ES2674710T3 - Fármaco, medicamento, composición antitumoral y uso de los mismos - Google Patents

Fármaco, medicamento, composición antitumoral y uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:3, en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica para el polipéptido de la SEQ ID NO:4 que tiene actividad antiangiogénica y antitumoral.

Description

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DESCRIPCION
Fármaco, medicamento, composición antitumoral y uso de los mismos
La presente invención se refiere al campo de los tratamientos para cánceres. Más específicamente, la presente invención se refiere al tratamiento de cánceres mediante polipéptidos pequeños.
El cáncer es una clase de enfermedades o trastornos caracterizados por división descontrolada de células y la capacidad de estas células para diseminarse, ya sea por crecimiento directo en tejido adyacente a través de invasión, o por implantación en sitios distantes por metástasis (donde se transportan células cancerosas a través del torrente sanguíneo o del sistema linfático). El cáncer puede afectar a personas de todas las edades, pero el riesgo tiende a aumentar con la edad. Es una de las principales causas de muerte en los países desarrollados.
Hay muchos tipos de cáncer. La gravedad de los síntomas depende del sitio y el carácter de la malignidad y de si hay metástasis. Una vez diagnosticado, el cáncer generalmente se trata con una combinación de cirugía, quimioterapia y radioterapia. A medida que se desarrolla la investigación, los tratamientos se vuelven más específicos para el tipo de patología del cáncer. Ya existen fármacos para cánceres específicos diana para varios cánceres. Si no se trata, los cánceres pueden causar enfermedad y muerte, aunque este no es siempre el caso.
Los tratamientos actuales se dirigen a propiedades distintas de células malignas, tales como por ejemplo evadir la apoptosis, potencial de crecimiento ilimitado (inmortalización) debido a la superabundancia de la telomerasa, autosuficiencia de factores de crecimiento, insensibilidad a factores anticrecimiento, aumento de la tasa de división celular, capacidad alterada para diferenciar, sin capacidad de inhibición de contacto, capacidad de invadir tejidos vecinos, capacidad para construir metástasis en sitios distantes, capacidad para promover el crecimiento de vasos sanguíneos (angiogénesis).
La angiogénesis tumoral es la proliferación de una red de vasos sanguíneos que penetra en el tumor, suministra nutrientes y oxígeno y elimina productos de desecho. La angiogénesis tumoral en realidad comienza con células tumorales cancerosas que liberan moléculas que envían señales al tejido huésped normal circundante. Esta señalización activa ciertos genes en el tejido del huésped que, a su vez, producen proteínas para estimular el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Los tumores sólidos deben estimular la formación de nuevos vasos sanguíneos a fin de obtener los nutrientes y el oxígeno necesarios para su crecimiento, proporcionando de este modo una ruta por la cual los tumores pueden hacer metástasis a sitios distantes.
La evidencia experimental ha sugerido que los tumores malignos pueden inducir angiogénesis mediante la elaboración de una variedad de factores, tales como el factor de crecimiento de fibroblastos ácido (aFGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), derivado de plaquetas factor de crecimiento (PDGF), factor de crecimiento alfa transformante (TGF-alfa), factor de crecimiento de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) y muchos otros (Liotta et al., 1991, Cell 64:327-336; Hanahan et al., Cell 86:353-364).
Hoy en día, muchas moléculas quimioterapéuticas que se dirigen a la angiogénesis están disponibles en el mercado. Los inhibidores de angiogénesis naturales bien conocidos son angiostatina, endostatina, interferones, factor plaquetario 4, fragmento de prolactina 16Kd, trombospondina, TIMP-1 (inhibidor tisular de metaloproteasa-1), TIMP-2 y TIMP-3. Estas moléculas se pueden usar como tratamientos quimioterapéuticos, así como otros fármacos tales como, por ejemplo, combrestatin A4, EMD 121974, TNP-470, escualamina, talidomida, interferón-alfa, anti-VEGF, anticuerpos. Sin embargo, su eficacia nunca es tratamientos suficientes y alternativos son deseables.
Por lo tanto, existe la necesidad de agentes quimioterapéuticos alternativos para el tratamiento de tumores que tengan una eficacia aumentada, que sean menos invasivos o tóxicos, y que den como resultado una velocidad de recuperación aumentada.
El documento WO03/080105, en nombre del solicitante, describe cinco genes implicados en la regulación de la angiogénesis. Entre estos genes, el "gen 168" (SEQ ID NO: 1 en esta especificación), codificante de la "proteína 168A" (SEQ ID NO: 2 en esta especificación), se ha descrito como implícito en la activación de la angiogénesis. En particular, el documento WO03/080105 describe que la proteína 168A se expresa en células endoteliales estimuladas con factores proangiogénicos, tales como, por ejemplo, TNF-a. El documento WO03/080105 también describe que la expresión, en células endoteliales humanas, de una secuencia antisentido del gen 168, esto es, la inhibición de la expresión del gen 168, inhibe la formación de tubos capilares.
Los experimentos in silico revelaron además que la proteína 168A, que está constituida por 924 aminoácidos, puede tener un solo dominio transmembrana y cinco dominios similares a la inmunoglobulina.
Profundizando en sus investigaciones, los inventores produjeron formas truncadas de proteína 168A, que corresponden a diversos fragmentos de proteína 168A. Entre estos fragmentos, 168A-T2 corresponde a un fragmento del dominio extracelular de la proteína 168A, y se identifica mediante la SEQ ID NO:4 en esta especificación (108 aminoácidos).
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En un primer experimento, los inventores encontraron que la proteína 168A-T2 puede inhibir la proliferación de células endoteliales humanas in vitro de una manera dependiente de la dosis.
