranal expresado en la superficie de una celula cancerosa o puede ser un polipeptido producido y
35 secretado por una celula cancerosa. Los anticuerpos dirigidos contra TAT, los oligopeptidos o las moleculas organicas inhibidores del crecimiento preferidos inhiben el crecimiento de las celulas tumorales que expresan TAT en mas del 20 %, preferentemente desde aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 50 % e, incluso con mayor preferencia, en mas del 50 % (por ejemplo, desde aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 100 %) en comparacion con el control apropiado, en que el control son tipicamente celulas tumorales no tratadas con el
40 anticuerpo, el oligopeptido u otra molecula organica analizados. En una realizacion, la inhibicion del crecimiento puede medirse para una concentracion del anticuerpo de aproximadamente 0,1 a 30 !g/ml o de aproximadamente 0,5 nM a 200 nM en el cultivo celular, en que la inhibicion del crecimiento se determina de uno a diez dias despues de la exposicion de las celulas tumorales al anticuerpo. La inhibicion del crecimiento de las celulas tumorales in vivo puede determinarse de diversos modos, segun se describe en los ejemplos experimentales a continuacion. El
45 anticuerpo inhibe el crecimiento in vivo si la administracion del anticuerpo dirigido contra TAT en una cantidad de aproximadamente 1 !g/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal resulta en la reduccion del tamano del tumor o la proliferacion de las celulas tumorales en un plazo de cinco dias a tres meses desde la primera administracion del anticuerpo, preferentemente en un plazo de aproximadamente cinco a 30 dias.
50 [0100] Un anticuerpo, un oligopeptido u otra molecula organica que 'inducen apoptosisquot; son aquellos que inducen la muerte celular programada, segun se determina por la union de anexina V, fragmentacion de ADN, disminucion del volumen celular, dilatacion del reticulo endoplasmico, fragmentacion celular y/o formacion de vesiculas de membrana (denominadas cuerpos apoptoticos). La celula es normalmente una celula que expresa un polipeptido TAT en exceso. Preferentemente, la celula es una celula tumoral, por ejemplo, una celula de prostata,
55 mama, ovario, estomago, endometrio, pulmon, rinon, colon o vejiga. Existen diversos procedimientos disponibles para evaluar los eventos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo, la translocacion de fosfatidilserina (PS) puede medirse por la union de anexina; la fragmentacion de ADN puede evaluarse a traves de la observacion de escalas de ADN; y la condensacion nuclear o de cromatina junto con la fragmentacion de ADN pueden evaluarse por cualquier incremento de las celulas hipodiploides. Preferentemente, el anticuerpo, el oligopeptido u otra molecula organica que inducen apoptosis son aquellos que resultan en aproximadamente de dos a 50 veces, preferentemente de aproximadamente cinco a 50 veces y con la maxima preferencia de aproximadamente diez a 50 veces la induccion de union de anexina en relacion a las celulas sin tratar en un ensayo de union de anexina.
5 [0101] Las 'funciones efectorasquot; de un anticuerpo se refieren a aquellas actividades biologicas atribuibles a la region Fc (una region Fc de secuencia nativa o una region Fc de secuencia aminoacidica variante) de un anticuerpo y varian con el isotipo del anticuerpo. Algunos ejemplos de funciones efectoras de un anticuerpo incluyen: union a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento; union al receptor de Fc; citotoxicidad mediada por celulas y dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulacion por disminucion de receptores superficiales celulares
10 (por ejemplo, el receptor de linfocitos B); y activacion de linfocitos B.
[0102] La 'citotoxicidad mediada por celulas y dependiente de anticuerposquot; o 'ADCCquot; se refiere a una forma de citotoxicidad en la que Ig secretadas unidas a receptores Fc (FcR) presentes en ciertas celulas citotoxicas (por ejemplo, linfocitos citoliticos naturales (NK), neutrofilos y macrofagos) permiten a estas celulas efectoras citotoxicas 15 unirse especificamente a una celula diana que contiene un antigeno y destruir subsiguientemente la celula diana con citotoxinas. Los anticuerpos 'armanquot; a las celulas citotoxicas y son absolutamente necesarios para tal destruccion. Las celulas principales para la ADCC, los linfocitos NK, expresan solo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresion de FcR en celulas hematopoyeticas se resume en la tabla 3 en la pagina 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molecula de 20 interes, puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro como el descrito en las patentes de los EE. UU. nos 5.500.362
o 5.�21.337. Las celulas efectoras utiles para tales ensayos incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) y linfocitos citoliticos naturales (NK). Alternativa o adicionalmente, la actividad ADCC de la molecula de interes puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el desvelado en Clynes y col., (USA) 95: 652-656 (19 ��).
25 [0103] El 'receptor de Fcquot; o 'FcRquot; describe un receptor que se une a la region Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Ademas, un FcR preferido es aquel que se une a un anticuerpo IgG (un receptor y) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluidas variantes alelicas y formas de corte y empalme alternativo de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un 'receptor
30 activadorquot;) y FcyRIIB (un 'receptor inhibidorquot;) que tienen secuencias aminoacidicas similares que difieren fundamentalmente en los dominios citoplasmicos de las mismas. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activacion de inmunorreceptores a base de tirosina (ITAM) en su dominio citoplasmico. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibicion de inmunorreceptores a base de tirosina (ITIM) en su dominio citoplasmico (vease una revision en M. Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15: 203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y
35 Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-492 (1991); Capel y col., Immunomethods 4: 25-34 (1994); y de Haas y col., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Otros FcR, incluidos aquellos por identificar en el futuro, quedan abarcados por el termino 'FcRquot; en este documento. El termino tambien incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer y col., J. Immunol. 117: 5�7 (1976) y Kim y col., J. Immunol. 24: 249 (1994)).
40 [0104] Las 'celulas efectoras humanasquot; son leucocitos que expresan uno o mas FcR y llevan a cabo funciones efectoras. Preferentemente, las celulas expresan al menos FcyRIII y realizan la funcion efectora ADCC. Algunos ejemplos de leucocitos humanos con ADCC incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), linfocitos citoliticos naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotoxicos y neutrofilos; en que se prefieren PBMC y linfocitos NK.
45 Las celulas efectoras pueden aislarse de una fuente nativa, por ejemplo, de sangre.
[0105] La 'citotoxicidad dependiente del complementoquot; o 'CDCquot; se refiere a la lisis de una celula diana en presencia del complemento. La activacion de la ruta clasica del complemento se inicia por la union del primer componente del sistema del complemento (C1q) a anticuerpos (de la subclase apropiada) unidos a su antigeno afin.
50 Para evaluar la activacion del complemento, puede llevarse a cabo un ensayo de CDC, por ejemplo, segun se describe en Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
[0106] Los terminos 'cancerquot; y 'cancerosoquot; se refieren o describen el estado fisiologico en mamiferos que se caracteriza tipicamente por un crecimiento celular desregulado. Algunos ejemplos de cancer incluyen, pero no se 55 limitan a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o tumores linfoides. Algunos ejemplos mas concretos de tales canceres incluyen: cancer de celulas escamosas (por ejemplo, cancer de celulas escamosas epiteliales), cancer de pulmon, incluidos el cancer de pulmon microcitico, cancer de pulmon no microcitico, adenocarcinoma pulmonar y carcinoma escamoso de pulmon, cancer de peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrico o de estomago, incluido el cancer gastrointestinal, cancer de pancreas, glioblastoma, cancer cervical, cancer de ovario,
cancer de higado, cancer de vejiga, cancer de las vias urinarias, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer rectal, cancer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glandulas salivales, cancer de rinon o renal, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer de tiroides, carcinoma hepatico, carcinoma anal, carcinoma de pene, melanoma, mieloma multiple y linfoma de linfocitos B, cancer cerebral, asi como de cabeza y
5 cuello y metastasis asociadas.
[0107] Los terminos 'trastorno proliferativo celularquot; y 'trastorno proliferativoquot; se refieren a trastornos asociados con cierto grado de proliferacion celular anormal. En una realizacion, el trastorno proliferativo celular es cancer.
10 [0108] Un 'tumorquot;, segun se usa en este documento, se refiere a todo crecimiento y proliferacion celulares neoplasicos, ya sean malignos o benignos, y a todas las celulas y tejidos precancerosos y cancerosos.
[0109] Un anticuerpo, un oligopeptido u otra molecula organica que 'inducen la muerte celularquot; son aquellos que hacen que una celula viable deje de ser viable. La celula es una celula que expresa un polipeptido TAT, 15 preferentemente una celula que expresa un polipeptido TAT en exceso, en comparacion con una celula normal del mismo tipo de tejido. El polipeptido TAT puede ser un polipeptido transmembranal expresado en la superficie de una celula cancerosa o puede ser un polipeptido producido y secretado por una celula cancerosa. Preferentemente, la celula es una celula cancerosa, por ejemplo, una celula de mama, ovario, estomago, endometrio, glandula salival, pulmon, rinon, colon, tiroides, pancreas o vejiga. La muerte celular in vitro puede determinarse en ausencia del 20 complemento y de celulas efectoras inmunitarias, para distinguir la muerte celular inducida por citotoxicidad mediada por celulas y dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Por lo tanto, el ensayo de muerte celular puede realizarse con suero inactivado por calor (es decir, en ausencia del complemento) y en ausencia de celulas inmunitarias efectoras. Para determinar si el anticuerpo, el oligopeptido u otra molecula organica son capaces de inducir la muerte celular, puede evaluarse la perdida de integridad de la
25 membrana, segun se evalua por la absorcion de yoduro de propidio (PI), azul de tripano (vease, Moore y col., Cytotechnology 17: 1-11 (1995)) o 7AAD, en relacion con celulas no tratadas. Los anticuerpos, oligopeptidos u otras moleculas organicas preferidos son aquellos que inducen la absorcion de PI en el ensayo de absorcion de PI en celulas BT474.
30 [0110] Una 'celula que expresa TATquot; es una celula que expresa un polipeptido TAT endogeno o transfectado en la superficie celular o en una forma secretada. Un 'cancer que expresa TATquot; es un cancer que comprende celulas que tienen un polipeptido TAT presente en la superficie celular o que producen y secretan un polipeptido TAT. Un 'cancer que expresa TATquot; produce opcionalmente suficientes cantidades del polipeptido TAT en la superficie celular del mismo, de modo que un anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido u otra molecula organica pueden unirse
35 a este y tener un efecto terapeutico con respecto al cancer. En otra realizacion, un 'cancer que expresa TATquot; produce y secreta opcionalmente cantidades suficientes del polipeptido TAT, de modo que un anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido u otra molecula organica antagonista pueden unirse a este y tener un efecto terapeutico con respecto al cancer. Con respecto a este ultimo, el antagonista puede ser un oligonucleotido no codificante que reduce, inhibe o impide la produccion y secrecion del polipeptido TAT secretado por las celulas tumorales. Un cancer
40 que 'expresa en excesoquot; un polipeptido TAT es aquel que tiene en la superficie celular del mismo o que produce y secreta cantidades significativamente mayores del polipeptido TAT en comparacion con una celula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Tal expresion en exceso puede estar causada por una amplificacion genica o por un aumento de la transcripcion o la traduccion. El exceso de la expresion del polipeptido TAT puede determinarse en un ensayo de diagnostico o de pronostico mediante evaluacion del aumento de las cantidades de la proteina TAT presente en
45 la superficie de una celula o secretada por la celula (por ejemplo, por medio de un ensayo inmunohistoquimico con anticuerpos dirigidos contra TAT, preparados contra un polipeptido TAT aislado que puede prepararse mediante tecnologia de ADN recombinante a partir de un acido nucleico aislado que codifica el polipeptido TAT; analisis por FACS, etc.). Alternativa o adicionalmente, es posible medir las cantidades del acido nucleico o del ARNm codificantes del polipeptido TAT en la celula, por ejemplo, por medio de hibridacion in situ con fluorescencia, con una
50 sonda basada en un acido nucleico que corresponde a un acido nucleico que codifica TAT o al complemento del mismo; (FISH; vease el documento WO 9 /45479 publicado en octubre de 199�); transferencia de Southern, transferencia de ARN o las tecnicas de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), como PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR). Tambien es posible estudiar la expresion en exceso de TAT mediante la medida del antigeno diseminado en un liquido biologico como el suero, por ejemplo, con ensayos a base de anticuerpos (vease tambien,
55 por ejemplo, la patente de los EE. UU. n'4.933.294, concedida el 12 de junio de 1990; el documento WO 91/05264, publicado el 1� de abril de 1991; la patente de los EE. UU. n'5.401.63�, concedida el 2� de marzo de 1995; y Sias y col., J. Immunol. Methods 132: 73-�0 (1990)). Ademas de los ensayos anteriores, el experto en la tecnica dispone de diversos ensayos in vivo. Por ejemplo, es posible exponer celulas dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo que se ha marcado opcionalmente con un marcador detectable, por ejemplo, un isotopo radiactivo, y la union del anticuerpo a las celulas en el paciente puede evaluarse, por ejemplo, por exploracion externa para detectar la radiactividad o por analisis de una biopsia tomada del paciente previamente expuesto al anticuerpo.
[0111] Segun se usa en este documento, el termino 'inmunoadhesinaquot; designa moleculas similares a
5 anticuerpos que combinan la especificidad de union de una proteina heterologa (una 'adhesinaquot;) con las funciones efectoras de los dominios constantes de las inmunoglobulinas. Desde el punto de vista estructural, las inmunoadhesinas comprenden una fusion entre una secuencia aminoacidica con la especificidad de union deseada, que es distinta de la del sitio de reconocimiento y union al antigeno de un anticuerpo (es decir, 'heterologaquot;) y una secuencia del dominio constante de una inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molecula de
10 inmunoadhesina es tipicamente una secuencia aminoacidica contigua que comprende al menos el sitio de union de un receptor o un ligando. La secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse de cualquier inmunoglobulina, como los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA (incluidas IgA1 e IgA2), IgE, IgD o IgM.
15 [0112] La palabra 'marcadorquot;, cuando se usa en este documento, se refiere a un compuesto o composicion detectables que se conjugan directa o indirectamente con el anticuerpo, el oligopeptido u otra molecula organica para generar un anticuerpo, un oligopeptido u otra molecula organica 'marcadosquot;. El marcador puede ser detectable por si mismo (por ejemplo, marcadores radioisotopicos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimatico, puede catalizar la alteracion quimica de un compuesto o composicion sustratos que son detectables.
20 [0113] El termino 'agente citotoxicoquot;, segun se usa en este documento, se refiere a una sustancia que inhibe o impide la funcion de las celulas y/o causa la destruccion celular. El termino pretende incluir isotopos radiactivos (por ejemplo, 211At, 131I, 125I, 90Y, 1�6Re, 1�� Re, 153Sm, 212Bi, 32P e isotopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapeuticos. por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de vinca (vincristina, vimblastina, etoposido), doxorrubicina,
25 melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de las mismas, como enzimas nucleoliticas, antibioticos y toxinas, como toxinas de moleculas pequenas o toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, incluidos fragmentos y/o variantes de las mismas y los diversos antitumorales o anticancerigenos desvelados a continuacion. Otros agentes citotoxicos se describen a continuacion. Un agente tumoricida causa la destruccion de las celulas tumorales.
30 [0114] Un 'agente inhibidor del crecimientoquot;, cuando se usa en este documento, se refiere a un compuesto o composicion que inhibe el crecimiento de una celula, especialmente de una celula cancerosa que expresa TAT, in vitro o in vivo. Por lo tanto, el agente inhibidor del crecimiento puede ser un agente que reduce significativamente el porcentaje de celulas que expresan TAT en la fase S. Algunos ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento
35 incluyen agentes que bloquean la progresion del ciclo celular (en un momento distinto de la fase S), como agentes que inducen una parada en la fase G1 o una parada en la fase M. Los bloqueantes clasicos de la fase M incluyen las vincas (vincristina y vimblastina), taxanos e inhibidores de topoisomerasa II como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposido y bleomicina. Los agentes que causan una parada en la fase G1 tambien extienden su efecto a una parada en la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN, como tamoxifeno, prednisona,
40 dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Informacion adicional puede encontrarse en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., capitulo 1, titulado quot;Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugsquot; por Murakami y col. (WB Saunders: Filadelfia, EE. UU., 1995), especialmente la pagina 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son farmacos anticancerigenos derivados del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un analogo semisintetico de paclitaxel
45 (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel estimulan el ensamblaje de microtubulos a partir de dimeros de tubulina y estabilizan los microtubulos al impedir la despolimerizacion, lo que resulta en la inhibicion de la mitosis en las celulas.
[0115] La 'doxorrubicinaquot; es un antibiotico antraciclinico. El nombre quimico completo de la doxorrubicina es
50 (�S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxi-a-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7,�,9,10-tetrahidro-6,�,11-trihidroxi-�-(hidroxiacetil)-1metoxi-5,12-naftacenodiona.
[0116] El termino 'citocinaquot; es un termino generico para proteinas producidas por una poblacion de celulas que actuan sobre otras celulas como mediadores intercelulares. Algunos ejemplos de tales citocinas son linfocinas, 55 monocinas y hormonas polipeptidicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen hormonas del crecimiento como la hormona del crecimiento humana, la hormona del crecimiento humana sustituida en N con metionilo y la hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glucoproteicas como la hormona estimulante del foliculo (FSH), la hormona estimulante del tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH); el factor de crecimiento hepatico; el factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactogeno placentario; los factores de necrosis tumoral a y ; la sustancia inhibidora mulleriana; el peptido asociado a la gonadotropina de raton; inhibina; activina; el factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso, como NGF-�; el factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformante (TGF), como TGF-a y TGF-�; el factor de crecimiento insulinico I y II; eritropoyetina (EPO); factores 5 osteoinductores; interferones como interferon a, y y; factores estimulantes de colonias (CSF), como CSF macrofagico (M-CSF), CSF granulocito-macrofagico (GM-CFS) y CFS granulocitico (G-CFS); interleucinas, como IL1,IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-�, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral, como TNF-a o TNF-�; y otros factores polipeptidicos, incluidos LIF y el ligando kit (KL). Segun se usa en este documento, el termino citocina incluye proteinas de fuentes naturales o de cultivos celulares recombinantes y equivalentes biologicamente activos
10 de las citocinas de secuencia nativa.
[0117] El termino 'prospectoquot; se usa para referirse a las instrucciones incluidas normalmente en los envases comerciales de los productos terapeuticos que contienen informacion sobre las indicaciones, uso, dosificacion, administracion, contraindicaciones y/o advertencias relativas al uso de tales productos terapeuticos.
15 Tabla 1
Tabla 2
TAT
XXXXXXXXXXXXXXX (longitud = 15 aminoacidos)
Proteina de comparacion
XXXXXYYYYYYY (longitud = 12 aminoacidos)
5
% de identidad de secuencia aminoacidica = (el numero de restos aminoacidicos que se corresponden identicamente entre las dos secuencias polipeptidicas segun se determina por ALIGN-2) dividido por (el numero total de restos aminoacidicos del polipeptido TAT) = 5 dividido por 15 = 33,3 %
10 Tabla 3
TAT XXXXXXXXXX (longitud = 10 aminoacidos) Proteina de comparacion XXXXXYYYYYYZZYZ (longitud = 15 aminoacidos)
% de identidad de secuencia aminoacidica = (el numero de restos aminoacidicos que se corresponden identicamente entre las dos secuencias polipeptidicas segun se determina por ALIGN-2) dividido por (el numero total 15 de restos aminoacidicos del polipeptido TAT) = 5 dividido por 10 = 50 %
Tabla 4
ADN de TAT NNNNNNNNNNNNNN (longitud = 14 nucleotidos) ADN de comparacion NNNNNNLLLLLLLLLL (longitud = 16 nucleotidos)
20 % de identidad de secuencia de acido nucleico = (el numero de nucleotidos que se corresponden identicamente entre las dos secuencias de acido nucleico segun se determina por ALIGN-2) dividido por (el numero total de nucleotidos de la secuencia de acido nucleico del ADN de TAT) = 6 dividido por 14 = 42,9 %
Tabla 5
25 ADN de TAT NNNNNNNNNNNN (longitud = 12 nucleotidos) ADN de comparacion NNNNLLLVV (longitud = 9 nucleotidos)
% de identidad de secuencia de acido nucleico = (el numero de nucleotidos que se corresponden identicamente entre las dos secuencias de acido nucleico segun se determina por ALIGN-2) dividido por (el numero total de
nucleotidos de la secuencia de acido nucleico del ADN de TAT) = 4 dividido por 12 = 33,3 %
II. Composiciones y procedimientos de la invencion
5 A. Anticuerpos dirigidos contra TAT
[0118] La presente invencion se refiere a anticuerpos dirigidos contra TAT que pueden usarse en este documento como agentes terapeuticos y/o de diagnostico. Los anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecificos y heteroconjugados.
1. Anticuerpos policlonales
[0119] Los anticuerpos policlonales se producen preferentemente en animales por inyecciones multiples subcutaneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antigeno pertinente y un adyuvante. Puede ser util conjugar el antigeno 15 pertinente (especialmente cuando se usan peptidos sinteticos) con una proteina que es inmunogenica en la especie que se inmuniza. Por ejemplo, el antigeno puede conjugarse con hemocianina de lapa californiana (KLH), seroalbumina, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja mediante un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, ester de maleimidobenzoilsulfosuccinimida (conjugacion a traves de restos de cisteina), Nhidroxisuccinimida (a traves de restos de lisina), glutaraldehido, anhidrido succinico, SOCl2 o R1N=C=NR, en que R
20 y R1 son grupos alquilo diferentes.
[0120] Los animales se inmunizan contra el antigeno, conjugados inmunogenicos o derivados por combinacion, por ejemplo, de 100 !g o 5 !g de la proteina o el conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con tres volumenes del adyuvante completo de Freund e inyeccion de la disolucion por via intradermica en puntos 25 multiples. Un mes despues, los animales reciben un refuerzo con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del peptido o el conjugado en el adyuvante completo de Freund por inyeccion subcutanea en puntos multiples. Siete a 14 dias despues, se extrae la sangre de los animales y se analiza el titulo de anticuerpos en el suero. Los animales reciben un refuerzo hasta que el titulo alcanza un nivel constante. Los conjugados tambien pueden prepararse en cultivos de celulas recombinantes como fusiones de proteinas. Tambien se usan adecuadamente agentes agregantes como el
30 alumbre para aumentar la respuesta inmunitaria.
2. Anticuerpos monoclonales
[0121] Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante el procedimiento del hibridoma, descrito
35 primeramente por Kohler y col., Nature 256: 495 (1975) o pueden prepararse por procedimientos de ADN recombinante (patente de los EE. UU. n'4.� 16.567).
[0122] En el procedimiento del hibridoma, un raton u otro animal huesped apropiado, como un hamster, se inmunizan segun se describe anteriormente para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir
40 anticuerpos que se uniran especificamente a la proteina usada para la inmunizacion. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Despues de la inmunizacion, los linfocitos se aislan y despues se fusionan con una linea celular de mieloma mediante un agente de fusion adecuado, como polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pags. 59-103 (Academic Press, 19� 6)).
45 [0123] Las celulas de hibridoma asi preparadas se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado, que contiene preferentemente una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las celulas de mieloma parentales no fusionadas (tambien denominadas parejas de fusion). Por ejemplo, si las celulas de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo selectivo para los hibridomas incluira tipicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que
50 impiden el crecimiento de las celulas deficientes en HGPRT.
[0124] Las celulas de mieloma preferidas como parejas de fusion son aquellas que se fusionan eficientemente, permiten un nivel alto y estable de produccion del anticuerpo por las celulas productoras de anticuerpo seleccionadas y son sensibles a un medio selectivo que selecciona contra las celulas parentales no 55 fusionadas. Las lineas celulares de mieloma preferidas son lineas de mieloma murinas, como las derivadas de los tumores de raton MOPC-21 y MPC-11, disponibles en el Centro de Distribucion Celular del Instituto Salk, San Diego, California, EE. UU. y lineas derivadas, por ejemplo, las celulas X63-Ag�-653, disponibles en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Manassas, Virginia, EE. UU. Tambien se han descrito lineas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de raton/humano para la produccion anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol.
133: 3001 (19 �4); y Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pags. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 19�7)).
[0125] El medio de cultivo en el que crecen las celulas de hibridoma se analiza en cuanto a la produccion de
5 anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno. Preferentemente, la especificidad de union de los anticuerpos monoclonales producidos por celulas de hibridoma se determina por inmunoprecipitacion o por un ensayo de union in vitro, como radioinmunoensayo (RIA) o enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA).
[0126] La afinidad de union del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, por el analisis de 10 Scatchard descrito en Munson y col., Anal. Biochem. 107: 220 (19� 0).
[0127] Una vez identificadas las celulas de hibridoma que producen anticuerpos de la deseada especificidad, afinidad y/o actividad, los clones pueden subclonarse por procedimientos de dilucion limitada y cultivarse por procedimientos estandar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pags. 59-103 (Academic Press,
15 19�6)). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, los medios D-MEM o RPMI-1640. Ademas, las celulas de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores asciticos en un animal, por ejemplo, por inyeccion de las celulas en ratones.
[0128] Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de
20 cultivo, liquido ascitico o suero por procedimientos convencionales de purificacion de anticuerpos como, por ejemplo, cromatografia de afinidad (por ejemplo, con proteina A o proteina G unidas a SEPHAROSE) o cromatografia de intercambio ionico, cromatografia sobre hidroxiapatito, electroforesis en gel, dialisis, etc.
[0129] El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla y secuencia facilmente mediante
25 procedimientos convencionales (por ejemplo, por medio de sondas oligonucleotidicas capaces de unirse especificamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las celulas de hibridoma sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede insertarse en vectores de expresion, que se transfectan en celulas huesped, como celulas de E. coli, celulas COS de simio, celulas de ovario de hamster chino (CHO) o celulas de mieloma que de otra manera no producen la proteina anticuerpo, para obtener
30 la sintesis de anticuerpos monoclonales en las celulas huesped recombinantes. Algunos articulos de revision sobre la expresion recombinante del ADN que codifica el anticuerpo en bacterias incluyen Skerra y col., Curr. Opinion in Immunol. 5: 256-262 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-1�� (1992).
[0130] En otra realizacion, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de
35 bancos de anticuerpos en fagos generados mediante las tecnicas descritas en McCafferty y col., Nature 34 : 552554 (1990). Clackson y col., Nature 352: 624-62� (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol. 222: 5�1-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, mediante bancos de fagos. Otras publicaciones subsiguientes describen la produccion de anticuerpos humanos de gran afinidad (intervalo nM) por intercambio de cadenas (Marks y col., Bio/Technology 10: 779-7 �3 (1992)), asi como la infeccion combinatoria y recombinacion in
40 vivo como estrategia para la construccion de bancos de fagos de gran extension (Waterhouse y col., Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266 (1993)). Por lo tanto, estas tecnicas son alternativas viables a las tecnicas tradicionales de hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.
[0131] El ADN que codifica el anticuerpo puede modificarse para producir anticuerpos polipeptidicos
45 quimericos o de fusion, por ejemplo, por sustitucion de las secuencias de los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas (CH y CL) por las secuencias murinas homologas (patente de los EE. UU. n'4.�16.567; y Morrison y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA �1: 6�51 (19�4)) o por fusion de la secuencia codificante de la inmunoglobulina con toda o parte de la secuencia codificante de un polipeptido no inmunoglobulinico (polipeptido heterologo). Las secuencias del polipeptido no inmunoglobulinico pueden sustituir a los dominios constantes de un
50 anticuerpo o sustituyen a los dominios variables de un sitio de combinacion antigenica de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimerico que comprende un sitio de combinacion antigenica con especificidad por un antigeno y otro sitio de combinacion antigenica con especificidad por un antigeno diferente.
3. Anticuerpos humanos y humanizados
55 [0132] Los anticuerpos dirigidos contra TAT pueden comprender ademas anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quimericas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de union a antigenos) que contienen una secuencia minima derivada
de la inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que restos de una region determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como raton, rata o conejo, de la deseada especificidad, afinidad y capacidad. En algunos casos, se sustituyen restos de la region estructural FR de la 5 inmunoglobulina humana por los correspondientes restos no humanos. Los anticuerpos humanizados pueden comprender tambien restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o estructurales importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos o al menos uno y tipicamente dos dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una
10 secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Optimamente, el anticuerpo humanizado comprendera tambien al menos una porcion de una region constante de una inmunoglobulina (Fc), tipicamente, la de una inmunoglobulina humana (Jones y col., Nature 321: 522-525 (19�6); Riechmann y col., Nature 332: 323-329 (19� �); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
15 [0133] Los procedimientos para la humanizacion de anticuerpos no humanos son bien conocidos en la tecnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o mas restos aminoacidicos introducidos en el mismo de una fuente no humana. Estos restos aminoacidicos no humanos se denominan frecuentemente restos 'importadosquot;, que se toman tipicamente de un dominio variable 'importadoquot;. La humanizacion puede realizarse esencialmente por el metodo de Winter y colaboradores, (Jones y col., Nature 321: 522-525 (19�6); Riechmann y
20 col., Nature 332: 323-327 (19��); Verhoeyen y col., Science 239: 1534-1536 (19� �)) por sustitucion con CDR o secuencias de CDR de roedor las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos 'humanizadosquot; son anticuerpos quimericos (patente de los EE. UU. n' 4.�16.567), en los que sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados son tipicamente anticuerpos humanos en
25 los que algunos restos de las CDR y posiblemente algunos restos de la FR se sustituyen por restos de sitios analogos en anticuerpos de roedores.
[0134] La eleccion de los dominios variables humanos, tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, para uso en la preparacion de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad y la 30 respuesta HAMA (anticuerpos humanos dirigidos contra antigenos de raton) cuando el anticuerpo esta destinado a uso terapeutico en humanos. De acuerdo con el procedimiento denominado del 'mejor ajustequot;, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de raton se examina en relacion con el banco completo de secuencias de dominios variables humanos conocidos. Se identifica la secuencia del dominio V humano mas proxima a la del roedor y la region estructural (FR) humana dentro de la anterior se acepta para el anticuerpo humanizado (Sims y
35 col., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia y col., J. Mol. Biol. 196: 901 (19�7)). Otro procedimiento usa una region estructural concreta, derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo concreto de cadenas ligeras o pesadas. La misma region estructural puede usarse para anticuerpos humanizados diferentes (Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA �9: 42�5 (1992); Presta y col., J. Immunol. 151: 2623 (1993)).
