ES2342477T3 - Composiciones y metodos para el diagnostico y el tratamiento de un tumor. - Google Patents

Composiciones y metodos para el diagnostico y el tratamiento de un tumor. Download PDF

Info

Publication number
ES2342477T3
ES2342477T3 ES05795139T ES05795139T ES2342477T3 ES 2342477 T3 ES2342477 T3 ES 2342477T3 ES 05795139 T ES05795139 T ES 05795139T ES 05795139 T ES05795139 T ES 05795139T ES 2342477 T3 ES2342477 T3 ES 2342477T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
tat
cell
polypeptide
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES05795139T
Other languages
English (en)
Inventor
Belinda Cairns
Ruihuan Chen
Anan Chuntharapai
Gretchen Frantz
Kenneth Hillan
Kartmut Koeppen
Heidi Phillips
Paul Polakis
Chae Janeka Reed
Chie Sakanaka
Victoria Smith
Susan Spencer
P. Mickey Williams
Thomas Wu
Zemin Zhang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2342477T3 publication Critical patent/ES2342477T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6839—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting material from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1006—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody the antibody being against or targeting material from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1018—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • C07K16/1072—Regulatory proteins, e.g. tat, rev, vpt
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)

Abstract

Anticuerpo aislado producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste en 3B5.1 (ATCC Acceso No. PTA-6193), 12B9.1 (ATCC Acceso No. PTA-6194) y 12G12.1 (ATCC Acceso No. PTA-6195).