Luego, en un segundo experimento, los inventores encontraron sorprendentemente que 168A-T2 puede tener una fuerte actividad para inhibir la formación de tubos capilares in vitro, de una manera dependiente de la dosis.
Otros experimentos realizados por los inventores sugirieron que 168A-T2 puede inducir la inhibición de la migración de células endoteliales in vitro, de una manera dependiente de la dosis.
Los resultados del estudio de dosis-respuesta revelaron además que la proteína 168A-T2 puede inhibir de manera dependiente de la dosis la proliferación de células endoteliales humanas, y esta inhibición podría alcanzar más del 80% con una concentración de 3.1 |iM. Esto tiende a demostrar que la proteína recombinante puede ser un compuesto anti- angiogénico potente, al menos 600 veces más potente que los péptidos identificados basados en mAb anti-VEGF y/o receptor de VEGF (KDR) (Binetruy-Tournaire R et al., Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis, EMBO J. 2000; 19: 1525-1533).
La formación de tubo capilar, la proliferación de células endoteliales humanas y la migración de células endoteliales humanas son tres etapas esenciales de la angiogénesis. En consecuencia, el hecho de que 168A-T2 pueda inhibir la formación de tubos capilares in vitro, la proliferación y/o migración de células endoteliales humanas de una manera dependiente de la dosis, de este modo constituía una fuerte evidencia de la potente actividad antiangiogénica de las formas truncadas de la proteína 168A.
Todos estos resultados fueron absolutamente inesperados ya que la proteína 168A nativa se expresa preferiblemente en condiciones proangiogénicas, esto es, en presencia de TNFa, y que la expresión de un antisentido del gen 168, esto es, la inhibición del gen 168, en células endoteliales humanas inhibe la formación de tubos capilares. Por lo tanto, fue realmente sorprendente que una forma truncada de proteína 168A, pueda tener actividad antiangiogénica.
Aun sorprendentemente, los inventores encontraron que la proteína 168A-T2 tenía una fuerte actividad antitumoral in vivo, y una fuerte actividad sinérgica en combinación con otro agente quimioterapéutico tal como, por ejemplo, cisplatino.
Los inventores encontraron que la sustancia de prueba 168A-T2 no era tóxica en ratones desnudos portadores de tumores a diferentes dosis ensayadas. Además, 168A-T2 exhibió una fuerte actividad antitumoral estadísticamente significativa contra tumores humanos tan pronto como dos días después del comienzo del tratamiento. Esta actividad antitumoral fue persistente durante el período de tratamiento. Este efecto antitumoral de 168A-T2 representa un enfoque terapéutico realista como monoterapia. Su eficacia también se potenciaba fuertemente cuando se combinaba con el fármaco citotóxico anticanceroso CDDP (cisplatino), que suprimía el crecimiento tumoral. El cisplatino solo, por otro lado, no erradicó el crecimiento tumoral.
Los datos sugieren fuertemente que 168A-T2 puede ser de utilidad como agente antitumoral primario o como una terapia sinérgica de complemento a agentes citotóxicos primarios para el tratamiento de cánceres.
Como se menciona anteriormente, ahora se establece que la proteína 168A se expresa en células endoteliales, y que su expresión aumenta cuando la angiogénesis es estimulada por factores proangiogénicos tales como TNFa, como se describe en el documento WO03/080105. La proteína 168A es una proteína transmembrana, y podría estar implicada en la transducción de una señal proangiogénica. Sin querer limitarse a una teoría, los solicitantes sugieren que las formas truncadas de 168A pueden desempeñar su papel a través de un "mecanismo receptor soluble": las formas truncadas de 168A pueden permanecer solubles en la superficie de la célula y pueden ser reconocidas por el ligando de la proteína 168A nativa. Como resultado, puede haber una competencia en el reconocimiento del ligando entre las formas solubles de 168A (los fragmentos de la invención) y la proteína transmembrana nativa, y en consecuencia una disminución, de una manera dependiente de la dosis, de la transducción de la señal proangiogénica, lo que resulta en la inhibición de la angiogénesis y luego en la disminución del volumen del tumor.
La invención se refiere de este modo, en un primer aspecto, a un ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:3, dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido o péptido que tiene actividad antiangiogénica y antitumoral.
La SEQ ID NO: 21 corresponde a la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 87 descrita en WO02/081731.
La SEQ ID NO: 23 corresponde a la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 28 descrita en WO03/080105.
En otro aspecto, la invención se refiere a un vector de expresión que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico como se definió anteriormente.
Como se usa en este documento, "vector de expresión" significa cualquier construcción de plásmido o de ácido nucleico, que se usa para introducir y expresar una secuencia de ácido nucleico específica en una célula diana.
La invención se refiere adicionalmente, en un tercer aspecto, a un polipéptido activo que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:4.
La SEQ ID NO: 22 corresponde a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 87 descrita en WO02/081731.
Como se usa en este documento, "péptido" significa moléculas cortas formadas a partir del enlace, en un orden definido, 5 de menos de 100 aminoácidos.
Como se usa en este documento, "polipéptido" significa moléculas formadas a partir del enlace, en un orden definido, de al menos 100 aminoácidos.
Como se usa en este documento, "polipéptido activo" significa polipéptidos que tienen una actividad biológica. En la presente invención, los polipéptidos tienen una actividad antiangiogénica y antitumoral.
10 Según la invención, el polipéptido como se describió anteriormente tiene una actividad antitumoral.
En una realización particular, el polipéptido activo según la invención se produce mediante el vector de expresión como se definió anteriormente.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un medicamento que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico, vector o polipéptido como se describió anteriormente.