40 [0135] Ademas es importante que los anticuerpos se humanicen reteniendo la alta afinidad de union por el antigeno y otras propiedades biologicas favorables. Para conseguir este objetivo, de acuerdo con un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan por un proceso de analisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales por medio de modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Existen modelos tridimensionales de inmunoglobulinas comunmente disponibles que son conocidos
45 por los expertos en la tecnica. Tambien se dispone de programas informaticos que ilustran y representan probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidatas. La inspeccion de tales representaciones permite el analisis del probable papel de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el analisis de los restos que influyen en la capacidad de la secuencia de inmunoglobulina candidata para unirse a su antigeno. De esta manera, pueden seleccionarse y combinarse los
50 restos de la FR de las secuencias receptora y donante, de modo que se consigan las caracteristicas deseadas del anticuerpo, como una afinidad aumentada por el(los) antigeno(s) diana. En general, los restos de la region hipervariable estan implicados directamente y de la manera mas sustancial en la influencia sobre la union al antigeno.
55 [0136] Se contemplan diversas formas de anticuerpos dirigidos contra TAT humanizados. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, como Fab, opcionalmente conjugado con uno o mas agentes citotoxicos con el fin de generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, como un anticuerpo IgG1 intacto.
[0137] Como alternativa a la humanizacion, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgenicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras su inmunizacion, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de una produccion endogena de inmunoglobulinas. Por ejemplo, se ha descrito que la delecion homocigota del gen de la region de union de la cadena pesada del 5 anticuerpo (JH) en ratones quimericos y mutantes de linea germinal resulta en la inhibicion total de la produccion endogena de anticuerpos. La transferencia de un grupo de genes de inmunoglobulina de linea germinal humana a tales ratones mutantes de linea germinal resultara en la produccion de anticuerpos humanos tras la exposicion al antigeno. Veanse, por ejemplo, Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits y col., Nature 362: 255-25� (1993); Bruggemann y col., Year in Immuno. 7: 33 (1993); las patentes de los EE. UU. nos
10 5.545. �06, 5.569.� 25, 5.591.669 (todas de GenPharm); 5.545.�07; y el documento WO 97/17�52.
[0138] Alternativamente, la tecnologia de exposicion en fagos (McCafferty y col., Nature 34�: 552-553 (1990)) puede usarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro a partir de repertorios de genes de dominios variables (V) de inmunoglobulina de donantes sin inmunizar. De acuerdo con esta tecnica, los 15 genes de dominios V de anticuerpo se clonan en fase de lectura dentro de un gen de una proteina mayor o menor de la cubierta de un bacteriofago filamentoso, como M13 o fd, y se exponen como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la particula fagica. Dado que la particula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenaria del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo tambien resultan en la seleccion del gen que codifica el anticuerpo que muestra estas propiedades. Por lo tanto, el fago 20 mimetiza alguna de las propiedades del linfocito B. La exposicion en fagos puede realizarse en diversos formatos, revisados, por ejemplo, en Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-57 (1993). Para la exposicion en fagos pueden usarse varias fuentes de segmentos de genes V. Clackson y col., Nature
352: 624-62� (1991) aislaron un grupo diverso de anticuerpos dirigidos contra oxazolona a partir de un pequeno banco combinatorio aleatorio de genes V derivados del bazo de ratones inmunizados. Puede construirse un
25 repertorio de genes V a partir de donantes humanos sin inmunizar y es posible aislar anticuerpos dirigidos contra un grupo diverso de antigenos (incluidos autoantigenos), esencialmente segun las tecnicas descritas por Marks y col.,
J. Mol. Biol. 222: 5 1-597 (1991) o Griffith y col., EMBO J. 12: 725-734 (1993). Veanse tambien las patentes de los EE. UU. nos 5.565.332 y 5.573.905.
30 [0139] Segun se discute anteriormente, los anticuerpos humanos tambien pueden ser generados por linfocitos B activados in vitro (veanse las patentes de los EE. UU. nos 5.567.610 y 5.229.275).
4. Fragmentos de anticuerpos
35 [0140] En ciertas circunstancias, existen ventajas en el uso de fragmentos de anticuerpos, mas bien que anticuerpos completos. El menor tamano de los fragmentos permite una rapida eliminacion y puede conducir a un mejor acceso a los tumores solidos.
[0141] Se han desarrollado diversas tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpos.
40 Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban de anticuerpos intactos a traves de una digestion proteolitica (vease, por ejemplo, Morimoto y col., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); y Brennan y col., Science 229: �1 (19�5)). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse ahora directamente por celulas huesped recombinantes. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y scFv pueden expresarse en E. coli y ser secretados por esta bacteria, lo que permite la facil produccion de grandes cantidades de estos fragmentos. Los
45 fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de los bancos de anticuerpos en fagos discutidos anteriormente. Alternativamente, pueden recuperarse fragmentos Fab'-SH directamente de E. coli y acoplarse quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter y col., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acuerdo con otra estrategia, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente de un cultivo de celulas huesped recombinantes. En la patente de los EE. UU no 5.�69.046 se describen fragmentos Fab y F(ab')2 con una semivida in vivo aumentada que
50 comprenden restos epitopicos que se unen a un receptor de salvamento. Otras tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpos seran evidentes para los expertos en la tecnica. En otras realizaciones, el anticuerpo elegido es un fragmento de cadena sencilla (scFv). Veanse el documento WO 93/161� 5; la patente de los EE. UU. n'5.571.�94; y la patente de los EE. UU. n'5.5� 7.45 �. Fv y sFv son las unicas especies con sitios de combinacion intactos que no contienen regiones constantes; por lo tanto, son adecuados para una union inespecifica reducida en
55 el uso in vivo. Pueden construirse proteinas de fusion con sFv para obtener la fusion de una proteina efectora en el extremo amino o en el extremo carboxilo de un sFv. Vease Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, cita anterior. El fragmento de anticuerpo puede ser tambien un 'anticuerpo linealquot;, por ejemplo, segun se describe en la patente de los EE. UUn' 5.641. �70. Tales fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecificoso biespecificos.
5. Anticuerpos biespecificos
[0142] Los anticuerpos biespecificos son anticuerpos con especificidades de union por al menos dos epitopos diferentes. Algunos anticuerpos biespecificos ejemplares pueden unirse a dos epitopos diferentes de una proteina 5 TAT segun se describe en este documento. Otros de estos anticuerpos pueden combinar un sitio de union a TAT con un sitio de union para otra proteina. Alternativamente, puede combinarse un brazo dirigido contra TAT con un brazo que se une a una molecula desencadenante en un linfocito, como una molecula receptora de un linfocito T (por ejemplo, CD3) o receptores de Fc para IgG (FcyR), como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16), para enfocar y dirigir los mecanismos de defensa celular hacia la celula que expresa TAT. Los anticuerpos biespecificos
10 pueden usarse tambien para dirigir agentes citotoxicos a celulas que expresan TAT. Estos anticuerpos tienen un brazo de union a TAT y un brazo que se une al agente citotoxico (por ejemplo, saporina, antiinterferon a, alcaloides de vinca, cadena A de la ricina, metotrexato o un hapteno isotopico radiactivo). Los anticuerpos biespecificos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos F(ab')2).
15 [0143] El documento WO 96/16673 describe un anticuerpo biespecifico dirigido contra ErbB2 y FcyRIII y la patente de los EE. UU. n' 5.�37.234 desvela un anticuerpo biespecifico dirigido contra ErbB2 y FcyRI. En el documento WO 9�/02463 se muestra un anticuerpo biespecifico dirigido contra ErbB2 y Fca. La patente de los EE. UU. n'5.�21.337 expone un anticuerpo biespecifico dirigido contra ErbB2 y CD3.
20 [0144] Los procedimientos para la preparacion de anticuerpos biespecificos son conocidos en la tecnica. La produccion tradicional de anticuerpos biespecificos de longitud completa se basa en la coexpresion de dos parejas de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina, en que las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein y col., Nature 305: 537-539 (19 �3)). Debido a la distribucion aleatoria de las cadenas pesada y ligera de
25 inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen un mezcla potencial de diez moleculas de anticuerpo diferentes, de las que solo una tiene la estructura biespecifica correcta. La purificacion de la molecula correcta, que se lleva a cabo normalmente por etapas de cromatografia de afinidad, es bastante engorrosa y los rendimientos de producto son bajos. En el documento WO 93/0��29 y en Traunecker y col., EMBO J. 10: 3655-3659 (1991) se describen procedimientos similares.
30 [0145] De acuerdo con una estrategia diferente, se fusionan dominios variables de anticuerpos con las especificidades de union deseadas (sitios de combinacion antigenica de los anticuerpos) con secuencias de dominios constantes de inmunoglobulina. Preferentemente, la fusion tiene lugar con un dominio constante de cadena pesada de Ig que comprende al menos parte de la region de bisagra y las regiones CH2 y CH3. Se prefiere que la
35 primera region constante de la cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la union de la cadena ligera, este presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de las cadenas pesadas de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina se insertan en vectores de expresion independientes y se cotransfectan en una celula huesped adecuada. Esto proporciona mayor flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptidicos en realizaciones en las que relaciones desiguales
40 de las tres cadenas polipeptidicas usadas en la construccion proporcionan el maximo rendimiento del anticuerpo biespecifico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes de dos o de las tres cadenas polipeptidicas en un solo vector de expresion, cuando la expresion de al menos dos cadenas polipeptidicas en proporciones iguales resulta en grandes rendimientos o cuando las proporciones no afectan significativamente al rendimiento de la combinacion de cadenas deseada.
45 [0146] En una realizacion preferida de esta estrategia, los anticuerpos biespecificos estan compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina hibrida con una primera especificidad de union en un brazo y una pareja de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina hibrida (que proporciona una segunda especificidad de union) en el otro brazo. Se ha encontrado que esta estructura asimetrica facilita la separacion del compuesto biespecifico
50 deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molecula biespecifica permite una facil separacion. Esta estrategia se desvela en el documento WO 94/04690. Para mas detalles sobre la generacion de anticuerpos biespecificos, vease, por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology 121: 210 (19�6).
55 [0147] Deacuerdo con otra estrategia descrita en la patente de los EE. UU.n'5.731.16�, la interfase entre una pareja de moleculas de anticuerpo puede manipularse para maximizar el porcentaje de heterodimeros que se recuperan del cultivo de celulas recombinante. La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3. En este procedimiento, una o mas pequenas cadenas aminoacidicas laterales de la interfase de la primera molecula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales mayores (por ejemplo, tirosina o triptofano). En la interfase de la segunda molecula de anticuerpo se crean 'cavidadesquot; compensatorias de tamano igual o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) de mayor tamano por sustitucion de dichas cadenas aminoacidicas laterales de mayor tamano por otras mas pequenas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodimero con respecto a productos finales no deseados como homodimeros.
5 [0148] Los anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos entrecruzados o 'heteroconjugadosquot;. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse con avidina y el otro con biotina. Se han propuesto tales anticuerpos, por ejemplo, para el reconocimiento especifico de celulas no deseadas por celulas del sistema inmunitario (patente de los EE. UU.n'4.676.9�0) y para el tratamiento de la infeccion por VIH(documentosWO
10 91/00360, WO 92/200373 y EP 030� 9). Los anticuerpos heteroconjugados pueden prepararse mediante cualquier procedimiento de entrecruzamiento conveniente. Los agentes de entrecruzamiento adecuados son bien conocidos en la tecnica y se desvelan en la patente de los EE. UU. n' 4.676.9�0, junto con una serie de tecnicas de entrecruzamiento.
15 [0149] Las tecnicas para la generacion de anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpos tambien se han descrito en la bibliografia. Por ejemplo, los anticuerpos biespecificos pueden prepararse mediante enlace quimico. Brennan y col., Science 229: �1 (19�5) describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se escinden proteoliticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol, arsenito de sodio, para estabilizar los ditioles proximos e impedir la formacion de
20 disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se transforman entonces en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB se retransforma despues en el Fab'-tiol por reduccion con mercaptoetilamina y se mezcla en una cantidad equimolar con el otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecifico. Los anticuerpos biespecificos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilizacion selectiva de enzimas.
25 [0150] El progreso reciente ha facilitado la recuperacion directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que pueden acoplarse quimicamente para formar anticuerpos biespecificos. Shalaby y col., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) describen la produccion de una molecula de anticuerpo biespecifico F(ab')2 totalmente humanizada. Cada uno de los fragmentos Fab' fue secretado separadamente por E. coli y ambos se sometieron a un acoplamiento quimico directo
30 in vitro para formar el anticuerpo biespecifico. El anticuerpo biespecifico asi formado fue capaz de unirse a celulas que expresaban el receptor ErbB2 en exceso y a linfocitos T humanos normales, asi como de desencadenar la actividad litica de linfocitos citotoxicos humanos contra dianas de tumores de mama humanos.
Se han descrito diversas tecnicas para la preparacion y el aislamiento de fragmentos de anticuerpos biespecificos
35 directamente a partir de cultivos celulares recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecificos mediante cremalleras de leucina. Kostelny y col., J. Immunol. 14�(5): 1547-1553 (1992). Los peptidos con cremalleras de leucina de las proteinas Fos y Jun se enlazaron con las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusion genica. Los homodimeros de anticuerpo se redujeron en la region de bisagra para formar monomeros y despues se reoxidaron para formar heterodimeros de anticuerpo. Este procedimiento puede utilizarse tambien para
40 la produccion de homodimeros de anticuerpo. La tecnologia de 'diacuerposquot; descrita por Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-644� (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para la preparacion de fragmentos de anticuerpos biespecificos. Los fragmentos comprenden un VH conectado con un VL por un enlazante demasiado pequeno para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, se fuerza el emparejamiento de los dominios VH y VL de un fragmento con los dominios complementarios VL y VH de
45 otro fragmento, con lo que se forman dos sitios de union a un antigeno. Se ha descrito otra estrategia para la preparacion de anticuerpos biespecificos mediante el uso de dimeros de Fv de cadena sencilla (sFv). Vease Gruber y col., J. Immunol. 152: 536� (1994).
[0151] Tambien se contemplan anticuerpos con mas de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse 50 anticuerpos triespecificos. Tutt y col., J. Immunol. 147: 60 (1991).
6. Anticuerpos heteroconjugados
[0152] Los anticuerpos heteroconjugados tambien se encuentran dentro del alcance de la presente invencion.
55 Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos unidos covalentemente. Se han propuesto tales anticuerpos, por ejemplo, para el reconocimiento especifico de celulas no deseadas por celulas del sistema inmunitario (patente de los EE. UU.n'4.676.9�0) y para el tratamiento de la infeccion por VIH(documentosWO 91/00360, WO 92/200373, EP 030�9). Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro mediante procedimientos conocidos de quimica de proteinas sinteticas, incluidos aquellos que implican agentes entrecruzantes. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas mediante una reaccion de intercambio de disulfuro o por formacion de un enlace tioeter. Algunos ejemplos de agentes adecuados para este fin incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los desvelados, por ejemplo, en la patente de los EE. UU. n'4.676.9�0.
5 7. Anticuerpos multivalentes
[0153] Un anticuerpo multivalente puede ser internalizado (y/o catabolizado) mas rapidamente que un anticuerpo bivalente por una celula que expresa un antigeno al cual se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invencion pueden ser anticuerpos multivalentes (que son distintos de los de la clase IgM) con tres o mas
10 sitios de union a un antigeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que pueden producirse facilmente por expresion recombinante del acido nucleico que codifica las cadenas polipeptidicas del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerizacion y tres o mas sitios de union a un antigeno. El dominio de dimerizacion preferido comprende (o consta de) una region Fc o una region bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprendera una region Fc y tres o mas sitios de union a un antigeno hacia el extremo amino terminal de la region
15 Fc. El anticuerpo multivalente preferido en este documento comprende (o consta de) tres a aproximadamente ocho, pero preferentemente cuatro sitios de union a un antigeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena polipeptidica (y preferentemente dos cadenas polipeptidicas), en que la(s) cadena(s) polipeptidica(s) comprende(n) dos o mas dominios variables. Por ejemplo, la(s) cadena(s) polipeptidica(s) puede(n) comprender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, en que VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una
20 cadena polipeptidica de una region Fc, X1 y X2 representan un aminoacido o polipeptido y n es 0 o 1. Por ejemplo, la(s) cadena(s) polipeptidica(s) pueden comprender VH-CH1-enlazante flexible-VH-CH1-cadena de la region Fc o VHCH1-VH-CH1-cadena de la region Fc. El anticuerpo multivalente en este documento comprende preferentemente ademas al menos dos (y preferentemente cuatro) polipeptidos de dominios variables de cadena ligera. El anticuerpo multivalente en este documento puede comprender, por ejemplo, de aproximadamente dos a aproximadamente
25 ocho polipeptidos de un dominio variable de cadena ligera. Los polipeptidos de un dominio variable de cadena ligera contemplados en este documento comprenden un dominio variable de cadena ligera y opcionalmente comprenden ademas un dominio CL.
�. Manipulacion de la funcion efectora
30 [0154] Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invencion con respecto a la funcion efectora, por ejemplo, para aumentar la citotoxicidad mediada por celulas y dependiente de antigenos (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede conseguirse por la introduccion de una o mas sustituciones aminoacidicas en una region Fc del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, pueden introducirse uno
35 o mas restos de cisteina en la region Fc, lo que permite la formacion de puentes disulfuro intercatenarios en esta region. El anticuerpo homodimerico asi generado puede tener mejor capacidad de internalizacion y/o mayor citotoxicidad mediada por el complemento y citotoxicidad mediada por celulas y dependiente de anticuerpos (ADCC). Veanse Caron y col., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 14�: 291�-2922 (1992). Tambien pueden prepararse anticuerpos homodimericos con una actividad antitumoral aumentada mediante entrecruzantes
40 heterobifuncionales, segun se describe en Wolff y col., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, puede construirse un anticuerpo que tiene regiones Fc dobles y que, por lo tanto, puede tener mayor capacidad de lisis por el complemento y ADCC. Vease Stevenson y col., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (19�9). Para aumentar la semivida del anticuerpo en suero, es posible incorporar un epitopo de union a un receptor de salvamento en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo), segun se describe en la patente de los
45 EE. UU. n'5.739.277, por ejemplo. Segun se usa en estedocumento, el termino 'epitopode union a unreceptor de salvamentoquot; se refiere a un epitopo de la region Fc de una molecula IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable del aumento de la semivida de la molecula de IgG en suero in vivo.
9. Inmunoconjugados
50 [0155] La invencion se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotoxico como un agente quimioterapeutico, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal o fragmentos de la misma) o un isotopo radiactivo (por ejemplo, un radioconjugado).
55 [0156] Los agentes quimioterapeuticos utiles para la generacion de tales inmunoconjugados han sido descritos anteriormente. Las toxinas enzimaticamente activas o fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos no implicados en la union de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de
la modecina, a-sarcina, proteinas de Aleurites fordii, proteinas diantinas, proteinas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), el inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, el inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Existen diversos radionuclidos disponibles para la produccion de radioconjugados. Algunos ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 1�6Re. Los conjugados del 5 anticuerpo y el agente citotoxico se preparan mediante diversos agentes acopladores de proteinas bifuncionales, como 3-(2-piridilditiol)propionato de N-succinimidilo (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (como adipimidato de dimetilo HCl), esteres activos (como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (como glutaraldehido), compuestos de bis-azido (como bis-(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bisdiazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos
10 bisactivos de fluor (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse segun se describe en Vitetta y col., Science 23 : 109 (19 �7). El acido 1-isotiocianatobencil-3metildietilentriaminopentaacetico (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugacion de un radionuclido con el anticuerpo. Vease el documento WO 94/11026.
15 [0157] En este documento tambien se contemplan conjugados de un anticuerpo con una o mas toxinas de molecula pequena como una caliqueamicina, maitansinoides, un tricoteceno y CC1065 y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina.
Maitansina y maitansinoides
20 [0158] En una realizacion preferida, un anticuerpo dirigido contra TAT (de longitud completa o fragmentos) de la invencion se conjuga con una o mas moleculas de maitansinoides.
[0159] Los maitansinoides son inhibidores mitoticos que actuan por inhibicion de la polimerizacion de la
25 tubulina. La maitansina se aislo primeramente del arbusto africano Maytenus serrata (patente de los EE. UU. n' 3.�96.111). Posteriormente, se descubrio que ciertos microorganismos tambien producen maitansinoides, como maitansinol y esteres de maitansinol C3 (patente de los EE. UU. n'4.151.042). Un maitansinol sintetico y derivados y analogos del mismo se desvelan, por ejemplo, en las patentes de los EE. UU. nos 4.137.230, 4.24 .�70, 4.256.746, 4.260.60�, 4.265.�14, 4.294.757, 4.307.016, 4.30� .26� , 4.30�.269, 4.309.42�, 4.313.946, 4.315.929, 4.317. �21,
30 4.322.34�, 4.331.59� , 4.361.650, 4.364.�66, 4.424.219, 4.450.254, 4.362.663 y 4.371.533, cuyas descripciones se incorporan expresamente por la presente por referencia.
Conjugados de maitansinoides y anticuerpos
35 [0160] En un intento de mejorar su indice terapeutico, la maitansina y los maitansinoides se han conjugado con anticuerpos que se unen especificamente a antigenos de celulas tumorales. Algunos inmunoconjugados que contienen maitansinoides y su uso terapeutico se desvelan, por ejemplo, en las patentes de los EE. UU. nos
5.20�.020 y 5.416.064 y en la patente europea EP 0425235 B1, cuyas descripciones se incorporan expresamente por la presente por referencia. Liu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: �61 -�623 (1996) describen 40 inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide denominado DM 1 enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cancer colorrectal humano. Se encontro que el conjugado era muy citotoxico frente a celulas de cancer de colon cultivadas y mostraba actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo. Chari y col., Cancer Research 52: 127-131 (1992) describen inmunoconjugados en los que se habia conjugado un maitansinoide por medio de un enlazante de disulfuro al anticuerpo murino A7 que se une a un antigeno en lineas 45 celulares de cancer de colon humano o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une al oncogen HER2/neu. La citotoxicidad del conjugado de TA.1 y maitansinoide se analizo in vitro en la linea celular de cancer de mama humana SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antigenos superficiales HER-2 por celula. El farmaco conjugado alcanzo un grado de citotoxicidad similar al del farmaco maitansinoide libre, que pudo aumentarse al aumentar el numero de moleculas de maitansinoide por molecula de anticuerpo. El conjugado de A7 y maitansinoide mostro una
50 baja citotoxicidad sistemica en ratones.
Conjugados de un anticuerpo dirigido contra el polipeptido TAT y maitansinoides (inmunoconjugados)
[0161] Los conjugados de un anticuerpo dirigido contra TAT y maitansinoides se preparan por enlace quimico
55 de un anticuerpo dirigido contra TAT con una molecula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biologica del anticuerpo ni de la molecula de maitansinoide. Se ha demostrado que una media de tres-cuatro moleculas de maitansinoide conjugadas por molecula de anticuerpo es eficaz para aumentar la citotoxicidad en las celulas diana sin afectar negativamente a la funcion o la solubilidad del anticuerpo, aunque se esperaria que una molecula de toxina por anticuerpo aumentaria la citotoxicidad con respecto al uso del anticuerpo solamente. Los maitansinoides son bien conocidos en la tecnica y pueden sintetizarse por tecnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Algunosmaitansinoides adecuados se desvelan, por ejemplo, enla patente de los EE. UU. n'5.20�.020 y en otras patentes y publicaciones que no son de patente a las que se hace referencia anteriormente en este documento. Los maitansinoides preferidos son maitansinol y analogos de maitansinol modificados en el anillo
5 aromatico o en otras posiciones de la molecula de maitansinol, como diversos esteres de maitansinol.
[0162] Se conocen muchos grupos enlazantes en la tecnica para la preparacion de conjugados de anticuerpos y maitansinoides, incluidos, por ejemplo, aquellos desvelados en la patente de los EE. UU. n'5.20�.020 o la patente EP 0425235 B1 y en Chari y col., Cancer Research 52: 127-131 (1992). Los grupos enlazantes incluyen grupos
10 disulfuro, grupos tioeter, grupos acidolabiles, grupos fotolabiles, grupos labiles frente a peptidasa o grupos labiles frente a esterasa, segun se desvelan en las patentes identificadas anteriormente, en que se prefieren los grupos disulfuro y tioeter.
[0163] Los conjugados de anticuerpo y maitansinoide pueden prepararse utilizando diversos agentes de
15 acoplamiento de proteinas bifuncionales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(Nmaleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (como adipimidato de dimetilo HCl), esteres activos (como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (como glutaraldehido), compuestos de bis-azido (como bis-(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos bisactivos
20 de fluor (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Los agentes de acoplamiento preferidos especialmente incluyen 3(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) (Carlsson y col., Biochem J. 173: 723-737 (197 �)) y 4-(2piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro.
[0164] El enlazante puede unirse a la molecula de maitansinoide en diversas posiciones, dependiendo del tipo
25 de enlace. Por ejemplo, puede formarse un enlace ester por reaccion con un grupo hidroxilo por medio de tecnicas de acoplamiento convencionales. La reaccion puede tener lugar en la posicion C-3 con un grupo hidroxilo, la posicion C-14 modificada con hidroximetilo, la posicion C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posicion C20 con un grupo hidroxilo. En una realizacion preferida, el enlace se forma en la posicion C-3 de maitansinol o un analogo de maitansinol.
30 Caliqueamicina
[0165] Otro inmunoconjugado de interes comprende un anticuerpo dirigido contra TAT conjugado con una o mas moleculas de caliqueamicina. La familia de antibioticos de la caliqueamicina es capaz de producir roturas en 35 ADN bicatenario en concentraciones subpicomolares. Para la preparacion de conjugados de la familia de la caliqueamicina, veanse las patentes de los EE. UU. nos 5.712.374, 5.714.5�6, 5.739.116, 5.767.2 �5, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 y 5.�77.296 (todas de American Cyanamid Company). Los analogos estructurales de caliqueamicina que pueden usarse incluyen pero no se limitan a y1I, a2I, a3I, N-acetil- y1I, PSAG y 8I1 (Hinman y col., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993); Lode y col., Cancer Research 5�: 2925-292 (199�) y las patentes de los
40 EE. UU. concedidas a American Cyanamid mencionadas anteriormente). Otro farmaco antitumoral con el que puede conjugarse el anticuerpo es QFA, que es un antifolato. Tanto caliqueamicina como QFA tienen sitios de accion intracelulares y no atraviesan facilmente la membrana plasmatica. por lo tanto, la absorcion celular de estos agentes a traves de una internalizacion mediada por anticuerpos aumenta en gran medida sus efectos citotoxicos.
45 Otros agentes citotoxicos
[0166] Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse con los anticuerpos dirigidos contra TAT incluyen BCNU, estreptozotocina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocida colectivamente como complejo LL-E332 ��, descrita en la patentes de los EE. UU. nos 5.053.394 y 5.770.710, asi como esperamicinas (patente de
50 los EE. UU. n'5. �77.296)
[0167] Las toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos no implicados en la union de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la
55 modecina, a-sarcina, proteinas de Aleurites fordii, proteinas diantinas, proteinas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), el inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, el inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Vease, por ejemplo, el documento WO 93/21232, publicado el 2� de octubre de 1993.
[0168] La presente invencion contempla ademas un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolitica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN-endonucleasa como una desoxirribonucleasa; ADNasa).
5 [0169] Para la destruccion selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un atomo de gran radiactividad. Existen diversos isotopos radiactivos disponibles para la produccion de anticuerpos dirigidos contra TAT radioconjugados. Algunos ejemplos incluyen 211At, 131I, 115I, 90Y, 1�6Re, 1� Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb e isotopos radiactivos de Lu. Cuando el conjugado se usa para diagnostico, puede comprender un atomo radiactivo para estudios escintigraficos, por ejemplo 99mTc o 123I, o un marcador de espin para obtencion de imagenes por
10 resonancia magnetica nuclear (RMN) (tambien conocida como obtencion de imagenes por resonancia magnetica, IRM), como yodo-123, de nuevo, yodo-131, indio-111, fluor-19, carbono-13, nitrogeno-15, oxigeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
[0170] Los radiomarcadores y otros marcadores pueden incorporarse en el conjugado de maneras conocidas.
15 Por ejemplo, el peptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse por sintesis quimica de aminoacidos mediante precursores de aminoacidos adecuados que incluyen, por ejemplo, fluor-19 en lugar de hidrogeno. Los marcadores como m99Tc o 123I, 1� 6Re, 1�� Re e 111In pueden incorporarse al peptido por medio de un resto de cisteina. El itrio-90 puede incorporarse por medio de un resto de lisina. El procedimiento de IODOGEN (Fraker y col. Biochem. Biophys. Res. Commun. �0: 49-57 (197�)) puede usarse para incorporar yodo-123. En 'Monoclonal Antibodies in
20 Immunoscintigraphyquot; (Chatal, CRC Press 1 �99) se describen otros procedimientos en detalle.
[0171] Los conjugados del anticuerpo y el agente citotoxico pueden prepararse por medio de diversos agentes de acoplamiento de proteinas bifuncionales, como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(Nmaleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres 25 (como adipimidato de dimetilo HCl), esteres activos (como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (como glutaraldehido), compuestos de bis-azido (como bis-(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos bisactivos de fluor (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse segun se describe en Vitetta y col., Science 23�: 109� (19�7). El acido 1-isotiocianatobencil-330 metildietilentriaminopentaacetico (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante ejemplar para la conjugacion de un radionuclido con el anticuerpo. Vease el documento WO 94/11026. El enlazante puede ser un 'enlazante escindiblequot; que facilita la liberacion del farmaco citotoxico en la celula. Por ejemplo, puede usarse un enlazante acidolabil, un enlazante sensible a peptidasa, un enlazante fotolabil, un enlazante dimetilico o un enlazante que contiene disulfuro (Chari y col., Cancer Research 52: 127-131 (1992); patente de los EE. UU. n'
35 5.20�.020).