Description

Composiciones y métodos para el diagnóstico y el tratamiento de un tumor.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones de materia para su uso en el diagnóstico y el tratamiento de tumor en mamíferos y a métodos de utilización de estas composiciones de materia para los mismos.
Antecedentes de la invención
Los tumores malignos (cánceres) son la segunda causa de muerte en los Estados Unidos, después de las enfermedades del corazón (Boring et al., CA Cancer J Clin., 43:7 [(1993]). El cáncer se caracteriza por el incremento en el número de células anormales, o neoplásicas, derivadas de un tejido normal que proliferan para formar una masa tumoral, la invasión de tejidos adyacentes por estas células tumorales neoplásicas, y la generación de células malignas que finalmente se extienden a través de la sangre o el sistema linfático hasta nódulos linfáticos regionales y hasta puntos distantes a través de un proceso denominado metástasis. En un estado canceroso, una célula prolifera bajo condiciones en las que no crecerían células normales. El cáncer se manifiesta en una gran variedad de formas, caracterizadas por diferentes grados de invasión y agresividad.
En los intentos por descubrir dianas celulares eficaces para el diagnostico y la terapia contra el cáncer, los investigadores han buscado identificar polipéptidos transmembrana u otros polipéptidos asociados a membranas que se expresan específicamente en la superficie de uno o más tipos particulares de células cancerosas en comparación con una o más células no cancerosas normales. A menudo, dichos polipéptidos asociados a membrana se expresan de manera más abundante en la superficie de las células cancerosas en comparación con la superficie de las células no cancerosas. La identificación de dichos polipéptidos antígenos de la superficie celular asociados a tumores ha proporcionado la capacidad de reconocer específicamente células cancerosas para la destrucción a través de terapias basadas en anticuerpos. En este aspecto, cabe indicar que la terapia basada en anticuerpos se ha demostrado muy eficaz en el tratamiento de ciertos cánceres. Por ejemplo, HERCEPTIN® y RITUXAN® (ambas de Genentech Inc, South San Francisco, California) son anticuerpos que se han utilizado satisfactoriamente para tratar el cáncer de mama y el linfoma de no Hodgkin, respectivamente. Más específicamente, HERCEPTIN® es un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se une selectivamente al dominio extracelular del protooncogén del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2). Se observa la sobreexpresión de la proteína HER2 en el 25-30% de cánceres de mama primarios. RITUXAN® es un anticuerpo monoclonal murino/humano quimérico modificado genéticamente dirigido contra el antígeno CD20 hallado en la superficie de linfocitos B normales y malignos. Estos anticuerpos se producen recombinantemente en células CHO.
En otros intentos por descubrir dianas celulares eficaces para el diagnostico y la terapia contra el cáncer, los investigadores han buscado identificar (1) polipéptidos no asociados a membrana que son producidos específicamente por uno o más tipos particulares de células cancerosas en comparación a por uno o más tipos particulares de células normales no cancerosas, (2) polipéptidos que son producidos por células cancerosas en un nivel de expresión que es significativamente más elevado que el de una o más células normales no cancerosas, o (3) polipéptidos cuya expresión está limitada específicamente a sólo un tipo de tejido (o a un número muy limitado de diferentes tejidos) tanto en estado canceroso como no canceroso (por ejemplo, tejido de próstata normal y de tumor de próstata). Dichos polipéptidos pueden permanecer localizadas intracelularmente o se puede secretar por la célula cancerosa. Además, dichos polipéptidos pueden expresarse no por la propia célula cancerosa, sino por células que producen y/o secretan polipéptidos que tienen un efecto potenciador o un efecto de aumento del crecimiento en células cancerosas. Dichos polipéptidos secretados son a menudo proteínas que proporcionan células cancerosas con una ventaja de crecimiento sobre las células normales e incluyen cosas, tales como factores angiogénicos, factores de adhesión celular, factores de crecimiento, y similares. Se esperaría que la identificación de antagonistas de dichos polipéptidos no asociados a membrana sirviera como agentes terapéuticos eficaces para el tratamiento de dichos cánceres. Además, la identificación del patrón de expresión de dichos polipéptidos sería útil para el diagnóstico y el tratamiento de cánceres particulares en mamíferos. La capacidad de modular la expresión génica en un mamífero es aún difícil. Habitualmente, se ha realizado utilizando herramientas, tales como vectores virales que expresarán un polipéptido donde falta el huésped. La capacidad de introducir un vector viral en un huésped que reducirá la expresión génica no se ha perfeccionado. La represión de la expresión génica se ha realizado habitualmente en mamíferos en un modo "knockout", donde en el mamífero de prueba, habitualmente un ratón, se extirpa o "knock out" el gen a través de la técnica de recombinación homóloga. Esta técnica en ratones es lenta, laboriosa y difícil, y no es práctica en humanos. Por lo tanto, los solicitantes se centraron en un sistema de vectores que expresarán un ARN de interferencia (siARN) para rducir la expresión génica.
Se ha demostrado que los siARN son una herramienta útil en estudios de modulación de la expresión génica donde no han triunfado los antagonistas tradicionales, tales como moléculas pequeñas o anticuerpos (Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003)). Los ARN de doble cadena sintetizados in vitro que tienen de 21 a 23 nucleótidos de longitud pueden actuar como ARN de interferencia (ARNi) y pueden inhibir específicamente la expresión génica (Fire A., Trends in Genetics 391; 806-810 (1999)). Estos ARNi actúan mediando en la degradación de sus ARN diana. Dado que tienen menos de 30 nucleótidos de longitud, sin embargo, no desencadenan un mecanismo de defensa antiviral celular. Dichos mecanismso incluyen la producción de interferones, y la paralización general de la síntesis de proteínas de las células huésped. En la práctica, los siARN se pueden sintetizar y, a continuación, clonar en vectores de ADN. Dichos vectores se pueden transfectar y producir para expresar el siARN a niveles elevados y/o de una manera específica de tejido. El nivel elevado de expresión de siARN se utiliza para "knockdown" o reducir significativamente la cantidad de proteína producida en una célula y, de este modo, es útil en experimentos en los que se cree que la sobreexpresión de una proteína está unida a trastornos, tales como el cáncer. A pesar de los avances en la terapia contra el cáncer en mamíferos, existe una gran necesidad para agentes terapéuticos capaces de inhibir de manera eficaz el crecimiento de células neoplásicas a través de la reducción de la expresión génica. Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es identificar un sistema que modulará la expresión génica.
La mejora de la liberación de fármacos y otros agentes o células diana, tejidos y tumores para conseguir la máxima eficacia y la mínima toxicidad ha sido el foco de una investigación considerable durante muchos años. A pesar de que se han realizado muchos intentos por desarrollar métodos eficaces para importar moléculas biológicamente activas en células, tanto in vivo como in vitro, ninguno ha demostrado ser completamente satisfactorio. La optimización de la asociación del fármaco con su diana intracelular, minimizando la redistribución intercelular del fármaco, por ejemplo, a células vecinas, es a menudo difícil o ineficiente.
La mayoría de agentes administrados actualmente a un paciente parenteralmente no están dirigidos, dando lugar a una liberación sistémica del agente a las células y tejidos del cuerpo donde no son necesarios, y a menudo, son indeseables. Esto puede dar lugar a efectos secundarios adversos del fármaco y, a menudo, limita la dosis que se puede administrar de un fármaco (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos (anti-cancerosos), citotóxicos, inhibidores de enzimas o fármacos antimicrobianos), Mediante comparación, aunque se considera que la administración oral de fármacos es un modo conveniente y económico de administración, comparte las mismos problemas de toxicidad no específica a las células no afectadas una vez el fármaco ha sido absorbido en la circulación sistémica. Otras complicaciones implican problemas con la biodisponibilidad oral y la residencia de fármaco en el intestino que conduce a una exposición adicional del intestino al fármaco y, por tanto, riesgo de toxicidades en el intestino. Por consiguiente, un objetivo principal ha sido desarrollar métodos para dirigir específicamente agentes a células y tejidos. Las ventajas de dicho tratamiento incluyen evitar los efectos fisiológicos generales de liberación inapropiada de dichos agentes a otras células y tejidos, tales como células no afectadas. El reconocimiento intracelular se puede conseguir mediante métodos, compuestos y formulaciones que permiten la acumulación o retención de agentes biológicamente activos, es decir, metabolitos activos, en el interior de las células.
Se ha establecido la terapia con anticuerpos monoclonales para el tratamiento dirigido de pacientes con cáncer, trastornos inmunológicos y angiogénicos.
Existe un conjunto de toxinas disponibles. Por ejemplo, los péptidos de auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, se conjugaron a: (i) anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos a Lewis Y en carcinomas); (ii) cAC10 que es específico para CD30 en tumores hematológicos (Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773; Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"; Francisco et al (2003) Blood 102(4):1458-1465; US 2004/0018194; (iii) anticuerpos anti-CD20, tales como rituxan (WO 04/032828) para el tratamiento de cánceres que expresan CD20 y trastornos inmunes; (iv) anticuerpos anti-EphB2 2H9 y anti-IL-8 para el tratamiento del cáncer colorrectal (Mao, et al (2004) Cancer Research 64(3):781-788); (v) anticuerpo E-selectina (Bhaskar et al (2003) Cancer Res. 63:6387-6394); y (vi) otros anticuerpos anti-CD30 (WO 03/043583). También se ha conjugado la monometilauristatina (MMAE) a 2H9, un anticuerpo contra EphB2R, que es un receptor tirosina quinasa TM de tipo 1 con una homología próxima entre ratón y humano, y se sobreexpresa en células de cáncer colorrectal (Mao et al (2004) Cancer Res. 64:781-788).
Se ha descrito que la monometilauristatina MMAF, una variante de auristatina E (MMAE) con una fenilalanina en el extremo C-terminal (US 5767237; US6124431), es menos potente que MMAE, pero más potente cuando se conjuga a anticuerpos monoclonales (Senter et al, Proceedings fo the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, presentado el 28 de marzo de 2004). La auritatina F fenilen diamina (AFP); una variante de fenilalanina de MMAE se unió a un mAb anti-CD70, 1F6, a través del extremo C-terminal de 1F6 mediante un espaciador de fenilen diamina (Law et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 625, presentado el 28 de marzo de 2004).
A pesar de los avances identificados anteriormente en la terapia del cáncer de mamífero, existe una gran necesidad para agentes de diagnóstico y terapéuticos adicionales capaces de detectar la presencia de un tumor en un mamífero y para inhibir de manera eficaz el crecimiento de células neoplásicas, respectivamente. Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es identificar: (1) polipéptidos asociados a la membrana celular que se expresan de manera más abundante en uno o más tipos de células cancerosas en comparación con células normales o en otras células cancerosas diferentes, (2) polipéptidos no asociados a membrana que son producidos específicamente por uno o más tipos particulares de células de cáncer (o por otras células que producen polipéptidos que tienen un efecto potenciador en el crecimiento de células cancerosas) en comparación con por uno o más tipos particulares de células normales no cancerosas, (3) polipéptidos no asociados a membrana que son producidos por células cancerosas en un nivel de expresión que es significativamente superior que el de una o más células no cancerosas normales, o (4) polipéptidos, cuya expresión está específicamente limitada a sólo un único (o un número muy limitado) de tipos de tejidos diferentes tanto en estado canceroso como no canceroso (por ejemplo, tejido de próstata normal y tumor de próstata), y al uso de estos polipéptidos, y sus ácido nucleicos codificantes, para producir composiciones de materia útiles en el tratamiento terapéutico y la detección diagnóstica de cáncer en mamíferos. También es un objetivo de la presente invención identificar polipéptidos asociados a membrana celular, secretados o intracelular, cuya expresión está limitada a un único tejido o un número muy limitado de los mismos, y utilizar estos polipéptidos y sus ácidos nucleicos codificantes, para producir composiciones de materia útiles en el tratamiento terapéutico y la detección diagnóstica del cáncer en mamíferos.
WO 03/000 113 A, Mannion et al (1998) J. Biol. Chem. 273 pp 33127-33129 y EP-A-111 048 describen polipéptidos con la secuencia de TAT188, descrito aquí, y anticuerpos para los mismos.
Descripción resumida de la invención A. Realizaciones
En la presente memoria, los solicitantes describen por primera vez la identificación de varios polipéptidos celulares (y sus ácidos nucleicos codificantes o fragmentos de los mismos) que son expresados en mayor grado en la superficie de o por uno o más tipos de células cancerosas en comparación con la superficie de o por una o más tipos de células no cancerosas normales. Alternativamente, dichos polipéptidos son expresados por células que producen y/o secretan polipéptidos que tienen un efecto potenciador o aumentador del crecimiento en células cancerosas. De nuevo, alternativamente, dichos polipéptidos pueden no ser sobreexpresados por células tumorales en comparación con células normales del mismo tipo de tejido, sino que más bien pueden ser expresados específicamente tanto por células tumorales como por células normales de sólo un tipo de tejido o un número muy limitado de tejidos (preferiblemente tejidos que no son esenciales para la vida, por ejemplo, la próstata, etc.). Todos los polipéptidos anteriores se refieren aquí como polipéptidos antigénicos diana asociados a tumores (polipéptidos "TAT") y se espera que sirvan como dianas eficaces para la terapia y el diagnóstico contra el cáncer en mamíferos.
Por consiguiente, se describe aquí una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido antigénico diana asociado a tumores o fragmento del mismo (un polipéptido "TAT").
En ciertos aspectos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos con (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido TAT de longitud completa que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se describe aquí, una secuencia de aminoácidos del polipéptido TAT que carece del péptido señal tal como se describe aquí, un dominio extracelular de un polipéptido TAT transmembrana, con o sin el péptido señal, tal como se describe aquí o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAT de longitud completa tal como se describe aquí, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).
En otros aspectos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, con (a) una molécula de ADN que comprende la secuencia codificante de un ADNc del polipéptido TAT de longitud completa tal como se describe aquí, la secuencia codificante de un polipéptido TAT que carece del péptido señal tal como se describe aquí, la secuencia codificante de un dominio extracelular de un polipéptido TAT transmembrana, con o sin el péptido señal, tal como se describe aquí o la secuencia codificante de cualquier otro fragmento específicamente definido de la secuencia de aminoácidos del polipéptido TAT de longitud completa tal como se describe aquí o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).
También se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos con (a) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por la región codificante de longitud completa de cualquiera de los ADNcs de proteína humana depositados con la ATCC tal como se describe aquí, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).
También se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido TAT que presenta el dominio transmembrana eliminado o inactivado, o es complementaria a dicha secuencia de nucleótidos codificante, donde el dominio o dominios transmembrana de dicho polipéptido o polipéptidos se describen aquí. Por lo tanto, se contemplan los dominios extracelulares solubles de los polipéptidos TAT descritos aquí.
También se describen moléculas de ácido nucleico aisladas que se hibridan a (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido TAT que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa tal como se describe aquí, una secuencia de aminoácidos del polipéptido TAT que carece del péptido señal tal como se describe aquí, un dominio extracelular de un polipéptido TAT transmenbrana, con o sin el péptido señal, tal como se describe aquí, o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de aminoácidos del polipéptido TAT de longitud completa tal como se describe aquí, o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a). Los fragmentos de una secuencia codificante del polipéptido TAT de longitud completa, o el complemento de la misma, tal como se describe aquí, pueden ser útiles como, por ejemplo, sondas de hibridación útiles como, por ejemplo, sondas de detección, sondas de oligonucleótidos no codificante, o para codificar fragmentos de un polipéptido TAT de longitud completa que pueden codificar opcionalmente un polipéptido que comprende un sitio de unión para un anticuerpo anti-polipéptido TAT, un oligopéptido de unión a TAT u otra molécula orgánica pequeña que se une a un polipéptido TAT. Dichos fragmentos de ácidos nucleicos tienen normalmente por lo menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 83, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, ó 1000 nucleótidos de longitud, donde en este contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de la secuencia de nucleótidos referenciada más o menos un 10% de la longitud referenciada. Cabe indicar que se pueden determinar fragmentos novedosos de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido TAT de manera rutinaria mediante la alineación de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido TAT con otras secuencias de nucleótidos conocidas utilizando cualquiera de un conjunto de programas de alineación de secuencias bien conocidos y determinando qué fragmento o fragmentos de la secuencia de nucleótidos que codifican el polipéptido TAT son nuevos. Se contemplan en la presente invención todos estos fragmentos nuevos de secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido TAT. También se contemplan los fragmentos de polipéptido TAT codificados por estos fragmentos de moléculas nucleótidos, preferiblemente aquellos fragmentos de polipéptido TAT que comprenden un sitio de unión por un anticuerpo anti-TAT, un oligopéptido de unión a TAT u otra molécula orgánica pequeña que se une a un polipéptido
TAT.
También se describen polipéptidos TAT aislados codificados por cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos aislados identificadas anteriormente aquí, que incluyen un polipéptido TAT aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de identidad en la secuencia de aminoácidos, con un polipéptido TAT que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa tal como se describe aquí, una secuencia de aminoácidos del polipéptido TAT que carece del péptido señal tal como se describe aquí, un dominio extracelular de una proteína polipéptido TAT transmembrana, con o sin el péptido señal, tal como se describe aquí, una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas aquí o cualquier otro fragmento de específicamente definido de una secuencia de aminoácidos del polipéptido TAT de longitud completa tal como se describe aquí; un polipéptido TAT aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos, con una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los ADNcs de proteína humana depositados con la ATCC tal como se describe aquí, y un polipéptido TAT aislado sin la secuencia señal N-terminal y/o sin la metionina de iniciación y está codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica dicha secuencia de aminoácidos descrita anteriormente en la presente invención. Los procesos para producir el mismo también se describen en la presente invención, donde estos procesos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico codificante apropiada en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido TAT y recuperar el polipéptido TAT del cultivo celular.
También se describe un polipéptido TAT aislado que presenta el dominio transmembrana eliminado o inactivado. Los procesos para producir el mismo también se describen aquí, donde estos procesos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico codificante apropiada en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido TAT y recuperar el polipéptido TAT del cultivo celular.
También se describen además vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos descritos aquí. También se proporcionan las células huésped que comprenden cualquiera de dichos vectores. A modo de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, células E. coli, o células de levadura. Se proporciona también un proceso para producir cualquiera de los polipéptidos descritos aquí y comprende cultivar las células huésped en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y recuperar el polipéptido deseado del cultivo celular.
También se describen polipéptidos quiméricos aislados que comprende cualquiera de los polipéptidos TAT descritos aquí fusionados a un polipéptido heterólogo (no TAT). Ejemplos de dichas moléculas quiméricas comprenden cualquiera de los polipéptidos TAT descritos aquí fusionados a un polipéptido heterólogo, tal como, por ejemplo, una secuencia epítopo etiqueta o una región Fc de una inmunoglobulina.
En otra realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une, preferiblemente específicamente, a cualquiera de los polipéptidos descritos anterior o posteriormente tal como se definen en las reivindicaciones. El anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo anti-polipéptido TAT a su respectivo epítopo antigénico. Los anticuerpos de la presente invención se pueden conjugar opcionalmente a un agente inhibidor del crecimiento o un agente citotóxico, tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maitansinoide o caliqueamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o similar. Los anticuerpos de la presente invención se pueden producir opcionalmente en células CHO o células bacterianas y preferiblemente inducen la muerte de una célula a la que se unen. Para fines de diagnóstico, los anticuerpos de la presente invención se pueden marcar para su detección, unirse a un soporte sólido o similar.
En otra realización de la presente invención que comprende el anticuerpo conjugado a una citotoxina, la toxina se puede seleccionar de cualquiera de las toxinas conocidas en la técnica. En una realización, la toxina está unida al anticuerpo por en péptido o péptidomimético enlazador. En una realización, la toxina está unida al anticuerpo a través de un enlazador que comprende valina-citrulina (-vc-). En una realización, la toxina es MMAB. En una realización, la toxina es MMAB. En una realización, a toxina es un péptido auristatina.
En otras realizaciones de la presente invención, la presente invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos descritos aquí. También se proporcionan las células huésped que comprenden cualquiera de dichos vectores. A modo de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, células E. coli, o células de levadura. Se proporciona también un proceso para producir cualquiera de los polipéptidos descritos aquí y comprende cultivar las células huésped en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo deseado y recuperar el polipéptido deseado del cultivo celular.
También se describen aquí oligopéptidos ("oligopéptidos de unión a TAT") que se unen, preferiblemente específicamente, a cualquiera de los polipéptidos TAT descritos anterior o posteriormente. Opcionalmente, los oligopéptidos de unión a TAT se pueden conjugar a un agente inhibidor del crecimiento o un agente citotóxico, tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maitansinoide o una caliqueamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica, o similar. Los oligopéptidos de unión a TAT se pueden producir opcionalmente en células CHO o células bacterianas e inducen preferiblemente la muerte de una célula a la que se unen. Para fines de diagnóstico, los oligopéptidos de unión a TAT se pueden marcar para su detección, unirse a un soporte sólido, o similar.
También se describen vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los oligopéptidos de unión a TAT descritos aquí. También se proporciona la célula huésped que comprende cualquiera de dichos vectores. A modo de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, células E. coli, o células de levadura. También se describe un proceso para producir cualquiera de los oligopéptidos de unión a TAT descritos aquí y comprende cultivar células huésped en condiciones adecuadas para la expresión del oligopéptido deseado y recuperar el oligopéptido deseado del cultivo celular.
También se describen moléculas orgánicas pequeñas ("moléculas orgánicas de unión a TAT") que se unen, preferiblemente específicamente, a cualquiera de los polipéptidos TAT descritos anterior o posteriormente. Opcionalmente, las moléculas orgánicas de unión a TAT se pueden conjugar a un agente inhibidor del crecimiento o un agente citotóxico, tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maitansinoide o una caliqueamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica, o similar. Las moléculas orgánicas de unión a TAT inducen preferiblemente la muerte de una célula a la que se unen. Para fines de diagnóstico, las moléculas orgánicas de unión a TAT se pueden marcar para su detección, unirse a un soporte sólido, o similar.
En una realización adicional, la presente invención se refiere a una composición de materia que comprende un anticuerpo anti-TAT tal como se define en las reivindicaciones en combinación con un portador. Opcionalmente, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable.
En una realización adicional, la presente invención se refiere a una composición de materia que comprende un anticuerpo anti-TAT tal como se define en las reivindicaciones en combinación con un portador. Opcionalmente, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. Específicamente, el polipéptido TAT es TAT188, también referido aquí como E16 o como TAT188 (E16). El anticuerpo anti-TAT188 (también referido como anti-E16 o anti-TAT 188 (E16)) de una realización de la presente invención incluye sin limitación 3B5, 12B9 y 12G12, tal como se describen aquí.
En otra realización, la presente invención se refiere a un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición de materia contenida en el recipiente, donde la composición de materia comprende un anticuerpo anti-TAT tal como se define en las reivindicaciones. El artículo puede comprender opcionalmente un marcador fijado al recipiente, o un prospecto incluido en el recipiente, que se refiere al uso de la composición de materia para el tratamiento terapéutico o la detección diagnóstica de un tumor.
Otra realización de la presente invención se dirige al uso de un anticuerpo anti-polipéptido TAT tal como se define en las reivindicaciones para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una patología que es sensible al anticuerpo anti-polipéptido TAT.
B. Realizaciones adicionales
Otra realización de la presente invención se dirige a un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa un polipéptio TAT, donde el método comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo que se une al polipéptido TAT tal como se define en las reivindicaciones, y donde la unión del anticuerpo al polipéptido TAT provoca la inhibición del crecimiento de la célula que expresa el polipéptido TAT. En realizaciones preferidas, la célula es una célula cancerosa y la unión del anticuerpo al polipéptido TAT provoca la muerte de la célula que expresa el polipéptido TAT. Los anticuerpos utilizados en los métodos de la presente invención se pueden conjugar opcionalmente a un agente inhibidor del crecimiento o un agente citotóxico, tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maitansinoide o caliqueamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o similar. Los anticuerpos y oligopéptidos de unión a TAT utilizados en los métodos de la presente invención se pueden producir opcionalmente en células CHO o células bacterianas.
Otra realización de la presente invención se dirige a un método para tratar terapéuticamente un mamífero que tiene un tumor canceroso que comprende células que expresan un polipéptido TAT, donde el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo tal como se define en las reivindicaciones que se une al polipéptido TAT, dando lugar así a un tratamiento terapéutico eficaz del tumor. Los anticuerpos utilizados en los métodos de la presente invención se pueden conjugar opcionalmente a un agente inhibidor del crecimiento o un agente citotóxico, tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maitansinoide o caliqueamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o similar. Los anticuerpos y oligopéptidos utilizados en los métodos de la presente invención se pueden producir opcionalmente en células CHO o células bacterianas.
Otra realización de la presente invención se dirige a un método para determinar la presencia de un polipéptido TAT en una muestra sospechosa de contener el polipéptido TAT, donde el método comprende exponer la muestra a un anticuerpo tal como se define en las reivindicaciones que se une al polipéptido TAT y determinar la unión del anticuerpo al polipéptido TAT en la muestra, donde la presencia de dicha unión es indicativa de la presencia del polipéptido TAT en la muestra. Opcionalmente, la muestra puede contener células (que pueden ser células cancerosas) sospechosas de expresar el polipéptido TAT. El anticuerpo utilizado en el método opcionalmente se puede marcar para su detección, unirse a un soporte sólido, o similar.
Una realización adicional de la presente invención se dirige a un método de diagnóstico de la presencia de un tumor en un mamífero, donde el método comprende utilizar un anticuerpo tal como se define en las reivindicaciones para detectar el nivel de expresión de un gen que codifica un polipépotido TAT (a) en una muestra de prueba de células de tejido obtenidas de dicho mamífero, y (b) en una muestra de control de células no cancerosas normales conocidos del mismo origen o tipo de tejido, donde un nivel de expresión del polipéptido TAT más elevado en la muestra de prueba, en comparación con la muestra de control, es indicativo de la presencia de un tumor en el mamífero del que se obtuvo la muestra de prueba.
Otra realización de la presente se dirige a un método de diagnóstico de la presencia de un tumor en un mamífero, donde el método comprende (a) poner en contacto una muestra de prueba que comprende células de tejido obtenidas del mamífero con un anticuerpo tal como se define en las reivindicaciones y (b) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo y el polipéptido TAT en la muestra de prueba, donde la formación de un complejo es indicativo de la presencia de un tumor en el mamífero. Opcionalmente, el anticuerpo utilizado se puede marcar para su detección, unirse a un soporte sólido, o similar, y/o la muestra de prueba de células de tejido se obtiene de un individuo sospechoso de tener un tumor canceroso.
Otra realización de la presente invención se dirige a un método de tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo de células asociado con una expresión o actividad alterada, preferiblemente incrementada, de un polipéptido TAT, comprendiendo el método administrar a aun sujeto con necesidad de dicho tratamiento de una cantidad eficaz e un antagonista de un polipérptido TAT, donde el antagonista del polipéptido TAT es un anticuerpo anti-polipéptido TAT tal como se define en las reivindicaciones. El tratamiento o prevención eficaz del trastorno proliferativo de células puede ser resultado de la citólisis directa o la inhibición del crecimiento de células que expresan un polipéptido TAT o mediante la antagonización de la actividad potenciadora del crecimiento celular de un polipéptio
TAT.
Otras realizaciones de la presente invención están dirigidas a uso de un anticuerpo anti-polipéptido TAT tal como se define en las reivindicaciones en la preparación de un medicamento útil para (i) el tratamiento terapéutico o la detección diagnóstica de un cáncer o tumor, o (ii) el tratamiento o prevención terapéutica de un trastorno proliferativo de células.
Otra realización de la presente invención se dirige a un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa, donde el crecimiento de dicha célula cancerosa es por lo menos en parte dependiente del efecto o efectos potenciadores del crecimiento de un polipéptido TAT (donde el polipéptido TAT puede ser expresado por la propia célula cancerosa o una célula que produce el polipéptido o polipéptidos que tienen un efecto potenciador del crecimiento en células cancerosas), donde el método comprende poner en contacto el polipéptido TAT con un anticuerpo que se une al polipéptido TAT tal como se define en las reivindicaciones antagonizando así la actividad potenciadora del crecimiento del polipéptido TAT y, a su vez, inhibiendo el crecimiento de la célula cancerosa. Preferiblemente, el crecimiento de la célula cancerosa se inhibe completamente. Más preferiblemente, la unión del anticuerpo al polipéptio TAT induce la muerte de la célula cancerosa. Los anticuerpos utilizados en los métodos de la presente invención se pueden conjugar opcionalmente a un agente inhibidor del crecimiento o un agente citotóxico, tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maitansinoide o caliqueamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o similar. Los anticuerpos utilizados en los métodos de la presente invención se pueden producir opcionalmente en células CHO o células bacterianas.
Otra realización de la presente invención se dirige a un método de tratamiento terapéutico de un tumor en un mamífero, donde el crecimiento de dicho tumor es por lo menos en parte dependiente del efecto o efectos potenciadores del crecimiento de un polipéptido TAT, donde el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que se une al polipéptido TAT tal como se define en las reivindicaciones, antagonizando así la actividad potenciadora del crecimiento de dicho polipéptido TAT y dando lugar al tratamiento terapéutico eficaz del tumor. Los anticuerpos utilizados en el método de la presente invención se pueden conjugar opcionalmente a un agente inhibidor del crecimiento o un agente citotóxico, tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maitansinoide o caliqueamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o similar. Los anticuerpos utilizados en los métodos de la presente invención se pueden producir opcionalmente en células CHO o células bacterianas.
Otras realizaciones adicionales de la presente invención serán evidentes para el experto en la materia tras una lectura de la presente memoria.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID NO:37) de un ADNc de TAT188, al que se refiere aquí como "TAT", donde la SEC ID NO:37 es un clon designado aquí como "DNA237637".
La Figura 2 muestra una secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 115) derivada de la secuencia codificante de SEC ID NO:37 mostrada en la Figura 1.
La Figura 3 es un diagrama que representa la estructura tridimensional del polipéptido E16 (TAT188) como una subunidad del transportador de aminoácidos neutros grandes independiente de iones sodio.
La Figura 4 muestra los resultados gráficos de representaciones FACS que demuestran la unión de anticuerpos anti-TAT188 (anti-B16) a la superficie celular de PC3 (representación en verde) y la reducción en la unión con reducción en la expresión de TAT188 (representación en rojo).
La Figura 5 muestra la internalización de anticuerpo anti-TAT188 después de unirse a la superficie de células PC3 que expresan TAT188.
La Figura 6 es un gráfico de barras que muestra cambios en la actividad de transporte de aminoácidos de TAT188 en presencia de anticuerpo anti-TAT188 con el tiempo.
La Figura 7 proporciona representaciones de la viabilidad celular en presencia de cantidades crecientes de anticuerpo anti-TAT188 conjugado con toxina MC-vc-PAB-MMAE en células PC3 y Colo205.
La Figura 8 es una representación de la viabilidad celular en presencia de cantidades crecientes de anticuerpo anti-TAT188 conjugado con MC-vc-PAB-MMAE o MC-vc-PAB-MMAF en células Colo205.
La Figura 9 muestra los resultados de células que se unen al anticuerpo E16 anti-humano que expresa endógenamente el polipéptido E16, donde las células son células COS7 de mono, células de cáncer de mama MCF10A humano, y células NIH-3T3 de ratón. La Figura 9A muestra los resultados FACS de unión de anticuerpos anti-E16 3B5, 12B9, y 12G12 a COS de mono. La Figura 9B muestra la unión de anti-E16 3B5 a la línea celular de tumor de mama MCF10A humano y la no unión a las células NIH-3T3 de ratón.
La Figura 10 es una representación de los cambios del volumen de tumor promedio con el tiempo con anticuerpos anti-E16 (no conjugados a toxina) desnudos administrados en xenoinjertos de ratones.
La Figura 11 es un gráfico de los cambios del volumen de tumor promedio con el tiempo con anticuerpos anti-E16 conjugados a toxina administrados en xenoinjertos de ratones, donde la toxina era MC-vc-PAB-MMAE o MC-vc-PAB-MMAF.
La Figura 12 muestra que la expresión del polipéptido de fusión E16-GFP se reduce en células transfectadas con siARN que reconoce el gen E16. El panel superior son fotografías de los resultados de los ensayos de bioluminiscencia por la presencia de GFP. El panel inferior son fotografías de visualización por contraste de fase que muestran que la reducción por bioluminiscencia de GFP no fue causada por la reducción en el número de células.
La Figura 13 es una transferencia Western que muestra que la expresión del polipéptido de fusión E16-GFP se inhibe en células PC3 transfectadas transitoriamente con siARN de E16. La \beta-tubulina es un control de carga de
gel.
La Figura 14 muestra que la transfeción transitoria de células PC3 con siARN de E16 está asociada con una reducción en la función del transporte de aminoácidos que concuerda con la expresión reducida de E16.
La Figura 15 es una representación de la proliferación celular con el tiempo con o sin la transfección transitoria con siARN de E16. La proliferación celular se reduce en células PC3 transfectadas transitoriamente con E16.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones
Los términos "polipéptido TAT" y "TAT" tal como se utilizan aquí y cuando va seguida inmediatamente por una designación numérica, se refieren a varios polipéptidos, en los que la designación completa (es decir, TAT/número) se refiere a secuencias de polipéptidos específicas tal como se describen aquí. Los términos "polipéptido TAT/número" y "TAT/número" donde el término "número" se proporciona como una designación numérica real tal como se utiliza aquí, comprenden polipéptidos de secuencia nativa, variantes de polipéptidos y fragmentos de polipéptidos de secuencia nativa y variantes de polipéptidos (que se definen posteriormente aquí). Los polipéptidos TAT descritos en la presente invención se pueden aislar de un conjunto de fuentes, tales como de tipos de tejido humano y de otras fuentes, o se pueden preparar mediante métodos recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido TAT" se refiere a cada polipéptido TAT/número individual descrito aquí. Todas las descripciones en esta memoria que se refieren al "polipéptido TAT" se refieren a cada uno de los polipéptidos individualmente, así como de manera conjunta. Por ejemplo, las descripciones de la preparación, purificación, derivación, formación de anticuerpos a o contra, la formación de oligopéptidos de unión a TAT a o contra, la formación de moléculas orgánicas de unión a TAT a o contra, la administración de composiciones que contienen, el tratamiento de una enfermedad con, etc., se refieren a cada polipéptido de la invención individualmente. El término "polipéptido TAT" también incluye variantes de polipéptidos TAT/número descritos aquí.
Un "polipéptido TAT de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el correspondiente polipéptido TAT derivado de la naturaleza. Dichos polipéptidos TAT de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse mediante medios recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido TAT de secuencia nativa" abarca específicamente las formas truncadas o secretadas naturales del polipéptido TAT específico (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), formas variantes naturales (por ejemplo, formas cortadas y empalmadas ("spliced") alternativamente) y variantes alélicas naturales del polipéptido. En varias realizaciones de la invención, los polipéptidos TAT de secuencia nativa descritos aquí son polipéptidos de secuencia nativa madura o de longitud completa que comprenden las secuencias de aminoácidos de longitud completa que se muestran en las figuras acompañantes. Los codones de inicio y parada (si se indican) se muestran en negrita y subrayados en las figuras. Los residuos de ácidos nucleicos indicados como una "N" en las figuras acompañantes son cualquier residuo de ácido nucleico. Sin embargo, mientras que se muestra que los polipéptidos TAT descritos en las figuras acompañantes se inician con los residuos de metionina denominados aquí como posición 1 de aminoácido en las figuras, es concebible y posible que otros residuos de metionina localizados cadena arriba o cadena abajo de la posición 1 de aminoácidos en las figuras puedan utilizarse como el residuo de aminoácido de partida de los polipéptidos TAT.
El "dominio extracelular" o "ECD" del polipéptido TAT se refiere a una forma del polipéptido TAT que está libre esencialmente de los dominios transmembrana y citoplasmático. Generalmente, un ECD del polipéptido TAT tendrá menos del 1% de dichos dominios transmembrana y/o citoplasmático y preferiblemente, tendrá menos del 0,5% de dichos dominios. Se entenderá que cualquier dominio transmembrana identificado para los polipéptidos TAT de la presente invención se identifican siguiendo los criterios utilizados habitualmente en la técnica para la identificación de ese tipo de dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio transmembrana pueden variar, pero muy probablemente, en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio tal como inicialmente se identificó aquí. Opcionalmente, por tanto, un dominio extracelular de un polipéptido TAT puede contener desde aproximadamente 5 o menos aminoácidos en cualquier extremo de los límites del dominio transmembrana/dominio extracelular tal como se identifica en los Ejemplos o la memoria y dichos polipéptidos, con o sin el péptido señal asociado, y el ácido nucleico que los codifica, están contemplados por la presente invención.
La localización aproximada de los "péptidos señal" de los diversos polipéptidos TAT descritos aquí se puede mostrar en la presente memoria y/o las figuras acompañantes. Se ha de remarcar, sin embargo, que el límite C-terminal de un péptido señal puede variar, pero muy probablemente, en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquiera de los extremos del límite C-terminal del péptido señal tal como se identificó inicialmente aquí, donde el límite C-terminal del péptido señal puede identificarse según el criterio utilizado de forma rutinaria en la técnica para identificar ese tipo de elemento de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, Nielsen y et al., Prot Eng, 10:1-6 (1997) y von Heinje y et al., Nucl Acids Res, 14:4683-4690 (1986)). Además, también se ha reconocido, que, en algunos casos, la división de una secuencia señal de un polipéptido secretado no es totalmente uniforme, dando como resultado más de una especie secretada. Estos polipéptidos maduros, cuando su péptido señal se divide en no más de aproximadamente 5 aminoácidos por cualquier extremo del límite C-terminal del péptido señal identificado aquí, y los polinucleótidos que los codifican, están contemplados por la presente invención.
"Variante de polipéptido TAT" significa un polipéptido TAT, preferiblemente un polipéptido TAT activo, tal como se define aquí que tiene por lo menos aproximadamente el 80% de identidad en la secuencia con una secuencia de polipéptido TAT de secuencia nativa de longitud completa tal como se describe aquí, una secuencia de polipéptido TAT que carece del péptido señal tal como se describe aquí, un dominio extracelular de un polipéptido TAT, con o sin el péptido señal, tal como se describe aquí, o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido TAT de longitud completa tal como se describe aquí (tales como las codificadas por un ácido nucleico que representa sólo una parte de la secuencia codificante completa para un polipéptido TAT de longitud completa). Dichas variantes de polipéptido TAT incluyen, por ejemplo, los polipéptidos TAT en donde uno o más residuos de aminoácido se añaden, o eliminan, en el extremo N- o C-terminal de la secuencia de aminoácidos nativa de longitud completa. Generalmente, una variante de polipéptido TAT tendrá por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos con una secuencia de un polipéptido TAT de secuencia nativa de longitud completa tal como se describe aquí, una secuencia de polipéptido TAT que carece del péptido señal tal como se describe aquí, un dominio extracelular de un polipéptido TAT, con o sin el péptido señal, tal como se describe aquí o cualquier otro fragmento definido específicamente de una secuencia de polipéptido TAT de longitud completa tal como se describe aquí. Generalmente, los polipéptidos variantes de TAT tienen una longitud de por lo menos aproximadamente 10 aminoácidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 1170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 aminoácidos de longitud, o mas. Opcionalmente, los polipéptidos variantes de TAT tendrán no más de una sustitución de aminoácido conservativo en comparación con la secuencia de polipéptido TAT nativa, alternativamente no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 sustituciones de aminoácido conservativo en comparación con la secuencia de polipéptido TAT
nativa.
El "porcentaje (%) de identidad en la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias del polipéptido TAT identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en la secuencia de polipéptido TAT específica, después de la alineación de las secuencias y la introducción de espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de identidad en la secuencia. La alineación con el objetivo de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos se puede conseguir de varias maneras que están dentro de la técnica, por ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN, o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo de alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Para los objetivos de la presente invención, sin embargo, los valores en % de la identidad en la secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2, en el que el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 era propiedad de Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla 1 se ha presentado con la documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C. 20559, donde está registrado bajo el U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente mediante Genentech Inc., South San Francisco, California o se puede compilar a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1 siguiente. El programa ALIGN-2 debería compilarse para su utilización en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de las secuencias son fijados en el programa ALIGN-2 y no varían.
En las situaciones en las que se utiliza ALIGN-2 para la comparación de secuencia de aminoácidos, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos determinada A a, con, o contra una secuencia de aminoácidos determinada B (que se puede escribir alternativamente como una secuencia de aminoácidos determinada A que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos determinada B) se calcula tal y como se indica a continuación:
100\ veces\ la\ fracción\ X/Y
donde X es el número de residuos de aminoácidos identificados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se comprenderá que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad en la secuencia de aminoácidos de B a A. Como ejemplos de los cálculos del % de identidad en la secuencia de aminoácidos utilizando este procedimiento. Las Tablas 2 y 3 demuestran cómo calcular el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos denominada "Proteína de comparación" con la secuencia de aminoácidos denominada "TAT", donde "TAT" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido contra el que el polipéptido "TAT" hipotético de interés, "Proteína de comparación" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido contra el que se compara el "polipéptido TAT" de interés, y "X", "Y" y "Z" cada uno representa residuos de aminoácidos hipotéticos diferentes. A menos que se afirme específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad en la secuencia de aminoácidos utilizados aquí se obtienen tal como se describe en párrafo inmediatamente anterior utilizando el programa informático ALIGN-2.
El "polinucleótido variante de TAT" o "secuencia de ácidos nucleicos variante de TAT" significa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido TAT, preferiblemente un polipéptido TAT activo, tal y como se define a continuación y que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de polipéptido TAT de secuencia nativa y de longitud completa tal y como se describe en la presente invención, una secuencia de polipéptido TAT de secuencia nativa y de longitud completa que carece del péptido señal tal y como se describe en la presente invención, un dominio extracelular de un polipéptido TAT, con o sin el péptido señal, tal y como se describe en la presente invención, o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido TAT de longitud completa tal y como se describe en la presente invención (tales como las codificadas por un ácido nucleico que representa sólo una parte de la secuencia codificante completa para un polipéptido TAT de longitud completa). Habitualmente, un polinucleótido variante de TAT tendrá por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de polipéptido TAT de secuencia nativa y de longitud completa tal y como se describe en la presente invención, una secuencia de polipéptido TAT de secuencia nativa y longitud completa que carece del péptido señal tal y como se describe en la presente invención, un dominio extracelular de un polipéptido TAT, con o sin el péptido señal, tal y como se describe en la presente invención, o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido TAT de longitud completa tal y como se describe en la presente invención. Las variantes no comprenden la secuencia de nucleótidos nativa.
Habitualmente, los polinucleótidos variantes de TAT tienen por lo menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,65,70,75,80, 85, 90, 95, 100,105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, ó 1000 nucleótidos de longitud, donde en este contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de la secuencia de nucleótidos referenciada más o menos un 10% de esa longitud referenciada.
El "porcentaje (%) de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el TAT identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos con los nucleótidos en la secuencia de ácidos nucleicos que codifica TAT de interés, después de la alineación de las secuencias y la introducción de espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia. La alineación con el objetivo de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos se puede conseguir de varias maneras que están dentro de la técnica, por ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN, o Megalign (DNASTAR). Para los objetivos de la presente invención, sin embargo, los valores en % de la identidad en la secuencia de ácidos nucleicos se generan utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2, en el que el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 era propiedad de Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla 1 siguiente se ha presentado con la documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C. 20559, donde está registrado bajo el U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente mediante Genentech Inc., South San Francisco, California o se puede compilar a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1 siguiente. El programa ALIGN-2 debería compilarse para su utilización en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de las secuencias son fijados en el programa ALIGN-2 y no varían.
En las situaciones en las que se utiliza ALIGN-2 para las comparaciones de secuencia de ácidos nucleicos, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos determinada C a, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos determinada D (que se puede escribir alternativamente como una secuencia de ácidos nucleicos determinada C que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos a, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos determinada D) se calcula tal y como se indica a continuación:
100\ veces\ la\ fracción\ W/Z
donde W es el número de nucleótidos identificados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en dicha alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se comprenderá que cuando la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de C a D no será igual al % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de D a C. Como ejemplos de los cálculos del % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, las Tablas 4 y 5 demuestran cómo calcular el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos denominada "ADN de comparación" con la secuencia de ácidos nucleicos denominada "TAT-DNA", donde "TAT-DNA" representa una secuencia de ácidos nucleicos hipotética que codifica TAT de interés, "ADN de comparación", representa la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico contra la que se compara la molécula de ácido nucleico "TAT-DNA" de interés, y "N", "L" y "V" cada uno representa nucleótidos hipotéticos. A menos que se afirme específicamente lo contrario, todos los valores del % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos utilizados aquí se obtienen tal como se describe en párrafo inmediatamente anterior utilizando el programa informático ALIGN-2.
En otras realizaciones, los polinucleótidos variantes de TAT son moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido TAT y que son capaces de hibridarse, preferiblemente bajo condiciones de hibridación y lavado astringentes, a secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido TAT de longitud completa tal como se describe aquí. Los polipéptidos variantes de TAT pueden ser aquéllos codificados por un polinucleótido variante de TAT.
El término "región codificante de longitud completa" cuando se utiliza en referencia a un ácido nucleico que codifica un polipéptido TAT se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido TAT de longitud completa de la invención (que se muestra a menudo entre los codones de inicio y parada, incluyendo ambos, en las figuras que se acompañan). El término "región codificante de longitud completa" cuando se utiliza en referencia a un ácido nucleico depositado en ATCC se refiere a la parte del ADNc que codifica el polipéptido TAT que se inserta en el vector depositado con la ATCC (que se muestra a menudo entre los codones de inicio y parada, incluyendo ambos, en las figuras que se acompañan.
El término "aislado", cuando se utiliza para describir los diversos polipéptidos TAT descritos en la presente invención, significa polipéptidos que se han identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que habitualmente interferirían con usos de diagnóstico o terapéutico para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, se purificará el polipéptido (1) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta una homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ en el interior de células recombinantes, ya que por lo menos un componente del medio natural del polipéptido TAT no estará presente. Normalmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.
Un ácido nucleico "aislado" que codifica un polipéptido TAT u otro ácido nucleico que codifica un polipéptido es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está asociada normalmente en el medio natural del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido aislada es una forma o composición diferente de la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido se diferencian de la molécula de ácido nucleico específica que codifica un polipéptido tal y como existen en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido incluye moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido contenidas en células que normalmente expresan el polipéptido cuando, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células
naturales.
El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.
Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está situado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o secuencia líder secretora está unido operativamente a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está situado para facilitar la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen están contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La unión se realiza mediante la unión en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se utilizan los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional.
La "astringencia" de las reacciones de hibridación se puede determinar fácilmente por un experto habitual en la materia, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sal. En general, sondas más largas requieren temperaturas más elevadas para una hibridación más correcta, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para rehibridarse cuando las cadenas complementarias están presentes en un medio por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia de hibridación, mayor es la temperatura relativa que se puede utilizar. Como resultado, se deduce que temperaturas relativas superiores tenderían a hacer las condiciones de reacción más astringentes, mientras que temperaturas inferiores no tanto. Para detalles adicionales y explicaciones de la astringencia de las reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
"Condiciones astringentes" o "condiciones de astringencia elevada", tal y como se definen en la presente invención, se pueden identificar por aquéllas que: (1) utilizan una fuerza iónica baja y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) utilizan durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficol al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) una hibridación durante la noche en una solución que utiliza formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con un lavado de 10 min a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) seguido de un lavado de astringencia elevada de 10 min que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.
Las "condiciones moderadamente astringentes" se pueden identificar tal y como se describen en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen la utilización de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos astringentes que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente astringentes es la incubación durante toda la noche a 37ºC en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado 20 mg/ml, seguido del lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. El experto en la materia sabrá como ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc. necesarias para acomodar factores, tales como la longitud de la sonda y similares.
El término "epítopo etiquetado", cuando se utiliza en la presente invención, se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido TAT o un anticuerpo anti-TAT fusionado a un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene residuos suficientes para proporcionar un epítopo contra el que se puede fabricar un anticuerpo, aunque es suficientemente corto, de manera que no interfiere en la actividad del polipéptido al que se fusiona. El polipéptido etiqueta es también preferiblemente bastante único, de manera que el anticuerpo sustancialmente no reacciona de forma cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados tienen generalmente por lo menos seis residuos de aminoácidos y habitualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácidos (preferiblemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoácidos).
"Activo" o "actividad" para los objetivos de la presente invención se refiere a una forma o formas de un polipéptido TAT que retiene una actividad biológica y/o inmunológica de un polipéptido TAT nativo o natural, donde la actividad "biológica" se refiere a una función biológica (inhibidora o estimuladora) provocada por un polipéptido TAT nativo o natural que es diferente de la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico que se encuentra en un polipéptido TAT nativo o natural y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico que se encuentra en un polipéptido TAT nativo o natural.
El término "antagonista" se utiliza en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o completamente una actividad biológica de un polipéptido nativo TAT descrito aquí. De manera similar, el término "agonista" se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que mimetiza una actividad biológica de un polipéptido TAT nativo descrito aquí. Las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas incluyen específicamente los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpos, fragmentos o variantes en la secuencia de aminoácidos de polipéptidos TAT nativos, péptidos, oligonucleótidos no codificantes, moléculas orgánicas pequeñas, etc., ya sean agonistas o antagonistas. Los procedimientos para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido TAT pueden comprender poner en contacto un polipéptido TAT con una molécula agonista o antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido TAT.
"Tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refieren a tanto un tratamiento terapéutico como con medidas profilácticas o preventivas, en las que el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) la afección o trastorno patológico reconocido. Los necesitados del tratamiento incluyen aquéllos que ya padecen el trastorno, así como aquéllos propensos a padecer el trastorno o aquéllos a los que debe prevenirse el trastorno. Un sujeto o mamífero es "tratado" satisfactoriamente para una cáncer que expresa el polipéptido TAT si, después de recibir una cantidad terapéutica de un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de unión a TAT o molécula orgánica de unión a TAT según los métodos de la presente solicitud, el paciente muestra una reducción observable y/o medible o ausencia de uno o más de los siguientes: reducción en el número de células cancerosas o ausencia de células cancerosas; reducción en el tamaño del tumor; inhibición (es decir, ralentización en cierto grado y preferiblemente detención) de la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos incluyendo la extensión del cáncer a tejido blando y hueso; inhibición (es decir, ralentización en cierto grado y preferiblemente detención) de la metástasis tumoral; inhibición, en cierto grado, del crecimiento tumoral; y/o alivio, en cierto grado, de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico; morbilidad y mortalidad reducidas, y mejora en cuestiones de calidad de vida. Siempre que el anticuerpo anti-TAT o el oligopéptido de unión a TAT puedan prevenir el crecimiento y/o la citólisis de células cancerosas existentes, pueden ser citostáticos o citotóxicos. La reducción de estos signos o síntomas también puede ser sentida por el paciente.
Los parámetros anteriores para evaluar una tratamiento satisfactorio y una mejora en la enfermedad son fácilmente medibles mediante procedimientos de rutina familiares para el médico. Para la terapia contra el cáncer, se puede medir la eficacia, por ejemplo, mediante la valoración del tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP) y/o la determinación de la velocidad de respuesta (RR). La metástasis se puede determinar mediante tests de estadificación y mediante escaneo óseo y tests de los niveles de calcio y otras enzimas para determinar la expansión hacia los huesos. Los escaneos CT también se pueden realizar para buscar la expansión hacia la pelvis y los nódulos linfáticos en el área. Los rayos X del pecho y la medición de los niveles de enzimas hepáticas mediante métodos conocidos se utilizan para buscar metástasis hacia pulmones e hígado, respectivamente. Otros métodos de rutina para monitorizar la enfermedad incluyen ultrasonografía transrectal (TRUS) y biopsia con aguja transrectal (TRNB).