15 En un quinto aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico, vector o polipéptido como se describió anteriormente, y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
En un sexto aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico, vector o polipéptido como se describió anteriormente, y uno o más excipientes farmacéuticamente 20 aceptables, para uso en un método de tratamiento de cáncer y/o tumores del cuerpo humano o animal.
En una realización particular, las composiciones farmacéuticas como se describió anteriormente comprenden además al menos otra sustancia activa seleccionada de sustancias antiangiogénicas o sustancias antitumorales. Estas sustancias pueden ser elegidas por el hombre en la técnica, con respecto al efecto que se logrará. Preferiblemente, estas sustancias se pueden seleccionar entre cisplatino, carboplatino, etopósido, ifosfamida, mitomicina, vinblastina, 25 vinorelbina, gemcitabina, paclitaxel, docetaxel e irinotecán, etc.
En un séptimo aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende cantidades eficaces de:
- un polipéptido, un fragmento y/o un péptido como se describió anteriormente, y
- un complejo de platino seleccionado del grupo que consiste en cisplatino y carboplatino.
Los solicitantes encontraron sorprendentemente que la combinación de un polipéptido según la invención con un 30 complejo de platino mostró actividad sinérgica.
Por "sinérgico", se entiende, dentro de la presente invención, que el efecto total de la combinación de principios activos es mayor que el efecto de cada principio activo tomado por separado.
El medicamento o composición útil en la práctica de esta invención se administra al mamífero por rutas convencionales conocidas. El medicamento o composición descrita en este documento se puede administrar por la misma ruta o por 35 diferentes rutas. Por ejemplo, el medicamento o composición se puede administrar a pacientes por vía oral o parenteral (por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraespinal, intraperitoneal y similares).
Cuando se administra por vía parenteral, la composición se formula preferiblemente en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, emulsión) con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales excipientes son por lo general no tóxicos y no terapéuticos. Ejemplos de tales excipientes son agua, vehículos acuosos 40 tales como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank y vehículos no acuosos tales como aceites fijos (por ejemplo, maíz, semilla de algodón, cacahuete y sésamo), oleato de etilo y miristato de isopropilo. La solución salina estéril es un excipiente preferido. El excipiente puede contener cantidades menores de aditivos tales como sustancias que mejoran la solubilidad, la isotonicidad y la estabilidad química, por ejemplo, antioxidantes, soluciones reguladoras y conservantes. Cuando se administran por vía oral (o rectal), los compuestos se formularán 45 usualmente en una forma de dosificación unitaria tal como un comprimido, cápsula, supositorio o sello. Tales formulaciones incluyen por lo general un portador o diluyente sólido, semisólido o líquido. Los diluyentes y excipientes de ejemplo son lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, fosfato de calcio, aceite mineral, manteca de cacao, aceite de teobroma, alginatos, tragacanto, gelatina, metilcelulosa, polioxietileno, sorbitán,
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monolaurato, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco y estearato de magnesio. En realizaciones preferidas, la composición farmacéutica según la invención se administra por vía intravenosa.
Según la invención, la cantidad de polipéptido presente en el medicamento o composición es eficaz para tratar tumores susceptibles. Preferiblemente, el polipéptido está presente en una cantidad desde 0.01 a 90% en peso, preferiblemente desde 0.1% a 10% en peso, más preferiblemente de 1% a 5% en peso, en el medicamento o en la composición. Estas cantidades son rutinariamente adaptables por el experto en el arte, que puede elegir la mejor cantidad para administrar a un paciente para lograr la recuperación.
En un octavo aspecto, la invención se refiere al uso de al menos una secuencia de ácido nucleico, vector o polipéptido como se describió anteriormente, o del medicamento como se describió anteriormente, o de la composición farmacéutica como se describió anteriormente, para el tratamiento de cánceres y/o tumores
Según la invención, los tumores que se van a tratar son preferiblemente tumores sólidos. Más preferiblemente, los tumores que se van a tratar se seleccionan de sarcomas, carcinomas y linfomas. Ejemplos de tales tumores son cáncer de vejiga, melanoma, cáncer de mama, linfoma no Hodgkin, cáncer de cerebro, cáncer de hueso, cáncer de colon y recto, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de endometrio, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de piel (no melanoma), cáncer de tiroides, cáncer de pulmón (cáncer de pulmón de células pequeñas y cáncer de pulmón de células no pequeñas).
En un noveno aspecto, la presente invención se refiere a un método de tratamiento que comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento al menos una secuencia de ácido nucleico, vector o polipéptido como se describió anteriormente, o el medicamento como se describió anteriormente, o la composición farmacéutica como se describió anteriormente, en una cantidad suficiente para inhibir el cáncer o el crecimiento tumoral.
Como se usa en este documento, "sujeto que necesita tratamiento" significa cualquier animal de sangre humana o caliente que padezca de cáncer o tumor.
En una realización particular, la invención se refiere al método de tratamiento como se describe anteriormente que comprende además administrar al menos otro fármaco antineoplásico o antitumoral.
En estos métodos, la administración comprende administración tópica, administración oral, administración intravenosa o administración intraperitoneal.
En un octavo aspecto, la presente invención se refiere a un método de tratamiento que comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad efectiva de:
- un polipéptido, un fragmento y/o un péptido como se describió anteriormente, y
- un complejo de platino seleccionado del grupo que consiste en cisplatino y carboplatino, que es suficiente para inhibir el cáncer o crecimiento tumoral
Los solicitantes encontraron sorprendentemente que la administración tanto de un polipéptido según la invención como de un complejo de platino mostró un efecto sinérgico.