[0172] Alternativamente, puede prepararse una proteina de fusion que comprenda el anticuerpo dirigido contra TAT y un agente citotoxico, por ejemplo, por tecnicas recombinantes o sintesis peptidica. La longitud del ADN puede comprender las regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado, bien adyacentes entre si o
40 separadas por una region que codifica un peptido enlazante que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.
[0173] El anticuerpo puede conjugarse con un 'receptorquot; (como estreptavidina) para su utilizacion en un reconocimiento selectivo previo del tumor, en que el conjugado de anticuerpo y receptor se administra al paciente,
45 seguido de la eliminacion de la circulacion del conjugado no unido mediante un agente de eliminacion y la administracion posterior de un 'ligandoquot; (por ejemplo, avidina) conjugado con un agente citotoxico (por ejemplo un radionuclido).
10. Inmunoliposomas
50 [0174] Los anticuerpos dirigidos contra TAT desvelados en este documento pueden formularse tambien como inmunoliposomas. Un 'liposomaquot; es una pequena vesicula compuesta de diversos tipos de lipidos, fosfolipidos y/o tensioactivos que es util para la administracion de un farmaco a un mamifero. Los componentes del liposoma estan normalmente dispuestos en una formacion bicapa, similar a la disposicion de los lipidos de las membranas
55 biologicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por procedimientos conocidos en la tecnica, como los descritos en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA �2: 36�� (19�5); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030 (19� 0); las patentes de los EE. UU. nos 4.4�5.045 y 4.544.545; y el documento WO 97/3� 731, publicado el 23 de octubre de 1997. En la patente de los EE. UU. n'5.013.556 se desvelan liposomas con mayor tiempo de circulacion.
[0175] Unos liposomas especialmente utiles pueden generarse por el procedimiento de evaporacion en fase inversa, con una composicion de lipidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a traves de filtros de un tamano de poro definido para
5 producir liposomas con el tamano deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invencion pueden conjugarse con los liposomas segun se describe en Martin y col., J. Biol. Chem. 257: 2 6-2�� (19�2) mediante una reaccion de intercambio de sulfuro. Opcionalmente, el liposoma contiene en su interior un agente quimioterapeutico. Vease Gabizon y col., J. National Cancer Inst. �1(19): 14� 4 (19�9).
10 B. Oligopeptidos de union a TAT
[0176] Los oligopeptidos de union a TAT son oligopeptidos que se unen, preferentemente de manera especifica, a un polipeptido TAT segun se describe en este documento. Los oligopeptidos de union a TAT pueden sintetizarse quimicamente mediante la metodologia de sintesis de oligopeptidos conocida o pueden prepararse y 15 purificarse mediante tecnologia recombinante. Los oligopeptidos de union a TAT tienen normalmente una longitud de al menos aproximadamente cinco aminoacidos, alternativamente una longitud de al menos aproximadamente seis, siete, ocho, nueve, diez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 1 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 2�, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 3�, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 4�, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 5�, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 6 �, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 7 �, 79, 0, �1, �2, �3, 4, �5, 6, �7, �, �9, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 20 97, 9 �, 99 o 100 aminoacidos o mas, en que tales oligopeptidos son capaces de unirse, preferentemente de manera especifica, a un polipeptido TAT segun se describe en este documento. Los oligopeptidos de union a TAT pueden identificarse sin excesiva experimentacion mediante tecnicas bien conocidas. A este respecto, se senala que las tecnicas para el cribado de bancos de oligopeptidos para identificar oligopeptidos capaces de unirse de manera especifica a un polipeptido diana son bien conocidas en la tecnica (veanse, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. 25 nos 5.556.762, 5.750.373, 4.70 �.�71,4.�33.092, 5.223.409, 5.403.4 �4, 5.571.6� 9 y 5.663.143; las publicaciones PCT nos WO �4/03506 y WO 4/03564; Geysen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA �1: 399�-4002 (19� 4); Geysen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2: 17�-1 �2 (19 �5); Geysen y col., en Synthetic Peptides as Antigens 130-149 (19�6); Geysen y col., J. Immunol. Meth. 102: 259-274 (19 �7); Schoofs y col., J. Immunol. 140: 611-616 (19 ��), Cwirla, S. E. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA �7: 637� (1990); Lowman, H. B. y col., Biochemistry 30: 10�32 (1991); Clackson,
30 T. y col., Nature 352: 624 (1991); Marks, J. D. y col., J. Mol. Biol. 222: 5�1 (1991); Kang, A. S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ��: �363 (1991); y Smith, G. P. Current Opin. Biotechnol. 2: 66� (1991)).
[0177] A este respecto, la exposicion en bacteriofagos (fagos) es una tecnica bien conocida que permite el cribado de extensos bancos de oligopeptidos para identificar uno o mas miembros de dichos bancos capaces de 35 unirse especificamente a un polipeptido diana. La exposicion en fagos es una tecnica en la que polipeptidos variantes se exponen como proteinas de fusion con la proteina de la cubierta en la superficie de particulas de bacteriofagos (Scott, J. K. y Smith, G. P. Science 249: 3�6 (1990)). La utilidad de la exposicion en fagos radica en el hecho de que es posible clasificar rapida y eficientemente extensos bancos de variantes proteinicas selectivamente aleatorizadas (o ADNc clonados aleatoriamente) para identificar aquellas secuencias que se unen a una molecula 40 diana con gran afinidad. La exposicion de bancos de peptidos (Cwirla, S. E. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA �7: 637� (1990)) o proteinas (Lowman, H. B. y col., Biochemistry 30: 10�32 (1991); Clackson, T. y col., Nature 352: 624 (1991); Marks, J. D. y col., J. Mol. Biol. 222: 5� 1 (1991); Kang, A. S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ��: 363 (1991)) en fagos ha sido usada para el cribado de millones de polipeptidos y oligopeptidos para identificar aquellos con propiedades de union especificas (Smith, G. P. Current Opin. Biotechnol. 2: 66� (1991)). La clasificacion de 45 bancos de fagos de mutantes aleatorios requiere una estrategia para la construccion y propagacion de un gran numero de variantes, un procedimiento para la purificacion por afinidad mediante el receptor diana y un modo de evaluar los resultados de los enriquecimientos de union. Patentes de los EE. UU. nos 5.223.409, 5.403.4 �4,
5.571.6�9 y 5.663.143.
50 [0178] Aunque la mayoria de los procedimientos de exposicion en fagos han usado fagos filamentosos, tambien se conocen sistemas de exposicion en fagos de tipo A (documentos WO 95/346�3; US 5.627.024), sistemas de exposicion en el fago T4 (Ren, Z-J. y col., Gene 215: 439 (199�); Zhu, Z., CAN 33: 534 (1997); Jiang, J. y col., can 12� : 443�0 (1997); Ren, Z-J. y col., (1997) CAN 127: 215644; Ren, Z-J., Protein Sci. 5: 1 33 (1996); Efimov, V.
P. y col., Virus Genes 10: 173 (1995)) y sistemas de exposicion en el fago T7 (Smith, G. P. y Scott, J. K., Methods in 55 Enzymology 217: 22 -257 (1993); documento US 5.766.905)
[0179] En la actualidad se han desarrollado muchas otras mejoras y variaciones del concepto basico de la exposicion en fagos. Estas mejoras aumentan la capacidad de los sistemas de exposicion para el cribado de bancos de peptidos en cuanto a la union a moleculas diana seleccionadas y la exposicion de proteinas funcionales con el
potencial de cribar estas proteinas para identificar propiedades deseadas. Se han desarrollado dispositivos de reaccion combinatorios para reacciones de exposicion en fagos (documento WO 9 �/14277) y se han usado bancos de exposicion en fagos para analizar y controlar interacciones bimoleculares (documentos WO 9 /20169; WO 9�/20159) y propiedades de peptidos helicoidales restringidos (documento WO 9�/20036). El documento WO 5 97/35196 describe un procedimiento para el aislamiento de un ligando de afinidad en el que un banco de exposicion en fagos se pone en contacto con una disolucion en la que el ligando se une a una molecula diana y con una segunda disolucion en la que el ligando de afinidad no se une a la molecula diana para aislar selectivamente ligandos de union. El documento WO 97/46251 describe un procedimiento para seleccionar por afinidad (biopanning) un banco aleatorio de exposicion en fagos con un anticuerpo purificado por afinidad y despues aislar el fago unido, 10 seguido de un procedimiento de biopanning miniaturizado (micropanning) en pocillos de microplaca para aislar fagos de union con gran afinidad. Tambien se ha descrito el uso de la proteina A de Staphylococcus aureus como etiqueta de afinidad (Li y col., Mol. Biotech. 9: 1 �7 (199�)). El documento WO 97/47314 describe el uso de bancos de sustraccion de sustrato para distinguir especificidades enzimaticas con el uso de un banco combinatorio que puede ser un banco de exposicion en fagos. Un procedimiento de seleccion de enzimas adecuadas para uso en
15 detergentes mediante exposicion en fagos se describe en el documento WO 97/09446. Otros procedimientos adicionalesde seleccion de proteinas de union especifica sedescriben en las patentesde los EE. UU. nos 5.49�.53 y5.432.01� yel documentoWO 9�/15� 33.
[0180] Los procedimientos para la generacion de bancos de peptidos y el cribado de tales bancos se desvelan
20 tambien en las patentes de los EE. UU. nos 5.723.2 �6, 5.432.01�, 5.5 �0.717, 5.427.90�, 5.49� .530, 5.770.434, 5.734.01�, 5.69�.426, 5.763.192 y 5.723.323.
C. Moleculas organicas de union a TAT
25 [0181] Las moleculas organicas de union a TAT son moleculas organicas distintas de los oligopeptidos o anticuerpos segun se definen en este documento que se unen, preferentemente de manera especifica, a un polipeptido TAT segun se describe en este documento. Las moleculas organicas de union a TAT pueden identificarse y sintetizarse quimicamente mediante metodologia conocida (veanse, por ejemplo, las publicaciones PCT nos WO 00/00�23 y WO 00/395�5). Las moleculas organicas de union a TAT tienen normalmente un tamano
30 inferior a aproximadamente 2.000 Da, alternativamente un tamano inferior a aproximadamente 1.500, 750, 500, 250
o 200 Da, en que tales moleculas organicas que son capaces de unirse, preferentemente de manera especifica, a un polipeptido TAT segun se describe en este documento pueden identificarse sin excesiva experimentacion mediante tecnicas bien conocidas. A este respecto, se senala que las tecnicas para el cribado de bancos de moleculas organicas para identificar moleculas capaces de unirse a un polipeptido diana son bien conocidas en la tecnica 35 (veanse, por ejemplo, las publicaciones PCT nos WO 00/00� 23 y WO 00/395 �5). Las moleculas organicas de union a TAT pueden ser, por ejemplo, aldehidos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, amines terciarias, hydrazinas N-sustituidas, hydrazidas, alcoholes, eteres, tioles, tioeteres, disulfuros, acidos carboxilicos, esteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acetales, tioacetales, haluros de arilo, sulfonatos de arilo, haluros de alquilo, sulfonatos de alquilo, compuestos
40 aromaticos, compuestos heterociclicos, anilinas, alquenos, alquinos, dioles, aminoalcoholes, oxazolidinas, oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epoxidos, aziridinas, isocianatos, cloruros de sulfonilo, compuestos diazoicos, cloruros acidos o similares.
D. Identificacion de anticuerpos dirigidos contra TAT, oligopeptidos de union a TAT y moleculas organicas de union a 45 TAT con las propiedades deseadas
[0182] Las tecnicas para la generacion de anticuerpos, oligopeptidos y moleculas organicas que se unen a polipeptidos TAT han sido descritas anteriormente. Es posible ademas seleccionar anticuerpos, oligopeptidos u otras moleculas organicas con ciertas caracteristicas biologicas, segun se desee.
50 [0183] Los efectos de inhibicion del crecimiento de un anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido u otra molecula organica pueden evaluarse por procedimientos conocidos en la tecnica, por ejemplo, mediante celulas que expresan un polipeptido TAT endogenamente o despues de su transfeccion con el gen de TAT. Por ejemplo, las lineas de celulas tumorales apropiadas y las celulas transfectadas con TAT pueden tratarse con un anticuerpo
55 monoclonal dirigido contra TAT, un oligopeptido u otra molecula organica de la invencion a diversas concentraciones durante algunos dias (por ejemplo, dos a siete dias) y tenirse con violeta cristal o MTT o analizarse por cualquier otro ensayo colorimetrico. Otro procedimiento para medir la proliferacion seria la comparacion de la absorcion de 3Htimidina por las celulas tratadas en presencia o ausencia de un anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido de union a TAT o una molecula organica de union a TAT de la invencion. Despues del tratamiento, las celulas se
recogen y se cuantifica la cantidad de radiactividad incorporada en el ADN en un contador de centelleo. Los controles positivos apropiados incluyen el tratamiento de una linea celular seleccionada con un anticuerpo inhibidor del crecimiento del que se sabe que inhibe el crecimiento de dicha linea celular. La inhibicion del crecimiento de celulas tumorales in vivo puede determinarse de diversos modos conocidos en la tecnica. Preferentemente, la celula 5 tumoral es aquella que expresa un polipeptido TAT en exceso. Preferentemente, el anticuerpo dirigido contra TAT, el oligopeptido de union a TAT o la molecula organica de union a TAT inhibiran la proliferacion celular de una celula tumoral que expresa TAT in vitro o in vivo en aproximadamente el 25-100 %, en comparacion con la celula tumoral no tratada, con mayor preferencia en aproximadamente el 30-100 % y incluso con mayor preferencia en aproximadamente el 50-100 % o el 70-100 %, en una realizacion, para una concentracion de anticuerpo de 10 aproximadamente 0,5 a 30 !g/ml. La inhibicion del crecimiento puede medirse para una concentracion de anticuerpo de aproximadamente 0,5 a 30 !g/ml o de aproximadamente 0,5 nM a 200 nM en un cultivo celular, en que la inhibicion del crecimiento se determina uno a diez dias despues de la exposicion de las celulas tumorales al anticuerpo. El anticuerpo inhibe el crecimiento in vivo si la administracion del anticuerpo dirigido contra TAT en una concentracion de aproximadamente 1 !g/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso vivo resulta en una reduccion
15 del tamano del tumor u una reduccion de la proliferacion de las celulas tumorales en un plazo de cinco dias a tres meses desde la primera administracion del anticuerpo, preferentemente de aproximadamente cinco a 30 dias.
[0184] Para seleccionar un anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido de union a TAT o una molecula organica de union a TAT que inducen la muerte celular, puede evaluarse la perdida de integridad de la membrana, 20 segun se indica por la absorcion, por ejemplo, de yoduro de propidio (PI), azul de tripano o 7AAD, en relacion con un control. Un ensayo de absorcion de PI puede realizarse en ausencia del complemento y de celulas efectoras inmunitarias. Las celulas tumorales que expresan el polipeptido TAT se incuban con medio solamente o con medio que contiene el anticuerpo dirigido contra TAT apropiado (por ejemplo, a aproximadamente 10 !g/ml), el oligopeptido de union a TAT o la molecula organica de union a TAT. Las celulas se incuban por un periodo de tres dias. Despues 25 de cada tratamiento, las celulas se lavan y se distribuyen en alicuotas en tubos de 12 x 75 con tapon colador de 35 mm (1 ml por tubo, tres tubos por grupo de tratamiento) para la separacion de las agrupaciones de celulas. Los tubos reciben entonces PI (10 !g/ml). Las muestras pueden analizarse mediante un citometro de flujo FACSCAN® y un programa FACSCONVERT® CellQuest (Becto Dickinson). Aquellos anticuerpos dirigidos contra TAT, oligopeptidos de union a TAT o moleculas organicas de union a TAT que inducen niveles estadisticamente
30 significativos de muerte celular, segun se determina por la absorcion de PI, pueden seleccionarse como anticuerpos dirigidos contra TAT, oligopeptidos de union a TAT o moleculas organicas de union a TAT que inducen la muerte celular.
[0185] Para identificar anticuerpos, oligopeptidos u otras moleculas organicas que se unen a un epitopo en un
35 polipeptido TAT unido a un anticuerpo de interes, puede usarse un ensayo de bloqueo cruzado rutinario como el que se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (19 ��). Este ensayo puede usarse para determinar si un anticuerpo, un oligopeptido u otra molecula organica de prueba se unen al mismo sitio o epitopo que un anticuerpo dirigido contra TAT conocido. Alternativa o adicionalmente, puede realizarse un mapeo de epitopos por procedimientos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la secuencia del
40 anticuerpo puede mutagenizarse, como por barrido con alanina, para identificar restos de contacto. El anticuerpo mutante se examina inicialmente con respecto a la union con un anticuerpo policlonal para asegurar un plegamiento correcto. En un procedimiento diferente, algunos peptidos correspondientes a diferentes regiones de un polipeptido TAT pueden usarse en ensayos de competicion con los anticuerpos de prueba o con un anticuerpo de prueba y un anticuerpo con un epitopo caracterizado o conocido.
E. Tratamiento con profarmacos mediado por enzimas y dependiente de anticuerpos (ADEPT)
[0186] Los anticuerpos pueden usarse tambien en ADEPT mediante conjugacion del anticuerpo con una enzima activadora de un profarmaco que transforma un profarmaco (por ejemplo, un agente quimioterapeutico de
50 peptidilo, vease el documento WO �1/01145) en un farmaco anticancerigeno activo. Veanse, por ejemplo, el documento WO /0737� ylapatente de los EE. UUn'4.975.27�.
[0187] El componente enzimatico del inmunoconjugado util para ADEPT incluye una enzima capaz de actuar sobre un profarmaco de manera que lo transforme en su forma mas activa, citotoxica.
55 [0188] La enzimas utiles en el procedimiento incluyen, pero no se limitan a fosfatasa alcalina, util para transformar profarmacos que contienen fosfato en farmacos libres; aril-sulfatasa, util para transformar profarmacos que contienen sulfato en farmacos libres; citosina-desaminasa, util para transformar la 5-fluorocitosina no toxica en el farmaco anticancerigeno 5-fluorouracilo; proteasas, como la proteasa de Serratia, termolisina, subtilisina,
carboxipeptidasas y catepsinas (como las catepsinas B y L), que son utiles para transformar profarmacos que contienen peptidos en farmacos libres; D-alanil-carboxipeptidasas, utiles para transformar profarmacos que contienen sustituyentes de aminoacidos D; enzimas de escision de carbohidratos como -galactosidasa y neuramidasa, utiles para transformar profarmacos glucosilados en farmacos libres; -lactamasa, util para convertir 5 farmacos derivatizados con �-lactamas en farmacos libres; y penicilina-amidasas, como penicilina-V-amidasa o penicilina-G-amidasa, utiles para transformar farmacos derivatizados en sus nitrogenos aminos con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en farmacos libres. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos con actividad enzimatica, tambien conocidos en la tecnica como 'abzimasquot;, para transformar los profarmacos de la invencion en farmacos activos libres (vease, por ejemplo, Massey, Nature 32� : 457-45� (19�7)). Es posible preparar
10 conjugados de anticuerpo y abzima segun se describe en este documento para la administracion de la abzima a una poblacion de celulas tumorales.
[0189] Las enzimas pueden unirse covalentemente a los anticuerpos dirigidos contra TAT por tecnicas bien conocidas en la tecnica como el uso de agentes entrecruzantes heterobifuncionales discutido anteriormente.
15 Alternativamente, pueden construirse proteinas de fusion que comprenden al menos la region de union al antigeno de un anticuerpo de la invencion enlazada con al menos una porcion funcionalmente activa de una enzima de la invencion mediante tecnicas de ADN recombinante bien conocidas en la tecnica (vease, por ejemplo Neuberger y col., Nature 312: 604-60 (19 4)).
20 F. Polipeptidos TAT de longitud completa
[0190] La presente invencion se refiere a secuencias nucleotidicas nuevamente identificadas y aisladas que codifican polipeptidos denominados polipeptidos TAT en la presente invencion. En particular, se han identificado y aislado ADNc (de longitud parcial y completa) que codifican diversos polipeptidos TAT, segun se desvela mas
25 detalladamente en los ejemplos a continuacion.
[0191] Segun se desvela en los ejemplos a continuacion, se han depositado diversos clones de ADNc en la coleccion ATCC. Las secuencias nucleotidicas exactas de estos clones pueden ser determinadas facilmente por el experto en la tecnica por secuenciacion de los clones depositados mediante procedimientos rutinarios en la tecnica.
30 La secuencia aminoacidica prevista puede determinarse a partir de la secuencia nucleotidica mediante tecnicas rutinarias. Para los polipeptidos TAT y los acidos nucleicos codificantes descritos en este documento, en algunos casos, los solicitantes han identificado lo que se cree que es el marco de lectura mejor identificable con la informacion de secuencia disponible en el momento.
35 G. Variantes de anticuerpos dirigidos contra TAT y de polipeptidos TAT
[0192] Ademas de los anticuerpos dirigidos contra TAT y los polipeptidos TAT de secuencia nativa de longitud completa descritos en este documento, se contempla que pueden prepararse variantes de anticuerpos dirigidos contra TAT y de polipeptidos TAT. Las variantes de anticuerpos dirigidos contra TAT y de polipeptidos TAT pueden
40 prepararse por introduccion de los cambios nucleotidicos apropiados en el ADN codificante y/o por sintesis del anticuerpo o el polipeptido deseados. Los expertos en la tecnica apreciaran que los cambios de aminoacidos pueden alterar procesos postraduccionales del anticuerpo dirigido contra TAT o del polipeptido TAT, como el cambio del numero o la posicion de los sitios de glucosilacion o la alteracion de las caracteristicas de anclaje a la membrana.
45 [0193] Las variaciones en los anticuerpos dirigidos contra TAT y los polipeptidos TAT descritos en este documento pueden realizarse, por ejemplo, mediante cualquiera de las tecnicas e instrucciones para mutaciones conservadoras y no conservadoras expuestas, por ejemplo, en la patente de los EE. UU. n' 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitucion, una delecion o una insercion de uno o mas codones que codifican el anticuerpo o el polipeptido que resultan en un cambio en la secuencia aminoacidica en comparacion con el
50 anticuerpo o el polipeptido de secuencia nativa. Opcionalmente, la variacion es por sustitucion de al menos un aminoacido por otro aminoacido en uno o mas de los dominios del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT. Una orientacion para determinar que resto aminoacidico puede insertarse, sustituirse o delecionarse sin un efecto adverso sobre la actividad deseada puede encontrarse por comparacion de la secuencia del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT con la de moleculas de proteinas conocidas homologas y minimizacion del
55 numero de cambios en la secuencia aminoacidica en regiones de gran homologia. Las sustituciones de aminoacidos pueden ser el resultado de reemplazar un aminoacido por otro aminoacido con propiedades estructurales y/o quimicas similares, como la sustitucion de una leucina por una serina, es decir sustituciones de aminoacidos conservadoras. Las inserciones o deleciones pueden ser opcionalmente del orden de uno a cinco aminoacidos. La variacion permitida puede determinarse haciendo sistematicamente inserciones, deleciones y sustituciones de
aminoacidos en la secuencia y analizando las variantes resultantes en relacion con la actividad mostrada por la secuencia nativa de longitud completa o madura.
[0194] En este documento se proporcionan fragmentos de un anticuerpo dirigido contra TAT y de un
5 polipeptido TAT. Tales fragmentos pueden estar truncados en el extremo N o en el extremo C o pueden faltar restos internos, por ejemplo, en comparacion con un anticuerpo o proteina nativos de longitud completa. En ciertos fragmentos faltan restos aminoacidicos que no son esenciales para una actividad biologica deseada del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT.
10 [0195] Los fragmentos de un anticuerpo dirigido contra TAT y de un polipeptido TAT pueden prepararse por cualquiera de una serie de tecnicas convencionales. Los fragmentos peptidicos deseados pueden sintetizarse quimicamente. Una estrategia alternativa implica la generacion de fragmentos del anticuerpo o el polipeptido por digestion enzimatica, por ejemplo, por tratamiento de la proteina con una enzima de la que se sabe que escinde proteinas en puntos definidos por restos aminoacidicos concretos o por digestion del ADN con enzimas de
15 restriccion adecuadas y aislamiento del fragmento deseado. Otra tecnica adecuada mas implica el aislamiento y la amplificacion de un fragmento de ADN que codifica un fragmento deseado del anticuerpo o el polipeptido mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Como cebadores 5' y 3' de la PCR se emplean oligonucleotidos que definen los extremos deseados de los fragmentos de ADN. Preferentemente, los fragmentos del anticuerpo dirigido contra TAT y el polipeptido TAT tienen al menos una actividad biologica y/o inmunologica en comun con el
20 anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT nativos desvelados en este documento.
[0196] En realizaciones concretas, las sustituciones conservadoras de interes se muestran en la tabla 6 bajo
el encabezamiento de sustituciones preferidas. Si tales sustituciones resultan en un cambio en la actividad biologica,
se introducen otros cambios mas sustanciales, denominados sustituciones ejemplares en la tabla 6 o segun se
25 describen mas detalladamente a continuacion en referencia a las clases de aminoacidos, y los productos se
analizan.
Tabla 6
Resto original
Sustituciones ejemplares Sustituciones preferidas
Ala (A)
val; leu; ile val
Arg (R)
lys; gln; asn lys
Asn (N)
gln; his; lys; arg gln
Asp (D)
glu glu
Cys (C)
ser ser
Gln (Q)
asn asn
Glu (E)
asp asp
Gly (G)
pro; ala ala
His (H)
asn; gln; lys; arg arg
Ile (I)
leu; val; met; ala; phe; norleucina leu
Leu (L)
norleucina; ile; val; met; ala; phe ile
Lys (K)
arg; gln; asn arg
Met (M)
leu; phe; ile leu
Phe (F)
leu; val; ile; ala; tyr leu
Pro (P)
ala ala
Ser (S)
thr thr
Thr (T)
ser ser
Trp (W)
tyr; phe tyr
Tyr (Y)
trp; phe; thr; ser phe
Val (V)
ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu
[0197] Las modificaciones sustanciales en la funcion o en la identidad inmunologica del anticuerpo dirigido
contra TAT o el polipeptido TAT se consiguen seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su
efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptidico en el area de la sustitucion, por
ejemplo, como conformacion de hoja o helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molecula en el sitio diana o (c) 35 el volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos basados en las propiedades
comunes de las cadenas laterales:
(1)
hidrofobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2)
hidrofilos neutros; cys, ser, thr;
(3)
acidos; asp; glu;
(4)
basicos: asn, gln, his, lys, arg;
(5) restos que influyen en la orientacion de la cadena: gly, pro; y 5 (6) aromaticos: trp, tyr, phe.
[0198] Las sustituciones no conservadoras implicaran el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Tales restos sustituidos pueden introducirse tambien en los sitios de sustitucion conservadora o, con mayor preferencia, en los sitios restantes (no conservadores).
10 [0199] Las variaciones pueden llevarse a cabo mediante procedimientos conocidos en la tecnica como la mutagenesis mediada por oligonucleotidos (dirigida), el barrido con alanina y la mutagenesis por PCR. La mutagenesis dirigida (Carter y col., Nucl. Acids Res. 13: 4331(19�6); Zoller y col., Nucl. Acids Res.10: 64� 7 (19�7)), la mutagenesis de casete (Wells y col., Gene 34: 315 (19� 5)), la mutagenesis de seleccion por restriccion (Wells y
15 col., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317: 415 (19 �6)) u otras tecnicas conocidas pueden llevarse a cabo en el ADN clonado para producir el ADN variante del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT.
[0200] El analisis de barrido con aminoacidos tambien puede emplearse para identificar uno o mas aminoacidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoacidos preferidos para el barrido se encuentran 20 los aminoacidos relativamente pequenos y neutros. Tales aminoacidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteina. La alanina es tipicamente un aminoacido preferido para el barrido en este grupo, ya que elimina la cadena lateral mas alla del carbono y es menos probable que altere la conformacion de la cadena principal de la variante (Cunningham y Wells, Science 244: 10�1-10� 5 (19�9)). La alanina se prefiere tipicamente tambien porque es el aminoacido mas comun. Ademas, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones ocultas como expuestas
25 (Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150: 1 (1976)). Si la sustitucion con alanina no produce cantidades de variantes adecuadas, puede usarse un aminoacido isosterico.
[0201] Cualquier resto de cisteina que no este implicado en el mantenimiento de la conformacion correcta del anticuerpo dirigido contra TAT o del polipeptido TAT puede sustituirse tambien, generalmente por serina, para
30 mejorar la estabilidad oxidativa de la molecula y evitar un entrecruzamiento aberrante. A la inversa, pueden anadirse uno o mas enlaces de cisteina al anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT para mejorar su estabilidad (especialmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo como un fragmento Fv).
[0202] Un tipo especialmente preferido de variante de sustitucion implica la sustitucion de uno o mas restos de
35 la region hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para su desarrollo posterior tendra(n) propiedades biologicas mejoradas en relacion con el anticuerpo parental a partir del que se ha(n) generado. Una manera conveniente de generar tales variantes de sustitucion implica la maduracion de la afinidad mediante exposicion en fagos. Brevemente, varios sitios de la region hipervariable (por ejemplo, seis a siete sitios) se mutan para generar todas las
40 posibles sustituciones en cada sitio. Las variantes de anticuerpo asi generadas se exponen de forma monovalente en particulas de fagos filamentosas como fusiones con el producto del gen III de M13 envuelto dentro de cada particula. Las variantes expuestas en los fagos se criban despues en cuanto a su actividad biologica (por ejemplo, afinidad de union), segun se desvela en este documento. Con el fin de identificar sitios de la region hipervariable candidatos para su modificacion, puede llevarse a cabo una mutagenesis por barrido con alanina para identificar los
45 restos de la region hipervariable que contribuyen significativamente a la union al antigeno. Alternativa o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antigeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el polipeptido TAT humano. Tales restos de contacto y los restos proximos son candidatos para sustitucion de acuerdo con las tecnicas elaboradas en este documento. Una vez que se han generado tales variantes, el conjunto de variantes se somete a un cribado segun se describe en este
50 documento y los anticuerpos con propiedades superiores pueden seleccionarse en uno o mas ensayos pertinentes para su desarrollo posterior.
[0203] Las moleculas de acido nucleico que codifican variantes de la secuencia aminoacidica del anticuerpo dirigido contra TAT se preparan por diversos procedimientos conocidos en la tecnica. Estos procedimientos incluyen,
55 pero no se limitan al aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias aminoacidicas de origen natural) o la preparacion por mutagenesis mediada por oligonucleotidos (o dirigida), mutagenesis por PCR y mutagenesis de casete de una variante anteriormente preparada o de una version no variante del anticuerpo TAT.
