CN101688205A

CN101688205A - 抗肿瘤药物、药剂、组合物及其用途

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Publication number: CN101688205A
Application number: CN200880015904A
Authority: CN
Inventors: S·阿尔·玛穆德; S·科兰
Original assignee: Gene Signal International SA
Current assignee: Gene Signal International SA
Priority date: 2007-05-16
Filing date: 2008-05-16
Publication date: 2010-03-31
Anticipated expiration: 2028-05-16
Also published as: US20100151051A1; JP5597534B2; US8742067B2; US9539306B2; HK1142631A1; EP2158317B1; WO2008138994A1; EP2158317A1; JP2010526549A; ES2674710T3; CA2685551C; CA2685551A1; AU2008249961B2; AU2008249961A1; CN101688205B; US20140134276A1

Abstract

本发明涉及具有抗肿瘤活性的包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的活性多肽。

Description

抗肿瘤药物、药剂、组合物及其用途

本发明涉及癌症治疗领域。更具体而言，本发明涉及使用小的多肽治疗癌症。

癌症为特征是无限制的细胞分裂，和这些细胞能够通过侵入直接生长到附近组织中或者通过转移移植到远处(其中，癌细胞通过血流或淋巴系统转运)而扩散的一类疾病或病症。癌症可以侵袭各个年龄段的人们，但是随着年龄的增长风险倾向于加大。癌症是发达国家中死亡的主要原因之一。

癌症有多种类型。症状的严重程度取决于恶性肿瘤的位置和特性以及是否存在转移。一旦确诊，癌症通常可以通过联合使用手术、化疗和放疗来进行治疗。随着研究的发展，针对癌症的病理类型的治疗更加具有特异性。对于几种癌症已经研究出靶向于特定癌症的药物。如果不加治疗，癌症可能最终导致病态和死亡，尽管并不总是如此。

目前的治疗针对恶性细胞的独特性质，例如，举例来说，避开细胞凋亡、由于端粒末端转移酶过多造成的不受限制的生长潜力(无限增殖化)、生长因子的自足性(self-sufficiency)、对于抗生长因子的不敏感性、细胞分裂速率提高、分化能力改变、无接触抑制能力、侵入邻近组织的能力、在远处形成转移的能力、促进血管生长(血管生成)的能力。

肿瘤血管生成是穿透到肿瘤中的血管网络的增殖，从而提供养分和氧气并清除废物。肿瘤血管生成实际上从释放向周围正常宿主组织发送信号的分子的癌症肿瘤细胞开始。该信号激活了宿主组织中的某些基因，而这些基因随之产生蛋白质以促使新血管的生长。实体瘤必须刺激新血管的生成以获得其生长必需的营养物和氧气，这样还提供了一条肿瘤可以转移到远处的途径。

试验证据显示：恶性肿瘤可以通过多种因子的精密作用诱导血管生成，例如酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子α(TGF-α)、肿瘤坏死生长因子α(TNF-α)和许多其它因子(Liotta等人，1991，Cell 64：327-336；Hanahan等人，Cell 86：353-364)。

目前，市场上存在许多靶向于血管生成的化疗分子。公知的天然存在的血管生成抑制剂是血管抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、干扰素、血小板因子4、催乳激素16Kd片段、凝血酶致敏蛋白(thrombospondin)、TIMP-1(金属蛋白酶-1组织抑制剂)、TIMP-2和TIMP-3。这些分子以及其它药物(例如，举例来说，考布他汀(combrestatin)A4、EMD 121974、TNP-470、角鲨胺、沙立度胺(thalidomide)、干扰素-α、抗VEGF、抗体......)可被用作化疗剂。但是，它们的效率远远不够，因而需要替代的治疗剂。

因此，需要用于治疗肿瘤的替代的化疗剂，其具有更高的效力、较低的侵袭性或毒性，以及使得恢复率提高。

本申请人所拥有的WO 03/080105描述了参与调控血管生成的5种基因。在这些基因中，编码“蛋白质168A”(本说明书中的SEQ ID NO：2)的“基因168”(本说明书中的SEQ ID NO：1)被指出参与激活血管生成。特别地，WO 03/080105公开了蛋白质168A在用促血管生成因子(pro-angiogenic factor)(例如，举例来说，TNF-α)刺激的内皮细胞中表达。WO 03/080105还描述了基因168的反义序列在人内皮细胞中的表达(即基因168的表达抑制)抑制了毛细管的形成。