En una realización, simultáneamente.
dicho polipéptido o fragmentos del mismo y dicho complejo de platino se administran
En otra realización,
dicho polipéptido o fragmentos del mismo y dicho complejo de platino se administran
secuencialmente. Preferiblemente, dicho polipéptido o fragmentos del mismo y dicho complejo de platino se administran por rutas separadas, esto es, por vía oral o parenteral (intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraespinal, intraperitoneal y similares).
En una realización particular, dicho complejo de platino es cisplatino.
En otra realización particular, dicho complejo de platino es carboplatino.
La presente invención se describirá ahora adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
La figura 1 es un diagrama que representa el % de inhibición de la proliferación de células endoteliales in vitro con concentraciones crecientes de proteína 168A-T2.
Las figuras 2a, 2b, 2c y 2d son imágenes de la angiogénesis in vitro de células endoteliales en diferentes condiciones:
- Figura 2a: Control (Solución reguladora Urea 2 M),
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- Figura 2b: 168A-T2 3.5 |ig/mL (0.2 |iM),
- Figura 2c: 168A-T2 6.9 |ig/mL (0.4 |iM),
- Figura 2d: 168A-T2 13.6 |ig/mL (0.8 |iM).
Las figuras 3a, 3b, 3c y 3d son imágenes del ensayo de lesiones en células endoteliales realizadas en diferentes condiciones:
- Figura 3a: Control (Solución reguladora Urea 2 M),
- Figura 3b: 168A-T2 12 |ig/mL (0.7 |iM),
- Figura 3c: 168A-T2 17 |ig/mL (1 |iM),
- Figura 3d: 168A-T3 23 |ig/mL (1.35 |iM).
La figura 4 es un diagrama que representa el % de inhibición de la proliferación de células tumorales renales (Biz) in vitro con concentraciones crecientes de proteína 168A-T2.
La figura 5 es un diagrama que representa el % de inhibición de la proliferación de células de tumor de pulmón (Calu-6) in vitro con concentraciones crecientes de proteína 168A-T2.
La figura 6 es un gráfico que representa el volumen del tumor medio (mm3) frente al tiempo (días) para diferentes grupos de ratones tratados según el ejemplo 8.
La figura 7 es un gráfico que representa el volumen del tumor relativo (sin unidad) frente al tiempo (días) para diferentes grupos de ratones tratados según el ejemplo 8.
La SEQ ID NO: 1 corresponde a la secuencia de ácido nucleico del gen 168.
La SEQ ID NO: 2 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la proteína 168A.
La SEQ ID NO:3 corresponde a la secuencia de ácido nucleico de 168A-T2.
La SEQ ID NO:4 corresponde a la secuencia de aminoácidos de 168A-T2.
La SEQ ID NO: 5 corresponde a la secuencia de ácido nucleico de 168A-T2 dentro del vector pET30.
La SEQ ID NO: 6 corresponde a la secuencia de aminoácidos de 168A-T2 producida con el vector pET30.
La SEQ ID NO: 7 corresponde a la secuencia de aminoácidos de un fragmento de 168A-T2.
La SEQ ID NO: 8 corresponde a la secuencia de aminoácidos de un fragmento de 168A-T2.
La SEQ ID NO: 9 corresponde a la secuencia de aminoácidos de un fragmento de 168A-T2.
La SEQ ID NO: 10 corresponde a la secuencia de aminoácidos de un fragmento de 168A-T2.
La SEQ ID NO: 11 corresponde a la secuencia de aminoácidos de un fragmento de 168A-T2.
La SEQ ID NO: 12 corresponde a la secuencia de aminoácidos de un fragmento de 168A-T2.
La SEQ ID NO: 13 corresponde a la secuencia de ácido nucleico de un fragmento de la SEQ ID NO: 7.

La SEQ ID NO: 14 corresponde a la secuencia de ácido nucleico codificante de la SEQ ID NO: 8.

La SEQ ID NO: 15 corresponde a la secuencia de ácido nucleico codificante de la SEQ ID NO: 9.

La SEQ ID NO: 16 corresponde a la secuencia de ácido nucleico codificante de la SEQ ID NO: 10.

La SEQ ID NO: 17 corresponde a la secuencia de ácido nucleico codificante de la SEQ ID NO: 11.

La SEQ ID NO: 18 corresponde a la secuencia de ácido nucleico codificante de la SEQ ID NO: 12.
La SEQ ID NO: 19 corresponde a la secuencia de ácido nucleico del cebador CDS5.
5
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15
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25
30
35
40
La SEQ ID NO: 20 corresponde a la secuencia de ácido nucleico del cebador CDS4.
Ejemplo 1: Producción de proteína 168A-T2 Síntesis de la inserción 168A-T2:
Primero, el gen 168A se clonó en el sistema de vector fácil pGEM®-T (Promega®) según procedimientos conocidos (el vector obtenido se denominó "pGEM-T-168A").
En segundo lugar, la inserción T2 (SEQ ID NO:3), codificante de la parte adyacente a la membrana plasmática del dominio extracelular de la proteína 168A, se amplificó por PCR usando el plásmido "pGEM-T-168A" y los dos cebadores CDS5 (SEQ ID NO: 19) y CDS4 (SEQ ID NO: 20) (tabla 1).
Tabla 1
Cebador
SEQ ID NO Secuencia
168A-cds-5
19 GACGACGACAAGATGGCCTTTGATGTGTCCTGGTTTG
168A-cds-4
20 GAGGAGAAGCCCGGTTCAGGGATACTTGAAGGCGTTCAGCACA
En tercer lugar, la secuencia de ADN (SEQ ID NO:3) codificante de la proteína 168A-T2 se insertó en el vector pET-30 EK/LIC (Novagen®) según procedimientos conocidos (pET-30-168AT2). La secuencia de ácido nucleico que codifica 168A-T2 dentro del vector pET-30 se da en la SEQ ID NO: 5.