H. Modificaciones de anticuerpos dirigidos contra TAT y polipeptidos TAT [0204] En este documento se describen modificaciones covalentes de anticuerpos dirigidos contra TAT y polipeptidos TAT. Un tipo de modificacion covalente incluye la reaccion de restos aminoacidicos diana de un anticuerpo dirigido contra TAT o un polipeptido TAT con un agente de derivatizacion organico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con los restos de los extremos N o C del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT. La derivatizacion con agentes bifuncionales es util, por ejemplo, para el entrecruzamiento del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para uso en el procedimiento de purificacion de anticuerpos dirigidos contra TAT y viceversa. Los agentes entrecruzantes usados normalmente incluyen, por ejemplo, 1,1,-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehido, esteres de Nhidroxisuccinimida, por ejemplo, esteres con acido 4-azidosalicilico, imidoesteres homobifuncionales, incluidos esteres de disuccinimidilo como 3,3'-ditiobis(propionato de succinimidilo), maleimidas bifuncionales como bis-Nmaleimido-1, �-octano y agentes como 3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato de metilo.
[0205] Otras modificaciones incluyen la desamidacion de restos de glutaminilo y asparraginilo para obtener los correspondientes restos de glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilacion de prolina y lisina, la fosforilacion de los grupos hidroxilo de restos de serilo o treonilo, la metilacion de los grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pags. 79-�6 (19 �3)), la acetilacion de la amina N-terminal y la amidacion de cualquier grupo carboxilo Cterminal.
[0206] Otro tipo de modificacion covalente del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT descritos en este documento comprende la alteracion del patron de glucosilacion nativo del anticuerpo o el polipeptido. La 'alteracion del patron de glucosilacion nativoquot; pretende indicar, para los fines de este documento, la supresion de una o mas fracciones de carbohidrato presentes en el anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT de secuencia nativa (por eliminacion del sitio de glucosilacion subyacente o supresion de la glucosilacion por procedimientos quimicos o enzimaticos) y/o la adicion de uno o mas sitios de glucosilacion que no estan presentes en la secuencia nativa del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT. Ademas, la frase incluye cambios cualitativos en la glucosilacion de las proteinas nativas, que implican un cambio en la naturaleza y proporciones de las diversas fracciones de carbohidrato presentes.
[0207] La glucosilacion de anticuerpos y otros polipeptidos es tipicamente N-glucosilacion u O-glucosilacion. La N-glucosilacion se refiere a la union de la fraccion de carbohidrato a la cadena lateral de un resto de asparragina. Las secuencias tripeptidicas asparragina-X-serina y asparragina-X-treonina, en que X es cualquier aminoacido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la union enzimatica de la fraccion de carbohidrato a la cadena lateral de la asparragina. Por lo tanto, la presencia de una de estas secuencias tripeptidicas en un polipeptido crea un sitio potencial de glucosilacion. La O-glucosilacion se refiere a la union de uno de los azucares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoacido, lo mas normal, serina o treonina, aunque tambien pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
[0208] La adicion de sitios de glucosilacion al anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT se realiza convenientemente por alteracion de la secuencia aminoacidica, de modo que contenga uno o mas de las secuencias tripeptidicas descritas anteriormente (para sitios de N-glucosilacion). La alteracion puede llevarse a cabo tambien por la adicion de o sustitucion por uno o mas restos de serina o treonina en la secuencia del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT originales (para sitios de O-glucosilacion). La secuencia aminoacidica del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT puede alterarse opcionalmente mediante cambios en el ADN, especialmente por mutacion del ADN que codifica el anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT en bases preseleccionadas, de modo que se generen codones que se traduciran en los aminoacidos deseados.
[0209] Otro modo de aumentar el numero de fracciones de carbohidrato en el anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT es por acoplamiento quimico o enzimatico de glucosidos al polipeptido. Tales procedimientos se describen en la tecnica, por ejemplo, en el documento WO �7/05330, publicado el 11 de septiembre de 19�7 y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem. pags. 259-306 (19 �1).
[0210] La eliminacion de fracciones de carbohidrato presentes en el anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT puede realizarse de manera quimica o enzimatica o por sustitucion mutacional de codones que codifican restos aminoacidicos que sirven como dianas de glucosilacion. Las tecnicas de desglucosilacion quimica se conocen en la tecnica y se describen, por ejemplo en Hakimuddin y col., Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (19 �7) y Edge y col., Anal. Biochem. 11�: 131 (19�1). La escision enzimatica de fracciones de carbohidrato en polipeptidos puede conseguirse mediante el uso de diversas endo y exoglucosidasas, segun se describen en Thotakura y col.,
Meth. Enzymol. 13�: 350 (19� 7).
[0211] Otro tipo de modificacion covalente del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT comprende el enlace del anticuerpo o el polipeptido a uno o a diversos polimeros no proteinicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), propilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las patentes de los EE. UU. nos 4.640.�35, 4.496.6�9, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 o 4.179.337. El anticuerpo o el polipeptido pueden tambien atraparse en microcapsulas preparadas, por ejemplo, por tecnicas de coacervacion o por polimerizacion interfacial (por ejemplo, microcapsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcapsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente) en sistemas de administracion de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanoparticulas y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Tales tecnicas se desvelan en Pharmaceutical Sciences de Remington, 16a edicion, Oslo, A., ed., (19� 0).
[0212] El anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT pueden modificarse tambien de manera que formen moleculas quimericas que comprenden un anticuerpo dirigido contra TAT o un polipeptido TAT fusionados con otro polipeptido o secuencia aminoacidica heterologos.
[0213] Una molecula quimerica tal puede comprender una fusion del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT con un polipeptido etiqueta que proporciona un epitopo al que puede unirse selectivamente un anticuerpo dirigido contra la etiqueta. El polipeptido etiqueta se situa generalmente en el extremo amino o carboxilo del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT. La presencia de tales formas etiquetadas con epitopos del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT puede detectarse con el uso de un anticuerpo dirigido contra el polipeptido etiqueta. Ademas, la etiqueta epitopica permite la facil purificacion del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT por afinidad, con un anticuerpo dirigido contra la etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se una a la etiqueta epitopica. En la tecnica son bien conocidos diversos polipeptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos. Algunos ejemplos incluyen etiquetas de polihistidina (poli-his) o polihistidinaglicina (poli-his-gly); el polipeptido etiqueta HA del virus de la influenza y su anticuerpo 12CA5 (Field y col., Mol. Cell. Biol. : 2159-2165 (19��)); la etiqueta c-myc y los anticuerpos dirigidos contra la misma �F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 (Evan y col., Molecular and Cellular Biology 5: 3610-3616 (19�5)); y la etiqueta de la glucoproteina D del virus del herpes simple (gD) y su anticuerpo (Paborsky y col., Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990)). Otros polipeptidos etiqueta incluyen el peptido Flag (Hopp y col., BioTechnology 6: 1204-1210 (19��)); el peptido epitopico KT3 (Martin y col., Science
255: 192-194 (1992); un peptido epitopico de a-tubulina (Skinner y col., J. Biol. Chem. 266: 15163-15166 (1991)); y la etiqueta peptidica de la proteina del gen 10 de T7 (Lutz-Freyermuth y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA �7: 63936397 (1990)).
[0214] Alternativamente, la molecula quimerica puede comprender una fusion del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT con una inmunoglobulina o una region concreta de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molecula quimerica (tambien denominada 'inmunoadhesinaquot;) una fusion tal puede tener lugar con la region Fc de una molecula de IgG. Las fusiones con Ig incluyen preferentemente la sustitucion de al menos una region variable dentro de una molecula de Ig por una forma soluble (con el dominio transmembranal delecionado o inactivado) de un anticuerpo dirigido contra TAT o un polipeptido TAT. Con especial preferencia, la fusion con inmunoglobulina incluye la region de bisagra y las regiones CH2 y CH3 o la region de bisagra y las regiones CH1, CH2 y CH3 de una molecula de IgG1. Para la produccion de fusiones con inmunoglobulina, vease tambien la patente de los EE. UU. n'5.42�.130, concedida el 27 de junio de 1995.
I. Preparacion de anticuerpos dirigidos contra TAT y polipeptidos TAT
[0215] La descripcion siguiente se refiere fundamentalmente a la produccion de anticuerpos dirigidos contra TAT y polipeptidos TAT por cultivo de celulas transformadas o transfectadas con un vector que contiene un acido nucleico codificante de un anticuerpo dirigido contra TAT o un polipeptido TAT. Por supuesto, se contempla que pueden emplearse procedimientos alternativos, bien conocidos en la tecnica, para preparar anticuerpos dirigidos contra TAT y polipeptidos TAT. Por ejemplo, la secuencia aminoacidica apropiada o porciones de la misma pueden producirse por sintesis directa de peptidos mediante tecnicas de fase solida (veanse, por ejemplo Stewart y col., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, CA, EE. UU. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. �5: 2149-2154 (1963)). La sintesis de proteinas in vitro puede llevarse a cabo mediante tecnicas manuales o con automatizacion. La sintesis automatizada puede efectuarse, por ejemplo, con un sintetizador de peptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA, EE. UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Es posible sintetizar quimicamente diversas porciones del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT por separado y combinarlas por procedimientos quimicos o enzimaticos para producir el anticuerpo dirigido contra TAT o el peptido TAT deseados.
1. Aislamiento del ADN que codifica un anticuerpo dirigido contra TAT o un polipeptido TAT
[0216] El ADN que codifica un anticuerpo dirigido contra TAT o un polipeptido TAT puede obtenerse de un banco de ADNc preparado a partir de tejido del que se cree que contiene el ARNm del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT y lo expresa en un nivel detectable. Por consiguiente, un anticuerpo dirigido contra TAT o un polipeptido TAT humanos pueden obtenerse convenientemente de un banco de ADNc preparado a partir de tejido humano. El gen codificante del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT tambien puede obtenerse de un banco genomico o por procedimientos sinteticos conocidos (por ejemplo, sintesis de acidos nucleicos automatizada).
[0217] Los bancos pueden cribarse con sondas (como oligonucleotidos de al menos aproximadamente 20-�0 bases) disenadas para identificar el gen de interes o la proteina codificada por este. El cribado del banco de ADNc o genomico con la sonda seleccionada puede llevarse a cabo mediante procedimientos estandar, como los descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 19�9). Un modo alternativo para aislar el gen que codifica el anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT es el uso de la metodologia de PCR (Sambrook y col., cita anterior; Dieffenbach y col., PCR Primer; A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995))
[0218] Las tecnicas de cribado de un banco de ADNc son bien conocidas en la tecnica. Las secuencias oligonucleotidicas seleccionadas como sondas deben tener la suficiente longitud y ser lo suficientemente inequivocas para minimizar los falsos positivos. El oligonucleotido se marca preferentemente de modo que pueda detectarse por hibridacion con el ADN en el banco que se analiza. Los procedimientos de marcaje son bien conocidos en la tecnica e incluyen el uso de radiomarcadores como ATP marcado con 32P, biotinilacion o marcaje enzimatico. Las condiciones de hibridacion, incluidas la astringencia moderada y la alta astringencia, se indican en Sambrook y col., cita anterior.
[0219] Las secuencias identificadas en tales procedimientos de cribado de bancos pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos publicas como GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencia (con respecto a aminoacidos o nucleotidos) dentro de regiones definidas de la molecula a lo largo de la secuencia de longitud completa puede determinarse mediante procedimientos conocidos en la tecnica y segun se describen en este documento.
[0220] Un acido nucleico con una secuencia codificante de una proteina puede obtenerse por cribado de bancos seleccionados de ADNc o genomicos usando la secuencia aminoacidica deducida desvelada por primera vez en este documento y, en caso necesario, usando procedimientos convencionales de extension de cebadores segun se describen en Sambrook y col., cita anterior, para detectar precursores e intermedios de procesamiento de ARNm que pueden no haberse transcrito inversamente para producir ADNc.
2. Seleccion y transformacion de celulas huesped
[0221] Las celulas huesped se transfectan o transforman con los vectores de expresion o clonacion descritos en este documento para la produccion de anticuerpos dirigidos contra TAT o polipeptidos TAT y se cultivan en un medio nutritivo convencional modificado segun sea apropiado para la induccion de promotores, seleccion de transformantes o amplificacion de los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, como medio, temperatura, pH y similares, pueden ser elegidas por el experto en la tecnica sin excesiva experimentacion. En general, los principios, protocolos y tecnicas practicas para maximizar la productividad de los cultivos celulares pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook y col., cita anterior.
[0222] Los procedimientos para la transfeccion de celulas eucariotas y la transformacion de celulas procariotas son conocidos por el experto en la tecnica, por ejemplo, CaCl2, CaPO4, por medio de liposomas y electroporacion. Dependiendo de la celula huesped usada, la transformacion se realiza mediante tecnicas estandar apropiadas para tales celulas. El tratamiento con calcio con el uso de cloruro de calcio segun se describe en Sambrook y col., cita anterior, o la electroporacion se usan generalmente para procariotas. La infeccion con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformacion de ciertas celulas vegetales segun se describe en Shaw y col., Gene 23: 315 (19 �3) y el documento WO �9/05�59, publicado el 29 de junio de 19�9. Para celulas de mamiferos, sin tales paredes celulares, puede emplearse el procedimiento de precipitacion con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology 52: 456-457 (197�). Los aspectos generales de las transfecciones de sistemas de celulas huesped de mamiferos han sido descritos en la patente de los EE. UU. n'4.399.216. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo tipicamente de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen y col., J. Bact. 130: 946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76: 3 �29 (1979). Sin embargo, tambien pueden usarse otros procedimientos para la introduccion de ADN en las celulas, como microinyeccion nuclear, electroporacion, fusion de protoplastos bacterianos con celulas intactas o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para las diversas tecnicas de transformacion de celulas de mamiferos, veanse Keown y col., Methods in Enzymology 1 5: 527-537 (1990) y Mansour y col., Nature 336: 34� -352 (19� �).
[0223] Las celulas huesped adecuadas para la clonacion o la expresion del ADN en los vectores en este documento incluyen celulas procariotas, de levadura o de eucariotas superiores. Los procariotas adecuados incluyen, pero no se limitan a eubacterias, como organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo enterobacteriaceas como E. coli. Existen publicamente disponibles diversas cepas de E. coli como la cepa de E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); las cepas de E. coli W3110 (ATCC 27.325) y K5772 (ATCC 53.635). Otras celulas huesped procariotas adecuadas incluyen enterobacteriaceas como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescens y Shigella, asi como Bacillus como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P, desvelado en el documento DD 266.710, publicado el 12 de abril de 19� 9), Pseudomonas como P. aeruginosa y Streptomyces. Estos ejemplos son mas bien ilustrativos que limitantes. La cepa W3310 es un huesped o huesped parental especialmente preferido, porque es una cepa huesped comun para las fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferentemente, la celula huesped secreta cantidades minimas de enzimas proteoliticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para efectuar una mutacion genetica en los genes que codifican proteinas endogenas del huesped, en que los ejemplos de tales huespedes incluyen la cepa de E. coli W3110 1A2, que tiene el genotipo completo tonA; la cepa de E. coli W3110 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; la cepa de E. coli W3110 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169degP ompT kanr; la cepa de E. coli W3110 37D6, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169degP ompTrbs7ilvGkanr; la cepa de E. coli W3110 40B4 que es la cepa 37D6 con una mutacion de delecion degP no resistente a kanamicina; y una cepa de E. coli con una proteasa periplasmica mutante desvelada enla patente de los EE. UU.n'4.946.7 �3, concedidael 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados procedimientos de clonacion in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de polimerasas de acidos nucleicos.
[0224] Es posible producir en bacterias anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos y proteinas de fusion con anticuerpos, especialmente cuando no se necesita glucosilacion ni la funcion efectora de Fc, como cuando el anticuerpo terapeutico se conjuga con un agente citotoxico (por ejemplo, una toxina) y el inmunoconjugado muestra eficacia por si mismo en la destruccion de celulas tumorales. Los anticuerpos de longitud completa tienen una mayor semivida en la circulacion. La produccion en E. coli es mas rapida y mas rentable. Para la expresion de fragmentos de anticuerpos y polipeptidos en bacterias, veanse, por ejemplo, los documentos U.S.
5.64�.237 (Carter y col.), U.S. 5.7�9.199 (Joly y col.) y U.S. 5.�40.523 (Simmons y col.) que describen la region de iniciacion de la traduccion (TIR) y secuencias senal para optimizar la expresion y la secrecion, en que estas patentes se incorporan en este documento por referencia. Despues de la expresion, el anticuerpo se aisla de la pasta de celulas de E. coli en una fraccion soluble y puede purificarse, por ejemplo, a traves de una columna con proteina A o G, dependiendo del isotipo. La purificacion final puede llevarse a cabo de manera similar al proceso para purificar anticuerpos expresados, por ejemplo, en celulas CHO.
[0225] Ademas de procariotas, tambien microorganismos eucariotas como hongos filamentosos o levaduras son huespedes adecuados de clonacion o expresion para vectores codificantes de anticuerpos dirigidos contra TAT
o polipeptidos TAT. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huesped eucariota inferior usado comunmente. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature 290: 140 (19�1); documento EP
139.3 �3, publicado el 2 de mayo de 19�5); huespedes de Kluyveromyces (patente de los EE. UU. n'4.943.529; Fleer y col., Bio/Technology 9: 96 �-975 (1991)) como, por ejemplo K. lactis (MW9 �-�C, CBS6�3, CBS4574; Louvencourt y col., J. Bacteriol. 154(2): 737-742 (19�3)), K.fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.17�), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg y col., Bio/Technology : 135 (1990)), K. thermotolerans y K. marxianus; Yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris (documento EP 1 �3.070; Sreekrishna y col., J. Basic Microbiol. 2� : 265-27� (19� �)); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244.234); Neurospora crassa (Case a col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5259-5263 (1979)); Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis (documento EP 394.53�, publicado el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (documento WO 91/00357, publicado el10 de enero de 1991), y huespedes de Aspergillus como A. nidulans (Ballance y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112: 2 �4-2 �9 (19�3); Tilbum y col., Gene 26: 205-221 (19 �3); Yelton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA �1: 1470-1474 (19� 4)) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J. 4: 475-479 (19�5)). Las levaduras metilotrofas son adecuadas en este documento e incluyen, pero no se limitan a levaduras capaces de crecer en metanol seleccionadas de los generos Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Una lista de especies especificas ejemplares de esta clase de levaduras puede encontrarse en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (19� 2).
[0226] Las celulas huesped adecuadas para la expresion de un anticuerpo dirigido contra TAT o un polipeptido TAT glucosilados derivan de organismos multicelulares. Algunos ejemplos de celulas de invertebrados incluyen celulas de insectos como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, asi como celulas vegetales, como cultivos celulares de algodon, maiz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y las correspondientes celulas huesped permisivas de insectos, de huespedes como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Existen diversas cepas viricas disponibles publicamente para transfeccion, por ejemplo, la variante L-1 del virus de la poliedrosis nuclear (VPN) de Autographa californica y la cepa Bm5 del VPN de Bombyx mori y tales virus pueden usarse como el virus en este documento de acuerdo con la presente invencion, especialmente para la transfeccion de celulas de Spodoptera frugiperda.
[0227] Sin embargo, el interes ha sido mayor en celulas de vertebrados y la propagacion de celulas de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Algunos ejemplos de lineas de celulas huesped de mamiferos utiles son la linea CV1 de rinon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); una linea de rinon embrionario humano (293 o celulas 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspension, Graham y col., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); celulas de rinon de hamster neonato (BHK, ATCC CCL 10); celulas de ovario de hamster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216(19�0)); celulas de Sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (19� 0)); celulas de rinon de mono (CV1 ATCC CCL 70); celulas de rinon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-15�7); celulas de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); celulas de rinon canino (MDCK, ATCC CCL 34); celulas de higado de rata bufalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); celulas de pulmon humano (W13 �, ATCC CCL 75); celulas de higado humano (Hep G2, HB �065); tumor mamario de raton (MMT 060562, ATCC CCL51); celulas TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci.
3�3: 44-6� (19� 2)); celulas MRC 5; celulas FS4 y una linea de hepatoma humano (Hep G2).
[0228] Las celulas huesped se transforman con los vectores de expresion o clonacion anteriormente descritos para la produccion del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT y se cultivan en un medio nutritivo convencional modificado segun sea apropiado para la induccion de promotores, seleccion de transformantes o amplificacion de los genes que codifican las secuencias deseadas.
3. Seleccion y uso de un vector replicable
[0229] El acido nucleico (por ejemplo ADNc o ADN genomico) que codifica el anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT puede insertarse en un vector replicable para clonacion (amplificacion del ADN) o para expresion. Existen diversos vectores publicamente disponibles. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plasmido, cosmido, particula virica o fago. La secuencia de acido nucleico apropiada puede insertarse en el vector por diversos procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio(s) de endonucleasa(s) de restriccion apropiado(s) mediante procedimientos conocidos en la tecnica. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a uno o mas de entre una secuencia senal, un origen de replicacion, uno o mas genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminacion de la transcripcion. En la construccion de vectores adecuados que contienen uno o mas de estos componentes se emplean tecnicas de ligacion estandar conocidas por el experto en la tecnica.
[0230] El polipeptido TAT puede producirse de manera recombinante, no solo directamente, sino tambien como un polipeptido de fusion con un polipeptido heterologo, que puede ser una secuencia senal u otro polipeptido con un sitio de escision especifico en el extremo N de la proteina o polipeptido maduros. En general, la secuencia senal puede ser un componente del vector o puede ser una parte del ADN codificante del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT insertado en el vector. La secuencia senal puede ser una secuencia senal procariota seleccionada, por ejemplo del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o lideres de la enterotoxina II termoestable. Para la secrecion por levaduras, la secuencia senal puede ser, por ejemplo, el lider de la invertasa de levadura, el lider del factor a (incluidos los lideres del factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces, en que el ultimo se describeen la patente de los EE. UU. n'5.010.1�2) o ellider de lafosfatasaacida, ellider de laglucoamilasa de
C. albicans (documento EP 362.179, publicado el 4 de abril de 1990) o la senal descrita en el documento WO 90/13646, publicado el 15 de noviembre de 1990. En la expresion en celulas de mamiferos, pueden usarse secuencias senal de mamiferos para dirigir la secrecion de la proteina, como secuencias senal de polipeptidos secretados de la misma especie o de una especie relacionada, asi como lideres secretores viricos.
[0231] Los vectores tanto de expresion como de clonacion contienen una secuencia de acido nucleico que permite al vector replicarse en una o mas celulas huesped seleccionadas. Tales secuencias son bien conocidas para bacterias, levaduras y virus diversos. El origen de replicacion del plasmido pBR322 es adecuado para la mayoria de las bacterias gramnegativas, el origen del plasmido 2! es adecuado para levaduras y diversos origenes viricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son utiles para vectores de clonacion en celulas de mamiferos.
[0232] Los vectores de expresion y clonacion contendran tipicamente un gen de seleccion, tambien denominado marcador seleccionable. Los genes de seleccion tipicos codifican proteinas que (a) confieren resistencia a antibioticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotroficas o (c) suministran nutrientes criticos no disponibles en los medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina-racemasa para Bacillus.
[0233] Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para celulas de mamiferos son aquellos que permiten la identificacion de celulas competentes para la absorcion del acido nucleico codificante del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT, como DHFR o timidina-cinasa. Una celula huesped apropiada cuando se emplea DHFR natural es la linea celular CHO deficiente en actividad de DFHR, preparada y propagada segun se describe en Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (19� 0). Un gen de seleccion adecuado para uso en levaduras es el gen trp1 presente en el plasmido de levadura YRp7 (Stinchcomb y col., Nature 2 �2: 39 (1979); Kingsman y col., Gene 7: 141 (1979); Tschemper y col., Gene 10: 157 (19 �0)). El gen trp1 proporciona un marcador de seleccion para una cepa mutante de levadura sin la capacidad de crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC n' 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics �5: 12 (1977)).
[0234] Los vectores de expresion y clonacion contienen normalmente un promotor unido operativamente a la secuencia de acido nucleico codificante del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT para dirigir la sintesis de ARNm. Los promotores reconocidos por diversas celulas huesped potenciales son bien conocidos. Los promotores adecuados para uso con huespedes procariotas incluyen los sistemas promotores de -lactamasa y lactosa (Chang y col., Nature 275:615 (197�); Goeddel y col., Nature 2 �1: 544 (1979)), alcalina fosfatasa, un sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res. : 4057 (19�0); documento EP 36.776) y promotores hibridos como el promotor tac (deBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA �0: 21-25 (19�3)). Los promotores para uso en sistemas bacterianos contendran tambien una secuencia de Shine-Dalgarno (SD) unida operativamente al ADN que codifica el anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT.
[0235] Algunos ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para uso con huespedes de levadura incluyen los promotores de 3-fosfoglicerato-cinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255: 2073 (19�0)) u otras enzimas glucoliticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (196 �); Holland, Biochemistry 17: 4900 (197�)), como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato-descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfatoisomerasa, 3-fosfoglicerato-mutasa, piruvato-cinasa, triosafosfato-isomerasa, fosfoglucosa-isomerasa y glucocinasa.
[0236] Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles con la ventaja adicional de una transcripcion controlada por las condiciones de cultivo, son las regiones promotoras de alcohol-deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa acida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrogeno, metalotioneina, gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilizacion de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para uso en la expresion en levaduras se describen mas detalladamente en el documento EP 73.657.
[0237] La transcripcion del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT a partir de vectores en celulas huesped de mamiferos esta controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (documento UK 2.211.504, publicado el 5 de julio de 19� 9), adenovirus (como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus de simio 40 (SV40), promotores de mamiferos heterologos, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina y promotores de choque termico, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de celulas huesped.
[0238] La transcripcion de un ADN que codifica el anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT por eucariotas superiores puede aumentarse por insercion de una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actuan en cis, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actuan sobre un promotor para aumentar su transcripcion. Se conocen muchas secuencias potenciadoras para genes de mamiferos (globina, elastasa, albumina, a-fetoproteina e insulina). Sin embargo, tipicamente se usara un potenciador de un virus de celulas eucariotas. Algunos ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardio del origen de replicacion (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardio del origen de replicacion y potenciadores de adenovirus. El potenciador puede estar incorporado en el vector en una posicion 5' o 3' con respecto a la secuencia del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT, pero preferentemente se localiza en un sitio 5' con respecto al promotor.
[0239] Los vectores de expresion usados en celulas huesped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales o celulas nucleadas de otros organismos multicelulares) contendran tambien secuencias necesarias para la terminacion de la transcripcion y para estabilizacion del ARNm. Tales secuencias estan publicamente disponibles de las regiones no traducidas del extremo 5' y, ocasionalmente, del extremo 3' de secuencias de ADN o ADNc eucariotico o virico. Estas regiones contienen segmentos nucleotidicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porcion no traducida del ARNm que codifica el anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT.
[0240] Otros procedimientos, vectores y celulas huesped adicionales, adecuados para su adaptacion a la sintesis del anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT en un cultivo de celulas recombinantes de vertebrados se describen en Gething y col., Nature 293620-625 (19 �1); Mantei y col., Nature 2�1: 40-46 (1979); y los documentos EP 117.060 y EP 117.05�.
4.
Cultivo de las celulas huesped
[0241] Las celulas huesped usadas para producir el anticuerpo dirigido contra TAT o el polipeptido TAT de esta invencion pueden cultivarse en diversos medios. Los medios comercialmente disponibles como el de Ham F10 (Sigma), medio minimo esencial ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para el cultivo de las celulas huesped. Ademas, cualquiera de los medios descritos en Ham y col., Meth. Enz. 5 : 44 (1979); Bames y col., Anal. Biochem. 102: 255 (19� 0); las patentes de los EE. UU. nos 4.767.704, 4.657.�66, 4.927.762, 4.560.655 o 5.122.469; los documentos WO 90/03430; WO �7/00195; o la patente de los EE. UU. reexaminada 30.9� 5 puede usarse como medio de cultivo para las celulas huesped. Cualquiera de estos medios puede complementarse segun sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o el factor de crecimiento epidermico), sales (como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES), nucleotidos (como adenosina y timidina), antibioticos (como el farmaco GENTAMICINATM), oligoelementos (definidos como compuestos inorganicos normalmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energia equivalente. Tambien puede incluirse cualquier otro complemento necesario en la concentracion apropiada, que sera conocida por los expertos en la tecnica. Las condiciones de cultivo, como temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la celula huesped seleccionada para expresion y seran evidentes para los expertos en la tecnica.
5.
Deteccion de la amplificacion/expresion genica
[0242] La amplificacion y/o expresion genica puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, por tecnicas convencionales de transferencia de Southern, transferencia de ARN para cuantificar la transcripcion de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201-5205 (19� 0)), transferencia en manchas (analisis de ADN) o hibridacion in situ, con una sonda marcada apropiadamente, basada en las secuencias proporcionadas en este documento. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer duplex especificos, incluidos duplex de ADN, duplex de ARN y duplex hibridos de ADN-ARN o duplex de ADN y proteina. A su vez, los anticuerpos pueden marcarse y el ensayo puede llevarse a cabo en que el duplex se une a una superficie, de modo que la presencia del anticuerpo unido al duplex puede detectarse al formarse un duplex en la superficie.
[0243] Alternativamente, la expresion genica puede medirse por procedimientos inmunologicos, como la tincion inmunohistoquimica de celulas o secciones de tejido y el analisis de cultivos celulares o liquidos corporales para cuantificar directamente la expresion del producto genico. Los anticuerpos utiles para la tincion inmunohistoquimica y/o el analisis de liquidos corporales pueden ser monoclonales o policlonales y pueden prepararse en cualquier mamifero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipeptido TAT de secuencia nativa o contra un peptido sintetico basado en las secuencias de ADN proporcionadas en este documento o contra una secuencia exogena fusionada al ADN de TAT y que codifica un epitopo especifico del anticuerpo.