基于计算机的(In silico)试验进一步显示，由924个氨基酸构成的蛋白质168A可能含有单个跨膜结构域和5个免疫球蛋白样结构域。

随着更深入的研究，本发明人制备了蛋白质168A的截短形式，对应于蛋白质168A的各种不同片段。在这些片段中，168A-T2对应于蛋白质168A的细胞外结构域片段，并确认为本说明书中的SEQ ID NO：4(108个氨基酸)。

在第一个试验中，本发明人发现蛋白质168A-T2可以在体外以剂量依赖的方式抑制人内皮细胞增殖。

然后，在第二个试验中，本发明人意外地发现168A-T2可以在体外以剂量依赖的方式显示出很强的抑制毛细管形成的活性。

本发明人进行的其它的试验表明：168A-T2可以在体外以剂量依赖的方式诱导内皮细胞的迁移抑制。

剂量-反应研究的结果进一步表明蛋白质168A-T2可以以剂量依赖的方式抑制人内皮细胞的增殖，且这种抑制可以以3.1μM的浓度达到80％以上。这趋于表明：该重组蛋白质可能是高效的抗血管生成的化合物，其效力比抗VEGF mAb和/或基于VEGF受体(KDR)识别的肽高至少600倍(Binetruy-Tournaire R等人，Identification of a peptide blockingvascular endothelial growth factor(VEGF)-mediated angiogenesis，EMBO J.2000；19：1525-1533)。

毛细管形成、人内皮细胞增殖和人内皮细胞迁移是血管生成的三个关键步骤。因此，168A-T2可以在体外以剂量依赖的方式抑制毛细管形成、人内皮细胞增殖和/或迁移的事实强有力地证明了蛋白质168A的截短形式具有高的抗血管生成活性。

所有这些结果都是绝对无法预料的，因为，天然原始蛋白质168A优选在促血管生成的条件下表达，即在TNFα存在的情况下表达，并且人内皮细胞中基因168的反义序列的表达(即基因168的抑制)抑制了毛细管的生成。因此，蛋白质168A的截短形式可以具有抗血管生成活性是非常令人意外的。

本发明人还意外地发现：蛋白质168A-T2具有很强的体内抗肿瘤活性，和与其它化疗剂(例如，举例来说，顺铂)联用时的很强的协同活性。

本发明人发现：在不同的测试剂量下，测试物质168A-T2对携带肿瘤的裸鼠无毒性。而且，最早在治疗开始的两天后，168A-T2便显示出针对人体肿瘤的强的统计学显著的抗肿瘤活性。这种抗肿瘤活性在治疗期间持续。168A-T2的这种抗肿瘤效应提供了一种现实的作为单一治疗的治疗方法。当与抑制肿瘤生长的细胞毒性抗癌药物CDDP(顺铂)联用时，其效力也得到极大的增强。另一方面，顺铂单独不能根除肿瘤生长。

这些数据强烈表明：168A-T2可作为主要的抗肿瘤剂使用，或者也可以作为用于治疗癌症的主要细胞毒性剂的附加协同治疗。

如上所述，现在确定，蛋白质168A在内皮细胞中表达，且其表达在促血管生成因子(例如TNFα)刺激血管生成时提高(如WO03/080105所述)。蛋白质168A为跨膜蛋白，并有可能参与传导促血管生成信号。不意图局限于理论，本申请人认为168A的截短形式可能通过“可溶性受体机制”来发挥其作用：168A的截短形式可以在细胞表面上保持可溶性，并可以被原始168A蛋白质的配体识别。因此，168A的可溶形式(本发明的片段)和原始跨膜蛋白之间在识别配体方面存在竞争，因而促血管生成信号的传导存在剂量依赖性的降低，因此，造成了血管生成的抑制，并随之造成肿瘤体积的减小。

因此在第一方面，本发明涉及具有核酸序列SEQ ID NO：3的核酸或与核酸序列SEQ ID NO：3具有至少50％、优选70％、更优选90％同一性的核酸，或者其具有至少60个连续核苷酸的核酸片段，或者与所述片段的核酸序列具有至少50％、优选70％、更优选90％同一性的核酸序列，条件是所述核酸不是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：21、US2005/106644中公开的SEQ ID NO：58、或SEQ ID NO：23，所述核酸编码具有抗血管生成和抗肿瘤活性的多肽或肽。