El vector purificado se introdujo luego en E. coli BL21 (DE3) pLys para la producción de proteínas. Las colonias se controlaron por la presencia tanto del vector como del inserto por PCR.
El tamaño de la proteína producida 168A-T2 fue de 18 kD, que correspondía al tamaño esperado, que comprendía el marcador His en el extremo N tal como se confirmó mediante secuenciación. La secuencia de aminoácidos de la proteína 168A-T2 tal como se produce se da en la SEQ ID NO: 6.
Extracción y purificación de la proteína 168A-T2
Como la proteína 168A-T2 se produjo dentro de la fracción insoluble de las bacterias, necesitó una extracción en condiciones de desnaturalización.
Después del cultivo, las bacterias se lisaron, se centrifugaron y se descartó el sobrenadante. La fracción insoluble obtenida se trató con Tris-HCl 20 mM, urea 8 M, imidazol 5 mM, NaCl 0.5 M, GSH 5 mM, pH 8.0. Después de este tratamiento, la suspensión se centrifugó y el sobrenadante se recogió, se filtró en membranas de 0.45 |im para descartar materiales insolubles. El extracto filtrado se usó luego para purificar la proteína 168A-T2 usando una columna His-Trap (Amersham®) conectada a un sistema de HPLC (Amersham).
La proteína purificada obtenida se diluyó en urea 4 M e imidazol 0.3 M. Para eliminar estos agentes de la preparación, la solución se sometió a diálisis a 4 °C.
Siguiendo estas etapas de diálisis, la proteína purificada se centrifugó a 4,000 x g, durante 15 minutos y se filtró en membranas de 0.45 |im para eliminar posibles precipitados. La preparación de proteína purificada se controló para el contenido de proteína según el método descrito por Bradford in 1976 (Anal. Biochem. 72:248-54) y por SDS - PAGE. Los geles se analizaron usando el software Gene Genius para cuantificar la pureza mediante análisis de imágenes.
Para aumentar la pureza de la proteína 168A-T2, se realizó una segunda etapa de purificación usando cromatografía líquida de intercambio iónico. La preparación purificada HisTrap se diluyó 3 veces con la solución reguladora Tris-HCl 20 mM, pH 8, urea 2 M (para disminuir la concentración de NaCl a 50 mM), y se cargó en una columna MonoS conectada a un sistema HPLC ejecutado por el software Unicorn (Amersham, GE, Saclay, Francia). La columna se lavó luego extensamente y se eluyó con un gradiente lineal de fuerza iónica (NaCl 0.05 M a 0.5 M en la solución reguladora Tris- HCl 20 mM, pH 8, urea 2 M). La preparación de proteína purificada se controló para el contenido de proteína tanto por Bradford como por SDS PaGe.
Ejemplo 2: Prueba de inhibición de la proliferación de células endoteliales por 168A-T2 in vitro
Se cultivaron células HUVEC hasta confluencia en medio EGM2-MV completo (Cambrex) a 37 °C y en atmósfera humidificada con CO2 al 5%. Las células se recogieron luego mediante digestión con tripsina-EDTA (Versene, Eurobio). Después de 5 minutos, se detuvo la reacción enzimática y se añadieron 3 ml del medio de cultivo que contenía 5% de
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FCS. Las células se centrifugaron luego a 220 g, durante 10 minutos a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con 5 ml de medio de cultivo, se suspendieron en medio de cultivo completo, se contaron y se ajustaron a 50 000 células/mL. Se distribuyeron entonces cien |il por pocillo en una microplaca de 96 pocillos de cultivo celular (5 000 células/pocillo) y se incubaron con diferentes concentraciones de la proteína purificada 168A-T2 en solución reguladora Tris-HCl 20 mM (pH 8), que contenía NaCl 150 mM y urea 2 M; esta solución reguladora se usó como control.
Después de 42 horas a 37 °C, se midió la proliferación celular usando el método de bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo (MTT). En resumen, se disolvió MTT (Sigma) en PBS a 5 mg/ml, la solución se filtró (0.22 |im) y se añadieron 10 |il a cada pocillo de las microplacas de 96 pocillos. Después de 3 horas de incubación a 37 °C, atmósfera humidificada con CO2 al 5%, las microplacas se centrifugaron a 220 x g, durante 10 minutos, el sobrenadante se descartó y los cristales se disolvieron mediante la adición de 100 |il de DMSO a cada pocillo. La densidad óptica (OD) a 570 nm se midió luego usando un lector de microplacas pQuant (Bio-Tek Instrument gmbh, Colmar, Francia) acoplado al software KC4 (Bio-Tek). La OD se corrigió restando valores de OD del pocillo de blanco (los valores de OD obtenidos de pocillos sin células) y se midió la inhibición de la proliferación celular en relación con el control (OD obtenida de los pocillos con HUVEC no tratada que representa la respuesta proliferativa máxima, esto es, 100%).
Como se muestra en la figura 1, la proteína 168A-T2 inhibió la proliferación de células endoteliales humanas de una manera dependiente de la dosis. Esta inhibición representó 80% a 54 |ig/mL (esto es, 3.1 |iM) de proteína 168A-T2.
Ejemplo 3: Inhibición de la angiogénesis in vitro por 168A-T2
Las proteínas purificadas 168A-T2 se probaron in vitro en la angiogénesis de HUVEC inducida por FGF2 y VEGF en Matrigel.