6. Purificacion del anticuerpo dirigido contra TAT y el polipeptido TAT [0244] Las formas del anticuerpo dirigido contra TAT y el polipeptido TAT pueden recuperarse del medio de cultivo o de lisados de la celula huesped. Si se encuentran unidas a la membrana, pueden liberarse de esta mediante una disolucion detergente adecuada (por ejemplo, Triton X-100) o por escision enzimatica. Las celulas empleadas en la expresion del anticuerpo dirigido contra TAT y el polipeptido TAT puede romperse por diversos procedimientos fisicos o quimicos, como ciclos de congelacion y descongelacion, ultrasonidos, rotura mecanica o agentes de lisis celular.
[0245] Puede desearse purificar el anticuerpo dirigido contra TAT y el polipeptido TAT de las proteinas o polipeptidos de la celula recombinante. Los procedimientos siguientes son ejemplos de procedimientos de purificacion adecuados: fraccionamiento en una columna de intercambio ionico; precipitacion con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografia en gel de silice o en una resina de intercambio cationico como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitacion con sulfato de amonio; filtracion en gel, por ejemplo con Sephadex G-75; columnas de SEPHAROSE con proteina A para eliminar contaminantes como IgG; y columnas quelantes de metales para fijar formas etiquetadas con epitopos del anticuerpo dirigido contra TAT y el polipeptido TAT. Pueden emplearse diversos procedimientos de purificacion de proteinas y tales procedimientos son conocidos en la tecnica y se describen, por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology 1 2 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (19�2). La(s) etapa(s) de purificacion seleccionada(s) dependera(n), por ejemplo, de la naturaleza del proceso de produccion usado y del anticuerpo dirigido contra TAT y el polipeptido TAT concretos producidos.
[0246] Cuando se usan tecnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplasmico o secretarse directamente al medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, se eliminan los residuos particulados, celulas huesped o fragmentos lisados, por ejemplo, por centrifugacion o ultraflitracion. Carter y col., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para el aislamiento de anticuerpos que se secretan al espacio periplasmico de E. coli. Brevemente, la pasta de celulas se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Los residuos celulares pueden eliminarse por centrifugacion. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresion se concentran generalmente en primer lugar con un filtro de concentracion de proteinas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltracion Amicon
o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de proteasas como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis y pueden incluirse antibioticos para impedir el crecimiento de contaminantes adventicios.
[0247] La composicion de anticuerpos preparada a partir de las celulas puede purificarse, por ejemplo, mediante cromatografia sobre hidroxiapatito, electroforesis en gel, dialisis y cromatografia de afinidad, en que la tecnica de purificacion preferida es la cromatografia de afinidad. La idoneidad de la proteina A como ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de los dominios Fc de inmunoglobulina que esten presentes en el anticuerpo. La proteina A puede usarse para purificar anticuerpos basados en las cadenas pesadas humanas y1, y2
o y4 (Lindmark y col., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (19�3)). La proteina G se recomienda para todos los isotipos de raton y para la cadena y3 humana (Guss y col., EMBO J. 5: 15671575 (19�6)). Lo mas frecuente es que la matriz a la que se fija el ligando de afinidad sea agarosa, pero existen otras matrices disponibles. Las matrices con estabilidad mecanica, como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten tasas de flujo mas rapidas y menores tiempos de procesamiento que los que pueden conseguirse con agarosa. Si el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABXTM (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ, EE. UU.) es util para la purificacion. Tambien existen otras tecnicas de purificacion de proteinas disponibles como el fraccionamiento en una columna de intercambio ionico, precipitacion con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografia en gel de silice, cromatografia en heparina-SEPHAROSETM, cromatografia en una resina de intercambio anionico o cationico (como una columna de acido poliaspartico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitacion con sulfato de amonio, dependiendo del anticuerpo que ha de recuperarse.
[0248] Despues de cualquier etapa(s) preliminar(es) de purificacion, la mezcla que comprende el anticuerpo de interes y los contaminantes puede someterse a una cromatografia de interaccion hidrofoba a bajo pH con un tampon de elucion a un pH de entre 2,5 y 4,5, llevada a cabo preferentemente con bajas concentraciones de sal (por ejemplo, aproximadamente 0-0,25 M de sal).
J. Formulaciones farmaceuticas
[0249] Las formulaciones terapeuticas de los anticuerpos dirigidos contra TAT, los oligopeptidos de union a TAT, las moleculas organicas de union a TAT y/o los polipeptidos TAT se preparan para su almacenamiento mediante la mezcla del anticuerpo, el polipeptido o la molecula organica que tiene el grado de pureza deseado con vehiculos, excipientes o estabilizantes opcionales farmaceuticamente aceptables (Pharmaceutical Sciences de Remington, 16a edicion, Osol, A. ed. (19�0), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los vehiculos, excipientes o estabilizantes aceptables no son toxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen tampones como acetato, Tris, fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes, incluidos acido ascorbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butilico o bencilico; alquilparabenos como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 restos); proteinas como seroalbumina, gelatina o inmunoglobulinas; polimeros hidrofilos como polivinilpirrolidona; aminoacidos como glicina, glutamina, asparragina, histidina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; trealosa o sorbitol; tensioactivos como polisorbato; contraiones formadores de sales como sodio; complejos metalicos (por ejemplo complejos Zn-proteina); y/o tensioactivos no ionicos como Tween®, Pluronics® o polietilenglicol (PEG). Preferentemente, la formulacion comprende el anticuerpo en una concentracion de 5-200 mg/ml, preferentemente de 10-100 mg/ml.
[0250] Las formulaciones en este documento pueden contener tambien mas de un compuesto activo segun sea necesario para la indicacion concreta que se trate, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no tengan efectos adversos reciprocos. Por ejemplo, ademas de un anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido de union a TAT o una molecula organica de union a TAT, puede ser deseable incluir en una formulacion un anticuerpo adicional, por ejemplo, un segundo anticuerpo dirigido contra TAT que se una a un epitopo diferente en el polipeptido TAT o un anticuerpo dirigido contra alguna otra diana, como un factor de crecimiento que afecte el crecimiento del cancer concreto. Alternativa o adicionalmente, la composicion puede comprender ademas un agente quimioterapeutico, un agente citotoxico, una citocina, un agente inhibidor del crecimiento, un agente antihormonal y/o un cardioprotector. Tales moleculas estan adecuadamente presentes en la combinacion en cantidades que son eficaces para el fin deseado.
[0251] Los principios activos tambien pueden estar atrapados en microcapsulas preparadas, por ejemplo, por tecnicas de coacervacion o por o por polimerizacion interfacial, por ejemplo, microcapsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcapsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administracion de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanoparticulas y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Tales tecnicas se desvelan en Pharmaceutical Sciences de Remington, 16a edicion, Osol, A., ed., (19�0).
[0252] Pueden prepararse preparaciones de liberacion sostenida. Algunos ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices semipermeables de polimeros hidrofobos solidos que contienen el anticuerpo, en que las matrices estan en forma de articulos conformados, por ejemplo, peliculas o microcapsulas. Algunos ejemplos de matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) o poli(vinilalcohol), polilactidas (patente de los EE. UU. n'3.773.919), copolimeros de acido L-glutamico y y-etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo no degradable, copolimeros degradables de acido lactico y acido glicolico, como LUPRON DEPOT® (microesferas inyectables compuestas de copolimero de acido lactico y acido glicolico y acetato de leuprolida) y acido poli-D-(-)-3-hidroxibutirico.
[0253] Las formulaciones para usar para administracion in vivo deben ser esteriles. Esto se consigue facilmente por filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles.
K. Diagnostico y tratamiento con anticuerpos dirigidos contra TAT, oligopeptidos de union a TAT y moleculas organicas de union a TAT
[0254] Para determinar la expresion de TAT en el cancer, existen diversos ensayos de diagnostico disponibles. La expresion en exceso del polipeptido TAT puede analizarse por inmunocitoquimica (IHC). Pueden someterse secciones de tejido de una biopsia tumoral incorporadas en parafina al ensayo de IHC y acordarse criterios de intensidad de tincion de la proteina TAT de la manera siguiente:
Puntuacion 0 -no se observa tincion o se observa tincion de la membrana en menos del 10 % de las celulas tumorales.
Puntuacion 1+ -se observa una tincion ligera/apenas perceptible de la membrana en mas del 10 % de las celulas tumorales. Las celulas solo se tinen en parte de la membrana.
Puntuacion 2+ -se observa una tincion de debil a moderada de la membrana completa en mas del 10 % de las celulas tumorales.
Puntuacion 3+ -se observa una tincion de moderada a intensa de la membrana completa en mas del 10 % de las celulas tumorales.
[0255] Aquellos tumores con puntuaciones de 0 o 1+ para la expresion del polipeptido TAT pueden caracterizarse como que no expresan TAT en exceso, mientras que aquellos tumores con puntuaciones de 2+ o 3+ pueden caracterizarse como que expresan TAT en exceso.
[0256] Alternativa o adicionalmente, pueden llevarse a cabo ensayos FISH como INFORM® (comercializado por Ventana, Arizona, EE. UU.) o PATHVISION® (Vysis, Illinois, EE. UU.) en tejido tumoral fijado en formalina e incorporado en parafina para determinar el grado (si acaso) del exceso de expresion de TAT en el tumor.
[0257] La expresion en exceso o la amplificacion de TAT pueden evaluarse mediante un ensayo de diagnostico in vivo, por ejemplo, mediante la administracion de una molecula (como un anticuerpo, un oligopeptido o una molecula organica) que se une a la molecula que ha de detectarse y esta marcada con un marcador detectable (por ejemplo, un isotopo radiactivo o un marcador fluorescente) y el examen externo del paciente para la localizacion del marcador.
[0258] Segun se describe anteriormente, los anticuerpos dirigidos contra TAT, los oligopeptidos y las moleculas organicas tienen diversas aplicaciones no terapeuticas. Los anticuerpos dirigidos contra TAT, los oligopeptidos y las moleculas organicas pueden ser utiles para el diagnostico y estadificacion de canceres que expresan el polipeptido TAT (por ejemplo, en la obtencion de radioimagenes). Los anticuerpos, oligopeptidos y moleculas organicas son tambien utiles para la purificacion e inmunoprecipitacion del polipeptido TAT a partir de celulas, para la deteccion y cuantificacion del polipeptido TAT in vitro, por ejemplo en un ensayo ELISA o una inmunotransferencia, para destruir y eliminar celulas que expresan TAT de una poblacion de celulas mixtas como etapa en la purificacion de otras celulas.
[0259] Actualmente, dependiendo del estado del cancer, su tratamiento implica uno o una combinacion de los siguientes tratamientos: cirugia para eliminar el tejido canceroso, radioterapia y quimioterapia. Un tratamiento con un anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido o una molecula organica puede ser especialmente deseable en pacientes de edad avanzada, que no toleran bien la toxicidad y los efectos secundarios de la quimioterapia y en la enfermedad metastasica en que la radioterapia tiene una utilidad limitada. Los anticuerpos dirigidos contra TAT, los oligopeptidos y las moleculas organicas de la invencion que reconocen especificamente tumores son utiles para aliviar canceres que expresan TAT tras un diagnostico inicial de la enfermedad o durante una recaida. Para las aplicaciones terapeuticas, el anticuerpo dirigido contra TAT, el oligopeptido o la molecula organica pueden usarse solos o en un tratamiento combinado, por ejemplo, con hormonas, antiangiogenicos o compuestos radiomarcados, o con cirugia, crioterapia y/o radioterapia. Un tratamiento con un anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido o una molecula organica puede administrarse junto con otras formas de tratamiento convencionales, bien de manera consecutiva, anterior o posterior al tratamiento convencional. Los farmacos quimioterapeuticos como TAXOTERE® (docetaxel), TAXOL® (paclitaxel), estramustina y mitoxantrona se usan para el tratamiento del cancer, especialmente en pacientes de pronostico favorable. De acuerpo con el presente uso medico de la invencion para el tratamiento o el alivio del cancer, puede administrarse al paciente de cancer un anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido o una molecula organica junto con un tratamiento con uno o mas de los agentes quimioterapeuticos precedentes. En particular, se contempla el tratamiento combinado con paclitaxel y derivados modificados (vease, por ejemplo, el documento EP 0600517). El anticuerpo dirigido contra TAT, el oligopeptido o la molecula organica se administraran con una dosis terapeuticamente eficaz del agente quimioterapeutico. Alternativamente, el anticuerpo dirigido contra TAT, el oligopeptido o la molecula organica se administran junto con quimioterapia para aumentar la actividad y eficacia del agente quimioterapeutico, por ejemplo, paclitaxel. La publicacion Physicians' Desk Reference (PDR) desvela las dosis de estos agentes que se han usado en el tratamiento de diversos canceres. El regimen de dosificacion y las dosis de los farmacos quimioterapeuticos mencionados anteriormente que son terapeuticamente eficaces dependeran del cancer concreto que se trata, del grado de la enfermedad y de otros factores conocidos por el medico experto en la tecnica y pueden ser determinados por este.
[0260] En un aspecto concreto, se administra al paciente un conjugado que comprende un anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido o una molecula organica conjugados con un agente citotoxico. Preferentemente, el inmunoconjugado unido a la proteina TAT es internalizado por la celula, lo que resulta en un aumento de la eficacia terapeutica de dicho inmunoconjugado para destruir la celula cancerosa a la que se une. Preferentemente, el agente citotoxico reconoce especificamente o interfiere con el acido nucleico en la celula cancerosa. Algunos ejemplos de tales agentes citotoxicos se describen anteriormente e incluyen maitansinoides, caliqueamicinas, ribonucleasas y ADN-endonucleasas.
[0261] Los anticuerpos dirigidos contra TAT, los polipeptidos, las moleculas organicas o los conjugados con toxinas de los mismos se administran a un paciente humano de acuerdo con procedimientos conocidos, como la administracion por via intravenosa, por ejemplo, como un bolo o como infusion continua durante un periodo de tiempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutanea, intrarticular, intrasinovial, intratecal, oral, topica o de inhalacion. Se prefiere la administracion del anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica por via intravenosa o subcutanea.
[0262] Otros regimenes terapeuticos pueden combinarse con la administracion del anticuerpo dirigido contra TAT, el oligopeptido o la molecula organica. La administracion combinada incluye la coadministracion, con formulaciones individuales o una unica formulacion farmaceutica, y la administracion consecutiva en cualquier orden, en que preferentemente hay un periodo de tiempo en el que ambos (o todos) los agentes activos ejercen su actividad biologica simultaneamente. Preferentemente, un tratamiento combinado semejante resulta en un efecto terapeutico sinergico.
[0263] Tambien puede ser deseable combinar la administracion del anticuerpo o los anticuerpos dirigidos contra TAT, los oligopeptidos o las moleculas organicas con la administracion de un anticuerpo dirigido contra otro antigeno tumoral asociado al cancer concreto.
[0264] En otro aspecto, los procedimientos de tratamiento terapeutico implican la administracion combinada de un anticuerpo (o anticuerpos) dirigido contra TAT, oligopeptidos o moleculas organicas y uno o mas agentes quimioterapeuticos o agentes inhibidores del crecimiento, incluida la coadministracion de cocteles de diferentes agentes quimioterapeuticos. Los agentes quimioterapeuticos incluyen fosfato de estramustina, prednimustina, cisplatino, 5-fluorouracilo, melfalan, ciclofosfamida, hidroxiurea e hidroxiureataxanos (como paclitaxel y docetaxel) y/o antibioticos antraciclinicos. La preparacion y los programas de dosificacion para tales agentes quimioterapeuticos pueden usarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o segun puede determinar empiricamente el experto en la tecnica. La preparacion y los programas de dosificacion para una quimioterapia semejante se describen tambien en Chemotherapy Service ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, EE. UU. (1992).
[0265] El anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica pueden combinarse con un compuesto antihormonal, por ejemplo, un compuesto antiestrogenico como tamoxifeno, una antiprogesterona como onapristona (vease el documento EP 616 12) o un antiandrogeno como flutamida, en las dosis conocidas para tales moleculas. Si el cancer que ha de tratarse es un cancer independiente de androgenos, el paciente puede haberse sometido previamente a un tratamiento antiandrogenico y el anticuerpo dirigido contra TAT, el oligopeptido o la molecula organica (y opcionalmente otros agentes segun se describen en este documento) pueden administrarse al paciente despues de que el cancer pase a ser independiente de androgenos.
[0266] Algunas veces, puede ser beneficioso coadministrar al paciente tambien un cardioprotector (para prevenir o reducir la disfuncion miocardica asociada con el tratamiento) o una o mas citocinas. Ademas de los regimenes terapeuticos anteriores, el paciente puede someterse a la eliminacion quirurgica de celulas cancerosas y/o a radioterapia, antes, simultaneamente o despues del tratamiento con el anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica. Las dosis adecuadas de cualquiera de los agentes coadministrados anteriores son las usadas actualmente y pueden reducirse debido a la accion combinada (sinergia) del agente y el anticuerpo dirigido contra TAT, el oligopeptido o la molecula organica.
[0267] La dosis y el modo de administracion para la prevencion o el tratamiento de la enfermedad seran elegidos por el medico de acuerdo con criterios conocidos. La dosis apropiada del anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica dependeran del tipo de enfermedad por tratar, segun se define anteriormente, la gravedad y el transcurso de la enfermedad, si el anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica se administran con fines preventivos o terapeuticos, los tratamientos previos, el historial clinico del paciente y la respuesta al anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica y el criterio del medico a cargo. El anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica se administran adecuadamente al paciente de una vez o en una serie de tratamientos. Preferentemente, el anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica se administran por infusion intravenosa o por inyecciones subcutaneas. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 !g/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, aproximadamente 0,1-15 mg/kg/dosis) de anticuerpo puede ser una dosis inicial candidata para administracion al paciente, ya sea, por ejemplo, en una o mas administraciones individuales o por infusion continua. Un regimen de dosificacion puede comprender la administracion de una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguida de un dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo dirigido contra TAT. Sin embargo, otros regimenes de dosificacion tambien pueden ser utiles. Una dosis diaria tipica puede ser desde aproximadamente 1 !g/kg hasta 100 mg/kg o mas, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios dias o un periodo mas largo y dependiendo del estado, el tratamiento se mantiene hasta que se produce la supresion deseada de los sintomas de la enfermedad. El progreso de este tratamiento puede monitorizarse facilmente por procedimientos y ensayos convencionales y sobre la base de criterios conocidos por los medicos u otros expertos en la tecnica.
[0268] Ademas de la administracion del anticuerpo al paciente como proteina, la presente solicitud contempla la administracion del anticuerpo por terapia genica. Tal administracion del acido nucleico que codifica el anticuerpo queda abarcada por la expresion 'administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpoquot;. Vease, por ejemplo, el documento WO 96/07321, publicado el 14 de marzo de 1996, concerniente al uso de terapia genica para generar anticuerpos intracelulares.
[0269] Existen dos estrategias principales para introducir el acido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las celulas del paciente: in vivo y ex vivo. Para la administracion in vivo, el acido nucleico se inyecta directamente en el paciente, normalmente en el lugar donde se necesita el anticuerpo. Para el tratamiento ex vivo, se extraen las celulas del paciente, el acido nucleico se introduce en estas celulas aisladas y las celulas modificadas se administran al paciente directamente o, por ejemplo, encapsuladas en membranas porosas que se implantan en el paciente (veanse, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. nos 4.�92.53 y 5.2�3.1�7). Existen diversas tecnicas disponibles para la introduccion de acidos nucleicos en celulas viables. Las tecnicas varian en funcion de si el acido nucleico se transfiere a celulas cultivadas in vitro o in vivo en las celulas del huesped deseado. Las tecnicas adecuadas para la transferencia de acidos nucleicos a celulas de mamiferos in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporacion, microinyeccion, fusion celular, DEAE-dextrano, el procedimiento de precipitacion con fosfato de calcio, etc. Un vector usado comunmente para la administracion ex vivo del gen es un vector retrovirico.
[0270] Las tecnicas preferidas actualmente para la transferencia de acidos nucleicos in vivo incluyen la transfeccion con vectores viricos (como adenovirus, virus del herpes simple I o virus adenoasociados) y sistemas basados en lipidos (los lipidos utiles para la transferencia de genes mediada por lipidos son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo). Para una revision de los protocolos conocidos actualmente de marcaje genico y terapia genica, vease Anderson y col., Science 256: �0�-�13 (1992). Vease tambien el documento WO 93/25673 y las referencias citadas en dicho documento.
[0271] Los anticuerpos dirigidos contra TAT pueden estar en las diferentes formas abarcadas por la definicion de 'anticuerpoquot; en este documento. Por lo tanto, los anticuerpos incluyen anticuerpos de longitud completa o intactos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de secuencia nativa o variantes aminoacidicas, anticuerpos humanizados, quimericos o de fusion, inmunoconjugados y fragmentos funcionales de los mismos. En los anticuerpos de fusion se fusiona la secuencia de una anticuerpo con una secuencia polipeptidica heterologa. Los anticuerpos pueden modificarse en la region Fc para proporcionar las funciones efectoras deseadas. Segun se discute mas detalladamente en las secciones en este documento, con las regiones Fc apropiadas, el anticuerpo sin moleculas asociadas unido a la superficie celular puede inducir citotoxicidad, por ejemplo, por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o por reclutamiento del complemento en citotoxicidad dependiente del complemento o algun otro mecanismo. Alternativamente, cuando es deseable eliminar o reducir la funcion efectora para minimizar los efectos secundarios o complicaciones terapeuticas, pueden usarse otras regiones Fc determinadas.
[0272] En un ejemplo, el anticuerpo compite por la union o se une sustancialmente al mismo epitopo que los anticuerpos descritos en este documento. Tambien se contemplan anticuerpos con las caracteristicas biologicas de los presentes anticuerpos dirigidos contra TAT descritos en este documento, incluidos especificamente el reconocimiento especifico de tumores in vivo y cualquier caracteristica de inhibicion de la proliferacion celular o citotoxicidad.
[0273] Los procedimientos para la produccion de los anticuerpos anteriores se describen en detalle en este documento.
[0274] Los presentes anticuerpos dirigidos contra TAT, oligopeptidos y moleculas organicas son utiles para el tratamiento de un cancer que expresa TAT o el alivio de uno o mas sintomas del cancer en un mamifero. Un cancer tal incluye cancer de prostata, cancer de las vias urinarias, cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de colon y cancer de ovario, mas especificamente, adenocarcinoma prostatico, carcinomas de celulas renales, adenocarcinomas colorrectales, adenocarcinomas pulmonares, carcinomas pulmonares de celulas escamosas y mesotelioma pleural. Los canceres abarcan canceres metastasicos de cualquiera de los precedentes. El anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica es capaz de unirse a al menos una porcion de las celulas cancerosas que expresan el polipeptido TAT en el mamifero. Preferentemente, el anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica son eficaces para destruir celulas tumorales que expresan TAT o inhibir el crecimiento de tales celulas tumorales, in vitro o in vivo, al unirse al polipeptido TAT en la celula. Un anticuerpo tal incluye un anticuerpo dirigido contra TAT sin moleculas asociadas (sin conjugar con ningun agente). Los anticuerpos sin moleculas asociadas que tienen propiedades citotoxicas o de inhibicion del crecimiento celular pueden asociarse ademas con un agente citotoxico para hacerlos aun mas potentes para la destruccion de celulas tumorales. Las propiedades citotoxicas pueden conferirse a un anticuerpo dirigido contra TAT, por ejemplo, por conjugacion del anticuerpo con un agente citotoxico para formar un inmunoconjugado segun se describe en este documento. El agente citotoxico o el agente inhibidor del crecimiento son preferentemente moleculas pequenas. Se prefieren toxinas como una caliqueamicina o un maitansinoide y analogos o derivados de los mismos.
[0275] La invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo dirigido contra TAT segun se define en las reivindicaciones o un oligopeptido o una molecula organica descritos en este documento y un vehiculo. Para los fines del tratamiento de un cancer, pueden administrarse composiciones a un paciente con necesidad de dicho tratamiento, en que la composicion puede comprender uno o mas anticuerpos dirigidos contra TAT presentes como inmunoconjugados o como anticuerpos sin moleculas asociadas. En otro ejemplo, las composiciones pueden comprender estos anticuerpos, oligopeptidos o moleculas organicas en combinacion con otros agentes terapeuticos como agentes citotoxicos o inhibidores del crecimiento, incluidos agentes quimioterapeuticos. Tambien se describen formulaciones que comprenden un anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido o una molecula organica de la invencion y un vehiculo. En un ejemplo, la formulacion es una formulacion terapeutica que comprende un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
[0276] Otro aspecto son los acidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos dirigidos contra TAT. Quedan abarcados los acidos nucleicos que codifican las dos cadenas H y L y, especialmente, los restos de la region hipervariable, las cadenas que codifican el anticuerpo de secuencia nativa, asi como variantes, modificaciones y versiones humanizadas del anticuerpo.
[0277] Tambien se describen procedimientos utiles para el tratamiento de un cancer que expresa un polipeptido TAT o el alivio de uno o mas de los sintomas del cancer en un mamifero que comprenden la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido o una molecula organica al mamifero. Las composiciones terapeuticas del anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica pueden administrarse a corto plazo (administracion aguda), de manera cronica o intermitentemente segun la direccion del medico. Tambien se proporcionan procedimientos para la inhibicion del crecimiento y la destruccion de una celula que expresa el polipeptido TAT.
[0278] Tambien se describen kits y articulos de fabricacion que comprenden al menos un anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido o una molecula organica. Los kits que contienen anticuerpos dirigidos contra TAT, oligopeptidos o moleculas organicas se usan, por ejemplo, para ensayos de destruccion de celulas con TAT, para la purificacion o la inmunoprecipitacion del polipeptido TAT a partir de celulas. Por ejemplo, para el aislamiento y la purificacion de TAT, el kit puede contener un anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido o una molecula organica acoplados a esferas (por ejemplo, esferas de SEPHAROSE). Pueden proporcionarse kits que contienen los anticuerpos, oligopeptidos o moleculas organicas para la deteccion y cuantificacion de TAT in vitro, por ejemplo en un ensayo ELISA o una inmunotransferencia. Tal anticuerpo, oligopeptido o molecula organica util para deteccion puede proporcionarse con un marcador, como un marcador fluorescente o un radiomarcador.
L. Articulos de fabricacion y kits
[0279] Otra realizacion de la invencion es un articulo de fabricacion que contiene materiales utiles para el tratamiento de un cancer que expresa TAT. El articulo de fabricacion comprende un envase y una etiqueta o un prospecto sobre el envase o asociados al mismo. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los envases pueden estar formados por diversos materiales como vidrio o plastico. El envase contiene una composicion que es eficaz para el tratamiento del estado canceroso y puede tener un puerto de acceso esteril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa con una disolucion intravenosa o un vial con un tapon perforable por una aguja de inyeccion hipodermica). Al menos un agente activo en la composicion es un anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido o una molecula organica de la invencion. La etiqueta o el prospecto indican que la composicion se usa para el tratamiento del cancer. La etiqueta o el prospecto comprenderan ademas instrucciones para la administracion de la composicion del anticuerpo, el oligopeptido o la molecula organica al paciente de cancer. Adicionalmente, el articulo de fabricacion puede comprender ademas un segundo envase que comprende un tampon farmaceuticamente aceptable, como agua bacteriostatica para inyeccion (BWFI), tampon de fosfato salino, disolucion de Ringer y disolucion de dextrosa. Puede incluir ademas otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
[0280] Tambien se proporcionan kits utiles para diversos fines, por ejemplo, para ensayos de destruccion de celulas que expresan TAT, para purificacion e inmunoprecipitacion del polipeptido TAT a partir de celulas. Para el aislamiento y la purificacion del polipeptido TAT, el kit puede contener un anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido o una molecula organica acoplados a esferas (por ejemplo, esferas de SEPHAROSE). Pueden proporcionarse kits que contienen los anticuerpos, oligopeptidos o moleculas organicas para la deteccion y cuantificacion del polipeptido TAT in vitro, por ejemplo en un ensayo ELISA o una inmunotransferencia. Al igual que el articulo de fabricacion, el kit comprende un envase y una etiqueta o un prospecto sobre el envase o asociados al mismo. El envase contiene una composicion que comprende al menos un anticuerpo dirigido contra TAT, un oligopeptido o una molecula organica de la invencion. Pueden incluirse envases adicionales que contienen, por ejemplo, diluyentes y tampones y anticuerpos de control. La etiqueta o el prospecto pueden proporcionar una descripcion de la composicion, asi como instrucciones para el uso in vitro o de diagnostico deseado.
M. Usos de los polipeptidos TAT a los acidos nucleicos codificantes de polipeptidos TAT
[0281] Las secuencias nucleotidicas (o su complemento) que codifican polipeptidos TAT tienen diversas aplicaciones en la tecnica de la biologia molecular, incluidos usos como sondas de hibridacion, en el mapeo cromosomico y genico y en la generacion de sondas de ARN y ADN no codificantes. Un acido nucleico que codifica TAT tambien sera util para la preparacion de polipeptidos TAT por las tecnicas recombinantes descritas en este documento, en que dichos polipeptidos TAT pueden usarse, por ejemplo, en la preparacion de los anticuerpos dirigidos contra TAT descritos en este documento.
[0282] El gen TAT de secuencia nativa de longitud completa, o porciones del mismo, pueden usarse como sondas de hibridacion para un banco de ADNc para aislar el ADNc de TAT de longitud completa o aislar tambien otros ADNc (por ejemplo, aquellos que codifican variantes de origen natural de TAT o TAT de otras especies) con una identidad de secuencia deseada con la secuencia de TAT nativa desvelada en este documento. Opcionalmente, la longitud de las sondas puede ser de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridacion pueden derivarse de regiones al menos parcialmente nuevas de la secuencia nucleotidica nativa de longitud completa, en que tales regiones pueden determinarse sin experimentacion excesiva o a partir de secuencias genomicas, incluidos promotores, elementos potenciadores e intrones de la secuencia nativa de TAT. A modo de ejemplo, un procedimiento de cribado comprendera el aislamiento de la region codificante del gen TAT usando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridacion pueden marcarse con diversos marcadores, incluidos radionuclidos como 32P o 35S o marcadores enzimaticos como fosfatasa alcalina, acoplados a la sonda por medio de los sistemas de acoplamiento de avidina y biotina. Las sondas marcadas que tienen una secuencia complementaria a la del gen TAT de la presente invencion pueden usarse para el cribado de bancos de ADNc, ADN genomico o ARNm humano para determinar que miembros de tales bancos hibridan con la sonda. Las tecnicas de hibridacion se describen mas detalladamente en los ejemplos a continuacion. Cualquier secuencia EST desvelada en la presente invencion puede emplearse de manera similar a las sondas, usando los procedimientos desvelados en este documento.