SEQ ID NO：21对应于WO 02/081731中公开的核酸序列SEQ IDNO：87。

SEQ ID NO：23对应于WO 03/080105中公开的核酸序列SEQ IDNO：28。

在一个优选实施方式中，本发明涉及核酸序列SEQ ID NO：3或在此出于实用的原因称为SEQ ID NO X的核酸序列，当与SEQ ID NO：3比对(alignment)时，该SEQ ID NO X核酸序列具有：

a)在SEQ ID NO：3长度上相同残基的百分比至少为50％、优选为至少70％、更优选为至少90％，和

b)在所述氨基酸序列SEQ ID NO X长度上相同残基的百分比至少为80％、优选为至少90％、更优选为至少95％，

或者其具有至少60个连续核苷酸的片段。

根据本发明，在SEQ ID NO：3长度上相同残基的百分比相当于SEQ ID NO：X和SEQ ID NO：3之间的相同残基数除以SEQ ID NO：3的残基数。当使用GenomeQuest数据库时，所述在SEQ ID NO：3长度上相同残基的百分比对应于查询物(query)同一性百分比(％id Query)，其中，查询物为SEQ ID NO：3。

根据本发明，在SEQ ID NO：X长度上相同残基的百分比相当于SEQID NO：X和SEQ ID NO：3之间的相同残基数除以SEQ ID NO：X的残基数。当使用GenomeQuest数据库时，所述在SEQ ID NO：X长度上相同残基的百分比对应于对象(subject)同一性百分比(％id Subject)。

上面所使用的“片段”是指SEQ ID NO：3的截短序列，具有至少60个连续的核苷酸，并编码具有抗血管生成和抗肿瘤活性的活性肽或多肽。在一个特别的实施方式中，片段具有核酸序列SEQ ID NO：13、SEQID：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18。在另一个实施方式中，本发明还包括当与至少60个连续核苷酸的SEQ ID NO：3的片段、特别是与SEQ ID NO：13、14、15、16、17或18比对时，具有以下特征的核酸片段：

a)在所述SEQ ID NO：3的片段的长度上相同残基的百分比为至少50％、优选为至少70％、更优选为至少90％，和

b)在所述核酸片段长度上相同残基的百分比为至少65％、优选为至少70％、更优选为至少90％，

且编码具有抗血管生成和抗肿瘤活性的肽。

另一方面，本发明涉及包含至少一种上述限定的核酸序列的表达载体。

此处所使用的“表达载体”是指用于向靶细胞导入并表达特定的核酸序列的任何质粒或核酸构建体。

第三方面，本发明进一步涉及包含氨基酸序列SEQ ID NO：4或与氨基酸序列SEQ ID NO：4具有至少50％、优选70％、更优选90％同一性的活性多肽，或者其具有至少20个连续氨基酸的片段，或者与所述片段具有至少50％、优选70％、更优选90％同一性的肽，条件是所述多肽不是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：22，或由US2005/106644中公开的SEQ ID NO：58编码的或由SEQ ID NO：23编码的多肽。

SEQ ID NO：22对应于WO 02/081731中公开的氨基酸序列SEQ IDNO：87。

在一个优选实施方式中，本发明涉及活性多肽SEQ ID NO：4或氨基酸序列SEQ ID NO：Y，其中，当与SEQ ID NO：4比对时，该氨基酸序列SEQ ID NO：Y具有以下特征：

a)在SEQ ID NO：4长度上相同残基的百分比为至少50％、优选为至少70％、更优选为至少90％，和

b)在所述氨基酸序列SEQ ID NO：Y长度上相同残基的百分比为至少65％、优选为至少70％、更优选为至少90％，

或者其具有至少20个连续氨基酸的片段。

此处所使用的“肽”是指以限定的顺序通过少于100个氨基酸的连接形成的短分子。

此处所使用的“多肽”是指以限定的顺序通过至少100个氨基酸的连接形成的分子。

此处所使用的“活性多肽”是指具有生物学活性的多肽。在本发明中，所述多肽具有抗血管生成和抗肿瘤活性。

根据本发明，上述多肽具有抗肿瘤活性。

根据本发明，在SEQ ID NO：4长度上相同残基的百分比相当于SEQ ID NO：Y和SEQ ID NO：4之间的相同残基数除以SEQ ID NO：4中的残基数。当使用GenomeQuest数据库时，所述在SEQ ID NO：4长度上相同残基的百分比对应于查询物同一性百分比(％id Query)，其中，查询物为SEQ ID NO：4。