Se prepararon 24 placas de pocillos con 250 |iL de BD Matrigel™/pocillo y luego se incubaron durante 30 minutos en una incubadora. Después se prepararon células HUVEC como se describe en el ejemplo 2 y se sembraron 70 000 células (en 0.5 mL) por pocillo y se incubaron con diferentes concentraciones de la proteína purificada 168A-T2, en solución reguladora Tris-HCl 20 mM (pH 8), que contenía 150 NaCl mM y urea 2 M; esta solución reguladora fue usado como control:
- Figura 2a: Control (Solución reguladora Urea 2 M),
- Figura 2b: 168A-T2 3.5 |ig/mL (0.2 |iM),
- Figura 2c: 168A-T2 6.9 |ig/mL (0.4 |iM),
- Figura 2d: 168A-T2 13.6 |ig/mL (0.8 |iM).
Como se muestra en las figuras 2b, 2c y 2d, la proteína 168A-T2 inhibió la angiogénesis in vitro de una manera dependiente de la dosis.
Ejemplo 4: Inhibición de la migración de células endoteliales humanas por 168A-T2
La migración de células se ensayó mediante el ensayo de lesiones descrito por Sato and Rifkin (J Cell Biol. 1988; 107:1199) con algunas modificaciones. HUVEC cultivadas en medio de cultivo EGM-2MV (Cambrex) se sembraron en placas de 24 pocillos a 80 000 células por pocillo en 500 |il de medio de cultivo y se cultivaron hasta confluencia a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía CO2 al 5%. Las células se desecharon con una punta de plástico en una sola línea. Después de lesionar, el medio de cultivo se cambió por medio fresco (control, figura 3a) o medio fresco suplementado con:
- Figura 3b: 168A-T2 12 |ig/mL (0.7 |iM),
- Figura 3c: 168A-T2 17 |ig/mL (1 |iM),
- Figura 3d: 168A-T3 23 |ig/mL (1.35 |iM).
Después de 18 horas de cultivo, las células se observaron y se fotografiaron bajo el microscopio invertido (Analysis, Olympus, Rungis, Francia).
Como se muestra en las figuras 3b, 3c y 3d, la proteína 168A-T2 inhibió la migración de células endoteliales humanas de una manera dependiente de la dosis.
Ejemplo 5: Prueba de inhibición de una proliferación de línea celular de cáncer de riñón mediante 168A-T2 in vitro
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Se preparó una preparación de células BizX de 50000 células/mL en medio completo. En una placa de 96 pocilios, se distribuyeron 100 mL de la preparación celular en cada pocillo y luego se incubaron con diferentes concentraciones de 168A-T2 (cada concentración se probó por triplicado). Después de 48 horas de incubación a 37 °C, se añadieron 10 ml de MTT (5 mg/L en agua) en cada pocillo. Después de 3 horas de incubación a 37 °C, se eliminó el medio de cultivo y se añadieron 100 mL de DMSO para solubilizar cristales de MMT. La densidad óptica (DO) a 570 nm se midió entonces usando un lector de microplacas mQuant (Bio-Tek Instrument Colmar, Francia) acoplado al software KC4 (Bio-Tek). La OD se corrigió restando valores de OD en pocillos de blanco (los valores OD obtenidos desde los pocillos sin células) y se midió la inhibición de la proliferación celular en relación con el control (OD obtenida de pocillos con células tumorales de riñón no tratadas que representaban la respuesta proliferativa máxima, esto es, 100%).
Como se muestra en la figura 4, la proteína 168A-T2 inhibió hasta el 20% de la proliferación de una línea de cáncer de riñón (BizX).
Ejemplo 6: Prueba de inhibición de una proliferación de línea celular de cáncer de pulmón por 168A-T2 in vitro Las células Calu6 se cultivaron y se trataron como se describe en el ejemplo 5.
Como se muestra en la figura 5, la proteína 168A-T2 inhibió hasta 40% de la proliferación de una línea de cáncer de pulmón (Calu6).
Ejemplo 7: Expresión de la proteína 168A en muestras tumorales
Se cribaron un número de muestras de tumores humanos diferentes para la expresión del gen 168A. Para cada muestra patológica, la periferia del tumor se separó del núcleo del tumor, y la expresión del gen 168A en estas dos áreas se comparó después de la extracción de ARNm seguido de RT-PCR.
Muestras de tumores renales
Se analizaron 19 biopsias patológicas de tumores renales. En 11 de 19 pacientes, la expresión de 168A fue mucho más alta en el núcleo que en la periferia del tumor. En 8 pacientes de 19 pacientes, la expresión de 168A fue mucho más alta en la periferia del tumor que en el núcleo.
Muestras de tumores pulmonares
Se analizaron 40 biopsias patológicas de tumores de pulmón humano. En 23 de 40 pacientes, la expresión de 168A fue mucho más alta en el núcleo que en la periferia del tumor.
Muestras de tumores de colon
Se analizaron 33 biopsias patológicas de tumores de colon humano. En 13 de 33 pacientes, la expresión de 168A fue mucho más alta en la periferia que en el núcleo del tumor.
Ejemplo 8: Prueba de 168A-T2 en el modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón de células no pequeñas humano (CALU-6) en ratones suizos desnudos in vivo
Preparación de células CALU-6
Se cultivaron células CALU-6 como células adherentes en medio EMEM completo (Ref. CM1MEM18-01, lote No. 462502, Eurobio, Francia) 10% de suero de ternera fetal (FCS; Ref. CVFSVF0001, lote No. S13021, Eurobio, Francia) en una atmósfera humidificada a 37 °C y CO2 al 5%. Se amplificaron en matraces de 75 cm2 para alcanzar 90x106 células.