[0283] Otros fragmentos utiles de los acidos nucleicos codificantes de TAT incluyen oligonucleotidos codificantes o no codificantes que comprenden una secuencia de acido nucleico monocatenaria (ARN o ADN) capaz de unirse a secuencias diana de ARNm de TAT (codificante) o de ADN de TAT (no codificante). Los oligonucleotidos codificantes o no codificantes de acuerdo con la presente invencion comprenden un fragmento de la region codificante del ADN de TAT. Generalmente, un fragmento tal comprende al menos aproximadamente 14 nucleotidos, preferentemente de aproximadamente 14 a 30 nucleotidos. La capacidad de derivar un oligonucleotido codificante o no codificante a partir de la secuencia de ADNc que codifica una proteina dada se describe, por ejemplo, en Stein y Cohen (Cancer Res. 4�: 2659, 19��) y van der Krol y col. (BioTechniques 6: 95�, 19� �).
[0284] La union de oligonucleotidos codificantes o no codificantes a secuencias de acido nucleico diana resulta en la formacion de duplex que bloquean la transcripcion o la traduccion de la secuencia diana de una de varias maneras que incluyen el aumento de la degradacion de los duplex, la terminacion prematura de la transcripcion o la traduccion u otras maneras. Tales procedimientos son abarcados por la presente invencion. Por lo tanto, los nucleotidos no codificantes pueden usarse para bloquear la expresion de las proteinas TAT, en que dichas proteinas TAT pueden desempenar un papel en la induccion de cancer en mamiferos. Los oligonucleotidos codificantes o no codificantes comprenden ademas oligonucleotidos con esqueletos de azucar-fosfodiester modificados (u otros enlaces de azucar, como los descritos en el documento WO 91/06629), en que tales enlaces de azucar son resistentes a nucleasas endogenas. Tales oligonucleotidos con enlaces de azucar resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradacion enzimatica), pero retienen la especificidad de secuencia para ser capaces de unirse a las secuencias nucleotidicas diana.
[0285] Los sitios intragenicos preferidos para la union de secuencias no codificantes incluyen la region que incorpora el codon de inicio/comienzo (5'-AUG / 5'-ATG) o el codon de terminacion/parada de la traduccion (5'-UAA, 5'-UAG y 5-UGA / 5'-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA) del marco de lectura abierto (ORF) del gen. Estas regiones se refieren a una porcion del ARNm o del gen que abarca de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleotidos contiguos en cada direccion (es decir, 5' o 3') a partir de un codon de iniciacion o de terminacion de la traduccion. Otras regiones preferidas para la union de secuencias no codificantes incluyen: intrones; exones; uniones intron-exon; el marco de lectura abierto (ORF) o 'region codificantequot;, que es la region entre el codon de inicio de la traduccion y el codon de terminacion de la traduccion; la caperuza en el extremo 5' de un ARNm que comprende un resto de guanosina N7-metilado unido al resto del extremo 5' del ARNm por medio de un enlace trifosfato 5'-5' e incluye la propia estructura de caperuza en 5', asi como los primeros 50 nucleotidos adyacentes a la caperuza; la region 5' no traducida (5'UTR), la porcion de un ARNm en la direccion 5' a partir del codon de inicio de la traduccion que, por tanto, incluye los nucleotidos entre el sitio de la caperuza en 5' y el codon de inicio de la traduccion en un ARNm o los correspondientes nucleotidos en el gen; y la region 3' no traducida (3'UTR), la porcion de un ARNm en la direccion 3' a partir del codon de terminacion de la traduccion que, por lo tanto, incluye los nucleotidos entre el codon de terminacion de la traduccion y el extremo 3' de un ARNm o los correspondientes nucleotidos en el gen.
[0286] Algunos ejemplos especificos de compuestos no codificantes preferidos utiles para inhibir la expresion de las proteinas TAT incluyen oligonucleotidos que contienen esqueletos modificados o enlaces internucleosidicos no naturales. Los oligonucleotidos con esqueletos modificados incluyen aquellos que retienen un atomo de fosforo en el esqueleto y aquellos que no tienen un atomo de fosforo en el esqueleto. Para los fines de esta memoria descriptiva, y como a veces se menciona en la tecnica, los oligonucleotidos modificados que no tienen un atomo de fosforo en su esqueleto internucleosidico pueden considerarse tambien como oligonucleosidos. Los esqueletos de oligonucleotidos modificados preferidos incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriesteres, aminoalquilfosfotriesteres, metilfosfonatos y otros alquilfosfonatos, incluidos 3'-alquilenfosfonatos, 5'alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos, incluidos 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriesteres, selenofosfatos y boranofosfatos con enlaces 3'-5' normales, analogos de estos con enlaces 2'-5' y aquellos que tienen polaridad invertida, en que uno o mas enlaces internucleotidicos son enlaces 3' a 3', 5' a 5' o 2' a 2'. Los oligonucleotidos con polaridad invertida preferidos comprenden un unico enlace 3' a 3' en el nucleotido del extremo 3', es decir, un unico resto nucleosidico invertido que puede ser abasico (falta la nucleobase o tiene un grupo hidroxilo en su lugar). Tambien se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de acidos libres. Algunas patentes de los EE. UU. representativas que exponen la preparacion de enlaces que contienen fosforo incluyen, pero no se limitan a las patentes de los EE. UU. nos: 3.6 �7.� 0�, 4.469.� 63, 4.476.301, 5.023.243, 5.177.196, 5.1�� .�97, 5.264.423, 5.276.019, 5.27�.302 5.2 �6.717, 5.321.131, 5.399.676, 5.405.939, 5.453.496, 5.455.233, 5.466.677, 5.476.925, 5.519.126, 5.536.�21, 5.541.306, 5.550.111, 5.563.253, 5.571.799, 5.5�7.361, 5.194.599, 5.565.555, 5.527. �99, 5.721.21�, 5.672.697 y 5.625.050.
[0287] Los esqueletos de oligonucleotidos modificados preferidos que no incluyen un atomo de fosforo en los mismos estan formados por enlaces internucleosidicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosidicos de heteroatomos mixtos y alquilo y cicloalquilo o uno o mas enlaces internucleosidicos heteroatomicos o heterociclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos con enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porcion de azucar de un nucleosido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfuro, sulfoxido y sulfona; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de metilenformacetilo y tioformacetilo; esqueletos de riboacetilo; esqueletos que contienen alquenos; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimina y metilenhidrazina; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tienen partes componentes de N, O, S mixtos y CH2. Algunas patentes de los EE. UU. representativas que exponen la preparacion de tales oligonucleosidos incluyen, pero no se limitan a las patentes de los EE. UU. nos: 5.034.506, 5.166.315, 5.1�5.444, 5.214.134, 5.216.141, 5.235.033, 5.264.562, 5.264.564, 5.405.93�, 5.434.257, 5.466.677, 5.470.967, 5.4�9.677, 5.541.307, 5.561.225, 5.596.0�6, 5.602.240, 5.610.2 �9, 5.602.240, 5.60 .046, 5.610.2 �9, 5.61�.704,
5.623.070, 5.663.312, 5.633.360, 5.677.437, 5.792.60�, 5.646.269 y 5.677.439.
[0288] En otros oligonucleotidos no codificantes preferidos, tanto el azucar como el enlace internucleosidico, es decir, el esqueleto de las unidades nucleotidicas, se sustituyen por grupos nuevos. Las unidades de las bases se mantienen para la hibridacion con un compuesto de acido nucleico diana apropiado. Uno de tales compuestos oligomericos, un compuesto mimetico de un oligonucleotido que ha demostrado tener excelentes propiedades de hibridacion, se denomina acido peptidonucleico (APN). En los compuestos de APN, el esqueleto de azucares de un oligonucleotido se sustituye por un esqueleto que contiene amidas, en particular un esqueleto de aminoetilglicina. Las nucleobases se mantienen y se unen directa o indirectamente a atomos de nitrogeno aza de la porcion amida del esqueleto. Algunos ejemplos representativos de patentes de los EE. UU. que exponen la preparacion de compuestos de APN incluyen, pero no se limitan a las patentes de los EE. UU. nos: 5.539.0� 2, 5.714.331 y
5.719.262. Puede encontrarse mas informacion sobre compuestos de APN en Nielsen y col., Science 254: 14971500 (1991).
[0289] Los oligonucleotidos no codificantes preferidos incorporan esqueletos de fosforotioato y/o esqueletos de heteroatomos y, en particular, -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-(conocido como esqueleto de metilen(metilimino) o MMI), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-y -O-N(CH3)-CH2-CH2-(en que el esqueleto fosfodiesternativo serepresenta como -O-P-O-CH1-),descritosen lapatentedelosEE.UU. n'5.4 9.677 mencionada anteriormente, y los esqueletos de amida de la patente de los EE. UU. n' 5.602.240 mencionada anteriormente. Tambien se prefieren los oligonucleotidos no codificantes con estructuras de esqueleto de morfolina de la patente de los EE. UU. n'5.034.506 mencionada anteriormente.
[0290] Los oligonucleotidos modificados tambien pueden contener una o mas fracciones de azucar sustituidas. Los oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes grupos en la posicion 2': OH; F; Oalquilo, S-alquilo o N-alquilo; O-alquenilo, S-alquenilo o N-alquenilo; O-alquinilo, S-alquinilo o N-alquinilo; u O-alquiloO-alquilo, en que el alquilo, alquenilo o alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10 o alquenilo y alquinilo C2 a C10, sustituidos o sin sustituir. Se prefieren especialmente O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, en que n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros nucleotidos no codificantes preferidos comprenden uno de los siguientes grupos en la posicion 2': alquilo inferior C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alquilarilo, arilalquilo, O-alquilarilo u O-arilalquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalquilarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escision de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinamicas de un oligonucleotido y otros sustituyentes con propiedades similares. Una modificacion preferida incluye 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, tambien conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin y col., Helv. Chim. Acta 7 : 4�6-504 (1995)), es decir, un grupo alcoxialcoxi. Otra modificacion preferida incluye 2'dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, tambien conocido como 2'-DMAOE, segun se describe en los ejemplos siguientes en este documento y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (tambien conocido en la tecnica como 2'O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2).
[0291] Otra modificacion preferida incluye acidos nucleicos bloqueados (ANB), en los que el grupo 2'-hidroxilo se enlaza con el atomo de carbono 3' o 4' del anillo de azucar, con lo que se forma una fraccion de azucar biciclica. El enlace es preferentemente un grupo metileno (-CH2-)n que une el atomo de oxigeno 2' con el atomo de carbono 4', en que n es 1 o 2.Los ANBysu preparacion se describenen los documentosWO9�/39352 yWO 99/14226.
[0292] Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2'-O-CH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-alilo (2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-alilo (2'-O-CH2-CH=CH2) y 2'-fluor (2'-F). La modificacion en 2' puede tener lugar en la posicion arabino (arriba) o la posicion ribo (abajo). Una modificacion 2'-arabino preferida es 2'-F. Tambien pueden efectuarse modificaciones similares en otras posiciones del oligonucleotido, especialmente en la posicion 3' del azucar en el nucleotido del extremo 3' o en oligonucleotidos con enlaces 2'-5' y en la posicion 5' del nucleotido del extremo 5'. Los oligonucleotidos pueden tener tambien grupos mimeticos de azucares como fracciones de ciclobutilo en lugar del azucar pentofuranosilo. Algunas patentes de los EE. UU. representativas que exponen la preparacion de tales estructuras de azucares modificadas incluyen, pero no se limitan a las patentes de los EE. UU. nos: 4.9 �1.957,
5.11�. �00, 5.319.0� 0, 5.359.044, 5.393. �7�, 5.446.137, 5.466.7 �6, 5.514.7�5, 5.519.134, 5.567.� 11, 5.576.427, 5.591.722, 5.597.909, 5.610.300, 5.627.053, 5.639.� 73, 5.646.265, 5.65�.� 73, 5.670.633, 5.792.747 y 5.700.920.
[0293] Los oligonucleotidos pueden incluir tambien modificaciones o sustituciones de las nucleobases (a menudo denominadas simplemente 'basesquot; en la tecnica). Segun se usa en este documento, las nucleobases 'sin modificarquot; o 'naturalesquot; incluyen las bases purinicas adenina (A) y guanina (G) y las bases pirimidinicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sinteticas y naturales como 5metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil- y otros derivados alquilicos de adenina y guanina, 2-propil- y otros derivados alquilicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y 5-halocitosina, 5-propinil-(-C:C-CH3 o -CH2-C:CH)-uracilo y 5-propinilcitosina y otros derivados alquinilicos de bases pirimidinicas, 6-azouracilo, 6-azocitosina y 6-azotimina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4tiouracilo, -halo-, �-amino-, �-tiol-, -tioalquil-, �-hidroxil- y otras adeninas y guaninas -sustituidas, 5-halo-, especialmente 5-bromo-, 5-trifluorometil- y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, -azaguanina y �-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3desazaguanina y 3-desazaadenina. Otras nucleobases modificadas incluyen pirimidinas triciclicas como fenoxacinocitidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazinocitidina (1H-pirimido[5,4b][1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), abrazaderas de G como una fenoxazinocitidina sustituida (por ejemplo, 9-(2aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazolcitidina (2H-pirimido[5,4-b]indol-2-ona), piridoindolcitidina (H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona). Las nucleobases modificadas pueden incluir tambien aquellas en las que la base purinica o pirimidinica se sustituye por otros heterociclos, por ejemplo, 7desazadenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Otras nucleobases incluyen las desveladas en la patente de los EE. UU. n' 3.6�7. �0�, las desveladas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, paginas �5�-�59, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, y las desveladas por Englisch y col., Angewandte Chemie, edicion internacional 30: 613 (1991). Algunas de estas nucleobases son especialmente utiles para aumentar la afinidad de union de los compuestos oligomericos de la invencion. Estas incluyen pirimidinas 5sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y O-6, incluidas 2-aminopropiladenina, 5propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad de los duplexde acidosnucleicosen 0,6-1,2 'C(Sanghvi y col, Antisense Research and Applications, CRCPress, Boca Raton, 1993, pags. 276-27�) y son las sustituciones de bases preferidas, incluso mas especialmente cuando se combinan con modificaciones de azucares con 2'-O-metoxietilo. Algunas patentes de los EE. UU. representativas que exponen la preparacion de nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a la patente de los EE. UU. no
3.6�7. �0�, asi como las patentes de los EE. UU. nos: 4. �45.205, 5.130.302, 5.134.066, 5.175.273, 5.367.066, 5.432.272, 5.457.1� 7, 5.459.255, 5.4�4.90�, 5.502.177, 5.525.711, 5.552.540, 5.5� 7.469, 5.594.121, 5.596.091, 5.614.617, 5.645.9 �5, 5.�30.653, 5.763.5��, 6.005.096, 5.6� 1.941 y 5.750.692.
[0294] Otra modificacion de los oligonucleotidos no codificantes consiste en enlazar quimicamente al oligonucleotido una o mas fracciones o conjugados que aumentan la actividad, la distribucion celular o la absorcion celular del oligonucleotido. Los compuestos de la presente descripcion pueden incluir grupos conjugados unidos covalentemente a grupos funcionales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados incluyen intercaladores, moleculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, polieteres, grupos que aumentan las propiedades farmacodinamicas de los oligomeros y grupos que aumentan las propiedades farmacocineticas de los oligomeros. Los grupos conjugados tipicos incluyen colesteroles, lipidos, lipidos cationicos, fosfolipidos, fosfolipidos cationicos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceinas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Los grupos que aumentan las propiedades farmacodinamicas, en el contexto de la presente descripcion, incluyen grupos que mejoran la absorcion de los oligomeros, aumentan la resistencia de los oligomeros a la degradacion y/o intensifican la hibridacion especifica de la secuencia con ARN. Los grupos que aumentan las propiedades farmacocineticas, en el contexto de la presente descripcion, incluyen grupos que mejoran la absorcion, la distribucion, el metabolismo o la excrecion de los oligomeros. Las fracciones conjugadas incluyen, pero no se limitan a fracciones lipidicas como una fraccion de colesterol (Letsinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
�6: 6553-6556 (19 �9)), acido colico (Manoharan y col., Bioorg. Med. Chem. Let. 4: 1053-1060 (1994)), un tioeter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 306-309 (1992); Manoharan y col., Bioorg. Med. Chem. Let. 3: 2765-2770 (1993)), un tiocolesterol (Oberhauser y col., Nucl. Acids Res. 20: 533-53� (1992)), una cadena alifatica, por ejemplo, dodecanodiol o restos undecilo (Saison-Behmoaras y col., EMBO J. 10: 1111-111� (1991); Kabanov y col., FEBS Lett. 259: 327-330 (1990); Svinarchuk y col., Biochimie 75: 49-54 (1993)), un fosfolipido, por ejemplo dihexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan a col., Tetrahedron Lett. 36: 3651-3654 (1995); Shea y col., Nucl. Acids Res. 1�: 3777-37� 3 (1990)), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan y col., Nucleosides & Nucleotides 14: 969-973 (1995)), o acido adamantanoacetico (Manoharan y col. Tetrahedron Lett. 36: 3651-3654 (1995)), una fraccion de palmitilo (Mishra y col., Biochim. Biophys. Acta 1264: 229-237 (1995)), o una fraccion de octadecilamina o hexilaminocarboniloxicolesterol. Los oligonucleotidos de la presente descripcion pueden conjugarse tambien con farmacos activos, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, cetoprofeno, (S)(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, acido 2,3,5-triyodobenzoico, acido flufenamico, acido folinico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometicina, un barbiturato, una cefalosporina, un farmaco sulfa, un antidiabetico, un antibacteriano o un antibiotico. Los conjugados de oligonucleotidos con farmacos y su preparacion se describen en la solicitud de patente de los EE. UU. con el numero de serie 09/334.130 (presentada el 15 de junio de 1999) y las patentes de los EE. UU. nos 4.�2 .979, 4.94�.� �2, 5.21 .105, 5.525.465, 5.541.313, 5.545.730, 5.552.53�, 5.57 .717. 5.5 �0.731, 5.5�0.731, 5.591.5�4, 5.109.124, 5.11�. �02, 5.13 .045, 5.414.077, 5.4 �6.603, 5.512.439, 5.57 .71 , 5.60�.046, 4.5�7.044, 4.605.735, 4.667.025, 4.762.779, 4.7� 9.737, 4.� 24.941, 4.� 35.263, 4.�76.335, 4.904.5� 2, 4.95�.013, 5.0�2. �30, 5.112.963, 5.214.136, 5.0�2. �30, 5.112.963, 5.214.136, 5.245.022, 5.254.469, 5.25 .506, 5.262.536, 5.272.250, 5.292.�73, 5.317.09�, 5.371.241. 5.391.723, 5.416.203. 5.451.463, 5.510.475, 5.512.667, 5.514.7�5, 5.565.552, 5.567.�10, 5.574.142, 5.5�5.4�1, 5.5� 7.371, 5.595.726, 5.597.696, 5.599.923, 5.599.92� y 5.6��.941.
[0295] No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado se modifiquen de manera uniforme y, de hecho, pueden incorporarse mas de una de las modificaciones mencionadas anteriormente en un solo compuesto
o incluso en un solo nucleosido dentro de un oligonucleotido. Tambien se incluyen compuestos no codificantes que son compuestos quimericos. Los compuestos no codificantes 'quimericosquot; o 'quimerasquot;, en el contexto de esta descripcion, son compuestos no codificantes, especialmente oligonucleotidos, que contienen una o mas regiones quimicamente distintas, cada una compuesta de al menos una unidad monomerica, es decir un nucleotido en el caso de un compuesto oligonucleotidico. Estos oligonucleotidos contienen tipicamente al menos una region en la que el oligonucleotido se ha modificado para conferirle mayor resistencia a la degradacion por nucleasas, mayor absorcion celular y/o mayor afinidad de union por el acido nucleico diana. Una region adicional del oligonucleotido puede servir como sustrato para enzimas capaces de escindir hibridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un duplex de ARN:ADN. Por lo tanto, la activacion de la ARNasa H resulta en la escision de la diana de ARN, lo que aumenta en gran manera la eficiencia de la inhibicion de la expresion genica por el oligonucleotido. Por consiguiente, frecuentemente pueden obtenerse resultados comparables con oligonucleotidos de menor tamano cuando se usan oligonucleotidos quimericos, en comparacion con desoxioligonucleotidos de fosforotioato que hibridan con la misma region. Los compuestos no codificantes quimericos de la presente descripcion pueden formarse como estructuras compuestas de dos o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados, oligonucleosidos y/o compuestos mimeticos de oligonucleotidos segun se describen anteriormente. Los oligonucleotidos no codificantes quimericos preferidos incorporan al menos un azucar modificado en 2' (preferentemente 2'-O-(CH2)2O-CH3) en el extremo 3' para conferir resistencia a nucleasas y una region con al menos cuatro azucares 2'-H contiguos para conferir actividad de ARNasa H. Tales compuestos se han denominado tambien en la tecnica hibridos o gapmeros. Los gapmeros preferidos tienen una region de azucares modificados en 2' (preferentemente 2'-O-(CH2)2-O-CH3) en el extremo 3' y en el extremo 5', separados por al menos una region con al menos cuatro azucares 2'-H contiguos e incorporan preferentemente enlaces fosforotioato en el esqueleto. Las patentes de los EE. UU. representativas que exponen la preparacion de tales estructuras hibridas incluyen, pero no se limitan a las patentes de los EE. UU. nos 5.013.�30, 5.149.797, 5.220.007, 5.256.775, 5.366.� 7�, 5.403.711, 5.491.133, 5.565.350, 5.623.065, 5.652.355, 5.652.356 y 5.700.922.
[0296] Los compuestos no codificantes pueden prepararse de manera conveniente y rutinaria por la tecnica bien conocida de sintesis en fase solida. Varios proveedores comercializan el equipamiento para dicha sintesis, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, California, EE. UU.). Adicional o alternativamente, puede emplearse para dicha sintesis cualquier otro procedimiento conocido en la tecnica. Es bien conocido el uso de tecnicas similares para preparar oligonucleotidos como los fosforotioatos y derivados alquilados. Los compuestos pueden tambien mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otra manera con otras moleculas, estructuras de moleculas o mezclas de compuestos como, por ejemplo, liposomas, moleculas que reconocen especificamente receptores, formulaciones para via oral, rectal, topica u otras formulaciones, para facilitar la captacion, distribucion y/o absorcion. Las patentes de los EE. UU. representativas que exponen la preparacion de tales formulaciones que facilitan la captacion, distribucion y/o absorcion incluyen, pero no se limitan a las patentes de los EE. UU. nos 5.10 .921,
5.354. �44, 5.416.016, 5.459.127, 5.521.291, 5.543.15� , 5.547.932, 5.5�3.020, 5.591.721, 4.426.330, 4.534. �99, 5.013.556, 5.10 .921, 5.213. �04, 5.227.170, 5.264.221, 5.356.633, 5.395.619, 5.416.016, 5.417.97�, 5.462. �54,
5.469. �54, 5.512.295, 5.527.52�, 5.534.259, 5.543.152, 5.556.94�, 5.5 �0.575 y 5.595.756.
[0297] Otros ejemplos de oligonucleotidos codificantes o no codificantes incluyen aquellos nucleotidos que estan covalentemente enlazados a fracciones organicas como los descritos en el documento WO 90/1004� y otras fracciones que aumentan la afinidad del oligonucleotido por una secuencia de acido nucleico diana como poli-(Llisina). Ademas, pueden asociarse agentes intercalantes como elipticina y agentes alquilantes o complejos metalicos a los oligonucleotidos codificantes o no codificantes para modificar las especificidades de union del oligonucleotido codificante o no codificante a la secuencia nucleotidica diana.
[0298] Los oligonucleotidos codificantes o no codificantes pueden introducirse en una celula que contiene la secuencia de acido nucleico diana por cualquier procedimiento de transferencia genica, por ejemplo, transfeccion mediada por CaPO4, electroporacion o el uso de vectores de transferencia genica como el virus de Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, un oligonucleotido codificante o no codificante se inserta en un vector retrovirico adecuado. Una celula que contiene la secuencia de acido nucleico diana se pone en contacto con el vector retrovirico recombinante in vivo o ex vivo. Los vectores retroviricos adecuados incluyen, pero no se limitan a aquellos derivados de los retrovirus murinos M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV) o los vectores de copia doble denominados DCT5A, DCT5B y DCT5C (vease el documento WO 90/13641).
[0299] Los oligonucleotidos codificantes o no codificantes pueden introducirse tambien en una celula que contiene la secuencia nucleotidica diana por formacion de un conjugado con una molecula de union a un ligando, segun se describe en el documento WO 91/04753. Las moleculas de union a ligandos adecuadas incluyen, pero no se limitan a receptores de la superficie celular, factores de crecimiento, otras citocinas u otros ligandos que se unen a receptores de la superficie celular. Preferentemente, la conjugacion de la molecula de union al ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de dicha molecula de union al ligando de unirse a su correspondiente molecula o receptor o de bloquear la entrada en la celula del oligonucleotido codificante o no codificante o de su version conjugada.
[0300] Alternativamente, un oligonucleotido codificante o no codificante puede introducirse en una celula que contiene la secuencia de acido nucleico diana por formacion de un complejo oligonucleotido-lipido, segun se describe en el documento WO 90/1044 �. El complejo oligonucleotido-lipido codificante o no codificante es disociado preferentemente dentro de la celula por una lipasa endogena.
[0301] Las moleculas de ARN o ADN codificantes o no codificantes tienen generalmente una longitud de al menos aproximadamente cinco nucleotidos, alternativamente una longitud de al menos aproximadamente seis, siete, ocho, nueve, diez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 1�, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 2�, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, �0, 5, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 1 �0, 1�5, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 2 0, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 3 0, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 4�0, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 5�0, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 6 0, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 7 0, 790, 00, �10, �20, �30, 40, �50, 60,
�70, 0, �90, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 9 �0, 990 o 1.000 nucleotidos, en que, en este contexto, el termino 'aproximadamentequot; significa la longitud de la secuencia nucleotidica indicada mas o menos el 10 % de dicha longitud indicada.
[0302] Las sondas pueden emplearse tambien en tecnicas de PCR para generar una coleccion de secuencias para la identificacion de secuencias codificantes de TAT estrechamente relacionadas.
[0303] Las secuencias nucleotidicas que codifican un polipeptido TAT pueden usarse tambien para la construccion de sondas de hibridacion para el mapeo del gen que codifica dicho TAT y para el analisis genetico de individuos con trastornos geneticos. Las secuencias nucleotidicas proporcionadas en este documento pueden mapearse en un cromosoma y en regiones especificas de un cromosoma usando tecnicas conocidas, como hibridacion in situ, analisis de ligamiento frente a marcadores cromosomicos conocidos y cribado de bancos por hibridacion.
[0304] Cuando las secuencias codificantes de TAT codifican una proteina que se une a otra proteina (por ejemplo, cuando TAT es un receptor), dicho TAT puede usarse en analisis para identificar las otras proteinas o moleculas implicadas en la interaccion de union. Mediante tales procedimientos pueden identificarse inhibidores de la interaccion de union entre el receptor y el ligando. Las proteinas implicadas en tales interacciones de union pueden usarse tambien para identificar peptidos o pequenas moleculas inhibidores o agonistas de la interaccion de union. Ademas, el receptor TAT puede usarse para aislar uno o mas ligandos correlativos. Pueden disenarse ensayos de cribado para encontrar compuestos de partida que imiten la actividad biologica de un TAT nativo o un receptor de TAT. Tales ensayos de cribado incluiran ensayos aptos para un cribado de alto rendimiento de bancos quimicos, que los hara especialmente adecuados para la identificacion de moleculas pequenas como farmacos candidatos. Las moleculas pequenas contempladas incluyen compuestos sinteticos organicos o inorganicos. Los ensayos pueden llevarse a cabo en diversos formatos, incluidos ensayos de union proteina-proteina, ensayos de cribado bioquimico, inmunoensayos y ensayos a base de celulas, que estan bien caracterizados en la tecnica.
[0305] Los acidos nucleicos que codifican TAT o sus formas modificadas pueden usarse tambien para generar animales transgenicos o animales con el gen inactivado ('knock outquot;), los cuales, a su vez, son utiles en el desarrollo y la identificacion sistematica de reactivos de utilidad terapeutica. Un animal transgenico (por ejemplo, un raton o una rata) es un animal que tiene celulas que contienen un transgen, en que dicho transgen se ha introducido en el animal o un antecesor del animal en una etapa prenatal, por ejemplo, embrionaria. Un transgen es un ADN que se integra en el genoma de una celula a partir de la cual se desarrolla el animal. En una realizacion, puede usarse el ADNc que codifica TAT para clonar el ADN genomico que codifica TAT de acuerdo con tecnicas establecidas y las secuencias genomicas pueden usarse para generar animales transgenicos que contienen celulas que expresan el ADN que codifica TAT. Los procedimientos para generar animales transgenicos, especialmente animales como ratones o ratas, se han convertido en convencionales en la tecnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de los EE. UU. nos 4.736. �66 y 4.�70.009. Tipicamente, se localizaran celulas concretas como diana para la incorporacion del transgen TAT con potenciadores especificos del tejido. Los animales transgenicos que incluyen una copia de un transgen que codifica TAT introducida en la linea germinal del animal en una etapa embrionaria pueden usarse para examinar el efecto del aumento de la expresion del ADN que codifica TAT. Tales animales pueden usarse como animales de prueba para reactivos de los que se piensa que confieren proteccion, por ejemplo, frente a estados patologicos asociados con su expresion en exceso. De acuerdo con esto, un animal se trata con el reactivo y una reducida incidencia del estado patologico, en comparacion con los animales sin tratar que contienen el transgen, indicara una intervencion terapeutica potencial para el estado patologico.