根据本发明，在SEQ ID NO：Y长度上相同残基的百分比对应于SEQID NO：Y和SEQ ID NO：4之间的相同残基数除以SEQ ID NO：Y的残基数。当使用GenomeQuest数据库时，所述在SEQ ID NO：Y长度上相同残基的百分比对应于对象同一性百分比(％id Subject)。

根据本发明，上述SEQ ID NO：4的片段对应于SEQ ID NO：4的截短形式，并具有抗肿瘤活性。所述片段优选具有SEQ ID NO：4的至少20个连续的氨基酸。在一个特定的实施方式中，该片段具有至少37个连续氨基酸的氨基酸序列。在另一个特定的实施方式中，所述片段具有SEQ ID NO：7(90个氨基酸)、SEQ ID NO：8(77个氨基酸)、SEQ IDNO：9(66个氨基酸)、SEQ ID NO：10(51个氨基酸)、SEQ ID NO：11(37个氨基酸)或SEQ ID NO：12(20个氨基酸)的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明还包括肽，当与至少20个连续氨基酸的SEQ IDNO：4的片段比对时，所述肽具有以下特征：

a)在所述SEQ ID NO：4的片段长度上相同残基的百分比为至少50％、优选为至少70％、更优选为至少90％，和

b)在所述肽长度上相同残基的百分比为至少65％、优选为至少70％、更优选为至少90％，

且具有抗肿瘤活性。

在一个特定的实施方式中，根据本发明的活性多肽是由上述限定的表达载体制备的。

第四方而，本发明涉及包含至少一种上述描述的核酸序列、载体或多肽的药物。

第五方面，本发明涉及包含至少一种上述描述的核酸序列、载体或多肽，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

第六方面，本发明涉及用于治疗人体或动物体癌症和/或肿瘤的方法中的包含至少一种上述描述的核酸序列、载体或多肽，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

在一个特定的实施方式中，上述药物组合物进一步包含至少一种选自抗血管生成物质或抗肿瘤物质的另外的活性物质。本领域的技术人员可以根据需要实现的效果来选择这些物质。优选地，这些物质可以选自顺铂、卡铂、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂霉素、长春碱、长春瑞滨、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛和依立替康、等。

第七方面，本发明涉及药物组合物，包含有效量的

-上述的多肽、片段和/或肽，和

-选自顺铂和卡铂的铂配合物。

本申请人意外地发现联合使用本发明的多肽和铂配合物显示出协同活性。

在本发明中“协同”是指活性成份的组合的总效应大于各别地使用各种活性成分的效应。

使用已知的常规途径将可用于实施本发明的药物或组合物施用于哺乳动物。在此描述的药物或组合物可以通过相同的途径或通过不同的途径施用。例如，所述药物或组合物可以经口服或经肠胃外(静脉内、皮下、肌肉内、脊柱内、腹膜内等)施用于患者。

当经肠胃外给药时，组合物优选通过至少一种药学上可接受的赋形剂配制成可注射的单位剂量形式(溶液、悬浮剂、乳液)。这样的赋形剂通常为无毒的，并且无治疗效果。这样的赋形剂的例子是水、水性载体(如盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和汉克溶液(Hank′ssolution))和非水性载体(如不挥发油(例如玉米油、棉籽油、花生油和芝麻油)、油酸乙酯和十四烷酸异丙酯)。灭菌盐水为优选的赋形剂。赋形剂可以包含少量添加剂，例如提高溶解度、等渗性和化学稳定性的物质，例如抗氧化剂、缓冲液和防腐剂。当口服(或直肠)施用时，通常将化合物配制成单位剂量形式，例如片剂、胶囊、栓剂或扁囊剂。这样的制剂通常包括固体、半固体或液体的载体或稀释剂。示例性的稀释剂和赋形剂是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、矿物油、可可脂、可可油、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、甲基纤维素、聚氧乙烯、单月桂酸脱水山梨醇酯、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉和硬脂酸镁。在优选的实施方式中，本发明的药物组合物经静脉施用。

根据本发明，药物或组合物中存在的多肽的量有效地治疗易感性肿瘤。优选地，在药物或组合物中多肽的量为0.01％至90％重量，优选为0.1％至10％重量，更优选为1％至5％重量。能够选择对患者的最佳施用量以使患者康复的本领域的技术人员可以按照常规调整这些剂量。