A DO, se recogieron células CALU-6 (carcinoma de pulmón humano) de matraces de 75 cm2 eliminando el medio y añadiendo 3 ml de tripsina-EDTA (Ref. CEZTDA00-OU, lote No. 633920, Eurobio, Francia). Después de 5 min de incubación a 37 °C, las células se desprendieron del plástico y la reacción enzimática se detuvo añadiendo 3 ml de medio EMEM que contenía 10% de suero de ternera fetal. Las células se centrifugaron a 700 g, durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se resuspendieron en medio de cultivo EMEM libre de suero. Las células se contaron y se evaluó la viabilidad mediante exclusión con azul tripán (Ref. CSTCOL03-OU, lote No. 434511, Eurobio, Francia). El número de células CALU-6 viables fue > 99%. El número de células se ajustó entonces a 25x106 células/ml en medio libre de suero.
Inducción del tumor
Se anestesiaron treinta ratones suizos desnudos femeninos sanos mediante inyección IP de Ketamina-Xilazina (80 mg/kg-12 mg/kg, Ref. K-113, Sigma, Francia). Las células CALU-6 5x106 células/ratón en 200 |il de medio libre de
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suero) se implantaron luego subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón. Los ratones se observaron durante 2 horas después de la implantación.
Programa de tratamiento
En D12 después de la implantación de las células CALU-6, los treinta ratones se distribuyeron aleatoriamente en cuatro grupos de 5 ratones. Los volúmenes tumorales habían alcanzado 54 a 296 mm3 y los volúmenes tumorales medios no fueron estadísticamente diferentes entre los grupos después de la aleatorización.
El programa de tratamiento, que comienza el D12 y termina el D28, se resume en la tabla 2.
- Los animales del grupo 1 se trataron con la solución del vehículo (Tris-HCl pH 7.5, urea 2 M, NaCl 150 mM, CaCl2 0.1 mM)
- Los animales del grupo 2 se trataron con una solución de cisplatino en suero fisiológico a una concentración de 0.5 mg/mL (CDDP, dicloruro de cis-diaminaplatino (II), Ref. P4394, lote No. 014K0993, Sigma, Francia, pureza 100%, PM 300)
- Los animales del grupo 3 se trataron con el vehículo suplementado con la sustancia de prueba 168A-T2 a una dosis de 15 mg/kg.
- Los animales del grupo 4 se trataron con el vehículo suplementado con la sustancia de prueba 168A-T2 a una dosis de 15 mg/kg, y recibieron además 5 mg/kg de CDDP. Las inyecciones en los grupos 1, 2, 3 y 4 se realizaron según los programas Q2DX8, esto es, 1 cantidad cada dos días, ocho veces.
Se observaron ratones durante 2 horas después de la inyección. Se usó ketamina/xilazina (80 mg/kg -12 mg/kg, Ref. K- 113, Sigma, Francia) para anestesiar los animales antes del sacrificio por dislocación cervical. Para todos los animales, el tamaño del tumor se midió dos veces por semana con pinzas. El volumen del tumor (mm3) se midió según la fórmula: (longitud X ancho2)/2.
Estudios estadísticos
Se calcularon los datos descritos a continuación:
- Las curvas de crecimiento tumoral se extrajeron usando los volúmenes tumorales medios (MTV),
- El volumen relativo de tumor medio (MRTV) se calculó como la relación entre el MTV en el tiempo t y el volumen en el momento de la inyección (t = D12),
- La inhibición del crecimiento tumoral (T/C,%) se evaluó como la proporción de los volúmenes tumorales medianos de los grupos tratados frente al grupo de vehículos.
Se realizaron análisis estadísticos de volúmenes tumorales (TV), tiempo para alcanzar "TV", tiempo de duplicación tumoral (DT), volumen del tumor relativo (RTV) e inhibición del crecimiento tumoral (T/C) para todos los grupos. Los datos se expresan como la media ± SD. Los grupos de datos se distribuyeron normalmente. Se realizó un análisis univariado para evaluar las diferencias entre los grupos. La significación estadística se determinó usando la prueba t de Student. Un P <0.05 se consideró como estadísticamente significativo. El análisis estadístico se realizó usando XLSTAT (Addinsoft, Francia).
Peso corporal
Como se muestra en la tabla 3, el vehículo no tuvo impacto: el comportamiento del ratón y la ganancia de peso corporal fueron normales y ningún animal murió prematuramente. No se observó toxicidad durante el curso del tratamiento con la sustancia de prueba 168A-T2 a la dosis de 15 mg/kg, se observó una ligera ganancia de peso corporal (+ 2,45 g).
En contraste, se observó una toxicidad importante en los grupos 2, 4 tratados con CDDP (-2,70 g y -2,35 g de pérdida de peso corporal, respectivamente). La diferencia entre el grupo 1 versus 2 y 4 y el grupo 3 versus 2 y 4 fue estadísticamente significativa (p <0.0001) pero la diferencia entre el grupo 2 y 4 no fue estadísticamente significativa.
Tabla 2
Grupo
Animales n Tratamiento Ruta de administración Dosis de tratamiento (mg/kg/adm) Volumen de administración Programa de tratamiento
1
5 Vehículo IP 0 10 ml/kg Q2DX8
2
5 Cisplatino IP 5 Q2DX8
3
5 168A-T2 IP 15 Q2DX8
4
5 168A-T2+ IP 15 Q2DX8
Cisplatino 5
Tabla 3: Peso corporal medio (MBW) de los ratones con tumores CALU-6 tratados con el vehículo, CDDP a 5 mg/kg (programa Q2DX8, G2), 168A-T2 a 10.0 mg/kg (programa Q2DX8, G3), combinado 168A-T2 a 10.0 mg/kg y CDDP a 5
mg/kg (programa Q2DX8, G4) en D12 y D28.