Para el cáncer de vejiga, que es un cáncer más localizado, los métodos para determinar el progreso de la enfermedad incluyen la evaluación citológica urinaria mediante citoscopía, monitorización de la presencia de sangre en la orina, visualización del tracto urotelial mediante monografía o un pielograma intravenoso, tomografía computerizada (CT) e imagen por resonancia magnética (MRI). La presencia de metástasis distantes se puede evaluar mediante CT del abdomen, rayos X del pecho u obtención de imágenes por radionucleidos del esqueleto.
Administración "crónica" se refiere a la administración del agente o agentes de un modo continuo en oposición a un modo agudo, para mantener el efecto (actividad) terapéutica inicial durante un periodo de tiempo largo. Administración "intermitente" es el tratamiento que no se realiza consecutivamente sin interrupción, sino que es más bien cíclico por naturaleza.
El término "mamífero" con el propósito de tratamiento, o alivio de los síntomas o diagnóstico del cáncer, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo el hombre, animales domésticos y de granja, y animales del zoo, deportivos o de compañía, tales como perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos etc. Preferiblemente, el mamífero es el hombre.
La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (a la vez) y la administración consecutiva en cualquier orden.
"Portadores", tal como se utiliza aquí, incluyen los portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables, que no son tóxicos para la célula o para el mamífero que se expone a los mismos en las dosificaciones y concentraciones utilizadas. A menudo, el portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa tamponada de pH. Ejemplos de portadores aceptables fisiológicamente incluyen tampones, tales como fosfato, citrato, y otros ácido orgánicos; antioxidantes incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (inferiores a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como la glicina, la glutamina, la asparagina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, la manosa, o las dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o tensoactivos no iónicos, tales como TWEEN^{TM}, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS^{TM}.
Por "fase sólida" o "soporte sólido" se entiende una matriz no acuosa a la que se puede adherir o unir un anticuerpo, un oligonucleótido de unión a TAT o una molécula orgánica de unión a TAT de la presente invención. Ejemplos de fases sólidas comprendidas en la presente invención incluyen aquellas formadas parcial o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), de polisacáridos (por ejemplo, agarosa), de poliacrilamidas, de poliestireno, de polivinil alcohol y de siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras, es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía por afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tal como las descritas en la patente de Estados Unidos no. 4.275.149.
Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos que es útil para la liberación de un fármaco (tal como un polipéptido TAT, un anticuerpo para el mismo o un oligopéptido de unión a TAT) a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen habitualmente en una formación de bicapa, similar a la disposición de los lípidos de las membranas biológicas.
Una molécula "pequeña" o molécula orgánica "pequeña" se define en la presente invención por tener un peso molecular por debajo de aproximadamente 500 Daltons.
Una "cantidad eficaz" de un polipéptido, anticuerpo, oligopéptido de unión a TAT, molécula orgánica de unión a TAT o un agonista o antagonista de los mismos tal como se describe aquí, es una cantidad suficiente para llevar a cabo un objetivo específicamente indicado. Una "cantidad eficaz" puede determinarse empíricamente y de forma rutinaria, en relación al objetivo indicado.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo, polipéptido, oligopéptido de unión a TAT, molécula orgánica de unión a TAT u otro fármaco eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducción en el tamaño del tumor; inhibición (es decir, ralentización en cierto grado y preferiblemente detención) de la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibición (es decir, ralentización en cierto grado y preferiblemente detención) de la metástasis tumoral; inhibición, en cierto grado, del crecimiento tumoral; y/o alivio, en cierto grado, de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Véase la definición de "tratamiento" en la presente invención. Siempre que el fármaco pueda prevenir el crecimiento y/o la citólisis de células cancerosas existentes, puede ser citostático o citotóxico.
Una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un anticuerpo anti-TAT, polipéptido TAT, oligopéptido de unión a TAT, siARN de TAT (tal como un siARN de TAT188) o molécula orgánica de unión a TAT es una cantidad capaz de inhibir el crecimiento de una célula, especialmente tumoral, por ejemplo, las células cancerosas, ya sea in vitro o in vivo. Una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un anticuerpo anti-TAT, polipéptido TAT, oligopéptido de unión a TAT, siARN de TAT (tal como un siARN de TAT188) o molécula orgánica de unión a TAT con el propósito de inhibir el crecimiento de células neoplásicas se puede determinar empíricamente y de una manera
rutinaria.
Una "cantidad citotóxica" de un anticuerpo anti-TAT, polipéptido TAT, oligopéptido de unión a TAT, siARN de TAT (tal como un siARN de TAT188) o molécula orgánica de unión a TAT es una cantidad capaz de causar la destrucción de una célula, especialmente tumoral, por ejemplo las células cancerosas, ya sea in vitro o in vivo. Una "cantidad citotóxica" de un anticuerpo anti-TAT, polipéptido TAT, oligopéptido de unión a TAT, siARN de TAT (tal como un siARN de TAT188) o molécula orgánica de unión a TAT con el propósito de inhibir el crecimiento de células neoplásicas se puede determinar empíricamente y de una manera rutinaria.
El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-TAT individuales (incluyendo agonista, antagonista, y anticuerpos neutralizantes), composiciones de anticuerpos anti-TAT con especificidad poliepitópica, anticuerpos policlonales, anticuerpos anti-TAT de cadena única, y fragmentos de anticuerpos anti-TAT (ver a continuación), siempre y cuando muestren la actividad biológica o inmunológica deseadas. El término "inmunoglobulina" (Ig) se utiliza indistintamente con el anticuerpo de la presente invención.
Un "anticuerpo aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que habitualmente interferirían con usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, se purificará el anticuerpo (1) en más de un 95% en peso del anticuerpo determinado por el método de Lowry, y aún más preferiblemente en más de un 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta una homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en el interior de células recombinantes, ya que por lo menos un componente del medio natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.
La unidad básica del anticuerpo de 4 cadenas es una glicoproteína heterotetramérica compuesta de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas (un anticuerpo IgM consiste en 5, la unidad heterotetramérica básica junto con un polipéptido adicional denominado cadena J y, por tanto, contiene 10 sitios de unión a antígeno, mientras que los anticuerpos IgA secretados pueden polimerizarse para formar ensamblajes polivalentes que comprenden 2-5 de las unidades básicas de 4 cadenas junto con la cadena J). En el caso de las IgGs, la unidad de 4 cadenas es generalmente de aproximadamente 150.00 daltons. Cada cadena L está unida a una cadena H mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están unidas entre sí mediante uno o más enlaces disulfuro que dependen del isotipo de cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes disulfuro intracatenarios regularmente separados. Cada cadena H tiene en el extremo N-terminal un dominio variable (V_{H}) seguido de tres dominios constantes (C_{H}) para cada una de las cadenas \alpha y \gamma y cuatro dominios C_{H} para los isotipos \mu y \varepsilon. Cada cadena L tiene en el extremo N-terminal un dominio variable (V_{L}) seguido de un dominio constante (C_{L}) en su otro extremo. El V_{L} está alineado con el V_{H} y el C_{L} está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (C_{H}1). Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El emparejamiento de un V_{H} y un V_{L} juntos forma un único sitio de unión a antígeno. Para la estructura y las propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véase, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8ª Edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristam G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 y capítulo 6.
La cadena L de cualquier especie vertebrada se puede asignar a uno de los dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (C_{H}), las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases o isotipos. Existen cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen las cadenas pesadas designadas \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma, y \mu, respectivamente. Las clases \gamma y \alpha se dividen además en subclases en base a diferencias relativamente menores en la secuencia y la función de C_{H}, por ejemplo, los humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.
El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas partes de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos. El dominio V media en la unión a antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente a lo largo del tramo de 110 aminoácidos de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en tramos relativamente invariantes denominados regiones armazón ("framework") (FRs) de 15-30 aminoácidos separadas por regiones más cortas de variabilidad extrema denominadas "regiones hipervariables" que tienen cada una de 9 a 12 aminoácidos de longitud. Los dominios variables de cadenas ligeras y pesadas nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan ampliamente una configuración de lámina beta, conectadas mediante tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina beta. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas de manera próxima mediante las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).
El término "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable (HVR) comprende generalmente residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, aproximadamente los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el V_{L} y aproximadamente 1-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en V_{H}; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el V_{L} y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el V_{H}; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Las HVR también se definen que comprenden las secuencias descritas en la Solicitud US de No. de Serie, solicitada el 19 de febrero del 2004, incorporada aquí por referencia en su totalidad, donde las HVR extendidas incluyen algunas de las posiciones de la secuencia de aminoácidos en las regiones variables que se definen por estar en contacto con un ligando unido del anticuerpo basado en un análisis de estructuras complejas de cristales. Tal como se utiliza aquí, los términos "HVR" y "CDR" se utilizan indistintamente para comprender las HVR entendidas definidas a continuación.
El término "región hipervariable", cuando se utiliza aquí, se refiere a las regiones de dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en la secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. En general, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en el VH (H1 H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). En la presente invención se utilizan y se comprenden un conjunto de delineaciones de regiones hipervariables. Las Regiones Determinantes de Complementariedad Kabat (CDRs) se basan en la variabilidad de secuencia y son los utilizados más habitualmente (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia se refiere en cambio a la localización de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las regiones hipervariables de AbM representan un compromiso entre las CDRs de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y son utilizadas por el software de modelación de anticuerpo AbM de Oxford Molecular. Las regiones hipervariables "de contacto" se basan en un análisis de las estructuras complejas de cristales disponibles. Los residuos de cada una de estas regiones hipervariables se indican a continuación.
TABLA HVR
1
Las regiones hipervariables pueden comprender "regiones hipervariables extendidas" tal como se indica: 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el VL y 26-35 (H1), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 o 95-102 (H3) en el VH. Los residuos de dominios variables se enumeran según Kabat et al., supra para cada una de estas definiciones.
Los residuos "armazón" o "FR" son aquellos residuos de dominios variables diferentes de los residuos de la región hipervariable tal como se define aquí.
El término "anticuerpo monoclonal", tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un sitio antigénico único. Además, a diferencia de preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes (epítopos) diferentes, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante único en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que se pueden sintetizar sin estar contaminados por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" no debe interpretarse como que se requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención se pueden fabricar mediante el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o se pueden fabricar mediante procedimientos de ADN recombinante en células bacterianas, animales o vegetales eucariotas (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de las bibliotecas de anticuerpos en fagos utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), por ejemplo.
Entre los anticuerpos monoclonales de la presente invención se incluyen anticuerpos "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de cadena o cadenas es idéntico con u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada (véase, Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente invención incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno del dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, Mono del viejo Mundo, Simio, etc) y secuencias de la región constante
humana.
Un anticuerpo "intacto" es aquel que comprende un sitio de unión a antígeno, así como un C_{L} y por lo menos los dominios constantes de cadena pesada C_{H}1, C_{H}2 y C_{H}3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes en la secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprende una parte de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región de unión a antígeno o variable del anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2} y Fv; diabodies; anticuerpos lineales (véase la Patente de Estados Unidos No. 5.641.870, Ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpo de cadena única; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab" y un fragmento "Fc" residual, una designación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste en una cadena L completa junto con el dominio de la región variable de la cadena H (V_{H}) y el primer dominio constante de una cadena pesada (C_{H}1). Cada fragmento de Fab es monovalente con respecto a la unión a antígeno, es decir, presenta un único sitio de unión a antígeno. El tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un único fragmento F(ab')_{2} grande que corresponde aproximadamente a dos fragmentos de Fab unidos por puentes disulfuro que tienen una actividad de unión a antígeno divalente y aún es capaz de reticular con el antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de una serie de residuos en el extremo carboxi terminal del dominio C_{H}1 que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en la presente invención para Fab' en el que el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes transportan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')_{2} se produjeron originalmente como parejas de fragmentos de Fab' que tienen cisteínas bisagras entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
El fragmento Fc comprende las partes carboxi terminales de ambas cadenas H mantenidas juntas mediante enlaces disulfuro. Las funciones efectoras de los anticuerpos se determinan mediante las secuencias en la región Fc, cuya región es también la parte reconocida por receptores Fc (FcR) hallados en ciertos tipos de células.
"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de unión y reconocimiento de antígeno. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y cadena ligera en asociación estrecha no covalente. A partir del pliegue de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada una de las cadenas H y L) que contribuyen con los residuos de aminoácidos para la unión a antígeno y que confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de una Fv que comprende sólo tres CDRs específicas de antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a antígeno, aunque con una menor afinidad que el sitio de unión completo.
"Fv de cadena única", también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios V_{H} y V_{L} del anticuerpo conectados en una única cadena de polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido sFv comprende además un polipéptido enlazador entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.
El término "diabodies" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos preparados mediante la construcción de fragmentos sFv (véase el párrafo anterior) con enlazadores cortos (aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios V_{H} y V_{L}, de manera que se consigue el emparejamiento de los dominios V entre cadenas, pero no intracadenas, dando lugar a un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno. Los diabodies biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos de sFv de entrecruce ("crossover"), donde los fragmentos V_{H} y V_{L} de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipeptídicas. Los diabodies se describen más detalladamente en, por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) donde los residuos de una región hipervariable del receptor se sustituyen por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región armazón ("framework") (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo dador. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente la acción del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente por lo menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, habitualmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986), Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).
Un "anticuerpo dependiente de especie", por ejemplo, un anticuerpo anti-IgE humano de mamífero, es un anticuerpo que tiene una afinidad de unión más fuerte por un antígeno de una primera especie mamífera que la que tiene por un homólogo de ese antígeno de una segunda especie de mamífero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de especie "se une específicamente" a un antígeno humano (es decir, tiene un valor de afinidad de unión (Kd) de no más de aproximadamente 1 x 10^{-7} M, preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 10^{-8} y lo más preferible no más de aproximadamente 1 x 10^{-9} M), pero presenta una afinidad de unión por un homólogo del antígeno de una segunda especie de mamífero no humana que es por lo menos aproximadamente 50 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o por lo menos aproximadamente 1000 veces, más débil que su afinidad de unión por el antígeno humano. El anticuerpo dependiente de especie puede ser cualquiera de los diversos tipos de anticuerpos definidos anteriormente, pero preferiblemente es un anticuerpo humanizado o humano.
Un "polipéptido de unión a TAT" es un oligopéptido que se une, preferiblemente específicamente, a un polipéptido TAT tal como se describe aquí. Los oligopéptidos de unión a TAT se pueden sitentizar químicamente utilizando una metodología de síntesis de oligopéptidos conocida o se pueden preparar y purificar utilizando tecnología recombinante. Los oligopéptidos de unión a TAT tienen habitualmente por lo menos aproximadamente 5 aminoácidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ó 100 aminoácidos de longitud o más, donde dichos oligopéptidos son capaces de unirse, preferiblemente específicamente, a un polipéptido TAT tal como se describe aquí. Los oligopéptidos de unión a TAT se pueden identificar sin una gran experimentación utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, cabe indicar que las técnicas para cribar bibliotecas de oligopéptidos para oligopéptidos que son capaces de unirse específicamente a un polipéptido diana son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,1.43; Publicación PCT Nos. WO 84/03506 y WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102: 259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140: 611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991). J. Mol. Biol., 222: 581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8363, y Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2: 668).
Una "molécula orgánica de unión a TAT" es una molécula orgánica diferente de un oligopéptido o anticuerpo tal como se define aquí, que se une, preferiblemente específicamente, a un polipéptido TAT tal como se describe aquí. Las moléculas orgánicas de unión a TAT se pueden identificar y sintetizar químicamente utilizando metodología conocida (véase, por ejemplo, Publicación PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585). Las moléculas orgánicas de unión a TAT tienen habitualmente menos de aproximadamente 2000 daltons de tamaño, alternativamente menos de aproximadamente 1500, 750, 500, 250 ó 200 daltons de tamaño, donde dichas moléculas orgánicas que son capaces de unirse, preferiblemente específicamente, a un polipéptido TAT tal como se describe aquí, se pueden identificar sin una gran experimentación utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, cabe indicar que las técnicas para cribar bibliotecas de moléculas orgánicas para moléculas que son capaces de unirse específicamente a un polipéptido diana son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Publicación PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585).
Un "ARN de interferencia" o "ARN de interferencia pequeño (siARN)" es una molécula de ARN de doble cadena que tiene menos de 30 nucleótidos de longitud que reduce la expresión de un gen diana. Un "ARN de interferencia de TAT" o "siARN de TAT" se une, preferiblemente específicamente a un ácido nucléico de TAT y reduce su expresión. Esto significa que la expresión de la molécula TAT es inferior con ARN de interferencia presente en comparación con la expresión de la molécula TAT en el control donde el ARN de interferencia no está presente. Los ARN de interferencias de TAT se pueden identificar y sintetizar utilizando métodos conocidos (Shi Y. Trends in genetics 19 (1): 9-12 (2003), WO/2003056012 y WO2003064621).
Un anticuerpo, oligopéptido, siARN, u otra molécula orgánica "que se une" a un antígeno de interés, por ejemplo, un polipéptido antígeno diana asociado a un tumor, es aquel que se une al antígeno con suficiente afinidad, de manera que el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en el reconocimiento de una célula o tejido que expresan el antígeno, y no reacciona significativamente de forma cruzada con otras proteínas. En dichas realizaciones, el grado de unión del anticuerpo, oligopéptido, siARN, u otra molécula orgánica a una proteína "no diana" será inferior a aproximadamente un 10% de la unión del anticuerpo, oligopéptido, siARN, u otra molécula orgánica a su proteína diana particular tal como se determina mediante un análisis mediante separador celular activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA). Con respecto a la unión de un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica a una molécula diana, el término "unión específica" o "que se une específicamente a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo en un polipéptido diana particular significa una unión que es diferente de forma medible de una interacción no específica. La unión específica se puede medir, por ejemplo, determinando la unión de una molécula en comparación con la unión de una molécula de control, que generalmente es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión. Por ejemplo, la unión específica se puede determinar mediante la competición con una molécula de control que es similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana no marcada. En este caso, se indica unión específica si la unión de la diana marcada a una sonda es inhibida competitivamente por un exceso de diana no marcada. El término "unión específica" o "que se une específicamente a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo en un polipéptido diana particular tal como se utiliza aquí se pueden mostrar, por ejemplo, mediante una molécula que tiene una Kd para la diana de por lo menos aproximadamente 10^{-4} M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10^{-5} M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10^{-6} M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10^{-7} M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10^{-8} M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10^{-9} M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10^{-10} M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10^{-11} M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10^{-12} M, o superior. En una realización, el término "unión específica" se refiere a la unión en la que una molécula se une a un polipéptido particular o un epítopo en un polipéptido particular sin unirse específicamente a cualquier otro polipéptido o epítopo en polipéptido.
Un anticuerpo, oligopéptido, siARN, u otra molécula orgánica que"inhibe el crecimiento de células tumorales que expresan un polipéptido TAT" o un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica "inhibidora del crecimiento" son aquellos que dan lugar a una inhibición de crecimiento medible de las células cancerosas que expresan o sobreexpresan el polipéptido TAT apropiado. El polipéptido TAT puede ser un polipéptido transmembrana expresado en la superficie de una célula cancerosa o puede ser un polipéptido que es producido y secretado por una célula cancerosa. Los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos o moléculas orgánicas inhibidoras del crecimiento preferidos inhiben el crecimiento de las células tumorales que expresan TAT en más de un 20%, preferiblemente de aproximadamente un 20% a aproximadamente un 50% e incluso, más preferiblemente, en más de un 50%, (por ejemplo, de aproximadamente un 50% a aproximadamente un 100%), en comparación con el control apropiado, siendo habitualmente el control células tumorales no tratadas con el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica a analizar. En una realización, la inhibición del crecimiento se puede medir a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,1 a 30 \mug/ml o aproximadamente 0,5 nM a 200 nM en cultivo celular, donde la inhibición del crecimiento se determina 1-10 días después de la exposición de las células tumorales al anticuerpo. La inhibición del crecimiento de las células tumorales in vivo se puede determinar de varias maneras, tales como las descritas en la sección de Ejemplos Experimentales siguiente. El anticuerpo es inhibidor del crecimiento in vivo si la administración del anticuerpo anti-TAT a aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal da lugar a la reducción en el tamaño tumoral o proliferación de células tumorales en aproximadamente 5 días a 3 meses desde la primera administración del anticuerpo, preferiblemente en aproximadamente 5 a 30 días.
Un anticuerpo, oligopéptido, siARN, u otra molécula orgánica que "induce apoptosis" es aquel que induce la muerte celular programada determinada mediante la unión de annexina V, la fragmentación de ADN, contracción celular, dilatación del retículo endoplasmático, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (denominadas cuerpos apoptóticos). La célula es normalmente aquella que sobreexpresa un polipéptido TAT. Preferiblemente, la célula es una célula tumoral, por ejemplo, una célula de próstata, mama, ovario, estómago, endometrio, pulmón, riñón, colón, colorrectal, vejíga. Existen varios métodos disponibles para evaluar los eventos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo, la translocación de la fosfatidil serina (PS) se puede medir mediante la unión a annexina; la fragmentación de ADN se puede evaluar a través del "laddering" del ADN; y la condensación nuclear/cromatina junto con la fragmentación de ADN se pueden evaluar mediante cualquier aumento en células hipodiploides. Preferiblemente, el anticuerpo, el oligopéptido u otra molécula orgánica que induce la apoptosis es aquel que da lugar de aproximadamente 2 a 50 veces, preferiblemente de aproximadamente 5 a 50 veces, y aún más preferiblemente de aproximadamente 10 a 50 veces, la inducción de unión a annexina en relación a célula no tratada en un ensayo de unión a annexina.
Las "funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc de una variante en la secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo y varían con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen la unión a C1q y la citotoxicidad dependiente de complemento; la unión a receptor de Fc; citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; subregulación de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B); y la activación de células B.
"Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refieren a una forma de citotoxicidad en que la Ig secretada unida a receptores de Fc (FcRs) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células asesinas ("killer") naturales (NK), neutrófilos, y macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que porta el antígeno y, posteriormente, destruyan la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" las células citotóxicas y son absolutamente necesarias para dicha destrucción. Las células primarias para mediar la ADCC, las células NK, expresan Fc\gammaRIII solo, mientras que los monocitos expresan Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para determinar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo ADCC in vitro, tal como el descrito en las patentes de Estados Unidos 5.500.362 ó 5.821.337. Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede determinar in vivo, por ejemplo en un modelo animal, tal como el descrito en Clynes et al. PNAS (USA), 95:652-656 (1998).
Los términos "receptor Fc" o "FcR" describen un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. La FcR preferida es una FcR humana de secuencia nativa. Además, una FcR preferida es aquella que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases Fc\gammaRI, Fc\gammaRII, y Fc\gammaRIII, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente empalmadas ("spliced") de estos receptores. Los receptores Fc\gammaRII incluyen Fc\gammaRIIA (un "receptor de activación") y Fc\gammaRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos. El receptor de activación Fc\gammaRIIA contiene un motivo de activación del inmunoreceptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición Fc\gammaRIIB contiene un motivo de inhibición del inmunoreceptor basado en tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico (revisado en Daëron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Los FcRs se revisan en Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Otros FcRs, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, están comprendidos por el término "FcR" aquí. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976); y Kim et al., J. Immunol., 24:249
(1994)).
"Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan por lo menos Fc\gammaRIII y realizan la función efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; prefiriéndose las células PBMCs y NK. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa, por ejemplo, de sangre.
"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refieren a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación del mecanismo de complemento clásico se inicia mediante la unión del primer componente del sistema de complemento (C1q) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que están unidos a su antígeno afín. Para determinar la activación del complemento se puede realizar un ensayo CDC, por ejemplo tal como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza habitualmente por un crecimiento celular no regulado. Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o tumores limfoides. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de célula escamosa (por ejemplo, cáncer de célula escamosa epitelial), cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hipatocelular, cáncer gástrico o de estómago que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejíga, cáncer del tracto urinario, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colón, cáncer rectal, cáncer de bulba, cáncer de tiroides, carcinoma hipático, carcinoma anal, carcinoma de pene, melanoma, mieloma múltiple y linfoma de células B, cáncer de cerebro, así como cáncer de cabeza y cuello, y las metástasis asociadas.
Los términos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que están asociados con cierto grado de proliferación anormal de células. En una realización, el trastorno proliferativo celular es el
cáncer.
"Tumor", tal como se utiliza aquí, se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, tanto malignas como benignas y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.
Un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que "induce la muerte celular" es aquel que provoca que una célula viable se convierta en no viable. La célula es aquella que expresa un polipéptido TAT, preferiblemente una célula que sobreexpresa un polipéptido TAT en comparación con una célula normal del mismo tipo de tejido. El polipéptido TAT puede ser un polipéptido transmembrana expresado en la superficie de una célula cancerosa o puede ser un polipéptido que es producido y secretado por una célula cancerosa. Preferiblemente, la célula es una célula cancerosa, por ejemplo, una célula de mama, ovario, estómago, endométrio, glándula salivar, pulmón, riñón, colon, colorrectal, tiroides, páncreas o vejíga. La muerte celular in vitro se puede determinar en ausencia de complemento y de células efectoras inmunes para distinguir la muerte celular inducida por la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). De este modo, el ensayo por la muerte celular se puede realizar utilizando suero inactivado por calor (es decir, en ausencia de complemento) y en ausencia de células efectoras inmunes. Para determinar si el anticuerpo, oligopéptido, u otra molécula orgánica es capaz de inducir la muerte celular, la pérdida de la integridad de membrana evaluada mediante la captación de yoduro de propidio (PI), azul de tripano (véase Moore et al. Cytotechnology 17: 1-11 (1995)) o 7AAD se puede evaluar en relación con las células no tratadas. Los anticuerpos, oligopéptidos u otras moléculas orgánicas que inducen la muerte celular preferidas son aquellos que inducen la captación de PI en el ensayo de captación de PI en células
BT474.
Una "célula que expresa TAT" es una célula que expresa un polipéptido TAT endógeno o transfectado en la superficie celular o en una forma secretada. Un "cáncer que expresa TAT" es un cáncer que comprende células que tienen un polipéptido TAT presente en la superficie celular o que producen y secretan un polipéptido TAT. Un "cáncer que expresa TAT" produce opcionalmente niveles suficientes de polipéptido TAT en la superficie de células del mismo, de manera que un anticuerpo anti-TAT, un oligopéptido u otra molécula orgánica se pueden unir al mismo y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. En otra realización, un "cáncer que expresa TAT" produce y secreta opcionalmente niveles suficientes de polipéptido TAT, de manera que un anticuerpo anti-TAT, un oligopéptido u otra molécula orgánica antagonistas se pueden unir al mismo y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. Con respecto a esto último, el antagonista puede ser un oligonucléotido no codificante que reduce, inhibe o evita la producción y la secreción del polipéptido TAT secretado por células tumorales. Un cáncer que "sobreexpresa" un polipéptido TAT es aquel que presenta niveles significativamente más elevados de polipéptido TAT en la superficie celular del mismo, o produce y secreta, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Dicha sobreexpresión puede estar causada por la amplificación génica o mediante el aumento de la transcripción o la traducción. La sobreexpresión de polipéptido TAT se puede determinar en un ensayo de diagnóstico o pronóstico mediante la evaluación de niveles incrementados de la proteína TAT presente en la superficie de una célula, o secretada por la célula, (por ejemplo, mediante un ensayo de inmunohistoquímica utilizando anticuerpos anti-TAT preparados contra un polipéptido TAT aislado que se puede preparar utilizando tecnología de ADN recombinante a partir de un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido TAT; análisis FACS, etc.). Alternativamente, o adicionalmente, se pueden medir los niveles de ácido nucleico que codifica el polipéptido TAT o ARNm en la célula, por ejemplo, a través de hibridación in situ fluorescente utilizando una sonda basada en ácidos nucleicos correspondiente a un ácido nucleico que codifica TAT o el complemento del mismo; (FISH; véase WO98/45479 publicada en octubre 1998), técnicas de transferencia Southern, transferencia Northern o reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tales como PCR cuantitativa a tiempo real (RT-PCR). También se puede estudiar la sobreexpresión del polipéptido TAT midiendo el antígeno escindido en un fluido biológico, tal como suero, por ejemplo, utilizando ensayos basados en anticuerpos (véase, también por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 4,933,294 concedida el 12 de junio de 1990; WO91/05264 publicada el 18 de abril de 1991; la Patente de estados unidos 5,401,638 concedida el 28 de marzo de 1995; y Sias et al., J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)). A parte de los ensayos anteriores, existen varios ensayos in vivo para el técnico experto. Por ejemplo, se pueden exponer células en el cuerpo del paciente a un anticuerpo que es opcionalmente marcado con un marcador detectable, por ejemplo, un isótopo radioactivo, y se puede evaluar la unión del anticuerpo a células en el paciente, por ejemplo, mediante rastreo externo para la radioactividad o mediante en análisis de una biopsia tomada de un paciente previamente expuesto al anticuerpo.
Tal como se utiliza aquí, el término "inmunoadhesina", designa moléculas de tipo anticuerpo que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de la inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden la fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada y que es distinta del sitio de reconocimiento y unión a antígeno de un anticuerpo (es decir es "heteróloga"), y de una secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia contigua de aminoácidos que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluidos IgA-1 y IgA-2), IgE, IgD o IgM.
La palabra "marcador", cuando se usa aquí, se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica para generar anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica "marcados". El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo marcadores radioisotópicos o marcadores fluorescentes) o, en el caso del marcador enzimático, pueden catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato detectables.
El término "agente citotóxico" tal como se utiliza aquí se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o causa la destrucción de las células. El término pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, At^{211}, I^{131}, I^{125}, Y^{90}, Re^{186}, Re^{188}, Sm^{153}, Bi^{212}, P^{32} e isótopos radioactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, vinca, alcaloides (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina, u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de los mismos, tales como enzimas nucleolíticos, antibióticos, y toxinas, tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos, y los diversos agentes antitumorales o anticancerosos descritos a continuación. A continuación, se describen otros agentes citotóxicos. Un agente tumoricida causa la destrucción de células tumorales. Las citotoxinas se pueden unir covalentemente a un anticuerpo para dirigir la toxina a una célula particular de interés que expresa el antígeno. Las citotoxinas útiles son sus enlazadores, que incluyen, sin limitación, los siguientes:
Enlazadores
MC = maleimidocaproílo
Val Cit = valina-citrulina, punto de dipéptido en el enlazador divisible por proteasa.
Citrulina = ácido 2-amino-5-ureido pentanoico
PAB = p-aminobencilcarbamoílo (parte "autoinmoladora" del enlazador)
Me= N-metil-valina citrulina, donde el enlace peptídico del enlazador ha sido modificado para evitar su división por la catepsina B
MC(PEG)6-OH = maleimidocaproil-polietilenglicol, unido a cisteínas de anticuerpo.
SPP = N-Succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoato
SMCC = N-Succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato.
Fármacos citotóxicos
MMAE = mono-metil auristatina E (PM 718)
MMAF = variante de auristatina E (MMAE) con una fenilalanina en el extremo C-terminal del fármaco (PM 731,5)
AEVB = auristatin E valeril bencilhidrazona, enlazador lábil a ácido a través del extremo C-terminal de AE (PM 732)
AFP =Auristatin F fenilen diamina; (la variante de fenilalanina unida al anticuerpo a través del extremo C-terminal mediante un espaciador de fenilen diamina) (PM 732).
Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a un compuesto o una composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula cancerosa que expresa TAT, in vitro o in vivo. De este modo, el agente inhibidor del crecimiento es aquel que reduce significativamente el porcentaje de células que expresan TAT en la fase S. Algunos ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un punto diferente de la fase S), tales como agentes que inducen la interrupción de G1 y la interrupción de la fase M. Algunos bloqueadores clásicos de fase M incluyen los vincas (vincristina y vinblastina), taxanos, e inhibidores de topoisomerasa II, tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido, y bleomicina. Los agentes que interrumpen G1 también afectan a la interrupción de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloroetamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Puede encontrarse más información en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn y Israel, eds., Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" por Murakami et al., (WB Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente la página 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticancerosos derivados del tejo. El docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo es un análogo semisintético del paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). El paclitaxel y el docetaxel promueven el ensamblaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos mediante la prevención de la despolimerizaciuón, lo que da lugar a la inhibición de la mitosis en células.
"Doxorrubicina" es un antibiótico de antraciclina. El nombre químico completo de la doxorrubicina es (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-\alpha-L-lixo-hexapiranosil) oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-5,12-naftacenodiona.
El término "citoquina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población de células que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Algunos ejemplos de dichas citoquinas son linfoquinas, monoquinas, y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citoquinas se incluyen hormonas del crecimiento, tales como hormona del crecimiento humano, hormona del crecimiento humano N-metionilo, y hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroidal; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas de glicoproteínas, tales como hormona estimulante del folículo (FSH), hormona estimulante de la tiroides (TSH), y hormona luteínica (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor \alpha y \beta de necrosis tumoral; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso, tales como NGF-\beta; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformante (TGFs), tales como TGF-\alpha y TGF-\beta, factor de crecimiento I y II de tipo insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones, tales como interferón-\alpha, \beta, y \gamma; factores estimulantes de colonias (CSFs), tales como macrófago-CSF (M-CSF); granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF); y granulocito-CSF (G-CSF); interleuquinas (ILs), tales como IL-1, IL-1\alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5 IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral, tal como TNF-\alpha o TNF-\beta, y otros factores de polipéptidos que incluyen LIF y ligando kit (LK). Tal y como se utiliza en la presente invención, el término citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.
El término "prospecto" se utiliza para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de los productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, utilización, dosis, administración, contraindicaciones y/o avisos con respecto al uso de dichos productos terapéuticos.
TABLA 1
2
TABLA 1 (continuación)
3
TABLA 1 (continuación)
4
TABLA 1 (continuación)
5
TABLA 1 (continuación)
6
TABLA 1 (continuación)
7
TABLA 1 (continuación)
8
TABLA 1 (continuación)
9
TABLA 1 (continuación)
10
TABLA 1 (continuación)
11
TABLA 1 (continuación)
12
TABLA 1 (continuación)
13
TABLA 1 (continuación)
14
TABLA 1 (continuación)
15
TABLA 1 (continuación)
16
TABLA 1 (continuación)
17
TABLA 1 (continuación)
18
TABLA 1 (continuación)
19
TABLA 1 (continuación)
20
TABLA 1 (continuación)
21
TABLA 1 (continuación)
22
TABLA 1 (continuación)
23
TABLA 1 (continuación)
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 (continuación)
240
TABLA 1 (continuación)
25
TABLA 1 (continuación)
26
TABLA 1 (continuación)
27
TABLA 1 (continuación)
28
TABLA 1 (continuación)
29
TABLA 1 (continuación)
30
TABLA 1 (continuación)
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2 
\vskip1.000000\baselineskip
32
TABLA 3 
\vskip1.000000\baselineskip
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4 
\vskip1.000000\baselineskip
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 5 
\vskip1.000000\baselineskip
35
36 
\newpage
II. Composiciones y métodos de la invención A. Anticuerpos anti-TAT
En una realización, la presente invención proporciona anticuerpos anti-TAT que pueden ser útiles como agentes terapéuticos y/o de diagnóstico. Entre los anticuerpos de ejemplo se incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.
1. Anticuerpos policlonales
Los anticuerpos policlonales se desarrollan preferiblemente en animales mediante inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno pertinente y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno pertinente (especialmente cuando se utilizan péptidos sintéticos) a una proteína que es inmunogénica en la especie a inmunizar. Por ejemplo, el antígeno se puede conjugar a la hemocianina de la lapa californiana (KLH), albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl_{2}, o R^{1}N=C=NR, donde R y R^{1} son grupos alquilo diferentes.
Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados mediante la combinación de, por ejemplo, 100 \mug o 5 \mug de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund y la inyección intradérmica de la solución en múltiples sitios. Un mes más tarde, los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a catorce días más tarde los animales sangran y el suero se analiza por el título de anticuerpo. Los animales se refuerzan hasta que el título se estabiliza. Los conjugados también se pueden producir en cultivos de células recombinantes como fusiones de proteínas. Además, se utilizan de forma adecuada agentes de agregación, tales como el alumbre, para potenciar la respuesta
inmune.
2. Anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos monoclonales se pueden producir utilizando el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975) o se pueden producir mediante métodos de ADN recombinante (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567).
En el método del hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, se inmunizan como se ha descrito anteriormente para conseguir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Después de la inmunización, los linfocitos se aislan y se fusionan a continuación con una línea celular de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103 (Academia Press. 1986)).
Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y se desarrollan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas (también referidas como compañero de fusión). Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo selectivo para los hibridomas incluirán habitualmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes de HGPRT.
Las células de mieloma de compañero de fusión preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficaz, contribuyen a una producción estable a un nivel elevado de anticuerpo por las células seleccionadas productoras de los anticuerpos, y son sensibles a un medio selectivo que se selecciona contra las células parentales no fusionadas. Entre las líneas de células de mieloma preferidas están las líneas de mieloma murinas, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y las células SP-2 y derivadas, por ejemplo células X63-Ag8-653, disponibles en la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, Estados Unidos. También se han descrito líneas de células de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
Se analiza el medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante la inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA).
La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y se pueden desarrollar mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103 (Academia Press, 1986)). Entre los medios de cultivo adecuados para este objetivo se incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o medio RPM1-1640. Además, las células de hibridoma se pueden desarrollar in vivo como tumores ascíticos en un animal, por ejemplo, mediante inyección i.p. de las células en los ratones.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de forma adecuada del medio de cultivo, fluido ascítico, o suero mediante procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales, tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad (por ejemplo, utilizando proteína A o proteína G-Sefarosa) o cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, etc.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped, tales como células E. coli, células COS de simios, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de ningún otro modo producen proteína anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Entre los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican el anticuerpo se incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol., 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol Revs., 130:151-188 (1992).
En una realización adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos monoclonales se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos en fagos generados utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Las posteriores publicaciones describen la producción de anticuerpos humanos de afinidad elevada (rango de nM) mediante intercambio de cadenas (Marks et al., Biol. Technology, 10:779-783 (1992)), así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). De este modo, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas convencionales de hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.
El ADN que codifica el anticuerpo se puede modificar para producir polipéptidos anticuerpo quiméricos o de fusión, por ejemplo, mediante la sustitución de las secuencias de los dominios constantes de cadena pesada y ligera (C_{H} y C_{L}) humanos por las secuencias murinas homólogas (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; Morrison et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o mediante la fusión de la secuencia codificante de inmunoglobulina con toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no es inmunoglobulina (polipéptido heterólogo). Las secuencias de polipéptidos que no son inmunoglobulinas se pueden sustituir por los dominios constantes de un anticuerpo o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación a antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo divalente quimérico que comprende un sitio de combinación a antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación a antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.
3. Anticuerpos humanos y humanizados
Los anticuerpos anti-TAT de la presente invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Entre los anticuerpos humanizados se incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos del armazón ("framework") de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de la CDR o el armazón importados. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones de FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado optimamente también comprenderá por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al ., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332 : 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].
Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos en la técnica. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo a partir de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se denominan frecuentemente como residuos "importados", que habitualmente se obtienen de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), mediante la sustitución de secuencias de CDRs o CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567) en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para utilizar en la fabricación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad y la respuesta HAMA (anticuerpo anti-ratón de humano) cuando el anticuerpo pretende utilizarse para uso terapéutico humano. Según el método denominado "mejor-ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda la biblioteca de secuencias de dominios variables humanos conocidos. Se identifica el dominio V humano de la secuencia humana que está más próxima a la del roedor y se acepta la región de armazón (FR) humana en el mismo para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Otro método utiliza una región de armazón particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma región de armazón se puede utilizar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151: 2623 (1993)).
Es también importante que los anticuerpos se humanicen manteniendo una afinidad elevada por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, según un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas están disponibles normalmente y son familiares para los expertos en la materia. Existen programas informáticos que muestran y visualizan probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La observación de estas visualizaciones permite el análisis de la probable función de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar a partir de secuencias receptoras e importadas, de manera que se consigue la característica del anticuerpo deseado, tal como una mayor afinidad para el antígeno o antígenos diana. En general, los residuos de la región hipervariable están directamente y más sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión al antígeno.
Se contemplan varias formas de un anticuerpo anti-TAT humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como Fab, que está conjugado opcionalmente con uno o más agentes citotóxicos con el fin de generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgG1 intacto.
Como alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, tras inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la región de unión (J_{H}) de la cadena pesada del anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y en la línea germinal da lugar a la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia del grupo de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes en la línea germinal dará lugar a la producción de anticuerpos humanos tras la estimulación con antígenos. Ver, por ejemplo Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993); y las Patentes de Estados Unidos 5.545.806, 5.569.825 y 5.591.669 (todas de GenPharm); 5.547.807; y WO 97/17852.
Alternativamente, la tecnología de expresión de fagos (McCafferty et al., Nature 348, 552-553 [1990]) se puede utilizar para producir anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. Según esta técnica, los genes del dominio V de anticuerpo se clonan en el marco en un gen de proteína de recubrimiento principal o secundario de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se expresan como fragmentos de anticuerpos funcionales sobre la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena sencilla del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan lugar a la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta esas propiedades. De este modo, el fago mimetiza algunas de las propiedades de la célula B. La expresión en fagos se puede realizar en una variedad de formatos; para su revisión ver, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Se pueden usar varias fuentes de segmentos de genes V para la expresión en fagos. Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) aislaron un conjunto diverso de anticuerpos de anti-oxazolona a partir de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos para un conjunto diverso de antígenos (incluyendo auto-antígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993). Véase también las Patentes de Estados Unidos Nos. 5.565.332 y 5.573.905.
Tal como se ha descrito anteriormente, también se pueden generar anticuerpos humanos por células B activadas in vivo (véase las Patentes de Estados Unidos 5.567.610 y 5.229.275).
4. Fragmentos de anticuerpos
En ciertas circunstancias, existen ventajas al utilizar fragmentos de anticuerpos, en lugar de anticuerpos completos. El menor tamaño de los fragmentos permite una depuración rápida y puede conducir a un mejor acceso a los tumores sólidos.
Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Habitualmente, estos fragmentos se derivaban mediante la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir actualmente directamente mediante células huésped recombinantes. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv se pueden todos expresar en y secretarse de E. coli, permitiendo así la producción simple de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar a partir de las bibliotecas de anticuerpos en fagos descritas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E coli y pueden acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')_{2} (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Según otra estrategia, los fragmentos F(Ab')_{2} se pueden aislar directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Los fragmentos Fab y F(ab')_{2} con una mayor vida media in vivo que comprenden residuos de epítopo de unión a receptor salvaje se describen en la Patente de Estados Unidos No. 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el técnico de la materia. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). Véase WO 93/16185; Patente de Estados Unidos No. 5.571.894; y Patente de Estados Unidos No. 5.587.458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos carentes de regiones constantes; de este modo, son adecuadas para una unión no específica reducida durante el uso in vivo. Las proteínas de fusión con sFv se pueden construir para producir la fusión de una proteína efectora en el extremo amino o carboxi de un sFv. Véase, Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5.641.870, por ejemplo. Dichos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.
5. Anticuerpos biespecíficos
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión con por lo menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo se pueden unir a dos epítopos diferentes de una proteína TAT tal como se describe aquí. Otros de dichos anticuerpos pueden combinar un sitio de unión a TAT con un sitio de unión para otra proteína. Alternativamente, un brazo anti-TAT puede combinarse con un brazo que se une a una molécula inductora en un leucocito, tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD3) o receptores Fc para IgG (FC\gammaR), tales como FC\gammaRI (CD64), FC\gammaRII (CD32) y FC\gammaRIII (CD16) con el fin de centrar y localizar los mecanismos de defensa celulares en la célula que expresa TAT. Estos anticuerpos biespecíficos también se pueden utilizar para localizar agentes citotóxicos en células que expresan TAT. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a TAT y un brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-\alpha, alcaloide vinca, cadena A de ricina, metotrexato o hapteno con isótopo radioactivo). Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}).
WO 96/16673 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-Fc\gammaRIII y la Patente de Estados Unidos
5.837.234 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-Fc\gammaRI. En WO98/02463 se muestra un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/Fc\alpha. La Patente de Estados Unidos No. 5.821.337 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-CD3.
Los procedimientos para realizar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. La producción habitual de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Milstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante incómoda y los rendimientos de producto son bajos. En WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) se describen procesos similares.
Según una estrategia diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias del dominio constante de inmunoglobulina. La fusión se produce preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones bisagra, C_{H}2 y C_{H}3. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (C_{H}1) contenga el sitio necesario para la unión a cadena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en una célula huésped adecuada. Esto proporciona una mayor flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan el rendimiento óptimo del anticuerpo biespecífico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes de dos o las tres cadenas de polipéptido en un único vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales da lugar a rendimientos elevados o cuando las proporciones no tienen un efecto significativo en el rendimiento de la combinación de cadenas deseadas.
En una realización preferida de esta estrategia, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y una pareja de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se observó que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulinas no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera sencilla de separación. Esta estrategia se describe en WO 94/04690. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).
Según otra estrategia descrita en la Patente de Estados Unidos No. 5.731.168, se puede diseñar la interfase entre una pareja de moléculas de anticuerpos para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de cultivos de células recombinantes. La interfase preferida comprende por lo menos una parte del dominio C_{H}3. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o cadenas laterales grandes en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo mediante la sustitución de cadenas laterales de aminoácidos grandes por más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.
Entre los anticuerpos biespecíficos se incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, y el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir las células del sistema inmune a células no deseadas (Patente de Estados Unidos No. 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden fabricar utilizando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen en la Patente de Estados Unidos No. 4.676.980 junto con un grupo de técnicas de reticulación.
Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos utilizando enlaces químicos. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se descomponen proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol, arsenito sódico, para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de enlaces disulfuro intermoleculares. A continuación, los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte a continuación en Fab'-tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
El reciente progreso ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli., que se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med, 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico F(ab')_{2} completamente humanizada. Cada fragmento de Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a un acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y células T humanas normales, así como de desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumores de mama humanos.
Se han descrito también varias técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y, a continuación, se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología de "diabody" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un V_{H} conectado a un V_{L} mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios V_{L} y V_{H} complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión a antígeno. También se ha descrito otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante la utilización de dímeros de Fv de cadena sencilla (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Se consideran los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