第八方面，本发明涉及至少一种上述核酸序列、载体或多肽，或者上述药物，或者上述药物组合物在治疗癌症和/或肿瘤中的用途。

根据本发明，待治疗的肿瘤优选为实体瘤。更优选地，待治疗的肿瘤选自肉瘤、癌瘤和淋巴瘤。这样的肿瘤的例子是膀胱癌、黑素瘤、乳腺癌、非何杰金氏淋巴瘤、脑癌、骨癌、结肠和直肠癌、肝癌、胰腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌(非黑素瘤)、甲状腺癌、肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)。

第九方面，本发明涉及治疗方法，包括向需要治疗的受试者施用足以抑制癌症或肿瘤生长的量的至少一种上述的核酸序列、载体或多肽，或者上述药物，或者上述药物组合物。

此处所使用的“需要治疗的受试者”是指任何患有癌症或肿瘤的人或温血动物。

在一个特定的实施方式中，本发明涉及上述的治疗方法，其进一步包括施用至少一种其它的抗瘤或抗肿瘤药物。

在这些方法中，施用包括局部施用、口服施用、静脉内施用或腹膜内施用。

第八方面，本发明涉及治疗方法，包括向需要治疗的受试者施用足以抑制癌症或肿瘤生长的有效量的

-上述的多肽、片段和/或肽，和

-选自顺铂和卡铂的铂配合物。

本申请人意外地发现同时施用本发明的多肽和铂配合物显示出协同效应。

在一个实施方式中，所述多肽或其片段和所述铂配合物同时施用。

在另一个实施方式中，所述多肽或其片段和所述铂配合物顺序给药。优选地，所述多肽或其片段和所述铂配合物经独立的途径(即口服或经肠胃外(静脉内、皮下、肌肉内、脊柱内、腹膜内等))施用。

在一个特定的实施方式中，所述铂配合物为顺铂。

在另一个特定的实施方式中，所述铂配合物为卡铂。

现在将参照下面的非限制性的实施例进一步描述本发明。

图1的图表代表了随着蛋白质168A-T2浓度的增加，内皮细胞体外增值的抑制％。

图2a、2b、2c和2d为不同条件下内皮细胞的体外血管生成的照片。

-图2a：对照(缓冲液，尿素2M)

-图2b：168A-T2 3.5μg/mL(0.2μM)

-图2c：168A-T2 6.9μg/mL(0.4μM)

-图2d：168A-T2 13.6μg/mL(0.8μM)

图3a、3b、3c和3d为不同条件下进行的内皮细胞创伤分析(woundassay)的照片。

-图3a：对照(缓冲液，尿素2M)

-图3b：168A-T2 12μg/mL(0.7μM)

-图3c：168A-T2 17μg/mL(1μM)

-图3d：168A-T3 23μg/mL(1.35μM)

图4的图表代表了随着蛋白质168A-T2浓度的增加，肾肿瘤细胞(Biz)体外增值的抑制％。

图5的图表代表了随着蛋白质168A-T2浓度的增加，肺肿瘤细胞(Calu-6)体外增值的抑制％。

图6代表了根据实施例8处理的不同组的小鼠的平均肿瘤体积(mm³)对时间(天)的曲线图。

图7代表了根据实施例8处理的不同组的小鼠的平均相对肿瘤体积(没有单位)对时间(天)的曲线图。

SEQ ID NO：1对应于基因168的核酸序列。

SEQ ID NO：2对应于蛋白质168A的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3对应于168A-T2的核酸序列。

SEQ ID NO：4对应于168A-T2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5对应于载体pET30中的168A-T2的核酸序列。

SEQ ID NO：6对应于载体pET30中的168A-T2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7对应于168A-T2的片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8对应于168A-T2的片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9对应于168A-T2的片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10对应于片段168A-T2的片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11对应于片段168A-T2的片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12对应于片段168A-T2的片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13对应于编码SEQ ID NO：7的核酸序列。