Grupo
Sustancia de prueba Dosis de tratamiento (mg/kg) MBW at D12 (g) MBW at D28 (g) MBWC Dl2-D28 (g)
1
Vehículo 0 22.35 ± 1.17 24.40 ± 1.19 +2,36 (± 0.59)
2
Cisplatino 5.00 21.40 ± 0.85 18.69 ± 1.97 -2.70 (± 1.57)
3
168A-T2 15.00 21.74 ± 0.89 24.20 ± 1.37 +2.45 (± 0.65)
4
168A-T2+ Cisplatino 15.0 + 5.00 20.74 ± 1.41 18.39 ± 0.74 -2,35 (± 1.99)
5
Los resultados del volumen del tumor medio (MTV), el volumen del tumor relativo medio (MRTV) y los parámetros de crecimiento tumoral (T/C) se muestran en las figuras 6, 7 y en las tablas 4, 5 y 6.
La MTV (Tabla 4, Figura 6) se disminuyó en D28 en ratones del grupo 2 tratados con CDDP (742,44 mm3) en comparación con ratones del grupo de vehículos 1 (1233,44 mm3). El mTv en D28 también disminuyó en el grupo 3 10 tratado con la sustancia de prueba 168A-T2 a 15 mg/kg con 1 inyección por dos días (615,96 mm3). La disminución más importante de MTV se obtuvo para los animales del grupo 4 (317,17 mm3). La diferencia entre el grupo 1 y los 2 grupos tratados con la sustancia de prueba alcanza la significancia estadística (p <0,0001 vs 4 - p = 0,003 vs 3). La diferencia entre los grupos 2 y 4 también fue significativa (p = 0,001). Por el contrario, no se observó diferencia estadística entre el grupo 2 (CdDp solo) y el grupo 3 (168A-T2 solo).
15 Tabla 4: Volumen del tumor medio (MTV) de animales portadores de células CALU-6 y tratados con vehículo (grupo 1), CDDP solo (grupo 2), 168A-T2 (10.0 mg/kg) (grupo 3) o combinado con 168A -T2 y CDDP (Grupo 4) según el
tratamiento Q2DX8 programado.
MTV(mm3)
Grupo
D12 D14 D16 D18 D20 D22 D24 D26 D28
1
142,61 252,49 365,52 522,27 784,61 588,53 803,89 1044,02 1233,44
2
142,60 351,15 291,29 329,18 386,84 470,59 595,00 527,98 742,44
3
159,22 181,94 264,20 322,99 391,90 485,42 642,24 524,95 615,96
4
137,68 157,35 250,14 226,39 290,70 311,24 387,85 334,10 317,1
Estos resultados se confirmaron mediante el análisis de la MRTV (Tabla 5, Figura 7). La MRTV para animales del grupo 20 1 fue 8,24 en D28. Para los animales del grupo 2, esto es, tratados con CDDP, la MRTV en D28 era 5,98; para los
animales del grupo 3, esto es, tratados con 168A-T2 (15 mg/kg), la MRTV en D28 fue 4,51; eventualmente, para animales del grupo 4, esto es, tratados tanto con CDDP como con 168A-T2, la MRTV fue 2,18.

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:3, en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica para el polipéptido de la SEQ ID NO:4 que tiene actividad antiangiogénica y antitumoral.
  2. 2. Un vector de expresión que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1.
  3. 3. Un polipéptido de la SEQ ID NO:4, en el que dicho polipéptido tiene actividad antiangiogénica y antitumoral.
  4. 4. Un polipéptido según la reivindicación 3, caracterizado porque se produce mediante el vector de expresión de la reivindicación 2.
  5. 5. Un medicamento que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1, o al menos un vector de expresión según la reivindicación 2, o al menos un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4.
  6. 6. Una composición farmacéutica que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1 o al menos un vector de expresión según la reivindicación 2 o al menos un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
  7. 7. Una composición farmacéutica según la reivindicación 6, que comprende además al menos una otra sustancia activa seleccionada entre sustancias antiangiogénicas o sustancias antitumorales.
  8. 8. Una composición farmacéutica que comprende cantidades eficaces de:
    - un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, y
    - un complejo de platino seleccionado del grupo que consiste en cisplatino y carboplatino.
  9. 9. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que está en una forma apropiada para administración tópica, sistémica, oral, subcutánea, transdérmica, intramuscular o intraperitoneal.
  10. 10. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en la que dicho polipéptido está presente en una cantidad desde 0.01 a 90% en peso, preferiblemente desde 0.1% a 10% en peso, más preferiblemente desde 1% a 5% en peso.
  11. 11. Un ácido nucleico de la reivindicación 1, o un vector de expresión de la reivindicación 2, o un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, o un medicamento de la reivindicación 5, o una composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, para uso en el tratamiento de cánceres y/o tumores.
  12. 12. El ácido nucleico, el vector de expresión, el polipéptido, el medicamento o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 11, en el que los tumores son tumores sólidos.
  13. 13. El ácido nucleico, el vector de expresión, el polipéptido, el medicamento o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 12, en el que los tumores sólidos se seleccionan de sarcomas, carcinomas y linfomas.
    Inhibición de la proliferación (%)
    imagen1
    imagen2
    imagen3
    Inhibición de la proliferación (%)
    imagen4
    Inhibición de la proliferación (%)
    imagen5
    MTV (mm3)
    imagen6
    D12 D14 D16 D18 D20 D22 D24 D26 D28
    Tiempo (días)
    Figura 6
    MRTV
    imagen7
    O 1 --------------'------------------T------------------V -------------1 - ---------------------------------- ----------------------------
    D12 D14 D16 D18 D20 D22 D24 D26 D28
    Tiempo (días)
    Figura 7
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