6. Anticuerpos heteroconjugados
Los anticuerpos heteroconjugados también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas [Patente de Estados Unidos No. 4.676.980] y para el tratamiento de la infección por VIH [WO 91/00360: WO 92/200373; EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos se pueden preparar in vitro utilizando procedimientos conocidos en la química sintética de proteínas, incluyendo los que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante la formación de un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este objetivo se incluyen el iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 4.676.980.
7. Anticuerpos multivalentes
Un anticuerpo multivalente se puede internalizar (y/o catabolizar) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son diferentes de los de la clase IgM) con tres o más sitios de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que se pueden producir fácilmente mediante expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas polipeptídicas del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión a antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste en) una región Fc o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fc y tres o más sitios de unión a antígeno amino terminales a la región Fc. El anticuerpo multivalente preferido de la presente invención comprende (o consiste en) tres a aproximadamente ocho, pero preferiblemente cuatro, sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente comprende por lo menos una cadena polipeptídica (y preferiblemente dos cadenas polipeptídicas), donde la cadena o cadenas polipeptídicas comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la cadena o cadenas polipeptídicas pueden comprender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena polipeptídica de una región Fc, X1 y X2 representan un aminoácido o un polipéptido, y n es 0 ó 1. Por ejemplo, la cadena o cadenas polipeptídicas pueden comprender: VH-CH1-enlazador flexible-VH-CH1-cadena de región Fc; o VH-CH1-VH-CH1-cadena de región Fc. El anticuerpo multivalente de la presente invención comprende preferiblemente además por lo menos dos (y preferiblemente cuatro) polipéptidos del dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente de la presente invención puede comprender, por ejemplo, de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos del dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos del dominio variable de cadena ligera contemplados aquí comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, además, comprenden un dominio CL.
8. Diseño de la función efectora
Se puede desear modificar el anticuerpo de la presente invención con respecto a la función efectora, por ejemplo, con el fin de aumentar la citotoxicidad mediada por célula dependiente de antígeno (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede conseguir mediante la introducción de una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, el residuo o residuos de cisteínas se pueden introducir en la región Fc, permitiendo de esta manera la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede mejorar la capacidad de internalización y/o incrementar la citólisis mediada por el complemento y la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Véase Caron et al., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con una actividad anti-tumoral aumentada también se pueden preparar utilizando entrecruzadores heterobifuncionales tal y como se describe en Wolf et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo para que tenga regiones Fc duales y, de esta manera, pueda aumentar la lisis por complemento y las capacidades de ADCC. Véase, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989). Para aumentar la vida media en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítopo de unión al receptor salvaje en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) tal como se describe en la Patente de Estados Unidos 5,739,277, por ejemplo. Tal como se utiliza aquí, el término "epítopo de unión al receptor salvaje" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula IgG (por ejemplo, IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} o IgG_{4}) que es responsable del incremento de la vida media en suero in vivo de la molécula IgG.
9. Inmunoconjugados
La presente invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).
Anteriormente se han descrito agentes quimioterapéuticos útiles para la generación de dichos inmunoconjugados. Entre las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden utilizar se incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de la toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Existe un conjunto de radionucleidos disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Algunos ejemplos son ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se fabrican utilizando un conjunto de agentes bifuncionales acopladores de proteínas, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal y como se describe en Vitella et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo. Véase WO94/11026.
También se contemplan en la presente invención conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como caliqueamicina, maitansinoides, un tricoteno y CC1065 y los derivados de estas toxinas que tiene actividad de toxina.
Maitansina y maitansinoides
En una realización preferida, se conjuga un anticuerpo anti-TAT (longitud completa o fragmentos) a una o más moléculas maitansinoides.
Los maitansinoides son inhibidores mitotóticos que actúan inhibiendo la polimerización de tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto Maytenus serrata del África del este (Patente de Estados Unidos No. 3,896,111). Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de C-3 maitansinol (Patente de Estados Unidos No. (4,151,042). El maitansinol sintético y derivados y análogos del mismo se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348;
4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533, las descripciones de las cuales se incorporan expresamente aquí por referencia.
Conjugados maitansinoide-anticuerpo
En un intento por mejorar su índice terapéutico, la maitansina y los maitansinoides se han conjugado a anticuerpos que se unen específicamente a antígenos de células tumorales. Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,208,020, 5,416,064 y la Patente Europea EP 0 425 235 B1, las descripciones de las cuales se incorporan expresamente aquí por referencia. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996) describieron inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide designado como DM1 unido al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorectal humano. Se observó que el conjugado era altamente citotóxico hacia las células del cáncer de colon cultivadas y mostró actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento de tumores in vivo. Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) describen inmunoconjugados en los que se conjugó un maitansinoide a través de un enlace disulfuro al anticuerpo murino A7 que se une a un antígeno en líneas celulares de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une al oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado Ta.1-maitansinoide se ensayó in vitro en la línea de células de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 10^{5} antígenos de la superficie de HER-2 por célula. El fármaco conjugado consiguió un grado de citotoxicidad similar al del fármaco maitansinoide libre, que se podía incrementar mediante el incremento del número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró una citotoxicidad sistémica baja en ratones.
Conjugados (inmunoconjugados) de anticuerpo anti-polipéptido TAT-maitansinoide
Los conjugados de anticuerpo anti-TAT-maitansinoide se preparan mediante la unión química de un anticuerpo anti-TAT a una molécula maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica del anticuerpo o la molécula maitansinoide. Un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo han mostrado una eficacia en el aumento de la citotoxicidad de células diana sin afectar negativamente a la función o solubilidad del anticuerpo, aunque se esperaría que incluso una molécula de toxina/anticuerpo aumentara la citotoxicidad sobre el uso de anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son bien conocidos en la técnica y se pueden sintetizar mediante técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Se describen maitansinoides adecuados, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 5,208,020 y en las otras publicaciones de patente y no patente referidas anteriormente aquí. Los maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tales como varios ésteres de maitansinol.
Existen muchos grupos enlazadores conocidos en la técnica para fabricar conjugados anticuerpo-maitansinoide, incluyendo, por ejemplo, los descritos en la Patente de Estados Unidos No. 5,208,020 o Patente EP 0 425 235 B1, y Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992). Los grupos enlazadores incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles peptidasa o grupos lábiles esterasa, tal como se describe en las patentes identificadas anteriormente, siendo preferidos los grupos disulfuro y tioéter.
Los conjugados del anticuerpo y el maitansinoide se pueden fabricar utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como, dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como, bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173: 723-737 [1978]), y N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro.
El enlazador se puede unir a la molécula de maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace éster puede estar formado por la reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede tener lugar en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una realización preferida, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol.
Caliqueamicina
Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo anti-TAT conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de caliqueamicina es capaz de producir roturas de ADN de doble cadena a concentraciones subpicomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de caliqueamicina, véase las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,712,374; 5,714,586; 5,739,116; 5,767,285; 5,770,701; 5,770,710; 5,773,001; y 5,877,296 (todas de la American Cyanamid Company). Entre los análogos estructurales de caliqueamicina que se pueden utilizar se incluyen, pero sin limitación, \gamma_{1}^{1}, \alpha_{2}^{1}, \alpha_{3}^{1}, N-acetil-\gamma_{1}^{1}, PSAG, y \theta_{1}^{1} (Hinman et al, CancerRes 53: 3336-3342 (1993); Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) y las patentes de Estados Unidos mencionadas anteriormente de American Cyanamid). Otro fármaco antitumoral al que el anticuerpo se puede conjugar es QFA, un antifolato. Tanto la caliqueamicina como QFA tienen sitios intracelulares de acción y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por anticuerpos aumenta ampliamente sus efectos citotóxicos.
Otros agentes citotóxicos
Otros agentes antitumorales que se pueden conjugar a los anticuerpos anti-TAT de la presente invención incluyen BCNU, estrepzoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocida colectivamente como complejo LL-E33288 descrita en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,053,394, 5,770,710, así como esperamicinas (patente de Estados Unidos 5,877,296).
Entre las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden utilizar se incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAPS), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, WO 93/21232 publicada el 28 de octubre de 1993.
La presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa, tal como una desorribonucleasa; ADNasa).
Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Existe un conjunto de isótopos radioactivos disponibles para la producción de anticuerpos anti-TAT radioconjugados. Algunos ejemplos incluyen At^{211}, I^{131}, I^{125}, Y^{90}, Re^{186}, Re^{188}, Sm^{153}, Bi^{212}, P^{32}, Pb^{212} e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se utiliza el conjugado para el diagnóstico, puede comprender un átomo radioactivo para estudios centellográficos, por ejemplo tc^{99m} o I^{123}, o un marcador de spin para la obtención de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como imagen por resonancia magnética, mri), tal como yodo-123, de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Los radiomarcadores u otros marcadores se pueden incorporar en el conjugado de varias maneras conocidas. Por ejemplo, el péptido se puede biosintetizar o se puede sintetizar mediante la síntesis química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácidos adecuados que implican, por ejemplo, fluor-19 en lugar de hidrógeno. Los marcadores, tales como, tc^{99m} o I^{123}, Re^{186}, Re^{188} e In^{111} se pueden unir mediante un residuo de cisteína en el péptido. El ytrio-90 se puede unir mediante un residuo de lisina. El método de IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57) se puede utilizar para incorporar yodo-123. "Monoclonal antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle.
Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se pueden fabricar utilizando un conjunto de agentes bifuncionales acopladores de proteínas, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal y como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo. Véase WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador separable" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede utilizar un enlazador lábil en ácido, un enlazador sensible a peptidasa, un enlazador fotolábil, un enlazador dimetilo o un enlazador que contiene disulfuro (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131; Patente de Estados Unidos No. 5,208,020).
Alternativamente, se puede fabricar una proteína de fusión que comprende el anticuerpo anti-TAT y agente citotóxico, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos partes del conjugado ya sea adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.
En otra realización, el anticuerpo se puede conjugar a un "receptor" (tal como estreptavidina) para su utilización en el pre-reconocimiento de tumores donde se administra el conjugado anticuerpo-receptor al paciente, seguido de la extracción del conjugado no unido de la circulación utilizando un agente depurador y, a continuación, la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidita) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleido).
10. Inmunoliposomas
Los anticuerpos anti-TAT descritos en la presente invención también se pueden formular como inmunoliposomas. Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivo que es útil para la liberación de un fármaco a un mamífero. Los componentes del liposoma están dispuestos habitualmente en una formación de bicapa, similar a la disposición de los lípidos de las membranas biológicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); Pat. de Estados Unidos Nos. 4.485.045 y 4.544.545; y WO97/38731 publicada el 23 de octubre de 1997. Liposomas con mayor tiempo de circulación se describen en la Patente de Estados Unidos No. 5.013.556.
Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente solicitud se pueden conjugar con los liposomas tal como se describe en Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. En el liposoma está contenido opcionalmente un agente quimioterapéutico. Véase Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989).
B. Oligopéptidos de unión a TAT
Los oligopéptidos de unión a TAT son oligopéptidos que se unen, preferiblemente específicamente, a un polipéptido TAT tal como se describe aquí. Los oligopéptidos de unión a TAT se pueden sintetizar químicamente utilizando la metodología de síntesis de oligopéptidos conocida o se pueden preparar y purificar utilizando tecnología recombinante. Los oligopéptidos de unión a TAT tienen habitualmente por lo menos aproximadamente 5 aminoácidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ó 100 aminoácidos de longitud o más, donde dichos oligopéptidos son capaces de unirse, preferiblemente específicamente, a un polipéptido TAT tal como se describe aquí. Los oligopéptidos de unión a TAT se pueden identificar sin una gran experimentación utilizando técnicas conocidas. En este aspecto, cabe indicar que las técnicas para cribar bibliotecas de oligopéptidos para oligopéptidos que son capaces de unirse específicamente a un polipéptido diana son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; Publicación PCT Nos. WO 84/03506 y WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102: 259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140: 611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222: 581; Kang, A.S. et al. (1991) Pcoc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8363, y Smith, G. P. (1991) Current Opin, Biotechnol., 2:
668).
En este aspecto, la expresión en bacteriófagos (fagos) es una técnica bien conocida que permite cribar bibliotecas grandes de oligopéptidos para identificar el miembro o miembros de estas bibliotecas que son capaces de unirse específicamente a un polipéptido diana. La expresión en fago es una técnica por la cual se expresan variantes de polipéptidos como proteínas de fusión a la proteína de recubrimiento en la superficie de partículas de bacteriófagos (Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386). La utilidad de la expresión en fagos radica en el hecho de que grandes bibliotecas de variantes de proteínas seleccionadas al azar (o ADNcs clonados al azar) se pueden separar rápida y eficazmente en las secuencias que se unen a una molécula diana con gran afinidad. La expresión de bibliotecas de péptidos (Cwirla, S. E. et al. (1990Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378) o proteínas (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222: 581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8363) en fagos se ha utilizado para cribar millones de polipéptidos u oligopéptidos en aquellos con propiedades de unión específicas (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2: 668). La separación de la bibliotecas en fagos de mutantes aleatorios requiere una estrategia para construir y propagar un gran número de variantes, un procedimiento para la purificación por afinidad utilizando el receptor diana, y un medio de evaluación de los resultados de enriquecimientos de unión. Patentes de Estados Unidos nos. 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, y 5,663,143.
Aunque la mayoría de métodos de expresión en fago han utilizado sistemas de expresión en fago filamentoso, también son conocidos los sistemas de expresión en fago lamboide (WO 95/34683; U.S. 5,627,024), sistema de expresión en fago T4 (Ren et al., Gene, 215: 439; Zhu Z. (1997), CAN 33: 534; Jiang J. et al. (1997), can 128:44380; Ren Z-J et al. (1997) CAN 127:215644; Ren, Z-J. (1996) Protein Sci., 5: 1833; Efimov, V.P. et al. (1995), Virus Genes, 10: 173) y sistemas de expresión en fago T7 (Smith, G.P, y Scott, J.K. (1993) Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); U.S. 5,766,905).
Actualmente se han desarrollado muchas otras mejoras y variaciones del concepto básico de expresión en fagos. Estas mejoras aumentan la capacidad de los sistemas de expresión para cribar bibliotecas de péptidos para unirse a moléculas diana seleccionadas y para expresar proteínas funcionales con el potencial de cribar estas proteínas por las propiedades deseadas. Se han desarrollado dispositivos de reacción combinatoria para las reacciones de expresión en fagos (WO 98/14277) y se han utilizado bibliotecas de expresión en fagos para analizar y controlar interacciones bimoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) y propiedades de péptidos helicoidales obligados (WO 98/20036). WO 97/35196 describe un método para aislar un ligando de afinidad en el que se pone en contacto una biblioteca de expresión en fagos con una solución en la que el ligando se unirá a una molécula diana y una segunda solución en la que el ligando de afinidad no se unirá a la molécula diana, para aislar selectivamente los ligandos de unión. WO 97/46251 describe un método para la bioadsorción de una biblioteca de expresión en fagos aleatoria con un anticuerpo purificado por afinidad y a continuación el aislamiento del fago de unión, seguido de un proceso de microadsorción utilizando pocillos de microplacas para aislar el fago de unión con afinidad elevada. También se ha descrito el uso de proteína A de Staphlylococcus aureus como etiqueta de afinidad (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9: 187). WO 97/47314 describe el uso de bibliotecas de sustracción de sustrato para distinguir las especificidades de enzima utilizando una biblioteca combinatoria que puede ser una biblioteca de expresión en fagos. En WO 97/094446 se describe un método para seleccionar enzimas adecuadas para su uso en detergentes utilizando la expresión en fagos. Métodos adicionales de selección de proteínas de unión específica se describen en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,498,538,5,432,018, y WO 98/15833.
Los métodos de generación de bibliotecas de péptidos y cribado de estas bibliotecas también se describen en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192, y 5,723,323.
C. Moléculas orgánicas de unión a TAT
Las moléculas orgánicas de unión a TAT son moléculas orgánicas diferentes de oligopéptidos o anticuerpos tal como se definen aquí, que se unen, preferiblemente específicamente, a un polipéptido TAT tal como se describe aquí. Las moléculas orgánicas de unión a TAT se pueden identificar y sintetizar químicamente utilizando metodología conocida (véase, por ejemplo, Publicación PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585). Las moléculas orgánicas de unión a TAT tienen habitualmente menos de aproximadamente 2000 daltons de tamaño, alternativamente menos de aproximadamente 1500, 750, 500, 250 ó 200 daltons de tamaño, donde dichas moléculas orgánicas que son capaces de unirse, preferiblemente específicamente, a un polipéptido tal como se describe aquí, se pueden identificar sin una gran experimentación utilizando técnicas conocidas. En este aspecto, cabe indicar que las técnicas para cribar bibliotecas de moléculas orgánicas en moléculas que son capaces de unirse a un polipéptido diana son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, la Publicación PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585). Las moléculas orgánicas de unión a TAT pueden ser, por ejemplo, aldehídos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidrazinas N-sustituidas, hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acetales, tioacetales, haluros de arilo, sulfonatos de arilo, haluros de alquilo, sulfonatos de alquilo, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, anilinas, alquenos, alquinos, dioles, amino alcoholes, oxazolidinas, oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloruros de sulfonilo, compuestos diazo, cloruros de ácido o
similares.
D. Cribado de anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos de unión a TAT y moléculas orgánicas de unión a TAT con las propiedades deseadas
Las técnicas para generar anticuerpos, oligopéptidos y moléculas orgánicas que se unen a polipéptidos TAT se han descrito anteriormente. Se pueden seleccionar además anticuerpos, oligopéptidos u otras moléculas orgánicas con ciertas características biológicas, según se desee.
Los efectos inhibidores del crecimiento de un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido u otra molécula orgánica de la invención se pueden valorar mediante los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando células que expresan un polipéptido TAT endógenamente o tras la transfección con el gen de TAT. Por ejemplo, las líneas de células tumorales y las células transfectadas con TAT apropiadas se pueden tratar con un anticuerpo monoclonal anti-TAT, oligopéptido u otra molécula orgánica de la invención a varias concentraciones durante unos días (por ejemplo, 2-7 días) y se pueden teñir con violeta cristal o MTT o analizarse mediante algún otro ensayo colorimétrico. Otro método de medición de la proliferación sería mediante la comparación de la captación de ^{3}H-timidina por las células tratadas en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de unión a TAT o molécula orgánica de unión a TAT de la invención. Después del tratamiento, las células se recogen y se cuantifica la cantidad de radioactividad incorporada en el ADN en un contador de centelleo. Los controles positivos apropiados incluyen el tratamiento de una línea celular seleccionada con un anticuerpo inhibidor del crecimiento conocido por inhibidor el crecimiento de esa línea celular. La inhibición del crecimiento de las células tumorales in vivo se puede determinar de varias maneras conocidas en la técnica. Preferiblemente, la célula tumoral es la que sobreexpresa un polipéptido TAT. Preferiblemente, el anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de unión a TAT o molécula orgánica de unión a TAT inhibirán la proliferación celular de una célula tumoral que expresa TAT in vitro o in vivo en aproximadamente 25-100% en comparación con la célula tumoral no tratada, más preferiblemente, en aproximadamente 30-100%, e incluso más preferiblemente en aproximadamente 50-100% ó 70-100%, en una realización, a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,5 a 30 \mug/ml. La inhibición del crecimiento se puede medir a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,5 a 30 \mug/ml o aproximadamente 0,5 nM a 200 nM en cultivo celular, donde la inhibición del crecimiento se determina 1-10 días después de la exposición de las células tumorales al anticuerpo. El anticuerpo es inhibidor del crecimiento in vivo si la administración del anticuerpo anti-TAT de aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal da lugar a la reducción del tamaño tumoral o la reducción de la proliferación del tumor dentro de aproximadamente 5 días a 3 meses desde la primera administración del anticuerpo, preferiblemente dentro de aproximadamente 5 a 30 días.
Para seleccionar un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de unión a TAT o molécula orgánica de unión a TAT que inducen la muerte celular, se pueden evaluar la pérdida de integridad de la membrana indicada mediante, por ejemplo, la captación de yoduro de propidio (PI), azul de tripano o 7AAD en relación al control. Se puede realizar un ensayo de captación de PI en ausencia de complemento y células efectoras inmunes. Las células tumorales que expresan el polipéptido TAT se incuban con medio solo o medio que contiene el anticuerpo anti-TAT (por ejemplo, a aproximadamente 10 \mug/ml), un oligopéptido de unión a TAT o una molécula orgánica de unión a TAT apropiados. Las células se incuban durante un periodo de 3 días. Tras cada tratamiento, las células se lavan y se fraccionan en tubos 12x 75 de tapón colador de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para la extracción de grupos de células. A continuación, los tubos reciben PI (10 \mug/ml). Las muestras se pueden analizar utilizando un citómetro de flujo FACSCAN® y el software FACSCONVERT® CellQuest (Becton Dickinson). Los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos de unión a TAT o moléculas de unión a TAT que inducen estadísticamente niveles significativos de la muerte celular determinada mediante la captación de PI se pueden seleccionar como anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos de unión a TAT o moléculas orgánicas de unión a TAT inductoras de la muerte celular.
Para cribar anticuerpos, oligopéptidos u otras moléculas orgáncias que se unen a un epítopo en un polipéptido TAT unido por un anticuerpo de interés, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado de rutina, tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Este ensayo se puede utilizar para determinar si un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica de análisis se unen al mismo sitio o epítopo que un anticuerpo anti-TAT conocido. Alternativa o adicionalmente, la localización del epítopo se realiza mediante métodos conocidos en el sector. Por ejemplo, la secuencia del anticuerpo se puede mutagenizar mediante, por ejemplo, rastreo de alanina, para identificar residuos de contacto. El anticuerpo mutante se analiza inicialmente por su unión con anticuerpo policlonal para segurar el pliegue correcto. En un método diferente, se pueden utilizar péptidos correspondientes a diferentes regiones de un polipéptido TAT en ensayos de competición con los anticuerpos de análisis o con un anticuerpo de análisis y un anticuerpo con un epítopo caracterizado o
conocido.
E. Terapia de profármaco mediada por enzimas dependiente de anticuerpo (ADEPT)
Los anticuerpos de la presente invención también se pueden utilizar en ADEPT mediante la conjugación del anticuerpo a una enzima activadora de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidilo, véase WO 81/01145) en un fármaco anticanceroso activo. Véase, por ejemplo, WO 88/07378 y la Patente de Estados Unidos No. 4.975.278.
El componente enzimático del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en un profármaco de manera que lo convierte en su forma citotóxica más activa.
Entre las enzimas que son útiles en el procedimiento de la presente invención se incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anticanceroso, 5-fluoroacilo; proteasas, tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácidos; enzimas que dividen los carbohidratos, tales como \beta-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; \beta-lactamasa útil para convertir fármacos derivatizados con \beta-lactamas en fármacos libres; y penicilin amidasas, tales como penicilin V amidasa o penicilin G amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas" se pueden utilizar para convertir los profármacos de la solicitud en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey Nature 328: 457-458 (1987)). Los conjugados anticuerpo-abzima se pueden preparar tal y como se ha descrito en la presente invención para la liberación de la abzima a una población de células
tumorales.
Las enzimas de la presente invención se pueden unir covalentemente a los anticuerpos anti-TAT mediante técnicas bien conocidas en el sector, tales como la utilización de los reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales descritos anteriormente. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden por lo menos la región de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención unida a por lo menos una parte funcionalmente activa de una enzima de la invención se pueden construir utilizando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en el sector (véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)).
F. Polipéptidos TAT de longitud completa
La presente invención también describe secuencias de nucleótidos recientemente identificadas y aisladas que codifican polipéptidos a los que se hace referencia en la presente solicitud como polipéptidos TAT. En particular, se han identificado y aislado los ADNc (parciales y de longitud completa) que codifican varios polipéptidos TAT, tal y como se describe con mayor detalle en los posteriores ejemplos.
Tal y como se describe en los Ejemplos posteriores, se han depositado varios clones de ADNc con el ATCC. Las secuencias de nucleótidos reales de los clones se pueden determinar fácilmente por un experto en la materia mediante la secuenciación del clon depositado utilizando procedimientos rutinarios en la técnica. Las secuencias de aminoácidos previstas se pueden determinar a partir de las secuencias de nucleótidos utilizando la técnica rutinaria. Para los polipéptidos TAT y los ácidos nucleicos codificantes descritos en la presente invención, en algunos casos, los solicitantes han identificado lo que se cree que son los mejores marcos de lectura identificables con la información de la secuencia disponible en el momento.
G. Variantes de anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT
Además de los anticuerpos anti-TAT y los polipéptidos TAT de secuencia nativa y de longitud completa descritos en la presente invención, se contempla que se pueden preparar variantes de anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT. Las variantes de anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT se pueden preparar introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN codificante y/o mediante la síntesis del polipéptido o anticuerpo deseados. Los expertos en la materia entenderán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos post-traduccionales del anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT, tales como el cambio del número o la posición de los sitios de glicosilación o la alteración de las características de anclamiento a la membrana.
Las variaciones en los anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT descritos en la presente invención, se pueden realizar, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservativas y no conservativas establecidas, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, una eliminación o una inserción de uno o más codones que codifican el anticuerpo o el polipéptido que dan lugar a un cambio en la secuencia de aminoácidos en comparación con el anticuerpo o polipéptido de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es por sustitución de por lo menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT. Al determinar qué residuo de aminoácido se puede insertar, sustituir o eliminar sin afectar de forma adversa la actividad deseada, se puede encontrar una guía mediante la comparación de la secuencia del anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT con la de las moléculas de proteínas conocidas homólogas y minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos realizados en regiones con elevada homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tienen una estructura y/o propiedades químicas similares, tales como la sustitución de una leucina por una serina, es decir, sustituciones conservativas de aminoácidos. Las inserciones o eliminaciones pueden estar opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se puede determinar realizando sistemáticamente inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y analizando en las variantes resultantes la actividad mostrada por la secuencia nativa de longitud completa o madura.
En la presente invención se proporcionan fragmentos de anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT. Dichos fragmentos pueden estar truncados en el extremo N-terminal o C-terminal, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con un anticuerpo o proteína nativa de longitud completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT.
Los fragmentos del anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT se pueden preparar mediante cualquiera de un conjunto de técnicas convencionales. Los fragmentos de péptidos deseados se pueden sintetizar químicamente. Un enfoque alternativo implica la generación de fragmentos de anticuerpo o polipéptido mediante digestión enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con una enzima conocida por dividir proteínas en los sitios definidos por residuos de aminoácidos concretos o mediante la digestión del ADN con enzimas de restricción adecuadas y el aislamiento del fragmento deseado. Otra técnica adecuada implica el aislamiento y la amplificación de un fragmento de ADN que codifica un fragmento de anticuerpo o polipéptido deseado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ADN se utilizan en los cebadores de los extremos 5' y 3' en la PCR. Preferiblemente, los fragmentos de anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT comparten por lo menos una actividad biológica y/o inmunológica con el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT nativos descritos aquí.
En realizaciones particulares, las sustituciones conservativas de interés se muestran en la Tabla 6 bajo el encabezamiento de "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones dan lugar a un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen cambios más sustanciales denominados "ejemplos de sustituciones" en la Tabla 6 o, tal como se describe posteriormente en referencia a clases de aminoácidos, y se criban los productos.
TABLA 6
37
Las modificaciones sustanciales en la función o identidad inmunológica del anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT se realizan mediante la selección de substituciones que difieren significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hélice o lámina, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos basados en propiedades comunes de la cadena lateral:
(1)
hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2)
hidrofílico neutro: cys, ser, thr;
(3)
ácido: asp, glu;
(4)
básico: asn, gln, his, lys, arg;
(5)
residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y
(6)
aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservativas comprenderán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Dichos residuos sustituidos también se pueden introducir en sitios de sustitución conservativa o, más preferiblemente, en los sitios restantes (no conservados).
Las variaciones se pueden realizar utilizando procedimientos conocidos en la técnica tales como la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida de sitio), el rastreo de alanina, y mutágenesis por PCR. Para fabricar el ADN variante del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT se puede llevar a cabo sobre el ADN clonado una mutagénesis dirigida de sitio [Carter et al., Nucl. Acids. Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids. Res., 10: 6487 (1987)], mutagénesis de cassette [Wells et al., Gene, 34 315 (1985)], mutagénesis de selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas.
El análisis de aminoácidos por rastreo también se puede realizar para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de rastreo preferidos están los aminoácidos relativamente pequeños y neutros. Entre dichos aminoácidos se incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es habitualmente un aminoácido de rastreo preferido de este grupo ya que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunninghan y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. La alanina es también habitualmente preferida ya que es el aminoácido más habitual. Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones escondidas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman and Co., N.Y.), Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede utilizar un aminoácido isotérico.
También se puede sustituir, generalmente por serina, cualquier residuo de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación correcta del anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación aberrante. En cambio, se pueden añadir el enlace o enlaces de cisteína al anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).
Un tipo particularmente preferido de variante por sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la variante o variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo posterior tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo parental del cual se generan. Una manera conveniente para generar dichas variantes por sustitución implica la maduración por afinidad utilizando la expresión en fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpo generadas de esta manera se expresan de manera monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado en cada partícula. A continuación, las variantes expresadas en el fago se criban por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se describe en la presente invención. Con el fin de identificar los sitios candidatos de la región hipervariable para la modificación, se puede aplicar la mutagénesis por rastreo de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión a antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura del cristal del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el polipéptido TAT humano. Dichos residuos de contacto y residuos próximos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en la presente invención. Una vez se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a cribado tal como se describe en la presente invención y se pueden seleccionar anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para un desarrollo posterior.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-TAT se preparan mediante una serie de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes en las secuencias de aminoácidos naturales) o la preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida de sitio), la mutagénesis de PCR y la mutagénesis de cassette de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo anti-
TAT.
H. Modificaciones de anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT
Las modificaciones covalentes de los anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT están incluidas en el alcance de la presente invención. Un tipo de modificación covalente incluye la reacción de residuos de aminoácidos marcados de un anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su utilización en el procedimiento para purificar anticuerpos anti-TAT, y viceversa. Entre los agentes entrecruzadores utilizados habitualmente se incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azido salicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimidílicos, tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales, tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes, tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86 (1983)], acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT incluido en el alcance de la presente invención comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo del anticuerpo o polipéptido. Por "alteración del patrón de glicosilación nativo" para los objetivos de la presente invención se pretende indicar la eliminación de uno o más grupos carbohidratos hallados en anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT de secuencia nativa (mediante la eliminación del sitio de glicosilación subyacente o mediante la eliminación de la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT de secuencia nativa. Además, la expresión incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, implicando un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos grupos de carbohidrato presentes.
La glicosilación de anticuerpos y otros polipéptidos es habitualmente por unión a N o unión a O. La unión a N se refiere a la unión del grupo carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del grupo carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De este modo, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptido en un polipéptido crea un potencial sitio de glicosilación. La glicosilación por unión a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un ácido hidroxiamino, más habitualmente serina o treonina, aunque también se pueden utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT se puede realizar convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos, de manera que contiene una o más de las secuencias tripéptido descritas anteriormente (para sitios de glicosilación unidos a N). La alteración se puede realizar, por ejemplo, mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT original (para sitios de glicosilación unidos a O). La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT puede alterarse opcionalmente a través de los cambios a nivel de ADN, particularmente mediante la mutación del ADN que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT en bases preseleccionadas, de manera que los codones que se generan se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otros medios para aumentar el número de grupos carbohidrato en el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT es mediante acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Dichos procedimientos están descritos en la técnica, por ejemplo, en WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306 (1981).
La eliminación de grupos carbohidrato presentes en el el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT se puede realizar química o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que codifican los residuos de aminoácidos que actúan como dianas para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación química son conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, por Hakimuddin, et. al. Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y por Edge, et al. Anal. Biochem., 118:131 (1981). La división enzimática de grupos carbohidrato en los polipéptidos se puede conseguir mediante la utilización de un conjunto de endo- y exoglicosidasas tal y como se describe en Thotakura et al. Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente de anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT comprende la unión del anticuerpo o polipéptido a uno del conjunto de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la forma establecida en las Patentes de Estados Unidos Nos: 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337. El anticuerpo o polipéptido pueden también encapsularse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato) respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980).
El anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT de la presente invención también se pueden modificar de una manera que forme moléculas quiméricas que comprenden un anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT fusionados a otro polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogo.
En una realización, dicha molécula quimérica comprende una fusión del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al que se puede unir selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. El epítopo-etiqueta se sitúa generalmente en el extremo amino o carboxilo terminal del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT. La presencia de dichas formas epítopo etiquetadas del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT se pueden detectar utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, la disposición del epítopo etiqueta permite que el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT se purifique fácilmente mediante purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se une al epítopo etiqueta. En la técnica se conocen varios polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos. Entre los ejemplos se incluyen etiquetas de poli-histidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly); el polipéptido etiqueta de gripe HA y su anticuerpo 12C45 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 de la misma [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de gliproteína D (gD) del virus del Herpes Simplex y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)]. Entre otros polipéptidos etiqueta se incluyen el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; el péptido epítopo KT3 [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; un péptido epítopo de \alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; y el péptido etiqueta de la proteína T7 del gen 10 [Lutz-Freyemuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)].
En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como "inmunoadhesina"), dicha fusión podría ser a la región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig incluyen preferiblemente la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana eliminado o inactivado) de un anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT en lugar de por lo menos una región variable de una molécula de Ig. En una realización particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye la bisagra, CH_{2} y CH_{3}, o la bisagra, regiones CH_{1}, CH_{2} y CH_{3} de una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulinas, véase también la Patente de Estados Unidos No. 5.428.130 concedida el 27 de junio de
1995.
I. Preparación de anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT
La siguiente descripción se refiere principalmente a la producción de anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT. Naturalmente, se prevé que se puedan utilizar procedimientos alternativos, que se conocen bien en la técnica, para preparar los anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos apropiada, o partes de la misma, se pueden producir mediante síntesis directa de péptidos utilizando técnicas de fase sólida [véase, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteínas in vitro se puede realizar utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se puede realizar, por ejemplo, utilizando un Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. Se pueden sintetizar químicamente por separado varias partes del anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT y combinarse utilizando procedimientos químicos o enzimáticos para producir el anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT deseado.
1. Aislamiento del ADN que codifica un anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT
El ADN que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT se puede obtener a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee el ARNm del anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT y lo expresa a un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT humano se puede obtener convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano. El gen que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT también se puede obtener a partir de una biblioteca genómica o mediante métodos de síntesis conocidos (por ejemplo, síntesis de ácidos nucleicos automatizada).
Las bibliotecas se pueden cribar con sondas (tales como oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente 20-80 bases) diseñados para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. El cribado del ADNc o biblioteca genómica con la sonda seleccionada se puede realizar utilizando procedimientos estándar, tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT es utilizar la metodología de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Las técnicas que describen técnicas para cribar una biblioteca de ADNc son bien conocidas. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberían ser de longitud suficiente y suficientemente inequívoca que se minimizan los falsos positivos. El oligonucleótido está preferiblemente marcado de manera que se puede detectar tras la hibridación a ADN en la biblioteca que se criba. Los procedimientos de marcado son bien conocidos en la técnica, e incluyen la utilización de radiomarcadores como ATP marcado con ^{32}P, biotinilación o marcaje enzimático. Las condiciones de hibridación, incluyendo la astringencia moderada y la astringencia elevada, se proporcionan en Sambrook et al., supra.
Las secuencias identificadas en dichos procedimientos de cribado de bibliotecas se pueden comparar y alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicos, tales como el Banco de Genes u otras bases de datos privadas de secuencias. La identidad de secuencia (a nivel de aminoácido o nucleótido) en las regiones definidas de la molécula o a lo largo de la secuencia de longitud completa se puede determinar utilizando procedimientos conocidos en la técnica y tal y como se describen en la presente invención.
El ácido nucleico que tiene la secuencia de codificación de la proteína se puede obtener mediante el cribado del ADNc seleccionado o las bibliotecas genómicas utilizando la secuencia de aminoácidos deducida descrita en la presente invención por primera vez, y, si es necesario, utilizando procedimientos convencionales de extensión con cebadores tal y como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar precursores y procesando intermedios de ARNm que no se han transcrito de forma inversa en ADNc.
2. Selección y transformación de células huésped
Las células huésped se transfectan o transforman con vectores de expresión o clonación descritos en la presente invención para la producción del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados para que sean adecuados para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y similares, se pueden seleccionar por un experto en la materia sin una experimentación excesiva. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares se pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al.,
supra.
Los procedimientos de transfección de células eucariotas y transformación de células procariotas son conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, CaCl_{2}, CaPO_{4}, mediados por liposomas y electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar adecuadas a dichas células. El tratamiento con calcio que utiliza cloruro cálcico, tal y como se describe en Sambrook et al., supra, o la electroporación se utilizan generalmente para procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células vegetales, tal como describe Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamíferos sin dichas paredes celulares, se puede utilizar el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978). En la Patente de Estados Unidos No. 4.399.216 se han descrito aspectos generales de transfecciones de sistemas de células huésped de mamíferos. Las transformaciones en levadura se llevan a cabo habitualmente según el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también se pueden utilizar otros procedimientos para introducir ADN en células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacteriano con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para varias técnicas para transformar células de mamífero, ver Keown et al., Methods in enzymology, 185:527-537 (1990) y Manssur et al., Nature, 336. 348-352 (1988).
Entre las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente invención se incluyen células procariotas, levadura, o eucariotas superiores. Entre las procariotas adecuadas se incluyen, pero no se limitan a, eubacterias, tales como organismos Gram-negativo o Gram-positivo, por ejemplo, Enterobacteriaceae, tal como E. coli. Varias cepas de E. coli están disponibles públicamente, tales como la cepa de E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); cepa de E. coli W3110 (ATCC 27.325) y cepa de E. coli K5772 (ATCC 53.635). Entre otras células huésped procariotas adecuadas se incluyen Enterobacteriaceae, tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli, tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266.710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son más ilustrativos que limitantes. La Cepa W3110 es un huésped o huésped parental particularmente preferible ya que es una cepa de huésped habitual para fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 se puede modificar para realizar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas al huésped, con ejemplos de dichos huéspedes incluyendo la cepa de E. coli W3110 1A2, que tiene el genotipo completo tonA; la cepa de E. coli W3110 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; la cepa de E. coli W3110 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan^{r}; la cepa de E. coli W3110 37D6, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan^{r}; la cepa de E. coli W3110 40B4, que es una cepa 37D6 con una mutación de eliminación degP no resistente a kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante descrita en la Patente de Estados Unidos No. 4.946.783 concedida el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de ácido nucleico polimerasa.
El anticuerpo de longitud completa, fragmentos de anticuerpo y proteínas de fusión de anticuerpos se pueden producir en bacterias, en particular cuando no son necesarias la glicosilación y la función efectora de Fc, tal como cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) y el inmunoconjugado por sí mismo muestra eficacia en la destrucción de la célula tumoral. Los anticuerpos de longitud completa presentan una vida media mayor en la circulación. La producción en E. coli es más rápida y más rentable. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5,648,237 (Carter et. al.), la Patente de Estados Unidos 5,789,199 (Joly et al.), y la Patente de Estados Unidos 5,840,523 (Simmons et al.) que describen la región de iniciación de la traducción (TIR) y las secuencias señal para optimizar la expresión y secreción, estas patentes se incorporan en la presente por referencia. Después de la expresión, se aisla el anticuerpo de la pasta celular de E: coli en una fracción soluble y se puede purificar a través de, por ejemplo, una columna de proteína A o G, dependiendo del isotipo. La purificación final se puede llevar a cabo de forma similar al proceso para purificar el anticuerpo expresado en, por ejemplo, células CHO.
Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT. El Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico inferior utilizado habitualmente. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139.383 publicada el 2 de mayo de 1985); huéspedes Kluyveromyces (Patente de Estados Unidos No. 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tal como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS574; Louvencourt et al. J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135(1990)), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic. Microbiol. 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma recia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces, tales como Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538, publicada el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus, tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilbum et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A. Niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en la presente invención e incluyen, pero no se limitan a, levadura capaz del crecimiento en metanol seleccionada del género que consiste en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son ejemplos de esta clase de levaduras se puede encontrar en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT glicosilados se derivan de organismos multicelulares. Entre los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células de insectos, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales, tales como cultivos celulares de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco. Se han modificado numerosas cepas baculovíricas y variantes y las correspondientes células huéspedes de insecto permisivas de huéspedes, tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Droshophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Una serie de cepas víricas para la transfección están públicamente disponibles, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos virus se pueden utilizar como el virus según la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.
Sin embargo, el mayor interés ha estado en las células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en un cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Entre los ejemplos de líneas celulares de huéspedes mamíferos útiles están la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón de embrión humano (células 293 ó 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 y una línea de hepatoma humano (Hep G2).
Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT y se cultivan en un medio con nutrientes habituales modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.
3. Selección e utilización de un vector replicable
El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico), que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT se puede insertar en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Existen varios vectores disponibles públicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de plásmido, cósmido, partícula viral, o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada se puede insertar en el vector mediante una serie de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción apropiados utilizando técnicas conocidas en el sector. Los componentes de los vectores incluyen generalmente, pero no se limitan a, una o más secuencias señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes utiliza técnicas de unión estándar que son conocidas por un experto en la materia.
El polipéptido TAT se puede producir recombinantemente no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de división específico en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduros. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de secuencias líderes de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxina II estable térmicamente. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal puede ser, por ejemplo, la secuencia líder de invertasa de levadura, la secuencia líder del factor alfa (incluyendo las secuencias líder del factor \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, la última descrita en la Patente de Estados Unidos No. 5.010.182), o la secuencia líder de fosfatasa ácida, la secuencia líder de C. Albicans glucoamilasa (EP 362.179 publicada el 4 de abril de 1990) o la señal descrita en WO 90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamíferos, las secuencias señal de mamíferos se pueden utilizar para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o especies relacionadas, así como secuencias líderes secretoras virales.
Ambos vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite la replicación del vector en una o más células huésped seleccionadas. Dichas secuencias son conocidas para un conjunto de bacterias, levadura, y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es adecuado para la levadura, y orígenes virales varios (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos.
Los vectores de clonación y expresión contendrán habitualmente un gen de selección, también denominado como marcador seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son aquéllos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea de células CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada tal y como se describe por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para su utilización en la levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de la levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
Los vectores de clonación y expresión contienen habitualmente un promotor unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT para dirigir la síntesis de ARNm. Son conocidos promotores reconocidos por un conjunto de células huésped potenciales. Entre los promotores adecuados para utilizar con huéspedes procariotas se incluyen los sistemas de promotores de \beta-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36.776], y promotores híbridos, tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT.
Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su utilización con huéspedes de levadura se incluyen promotores para 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros enzimas glucolíticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tal como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y
glucoquinasa.
Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de una transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la utilización en la expresión en levaduras se describen en detalle en EP 73.657.
La transcripción del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT a partir de vectores en células huésped de mamíferos está controlada, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar (Patente UK 2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus de papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B y virus de simio 40 (SV40), a partir de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.
Se puede incrementar la transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT por eucariotas superiores mediante la inserción de una secuencia de potenciador en el vector. Los potenciadores son elementos que actúan en cis de ADN, habitualmente aproximadamente de 10 a 300 pb, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Actualmente se conocen muchas secuencias de potenciadores de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Habitualmente, sin embargo, se utilizará un potenciador de un virus de célula eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador de SV40 en la cara tardía del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en la cara tardía del origen de replicación, y los potenciadores de adenovirus. El potenciador se puede cortar y empalmar ("splice") en el vector en una posición 5' ó 3' con respecto a la secuencia codificante del anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT, pero se sitúa preferiblemente en un sitio 5' con respecto al promotor.
Los vectores de expresión utilizados en células huéspedes eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Dichas secuencias están disponibles habitualmente desde las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADNs o ADNcs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica el anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT.
En Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117.060 y EP 117.058 se describen adicionalmente otros procedimientos, vectores, y células huésped adecuados para la adaptación a la síntesis del anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT en cultivos de células de vertebrados recombinantes.
4. Cultivo de células huésped
Las células huésped utilizadas para producir el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT de la presente invención se pueden cultivar en un conjunto de medios. Los medios comercialmente disponibles, tales como F10 de Ham (sigma), Medio Mínimo Esencial ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Medio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz., 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patente de Estados Unidos Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o la Patente de Estados Unidos Re. 30,985 se pueden utilizar como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede complementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMICINA^{TM}), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente a concentraciones finales en el rango micromolar) y la glucosa o una fuente de energía equivalente. También se puede incluir cualquier otro complemento necesario en las concentraciones apropiadas que serían conocidas por un experto en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión y será evidente para el experto en la materia.