SEQ ID NO：14对应于编码SEQ ID NO：8的核酸序列。

SEQ ID NO：15对应于编码SEQ ID NO：9的核酸序列。

SEQ ID NO：16对应于编码SEQ ID NO：10的核酸序列。

SEQ ID NO：17对应于编码SEQ ID NO：11的核酸序列。

SEQ ID NO：18对应于编码SEQ ID NO：12的核酸序列。

SEQ ID NO：19对应于引物CDS5的核酸序列。

SEQ ID NO：20对应于引物CDS4的核酸序列。

实施例1：制备蛋白质168A-T2

插入片段(insert)168A-T2的合成：

首先，根据已知的步骤在

-T easy载体系统

中克隆基因168A(得到的载体被称为“pGEM-T-168A”)。

第二，使用质粒“pGEM-T-168A”以及两个引物CDS5(SEQ ID NO：19)和CDS4(SEQ ID NO：20)(表1)通过PCR扩增编码蛋白质168A的细胞外结构域的邻近质膜部分的插入片段T2(SEQ ID NO：3)。

引物	SEQ ID NO	序列
引物	SEQ ID NO	序列	168A-cds-5	19	GACGACGACAAGATGGCCTTTGATGTGTCCTGGTTTG
168A-cds-4	20	GAGGAGAAGCCCGGTTCAGGGATACTTGAAGGCGTTCAGCACA	168A-cds-5	19	GACGACGACAAGATGGCCTTTGATGTGTCCTGGTTTG

表1

第三，根据已知的步骤将编码蛋白质168A-T2的DNA序列(SEQ IDNO：3)插入载体pET-30 EK/LIC

中(pET-30-168A-T2)。pET-30载体内的编码168A-T2的核酸序列在SEQ ID NO：5中给出。

然后将纯化的载体导入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)pLys中以产生蛋白质。通过PCR来控制载体和插入片段都存在的菌落。

产生的蛋白质168A-T2的大小为18kD，这与预期的大小相当，通过测序确定其在N末端包含His尾。产生的蛋白质168A-T2的氨基酸序列在SEQ ID NO：6中给出。

蛋白质168A-T2的提取和纯化

由于蛋白质168A-T2在细菌的不溶性部分中产生，因此需要在变性条件下进行提取。

培养之后，溶解细菌，离心之后弃去上清液。使用20mM Tris-HCl、8M尿素、5mM咪唑(imidazol)、0.5M NaCl、5mM GSH，pH 8.0处理所得到的不溶性部分。该处理之后，离心悬浮液，收集上清液，使用0.45μm的膜过滤以去除不溶物质。然后，通过使用与HPLC系统(Amersham)连接的His-Trap柱

从过滤的提取液纯化蛋白质168A-T2。

在4M尿素和0.3M咪唑中稀释得到的纯化蛋白质。为从制剂中去除这些试剂，溶液在4℃下进行透析。

在这些透析步骤之后，纯化的蛋白质在4,000xg下离心15min，并使用0.45μm的膜过滤以去除可能存在的沉淀物。按照Bradford在1976年描述的方法(Anal.Biochem.72：248-54)和通过SDS-PAGE来控制纯化的蛋白质制剂中的蛋白质含量。使用Gene Genius软件对凝胶进行分析以通过图象分析定量纯度。

为了提高蛋白质168A-T2的纯度，我们使用离子交换液相色谱进行了第二纯化步骤。使用缓冲液20mM Tris-HCl、pH 8、2M尿素对HisTrap纯化的制剂三倍稀释(以降低NaCl的浓度到50mM)，并上样到与由Unicorn软件运行(Amersham，GE，Saclay，法国)的HPLC系统连接的MonoS柱上。然后彻底洗涤该柱，并通过线性梯度的离子强度(ionic force)(20mM Tris-HCl缓冲液中0.05M至0.5M的NaCl、pH 8、2M尿素)进行洗脱。通过Bradford和SDS-PAGE两种方法来控制纯化的蛋白质制剂中的蛋白质含量。

实施例2：168A-T2对内皮细胞增殖的抑制的体外测试

在37℃和5％CO₂的潮湿空气中，在EGM2-MV完全培养基(Cambrex)中培养HUVEC细胞至融合(confluency)。然后通过胰蛋白酶-EDTA消化(Versene，Eurobio)收获细胞。五分钟之后，通过添加3ml的含5％FCS的培养基来终止酶反应。然后在室温下以220g离心细胞10分钟，细胞使用5ml培养基洗涤两次，悬浮在完全培养基中，计数并调节到50000细胞/ml。然后细胞悬浮液按每孔100μL分布在96孔的细胞培养级微板上(5000细胞/孔)，并与含150mM NaCl和2M尿素的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8)中的不同浓度的蛋白质168A-T2一起孵育；该缓冲液作为对照使用。