[0306] Alternativamente, pueden usarse homologos no humanos de TAT para construir un animal 'knock outquot; para TAT, con un gen codificante de TAT defectivo o alterado como resultado de una recombinacion homologa entre el gen endogeno que codifica TAT y un ADN genomico alterado que codifica TAT introducido en una celula madre embrionaria del animal. Por ejemplo, un ADNc que codifica TAT puede usarse para clonar un ADN genomico que codifica TAT de acuerdo con tecnicas establecidas. Una porcion del ADN genomico que codifica TAT puede delecionarse o sustituirse por otro gen, como un gen que codifica un marcador seleccionable que puede usarse para monitorizar la integracion. Tipicamente, se incluyen en el vector varias kilobases de ADN flanqueante inalterado (en los dos extremos 5' y 3') (vease, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell 51: 503 (19� 7) para una descripcion de vectores para recombinacion homologa). El vector se introduce en un linea de celulas madre embrionarias (por ejemplo, por electroporacion) y se seleccionan las celulas en las que el ADN introducido ha sufrido recombinacion homologa con el ADN endogeno (vease, por ejemplo, Li y col., Cell 69: 915 (1992)). Las celulas seleccionadas se inyectan despues en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un raton o una rata) para formar quimeras de agregacion (vease, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.
J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 19�7), pags. 113-152). Despues, puede implantarse un embrion quimerico en un animal receptor hembra pseudoprenado y el embrion llevarse a termino para crear un animal 'knock outquot;. La progenie que contiene el ADN recombinado homologamente en sus celulas germinales puede identificarse por tecnicas estandar y usarse para criar animales en los que todas las celulas del animal contienen el ADN recombinado homologamente. Los animales con el gen inactivado pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad para defenderse contra ciertos estados patologicos y por la aparicion de estados patologicos debidos a la ausencia del polipeptido TAT.
[0307] Los acidos nucleicos que codifican los polipeptidos TAT pueden usarse tambien en terapia genica. En aplicaciones de terapia genica, los genes se introducen en las celulas con el fin de conseguir la sintesis in vivo de un producto genetico terapeuticamente eficaz, por ejemplo, por sustitucion de un gen defectivo. La 'terapia genicaquot; incluye tanto terapia genica convencional, en la que se consigue un efecto duradero por un unico tratamiento, como la administracion de agentes terapeuticos genicos, que supone la administracion en una vez o repetida de un ADN o ARNm terapeuticamente eficaces. Los ARN y ADN no codificantes pueden usarse como agentes terapeuticos para bloquear la expresion de ciertos genes in vivo. Se ha demostrado que oligonucleotidos no codificantes de poca longitud pueden importarse en las celulas, en las que actuan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares causadas por su restringida absorcion por la membrana celular (Zamecnik y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA �3: 4143-4146 (19 �6)). Los oligonucleotidos pueden modificarse para aumentar su absorcion, por ejemplo, por sustitucion de sus grupos fosfodiester cargados negativamente por grupos sin carga.
[0308] Existen diversas tecnicas disponibles para la introduccion de acidos nucleicos en celulas viables. Las tecnicas varian dependiendo de si el acido nucleico se transfiere a celulas cultivadas in vitro o in vivo a las celulas del huesped deseado. Las tecnicas adecuadas para la transferencia de un acido nucleico a celulas de mamiferos in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporacion, microinyeccion, fusion de celulas, DEAE-dextrano, el procedimiento de precipitacion con fosfato de calcio, etc. Las tecnicas preferidas actualmente para la transferencia genica in vivo incluyen la transfeccion con vectores viricos (retroviricos tipicos) y la transferencia mediada por proteinas de la cubierta virica-liposomas (Dzau y col., Trends in Biotechnology 11: 205-210 (1993)). En algunas situaciones, es deseable proporcionar la fuente del acido nucleico con un agente que reconoce especificamente las celulas diana, como un anticuerpo especifico para una proteina de membrana de la superficie celular de la celula diana, un ligando para un receptor en la celula diana, etc. Cuando se emplean liposomas, pueden usarse proteinas que se unen a una proteina de membrana de la superficie celular asociada con endocitosis para el reconocimiento especifico y/o para facilitar la absorcion, por ejemplo, proteinas de la capsida o fragmentos de las mismas con tropismo para un tipo de celula concreto, anticuerpos dirigidos contra proteinas que experimentan internalizacion durante el ciclo, proteinas que se dirigen especificamente a una localizacion intracelular y que aumentan la semivida intracelular. La tecnica de endocitosis mediada por receptores se describe, por ejemplo, en Wu y col., J. Biol. Chem.
262: 4429-4432 (19 �7); y Wagner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA �7: 3410-3414 (1990). Para una revision de protocolos de marcado genico y terapia genica, vease Anderson y col., Science 256: �0�-�13 (1992).
[0309] Las moleculas de acido nucleico que codifican los polipeptidos TAT o fragmentos de los mismos descritos en este documento son utiles para la identificacion cromosomica. A este respecto, existe una permanente necesidad de identificar nuevos marcadores cromosomicos, dado que en la actualidad existen relativamente pocos reactivos marcadores de cromosomas basados en datos reales de secuencia. Cada uno de las moleculas de acido nucleico de TAT de la presente invencion puede usarse como marcador cromosomico.
[0310] Los polipeptidos y las moleculas de acido nucleico de TAT pueden usarse tambien en diagnostico para la tipificacion de tejidos, en que los polipeptidos TAT pueden expresarse diferencialmente en un tejido en comparacion con otro, preferentemente en un tejido enfermo en comparacion con un tejido normal del mismo tipo. Las moleculas de acido nucleico de TAT podran usarse para la generacion de sondas para PCR, analisis por transferencia de ARN, transferencia de Southern e inmunotransferencia.
[0311] Se describen procedimientos de cribado de compuestos para la identificacion de aquellos que mimetizan el polipeptido TAT (agonistas) o que impiden el efecto del polipeptido TAT (antagonistas). Los ensayos de cribado de candidatos de farmacos antagonistas se disenan para identificar compuestos que se unen o forman complejos con los polipeptidos TAT codificados por los genes identificados en este documento o que interfieren de otro modo con la interaccion de los polipeptidos codificados con otras proteinas celulares, incluida, por ejemplo, la inhibicion de la expresion del polipeptido TAT por las celulas. Tales ensayos de cribado incluiran ensayos aptos para un cribado de alto rendimiento de bancos quimicos, que los hara especialmente adecuados para la identificacion de moleculas pequenas como farmacos candidatos.
[0312] Los ensayos pueden llevarse a cabo en diversos formatos, incluidos ensayos de union proteinaproteina, ensayos de cribado bioquimico, inmunoensayos y ensayos a base de celulas, que estan bien caracterizados en la tecnica.
[0313] Todos los ensayos para la identificacion de antagonistas tienen en comun que requieren el contacto del farmaco candidato con un polipeptido TAT codificado por un acido nucleico identificado en este documento en condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la interaccion de estos dos componentes.
[0314] En los ensayos de union, la interaccion es una union y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reaccion. En una realizacion concreta, el polipeptido TAT codificado por el gen identificado en este documento o el farmaco candidato se inmovilizan en una fase solida, por ejemplo, en una placa de microtitulacion, por uniones covalentes o no covalentes. Una union no covalente se consigue generalmente por recubrimiento de la superficie solida con una disolucion del polipeptido TAT y secado. Alternativamente, puede usarse un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, especifico para el polipeptido TAT que ha de inmovilizarse, para anclarlo a una superficie solida. El ensayo se realiza por adicion del componente no inmovilizado, que puede estar marcado con un marcador detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando la reaccion ha finalizado, se eliminan los componentes que no han reaccionado, por ejemplo, por lavado, y se detectan los complejos anclados a la superficie solida. Cuando el componente originalmente no inmovilizado porta un marcador detectable, la deteccion del marcador inmovilizado en la superficie indica la formacion del complejo. Cuando el componente originalmente no inmovilizado no porta un marcador, la formacion del complejo puede detectarse, por ejemplo, mediante un anticuerpo marcado que se une especificamente al complejo inmovilizado.
[0315] Si el compuesto candidato interacciona, pero no se une con un polipeptido TAT concreto codificado por un gen identificado en este documento, la interaccion con este polipeptido puede ensayarse por procedimientos bien conocidos para la deteccion de interacciones proteina-proteina. Tales ensayos incluyen enfoques tradicionales como, por ejemplo, entrecruzamiento, coinmunoprecipitacion y copurificacion a traves de gradientes o columnas cromatograficas. Ademas, las interacciones proteina-proteina pueden monitorizarse con el uso del sistema genetico a base de levaduras descrito por Fields y colaboradores (Fields y Song, Nature (Londres) 340: 245-246 (19 �9); Chien y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ��: 957�-95 �2 (1991)) segun se desvela en Chevray y Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA �9: 57 �9-5793 (1991). Muchos activadores transcripcionales, como GAL4 de levaduras, constan de dos dominios modulares fisicamente discretos, uno que actua como dominio de union a ADN y otro que funciona como dominio de activacion de la transcripcion. El sistema de expresion de levaduras descrito en las publicaciones anteriores (generalmente denominado 'sistema de dos hibridosquot;), aprovecha esta propiedad y emplea dos proteinas hibridas, una en la que la proteina diana se fusiona con el dominio de union a ADN de GAL4 y otro, en el que las proteinas activadoras candidatas se fusionan con el dominio de activacion. La expresion del gen indicador GAL1lacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4 depende de la reconstitucion de la actividad de GAL4 por medio de una interaccion proteina-proteina. Las colonias que contienen polipeptidos que interaccionan se detectan con un sustrato cromogenico para �-galactosidasa. Un kit completo (MATCHMAKERTM) para la identificacion de interacciones proteina-proteina entre dos proteinas especificas mediante la tecnica de los dos hibridos es comercializado por Clontech. Este sistema puede extenderse tambien al mapeo de dominios proteinicos implicados en interacciones de proteinas especificas, asi como para determinar restos aminoacidicos que son criticos para tales interacciones.
[0316] Los compuestos que interfieren con la interaccion de un gen que codifica un polipeptido TAT identificado en este documento y otros componentes intra o extracelulares pueden analizarse de la manera siguiente: normalmente se prepara una mezcla de reaccion que contiene el producto del gen y el componente intra o extracelular en unas condiciones y durante un tiempo que permitan la interaccion y la union de los dos productos. Para analizar la capacidad de inhibicion de la union de un compuesto candidato, la reaccion se realiza en ausencia y en presencia del compuesto de prueba. Ademas, puede anadirse un placebo a una tercera mezcla de reaccion para servir como control positivo. La union (formacion de un complejo) entre el compuesto de prueba y el componente intra o extracelular presente en la mezcla se monitoriza segun se describe anteriormente en este documento. La formacion de un complejo en la(s) reaccion(es) de control pero no en la mezcla de reaccion que contiene el compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba interfiere con la interaccion del compuesto de prueba y su pareja de reaccion.
[0317] Para identificar antagonistas, el polipeptido TAT puede anadirse a una celula junto con el compuesto que se analiza en cuanto a una actividad concreta y la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de interes en presencia del polipeptido TAT indica que el compuesto es un antagonista del polipeptido TAT. Alternativamente, pueden detectarse antagonistas por combinacion del polipeptido TAT y un antagonista potencial con receptores o receptores recombinantes del polipeptido TAT unidos a la membrana en las condiciones apropiadas para un ensayo de inhibicion competitiva. El polipeptido TAT puede marcarse, por ejemplo, por radiactividad, de modo que el numero de moleculas del polipeptido TAT unidas al receptor puede usarse para determinar la eficacia del potencial antagonista. El gen que codifica el receptor puede identificarse por numerosos procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, por seleccion de ligandos por afinidad y clasificacion por FACS (Coligan y col., Current Protocols in Immun. 1(2): capitulo 5 (1991)). Preferentemente se emplea la clonacion de expresion, en que se prepara ARN poliadenilado de una celula que responde al polipeptido TAT y un banco de ADNc creado a partir de este ARN se divide en porciones que se usan para transfectar celulas COS u otras celulas que no responden al polipeptido TAT. Las celulas transfectadas que se cultivan en portaobjetos de vidrio se exponen al polipeptido TAT marcado. El polipeptido TAT puede marcarse de diversos modos, incluida la yodacion o la inclusion de un sitio de reconocimiento para una proteina-cinasa especifica del sitio. Despues de la fijacion y la incubacion, los portaobjetos se someten a analisis autorradiografico. Se identifican las porciones positivas y se preparan subporciones que se vuelven a transfectar en un proceso interactivo de subporcionado y recribado, lo que eventualmente da lugar a un unico clon que codifica el supuesto receptor.
[0318] Como estrategia alternativa para la identificacion del receptor, el polipeptido TAT marcado puede unirse por fotoafinidad con la membrana celular o preparaciones de extractos que expresan la molecula receptora. En material entrecruzado se separa por SDS-PAGE y se expone a una pelicula de rayos X. El complejo marcado que contiene el receptor puede extraerse del gel, separarse en los fragmentos peptidicos y someterse a microsecuenciacion de proteinas. La secuencia aminoacidica obtenida por microsecuenciacion se usara para disenar un conjunto de sondas oligonucleotidicas degeneradas para el cribado de un banco de ADNc para identificar el gen que codifica el supuesto receptor.
[0319] En otros ensayos para identificar antagonistas, se incubarian celulas de mamiferos o una preparacion de membrana que expresa el receptor con el polipeptido TAT marcado en presencia del compuesto candidato. Despues podria medirse la capacidad del compuesto para intensificar o bloquear esta interaccion.
[0320] Mas ejemplos especificos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleotido que se une a las fusiones de inmunoglobulina con el polipeptido TAT y, en particular, anticuerpos que incluyen, sin limitacion, anticuerpos policlonales y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos dirigidos contra idiotipos y versiones quimericas o humanizadas de tales anticuerpos o fragmentos, asi como anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanos. Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteina estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del polipeptido TAT que reconoce al receptor pero que no ejerce ningun efecto, con lo que inhibe competitivamente la accion del polipeptido TAT.
[0321] Otro antagonista potencial del polipeptido TAT es una construccion de ARN o ADN no codificante preparada mediante la tecnologia de los acidos nucleicos no codificantes, en que, por ejemplo, una molecula de ARN o ADN no codificante actua para bloquear directamente la traduccion del ARNm por hibridacion con el ARNm diana y prevencion de la traduccion de la proteina. La tecnologia de los acidos nucleicos no codificantes puede usarse para controlar la expresion genica a traves de la formacion de helices triples o ADN o ARN no codificantes, en que los dos procedimientos se basan en la union de un polinucleotido a ADN o ARN. Por ejemplo, la porcion codificante del extremo 5' de la secuencia polinucleotidica que codifica los polipeptidos TAT maduros en este documento se usa para disenar un oligonucleotido de ARN no codificante de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Se disena un oligonucleotido de ADN complementario de una region del gen implicada en la transcripcion (helice triple -vease Lee y col., Nucl. Acids Res. 6: 3073 (1979); Cooney y col., Science 241: 456 (19��); Dervan y col., Science 251: 1360 (1991)), con lo que se impide la transcripcion y la produccion del polipeptido TAT. El oligonucleotido de ARN no codificante hibrida con el ARNm in vivo y bloquea la traduccion de la molecula de ARNm para dar el polipeptido TAT (acidos nucleicos no codificantes -Okano, Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 19� �). Los oligonucleotidos descritos anteriormente pueden administrarse tambien a celulas de modo que el ARN o el ADN no codificantes pueden expresarse in vivo para inhibir la produccion del polipeptido TAT. Cuando se usa ADN no codificante, se prefieren oligodesoxirribonucleotidos derivados del sitio de iniciacion de la traduccion, por ejemplo, entre las posiciones -10 y +10 de la secuencia nucleotidica del gen diana.
[0322] Los antagonistas potenciales incluyen moleculas pequenas que se unen al sitio activo, el sitio de union del receptor o un factor de crecimiento u otro sitio de union relevante del polipeptido TAT, con lo que se bloquea la actividad biologica normal del polipeptido TAT. Algunos ejemplos de moleculas pequenas incluyen, pero no se limitan a peptidos pequenos o moleculas similares a peptidos, preferentemente peptidos solubles y compuestos organicos o inorganicos sinteticos no peptidicos.
[0323] Las ribozimas son moleculas enzimaticas de ARN capaces de catalizar la escision especifica de ARN. Las ribozimas actuan por hibridacion especifica de la secuencia con el ARN diana complementario, seguida de escision endonucleolitica. Los sitios especificos de escision por ribozimas dentro de una diana potencial de ARN pueden identificarse por tecnicas conocidas. para mas detalles, vease, por ejemplo, Rossi, Current Biology 4: 469471 (1994) y la publicacion PCTn'WO97/33551 (publicada el 1� de septiembre 1997).
[0324] Las moleculas de acido nucleico implicadas en la formacion de helices triples usadas para inhibir la transcripcion deberan ser monocatenarias y compuestas de desoxinucleotidos. La composicion de bases de estos oligonucleotidos se disena de modo que promueve la formacion de helices triples por medio de las reglas de emparejamiento de bases de Hoogsteen que, generalmente, requieren tramos considerables de purinas y pirimidinas en una hebra de un duplex. Para mas detalles, vease, por ejemplo, la publicacion PCT n'WO 97/33551, cita superior.
[0325] Estas moleculas pequenas pueden identificarse mediante uno o mas de los ensayos de cribado discutidos anteriormente en este documento y/o mediante cualquier otra tecnica de cribado conocida por los expertos en la tecnica.
[0326] Un acido nucleico aislado que codifica el polipeptido TAT puede usarse en este documento para la produccion recombinante del polipeptido TAT mediante tecnicas bien conocidas en la tecnica. A su vez, los polipeptidos TAT producidos pueden emplearse para generar anticuerpos dirigidos contra TAT mediante tecnicas bien conocidas en la tecnica segun se describen en este documento.
[0327] Los anticuerpos que se unen especificamente a TAT identificados en este documento, asi como otras moleculas identificadas por los ensayos de cribado desvelados anteriormente en este documento, pueden administrarse para el tratamiento de diversos trastornos, incluido el cancer, en forma de composiciones farmaceuticas.
[0328] Si el polipeptido TAT es intracelular y se usan anticuerpos completos como inhibidores, se prefieren anticuerpos de internalizacion. Sin embargo, tambien pueden usarse lipofecciones o liposomas para administrar el anticuerpo o un fragmento del anticuerpo a las celulas. Cuando se usan fragmentos de anticuerpos, se prefiere el
menor fragmento inhibidor que se une especificamente al dominio de union de la proteina diana. Por ejemplo, pueden disenarse moleculas peptidicas basadas en las secuencias de la region variable de un anticuerpo que retengan la capacidad de unirse a la secuencia de la proteina diana. Tales peptidos pueden sintetizarse quimicamente y/o producirse por tecnologia de ADN recombinante. Vease, por ejemplo, Marasco y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7��9-7�93 (1993).
[0329] La formulacion en este documento puede contener tambien mas de un compuesto activo, segun sea necesario para la indicacion concreta que se trate, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no tengan efectos adversos reciprocos. Alternativa o adicionalmente, la composicion puede comprender un agente que intensifique su funcion como, por ejemplo, un agente citotoxico, una citocina, un agente quimioterapeutico o un agente inhibidor del crecimiento. Tales moleculas estan adecuadamente presentes en la combinacion en cantidades eficaces para el fin deseado.
[0330] Los ejemplos siguientes se ofrecen solo con fin ilustrativo y no pretenden limitar de ninguna manera el alcance de la presente invencion.
EJEMPLOS
[0331] Los reactivos disponibles comercialmente mencionados en los ejemplos se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario. La fuente de las celulas identificadas en los ejemplos siguientes y a lo largo de la memoria descriptiva por numeros de accesion ATCC es la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA, EE. UU.
EJEMPLO5: Verificaci6n vanalisis de la expresi6n diferencial del polipeptido TAT mediante GEPIS
[0332] Los polipeptidos TAT que puedieran haberse identificado como antigenos tumorales segun se describe en uno o mas de los ejemplos anteriores se analizaron y verificaron de la manera siguiente. Se hizo una busqueda en una base de datos de ADN de etiquetas de secuencia expresada (EST) (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA, EE. UU.) y se identificaron secuencias EST interesantes mediante GEPIS. La elaboracion de perfiles de expresion genica por ordenador (GEPIS) es una herramienta bioinformatica desarrollada en Genentech Inc. que caracteriza genes de interes para nuevas dianas terapeuticas del cancer. GEPIS aprovecha la gran cantidad de informacion disponible sobre secuencias y bancos de EST para determinar perfiles de expresion genica. GEPIS es capaz de determinar el perfil de expresion de un gen sobre la base de su correlacion proporcional con el numero de veces que aparece en las bases de datos de EST y funciona por integracion de la base de datos relacional de EST LIFESEQ® y la informacion propiedad de Genentech de manera restrictiva y estadisticamente significativa. En este ejemplo, GEPIS se usa para identificar y validar de forma cruzada nuevos antigenos tumorales, aunque GEPIS puede configurarse para realizar analisis muy especificos o extensas tareas de cribado. Para el cribado inicial, GEPIS se usa para identificar secuencias EST de la base de datos LIFESEQ® que se correlacionan con la expresion en un tejido o tejidos concretos de interes (a menudo un tejido tumoral de interes). Las secuencias EST identificadas en este cribado inicial (o secuencias consenso obtenidas del alineamiento de multiples secuencias EST relacionadas y solapantes obtenidas en el cribado inicial) se sometieron despues a un cribado con el fin de identificar la presencia de al menos un dominio transmembranal en la proteina codificada. Finalmente, se empleo GEPIS para generar un perfil completo de expresion en el tejido para las diversas secuencias de interes. Por medio de este tipo de bioinformatica de cribado, se identificaron diversos polipeptidos TAT (y las moleculas de acido nucleico que los codifican) como expresados significativamente en exceso en un tipo de cancer concreto o en ciertos canceres, en comparacion con otros canceres y/o tejidos normales no cancerosos. La evaluacion de los aciertos de GEPIS se basa en varios criterios incluidos, por ejemplo, la especificidad con respecto al tejido, la especificidad con respecto al tumor y el nivel de expresion en tejidos esenciales normales y/o tejidos proliferativos normales. A continuacion se presenta una lista de moleculas cuyo perfil de expresion tisular, segun se determina por GEPIS, pone de manifiesto una elevada expresion tisular y una significativa regulacion por aumento de la expresion en un tumor o tumores especificos en comparacion con otro(s) tumor(es) y/o tejidos normales y opcionalmente una relativamente baja expresion en tejidos esenciales normales y/o tejidos proliferativos normales. Como tales, las moleculas listadas a continuacion son excelentes dianas polipeptidicas para el diagnostico y el tratamiento del cancer en mamiferos.
Molecula
regulacion por aumento de la expresion en: en comparacion con:
DNA96964 (TAT193)
tumor de mama tejido de mama normal
DNA96964 (TAT193)
tumor cerebral tejido cerebral normal
EJEMPLO6: Uso de TAT como sonda de hibridaci6n
[0333] El procedimiento siguiente describe el uso de una secuencia nucleotidica que codifica TAT como sonda de hibridacion, por ejemplo, para el diagnostico de la presencia de un tumor en un mamifero.
[0334] El ADN que comprende la secuencia codificante del polipeptido TAT de longitud completa o maduro segun se desvela en este documento puede emplearse tambien como sonda para identificar ADN homologos (aquellos que codifican variantes de TAT de origen natural) en bancos de ADNc de tejido humano o en bancos genomicos de tejido humano.
[0335] La hibridacion y el lavado de los filtros con el ADN de cada banco se realizan en las condiciones de alta astringencia siguientes. La hibridacion de los filtros con la sonda radiomarcada derivada de TAT se lleva a cabo en una disolucion de formamida al 50 %, 5x SSC, SDS al 0,1 %, pirofosfato de sodio al 0,1 %, fosfato de sodio 50 mM, pH 6,�, 2x disolucion de Denhardt y sulfato de dextrano al 10 % a 42 'C durante 20 horas. El lavado de los filtros se realiza en una disolucion acuosa de 0,1x SSC y SDS al 0,1 % a 42 'C.
[0336] Los ADN con la deseada identidad de secuencia con el ADN que codifica TAT de secuencia nativa de longitud completa pueden identificarse mediante tecnicas estandar conocidas en la tecnica.
EJEMPLO 7: Expresi6n de TAT en E. coli
[0337] Este ejemplo ilustra la preparacion de una forma no glucosilada de TAT por expresion recombinante en
E. coli.
[0338] La secuencia de ADN que codifica TAT se amplifica inicialmente mediante cebadores seleccionados para PCR. Los cebadores deberan contener sitios de enzimas de restriccion que se correspondan con los sitios de enzimas de restriccion en el vector de expresion seleccionado. Pueden emplearse diversos vectores de expresion. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli; vease Bolivaret y col., Gene 2: 95 (1977)) que contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina. El vector se digiere con enzimas de restriccion y se desfosforila. Las secuencias amplificadas por PCR se ligan entonces en el vector. El vector incluira preferentemente secuencias que codifican un gen de resistencia a un antibiotico, un promotor trp, una secuencia lider de poli-his (que incluye los primeros seis codones STII, la secuencia de poli-his y un sitio de escision para enterocinasa), la region codificante de TAT, el terminador transcripcional A y un gen de argU.
[0339] La mezcla de ligacion se usa entonces para transformar una cepa seleccionada de E. coli por los procedimientos descritos en Sambrook y col., cita anterior. Los transformantes se identifican por su capacidad de crecer en placas de LB y despues se seleccionan las colonias resistentes al antibiotico. El ADN plasmidico puede aislarse y confirmarse por analisis de restriccion y secuenciacion de ADN.
[0340] Los clones seleccionados pueden cultivarse durante la noche en un medio de cultivo liquido como caldo LB, complementado con antibioticos. El cultivo de la noche puede usarse posteriormente para inocular un cultivo a mayor escala. Las celulas se dejan crecer hasta una densidad optica deseada, en que se activa el promotor de expresion.
[0341] Despues de cultivar las celulas durante varias horas mas, estas pueden recogerse por centrifugacion. El sedimento de celulas obtenido en la centrifugacion puede solubilizarse mediante diversos agentes conocidos en la tecnica y la proteina TAT solubilizada puede purificarse despues con una columna quelante de metales en las condiciones que permiten la firme union de la proteina.
[0342] TAT puede expresarse en E. coli, en una forma etiquetada con poli-his, mediante el procedimiento siguiente. El ADN que codifica TAT se amplifica inicialmente mediante cebadores seleccionados para PCR. Los cebadores contendran sitios de enzimas de restriccion que se correspondan con los sitios de enzimas de restriccion en el vector de expresion seleccionado y otras secuencias utiles para un inicio de la traduccion eficiente y fiable, una rapida purificacion en una columna quelante de metales y el tratamiento proteolitico con enterocinasa. Las secuencias etiquetadas con poli-his amplificadas por PCR se ligan en un vector de expresion que se usa para transformar un huesped de E. coli basado en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq). Los transformantesse cultivanprimeramente en LB con50 mg/ml de carbenicilina a 30 'Ccon agitacion hasta alcanzar una DO600 de 3-5. Despues, los cultivos se diluyen 50-100 veces en el medio CRAP (preparado por mezcla de 3,57 g de (NH4)2SO4, 0,71 g de citrato de sodio·2H2O, 1,7 g de KCl, 5,36 g de extracto de levadura Difco, 5,36 g de hidrolizado de caseina Sheffield SF en 500 ml de agua, asi como MPOS 110 mM, pH 7,3, glucosa al 0,55 % (p/v) y MgSO47mM)yse dejan crecer durante aproximadamente 20-30 horas a 30 'Ccon agitacion. Se extraen muestras para verificar la expresion por analisis de SDS-PAGE y el cultivo en masa se centrifuga para sedimentar las celulas. Los sedimentos de celulas se congelan hasta su purificacion y replegamiento.
[0343] La pasta de E. coli de fermentaciones de 0,5 a 1 l (sedimentos de 6-10 g) se resuspende en 10 volumenes (p/v) de un tampon de guanidina 7M, Tris 20 mM, pH �. Se anaden sulfito de sodio y tetrationato de sodio solidos para alcanzar concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la disolucion se agita durante la nochea4 'C. Estaetapa resulta en unaproteinadesnaturalizadacontodos losrestosde cisteinabloqueados por sulfitolizacion. La disolucion se centrifuga a 40.000 rpm en una ultracentrifuga Beckman durante 30 min. El sobrenadante se diluye con 3-5 volumenes del tampon de la columna quelante de metales (guanidina 6M, Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtra a traves de filtros de 0,22 !m para su clarificacion. El extracto clarificado se carga en una columna quelante de metales Qiagen Ni-NTA equilibrada en el tampon de la columna quelante de metales. La columna se lava con un tampon adicional que contiene imidazol 50 mM (Calbiochen, grado Utrol), pH 7,4. La proteina se eluye con un tampon que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones que contiene la proteina deseada se reunen y se almacenan a 4 'C. La concentracion de proteina se estima por su absorbancia a 2 �0 nm mediante el coeficiente de extincion calculado sobre la base de su secuencia aminoacidica.
[0344] Las proteinas se repliegan por dilucion lenta de la muestra en el tampon de replegamiento recien preparado, que consta de: Tris 20 mM, pH ,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteina 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volumenes de replegamiento se eligen de modo que la concentracion final de proteina es de 50 a 100 !g/ml. La disolucion de replegamiento seagitasuavemente a 4 'Cdurante 12-36 horas. La disolucion de replegamiento se inactiva por la adicion de TFA hasta una concentracion final del 0,4 % (pH de aproximadamente 3). Antes de continuar purificando la proteina, la disolucion se filtra a traves de un filtro de 0,22 !m y se anade acetonitrilo hasta una concentracion final del 2-10 %. La proteina replegada se somete a cromatografia en una columna de fase inversa Poros R1/H, con un tampon movil de TFA al 0,1 % y elucion con un gradiente de acetonitrilo del 10 al �0 %. Las alicuotas o fracciones con absorbancia A2� 0 se analizan en geles de SDS y poliacrilamida y se reunen las fracciones que contienen la proteina replegada homogenea. Generalmente, las especies correctamente replegadas de la mayoria de las proteinas se eluyen a las menores concentraciones de acetonitrilo, ya que tales especies son las mas compactas con sus interiores hidrofobos protegidos de interacciones con la resina de fase inversa. Las especies agregadas se eluyen normalmente a mayores concentraciones de acetonitrilo. Ademas de separar las proteinas mal replegadas de la forma deseada, la etapa de la fase inversa tambien elimina las endotoxinas de las muestras.