5. Detección de la amplificación/expresión de los genes
La amplificación y/o expresión de los genes se puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern convencional para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia de puntos (análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada apropiadamente, basada en las secuencias proporcionadas en la presente invención. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos que pueden reconocer dobles cadenas específicas, incluyendo dobles cadenas de ADN, dobles cadenas de ARN, dobles cadenas híbridas de ADN-ARN o dobles cadenas de ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden marcar y el ensayo se puede llevar a cabo cuando la doble cadena está unida a una superficie, de manera que tras la formación de la doble cadena en la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpos unidos a la doble cadena.
La expresión génica, alternativamente, se puede medir mediante procedimientos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y el ensayo de cultivo de células o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de fluidos de muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden preparar en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos se pueden preparar contra un polipéptido TAT de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención o contra una secuencia exógena fusionada a ADN de TAT que codifica un epítopo de anticuerpo específico.
6. Purificación de anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT
Las formas de anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT se pueden recuperar del medio de cultivo o de los lisatos de células huésped. Si está unido a membrana, se puede liberar de la membrana utilizando una solución de detergente adecuada (por ejemplo, Triton X-100) o mediante división enzimática. Las células utilizadas en la expresión del anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT se pueden romper mediante diversos medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, destrucción mecánica, o agentes para lisar células.
Se puede desear purificar el anticuerpo anti-TAT y el polipéptido TAT a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE; "cromatofocusing"; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A sefarosa para eliminar contaminantes, tales como IgG, y columnas quelantes de metales para unir formas etiquetadas con epítopo del anticuerpo anti-TAT y el polipéptido TAT. Se pueden utilizar varios métodos de purificación de proteínas y dichos métodos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982). La etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT concreto producido.
Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir intracelularmente, en el espacio periplásmico, o se secreta directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, se elimina el debris particulado, ya sean células huésped o fragmentos lisados, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular se descongela en presencia de acetato sódico (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonil (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. La debris celular se puede eliminar mediante centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión en general se concentran en primer lugar utilizando un filtrador de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa, tal como PMSF, en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes extraños.
La composición de anticuerpos preparada a partir de las células se puede purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La adeqüidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A se puede utilizar para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas \gamma1, \gamma2 o \gamma4 humanas (Lindmark et al., J, Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para \gamma3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 1565-1575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad es frecuentemente agarosa, pero hay otras matrices disponibles. Las matrices mecánicamente estables, tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten velocidades de flujo más elevadas y tiempos de procesado más cortos que los conseguidos con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio C_{H}3, la resina Bakerbond ABX^{Tm} (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSE^{TM}, cromatografía en una resina de intercambio aniónica o catiónica (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque ("chromatofocusing"), SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar.
Tras la etapa o etapas de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes se puede someter a una cromatografía de interacción hidrofóbica de pH bajo utilizando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5 y 4,5, preferiblemente se realiza a concentraciones bajas de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0,25 M de sal).
J. Formulaciones farmacéuticas
Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos de unión a TAT, siARN de TAT, moléculas orgánicas de unión a TAT y/o polipéptidos TAT utilizados según la presente invención se preparan para su almacenamiento mediante la mezcla del anticuerpo, polipéptido, oligopéptido, siARN o molécula orgánica que tienen el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16^{a} Edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones, tales como acetato, Tris, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como, cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabens, tales como metil o propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de peso molecular bajo (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; tonificantes, tales como terhalosa y cloruro sódico; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; tensoactivos, tales como polisorbato; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos de metales (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensoactivos no iónicos, tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o polietilenglicol (PEG). El anticuerpo comprende preferiblemente el anticuerpo a una concentración entre 5 y 200 mg/ml, preferiblemente entre 10 y 100 mg/ml.
La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la enfermedad concreta a tratar, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no afectan de forma adversa entre sí. Por ejemplo, además del anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de unión a TAT, siARN de TAT o molécula orgánica de unión a TAT, puede ser deseable incluir en la formulación un anticuerpo adicional, por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-TAT que se une a un epítopo diferente en el polipéptido TAT, o un anticuerpo para alguna otra diana, tal como un factor de crecimiento que afecta al crecimiento del cáncer concreto. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede comprender además un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, una citoquina, un agente inhibidor del crecimiento, un agente anti-hormonal, y/o un cardioprotector. Dichas moléculas están presentes de forma adecuada combinadas en cantidades que son eficaces para el objetivo pretendido.
Los principios activos también pueden estar contenidos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización entre fases, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16^{a} Edición, Osol, A. Ed.
(1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberación controlada. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación controlada se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (Patente de Estados Unidos No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles.
K. Diagnostico y tratamiento con anticuerpos Anti-TAT, oligopéptidos de unión a TAT, siARN de TAT y moléculas orgánicas de unión a TAT
Para determinar la expresión de TAT en el cáncer, están disponibles varios ensayos de diagnóstico. En una realización, la sobreexpresión del polipéptido TAT puede analizarse mediante immunohistoquímica (IHC). Las secciones de tejido bañadas en parafina de una biopsia de tumor pueden someterse al ensayo IHC y acordarse unos criterios de intensidad de tinción de la proteína TAT tal y como se indica a continuación:
Valoración 0 - no se observa tinción o tinción de membrana en menos del 10% de células tumorales.
Valoración 1+ - se detecta una tinción de membrana débil/apenas perceptible en más del 10% de las células tumorales. Las células sólo se tiñen en parte de sus membranas.
Valoración 2+ - se observa una tinción de membrana completa de débil a moderada en más del 10% de las células tumorales.
Valoración 3+ - se observa una tinción de membrana completa de moderada a fuerte en más del 10% de las células tumorales.
Los tumores con una valoración 0 ó 1+ para la expresión de polipéptido TAT pueden caracterizarse como que no sobreexpresan TAT, mientras que los tumores con resultados 2+ o 3+ pueden caracterizarse como que sobreexpresan TAT.
Alternativamente, o adicionalmente, pueden realizarse ensayos FISH tal como el INFORM® (vendido por Ventana, Arizona) o PATHVISION® (Vysis, Illinois) en tejido tumoral fijado a formalina y bañado en parafina para determinar el grado (si lo hay) de sobreexpresión de TAT en el tumor.
Puede evaluarse la amplificación o la sobreexpresión de TAT utilizando un ensayo de diagnóstico in vivo, por ejemplo, mediante la administración de una molécula (como un anticuerpo, un oligopéptido o una molécula orgánica) que se une a la molécula a detectar y que está marcado con una etiqueta detectable (por ejemplo, un isótopo radioactivo o un marcador fluorescente) y el rastreo externo del paciente para la localización del marcador.
Tal y como se describe anteriormente, los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos y moléculas orgánicas de la presente invención tienen varias aplicaciones no terapéuticas. Los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos y moléculas orgánicas de la presente invención pueden ser útiles para el diagnóstico y determinación del estadio de cánceres que expresan los polipéptidos TAT (por ejemplo, en radioimagen). Los anticuerpos, oligopéptidos y moléculas orgánicas también son útiles para la purificación o la inmunoprecipitación de polipéptido TAT a partir de células, para la detección y la cuantificación de polipéptido TAT in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia Western, para matar y eliminar células que expresan TAT de una población de células mezcladas como una etapa en la purificación de las otras células.
Actualmente, dependiendo del estadio del cáncer, el tratamiento del cáncer implica una o una combinación de las siguientes terapias: cirugía para eliminar el tejido canceroso, radioterapia, y quimioterapia. La terapia con anticuerpo anti-TAT, oligopéptido, siARN o molécula orgánica puede ser deseable especialmente en pacientes ancianos que no toleran bien la toxicidad y los efectos secundarios de la quimioterapia y en enfermedad metastásica donde la radioterapia tiene una utilidad limitada. Los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos, siARN y moléculas orgánicas que reconocen tumores de la presente invención son útiles para aliviar los cánceres que expresan TAT tras su diagnóstico inicial de la enfermedad o durante la recaída. Para aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo anti-TAT, oligopéptido, siARN o molécula orgánica pueden utilizarse solos, o en terapia de combinación con, por ejemplo, hormonas, antiangiógenos, o compuestos radiomarcados, o con cirugía, crioterapia, y/o radioterapia. El tratamiento con anticuerpo anti-TAT, oligopéptido, siARN o molécula orgánica puede administrarse conjuntamente con otras formas de terapia convencional, ya sea consecutivamente con, terapia pre- o post-convencional. Se utilizan fármacos quimioterapéuticos, tales como TAXOTERE® (docetaxel), TAXOL® (paclitaxel), estramustina y mitoxantrona, en el tratamiento del cáncer, en concreto, en pacientes con riesgo. En los métodos actuales de la invención para tratar o aliviar el cáncer, a los pacientes de cáncer se les puede administrar anticuerpo anti-TAT, oligopéptido, siARN o molécula orgánica conjuntamente con el tratamiento con uno o más de los agentes quimioterapéuticos anteriores. En concreto, se contempla la terapia de combinación con paclictaxel y derivados modificados (ver, por ejemplo, EP0600517). Se administrará el anticuerpo anti-TAT, oligopéptido, siARN o molécula orgánica con una dosis terapéuticamente efectiva del agente quimioterapéutico. En otra realización, se administra el anticuerpo anti-TAT, oligopéptido, siARN o molécula orgánica conjuntamente con quimioterapia para potenciar la actividad y la eficacia del agente quimioterapéutico, por ejemplo, paclitaxel. La Physicians' Desk Reference (PDR) describe dosis de estos agentes que han sido utilizados en el tratamiento de varios cánceres. El régimen de dosificación y la dosis de estos fármacos quimioterapéuticos anteriormente mencionados que son efectivos terapéuticamente dependerán del cáncer concreto que se trata, la extensión de la enfermedad y otros factores familiares para los médicos expertos en la materia y pueden ser determinados por el médico.
En una realización particular, se administra al paciente un conjugado que comprende un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido, siARN o molécula orgánica conjugados con un agente citotóxico. Preferiblemente, el inmunoconjugado unido a la proteína TAT es internalizado por la célula, dando lugar a una eficacia terapéutica incrementada del inmunoconjugado en la citólisis de la célula cancerosa a la que se une. En una realización preferente, el agente citotóxico reconoce o interfiere con el ácido nucleico en la célula cancerosa. Anteriormente se han descrito ejemplos de dichos agentes citotóxicos y se incluyen maitansinoides, caliqueamicinas, ribonucleasas y ADN endonucleasas.
Se administran los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos, siARN, moléculas orgánicas o conjugados a toxina de los mismos a un paciente humano, según los procedimientos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, "como un bolo" o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o inhalación. Se prefiere la administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo, oligopéptido, o molécula orgánica.
Otros regímenes terapéuticos pueden combinarse con la administración del anticuerpo anti-TAT, oligopéptido, o molécula orgánica. La administración combinada incluye la co-administración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica única, y la administración consecutiva en cualquier orden, donde preferiblemente hay un periodo de tiempo en el que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Preferiblemente, dicha terapia combinada da lugar a un efecto terapéutico sinérgico.
También puede ser deseable combinar la administración del anticuerpo o anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos, o moléculas orgánicas con la administración de un anticuerpo dirigido contra otro antígeno tumoral asociado con el cáncer concreto.
En otra realización, los métodos de tratamiento terapéuticos de la presente invención implican la administración combinada de un anticuerpo anti-TAT (o anticuerpos), oligopéptidos o moléculas orgánicas y uno o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores del crecimiento, incluyendo la coadministración de cócteles de diferentes agentes quimioterapéuticos). Entre los agentes quimioterapéuticos se incluyen fosfato de estramustina, prednimustina, cisplatino, 5-fluorouracilo, melfalano, ciclofosfamida, hidroxiurea e hidroxiureataxanos (tales como, paclitaxel y doxetaxel) y/o antibióticos de antraciclina. La preparación y pautas de dosificación para dichos agentes quimioterapéuticos se pueden utilizar según las instrucciones de los fabricantes o tal como se determina empíricamente por el técnico en la materia. La preparación y pautas de dosificación para dicha quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & wilkins, Baltimore, MD (1992).
El anticuerpo, oligopépido o molécula orgánica se pueden combinar con un compuesto anti-hormonal, por ejemplo, un compuesto anti-estrógeno, tal como tamoxifeno; una anti-progesterona, tal como onapristona (véase, EP 616 812); o un anti-andrógeno, tal como flutamida, en dosis conocidas para dichas moléculas. Cuando el cáncer a tratar es un cáncer independiente de andrógeno, el paciente puede haber sido sometido previamente a terapia anti-andrógeno y, después de que el cáncer se convierta en independiente de andrógeno, se puede administrar al paciente el anticuerpo anti-TAT, oligopépido o molécula orgánica (y opcionalmente otros agentes tal como se describen en la presente invención).
A veces, puede ser beneficioso coadministrar también un cardioprotector (para evitar o reducir la disfunción miocárdiaca asociada con la terapia) o una o más citoquinas al paciente. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente se puede someter a una extracción quirúrgica de células cancerosas y/o terapia de radiación, antes, simultáneamente o posteriormente a la terapia con anticuerpos, oligopépidos o moléculas orgánicas. Las dosis adecuadas para cualquiera de los agentes coadministrados anteriores son aquellas utilizadas actualmente y pueden disminuir debido a la acción combinada (sinergia) del agente y el anticuerpo anti-TAT, oligopépido o molécula orgánica.
Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosis y el modo de administración serán elegidos por el médico según criterios conocidos. La dosis apropiada de anticuerpo, oligopépido o molécula orgánica dependerá del tipo de enfermedad a tratar, tal y como se ha definido anteriormente, la gravedad y la evolución de la enfermedad, si el anticuerpo, oligopépido o molécula orgánica se administran con objetivos de prevención o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al anticuerpo, oligopépido o molécula orgánica y el criterio del médico responsable. El anticuerpo, oligopépido o molécula orgánica se administran de forma adecuada al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Preferiblemente, el anticuerpo, oligopépido o molécula orgánica se amdisnitra mediante infusión intravenosa o mediante inyecciones subcutáneas. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 \mug/kg hasta 50 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, aproximadamente 0,1-15 mg/kg/dosis) de anticuerpo puede ser una dosis candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, mediante, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una pauta de dosificación puede comprender administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo anti-TAT. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. Una dosis diaria habitual podría variar desde, aproximadamente, 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se mantiene hasta que tiene lugar la desaparición deseada de los síntomas de la enfermedad. El progreso de esta terapia se puede monitorizar fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales y en base a criterios conocidos para el médico u otras personas expertas.
A parte de la administración de la proteína anticuerpo al paciente, la presente solicitud contempla la administración del anticuerpo mediante terapia génica. Dicha administración de ácido nucleico que codifica el anticuerpo esta comprendida por la expresión "administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo". Véase, por ejemplo, WO96/07321 publicada el 14 de marzo de 1996 que se refiere al uso de la terapia génica para generar anticuerpos intracelulares.
Existen dos estrategias principales para introducir el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células del paciente; in vivo y ex vivo. Para la liberación in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, normalmente en el punto donde se necesita el anticuerpo. Para el tratamiento ex vivo, se extraen las células del paciente, el ácido nucleico se introduce en estas células aisladas y se administran las células modificadas al paciente, ya sea directamente o, por ejemplo, encapsuladas en membranas porosas que se implantan en el paciente (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.892.538 y 5.283.187). Existen una serie de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del huésped pretendido. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamíferos in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación con fosfato de calcio, etc. Un vector utilizado normalmente para la liberación ex vivo del gen es un vector retroviral.
Entre las técnicas actuales de transferencia de ácido nucleico in vivo actuales preferidas se incluyen la transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus del herpes simplex I, o virus adenoasociados) y sistemas basados en lípidos (lípidos útiles para la transferencia mediada por lípidos del gen son, por ejemplo, DOTMA, DOPE y DC-Chol). Para una revisión de los protocolos de marcaje génico y terapia génica actualmente conocidos, véase Anderson et al., Science 256: 808-813 (1992). Véase también WO 93/25673 y las referencias citadas en la misma.
Los anticuerpos anti-TAT de la invención pueden estar en las diferentes formas comprendidas por la definición de "anticuerpo" de la presente invención. De este modo, los anticuerpos incluyen anticuerpos de longitud completa o intactos, fragmentos de anticuerpos, variantes de anticuerpo o aminoácidos de secuencia nativa, anticuerpos humanizados, quiméricos o de fusión, inmunoconjugados y fragmentos funcionales de los mismos. En los anticuerpos de fusión, se fusiona una secuencia de anticuerpo a una secuencia de polipéptido heteróloga. Los anticuerpos se pueden modificar en la región Fc para proporcionar las funciones efectoras deseadas. Tal como se describe en detalle en las secciones de la presente invención, con las regiones Fc apropiadas, el anticuerpo desnudo unido en la superficie celular puede inducir citotoxicidad, por ejemplo, a través de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) o mediante el reclutamiento de complemento en citotoxicidad dependiente de complemento, o algún otro mecanismo. Alternativamente, se pueden utilizar algunas otras regiones Fc cuando es deseable eliminar o reducir la función efectora para minimizar los efectos secundarios o las complicaciones terapéuticas.
En una realización, el anticuerpo compite por la unión o por unirse sustancialmente al mismo epítopo que los anticuerpos de la solicitud. También se contemplan los anticuerpos que tienen características biológicas de los presentes anticuerpos anti-TAT de la invención, específicamente incluyendo el reconocimiento de tumores in vivo y cualquier inhibición de proliferación celular o carácterísticas citotóxicas.
Los métodos para producir los anticuerpos anteriores se describen en detalle aquí.
Los presentes anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos, siARN o moléculas orgánicas son útiles para tratar un cáncer que expresa TAT o aliviar uno o más síntomas del cáncer en un mamífero. Dicho cáncer incluye cáncer de próstata, cáncer del tracto urinario, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal y cáncer de ovario, más específicamente, adenocarcinoma de próstata, carcinomas de células renales, adenocarcinomas colorrectales, adenocarcinomas de pulmón, carcinomas de células escamosas de pulmón, y mesotelioma pleural. Los cánceres comprenden cánceres metastáticos de cualquiera de los anteriores. El anticuerpo, oligopéptido, siARN o molécula orgánica son capaces de unirse a por lo menos una parte de las células cancerosas que expresan el polipéptido TAT en el mamífero. En una realización preferida, el anticuerpo, oligopéptido, siARN o molécula orgánica son eficaces para destruir o eliminar células tumorales que expresan TAT o para inhibir el crecimiento de dichas células tumorales, in vitro o in vivo, tras la unión al polipéptido TAT en la célula. Dicho anticuerpo incluye un anticuerpo anti-TAT desnudo (no conjugado a ningún agente). Los anticuerpos desnudos que tienen propiedades citotóxicas o de inhibición del crecimiento celular se pueden aprovechar adicionalmente con un agente citotóxico para hacerlos incluso más potentes en la destrucción de células tumorales. Las propiedades citotóxicas se pueden conferir a un anticuerpo anti-TAT mediante, por ejemplo, la conjugación del anticuerpo con un agente citotóxico, para formar un inmunoconjugado tal como se describe aquí. El agente citotóxico o el agente inhibidor del crecimiento es preferiblemente una molécula pequeña. Son preferibles las toxinas tales como caliqueamicina o un maitansinoide y análogos o derivados de las mismas.
La invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido, siARN o molécula orgánica y un portador. Para los objetivos del tratamiento del cáncer, las composiciones se pueden administrar al paciente con necesidad de dicho tratamiento, donde la composición puede comprender uno o más anticuerpos anti-TAT presentes como un inmunoconjugado o como el anticuerpo desnudo. En una realización adicional, las composiciones pueden comprender estos anticuerpos, oligopéptidos, siARN o moléculas orgánicas en combinación con otros agentes terapéuticos, tales como agentes citotóxicos o inhibidores del crecimiento, incluyendo agentes quimioterapéuticos. La presente invención también proporciona formulaciones que comprenden un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido, siARN o molécula orgánica de la inevención y un portador. En una realización, la formulación es una formulación terapéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención son ácidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos anti-TAT. Se comprenden ácidos nucleicos que codifican las cadenas H y L y especialmente los residuos de la región hipervariable, cadenas que codifican el anticuerpo de secuencia nativa, así como variantes, modificaciones y versiones humanizadas del anticuerpo.
La presente invención también proporciona métodos útiles para tratar un cáncer que expresa el polipéptido TAT o que alivia uno o más síntomas del cáncer en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido, siARN o molécula orgánica al mamífero. Las composiciones terapéuticas de anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se pueden administrar a corto plazo (agudo) o crónico, o intermitente según indique el médico. Además, se proporcionan métodos de inhibición del crecimiento y citólisis de una célula que expresa el polipéptido TAT.
La presente invención también proporciona kits y artículos de fabricación que comprenden por lo menos un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido, siARN o molécula orgánica. Los kits que contienen anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos, siARN o moléculas orgáncias son útiles, por ejemplo, para ensayos de citólisis de células TAT, para la purificación o inmunoprecipitación de polipéptido TAT a partir de las células. Por ejemplo, para el aislamiento y purificación de TAT, el kit puede contener un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido, siARN o molécula orgánica acoplados a esferas (por ejemplo, esferas de sefarosa). Los kits se pueden disponer conteniendo anticuerpos, oligopéptidos, siARN o moléculas orgánicas para la detección y cuantificación de TAT in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia Western. Dicho anticuerpo, oligopéptido, siARN o molécula orgánica útil para la detección se pueden disponer con un marcador, tal como un fluorescente o radiomarcador.
L. Artículos de fabricación y kits
Otra realización de la invención es un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento del cáncer que expresa anti-TAT. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado con el mismo. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para el tratamiento del cáncer y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón penetrable por una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido, siARN o molécula orgánica de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición se utiliza para el tratamiento del cáncer. La etiqueta o prospecto comprenderán además instrucciones para administrar una composición con el anticuerpo, el oligopéptido, siARN o la molécula orgánica al paciente con cáncer. Adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir también otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
También se proporcionan kits que son útiles para varios objetivos, por ejemplo, para ensayos para citólisis de células que expresan TAT, para la purificación o inmunoprecipitación de polipéptido TAT a partir de células. Para el aislamiento y purificación de polipéptido TAT, el kit puede contener un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido, siARN o molécula orgánica acoplada a esferas (por ejemplo, esferas de sefarosa). Los kits se pueden disponer conteniendo los anticuerpos, oligopéptidos, siARN o moléculas orgánicas para la detección y cuantificación de polipéptido TAT in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia Western. Como con el artículo de fabricación, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociados con el recipiente. El recipiente contiene una composición que comprende por lo menos un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido, siARN o molécula orgánica de la invención. Se pueden incluir recipientes adicionales que contienen, por ejemplo, diluyentes, tampones y anticuerpos de control. La etiqueta o prospecto pueden proporcionar una descripción de la composición, así como instrucciones para el uso in vitro o de diagnóstico pretendido.
Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido TAT identificado aquí, así como otras moléculas identificadas por los ensayos de cribado descritos anteriormente aquí, se pueden administrar para el tratamiento de varios trastornos, incluyendo cáncer, en forma de composiciones farmacéuticas.
Si el polipéptido TAT es intracelular se utilizan anticuerpos completos como inhibidores, se prefieren anticuerpos de internalización. Sin embargo, también se pueden utilizar lipofecciones o liposomas para liberar el anticuerpo o un fragmento de anticuerpo en las células. Cuando se utilizan fragmentos de anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se una específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, en base a las secuencias de región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas peptídicas que mantienen la capacidad de unirse a la secuencia proteica diana. Dichos péptidos se pueden sintetizar químicamente y/o producir mediante tecnología de ADN recombinante. Véase, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993).
La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la enfermedad concretar a tratar, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre sí. Alternativamente o adicionalmente, la composición puede comprender un agente que potencia su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, una citoquina, un agente quimioterapéutico o un agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el objetivo pretendido.
Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar en ningún caso el alcance de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos
Los reactivos comercialmente disponibles a los que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron según las instrucciones del fabricante a menos que se indicara lo contrario. La fuente de las células identificadas en los siguientes ejemplos y a lo largo de la memoria por los números de acceso ATCC es de la American Type Culture Collection, Manassas, VA.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1
Perfil de expresión en tejidos utilizando GeneExpress®
Se analizó una base de datos privada que contenía información de la expresión génica (GeneExpress®,GeneLogic Inc., Gaithersburg, MD) en un intento por identificar polipéptidos (y sus ácidos nucleicos codificantes), cuya expresión se favorece significativamente en un tejido o tejidos tumorales particulares de interés en comparación con otros tumor o turmores y/o tejidos normales. Específicamente, se realizó un análisis de la base de datos GeneExpress® utilizando el software disponible de Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD, para su uso con la base de datos GeneExpress® o con el software privado escrito y desarrollado en Genentech, Inc. para su uso use con la base de datos GeneExpress®. La tasa de positivos en el análisis se basa en varios criterios incluyendo, por ejemplo, la especificidad de tejido, la especificidad de tumor y el nivel de expresión en tejidos esenciales normales y/o tejidos proliferativos normales. A continuación se indica una lista de moléculas cuyo perfil de expresión de tejidos determinado a partir de un análisis de la base de datos GeneExpress® pone de manifiesto una expresión de tejido elevada y un favorecimiento significativo de la expresión en un tumor o tumores específicos en comparación con otro tumor o tumores y/o tejidos normales y opcionalmente una expresión relativamente baja en tejidos esenciales normales y/o tejidos proliferativos normales. Por tanto, las moléculas indicadas a continuación son polipéptidos dianas excelentes para el diagnóstico y la terapia del cáncer en mamíferos.
\vskip1.000000\baselineskip
39
Ejemplo 2
Análisis por microarray para detectar el favorecimiento de la expresión de polipéptidos TAT en tumores cancerosos
Los microarrays de ácidos nucleicos, que contienen a menudo miles de secuencias de genes, son útiles para identificar genes expresados diferencialmente en tejidos enfermos en comparación con sus equivalentes normales. Utilizando microarrays de ácidos nucleicos, las muestras de ARNm de análisis y control de las muestras de tejido de análisis y control se transcriben de manera inversa y se marcan para generar sondas de ADNc. A continuación, las sondas de ADNc se hibridan a un array de ácidos nucleicos inmovilizados en un soporte sólido. El array se configura de manera que la secuencia y la posición de cada miembro del array son conocidas. Por ejemplo, se pueden disponer en arrays una selección de genes conocidos por expresarse en ciertos estados patológicos en un soporte sólido. La hibridación de una sonda marcada con un miembro del array particular indica que la muestra de la que derivaba a sonda expresa ese gen. Si la señal de hibridación de una sonda de una muestra de análisis (tejido enfermo) es mayor que la señal de hibridación de una sonda de una muestra de control (tejido normal), se identifican el gen o genes sobreexpresados en el tejido enfermo. La implicación de este resultado es que una proteína sobreexpresada en un tejido enfermo es útil no sólo como marcador de diagnóstico para la presencia de la condición patológica, sino también como una diana terapéutica para el tratamiento de la condición patológica.
La metodología de hibridación de ácido nucleicos y la tecnología de microarray son bien conocidas en la técnica. En un ejemplo, la preparación específica de ácidos nucleicos para la hibridación y sondas, portamuestras y las condiciones de hibridación se detallan todos en la Solicitud de Patente PCT de No. de Serie PCT/US01/10482, solicitada el 30 de marzo del 2001 y que se incorpora en la presente por referencia.
En el presente ejemplo, se estudiaron los tumores cancerosos de diferentes tipos de tejido por el favorecimiento de la expresión génica en relación con tumores cancerosos de diferentes tipos de tejido y/o tejidos humanos no cancerosos en un intento por identificar aquellos polipéptidos que se sobreexpresan en un tumor o tumores cancerosos particulares. En ciertos experimentos, se obtuvieron tejido tumoral humano canceroso y tejido tumoral humano no canceroso del mismo tipo de tejido (a menudo del mismo paciente) y se analizó la expresión del polipeptido TAT. Adicionalmente, se obtuvo el tejido tumoral humano canceroso de un conjunto de diversos tumores humanos diferentes y se comparó con una muestra de control epitelial "universal" que se preparó mediante el agrupamiento de tejidos humanos no cancerosos de origen epitelial, incluyendo hígado, riñón y pulmón. El ARNm aislado de los tejidos agrupados representa una mezcla de productos génicos expresados de diferentes tejidos. Los experimentos de hibridación en microarray utilizando las muestras de control agrupadas generaron una representación lineal en un análisis de 2 colores. La pendiente de la línea generada en el análisis a 2 colores se utilizó a continuación para normalizar las proporciones de (detección análisis:control) en cada experimento. Las proporciones normalizadas de varios experimentos se compararon a continuación y se utilizaron para identificar agrupaciones de expresión génica. De este modo, la muestra de "control universal" agrupada no sólo permitía determinaciones eficaces de la expresión génica relativa en una comparación simple de 2 
\hbox{muestras, sino que también
permitía comparaciones  con múltiples muestras a través de varios
experimentos.}
En los presentes experimentos, se utilizaron sondas de ácidos nucleicos derivados de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido TAT descrito aquí en la creación del microarray y se utilizó el ARN de varios tejidos tumorales para la hibridación al mismo. A continuación se muestran los resultados de estos experimentos, demostrando que diversos polipéptidos TAT de la presente invención se sobreexpresan significativamente en varios tejidos tumorales humanos en comparación con su tejido o tejidos equivalentes normales. Además, todas las moléculas mostradas a continuación se sobreexpresan significativamente en su tejido o tejidos tumorales específicos en comparación con la sobreexpresión en el control epitelial "universal". Tal como se ha descrito anteriormente, estos datos demuestran que los polipéptidos TAT de la presente invención son útiles no sólo como marcadores de diagnóstico para la presencia de uno o más tumores cancerosos, sino también sirven como dianas terapéuticas para el tratamiento de estos tumores.
40
Ejemplo 3
Análisis cuantitativo de la expresión de ARNm de TAT
En este ensayo, se utilizaron un ensayo de 5' nucleasa (por ejemplo, TaqMan®) y PCR cuantitativa a tiempo real (por ejemplo, ABI Prizm 7700 Sequence Detection System® (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA)), para encontrar genes que se sobreexpresan significativamente en un tumor o tumores cancerosos en comparación con otros tumores cancerosos o tejidos no cancerosos normales. La reacción del ensayo de 5' nucleasa es una técnica basada en PCR fluorescente que utiliza la actividad de 5' exonucleasa de la enzima Taq ADN polimerasa para controlar la expresión génica a tiempo real. Se utilizan dos cebadores de oligonucleótidos (cuyas secuencias se basan en el gen o la secuencia EST de interés) para generar un amplicón típico de una reacción de PCR. Se diseña un tercer oligonucleótido, o sonda, para detectar la secuencia de nucleótidos localizada entre los dos cebadores de PCR. La sonda no es extendible por la enzima Taq ADN polimerasa, y se marca con un colorante fluorescente informador y un colorante fluorescente desactivador. Cualquier emisión inducida por láser del colorante informador es desactivada por el colorante desactivador cuando los dos colorantes se encuentran próximos al estar en la sonda. Durante la reacción de amplificación con PCR, la enzima Taq ADN polimerasa divide la sonda de una forma dependiente de la plantilla. Los fragmentos de la sonda resultantes se disocian en solución y la señal del colorante informador liberado está libre del efecto desactivador del segundo fluoróforo. Se libera una molécula del colorante informador para cada nueva molécula sintetizada y la detección del colorante informador no desactivado proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.
El procedimiento de 5' nucleasa se desarrolla en en un dispositivo de PCR cuantitativo a tiempo real, tal como el ABI Prism 7700 Sequence Detection. El sistema consiste en un termociclador, un láser, una cámara de dispositivo acoplado por carga (CCD) y un ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser se recoge a tiempo real a través de cables de fibra óptica para los 96 pocillos y se detecta en el CCD. El sistema incluye software para desarrollar el instrumento y para analizar los datos.
El material de partida para el cribado fue ARNm aislado de un conjunto de diferentes tejidos cancerosos. El ARNm se cuantifica de manera exacta, por ejemplo, fluorométricamente. Como control negativo, el ARN se aisló de diversos tejidos normales del mismo tipo de tejido que los tejidos cancerosos de análisis.
Los datos del ensayo de la 5' nucleasa se expresan inicialmente como Ct, o ciclo umbral. Éste se define como el ciclo en el que la señal informadora se acumula por encima del nivel base de fluorescencia. Los valores \DeltaCt se utilizan como medida cuantitativa del número relativo de copias de partida de una secuencia diana particular en una muestra de ácido nucleico cuando se comparan los resultados del ARNm del cáncer con los resultados de ARNm humano normal. Como una unidad Ct corresponde a 1 ciclo de PCR o aproximadamente a un incremento relativo de 2 veces en relación al normal, dos unidades corresponden a un incremento relativo de 4 veces, 3 unidades corresponden a un incremento relativo de 8 veces y así sucesivamente, se puede medir cuantitativamente el incremento relativo de veces en la expresión de ARNm entre dos o más tejidos diferentes. Utilizando esta técnica, se han identificado las moléculas indicadas a continuación por sobreexpresarse de manera significativa en un tumor o tumores particulares en comparación con su tejido o tejidos equivalentes no cancerosos (del mismo y diferentes donantes de tejido) y, de este modo, representan polipéptidos diana excelentes para el diagnóstico y la terapia contra el cáncer en mamíferos.
41
Ejemplo 4
Hibridación in situ
La hibridación in situ es una técnica potente y versátil para la detección y localización de secuencias de ácidos nucleicos en preparaciones de células o tejido. Puede ser útil, por ejemplo, para identificar sitios de expresión génica, analizar la distribución en el tejido de la transcripción, identificar y localizar la infección viral, seguir los cambios en la síntesis de ARNm específico y ayudar en la localización de los cromosomas.
La hibridación in situ se puede llevar a cabo siguiendo una versión optimizada del protocolo por Lu y Gillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994)), utilizando ribosondas marcadas con ^{33}P generadas por PCR que tienen homología con la secuencia diana a detectar. Brevemente, se seccionan tejidos humanos bañados en parafina y fijados a formalina, se desparafinan, se desproteinan en proteinasa K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37ºC, y se procesan posteriormente para una hibridación in situ tal y como se describe por Lu y Gillett, supra. Se genera una ribosonda no codificante marcada con [^{33}-P] UTP a partir de un producto de PCR y se hibrida a 55ºC durante toda la noche. Los portaobjetos se sumergen en una emulsión nuclear de rastreo Kodak NTB2 y se exponen durante 4 semanas.
Síntesis de ribosondas con ^{33}P
Se secaron con concentradores centrífugos de tipo Speed-Vac 6,0 \mul (125 mCi) de ^{33}P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2000 Ci/mol). A cada tubo que contenía ^{33}P-UTP secado, se añadieron los siguientes ingredientes:
2,0 \mul 5x de tampón de transcripción
1,0 \mul de DTT (100 mM)
2,0 \mul de mezcla de NTP (2,5 mM: 10 \mul; cada uno de 10 mM de GTP, CTP y ATP + 10 \mul de H_{2}O)
1,0 \mul de UTP (50 \muM)
1,0 \mul RNAsina
1,0 \mul de molde de ADN (1 \mug)
1,0 \mul de H_{2}O
1,0 \mul de ARN polimerasa (para productos de PCR T3 = AS, T7 = S, normalmente).
\vskip1.000000\baselineskip
Los tubos se incubaron a 37ºC durante una hora. Se añadieron 1,0 \mul de RQ1 ADNasa, seguido de incubación a 37ºC durante 15 minutos. Se añadieron 90 \mul de TE (Tris 10 mM pH 7,6/1 mM EDTA pH 8,0), y la mezcla se pipeteó sobre papel DE81. La solución remanente se cargó en una unidad de ultrafiltración Microcon-50, y se centrifugó utilizando el programa 10 (6 minutos). La unidad de filtración se invirtió sobre un segundo tubo y se centrifugó utilizando el programa 2 (3 minutos). Después de la centrifugación final de recuperación, se añadieron 100 \mul de TE. A continuación, se pipeteó 1 \mul del producto final sobre papel DE81 y se contaron en 6 ml de Biofluor
II.
La sonda se extendió sobre un gel de TBE/urea. Se añadieron 1-3 \mul de la sonda o 5 \mul de ARN MrkII a 3 \mul de tampón de carga. Después de calentar sobre un bloque de calor a 95ºC durante 3 minutos, la sonda se colocó inmediatamente sobre hielo. Los pocillos del gel se nivelaron, se cargó la muestra y se operó a 180-245 voltios durante 45 minutos. El gel se envolvió en un envoltorio de plástico y se expuso a una película XAR con una pantalla intensificadora en un congelador a -70ºC desde una hora hasta toda la noche.
Hibridación de ^{33}-P A. Pretratamiento de las secciones congeladas
Los portaobjetos se extrajeron del congelador, se colocaron sobre bandejas de aluminio y se descongelaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se colocaron en una incubadora a 55ºC durante cinco minutos para reducir la condensación. Los portaobjetos se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído al 4% sobre hielo en la campana de extracción, y se lavaron en 0,5 x SSC durante 5 minutos a temperatura ambiente (25 ml 20 x SSC + 975 ml H_{2}O SQ). Después de la desproteinación en 0,5 \mug/ml de proteinasa K durante 10 minutos a 37ºC (12,5 \mul de 10 mg/ml de reserva en 250 ml de tampón de ARNasa sin ARNasa precalentado), las secciones se lavaron en 0,5 x SSC durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron en etanol al 70%, 95%, 100% durante 2 minutos cada una.
B. Pretratamiento de las secciones bañadas en parafina
Los portaobjetos se desparafinaron, se colocaron en H_{2}O SQ, y se enjuagaron dos veces en 2 x SSC a temperatura ambiente, durante 5 minutos casa vez. Las secciones se desproteinaron en 20 \mug/ml de proteinasa K (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón de ARNasa sin ARNasa; 37ºC, 15 minutos) para tejido de embrión humano, u 8 x proteinasa K (100 \mul en 250 ml de tampón de ARNasa, 37ºC, 30 minutos) para tejidos en formalina. El posterior enjuague en 0,5 x SSC y deshidratación se llevaron a cabo tal y como se ha descrito anteriormente.
C. Prehibridación
Los portaobjetos se dispusieron en una caja de plástico recubierta por tampón de Caja (4 x SSC, formamida al 50%). El papel de filtro se saturó.
D. Hibridación
Se calentaron a 95ºC durante 3 minutos 1,0 x 10^{6} cpm de sonda y 1,0 \mul de ARNt (50 mg/ml reserva) por portaobjeto. Los portaobjetos se enfriaron sobre hielo, y se añadieron 48 \mul de tampón de hibridación por portaobjeto. Después de centrifugar, se añadieron 50 \mul de una mezcla de ^{33}P a 50 \mul de prehibridación en el portaobjetos. Los portaobjetos se incubaron durante toda la noche a 55ºC.
E. Lavados
El lavado se realizó 2 veces durante 10 minutos con 2 x SSC, EDTA a temperatura ambiente (400 ml de 20 x SSC + 16 ml de EDTA 0,25 M, V_{f}=4 L), seguido de un tratamiento con ARNasaA a 37ºC durante 30 minutos (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón de ARNasa = 20 \mug/ml). Los portaobjetos se lavaron 2 veces durante 10 minutos con 2 x SSC, EDTA a temperatura ambiente. Las condiciones de lavado de astringencia fueron las siguientes: 2 horas a 55ºC, 0,1 x SSC, EDTA (20 ml 20 x SSC + 16 ml de EDTA, V_{f}=4 L).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
Análisis por inmunohistoquímica
Se prepararon anticuerpos contra los polipéptidos TAT descritos aquí y se puede realizan un análisis por inmunohistoquímica tal como se indica a continuación. En primer lugar, se fijan las secciones de tejido durante 5 minutos en acetato/etanol (congeladas o insertadas en parafina). A continuación, las secciones se lavan en PBS y a continuación se bloquean con avidita y biotina (kit Vector) durante 10 minutos cada vez seguido de lavado en PBS. A continuación, las secciones se bloquean con suero al 10% durante 20 minutos y, a continuación se transfirieron para eliminar el exceso. A continuación, se añade un anticuerpo primario a las secciones a una concentración de 10 \mug/ml durante 1 hora y, a continuación, las secciones se lavan en PBS. A continuación, se añade un anticuerpo secundario biotinilado (anti-anticuerpo primario) a las secciones durante 30 minutos y a continuación se lavan las secciones con PBS. A continuación, las secciones se exponen a los reactivos del kit Vector ABC durante 30 minutos y, a continuación, las secciones se lavan en PBS. A continuación, las secciones se exponen a diaminobencidina (Pierce) durante 5 minutos y a continuación se lavan en PBS. A continuación, las secciones se contratiñen con hematoxilina de Mayer, se cubren con un portaobjetos y se visualizan. El análisis por inmunohistoquímica también se puede realizar tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press,1989 y Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons
(1997).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6
Verificación y análisis de la expresión diferencial de TAT mediante GEPIS
Los polipéptidos TAT que se pueden haber identificado como un antígeno tumoral tal como se ha descrito en uno o más de los ejemplos anteriores se analizaron y verificaron de la siguiente manera. Se buscó en una base de datos de ADN de marcador de secuencia expresada (EST) (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) y se identificaron las secuencias EST interesantes mediante GEPIS. La obtención del perfil de expresión génico in silico (GEPIS) es una herramienta bioinformática desarrollada en Genentech, Inc. Que caracteriza genes de interés para nuevas dianas terapéuticas contra el cáncer. El GEPIS aprovecha grandes cantidades de información sobre secuencias y bibliotecas de EST para determinar los perfiles de expresión génica. El GEPIS es capaz de determinar el perfil de expresión de un gen en base a su correlación proporcional con el número de sus apariciones en las bases de datos EST y funciona mediante la integración de la base de datos relacional EST de LIFESEQ® y la información propiedad de Genentech de una forma estricta y estadísticamente significativa. En este ejemplo, se utiliza GEPIS para identificar y validar de forma cruzada nuevos antígenso tumorales, aunque se puede configurar GEPIS para realizar análisis muy específicos o trabajos de cribados amplios. Para el cribado inicial, se utiliza GEPIS para identificar las secuencias EST de la base de datos de LIFESEQ® que se correlacionan con la expresión un tejido o tejidos concretos de interés (a menudo un tejido tumoral de interés). Las secuencias EST identificadas en este cribado inicial (o secuencias consenso obtenidas a partir de la alineación de múltiples secuencias EST relacionadas y solapantes obtenidas del cribado inicial) se sometieron entonces a un cribado con el fin de identificar la presencia de por lo menos un dominio transmembrana en la proteína codificada. Finalmente, se utilizó GEPIS para generar un perfil de expresión de tejido completo para las diversas secuencias de interés. Utilizando este tipo de bioinformática de cribado, se identificaron diversos polipéptidos TAT (y sus moléculas de ácido nucleico codificantes) por sobreexpresarse significativamente en un tipo de cáncer particular o ciertos cánceres en comparación con otros cánceres y/o tejidos no cancerosos normales. La tasa de aciertos de GEPIS se basa en varios criterios incluyendo, por ejemplo, especificidad de tejido, especificidad de tumor, y nivel de expresión en tejidos esenciales normales y/o proliferantes normales. La siguiente lista es una lista de moléculas cuyo perfil de expresión en tejidos determinado por GEPIS pone de manifiesto una expresión elevada en tejido y un favorecimiento de la expresión significativo en un tumor o tumores específicos en comparación con otros tejidos tumorales y/o normales y opcionalmente una expresión relativamente baja en tejidos esenciales normales y/o proliferantes normales. Por tanto, las moléculas indicadas a continuación son polipéptidos diana excelentes para el diagnóstico y terapia del cáncer en mamíferos.
42
Ejemplo 7
Utilización de TAT como sonda de hibridación
El siguiente procedimiento describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica TAT como sonda de hibridación para, por ejemplo, el diagnóstico de la presencia de un tumor en un mamífero.
El ADN que comprende la secuencia codificante del TAT de longitud completa o maduro tal como se describe aquí, también se puede utilizar como sonda para cribar los ADNs homólogos (tales como aquéllos que codifican variantes naturales de TAT) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o bibliotecas genómicas de tejido humano.
La hibridación y el lavado de filtros que contienen cualquier ADN de biblioteca se realizan según las siguientes condiciones de elevada astringencia. La hibridación de la sonda derivada de TAT radiomarcada a los filtros se realiza en una solución al 50% de formamida, 5x SSC, SDS al 0,1%, pirofosfato de sodio al 0,1%, 50 mM de fosfato de sodio, pH 6,8, 2x de solución de Denhardt, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de 0,1x SSC y SDS al 0,1% a 42ºC.
A continuación, se pueden identificar los ADNs que tienen una identidad secuencial deseada con el ADN que codifica TAT de secuencia nativa y longitud completa utilizando las técnicas estándar conocidas en el sector.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 8
Expresión de polipéptido de TAT en E. coli
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada de TAT mediante la expresión recombinante en E. coli.
La secuencia de ADN que codifica TAT se amplifica inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deberían contener sitios para las enzimas de restricción que se correspondan con los sitios para enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Se puede utilizar una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de vector adecuado es el pBR322 (derivado del E. coli, véase Bolivar et. al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. El vector se digiere con una enzima de restricción y se desfosforila. A continuación, las secuencias amplificadas por PCR se unen en el vector. El vector preferiblemente incluirá secuencias que codifican un gen resistente a un antibiótico, un promotor trp, una secuencia líder poli-His (incluyendo los primeros seis codones STII, secuencia poli-His, y sitio de división para la enteroquinasa), la región codificante de TAT, el terminador transcripcional lambda, y un gen argU.
A continuación, la mezcla de unión se utiliza para transformar una cepa seleccionada de E. coli utilizando los procedimientos descritos en Sambrook et. al., supra. Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas de LB y, a continuación, se seleccionan las colonias resistentes a los antibióticos. El ADN plasmídico se puede aislar y confirmar mediante el análisis de restricción y la secuenciación del ADN.
Los clones seleccionados se pueden desarrollar durante toda la noche en un medio de cultivo líquido tal como el caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche se puede utilizar posteriormente para inocular un cultivo a mayor escala. A continuación, las células se desarrollan hasta una densidad óptica deseada, durante la cual el promotor de la expresión se activa.
Después de cultivar las células durante muchas más horas, las células se pueden recoger mediante centrifugación. El residuo de células obtenido mediante la centrifugación se puede solubilizar utilizando diversos agentes conocidos en la técnica, y la proteína TAT solubilizada se puede a continuación purificar utilizando una columna quelante de metal en condiciones que permiten la unión fuerte de la proteína.
El TAT se puede expresar en E. coli en una forma etiquetada con poli-His según el procedimiento siguiente. El ADN que codifica TAT se amplifica inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores contendrán sitios para enzimas de restricción que corresponden con los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan un inicio de traducción eficiente y fiable, una purificación rápida en una columna quelante de metales y la eliminación proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias etiquetadas con poli-His amplificadas por PCR se ligan a continuación en un vector de expresión, que se utiliza para transformar un huésped E. coli basado en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA)lon galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq). Los transformantes se desarrollan en primer lugar en LB que contiene carbenicilina 50 mg/ml a 30ºC con agitación hasta alcanzar una D.O. de 3-5 a 600 nm. Los cultivos se diluyen entonces 50-100 veces en medio CRAP (preparado mezclando 3,57 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de citrato sódico\cdot2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de levadura Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF en 500 ml de agua, así como MPOS 110 mM, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y MgSO_{4} 7 mM) y se desarrollan durante aproximadamente 20-30 horas a 30ºC con agitación. Se toman muestras para verificar la expresión mediante análisis de SDS-PAGE, y se centrifuga todo el cultivo para sedimentar las células. Los sedimentos celulares se congelan hasta la purificación y renaturalización.
La pasta de E. coli de fermentaciones de 0,5-1 l (6-10 g de residuo) se resuspende en 10 volúmenes (p/v) en guanidina 7 M, Tris 20 mM, tampón pH 8. Se añaden sulfito sódico sólido y tetrationato sódico hasta concentraciones finales de 0,1 M y 0,02M, respectivamente, y la solución se agita durante toda la noche a 4ºC. Esta etapa da como resultado una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueados por la sulfitolización. La solución se centrifuga a 40.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman durante 30 min. El sobrenadante se diluye con 3-5 volúmenes de tampón de columna quelante de metales (guanidina 6M, Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtra a través de filtros de 0,22 micras para purificar. El extracto purificado se carga en una columna quelante Qiagen de Ni^{2+}-NTA de 5 ml equilibrada en el tampón de la columna quelante de metal. La columna se lava con tampón adicional que contiene imidazol 50 mM (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluye con tampón que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones que contienen la proteína deseada se agrupan y guardan a 4ºC. La concentración de proteínas se estima por su absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado en base a su secuencia de
aminoácidos.
Las proteína se renaturalizan diluyendo la muestra lentamente en tampón de renaturalización preparado fresco que consiste en: Tris 20 mM, pH 8,6; NaCl 0,3 M; urea 2,5 M; cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de renaturalización se eligen para que la concentración final se encuentre entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de renaturalización se agita suavemente a 4ºC durante 12-36 horas. La reacción de renaturalización se desactiva mediante la adición de TFA hasta una concentración final de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de una purificación adicional de la proteína, la solución se filtra a través de un filtro de 0,22 micras y se añade acetonitrilo hasta una concentración final de 2-10%. La proteína renaturalizada se cromatografía en una columna de fase inversa Poros R1/H con un tampón móvil de TFA al 0,1% con elución con un gradiente de acetonitrilo del 10 al 80%. Se analizan alícuotas de fracciones con una absorbancia A_{280} en geles de poliacrilamida-SDS y se agrupan las fracciones que contienen la proteína renaturalizada homogénea. En general, las muestras renaturalizadas de manera adecuada de la mayoría de proteínas se eluyen a las concentraciones más bajas de acetonitrilo, ya que estas muestras son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos resguardados de la interacción con la resina de fase inversa. Las muestras agregadas se eluyen normalmente a concentraciones de acetonitrilo superiores. Además de separar las formas mal plegadas de las proteínas de la forma deseada, la etapa de fase inversa también elimina la endotoxina de las
muestras.
Las fracciones que contienen el polipéptido TAT plegado deseada se agrupan y se elimina el acetonitrilo con una corriente suave de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas se formulan en Hepes 20 mm, pH 6,8 con cloruro sódico 0,14 M y manitol al 4% mediante diálisis o mediante filtración en gel utilizando resinas Superfine G25 (Pharmacia) equilibradas en el tampón de formulación y filtradas de forma estéril.
Algunos de los polipéptidos TAT descritos aquí se han expresado de manera satisfactoria y purificado utilizando técnica o técnicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 9
Expresión de TAT en células de mamíferos
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glicosilada de TAT mediante la expresión recombinante en células de mamíferos.
El vector pRK5 (véase, EP 307.247 publicada el 15 de marzo de 1989) se utiliza como vector de expresión. Opcionalmente, el ADN de TAT se liga en el pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN de TAT utilizando procedimientos de unión tales como los descritos en Sambrook et. al., supra. El vector resultante se denomina pRK5-TAT.
En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se desarrollan hasta la confluencia en placas de cultivo de tejidos en un medio tal como DMEM suplementado con suero de ternera fetal y opcionalmente, componentes nutricionales y/o antibióticos. Se mezclan aproximadamente 10 \mug de ADN de pRK5-[TAT] con aproximadamente 1 \mug de ADN que codifica el gen de ARN VA [Thimmappaya et. al., Cell, 31:543 (1982)] y se disuelve en 500 \mul de Tris-HCl1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227 M. A esta mezcla se le añade, gota a gota, 500 \mul de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM, y se deja formar un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspende y se añade a las células 293 y se deja reposar durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. A continuación, las células 293 se lavan con medio sin suero, se añade medio fresco y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo se extrae y se reemplaza por medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200 \muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml de ^{35}S- metionina. Tras una incubación de 12 horas, se recoge el medio condicionado, se concentra en un filtro de centrifugación y se carga en un gel SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a una película durante un período de tiempo concreto para revelar la presencia del polipéptido TAT. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden experimentar una incubación adicional (en medio sin suero) y el medio se examina en bioensayos concretos.
En una técnica alternativa, se puede introducir TAT en células 293 transitoriamente utilizando el procedimiento del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 1575 (1981). Las células 293 se desarrollan hasta la máxima densidad en un matraz giratorio y se añaden 700 \mug de ADN de pRK5-TAT. En primer lugar, las células se concentran a partir del matraz giratorio mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano es incubado en el residuo celular durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejido, y se reintroducen en el matraz giratorio que contiene el medio de cultivo de tejidos, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio condicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las células y restos celulares. La muestra que contiene el TAT expresado se puede concentrar a continuación y purificar mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como la diálisis y/o cromatografía en columna.
En otra realización, puede expresarse TAT en células CHO. El vector pRK5-TAT puede transfectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos, tales como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Tal y como se ha descrito anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio puede sustituirse por medio de cultivo (solo) o medio que contiene un radiomarcador, tal como ^{35}S-metionina. Después de determinar la presencia del polipéptido TAT, el medio de cultivo puede sustituirse por medio sin suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y, a continuación, se recoge el medio condicionado. A continuación, el medio que contiene el TAT expresado puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.
El TAT etiquetado con epítopo puede expresarse también en células CHO huéspedes. El TAT puede subclonarse fuera del vector pRK5. El inserto del subclón puede someterse a PCR para fusionarse en el marco con una etiqueta epítopo seleccionada, tal como una etiqueta de poli-His en un vector de expresión de Baculovirus. El inserto de TAT etiquetado con poli-His puede subclonarse a continuación en un vector dirigido por SV40 que contiene un marcador de selección, tal como DHFR, para seleccionar clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (tal como se ha descrito anteriormente) con el vector dirigido por SV40. El marcaje puede realizarse, tal como se ha descrito anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el TAT etiquetado con poli-His expresado puede a continuación concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como mediante cromatografía de afinidad de quelato con Ni^{2+}.