在37℃下42小时之后，通过噻唑蓝溴化四唑(MTT)方法来测量细胞的增殖。简而言之，将MTT(Sigma)溶于PBS，浓度为5mg/ml，然后将溶液进行过滤(0.22μm)，并向96孔微板的各孔中添加10μl该溶液。在37℃和5％CO₂的潮湿空气中孵育3小时之后，微板在220x g下离心10min，弃去上清液，然后通过向每个孔中添加100μl DMSO来溶解晶体。然后使用与KC4(Bio-Tek)软件配合的μQuant微板阅读器(Bio-Tek Instrument gmbh，Colmar，法国)在570nm下测量光密度(OD)。通过减去空白孔OD值(从不包含细胞的孔中得到的OD值)来校准OD，细胞增殖的抑制相对于对照(从代表最大增值响应，即100％的具有未经处理的HUVEC的孔中得到的OD)进行测量。

如图1所示，蛋白质168A-T2以剂量依赖的方式抑制人内皮细胞增殖。该抑制在54μg/mL(即3.1μM)的蛋白质168A-T2下为80％。

实施例3：168A-T2对体外血管生成的抑制

体外测试纯化的蛋白质168A-T2对在Matrigel上由FGF2和VEGF诱导的HUVEC的血管生成的效应。

24孔板中用每孔250μL BD Matrigel^TM进行准备，然后在培养箱中孵育30分钟。然后参照上述的实施例2制备HUVEC细胞，每个孔接种70000个细胞(0.5mL悬浮液)，并与含150mM NaCl和2M尿素的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8)中的不同浓度的纯化蛋白质168A-T2一起孵育；该缓冲液被用作对照：

-图2a：对照(缓冲液，尿素2M)

-图2b：168A-T2 3.5μg/mL(0.2μM)

-图2c：168A-T2 6.9μg/mL(0.4μM)

-图2d：168A-T2 13.6μg/mL(0.8μM)

如图2b、2c和2d显示，蛋白质168A-T2以剂量依赖的方式抑制体外血管生成。

实施例4：168A-T2对人内皮细胞迁移的抑制

通过具有少许修改的Sato和Rifkin描述的创伤分析(J Cell Biol.1988；107：1199)来测试细胞的迁移。在EGM-2MV生长培养基(Cambrex)中生长的HUVEC以每孔80000个细胞的浓度接种在24孔板中，每孔包含500μL生长培养基，并在37℃和含5％CO₂的潮湿空气中生长至融合。仅在一条线上使用塑料头刮碎细胞。创伤之后，将培养基更换为新鲜的培养基(对照，图3a)或补充下述物质的新鲜的培养基：

-图3b：168A-T2 12μg/mL(0.7μM)

-图3c：168A-T2 17μg/mL(1μM)

-图3d：168A-T3 23μg/mL(1.35μM)

培养18小时之后，使用倒置显微镜(Analysis，Olympus，Rungis，法国)观察细胞并照相。

如图3b、3c和3d所示，蛋白质168A-T2以剂量依赖的方式抑制人内皮细胞的迁移。

实施例5：在体外测试168A-T2对肾癌细胞系增殖的抑制

50000个细胞/mL的BizX细胞制剂在完全培养基中进行制备。在96孔板中，每个孔中分布100mL该细胞制剂，然后与不同浓度的168A-T2(每个浓度重复测试三次)一起进行孵育。在37℃下孵育48小时之后，向每孔中添加10mL MTT(5mg/L，在水中)。在37℃下孵育3小时之后，去除培养基，并添加100mL DMSO以溶解MMT晶体。使用与KC4(Bio-Tek)软件配合的μQuant微板阅读器(Bio-TekInstrument gmbh，Colmar，法国)测量570nm下的光密度(OD)。通过减去空白孔的OD值(从没有细胞的孔中得到的OD值)来校准OD，细胞增殖的抑制相对于对照(从代表最大增殖响应，即100％的具有未处理的肾肿瘤细胞的孔得到的OD)进行测量。

如图4所示，蛋白质168A-T2抑制肾癌细胞系(BizX)的增殖最高达20％。

实施例6：体外测试168A-T2对肺癌细胞系增殖的抑制

按照实施例5所述来培养和处理Calu6细胞。

如图5所示，蛋白质168A-T2抑制肺癌细胞系(Calu6)的增殖最高达40％。

实施例7：肿瘤样品中蛋白质168A的表达

在多种不同的人肿瘤样品中筛选了基因168A的表达。对于各种病理样本，将肿瘤的外周与肿瘤的核心进行分离，在mRNA表达后进行RT-PCR，对这两个区域中基因168A的表达进行比较。