[0345] Las fracciones que contienen el polipeptido TAT replegado deseado se reunen y el acetonitrilo se elimina con una corriente suave de nitrogeno dirigida a la disolucion. Las proteinas se formulan en HEPES 20 mM, pH 6,�, con cloruro de sodio 0,14 M y manitol al 4 % por dialisis o por filtracion en gel con una resina G25 Superfine (Pharmacia) equilibrada en el tampon de formulacion y filtrada esterilmente.
[0346] Algunos de los polipeptidos TAT desvelados en este documento se han expresado y purificado satisfactoriamente mediante esta(s) tecnica(s).
EJEMPLO 8: Expresi6n de TAT en cel�las de mam�feros
[0347] Este ejemplo ilustra la preparacion de una forma potencialmente glucosilada de TAT por expresion recombinante en celulas de mamiferos.
[0348] Como vector de expresion se emplea el vector pRK5 (vease el documento EP 307.247, publicado el 15 de marzo de 19 �9). Opcionalmente, el ADN de TAT se liga en pRK5 con enzimas de restriccion seleccionadas para permitir la insercion del ADN de TAT mediante procedimientos de ligacion como los descritos en Sambrook y col., cita anterior. El vector resultante se denomina pRK5-TAT.
[0349] En una realizacion, las celulas huesped seleccionadas pueden ser celulas 293. Las celulas 293 humanas (ATCC CCL 1573) se cultivan hasta crecimiento confluente en placas de cultivo de tejidos en un medio como DMEM complementado con suero bovino fetal y, opcionalmente, componentes nutricionales y/o antibioticos. Se mezclan aproximadamente 10 !g de ADN de pRK5-TAT con aproximadamente 1 !g de ADN que codifica el gen de ARN VA (Thimmappaya y col., Cell 31: 543 (19 �2)) y se disuelven en 500 !l de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl2 0,227 M. A la mezcla se anaden gota a gota 500 !l de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 2�0 mM, NaPO4 1,5 mM y se deja formar un precipitado durante 10 minutos a 25 'C. El precipitado se suspende y se anade a las celulas 293, que se dejan reposar durante aproximadamente cuatro horas a 37 'C. El medio de cultivo se retira por succion y se anaden 2 ml de glicerol al 20 % en PBS durante 30 segundos. Las celulas 293 se lavan despues con medio sin suero, se les anade medio fresco y se incuban durante aproximadamente cinco dias.
[0350] Aproximadamente 24 horas despues de las transfecciones, se retira el medio de cultivo y se sustituye por medio de cultivo (solo) o medio de cultivo con 200 !Ci/ml de 35S-cisteina y 200 pCi/ml de 35S-metionina. Despues de una incubacion de 12 horas, el medio acondicionado se recoge, se concentra en un filtro centrifugo y se carga en un gel con el 15 % de SDS. El gel procesado puede secarse y exponerse a una pelicula durante un periodo de tiempo seleccionado para revelar la presencia del polipeptido TAT. Los cultivos que contienen las celulas transfectadas pueden cultivarse adicionalmente (en medio sin suero) y el medio se analiza en bioensayos seleccionados.
[0351] En una tecnica alternativa, TAT puede introducirse en las celulas 293 de manera transitoria por el procedimiento del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 12: 7575 (19 �1). Las celulas 293 se cultivan hasta maxima densidad en un frasco agitador deflector y se anaden 700 !g del ADN de pRK5-TAT. Las celulas se concentran primeramente del frasco agitador deflector por centrifugacion y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba sobre el sedimento de celulas durante cuatro horas. Las celulas se tratan con glicerol al 20 % durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejidos y se reintroducen en el frasco agitador deflector que contiene medio de cultivo de tejidos, 5 !g/ml de insulina bovina y 0,1 !g/ml de transferrina bovina. Despues de aproximadamente cuatro dias, el medio acondicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las celulas y los residuos. Despues, la muestra que contiene el TAT expresado puede concentrarse y purificarse por cualquier procedimiento seleccionado, como dialisis y/o cromatografia en columna.
[0352] En otra realizacion, TAT puede expresarse en celulas CHO. El ADN de pRK5-TAT puede transfectarse en celulas CHO mediante reactivos conocidos como CaPO4 o DEAE-dextrano. Segun se describe anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse y el medio puede sustituirse por medio de cultivo (solo) o medio que contiene un radiomarcador como 35S-metionina. Despues de determinar la presencia del polipeptido TAT, el medio de cultivo puede sustituirse por medio sin suero. Preferentemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente seis dias y despues se recoge el medio acondicionado. El medio que contiene el TAT expresado puede concentrarse entonces y purificarse por cualquier procedimiento seleccionado.
[0353] Un TAT etiquetado con un epitopo tambien puede expresarse en celulas huesped CHO. TAT puede subclonarse fuera del vector pRK5. El inserto del subclon puede someterse a PCR para fusionarlo en fase con una etiqueta epitopica seleccionada, como una etiqueta de poli-his, en un vector de expresion de baculovirus. El inserto de TAT etiquetado con poli-his puede subclonarse despues en un vector bajo el control de SV40 con un marcador de seleccion como DHFR para la seleccion de clones estables. Finalmente, las celulas CHO pueden transfectarse (segun se describe anteriormente) con el vector bajo el control de SV40. Para verificar la expresion puede llevarse a cabo un marcado, segun se describe anteriormente. El medio de cultivo que contiene el TAT etiquetado con poli-his expresado puede concentrarse entonces y purificarse por cualquier procedimiento seleccionado, como cromatografia de afinidad por quelacion con Ni2+.
[0354] TAT puede expresarse tambien en celulas CHO y/o COS por un procedimiento de expresion transitoria
o en celulas CHO por otro procedimiento de expresion estable.
[0355] La expresion estable en celulas CHO se realiza mediante el siguiente procedimiento. Las proteinas se expresan como una construccion de IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias codificantes de las formas solubles (por ejemplo, dominios extracelulares) de las proteinas respectivas se fusionan con la secuencia de una region constante de IgG1 que contiene el dominio de bisagra y los dominios CH2 y CH2 y/o es una forma etiquetada con poli-his.
[0356] Despues de la amplificacion por PCR se subclonan los ADN respectivos en un vector de expresion de CHO mediante procedimientos estandar, segun se describe en Ausubel y col., Current Protocols of Molecular Biology, unidad 3.16, John Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresion en CHO se construyen para tener sitios de restriccion en los extremos 5' y 3' compatibles con el ADN de interes, para permitir el facil transporte de los ADNc. La expresion usada por el vector en las celulas CHO es segun se describe en Lucas y col., Nucl. Acids Res. 24(9): 1774-1779 (1996) y usa el promotor/potenciador temprano de SV40 para controlar la expresion del ADNc de interes y dihidrofolato-reductasa (DHFR). La expresion de DHFR permite la seleccion del mantenimiento estable del plasmido despues de la transfeccion.
[0357] Se introducen 12 !g del ADN del plasmido deseado en aproximadamente 10 millones de celulas CHO mediante los agentes de transfeccion disponibles comercialmente Superfect® (Qiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim). Las celulas se cultivan segun se describe en Lucas y col., cita anterior. Se congelan aproximadamente 3 x 107 celulas en una ampolla para el cultivo y produccion posterior segun se describe a continuacion.
[0358] Las ampollas que contienen el ADN plasmidico se descongelan en un bano de agua y se mezclan por agitacion con vortex. El contenido se pipetea a un tubo de centrifuga que contiene 10 ml de medio y se centrifuga a
1.000 rpm durante cinco minutos. El sobrenadante se retira por succion y las celulas se suspenden en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado por un diametro de poro de 0,2 !m con suero bovino fetal al 5 % diafiltrado por un diametro de poro de 0,2 !m). Las celulas se alicuotan despues en un agitador deflector de 100 ml que contiene 90 ml de medio selectivo. Despues de uno o dos dias, las celulas se transfieren a un agitador deflector de 200 ml que contiene150ml de mediodecultivoselectivoyseincuban a 37 'C.Despues deotrosdos-tres dias, sesiembran agitadores deflectores de 250 ml, 500 ml y 2.000 ml con 3 x 105 celulas/ml. El medio de las celulas se cambia por medio fresco por centrifugacion y suspension en el medio de produccion. Aunque puede emplearse cualquier medio para CHO adecuado, de hecho puede usarse un medio de produccion descrito en la patente de los EE. UU. n' 5.122.469, concedida el 16 de junio de 1992. Se siembra un agitador deflector de produccion de 3 l con 1,2 x 106 celulas/ml. En el dia 0, se determina el numero de celulas y el pH. En el dia 1, se toma una muestra del agitador deflector y se inicia el burbujeo con aire filtrado. En el dia 2, se toma una muestra del agitador deflector, la temperatura se varia a 33 'C y se anaden 30 ml de glucosa de 500 g/l y 0,6 ml de un antiespumante al 10 % (por ejemplo, una emulsion de polidimetilsiloxano al 35 %, Dow Coming 365 Medical Grade Emulsion). A lo largo de la produccion, el pH se ajusta segun sea necesario para mantenerlo a aproximadamente 7,2. Despues de 10 dias, o cuando la viabilidad ha disminuido por debajo del 70 %, el cultivo celular se recoge por centrifugacion y se filtra a traves de un filtro de 0,22 !m. El filtrado se almacena a 4 'C o se carga inmediatamente en columnas para su purificacion.
[0359] Para las construcciones etiquetadas con poli-his, las proteinas se purifican con una columna Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificacion, se anade imidazol al medio acondicionado hasta una concentracion de 5 mM. El medio acondicionado se bombea a una columna de 6 ml de Ni-NTA equilibrada en tampon HEPES 20 mM, pH 7,4 con NaCl0,3 Meimidazol 5mMcon una tasa de flujo de 4-5 ml/min a4 'C.Despues de cargarla, lacolumna se lava con mas tampon de equilibrado y la proteina se eluye con tampon de equilibrado con imidazol 0,25 M. La proteina altamente purificada se desala a continuacion en un tampon de almacenamiento con HEPES 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4 %, pH 6, �, con una columna G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml y se almacena a -�0 'C.
[0360] Las construcciones de inmunoadhesina (que contienen Fc) se purifican del medio acondicionado de la manera siguiente. El medio acondicionado se bombea a una columna con proteina A de 5 ml (Pharmacia) previamente equilibrada en tampon de fosfato de sodio 20 mM, pH 6,�. Despues de la carga, la columna se lava extensivamente con el tampon de equilibrado antes de la elucion con acido citrico 100 mM, pH 3,5. La proteina eluida se neutraliza inmediatamente por recogida de las fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 !l de tampon de Tris 1 M, pH 9. La proteina altamente purificada se desala a continuacion en un tampon de almacenamiento, segun se describe anteriormente para las proteinas etiquetadas con poli-his. La homogeneidad se evalua mediante geles de poliacrilamida con SDS y por secuenciacion aminoacidica N-terminal mediante la degradacion de Edman.
[0361] Algunos de los polipeptidos TAT desvelados en este documento se han expresado y purificado satisfactoriamente mediante esta(s) tecnica(s).
EJEMPLO 9: Expresi6n de TAT en le�ad�ras
[0362] El procedimiento siguiente describe la expresion recombinante de TAT en levaduras.
[0363] Primeramente, se construyen vectores de expresion en levaduras para la produccion intracelular o la secrecion de TAT a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica TAT y el promotor se insertan en sitios de enzimas de restriccion adecuados en el plasmido seleccionado para dirigir la expresion intracelular de TAT. Para la secrecion, el ADN que codifica TAT pueden clonarse en el plasmido seleccionado junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un peptido senal nativo u otro peptido senal de mamiferos o, por ejemplo, o una secuencia senal/lider secretora del factor a o de la invertasa de levaduras y secuencias enlazantes (en caso necesario) para la expresion de TAT.
[0364] Las celulas de levaduras, como la cepa AB110, pueden transformarse entonces con los plasmidos de expresion descritos anteriormente y cultivarse en medios de fermentacion seleccionados. Los sobrenadantes de las levaduras transformadas pueden analizarse por precipitacion con acido tricloroacetico al 10 % y separacion por SDS-PAGE, seguida de la tincion de los geles con el colorante azul de Coomassie.
[0365] El TAT recombinante puede aislarse y purificarse posteriormente mediante la eliminacion de las celulas de levadura del medio de fermentacion por centrifugacion y la concentracion del medio mediante filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene TAT puede purificarse adicionalmente mediante resinas para cromatografia en columna seleccionadas.
[0366] Algunos de los polipeptidos TAT desvelados en este documento se han expresado y purificado satisfactoriamente mediante esta(s) tecnica(s).
EJEMPLO 10: Expresi6n de TAT en cel�las de insectos infectadas con bac�lo�ir�s
[0367] El procedimiento siguiente describe la expresion recombinante de TAT en celulas de insectos infectadas con baculovirus.
[0368] La secuencia que codifica TAT se fusiona por delante de una etiqueta epitopica contenida en un vector de expresion de baculovirus. Tales etiquetas epitopicas incluyen etiquetas de poli-his y etiquetas de inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG). Pueden emplearse diversos plasmidos, incluidos plasmidos derivados de plasmidos disponibles comercialmente como pVL1393 (Novagen). Brevemente, la secuencia que codifica TAT o la porcion deseada de la secuencia codificante de TAT, como la secuencia que codifica un dominio extracelular de una proteina transmembranal o la secuencia que codifica la proteina madura si la proteina es extracelular, se amplifica por PCR con cebadores complementarios de las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios para enzimas de restriccion flanqueantes (seleccionados). El producto se digiere entonces con dichas enzimas de restriccion y se subclona en el vector de expresion.
[0369] Los baculovirus recombinantes se generan por cotransfeccion del plasmido anterior y el ADN virico BaculoGoldTM (Pharmingen) en celulas de Spodoptera frugiperda ('Sf9quot;) (ATCC CRL 1711) mediante lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Despues de cuatro-cinco dias de incubacion a 2 'C, los virus liberados se recogen y se usan para amplificaciones posteriores. La infeccion virica y la expresion de proteinas se llevan a cabo segun se describe en O'Reilley y col., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
[0370] El TAT etiquetado con poli-his expresado pude purificarse despues, por ejemplo, por cromatografia de afinidad por quelacion con Ni2+. Los extractos de las celulas Sf9 infectadas con los virus recombinantes se preparan segun se describe en Rupert y col., Nature 362: 175.179 (1993). Brevemente, las celulas SF9 se lavan, se resuspenden en tampon de sonicacion (HEPES 25 mM, pH 7,9, MgCl2 12,5 mM, EDTA 0,1 mM, glicerol al 10 %, NP40 al 0,1 %, KCl 0,4 M) y se someten a ultrasonidos dos veces durante 20 segundos en hielo. La suspension sometida a ultrasonidos se aclara por centrifugacion y el sobrenadante se diluye 50 veces en tampon de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10 %, pH 7, �) y se filtra a traves de un filtro de 0,45 !m. Se prepara una columna de agarosa con Ni2+-NTA (disponible comercialmente de Qiagen) con un volumen del lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml de tampon de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a una velocidad de 0,5 ml por minuto. La columna se lava hasta el valor de referencia de A2� 0 con tampon de carga, en cuyo momento se inicia la recogida de fracciones. A continuacion, la columna se lava con un tampon de lavado secundario (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10 %, pH 6,0) que eluye la proteina unida inespecificamente. Despues de volver a alcanzar el valor de referencia A2�0, la columna se desarrolla con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampon de lavado secundario. Se recogen fracciones de 1 ml y se analizan por SDS-PAGE y tincion con plata o por inmunotransferencia con Ni2+-NTA conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen TAT etiquetado con his10 eluido se reunen y se dializan frente al tampon de carga.
[0371] Alternativamente, la purificacion de TAT etiquetado con IgG (o etiquetado con Fc) puede realizarse mediante tecnicas cromatograficas conocidas, incluidas, por ejemplo, cromatografia en columna con proteina A o proteina G.
[0372] Algunos de los polipeptidos TAT desvelados en este documento se han expresado y purificado satisfactoriamente mediante esta(s) tecnica(s).
EJEMPLO 11: Preparaci6n de antic�erpos ��e se �nen a TAT
[0373] Este ejemplo ilustra la preparacion de anticuerpos monoclonales que pueden unirse especificamente a TAT.
[0374] Las tecnicas para la produccion de anticuerpos monoclonales se conocen en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Goding, cita anterior. Los inmunogenos que pueden emplearse incluyen TAT purificado, proteinas de fusion que contienen TAT y celulas que expresan TAT recombinante en la superficie celular. El experto en la tecnica puede llevar a cabo la seleccion del inmunogeno sin excesiva experimentacion.
[0375] Se inmunizan ratones, por ejemplo, BaIb/c, con el inmunogeno TAT emulsionado en adyuvante completo de Freund y se inyecta por via subcutanea o intraperitoneal en una cantidad de 1-100 !g. Alternativamente, el inmunogeno se emulsiona en el adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT, EE. UU.) y se inyecta en las almohadillas de las patas traseras del animal. A los10 a 12 despues, se administra un refuerzo a los ratones inmunizados con inmunogeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. Despues de lo cual, se siguen administrando inyecciones adicionales de refuerzo a los ratones durante varias semanas. Periodicamente se obtienen muestras de suero de los ratones por hemorragia retroorbital para su analisis en ensayos ELISA para detectar los anticuerpos dirigidos contra TAT.
[0376] Despues de que se ha detectado un titulo de anticuerpos adecuado, puede administrarse a los animales quot;positivosquot; para los anticuerpos una inyeccion intravenosa final de TAT. Tres o cuatro dias despues, los ratones se sacrifican y se recogen las celulas esplenicas. Las celulas esplenicas se fusionan (mediante polietilenglicol al 35 %) con una linea celular de mieloma murino seleccionada como P3X63AgU.1, disponible en la coleccion ATCC, n'CRL 1597. Las fusiones generan celulas de hibridoma que pueden sembrarse en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos que contienen el medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferacion de las celulas sin fusionar, hibridos de mieloma e hibridos de celulas esplenicas.
[0377] Las celulas de hibridoma se cribaran en un ensayo ELISA en cuanto a su reactividad contra TAT. La determinacion de celulas de hibridoma 'positivasquot; que secretan los anticuerpos monoclonales deseados dirigidos contra TAT esta dentro de los conocimientos de la tecnica.
[0378] Las celulas de hibridoma positivas pueden inyectarse por via intraperitoneal en ratones BaIb/c singenicos para producir liquido ascitico que contiene los anticuerpos monoclonales dirigidos contra TAT. Alternativamente, las celulas de hibridoma pueden cultivarse en frascos de cultivo de tejidos o en botellas rotativas. La purificacion de los anticuerpos monoclonales producidos en el liquido ascitico puede efectuarse mediante precipitacion con sulfato de amonio, seguida de cromatografia de exclusion en gel. Alternativamente, puede emplearse cromatografia de afinidad basada en la union del anticuerpo a la proteina A o la proteina G.
EJEMPLO 12: P�rificaci6n de polipeptidos TAT mediante antic�erpos espec�ficos
[0379] Los polipeptidos TAT nativos o recombinantes pueden purificarse por diversos procedimientos estandar en la tecnica de la purificacion de proteinas. Por ejemplo, un polipeptido pro-TAT, un polipeptido TAT maduro o un polipeptido pre-TAT se purifican por cromatografia de inmunoafinidad mediante antibioticos especificos para el polipeptido TAT de interes. En general, una columna de inmunoafinidad se construye por acoplamiento covalente del anticuerpo dirigido contra el polipeptido TAT con una resina de cromatografia activada.
[0380] Las inmunoglobulinas policlonales para antisueros se preparan por precipitacion con sulfato de amonio
o por purificacion sobre proteina A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ, EE. UU.). Igualmente, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de liquido ascitico de raton por precipitacion con sulfato de amonio o cromatografia sobre proteina A inmovilizada. Una inmunoglobulina parcialmente purificada se une covalentemente a una resina de cromatografia como SEPHAROSETM activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea y la resina derivada se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
[0381] Una columna de inmunoafinidad semejante se usa para la purificacion del polipeptido TAT mediante la preparacion de una fraccion a partir de celulas que contienen el polipeptido TAT en forma soluble. Esta preparacion se deriva por solubilizacion de la celula completa o de una fraccion subcelular obtenida por centrifugacion diferencial mediante la adicion de un detergente o por otros procedimientos bien conocidos en la tecnica. Alternativamente, un polipeptido TAT soluble que contiene una secuencia senal puede secretarse en una cantidad util al medio en el que se cultivan las celulas.
[0382] La preparacion que contiene el polipeptido TAT soluble se hace pasar a traves de la columna de inmunoafinidad y la columna se lava en condiciones que permiten la absorcion preferencial del polipeptido TAT (por ejemplo, tampones de alta fuerza ionica en presencia de detergente). Despues, la columna se eluye en condiciones que disocian la union entre el anticuerpo y el polipeptido TAT (por ejemplo, un tampon de pH bajo, como aproximadamente 2-3, o una alta concentracion de un agente caotropico como urea o un ion tiocianato) y el polipeptido TAT se recoge.
EJEMPLO 13: Ensavo de destr�cci6n de cel�las t�morales in vitro
[0383] Las celulas de mamiferos que expresan el polipeptido TAT de interes pueden obtenerse mediante vectores de expresion y tecnicas de clonacion estandar. Alternativamente, existen numerosas lineas de celulas tumorales que expresan polipeptidos TAT de interes, por ejemplo, en la coleccion ATCC, y pueden identificarse rutinariamente mediante analisis estandar por ELISA o FACS. Entonces, pueden emplearse anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipeptido TAT (y derivados de los mismos conjugados con toxinas) en ensayos para determinar la capacidad del anticuerpo para destruir celulas que expresan el polipeptido TAT in vitro.
[0384] Por ejemplo, se obtienen celulas que expresan el polipeptido TAT de interes segun se describe anteriormente y se distribuyen en placas de 96 pocillos. En un analisis, el conjugado anticuerpo/toxina (o el anticuerpo sin moleculas asociadas) se incluye en la incubacion de las celulas durante un periodo de cuatro dias. En un segundo analisis independiente, las celulas se incuban durante una hora con el conjugado anticuerpo/toxina (o el anticuerpo sin moleculas asociadas) y despues se lavan y se incuban en ausencia del conjugado anticuerpo/toxina durante un periodo de cuatro dias. Despues se mide la viabilidad de las celulas mediante el ensayo luminiscente de viabilidad celular CellTiter-Glo de Promega (n'de catalogo G7571). Las celulas sin tratar sirven como control negativo.
EJEMPLO 14: Ensavo de destr�cci6n de cel�las t�morales in vivo
[0385] Para analizar la eficacia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipeptido TAT, conjugados o sin conjugar, se inyecta un anticuerpo dirigido contra TAT por via intraperitoneal en ratones sin pelo 24 horas antes de recibir celulas promotoras de tumores por via subcutanea en la ijada. Las inyecciones del anticuerpo continuan dos veces por semana durante el resto del estudio. El volumen del tumor se mide dos veces por semana.
[0386] El cesionario de la presente solicitud esta de acuerdo en que si un cultivo de los materiales depositados muere, se pierde o se destruye al cultivarlo en las condiciones adecuadas, los materiales se sustituiran rapidamente por otros iguales al recibo de la notificacion. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una licencia para practicar la invencion en contravencion de los derechos garantizados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.
[0387] La anterior memoria descriptiva escrita se considera suficiente para permitir la practica de la invencion a un experto en la tecnica. La presente invencion no ha de limitarse en su alcance por la construccion depositada, ya que la realizacion depositada pretende ser solo una ilustracion de ciertos aspectos de la invencion y cualquier construccion funcionalmente equivalente se encuentra dentro del alcance de esta invencion. El deposito del material en este documento no constituye una admision de que la descripcion escrita contenida en este documento sea inadecuada para permitir la practica de cualquier aspecto de la invencion, incluido el mejor modo de la misma, ni ha de interpretarse como limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones especificas que representa. De hecho, diversas modificaciones de la invencion, ademas de las mostradas y descritas en este documento, seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la descripcion anterior y se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un conjugado de anticuerpo y farmaco que comprende un anticuerpo que se une al polipeptido antigenico diana asociado a tumores 193 (TAT193) de SEQ ID NO:62 para uso en un procedimiento de tratamiento
    o prevencion del cancer de mama, en que el procedimiento comprende la inhibicion del crecimiento de una celula tumoral de mama que expresa en exceso dicho polipeptido TAT193, en comparacion con una celula de mama no tumoral, en que el anticuerpo se selecciona del grupo que consta de anticuerpos dirigidos contra TAT193 y fragmentos de union a antigenos de los mismos, en que dicho anticuerpo dirigido contra TAT193 se conjuga con un maitansinoide, una caliqueamicina o un agente inhibidor del crecimiento que se selecciona del grupo que consta de inhibidores de topoisomerasa II, taxanos, agentes alquilantes de ADN, vincristina, etoposido, ara-C, doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, bleomicina, tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, paclitaxel y docetaxel.
  2. 2.
    Un conjugado de anticuerpo y farmaco que comprende un anticuerpo que se une al polipeptido antigenico diana asociado a tumores 193 (TAT193) de SEQ ID NO:62 para uso en un procedimiento de tratamiento de un tumor canceroso de mama que comprende celulas que expresan en exceso dicho polipeptido TAT193 en un mamifero, en comparacion con una celula de mama no tumoral, en que el anticuerpo se selecciona del grupo que consta de anticuerpos dirigidos contra TAT193 y fragmentos de union a antigenos de los mismos, en que dicho anticuerpo dirigido contra TAT193 se conjuga con un maitansinoide, una caliqueamicina o un agente inhibidor del crecimiento que se selecciona del grupo que consta de inhibidores de topoisomerasa II, taxanos, agentes alquilantes de ADN, vincristina, etoposido, ara-C, doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, bleomicina, tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, paclitaxel y docetaxel.
  3. 3.
    Un conjugado de anticuerpo y farmaco que comprende un anticuerpo que se une al polipeptido antigenico diana asociado a tumores 193 (TAT193) de SEQ ID NO:62 para uso en un procedimiento de prevencion o tratamiento de un trastorno proliferativo de mama asociado con un aumento de la expresion o la actividad de dicho polipeptido TAT193, en comparacion con una celula de mama normal, en que el anticuerpo se selecciona del grupo que consta de anticuerpos dirigidos contra TAT193 y fragmentos de union a antigenos de los mismos, en que dicho anticuerpo dirigido contra TAT193 se conjuga con un maitansinoide, una caliqueamicina o un agente inhibidor del crecimiento que se selecciona del grupo que consta de inhibidores de topoisomerasa II, taxanos, agentes alquilantes de ADN, vincristina, etoposido, ara-C, doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, bleomicina, tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, paclitaxel y docetaxel.
  4. 4.
    El conjugado de anticuerpo y farmaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso en un procedimiento de tratamiento o prevencion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el uso en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal dirigido contra TAT193.
  5. 5.
    El conjugado de anticuerpo y farmaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en un procedimiento de tratamiento o prevencion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en que dicho anticuerpo dirigido contra TAT193 se conjuga con un maitansinoide o una caliqueamicina.
  6. 6.
    Una composicion farmaceutica que comprende un conjugado de anticuerpo y farmaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso en un procedimiento de tratamiento de prevencion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en mezcla con un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
  7. 7.
    Un kit que comprende: (a) una composicion farmaceutica de la reivindicacion 6; y (b) un prospecto o etiqueta que indican un uso beneficioso para dicha composicion farmaceutica en el tratamiento del cancer de mama.
    �. Uso de un conjugado de anticuerpo y farmaco que comprende un anticuerpo que se une al polipeptido antigenico diana asociado a tumores 193 (TAT193) de SEQ ID NO:62 en la fabricacion de un medicamento para la inhibicion del crecimiento de una celula tumoral de mama que expresa en exceso dicho polipeptido TAT193, en comparacion con una celula de mama no tumoral, en que el anticuerpo se selecciona del grupo que consta de anticuerpos dirigidos contra TAT193 y fragmentos de union a antigenos de los mismos y en que dicho anticuerpo se conjuga con un maitansinoide, una caliqueamicina o un agente inhibidor del crecimiento que se selecciona del grupo que consta de inhibidores de topoisomerasa II, taxanos, agentes alquilantes de ADN, vincristina, etoposido, ara-C, doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, bleomicina, tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, paclitaxel y docetaxel.
  8. 9. Uso de un conjugado de anticuerpo y farmaco que comprende un anticuerpo que se une al polipeptido antigenico diana asociado a tumores 193 (TAT193) de SEQ ID NO:62 en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un tumor canceroso de mama que comprende celulas que expresan en exceso dicho polipeptido TAT193 en un mamifero, en comparacion con una celula de mama no cancerosa, en que el anticuerpo se selecciona del grupo que consta de anticuerpos dirigidos contra TAT193 y fragmentos de union a antigenos de los mismos y en
    5 que dicho anticuerpo se conjuga con un maitansinoide, una caliqueamicina o un agente inhibidor del crecimiento que se selecciona del grupo que consta de inhibidores de topoisomerasa II, taxanos, agentes alquilantes de ADN, vincristina, etoposido, ara-C, doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, bleomicina, tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, paclitaxel y docetaxel.
    10 10. Uso de un conjugado de anticuerpo y farmaco que comprende un anticuerpo que se une al polipeptido antigenico diana asociado a tumores 193 (TAT193) de SEQ ID NO:62 en la fabricacion de un medicamento para la prevencion o el tratamiento de un trastorno proliferativo de mama asociado con un aumento de la expresion o la actividad de dicho polipeptido TAT193, en comparacion con una celula de mama normal, en que el anticuerpo se selecciona del grupo que consta de anticuerpos dirigidos contra TAT193 y fragmentos de union a antigenos de los
    15 mismos y en que dicho anticuerpo se conjuga con un maitansinoide, una caliqueamicina o un agente inhibidor del crecimiento que se selecciona del grupo que consta de inhibidores de topoisomerasa II, taxanos, agentes alquilantes de ADN, vincristina, etoposido, ara-C, doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, bleomicina, tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, paclitaxel y docetaxel.
    20 11. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones a 10, en que el conjugado de anticuerpo y farmaco que comprende un anticuerpo dirigido contra TAT193 es segun se define en las reivindicaciones 4 o 5.
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