TAT también se puede expresar en células CHO y/o COS mediante un procedimiento transitorio o en células CHO mediante otro procedimiento de expresión estable.
La expresión estable en células CHO se realiza utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias codificantes de las formas solubles (por ejemplo, los dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan a una secuencia de región constante de IgG1 que contiene la bisagra, CH2 y los dominios de CH2 y/o es una forma etiquetada de poli-His.
Tras la amplificación por PCR, los ADNs respectivos se subclonan en un vector de expresión de CHO utilizando técnicas estándar descritas en Ausubel et. al., Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresión de CHO se construyen para tener sitios de restricción 5' y 3' compatibles del ADN de interés para permitir el traslado adecuado de los de ADNc. El vector utilizado para la expresión en las células CHO es tal y como se describe en Lucas et. al., Nucl. Acid Res. 24:9 (1774-1779 (1996), y utiliza el promotor/potenciador temprano de SV40 para dirigir la expresión del ADNc de interés y la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido tras la transfección.
Se introducen doce microgramos del ADN plasmídico deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando reactivos de transfección Superfect® (Quiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim) disponibles comercialmente. Las células se desarrollan tal y como se describe en Lucas et. al., supra. Se congelan aproximadamente 3 x 10^{7} células en una ampolla para el crecimiento y producción posterior tal y como se describe a continuación.
Las ampollas que contienen el ADN plasmídico se descongelan mediante la colocación en un baño de agua y se mezclan mediante agitación. El contenido se pipetea en un tubo de centrífuga que contiene 10 mL de medio y se centrifuga a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspira y las células se resuspenden en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado a 0,2 \mum con suero bovino fetal al 5% dialfiltrado a 0,2 \mum). A continuación, las células se fraccionan en un agitador de 100 mL que contiene 90 mL de medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfieren a un agitador de 250 mL lleno con 150 mL de medio de crecimiento selectivo y se incuban a 37ºC. Después de otros 2-3 días, se siembran 3 x 10^{5} células/mL en agitadores de 250 mL, 500 mL y 2000 mL. El medio celular se cambia por medio fresco mediante centrifugación y resuspensión en el medio de producción. Aunque se puede utilizar cualquier medio de CHO adecuado, en realidad se puede utilizar un medio de producción descrito en la patente de Estados Unidos No. 5.122.469, concedida el 16 de junio de 1992. En un agitador de producción de 3L se siembra a razón de 1,2 x 10^{6} células/ml. En el día 0, se determina el número de células y el pH. En el día 1, se toman muestras del agitador y se inicia el burbujeo con aire filtrado. En el día 2, se toman muestras del agitador, la temperatura se cambia a 33ºC, y se añaden 30 mL de glucosa 500 g/L y 0,6 mL de antiespuma al 10% (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). Durante toda la producción, el pH se ajusta según la necesidad manteniéndose en valores alrededor de 7,2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad cae por debajo del 70%, el cultivo celular se recoge mediante centrifugación y se filtra a través de un flitro de 0,22 \mum. El filtrado se guarda a 4ºC o se carga inmediatamente en columnas para la purificación.
Para las construcciones etiquetadas de poli-his, las proteínas se purifican utilizando una columna de Ni^{2+}-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añade imidazol al medio condicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombea en una columna de 6 ml de Ni^{2+}-NTA equilibrada en Hepes20 mM, pH 7,4, tampón que contiene NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min. a 4ºC. Tras cargarse, la columna se lava con un tampón de equilibrio adicional y la proteína se eluye con tampón de equilibrio que contiene imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada se desala posteriormente en un tampón de almacenamiento que contiene Hepes10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml y se guarda a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que contiene Fc) se purifican a partir del medio condicionado tal y como se indica a continuación. El medio condicionado se bombea en una columna de Proteína A (Pharmacia) de 5 ml que ha sido equilibrada en un tampón de fosfato sódico20 mM, pH 6,8. Después de cargarse, la columna se lava ampliamente con tampón de equilibrio antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluída se neutraliza inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 \muL de tampón Tris 1M, pH 9. La proteína altamente purificada se desala posteriormente en un tampón de almacenamiento, tal como el descrito anteriormente para las proteínas etiquetadas con poli-his. La homogeneidad se valora mediante geles de poliacrilamida SDS y mediante la secuenciación de los aminoácidos N-terminales mediante degradación Edman.
Algunos de los polipéptidos TAT descritos aquí se han expresado de manera satisfactoria y purificado utilizando esta técnica o técnicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 10
Expresión de TAT en levadura
El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de TAT en levadura.
En primer lugar, los vectores de expresión de levadura se construyen para la producción o secreción intracelular de TAT a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica TAT y el promotor se insertan en los sitios para enzimas de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de TAT. Para la secreción, el ADN que codifica TAT puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido señal TAT nativo u otro péptido señal de mamífero, o, por ejemplo, una secuencia señal/líder secretora del factor alfa o invertasa de levadura, y secuencias enlazadoras (si se necesitan) para la expresión de TAT.
Las células de levadura, tales como la cepa AB110 de la levadura, pueden a continuación transformarse con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levadura transformados pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y una separación mediante SDS-PAGE, seguido de la tinción de los geles con azul de Coomassie.
El TAT recombinante puede aislarse posteriormente y purificarse mediante la extracción de las células de levadura del medio de fermentación por centrifugación y, a continuación, la concentración del medio utilizando filtros de cartucho específicos. El concentrado que contiene TAT puede purificarse adicionalmente utilizando resinas de cromatografía en columna seleccionadas.
Algunos de los polipéptidos TAT descritos aquí se han expresado de manera satisfactoria y purificado utilizando esta técnica o técnicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 11
Expresión de TAT en células de insectos infectadas de Baculovirus
El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de TAT en células de insectos infectadas de Baculovirus. La secuencia que codifica para TAT se fusiona en dirección 5' de un epítopo etiqueta contenido en un vector de expresión de baculovirus. Dichas epítopo etiquetas incluyen etiquetas de poli-His y etiquetas de inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG). Pueden utilizarse una variedad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de los plásmidos disponibles comercialmente, tales como pVL1393 (Novagen). Brevemente, la secuencia que codifica TAT o la parte deseada de la secuencia codificante de TAT, tal como la secuencia que codifica un dominio extracelular de una proteína transmembrana o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular, se amplifica mediante PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios para enzimas de restricción flanqueantes (seleccionados). El producto se digiere a continuación con todas esas enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera mediante la cotransfección del plásmido anterior y el ADN del virus BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recogen y se utilizan para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de la proteína se realizan tal y como se describe en O'Reilley et. al., Baculovirus expresion vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
A continuación, TAT etiquetado con poli-His expresados puede purificarse, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad de Ni^{2+}-quelato tal y como se indica a continuación. Los extractos se preparan a partir de las células recombinantes Sf9 infectadas del virus tal y como se ha descrito por Rupert et. al., Nature, 362: 175-179 (1993). Brevemente, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en el tampón de sonicación (25 ml de HEPES, pH 7,9; MgCl_{2} 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol al 10%; NP-40 al 0,1%; KCl 0,4 M), y se sonican dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se depuran por centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en el tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara una columna de agarosa Ni^{2+}-NTA (comercialmente disponible de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml del tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se lava hasta la línea base a A_{280} con el tampón de carga, en cuyo punto se inicia la recogida de la fracción. A continuación, la columna se lava con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye la proteína no unida específicamente. Después de alcanzar la línea base a A_{280} de nuevo, la columna se desarrolla con un gradiente de 0 a 500 mM de imidazol en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de un ml y se analizan mediante SDS-PAGE y tinción con plata o transferencia Western con Ni^{2+}-NTA-conjugado a fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen el TAT etiquetado con His_{10} eluído se agrupan y se dializan contra el tampón de carga.
Alternativamente, la purificación del TAT etiquetado con IgG (o con Fc) puede realizarse usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo, por ejemplo, cromatografía en columna con Proteína A o proteína G.
Algunos de los polipéptidos TAT descritos aquí se han expresado de manera satisfactoria y purificado utilizando esta técnica o técnicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 12
Preparación de anticuerpos que se unen a TAT
Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a TAT. Este ejemplo ilustra además la preparación de anticuerpos monoclonales que se pueden unir específicamente al polipéptido TAT188(E16).
Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales son conocidas en el sector y están descritas, por ejemplo, en Goding, supra. Entre los inmunógenos que se pueden utilizar se incluyen TAT purificado, proteínas de fusión que contienen TAT y células que expresan TAT recombinante en la superficie celular. La selección del inmunógeno puede realizarse según el técnico en la materia sin una gran experimentación.
Los ratones, tales como Balb/c, se inmunizan con el inmunógeno de TAT emulsionado en adyuvante completo de Freund y se injecta subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsiona en el adyuvante de MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las bases de las patas traseras del animal. A continuación, los ratones inmunizados se refuerzan 10 a 12 días después con inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A continuación, durante diversas semanas, los ratones también se pueden reforzar con inyecciones de inmunización adicionales. Las muestras de suero se pueden obtener periódicamente de los ratones mediante muestras de sangre retro-orbitales para ser analizadas en ensayos ELISA para detectar anticuerpos anti-TAT.
El polipéptido TAT188, E16, es un proteína con doce segmentos transmembrana con los extremos C y N terminales localizados intracelularmente. TAT(E16) es una subunidad del transportador de aminoácidos grandes neutros independiente de Na2+, heterodimerizado con una cadena pesada habitual 4F2hc (CD98hc) para formar una unidad funcional (véase el diagrama en la figura 155). Para preparar anticuerpos anti-TAT188 (anti-E16) que reconocen un dominio o dominios extracelulares, se utilizaron células PC3, que expresan endógenamente E16, como inmunógenos. Brevemente, se inyectaron células PC3 (22 x 10^{6} células/ml) en ratones Balb-c. Se analizaron títulos de anticuerpos contra células 293 y células 293-E16 (células 293 transfectadas con y que producen E16). Se prepararon seis hibridomas que expresaban anticuerpos anti-E16. De éstos, se observó que tres anticuerpos tenían una buena especificidad para E16 mediante análisis FACS (véase la figura 156) en que la unión a la superficie celular va en paralelo con la expresión en la superficie de E16. Específicamente, la transfección de siARN de E16 inhibía la expresión de E16 (véase el ejemplo 17 aquí) y también disminuía la cantidad de anticuerpo anti-E16 unido a la superficie de células PC3. Estos anticuerpos se refieren aquí como 3B5.1 (o 3B5), 12G12.1 (o 12G12), y 12B9.1 (o 2B9) y se utilizaron para experimentos posteriores descritos aquí.
Los hibridomas que expresan los anticuerpos de la invención se prepararon de la siguiente manera. Después de detectar un título de anticuerpo adecuado, a los animales "positivos" para anticuerpos se les puede inyectar una inyección intravenosa final de TAT. De tres a cuatro días más tarde, los ratones se sacrifican y se recogen las células del bazo. A continuación, las células del bazo se fusionan (usando polietilenglicol al 35%) a una línea celular de mieloma murino seleccionado, tal como la P3X63AgU.1, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que se pueden colocar a continuación en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos que contienen un medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo.
Las células de hibridomas se cribaron en un ELISA para la reactividad contra TAT. La determinación de células de hibridomas "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra TAT está dentro de la técnica.
Las células de hibridomas positivas se pueden inyectar intraperitonialmente en ratones singeneicos Balb/c para producir fluidos ascíticos que contienen los anticuerpos monoclonales anti-TAT. Alternativamente, las células de hibridoma pueden desarrollarse en matraces o en botellas en rodillo de cultivos de tejidos. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en los fluidos ascíticos se puede realizar usando precipitación con sulfato de amonio, seguido por cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede usarse la cromatografía por afinidad basada en la unión del anticuerpo a la proteína A o la proteína G.
Los anticuerpos dirigidos contra el polipéptido TAT descrito aquí se pueden producir satisfactoriamente utilizando esta técnica o técnicas. Más específicamente, los anticuerpos monoclonales funcionales que son capaces de reconocer y unirse a la proteína TAT (medido mediante ELISA estándar, análisis de separación FACS y/o análisis por inmunohistoquímica) se generan satisfactoriamente contra la siguiente proteína TAT descritas aquí: TAT188 (DNA237637).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 13
Purificación de polipéptidos TAT utilizando anticuerpos específicos
Los polipéptidos TAT nativos o recombinantes se pueden purificar mediante una variedad de técnicas estándar en las técnicas de purificación de proteínas. Por ejemplo, se purifica el polipéptido pro-TAT, el polipéptido TAT maduro, o el polipéptido pre-TAT mediante cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para el polipéptido TAT de interés. En general, se construye una columna de inmunoafinidad por acoplamientos covalentes de anticuerpos anti-polipéptido TAT a una resina de cromatografía activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de sueros inmunes mediante precipitación con sulfato de amonio o mediante purificación en la Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J). Así mismo, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de los fluidos ascíticos de ratón mediante la precipitación con sulfato de amonio o cromatografía en Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se une covalentemente a una resina cromatográfica, tal como la SEPHAROSE^{TM} activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea y la resina derivada se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Dicha columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación del polipéptido TAT mediante la preparación de una fracción a partir de células que contienen polipéptido TAT en una forma soluble. Esta preparación se deriva por solubilización de toda la célula o de una fracción subcelular obtenida mediante centrifugación diferencial por adición de detergente o mediante otros procedimientos conocidos en la técnica. Alternativamente, el polipéptido TAT soluble que contiene una secuencia señal puede secretarse en una cantidad útil en el medio en el que las células crecen.
Una preparación que contiene polipéptido TAT soluble se pasa por la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava en condiciones que permiten la absorbancia preferencial del polipéptido TAT (por ejemplo, tampones de fuerza iónica elevada en presencia de detergente). A continuación, la columna se eluye en condiciones que interrumpen la unión anticuerpo/polipéptido TAT (por ejemplo, un tampón de pH bajo, tal como aproximadamente un pH de 2-3, o una alta concentración de caótropo, tal como urea o ión tiocianato), y se recoge el polipéptido TAT.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 14
Ensayo de citólisis de células tumorales in vitro
Las células de mamífero que expresan el polipéptido TAT de interés se pueden obtener utilizando técnicas con vectores de expresión y clonación estándar. Alternativamente, muchas líneas de células tumorales que expresan polipéptidos TAT de interés están disponibles públicamente, por ejemplo, a través de ATCC y se pueden identificar de manera rutinaria utilizando un análisis ELISa o FACS estándar. A continuación, se pueden utilizar anticuerpos monoclonales anti-péptido TAT (y derivados de los mismos conjugados a toxina) en ensayos para determinar la capacidad del anticuerpo para provocar la citólisis de células que expresan el polipéptido TAT in vitro.
Por ejemplo, las células que expresan el polipéptido TAT de interés se obtienen tal como se ha descrito anteriormente y se emplacan en placas de 96 pocillos. En un análisis, el conjugado anticuerpo/toxina (o anticuerpo desnudo) se incluye a lo largo de la incubación celular durante un periodo de 4 días. En un segundo análisis independiente, las células se incuban durante 1 hora con el conjugado anticuerpo/toxina (o anticuerpo desnudo) y a continuación se lavan y se incuban en ausencia de conjugado anticuerpo/toxina durante un periodo de 4 días. A continuación, se mide la viabilidad celular utilizando el CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay de Promega (Cat# G7571). Las células no tratadas sirven como control negativo.
En un análisis específico, se analizó la capacidad de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra TAT112
(DNA96930) por su capacidad de eliminar células que expresan ese polipéptido. En un análisis, se preparó un vector de expresión denominado gD.NCA. Las secuencias que codifican el polipéptido TAT112 insertadas en el vector son dirigidas por un promotor SV40 y el vector también contiene una señal poliA temprana de Sv40. El vector gD.NCA se cotransfectó en células PC3 junto con un vector Sv40 que expresa la resistencia a neo en células PC3 y se seleccionaron transformantes positivos en 800 mg/ml de G418. Se aislaron los clones positivos en placas de 96 pocillos y se analizaron por citometría de flujo utilizando un anticuerpo monoclonal anti-TAT112 tal como se ha descrito anteriormente y se denominó 3E6. Se seleccionó el clon 3 para el análisis ya que se encontró que expresaba un nivel elevado de polipéptido TAT112 en su superficie. En un segundo análisis independiente, la línea de células de cáncer pancreático, Hpaf II, se obtuvo del ATCC y se utilizó en el ensayo.
En otro análisis específico, se analizó la capacidad de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra TAT188 (DNA237637) por la capacidad de eliminar células que expresan ese polipéptido.
En primer lugar, se demostró la capacidad de un anticuerpo anti-TAT188(E16) desnudo de afectar en la actividad celular.
A. Los anticuerpos monoclonales anti-TAT188(E16) estimulan la internalización de TAT188(E16) y reducen la actividad de transporte de aminoácidos
La unión del anticuerpo anti-E16 a células que expresan la proteína E16 produjo la internalización de anticuerpos en paralelo con una reducción en el transporte de aminoácidos. Las células PC3 se incubaron con anticuerpos primarios durante el tiempo indicado con inhibidores de proteasoma (Sigma) a 37ºC. a continuación, se extrajeron los anticuerpos y se lavaron las células con PBS diversas veces. Las células se fijan con PFA al 4%, a continuación se permeabilizan con PBS/Triton X-100 al 0,1%. Después de bloquear con suero de cabra al 10%, las células se tiñeron con anticuerpo secundario (conjugado IgG-Cy3 anti-ratón de cabra (Jackson immunolabs)) y se analizaron mediante microscopía fluorescente. Los resultados muestran que un anticuerpo monoclonal anti-E16 se une y es internalizado por células PC3 que expresan TAT188(E16) en su superficie (véase la figura 157). La demostración de la internalización del anticuerpo anti-TAT188 destaca una característica útil de la interacción anticuerpo-E16 ya que la internalización de un anticuerpo unido puede dar lugar a la captación de toxinas conjugadas a los anticuerpos anti-TAT188 (véase las secciones B y C de este ejemplo 14).
La función de TAT188(E16) como proteína transportadora de aminoácidos se inhibió mediante la unión de anticuerpo anti-TAT188(E16). El ensayo funcional de transporte de leucinas se realizó de la siguiente manera. Las células se desarrollaron en placas de 24 pocillos y se trataron con anticuerpo anti-E16 durante la noche. A continuación, se enjuagaron las células con Hepes-Ringer libre de Na++ caliente y se incubaron durante 10 minutos a 37ºC. Se cambió el tampón a 200 \mul/pocillo de tampón de ensayo que contenía aminoácidos radiomarcados (L-[2, 3-^{3}H]-Arginina o L-[3, 4, 5-^{3}H(N)]-Leucina) 5 \muCi/ml, 50 \mul de Hepes-Ringer sin sodio). Después de incubar la mezcla radioactiva durante 30 segundos a 37ºC, se extrajo el tampón mediante aspiración y las célula se lavaron con Hepes-Ringer libre de sodio enfriado en hielo 1 ml/pocillo durante 4 veces. Las placas se secaron y se les añadió 0,2 ml/pocillo de SDS al 0,2%/NaOH 0,2 N. Se neutralizaron alícuotas de 0,1 ml de cada muestra con 0,1 ml de HCl 0,2 N, después de lo cual, se añadió un cóctel de centelleo líquido. Se analizó la radioactividad ([^{3}H]) de los lisados utilizando un contador de centelleo. Los resultados en la figura 158 también demuestran que la unión del anticuerpo anti-E16 a la proteína E16 en la superficie celular provoca una reducción global en el transporte de aminoácidos después de aproximadamente 24 horas. La reducción es debida a la internalización concomitante del polipéptido E16 y la pérdida de E16 disponible para la función de transporte.
B. La unión de anticuerpos anti-TAT188(E16) conjugados a toxina a células que expresan TAT188(E16) da lugar a la citólisis Preparación de anti-TAT188-MC-vc-PAB-MMAE mediante la conjugación de anti-TAT188 y MC-vc-PAB-MMAE
Los anticuerpos proporcionan un método conveniente y altamente específico para liberar citotoxinas a las células en las que una característica relativamente única de la célula, tal como una proteína de la superficie específica de tejido (o específica de la enfermedad o ambos), permite que la célula sea reconocida para la citólisis a la vez que se evita la citólisis de células sanas. Las citotoxinas de auristatina acopladas a un anticuerpo a través de un enlazador MCvc-PAB tal como se ha descrito anteriormente aquí, son útiles para demostrar la citólisis resultante de la internalización mediada por E16 del conjugado anticuerpo-toxina. El procedimiento seguido fue el siguiente. Utilizando un enlazador MC-vc-PAB, la toxina MMAE se unió covalentemente a residuos de cisteína en anticuerpos anti-TAT188. Los anti-TAT188, disueltos en borato sódico 500 mM y cloruro sódico 500 mM a pH 8,0, se tratan con un exceso de ditiotreitol (DTT) 100 mM. Después de incubación a 37ºC durante aproximadamente 30 minutos, el tampón se intercambia por elución sobre una resina Sephadex G25 y se eluye con PBS con DTPA 1 mM. El valor de tiol/Ab se comprueba determinando la concentración de anticuerpo reducida a partir de la absorbancia a 280 nm de la solución y la concentración de tiol mediante la reacción con DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) y la determinación de la absorbancia a 412 nm. El anticuerpo reducido disuelto en PBS se enfría en hielo.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
El fármaco reactivo enlazador, maleimidocaproil-valina-citrulina-PAB-monometil auristatina E (MMAE), es decir MC-vc-PAB-MMAE, disuelto en DMSO, se diluye en acetonitrilo y agua a concentraciones conocidas, y se añaden al anticuerpo anti-TAT188(E16) reducido enfriado en PBS. Después de aproximadamente una hora, se añade un exceso de maleimida para detener la reacción y bloquear cualquier grupo tiol de anticuerpo no reaccionado. La mezcla de reacción se concentra mediante ultracentrifugación centrífuga y el anti-TAT188(E16)-MC-vc-PAB-MMAE se purifica y desala mediante elución en un resina G25 en PBS, se filtra a través de filtros de 0,2 mm en condiciones estériles y se congela para su almacenamiento.
Preparación de anti-TAT188-MC-vc-PAB-MMAF por conjugación de anti-TAT188 y MC-vc-PAB-MMAF
Anti-TAT198-MC-val-cit-PAB-MMAF se prepare por conjugación de anti-TAT188(E16) y MC-val-cit-PABMMAF siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para la conjugación de MMAE. MMAF es un derivado de MMAE con una fenilalanina en el extremo c-terminal del fármaco.
Determinación de la citotoxicidad in vitro de anti-TAT188 conjugado a toxina
Los anticuerpos 3B5, 12B9, y 12G12 conjugados a toxina para este experimento se prepararon como conjugados 3B5-MC-vc-PAB-MMAE, 12B9-MC-vc-PAB-MMAE, y 3B5-MC-vc-PAB-MMAE, respectivamente. El conjugado anticuerpo-toxina, alfa-IL8-MC-vc-PAB-MMAE, se utilizó como control negativo. Las células PC3 (una línea celular de cáncer de próstata, disponible de ATCC y que expresa endógenamente E16 en su superficie) y las células Colo205 (una línea celular de cáncer de colon humano, disponible de ATCC y que expresa endógenamente E16 en su superficie) se pudieron en contacto con concentraciones crecientes de anticuerpos conjugados a toxina y se monitorizó la citólisis mediante un ensayo por bioluminiscencia estándar de la viabilidad celular (CellTiterGlo^{TM} Kit, Promega) tal como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la figura Fig. 159A (células PC3) y la Fig. 159B (células Colo205) demuestran que los tres anticuerpos anti-E16 conjugados a toxina estimulan la citólisis de células que expresan E16.
Se unió otra toxina, MMAF, al anticuerpo y se analizó la citotoxicidad. Los anticuerpos 3B5 unidos a toxina para este experimento se designaron como 3B5-MC-vc-PAB-MMAE y 3B5-MC-vc-PAB-MMAF. El conjugado anticuerpo-toxina, alfa-IL8-vc-MMAE, se utilizó como control negativo. EL número promedio de moléculas de toxina unidas a cada anticuerpo fue de aproximadamente cuatro molécula de toxina por anticuerpo tal como se muestra en la Fig. 160. Las células de la línea celular de cáncer de colon humano, Colo205, se sembraron en placas de 96 pocillos a 4000 células/pocillo en 50 ml de medio de cultivo. Al día siguiente, las células se incubaron con anticuerpos 3B5-MC-vc-PAB-MMAE, 3B5-MC-vc-PAB-MMAF o alfa-IL8-vc-MMAE en concentraciones graduales diluidas en 50 ml de medio de cultivo durante 72 horas. La viabilidad celular se midió utilizando un kit de ensayo de la viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo^{TM} (Promega). Los resultados mostrados en la Fig. 160 demuestran que los anticuerpos anti-E16 conjugados a MC-vc-PAB-MMAE y MC-vc-PAB-MMAF presentan la capacidad de eliminar células que expresan E16, proporcionando la toxina MMAF (EC50 aproximadamente 0,06 \mug/ml) una mayor citólisis que MMAF (EC50 aproximadamente 0,007 \mug/ml).
El desarrollo de los anticuerpos de la presente invención como agentes terapéuticos en humanos requiere estudios iniciales de toxicidad en monos y/o primates. La secuencia de aminoácidos de E16 varía a lo largo de las especies, tales como las secuencias de aminoácidos de E16 de humano versus mono, rata y ratón son del 96,26%, 91,05% y 90,66, respectivamente. Para determinar si los anticuerpos anti-TAT188(E16) humano eran capaces también de unirse y eliminar células de mono, se realizó el siguiente experimento in vitro. Se utilizó una línea celular de mono, COS7 (disponible de ATCC), que expresa endógenamente E16 de mono en su superficie. Los anticuerpos anti-E16 3B5, 12B9, y 12G12 se pusieron en contacto con células de humano, mono y ratón que expresan endógenamente E16 de humano, mono y ratón, respectivamente, y se analizó mediante análisis FACS estándar. El FACS mostró que cada uno de los tres anticuerpos E16 anti-humanos 3B5, 12G12, y 12B9 se unen a células COS7 de mono que expresan E16 humano (véase la Fig. 161A), así como células humanas que expresan E16 humano (véase Fig. 161B), pero no se unen a células que expresan E16 de ratón (véase Fig. 161B). Por tanto, los anticuerpos anti-TAT188(E16) de la invención son útiles para estudios de actividad clínica, eficacia y toxicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 15
Ensayo de citólisis de tumores in vivo Actividad anti-TAT112
Para analizar la eficacia de anticuerpos monoclonales anti-TAT112 no conjugados, se inyectó el anticuerpo anti-TAT112 intraperitonealmente en ratones desnudos 24 horas antes de recibir las células del clon 3 de PC3.gD.NCA (obtenidas tal como se describe en el Ejemplo 14 anterior) subcutáneamente en el costado. Las inyecciones de anticuerpo continuaron dos veces por semana.
Para analizar la eficacia del anticuerpo anti-TAT112 conjugado DM1, las células del clon 3 de PC3.gD.NCA (tal como se describe en el Ejemplo 14 anterior) se inocularon en el costado de los ratones desnudos. Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de aproximadamente 100 mm^{3}, los ratones se trataron con anticuerpo anti-TAT112 conjugado a DM1 intravenosamente una vez o dos veces por semana.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los resultados de los análisis anteriores demostraron que tanto el anti-TAT112 no conjugado como el anticuerpo anti-TAT112 conjugado a DM1 eran altamente eficaces en la reducción del volumen tumoral en este modelo in vivo. Estos análisis demuestran que los anticuerpos monoclonales anti-polipéptido TAT son eficaces para la citólisis de células tumorales que expresan un polipéptido TAT de interés.
Actividad anti-TAT118 (E16)
Para analizar la eficacia de los anticuerpos monoclonales anti-TAT188 no conjugados, anticuerpos anti-TAT188 3B5, 12B9 y 12G12 en la citólisis in vitro, se siguió el siguiente procedimiento. Se inyectaron células PC3, que expresan E16 endógenamente, en ratones desnudos atímicos (un/un) en el costado dorsal. En el mismo día que la inoculación celular, se inyectaron anticuerpos a 2 mg/kg intraperitonealmente dos veces por semana. A los ratones de control se les inyectó PBS sin anticuerpo. Se monitorizaron diez ratones en cada grupo durante 4 semanas y se midió el volumen tumoral dos veces por semana. Mediante la inyección de células tumorales y anticuerpo anti-E16 simultáneamente, este procedimiento analizó la capacidad de los anticuerpos administrados para inhibir el establecimiento de tumores en los ratones con xenoinjerto. Los resultados en la figura 162 muestran que en este experimento, el volumen tumoral promedio no era significativamente inferior que para el anticuerpo de control.
Para analizar la eficacia del anticuerpo anti-TAT188(E16) conjugado a MC-vc-PAB-MMAE y MC-vc-PAB-MMAF, las células Colo205 se inocularon en el costado de ratones desnudos atímicos (un/un) y, después de aproximadamente 1 semana, cuando el tumor había alcanzado un volumen promedio de aproximadamente 100-200 mm^{3}, se les inyectó a los ratones anticuerpo conjugado a 3 mg/kg intravenosamente una vez por semana. Los siguientes tratamientos con anticuerpo se realizaron en el día. Los ratones que contenía tumores se dividieron en grupos: (1) Mock control - 0,2ml o menos de PBS, inyección intravenosa una vez por semana durante 4 semanas; (2) anticuerpo control - anti-IL8-MC-vc-PAB-MMAE en 0,2 ml o menos de PBS, inyección intravenosa una vez por semana durante 4 semanas; (3) Anticuerpo - 3B5-MC-vc-PAB-MMAE inyección intravenosa una vez por semana durante 4 semanas; (4) Anticuerpo - 3B5-MC-vc-PAB-MMAF inyección intravenosa una vez por semana durante 4 semanas. Se midió el volumen tumoral promedio y se representó frente al tiempo. Los resultados en la figura 163 muestran que el anticuerpo anti-E16 conjugado a MMAE y MMAF reducía significativamente el volumen tumoral en este modelo in vivo. Estos análisis demuestran que los anticuerpos monoclonales anti-polipéptido TAT, tales como anticuerpos anti-188(E16), son eficaces para la citólisis de células tumorales que expresan un polipéptido TAT de interés, tal como el polipéptido TAT188(E16).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 16
Análisis por transferencia Northern
Se realizó el análisis por transferencia Northern esencialmente tal y como describe Sambrook et al., supra. El análisis por transferencia Northern que utiliza sondas derivadas de DNA231542, DNA231542-1, DNA231542-2 y DNA297393 pone de manifiesto el favorecimiento significativo de la expresión en tejido de glioma humano en comparación con tejido de cerebro humano normal.
También se realizaron análisis por transferencia Northern utilizando sondas derivadas de DNA237637 (TAT188, E16) y los resultados mostraron que la expresión en mama, colon, recto, endometrio, riñón, pulmón, ovario, piel, e hígado humanos pone de manifiesto el favorecimiento significativo de la expresión en cánceres humanos en comparación con el tejido humano normal del mismo tipo de tejido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 17
Modulación de la expresión de TAT mediante siARN
Se ha demostrado que los siARN son útiles como herramienta en estudios de modulación de expresión génica en los que los antagonistas tradicionales, tales como las moléculas pequeñas o anticuerpos, han fallado. (Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003)). Los ARNs de doble cadena sintetizados in vitro que tienen de 21 a 23 nucleótidos de longitud pueden actuar como ARNs de interferencia (ARNsi) y pueden inhibir específicamente la expresión génica (Fire A., Trends in Genetics 391; 806-810 (1999)). Estos siARN actúan a través de la mediación de la degradación de sus ARNs diana. Sin embargo, debido a que son de una longitud inferior a 30 nucleótidos, no desencadenan un mecanismo de defensa antiviral celular. Dichos mecanismos incluyen la produccción de interferones, y una suspensión general de la síntesis proteica en la célula huésped. En la práctica, pueden sintetizarse los siARN y a continuación clonarse en vectores de ADN. Dichos vectores pueden transfectarse y hacer que expresen los siARN a niveles elevados. El nivel elevado de expresión de siARN se utiliza para "knockdown" o reducir significativamente la cantidad de proteína producida en una célula, y de este modo, es útil en experimentos en los que se cree que la sobreexpresión de una proteína está unida a un trastorno como el cáncer. Los TAT son antígenos tumorales expresados en la superficie celular y se observó la sobreexpresión de TAT mediante microarray, Taqman^{TM} y análisis de hibridación in situ. Aunque en la presente invención se demuestra que el anticuerpo que se une a TATs, tales como TAT188, inhibe la función del antígeno tumoral y, con respecto a los anticuerpos conjugados a toxina, causa muerte celular, los siARN son antagonistas útiles para proteínas TAT al limitar la producción celular del antígeno.
Procedimientos experimentales y resultados: TAT188 (E16)
Los siguientes experimentos demuestran que siARN específico para TAT188 (también llamado E16 en la presente invención) reduce la expresión de ARN, la producción de proteína, la expresión en la superficie celular, y la función proteica. El mismo o procedimientos similares son útiles para demostrar el desfavorecimiento de la expresión de siARN de otros ARNs de TAT de la invención. Puede realizarse una selección de la secuencia diana mediante cualquier procedimiento adecuado (ver, por ejemplo, Amarzguioui, M. y Prydz, H., Biochem Biophys Res Comm 316:1050-1058 (2004).
A. La transfección transitoria de siARN de E16 reduce la expresión de E16-GFP en células PC3-E16-GFP
Se utilizó la línea celular de cáncer de próstata, PC3, en este conjunto de experimentos ya que sobreexpresa TAT188 endógenamente. Se transfectaron células PC3 utilizando oligos de ARN de 21 unidades de doble cadena contra TAT188 (siTAT188), lamin o transfectados mock. A continuación se enumeran estos oligos.
oligos de siARN:
TAT188(E16)
A continuación, se muestra la secuencia de ADN de la región diana en la secuencia que codifica TAT188(E16) seguida de las secuencias de las cadenas de sentido y antisentido del siARN de doble cadena.
AAGGAAGAGGCGCGGGAGAAG (SEC ID Nº:155), es la secuencia de ácido nucleico en la región que codifica TAT188 marcada por los oligos de siARN utilizados en los ejemplos de siARN de TAT188 descritos en la presente invención. Pueden elegirse otras secuencias como dianas según la práctica estándar en el campo del silenciamiento de genes de ARNsi.
oligos de siARN de TAT188(E16):
Sentido: r(GGAAGAGGCGCGGGAGAAG)TT (SEC ID Nº:156)
Antisentido: r(CUUCUCCCGCGCCUCUUCC)TT (SEC ID Nº:157)
oligos de siARNsi silamin:
Sentido: r(CUGGACUUCCAGAAGAACA)TT (SEC ID Nº:158)
Antisentido: r(UGUUCUGGAAGUCCAG)TT (SEC ID Nº:159)
(ver Elbashir et al., Nature 411:494-498 (2001).
Se analizó dos días después de la transfección el nivel relativo de polipéptido TAT188(E16) frente al "knockdown" de la expresión de E16-EGFP mediante la monitorización con microscopía de fluorescencia de la fluorescencia de EGFP. Una disminución de la expresión de E16 va en paralelo con una reducción en la producción de EGFP y la bioluminiscencia detectada. Los resultados en la Fig. 164 demuestran que la transfección transitoria con siARN de siTAT188(E16) redujo la expresión de la fusión E16-EGFP. La proteína de fusión referida como "GFP" en las Figs. 164 y 164 hace referencia a una fusión E16-EGFP producida mediante la clonación del gen de E16 en un vector pEGFP-C1 de BDClontech.
B. La transfección transitoria de siARN de E16 reduce la producción de polipéptido TAT188(E16)
Se demostró que la reducción de la expresión de E16 mediante la reducción en proteína E16 utilizando análisis de transferencia Western. Los oligos de ARN de siTAT188(siEl6) SEC ID Nº:156 y SEC ID Nº:157 y los oligos de siARN de lamin SEC ID Nº:158 y SEC ID Nº:159 utilizados en este ejemplo eran los mismos que los mostrados anteriormente en la parte A de este ejemplo. Se recogieron células PC3 transfectadas transitoriamente con E116-EGFP 3 días después de la transfección y se realizó una transferencia Western en banda con beta-tubulina para indicar la carga proteica. Se visualizó la transferencia Western de fusiones de TAT188(E16)-GFP utilizando anticuerpo anti-GFP marcado de forma detectable (ver Fig. 165, carril izquierdo - transfección mock; carril derecho, transfección de siARN de E16). Los resultados demuestran que la presencia de siARN de TAT188(E16) en una célula que expresa la proteína de fusión E16-GFP reducía la expresión de E16-GFP significativamente.
C. La transfección transitoria de siARN de E16 inhibe la actividad transportadora de aminoácidos de E16 endógeno en células PC3
Se llevó a cabo el mismo procedimiento para la transfección transitoria de siARN de TAT188(E16) y siARN de lamin (control). Se evaluaron las células de análisis y control por su actividad E16 como una proteína de transporte de aminoácidos tal y como se indica a continuación utilizando el ensayo de transporte de leucina descrito en la presente invención anteriormente. Los resultados en la Fig. 166 muestran que la reducción de siARN de E16 en ARN de E16 y la producción de proteína concuerdan con la reducción en la cantidad de E16 disponible para actuar en el transporte de aminoácidos en la célula.
D. La transfección transitoria de siARN de E16 reduce la expresión en superficie de E16
Este ejemplo se realizó tal y como indica a continuación. Cuarenta y ocho horas después de la transfección de siARN, se analizaron las células mediante FACS. En resumen, se incubaron las células con anticuerpos primarios durante una hora en hielo. A continuación, se marcaron las células con un anticuerpo secundario conjugado con un colorante fluorescente (tales como, ejemplos no limitantes, Cy-3 o PE) y se recogieron datos con FACScaliber^{TM} o FACScan^{TM}. Se analizaron los datos recogidos utilizando, como ejemplos no limitantes, Cellquest^{TM} (BD Clontech) o FlowJo^{TM} (Tree Star, Inc.). Tal y como se describe en el Ejemplo 12, en la presente invención, se demostró que los tres anticuerpos monoclonales anti-E16, 3b5, 12B9, y 12G12, se unían menos en células PC3 después de la transfección de siARN de TAT188(E16) que concuerda con la expresión reducida de la proteína E16 en presencia de siARN marcado (ver Fig. 156).
E. La transfección transitoria de siARN de TAT188(E16) inhibe la proliferación celular de PC3
La proliferación de células PC3 transfectadas con siARN que reconocen TAT188 puede analizarse según el siguiente protocolo comercial (Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Mendoza et al. (2202) Cancer Res. 62:5485-5488). Por ejemplo, se pusieron en placas las células PC3 a 3,5x10^{5} células/pocillo en placas de 6 pocillos. Al día siguiente, se utilizó ARN de doble cadena (ARNds, SEC ID Nº:155 y SEC ID Nº:156) o siARN de control de lamin (utilizando oligos de siARN SEC ID Nº:157 y SEC ID Nº:158) en una concentración final de 100 nM para transfectar las células utilizando Lipofectamin2000 (Invitrogen). Después de 6 horas de transfección, se resembraron células en placas de 96 pocillos, y se midió la viabilidad celular utilizando Cell Counting Kit-8^{TM} (Dojindo) en los puntos de tiempo indicados en la Fig. 167, donde RLU = unidades de luminiscencia relativa. Otras células que pueden analizarse mediante este método si expresan TAT188 (ya sea endógenamente o después de la transfección con ácido nucleico que codifica TAT188) incluyen sin limitación SKBR-3, BT474, MCF7 o MDA-MB-468 demostrando que la reducción en la expresión de E16 en células de cáncer de mama da lugar a citólisis y que el cáncer de mama, además del de próstata, el colorrectal y otros tipos de cáncer, son dianas deseables para el tratamiento utilizando el "knockdown" de la expresión de E16.
Estos datos muestran que los siARNs pueden "knockdown" o reducir la expresión de proteínas TAT, tales como la proteína TAT188 (E16). La reducción se muestra mediante la reducción de la expresión de ARN (ensayos de hibridación in situ), la producción reducida de proteína (tal y como se muestra en análisis de transferencia Western), expresión reducida en la superficie celular de TAT188 (E16) (tal y como se muestra mediante análisis FACS y ensayos de internalización), y función reducida (tal y como se muestra por la reducción en el transporte de aminoácidos). La reducción de siARN de proteínas TAT, tales como TAT188 (E16), durante un periodo de tiempo da lugar a la reducción de la proliferación celular en líneas celulares de cáncer. Por tanto, siARN es útil en la reducción de proteínas TAT, tales como TAT188 (E16). La reducción en el nivel de proteínas TAT, tales como TAT188 (E16), provoca una reducción en la proliferación de líneas celulares de cáncer. Debido a que el cáncer es un trastorno proliferativo celular, estos resultados muestran que antagonistas de los polipéptidos TAT, tales como TAT188 (E16) serían útiles en la reducción del crecimiento celular del cáncer. La reducción del crecimiento celular del cáncer sería útil para el alivio del cáncer en mamíferos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 18
Depósito de Materiales
La siguiente línea celular de hibridoma se ha depositado con la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA (ATCC):
43
Este depósito se realizó según lo estipulado en el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes y el Reglamento bajo el mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha del depósito. La línea celular estará disponible mediante la ATCC según los términos del Tratado de Budapest, y está sujeta a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura (a) que el acceso al cultivo estará disponible durante el trámite de la solicitud de patente por alguien determinado por el Comisionado como autorizado al mismo según la norma 37 CFR \NAK 1.14 y 35 USC \NAK 122 y (b) que todas las restricciones en la disponibilidad al público del cultivo depositado de este modo será irrevocablemente retiradas después de la concesión de la patente.
El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si el cultivo en el depósito muriera o se perdiera o se destruyera cuando se cultiva en las condiciones adecuadas, será inmediatamente remplazado en una notificación una muestra viable del mismo cultivo. La disponibilidad de la línea celular depositada no se interpreta como una licencia para realizar la invención contraviniendo los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente.
La memoria escrita anterior se considera que es suficiente para permitir a un experto en la materia realizar la invención. La presente invención no se limita en su alcance por la construcción depositada, ya que la realización depositada pretende ser una ilustración individual de ciertos aspectos de la presente invención y otras construcciones que son funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la presente invención. El depósito del material de la presente invención no constituye la admisión de que la descripción escrita contenida en la presente invención sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el modo óptimo de la misma, ni se interpreta como limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. De hecho, las diversas modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en la presente invención serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.
Documentos de patente citados en la descripción
\bullet US 20040018194 A [0009]
\bullet WO 04032828 A [0009]
\bullet WO 03043583 A [0009]
\bullet US 5767237 A [0009]
\bullet US 6124431 A [0009]
\bullet WO 03000113 A [0011]
\bullet EP 111048 A [0011]
\bullet US 4275149 A [0074]
\bullet US 4816567 A [0090] [0091] [0129] [0139] [0141]
\bullet US 5641870 A [0093] [0149]
\bullet EP 404097 A [0098]
\bullet WO 9311161 A [0098]
\bullet US 5556762 A [0101] [0185]
\bullet US 5750373 A [0101] [0185]
\bullet US 4708871 A [0101] [0185]
\bullet US 4833092 A [0101] [0185]
\bullet US 5223409 A [0101] [0185] [0186]
\bullet US 5403484 A [0101] [0185] [0186]
\bullet US 5571689 A [0101] [0185] [0186]
\bullet US 5663143 A [0101] [0185] [0186]
\bullet WO 8403506 A [0101] [0185]
\bullet WO 8403564 A [0101] [0185]
\bullet WO 0000823 A [0102] [0190]
\bullet WO 0039585 A [0102] [0190]
\bullet WO 2003056012 A [0103]
\bullet WO 2003064621 A [0103]
\bullet US 5500362 A [0108]
\bullet US 5821337 A [0108] [0151]
\bullet WO 984547 A [0116]
\bullet US 4933294 A [0116]
\bullet WO 9105264 A [0116]
\bullet US 5401638 A [0116]
\bullet US 5545806 A [0145]
\bullet US 5569825 A [0145]
\bullet US 5591669 A [0145]
\bullet US 5545807 A [0145]
\bullet WO 9717852 A [0145]
\bullet US 5565332 A [0146]
\bullet US 5573905 A [0146]
\bullet US 5567610 A [0147]
\bullet US 5229275 A [0147]
\bullet US 5869046 A [0149]
\bullet WO 9316185 A [0149]
\bullet US 5571894 A [0149]
\bullet US 5587458 A [0149]
\bullet WO 9616673 A [0151]
\bullet US 5837234 A [0151]
\bullet WO 9802463 A [0151]
\bullet WO 9308829 A [0152]
\bullet WO 9404690 A [0154]
\bullet US 5731168 A [0155]
\bullet US 4676980 A [0156] [0161]
\bullet WO 9100360 A [0156] [0161]
\bullet WO 92200373 A [0156] [0161]
\bullet EP 03089 A [0156] [0161]
\bullet US 5739277 A [0163]
\bullet WO 9411026 A [0165] [0180]
\bullet US 3896111 A [0168]
\bullet US 4151042 A [0168]
\bullet US 4137230 A [0168]
\bullet US 4248870 A [0168]
\bullet US 4256746 A [0168]
\bullet US 4260608 A [0168]
\bullet US 4265814 A [0168]
\bullet US 4294757 A [0168]
\bullet US 4307016 A [0168]
\bullet US 4308268 A [0168]
\bullet US 4308269 A [0168]
\bullet US 4309428 A [0168]
\bullet US 4313946 A [0168]
\bullet US 4315929 A [0168]
\bullet US 4317821 A [0168]
\bullet US 4322348 A [0168]
\bullet US 4331598 A [0168]
\bullet US 4361650 A [0168]
\bullet US 4364866 A [0168]
\bullet US 4424219 A [0168]
\bullet US 4450254 A [0168]
\bullet US 4362663 A [0168]
\bullet US 4371533 A [0168]
\bullet US 5208020 A [0169] [0170] [0171] [0180]
\bullet US 5416064 A [0169]
\bullet EP 0425235 B1 [0169] [0171]
\bullet US 5712374 A [0174]
\bullet US 5714586 A [0174]
\bullet US 5739116 A [0174]
\bullet US 5767285 A [0174]
\bullet US 5770701 A [0174]
\bullet US 5770710 A [0174] [0175]
\bullet US 577300 A [0174]
\bullet US 15877296 B [0174]
\bullet US 5053394 A [0175]
\bullet US 5877296 A [0175]
\bullet WO 9321232 A [0176]
\bullet US 4485045 A [0183]
\bullet US 4544545 A [0183]
\bullet WO 9738731 A [0183]
\bullet US 5013556 A [0183]
\bullet WO 9534683 A [0187]
\bullet US 5627024 A [0187]
\bullet US 5766905 A [0187]
\bullet WO 9814277 A [0188]
\bullet WO 9820169 A [0188]
\bullet WO 9820159 A [0188]
\bullet WO 9820036 A [0188]
\bullet WO 9735196 A [0188]
\bullet WO 9746251 A [0188]
\bullet WO 9747314 A [0188]
\bullet WO 9709446 A [0188]
\bullet US 5498538 A [0188]
\bullet US 5432018 A [0188] [0189]
\bullet WO 9815833 A [0188]
\bullet US 5723286 A [0189]
\bullet US 5580717 A [0189]
\bullet US 5427908 A [0189]
\bullet US 5498530 A [0189]
\bullet US 5770434 A [0189]
\bullet US 5734018 A [0189]
\bullet US 5698426 A [0189]
\bullet US 5763192 A [0189]
\bullet US 5723323 A [0189]
\bullet WO 8101145 A [0195]
\bullet WO 8807378 A [0195]
\bullet US 4975278 A [0195]
\bullet US 5364934 A [0202]
\bullet WO 8705330 A [0218]
\bullet US 4640835 A [0220]
\bullet US 4496689 A [0220]
\bullet US 4301144 A [0220]
\bullet US 4670417 A [0220]
\bullet US 4791192 A [0220]
\bullet US 4179337 A [0220]
\bullet US 5428130 A [0223]
\bullet WO 8905859 A [0231]
\bullet US 4399216 A [0231]
\bullet DD 266710 [0232]
\bullet US 4946783 A [0232]
\bullet US 5648237 A, Carter [0233]
\bullet US 5789199 A, Joly [0233]
\bullet US 5840523 A, Simmons [0233]
\bullet EP 139383 A [0234]
\bullet US 4943529 A [0234]
\bullet EP 402226 A [0234]
\bullet EP 183070 A [0234]
\bullet EP 244234 A [0234]
\bullet EP 394538 A [0234]
\bullet WO 9100357 A [0234]
\bullet US 5010182 A [0239]
\bullet EP 362179 A [0239]
\bullet WO 9013646 A [0239]
\bullet EP 36776 A [0243]
\bullet EP 73657 A [0245]
\bullet GB 2211504 A [0246]
\bullet EP 117060 A [0249]
\bullet EP 117058 A [0249]
\bullet US 4767704 A [0250]
\bullet US 4657866 A [0250]
\bullet US 4927762 A [0250]
\bullet US 4560655 A [0250]
\bullet US 5122469 A [0250] [0341]
\bullet WO 9003430 A [0250]
\bullet WO 8700195 A [0250]
\bullet US RE30985 E [0250]
\bullet US 3773919 A [0261]
\bullet EP 0600517 A [0268]
\bullet EP 616812 A [0274]
\bullet WO 9607321 A [0277]
\bullet US 4892538 A [0278]
\bullet US 5283187 A [0278]
\bullet WO 9325673 A [0279]
\bullet US 0110482 W [0297]
\bullet EP 307247 A [0331]
Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción
\bulletBoring et al. CA Cancel J. Clin., 1993, vol. 43, 7 [0002]
\bulletShi Y. Trends in Genetics, 2003, vol. 19 (1), 9-12 [0005] [0387]
\bulletFire A. Trends in Genetics, 1999, vol. 391, 806-810 [0005] [0387]
\bulletKlussman et al. Bioconjugate Chemistry, 2004, vol. 15 (4), 765-773 [0009]
\bulletDoronina et al. Nature Biotechnology, 2003, vol. 21 (7), 778-784 [0009]
\bulletFrancisco et al. Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands. Blood, 2003, vol. 102 (4), 1458-1465 [0009]
\bulletMao et al. Cancer Research, 2004, vol. 64 (3), 781-788 [0009]
\bulletBhaskar et al. Cancer Res., 2003, vol. 63, 6387-6394 [0009]
\bulletMao et al. Cancer Res., 2004, vol. 64, 781-788 [0009]
\bulletSenter et al. Proceedings fo the American Association for Cancer Research, 28 March 2004, vol. 45 (623) [0009]
\bulletLaw et al. Proceedings of the American Association for Cancer Research, 28 March 2004, vol. 45 (625) [0009]
\bulletMannion et al. J. Biol. Chem., 1998, vol. 273, 33127-33129 [0011]
\bulletNielsen et al. Prot. Eng., 1997, vol. 10, 1-6 [0047]
\bulletHeinje et al. Nucl. Acids. Res., 1986, vol. 14, 4683-4690 [0047]
\bulletAusubel et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience Publishers [0061]
\bulletSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, 1989 [0063] [0314]
\bullet Basic and Clinical Immunology. Appleton & Lange, 1994, 71 [0083]
\bulletKabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. Public Health Service, National Institutes of Health, 1991 [0085] [0086] [0087]
\bulletChothia; Lesk. J. Mol. Biol., 1987, vol. 196, 901-917 [0086] [0087]
\bulletKohler et al. Nature, 1975, vol. 256, 495 [0090] [0129]
\bulletClackson et al. Nature, 1991, vol. 352, 624-628 [0090] [0138] [0146]
\bulletMarks et al. J. Mol. Biol., 1991, vol. 222, 581-597 [0090] [0138] [0146]
\bulletMorrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 6851-6855 [0091]
\bulletZapata et al. Protein Eng., 1995, vol. 8 (10), 1057-1062 [0093]
\bulletPluckthun. The Pharmacology of Monoclonal Antibodies. Springer-Verlag, 1994, vol. 113, 269-315 [0097]
\bulletHollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 6444-6448 [0098] [0159]
\bulletJones et al. Nature, 1986, vol. 321, 522-525 [0099] [0140] [0141]
\bulletRiechmann et al. Nature, 1988, vol. 332, 323-329 [0099] [0140]
\bulletPresta. Curr. Op. Struct. Biol., 1992, vol. 2, 593-596 [0099] [0140]
\bulletGeysen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1984, vol. 81, 3998-4002 [0101] [0185]
\bulletGeysen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1985, vol. 82, 178-182 [0101] [0185]
\bulletGeysen et al. Synthetic Peptides as Antigens, 1986, 130-149 [0101] [0185]
\bulletGeysen et al. J. Immunol. Meth., 1987, vol. 102, 259-274 [0101] [0185]
\bulletSchoofs et al. J. Immunol., 1988, vol. 140, 611-616 [0101] [0185]
\bulletCwirla, S. E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, vol. 87, 6378 [0101] [0185]
\bulletLowman, H. B. et al. Biochemistry, 1991, vol. 30, 10832 [0101] [0185] [0186]
\bulletClackson, T. et al. Nature, 1991, vol. 352, 624 [0101] [0185] [0186]
\bulletMarks, J. D. et al. J. Mol. Biol., 1991, vol. 222, 581 [0101] [0185] [0186]
\bulletKang, A. S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88, 8363 [0101] [0186]
\bulletSmith, G. P. Current Opin. Biotechnol., 1991, vol. 2, 668 [0101] [0185] [0186]
\bulletShi Y. Trends in Genetics, 2003, vol. 19 (1), 9-12 [0103]
\bulletRavetch; Kinet. Annu. Rev. Immunol., 1991, vol. 9, 457-92 [0108]
\bullet M. in Daëron. Annu. Rev. Immunol., 1997, vol. 15, 203-234 [0109]
\bulletKinet. Annu. Rev. Immunol., 1991, vol. 9, 457-492 [0109]
\bulletCapel et al. Immunomethods, 1994, vol. 4, 25-34 [0109]
\bullet de Haas et al. J. Lab. Clin. Med., 1995, vol. 126, 330-41 [0109]
\bulletGuyer et al. J. Immunol., 1976, vol. 117, 587 [0109]
\bulletKim et al. J. Immunol., 1994, vol. 24, 249 [0109]
\bulletGazzano-Santoro et al. J. Immunol. Methods, 1996, vol. 202, 163 [0111]
\bulletMoore et al. Cytotechnology, 1995, vol. 17, 1-11 [0115]
\bulletSias et al. J. Immunol. Methods, 1990, vol. 132, 73-80 [0116]
\bullet Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs. Murakami et al. The Molecular Basis of Cancer. WB Saunders, 1995, 13 [0122]
\bulletGoding. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Academic Press, 1986, 59-103 [0130] [0135]
\bulletKozbor. J. Immunol., 1984, vol. 133, 3001 [0132]
\bulletBrodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. Marcel Dekker, Inc, 1987, 51-63 [0132]
\bulletMunson et al. Anal. Biochem., 1980, vol. 107, 220 [0134]
\bulletSkerra et al. Curr. Opinion in Immunol., 1993, vol. 5, 256-262 [0137]
\bulletPlückthun. Immunol. Revs., 1992, vol. 130, 151-188 [0137]
\bulletMcCafferty et al. Nature, 1990, vol. 348, 552-554 [0138]
\bulletMarks et al. Bio/Technology, 1992, vol. 10, 779-783 [0138]
\bulletWaterhouse et al. Nuc. Acids. Res., 1993, vol. 21, 2265-2266 [0138]
\bulletMorrison et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 6851 [0139]
\bulletRiechmann et al. Nature, 1988, vol. 332, 323-327 [0141]
\bulletVerhoeyen et al. Science, 1988, vol. 239, 1534-1536 [0141]
\bulletSims et al. J. Immunol., 1993, vol. 151, 2296 [0142]
\bulletChothia et al. J. Mol. Biol., 1987, vol. 196, 901 [0142]
\bulletCarter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 4285 [0142]
\bulletPresta et al. J. Immunol., 1993, vol. 151, 2623 [0142]
\bulletJakobovits et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 2551 [0145]
\bulletJakobovits et al. Nature, 1993, vol. 362, 255-258 [0145]
\bulletBruggemann et al. Year in Immuno., 1993, vol. 7, 33 [0145]
\bulletMcCafferty et al. Nature, 1990, vol. 348, 552-553 [0146]
\bulletJohnson, Kevin S.; Chiswell, David J. Current Opinion in Structural Biology, 1993, vol. 3, 564-571
\bulletGriffith et al. EMBO J., 1993, vol. 12, 725-734 [0146]
\bulletMorimoto et al. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, vol. 24, 107-117 [0149]
\bulletBrennan et al. Science, 1985, vol. 229, 81 [0149] [0157]
\bulletCarter et al. Bio/Technology, 1992, vol. 10, 163-167 [0149] [0255]
\bulletAntibody Engineering [0149]
\bulletMillstein et al. Nature, 1983, vol. 305, 537-539 [0152]
\bulletTraunecker et al. EMBO J., 1991, vol. 10, 3655-3659 [0152]
\bulletSuresh et al. Methods in Enzymology, 1986, vol. 121, 210 [0154]
\bulletShalaby et al. J. Exp. Med., 1992, vol. 175, 217-225 [0158]
\bulletKostelny et al. J. Immunol., 1992, vol. 148 (5), 1547-1553 [0159]
\bulletGruber et al. J. Immunol., 1994, vol. 152, 5368 [0159]
\bulletTutt et al. J. Immunol., 1991, vol. 147, 60 [0160]
\bulletCaron et al. J. Exp Med., 1992, vol. 176, 1191-1195 [0163]
\bulletShopes, B. J. Immunol., 1992, vol. 148, 2918-2922 [0163]
\bulletWolff et al. Cancer Research, 1993, vol. 53, 2560-2565 [0163]
\bulletStevenson et al. Anti-Cancer Drug Design, 1989, vol. 3, 219-230 [0163]
\bulletVitetta et al. Science, 1987, vol. 238, 1098 [0165] [0180]
\bulletLiu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, vol. 93, 8618-8623 [0169]
\bulletChari et al. Cancer Research, 1992, vol. 52, 127-131 [0169] [0171] [0180]
\bulletCarlsson et al. Biochem. J., 1978, vol. 173, 723-737 [0172]
\bulletHinman et al. Cancer Research, 1993, vol. 53, 3336-3342 [0174]
\bulletLode et al. Cancer Research, 1998, vol. 58, 2925-2928 [0174]
\bulletFraker et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1978, vol. 80, 49-57 [0179]
\bulletEpstein et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 3688 [0183]
\bulletHwang et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4030 [0183]
\bulletMartin et al. J. Biol. Chem@., 1982, vol. 257, 286-288 [0184]
\bulletGabizon et al. J. National Cancer Inst., 1989, vol. 81 (19), 1484 [0184]
\bulletKang, A. S. et al. Proc.'Natl. Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88, 8363 [0185]
\bulletScott, J. K.; Smith, G. P. Science, 1990, vol. 249, 386 [0186]
\bulletCwirla, S. E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 87, 6378 [0186]
\bulletRen, Z-J. et al. Gene, 1998, vol. 215, 439 [0187]
\bulletZhu, Z. CAN, 1997, vol. 33, 534 [0187]
\bulletJiang, J. et al. can, 1997, vol. 128, 44380 [0187]
\bulletRen, Z-J. et al. CAN, 1997, vol. 127, 215644 [0187]
\bulletRen, Z-J. Protein Sci., 1996, vol. 5, 1833 [0187]
\bulletEfimov, V. P. et al. Virus Genes, 1995, vol. 10, 173 [0187]
\bulletSmith, G. P.; Scott, J. K. Methods in Enzymology, 1993, vol. 217, 228-257 [0187]
\bulletLi et al. Mol Biotech., 1998, vol. 9, 187 [0188]
\bullet Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 [0194]
\bulletMassey. Nature, 1987, vol. 328, 457-458 [0197]
\bulletNeuberger et al. Nature, 1984, vol. 312, 604-608 [0198]
\bulletCarter et al. Nucl. Acids Res., 1986, vol. 13, 4331 [0208]
\bulletZoller et al. Nucl. Acids Res., 1987, vol. 10, 6487 [0208]
\bulletWells et al. Gene, 1985, vol. 34, 315 [0208]
\bulletWells et al. Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 1986, vol. 317, 415 [0208]
\bulletCunningham; Wells. Science, 1989, vol. 244, 1081-1085 [0209]
\bulletCreighton. The Proteins. W.H. Freeman & Co, [0209]
\bulletChothia. J. Mol. Biol., 1976, vol. 150, 1 [0209]
\bullet T. E. Creighton. Proteins: Structure and Molecular Properties. W. H. Freeman & Co, 1983, 79-86 [0214]
\bulletAplin; Wriston. CRC Crit. Rev. Biochem., 1981, 259-306 [0218]
\bulletHakimuddin et al. Arch. Biochem. Biophys., 1987, vol. 259, 52 [0219]
\bulletEdge et al. Anal. Biochem., 1981, vol. 118, 131 [0219]
\bulletThotakura et al. Meth. Enzymol., 1987, vol. 138, 350 [0219]
\bulletRemington's Pharmaceutical Sciences. 1980 [0220] [0258] [0260]
\bulletField et al. Mol. Cell. Biol., 1988, vol. 8, 2159-2165 [0222]
\bulletEvan et al. Molecular and Cellular Biology, 1985, vol. 5, 3610-3616 [0222]
\bulletPaborsky et al. Protein Engineering, 1990, vol. 3 (6), 547-553 [0222]
\bulletHopp et al. Biotechnology, 1988, vol. 6, 1204-1210 [0222]
\bulletMartin et al. Science, 1992, vol. 255, 192-194 [0222]
\bulletSkinner et al. J. Biol. Chem., 1991, vol. 266, 15163-15166 [0222]
\bulletLutz-Freyermuth et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, vol. 87, 6393-6397 [0222]
\bulletStewart et al. Solid-Phase Peptide Synthesis. W.H. Freeman Co, 1969 [0224]
\bulletMerrifield. J. Am. Chem. Soc., 1963, vol. 85, 2149-2154 [0224]
\bulletSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0226]
\bulletDieffenbach et al. PCR Primer: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995 [0226]
\bullet Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach. IRL Press, 1991 [0230]
\bulletShaw et al. Gene, 1983, vol. 23, 315 [0231]
\bulletGraham; van der Eb. Virology, 1978, vol. 52, 456-457 [0231]
\bullet Van Solingen et al. J. Bact., 1977, vol. 130, 946 [0231]
\bulletHsiao et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1979, vol. 76, 3829 [0231]
\bulletKeown et al. Methods in Enzymology, 1990, vol. 185, 527-537 [0231]
\bulletMansour et al. Nature, 1988, vol. 336, 348-352 [0231]
\bulletBeach; Nurse. Nature, 1981, vol. 290, 140 [0234]
\bulletFleer et al. Bio/Technology, 1991, vol. 9, 968-975 [0234]
\bulletLouvencourt et al. J. Bacteriol., 1983, vol. 154 (2), 737-742 [0234]
\bullet Van den Berg et al. Bio/Technology, 1990, vol. 8, 135 [0234]
\bulletSreekrishna et al. J. Basic Microbiol., 1988, vol. 28, 265-278 [0234]
\bulletCase et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, vol. 76, 5259-5263 [0234]
\bulletBallance et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 112, 284-289 [0234]
\bulletTilburn et al. Gene, 1983, vol. 26, 205-221 [0234]
\bulletYelton et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 1470-1474 [0234]
\bulletKelly; Hynes. EMBO J., 1985, vol. 4, 475-479 [0234]
\bullet C. Anthony. The Biochemistry of Methylotrophs, 1982, 269 [0234]
\bulletGraham et al. J. Gen Virol., 1977, vol. 36, 59 [0236]
\bulletCHO, Urlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4216 [0236]
\bulletBiol. Reprod., 1980, vol. 23, 243-251 [0236]
\bulletMather et al. Annals N.Y. Acad. Sci., 1982, vol. 383, 44-68 [0236]
\bulletUrlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4216 [0242]
\bulletStinchcomb et al. Nature, 1979, vol. 282, 39 [0242]
\bulletKingsman et al. Gene, 1979, vol. 7, 141 [0242]
\bulletTschemper et al. Gene, 1980, vol. 10, 157 [0242]
\bulletJones. Genetics, 1977, vol. 85, 12 [0242]
\bulletChang et al. Nature, 1978, vol. 275, 615 [0243]
\bulletGoeddel et al. Nature, 1979, vol. 281, 544 [0243]
\bulletGoeddel. Nucleic Acids Res., 1980, vol. 8, 4057 [0243]
\bullet de Boer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, vol. 80, 21-25 [0243]
\bulletHitzeman et al. J. Biol. Chem., 1980, vol. 255, 2073 [0244]
\bulletHess et al. J. Adv. Enzyme Reg., 1968, vol. 7, 149 [0244]
\bulletHolland. Biochemistry, 1978, vol. 17, 4900 [0244]
\bulletGething et al. Nature, 1981, vol. 293, 620-625 [0249]
\bulletMantei et al. Nature, 1979, vol. 281, 40-46 [0249]
\bulletHam et al. Meth. Enz., 1979, vol. 58, 44 [0250]
\bulletBarnes et al. Anal. Biochem., 1980, vol. 102, 255 [0250]
\bulletThomas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 5201-5205 [0251]
\bulletDeutscher. Methods in Enzymology, 1990, vol. 182 [0254]
\bulletScopes. Protein Purification: Principles and Practice. Springer-Verlag, 1982 [0254]
\bulletLindmark et al. J. Immunol. Meth., 1983, vol. 62, 1-13 [0256]
\bulletGuss et al. EMBO J., 1986, vol. 5, 15671575 [0256]
\bullet Chemotherapy Service. Williams & Wilkins, 1992 [0273]
\bulletAnderson et al. Science, 1992, vol. 256, 808-813 [0279]
\bulletMarasco et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 7889-7893 [0291]
\bulletLu; Gillett. Cell Vision, 1994, vol. 1, 169-176 [0305]
\bulletAusubel et al. Current Protocols of Molecular Biology. John Wiley and Sons, 1997 [0314] [0339]
\bulletThimmappaya et al. Cell, 1982, vol. 31, 543 [0332]
\bulletSomparyrac et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1981, vol. 12, 7575 [0334]
\bulletLucas et al. Nucl. Acids Res., 1996, vol. 24 (9), 1774-1779 [0339]
\bulletO'Reilley et al. Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual. Oxford University Press, 1994 [0351]
\bulletRupert et al. Nature, 1993, vol. 362, 175-179 [0352]
\bulletAmarzguioui, M.; Prydz, H. Biochem Biophys Res Comm, 2004, vol. 316, 1050-1058 [0388]
\bulletElbashir et al. Nature, vol. 411, 494-498 [0390]
\bulletMendoza et al. Cancer Res., 2002, vol. 62, 5485-5488 [0395]

Claims (32)

1. Anticuerpo aislado producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste en 3B5.1 (ATCC Acceso No. PTA-6193), 12B9.1 (ATCC Acceso No. PTA-6194) y 12G12.1 (ATCC Acceso No. PTA-6195).
2. Anticuerpo según la reivindicación 1 que está conjugado a un agente inhibidor del crecimiento.
3. Anticuerpo según la reivindicación 1 que está conjugado a un agente citotóxico.
4. Anticuerpo según la reivindicación 3, en el que el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticos.
5. Anticuerpo según la reivindicación 4, en el que el agente citotóxico es una toxina.
6. Anticuerpo según la reivindicación 5, en el que la toxina se selecciona del grupo que consiste en auristatina, maitansinoide y caliqueamicina.
7. Anticuerpo según la reivindicación 5, en el que la toxina se selecciona del grupo que consiste en MMAE (monometil auristatina E), MMAF y AEVB (auristatin E valeril bencilhidrazona), y AFP (Auristatin F fenilendiamina).
8. Anticuerpo según la reivindicación 5, en el que la toxina está unida covalentemente al anticuerpo mediante un enlazador.
9. Anticuerpo según la reivindicación 8, en el que el enlazador se selecciona del grupo que consiste en maleimidocaproil (MC), valinacitrulina (val-cit, vc), citrulina (ácido 2-amino-5-ureido pentanoico), PAB (p-aminobencilcarbamoil), Me (N-metilvalina citrulina), MC(PEG)6-OH (maleimidocaproil-polietilenglicol), SPP (N-Succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoato), SMCC (N-Succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato), y MC-vc-PAB.
10. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en un método de inhibición del crecimiento de una célula que expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (TAT188), comprendiendo el método poner en contacto la célula con dicho anticuerpo.
11. Anticuerpo según la reivindicación 10, en el que la célula es una célula cancerosa.
12. Anticuerpo según la reivindicación 11, en el que la célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste en mama, colon, recto, endometrio, rincón, pulmón, ovario, piel e hígado.
13. Anticuerpo según la reivindicación 12, en el que la célula cancerosa es una célula de mamífero.
14. Anticuerpo según la reivindicaicón 13, en el que la célula de mamífero es una célula humana.
15. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en un método de tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo celular asociado con el aumento de la expresión o actividad de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto con necesidad de dicho tratamiento una cantidad eficaz del anticuerpo.
16. Anticuerpo según la reivindicación 15, en el que el trastorno proliferativo celular es el cáncer.
17. Anticuerpo según la reivindicación 16, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en mama, colon, recto, endometrio, riñón, pulmón, ovario, piel e hígado.
18. Utilización de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en la fabricación de un medicamento para su utilización en un método de inhibición del crecimiento de una célula cancerosa que expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (TAT188), comprendiendo el método poner en contacto dicha célula cancerosa con dicho anticuerpo.
19. Utilización de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en la fabricación de un medicamento para su utilización en un método para tratar o prevenir un trastorno proliferativo celular asociado con un aumento de la expresión o actividad de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto con necesidad de dicho tratamiento una cantidad eficaz del anticuerpo.
20. Método de detección del nivel de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (TAT188) expresada en una célula de análisis en relación a una célula de control, comprendiendo el método:
(a)
poner en contacto la célula de análisis y la célula de control con un anticuerpo anti-TAT188 aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14;
(b)
detectar la unión del anticuerpo; y
(c)
determinar la unión relativa del anticuerpo a la célula de análisis y la célula de control.
21. Método según la reivindicación 20, en el que se lisan la célula de análisis y la célula de control.
22. Método según la reivindicación 20, en el que la célula de análisis está en un tejido.
23. Método según la reivindicación 22, en el que el tejido es un tejido tumoral.
24. Método según la reivindicación 23, en el que el tejido tumoral se selecciona del grupo que consiste en mama, colon, recto, endometrio, riñón, pulmón, ovario, piel e hígado.
25. Método de detección del nivel de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (TAT188) o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 en una célula de análisis en relación a una célula de control, comprendiendo el método:
(a)
poner en contacto la célula de análisis y la célula de control con un anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9;
(b)
detectar la unión del anticuerpo; y
(c)
determinar la unión relativa del anticuerpo a la célula de análisis y la célula de control.
26. Método según la reivindicación 25, en el que el nivel del polipéptido en la célula de análisis es superior que en la célula de control.
27. Método según la reivindicación 26, en el que el método diagnostica el cáncer en un tejido que contiene o que ha contenido la célula de análisis.
28. Método según la reivindicación 25, en el que la detección del nivel de expresión del polipéptido comprende utilizar un anticuerpo en un análisis por inmunohistoquímica.
29. Composición de materia que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, combinada con un portador.
30. Composición de materia según la reivindicación 29, en la que dicho portador es un portador farmacéuticamente aceptable.
31. Artículo de fabricación que comprende:
(a)
un recipiente; y
(b)
la composición de materia según la reivindicación 29 o la reivindicación 30 contenida en dicho recipiente.
32. Artículo de fabricación según la reivindicación 31, que comprende además una etiqueta fijada a dicho recipiente o un prospecto incluido con dicho recipiente, que se refiere a la utilización de dicha composición de materia para el tratamiento terapéutico o la detección para diagnóstico de un cáncer.
ES05795139T 2004-09-08 2005-09-07 Composiciones y metodos para el diagnostico y el tratamiento de un tumor. Active ES2342477T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US936626 1997-09-24
US10/936,626 US7803915B2 (en) 2001-06-20 2004-09-08 Antibody compositions for the diagnosis and treatment of tumor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2342477T3 true ES2342477T3 (es) 2010-07-07

Family

ID=36036964

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES05795139T Active ES2342477T3 (es) 2004-09-08 2005-09-07 Composiciones y metodos para el diagnostico y el tratamiento de un tumor.

Country Status (19)

Country Link
US (3) US7803915B2 (es)
EP (1) EP1786838B1 (es)
JP (1) JP2008512121A (es)
KR (1) KR20070100235A (es)
CN (1) CN101263159A (es)
AT (1) ATE464323T1 (es)
AU (1) AU2005282496A1 (es)
BR (1) BRPI0515616A (es)
CA (1) CA2579102A1 (es)
CO (1) CO6160304A2 (es)
DE (1) DE602005020645D1 (es)
ES (1) ES2342477T3 (es)
IL (1) IL181629A0 (es)
MX (1) MX2007002857A (es)
NO (1) NO20071791L (es)
NZ (1) NZ553565A (es)
RU (1) RU2007112932A (es)
WO (1) WO2006029183A2 (es)
ZA (1) ZA200702322B (es)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2163256B1 (en) 2001-05-11 2015-09-02 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Specific binding proteins and uses thereof
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
HUE027549T2 (hu) * 2002-07-31 2016-10-28 Seattle Genetics Inc Hatóanyagot tartalmazó konjugátumok és alkalmazásuk rák, autoimmun betegség vagy fertõzéses betegség kezelésére
US20050026224A1 (en) * 2003-04-28 2005-02-03 Follettie Maximillian T. Methods and compositions for modulating G-protein coupled receptor 54
DK2489364T3 (en) 2003-11-06 2015-03-02 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds conjugated to antibodies
US7399469B2 (en) * 2004-03-26 2008-07-15 Pdl Biopharma, Inc. Anti-LFL2 antibodies for the diagnosis, prognosis and treatment of cancer
AU2005249490B2 (en) 2004-06-01 2010-07-29 Genentech, Inc. Antibody drug conjugates and methods
US8288352B2 (en) * 2004-11-12 2012-10-16 Seattle Genetics, Inc. Auristatins having an aminobenzoic acid unit at the N terminus
CA2605507C (en) 2005-04-19 2016-06-28 Seattle Genetics, Inc. Humanized anti-cd70 binding agents and uses thereof
CN101948541B (zh) * 2005-06-20 2014-08-06 健泰科生物技术公司 用于肿瘤诊断和治疗的组合物和方法
USRE47223E1 (en) * 2005-06-20 2019-02-05 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
AU2006269422B2 (en) 2005-07-07 2012-12-06 Seagen Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain modifications at the C-terminus
US8871720B2 (en) 2005-07-07 2014-10-28 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the C-terminus
EP1928912A4 (en) * 2005-09-07 2010-02-24 Medimmune Inc EPH ANTI-RECEPTOR ANTIBODIES CONJUGATED TO TOXINS
US20110060647A1 (en) * 2005-10-31 2011-03-10 Troy David Weaver Computer implemented method for marketing business serves
US7750116B1 (en) * 2006-02-18 2010-07-06 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugate metabolites
JP2009528820A (ja) 2006-02-22 2009-08-13 フィロジェン・エッセペア 血管腫瘍マーカー
CN101711284A (zh) 2007-01-25 2010-05-19 达娜-法勃肿瘤研究所 抗egfr抗体在治疗egfr突变体介导的疾病中的用途
CN101688229B (zh) 2007-03-15 2013-06-12 路德维格癌症研究所 包含egfr抗体和src抑制剂的组合物及其在制备用于治疗哺乳动物癌症的药物中的用途
US7723485B2 (en) 2007-05-08 2010-05-25 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-MUC16 antibodies and antibody drug conjugates
EP1992694A1 (en) * 2007-05-16 2008-11-19 Gene Signal International Sa Anti-tumor drug, medicament, composition, and use thereof
ES2674710T3 (es) * 2007-05-16 2018-07-03 Gene Signal International Sa Fármaco, medicamento, composición antitumoral y uso de los mismos
US20090011060A1 (en) * 2007-07-06 2009-01-08 Peter Koepke Campsiandra angustifolia extract and methods of extracting and using such extract
EP2474557B1 (en) 2007-07-16 2014-08-20 Genentech, Inc. Anti-CD79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
PE20140625A1 (es) 2007-07-16 2014-05-29 Genentech Inc ANTICUERPOS ANTI-CD79b E INMUNOCONJUGADOS HUMANIZADOS
CN108424454B (zh) 2007-08-14 2022-05-31 路德维格癌症研究所有限公司 靶向egf受体的单克隆抗体175及其衍生物和用途
US7879369B2 (en) 2007-09-18 2011-02-01 Selvamedica, Llc Combretum laurifolium Mart. extract and methods of extracting and using such extract
RU2553566C2 (ru) 2008-01-31 2015-06-20 Дженентек, Инк. АНТИ-CD79b АНТИТЕЛА И ИММУНОКОНЪЮГАТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
KR20100131003A (ko) * 2008-03-31 2010-12-14 제넨테크, 인크. 천식을 치료 및 진단하기 위한 조성물 및 방법
PL2282773T3 (pl) 2008-05-02 2014-08-29 Seattle Genetics Inc Sposoby i kompozycje do wytwarzania przeciwciał i pochodnych przeciwciał o obniżonej fukozylacji rdzeniowej
RU2523419C2 (ru) 2008-07-15 2014-07-20 Дженетек, Инк. Конъюгаты производного антрациклина, способы их получения и их применение в качестве противоопухолевых соединений
WO2010096394A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Redwood Biosciences, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
WO2010120554A1 (en) 2009-04-01 2010-10-21 The Regents Of The University Of California Detecting and treating breast cancer resistance to egfr inhibitors
CA2809819A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
NZ599707A (en) * 2009-11-30 2014-07-25 Genentech Inc Antibodies for treating and diagnosing tumors expressing slc34a2 (tat211 = seqid2 )
EP3842074A1 (en) * 2010-09-29 2021-06-30 Philogen S.p.A. Protein-drug conjugates
CN112168962A (zh) 2010-12-16 2021-01-05 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 与th2抑制相关的诊断和治疗
KR20140014116A (ko) 2010-12-20 2014-02-05 제넨테크, 인크. 항-메소텔린 항체 및 면역접합체
KR20140016262A (ko) 2011-01-14 2014-02-07 레드우드 바이오사이언스 인코포레이티드 알데하이드-태깅된 면역글로불린 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법
US10260089B2 (en) 2012-10-29 2019-04-16 The Research Foundation Of The State University Of New York Compositions and methods for recognition of RNA using triple helical peptide nucleic acids
US9353150B2 (en) 2012-12-04 2016-05-31 Massachusetts Institute Of Technology Substituted pyrazino[1′,2′:1 ,5]pyrrolo[2,3-b]-indole-1,4-diones for cancer treatment
GB201319446D0 (en) * 2013-11-04 2013-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors
MX2016007865A (es) 2013-12-17 2017-01-11 Novartis Ag Peptidos citotoxicos y conjugados de los mismos.
CN106573956A (zh) 2014-06-13 2017-04-19 诺华股份有限公司 澳瑞他汀衍生物及其缀合物
WO2016049214A1 (en) 2014-09-23 2016-03-31 Genentech, Inc. METHOD OF USING ANTI-CD79b IMMUNOCONJUGATES
GB201505585D0 (en) 2015-03-31 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapy against renal cell carinoma (RCC) and other cancers
PT3290051T (pt) 2015-04-30 2020-01-07 Toray Industries Composição farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção de cancro
US11208632B2 (en) 2016-04-26 2021-12-28 R.P. Scherer Technologies, Llc Antibody conjugates and methods of making and using the same
US10918627B2 (en) 2016-05-11 2021-02-16 Massachusetts Institute Of Technology Convergent and enantioselective total synthesis of Communesin analogs
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11932650B2 (en) 2017-05-11 2024-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
US12017973B2 (en) 2018-06-22 2024-06-25 Basf Se Amino acid based surfactants as formulants for biocides
WO2020247054A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof
TW202138388A (zh) 2019-12-30 2021-10-16 美商西根公司 以非海藻糖苷化抗－ｃｄ７０抗體治療癌症之方法
WO2022182415A1 (en) 2021-02-24 2022-09-01 Massachusetts Institute Of Technology Himastatin derivatives, and processes of preparation thereof, and uses thereof
CN115094131B (zh) * 2022-06-15 2023-05-23 中山大学附属第一医院 一种用于炎症性肠病的诊断标志物及其应用

Family Cites Families (205)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4137230A (en) * 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) * 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) * 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) * 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS5566585A (en) * 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) * 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) * 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) * 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) * 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) * 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) * 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) * 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) * 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4484908A (en) 1981-04-21 1984-11-27 Bioresearch Inc. Method for relieving excess negativity in a drainage device
JPS57192389A (en) * 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4426330A (en) * 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4534899A (en) 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) * 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
EP0138854B1 (en) 1983-03-08 1992-11-04 Chiron Mimotopes Pty. Ltd. Antigenically active amino acid sequences
US4824941A (en) * 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4587044A (en) * 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) * 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) * 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) * 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5405938A (en) * 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) * 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
NZ215865A (en) 1985-04-22 1988-10-28 Commw Serum Lab Commission Method of determining the active site of a receptor-binding analogue
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
GB2183238A (en) * 1985-11-11 1987-06-03 Ceskoslovenska Akademie Ved Silane reagents containing a complexon grouping and inorganic materials modified with these reagents
JPS62138190A (ja) * 1985-12-12 1987-06-20 Takara Shuzo Co Ltd 新規制限酵素及びその製造法
US5317098A (en) * 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
DE3788914T2 (de) * 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
US4904852A (en) * 1986-12-12 1990-02-27 Omron Tateisi Electronics Co. IC card reader
AU625169B2 (en) 1987-03-23 1992-07-02 Imperial Chemical Industries Plc Molecular markers
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
WO1988010264A1 (en) 1987-06-24 1988-12-29 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5525465A (en) * 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
DE3738460A1 (de) * 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
ATE151467T1 (de) * 1987-11-30 1997-04-15 Univ Iowa Res Found Durch modifikationen an der 3'-terminalen phosphodiesterbindung stabilisierte dna moleküle, ihre verwendung als nukleinsäuresonden sowie als therapeutische mittel zur hemmung der expression spezifischer zielgene
US5403711A (en) * 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
US5082830A (en) * 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
US5266684A (en) * 1988-05-02 1993-11-30 The Reagents Of The University Of California Peptide mixtures
US5109124A (en) * 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) * 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5571689A (en) 1988-06-16 1996-11-05 Washington University Method of N-acylating peptide and proteins with diheteroatom substituted analogs of myristic acid
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5663143A (en) 1988-09-02 1997-09-02 Dyax Corp. Engineered human-derived kunitz domains that inhibit human neutrophil elastase
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) * 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) * 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5108921A (en) * 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US4958013A (en) * 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5227170A (en) 1989-06-22 1993-07-13 Vestar, Inc. Encapsulation process
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) * 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5013556A (en) * 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US5527528A (en) 1989-10-20 1996-06-18 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Solid-tumor treatment method
EP0942000B1 (en) 1989-10-24 2004-06-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-Modified oligonucleotides
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5208020A (en) * 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5292873A (en) * 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5469854A (en) 1989-12-22 1995-11-28 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods of preparing gas-filled liposomes
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
US5486603A (en) * 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5587470A (en) * 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5220007A (en) * 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
AU7579991A (en) * 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5427908A (en) * 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
ES2116977T3 (es) * 1990-05-11 1998-08-01 Microprobe Corp Soportes solidos para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y metodos para inmovilizar oligonucleotidos de modo covalente.
US5723286A (en) * 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
US5218105A (en) * 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5489677A (en) * 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5623070A (en) * 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5608046A (en) * 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5610289A (en) * 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5602240A (en) * 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5614617A (en) * 1990-07-27 1997-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5618704A (en) * 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5512667A (en) * 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) * 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
WO1992005186A1 (en) * 1990-09-20 1992-04-02 Gilead Sciences Modified internucleoside linkages
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
US5770434A (en) 1990-09-28 1998-06-23 Ixsys Incorporated Soluble peptides having constrained, secondary conformation in solution and method of making same
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
CA2095212A1 (en) * 1990-11-08 1992-05-09 Sudhir Agrawal Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
DE69130831T2 (de) 1990-11-21 1999-09-16 Iterex Pharmaceuticals Ltd. Partnership, San Diego Synthese äquimolarer mischungen vielzähliger oligomere, speziell oligopeptidmischungen
DE69129154T2 (de) * 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5206161A (en) 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
JP3220180B2 (ja) 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
US5719262A (en) * 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) * 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5521291A (en) * 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5270170A (en) * 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
ES2103918T3 (es) * 1991-10-17 1997-10-01 Ciba Geigy Ag Nucleosidos biciclicos, oligonucleotidos, procedimiento para su obtencion y productos intermedios.
US5594121A (en) * 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5484908A (en) * 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
JP3739785B2 (ja) 1991-11-26 2006-01-25 アイシス ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド 修飾されたピリミジンを含有するオリゴマーを使用する増強された三重らせんおよび二重らせんの成形
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
US5633360A (en) * 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5391726A (en) * 1992-04-30 1995-02-21 The Dow Chemical Company Preparation of giant ring compounds
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) * 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5583020A (en) 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
US5395619A (en) * 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
DK0691968T3 (da) 1993-03-30 1998-02-23 Sanofi Sa Acykliske nukleosid-analoge og oligonukleotidsekvenser indeholdende disse
AU6412794A (en) 1993-03-31 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US5462854A (en) 1993-04-19 1995-10-31 Beckman Instruments, Inc. Inverse linkage oligonucleotides for chemical and enzymatic processes
US5534259A (en) 1993-07-08 1996-07-09 Liposome Technology, Inc. Polymer compound and coated particle composition
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US5417978A (en) * 1993-07-29 1995-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
AU689131B2 (en) 1993-10-01 1998-03-26 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Novel peptide derivative
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
PT733059E (pt) 1993-12-09 2001-03-30 Univ Jefferson Compostos e metodos para mutacoes dirigidas ao local em celulas eucarioticas
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5595756A (en) * 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5519134A (en) * 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) * 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) * 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5773001A (en) * 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597696A (en) * 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5597909A (en) * 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5591721A (en) * 1994-10-25 1997-01-07 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
US5512295A (en) * 1994-11-10 1996-04-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery
US5792747A (en) 1995-01-24 1998-08-11 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Highly potent agonists of growth hormone releasing hormone
US5714586A (en) * 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) * 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
US6319688B1 (en) 1997-04-28 2001-11-20 Smithkline Beecham Corporation Polynucleotide encoding human sodium dependent phosphate transporter (IPT-1)
JP4689781B2 (ja) * 1998-09-03 2011-05-25 独立行政法人科学技術振興機構 アミノ酸輸送蛋白及びその遺伝子
US20030108544A1 (en) * 1999-09-01 2003-06-12 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US6333410B1 (en) * 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US20040018194A1 (en) * 2000-11-28 2004-01-29 Francisco Joseph A. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
AU2002310256A1 (en) * 2001-06-05 2002-12-16 Exelixis Inc. Ppp2cs as modifiers of the p53 pathway and methods of use
CA2633413C (en) 2001-06-20 2012-08-21 Genentech, Inc. Antibodies against tumor-associated antigenic target (tat) polypeptides
US20050107595A1 (en) 2001-06-20 2005-05-19 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20050180972A1 (en) 2002-07-31 2005-08-18 Wahl Alan F. Anti-CD20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
JP2006515167A (ja) * 2002-10-25 2006-05-25 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫関連疾患の治療のための新規組成物と方法
AU2005249490B2 (en) * 2004-06-01 2010-07-29 Genentech, Inc. Antibody drug conjugates and methods

Also Published As

Publication number Publication date
IL181629A0 (en) 2007-07-04
RU2007112932A (ru) 2008-10-20
CA2579102A1 (en) 2006-03-16
WO2006029183A3 (en) 2006-11-16
JP2008512121A (ja) 2008-04-24
US20100303834A1 (en) 2010-12-02
EP1786838A2 (en) 2007-05-23
WO2006029183A2 (en) 2006-03-16
EP1786838B1 (en) 2010-04-14
ZA200702322B (en) 2009-11-25
BRPI0515616A (pt) 2008-07-15
CO6160304A2 (es) 2010-05-20
CN101263159A (zh) 2008-09-10
MX2007002857A (es) 2007-09-07
KR20070100235A (ko) 2007-10-10
US7749504B2 (en) 2010-07-06
DE602005020645D1 (de) 2010-05-27
US7803915B2 (en) 2010-09-28
AU2005282496A1 (en) 2006-03-16
US20050106644A1 (en) 2005-05-19
ATE464323T1 (de) 2010-04-15
US20080124331A1 (en) 2008-05-29
NO20071791L (no) 2007-06-08
NZ553565A (en) 2010-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2342477T3 (es) Composiciones y metodos para el diagnostico y el tratamiento de un tumor.
ES2372321T3 (es) Composiciones y métodos para el diagnóstico y tratamiento de un tumor de pulmón.
ES2431929T3 (es) Composiciones y procedimientos para el diagnóstico y el tratamiento de tumores
JP4822710B2 (ja) 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
ES2373080T3 (es) Anticuerpos que se unen al antígeno tat10772 asociado a tumores para el diagnóstico y tratamiento de un tumor.
ES2309012T3 (es) Composiciones del anticuerpo anti-psca y a sus procedimientos contra celulas cancerigenas que expresen psca.
JP5587841B2 (ja) 造血系起源の腫瘍の治療のための組成物と方法
JP4703567B2 (ja) 膠細胞起源の腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
US20050107595A1 (en) Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
JP2005536190A (ja) 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
JP2006510735A (ja) 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
JP2008137989A (ja) 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
JP2004520806A (ja) 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
JP2006500009A (ja) 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
JP2016104752A (ja) 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
JP2015523852A (ja) 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
JP2013511993A5 (es)
ES2359055T3 (es) Composiciones y métodos para el diagnóstico y el tratamiento de tumores.
JP2008500949A (ja) 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
JP2004520810A (ja) 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
JP2007077155A (ja) 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
JP2013533732A (ja) 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
JP2007512019A (ja) 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
JP2006516655A (ja) 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
KR100607610B1 (ko) 종양의 진단 및 치료를 위한 방법 및 이를 위한 조성물