肾肿瘤样品

分析了来自肾肿瘤的19个病理活组织检查样品。在19位患者的11位中，肿瘤核心的168A表达比肿瘤外周的168A表达高得多。在19位患者的8位中，肿瘤外周的168A表达比肿瘤核心的168A表达高得多。

肺肿瘤样品

分析了来自人肺肿瘤的40个病理活组织检查样品。在40位患者的23位中，肿瘤核心的168A表达比肿瘤外周的168A表达高得多。

结肠肿瘤样品

分析了来自人结肠肿瘤的33个病理活组织检查样品。在33位患者的13位中，肿瘤外周的168A表达比肿瘤核心的168A表达高得多。

实施例8：168A-T2在瑞士裸鼠体内的人非小细胞肺癌(CALU-6)异种移植物模型中的测试

CAL U-6细胞的制备

在37℃和5％CO₂的潮湿空气中，在包含10％胎牛血清(FCS；参考号CVFSVF00-01，批号S13021，Eurobio，法国)的EMEM完全培养基(参考号CM1MEM18-01，批号462502，Eurobio，法国)中培养CALU-6作为粘附细胞。它们在75cm²烧瓶进行扩增以达到90x10⁶个细胞。

在第0天，通过除去培养基并添加3ml胰蛋白酶-EDTA(参考号CEZTDA00-0U，批号633920，Eurobio，法国)从75cm²烧瓶中收集CALU-6细胞(人肺癌)。在37℃下孵育5min之后，细胞已经与塑料脱离，并通过添加3ml含10％胎牛血清的EMEM培养基来终止酶反应。然后在室温下以700g离心细胞5分钟。细胞重新悬浮于不含血清的EMEM培养基中。通过台盼蓝排除(参考号CSTCOL03-OU，批号434511，Eurobio，法国)计数细胞并评估其生存力。活的CALU-6细胞数＞99％。然后在不含血清的培养基中将细胞数调整到25x10⁶细胞/ml。

肿瘤诱导

IP注射氯胺酮-甲苯噻嗪(80mg/kg-12mg/kg；参考号K-113，Sigma，法国)麻醉30只健康的雌性瑞士裸鼠。然后经皮下在每只小鼠的右侧腹植入CALU-6细胞(5x10⁶个细胞/小鼠，在200μl不含血清的培养基中)。植入之后观察小鼠2小时。

治疗方案

在植入CALU-6细胞之后的第12天，将30只小鼠随机分到4组中，每组5只小鼠。肿瘤的体积已经长到54至296mm³，且随机分组后组间的平均肿瘤体积不存在统计学意义上的差异。

治疗方案开始于第12天，结束于第28天，总结于表2中。

-动物组1，使用载体溶液处理(Tris-HCl pH 7.5、2M尿素、150mMNaCl、0.1mM CaCl₂)。

-动物组2，使用顺铂于生理血清中的溶液处理，浓度为0.5mg/mL(CDDP，顺二氯二氨基铂(II)，参考号P4394，批号014K0993，Sigma，法国，纯度100％，MW.300)。

-动物组3，使用补充有测试物质168A-T2的载体处理，剂量为15mg/kg。

-动物组4，使用补充有测试物质168A-T2的载体处理，剂量为15mg/kg，并进一步接受5mg/kg CDDP。

按照方案Q2DX8(即每2天给药1次，共给药8次)对组1、2、3和4进行注射。

注射之后观察小鼠2小时。在使用脱颈椎法处死小鼠之前使用氯胺酮-甲苯噻嗪(80mg/kg-12mg/kg；参考号K-113，Sigma，法国)对动物进行麻醉。对于所有动物，使用测径器每周两次测量肿瘤大小。计算肿瘤体积(mm³)的公式为：(长×宽²)/2。

统计学研究

计算下述列举的数据：

-使用平均肿瘤体积(MTV)来制作肿瘤生长曲线，

-平均相对肿瘤体积(MRTV)计算为在时间t的MTV与在注射时(t＝第12天)的体积的比率。

-肿瘤生长抑制(T/C，％)计算为处理组的平均肿瘤体积与载体组的平均肿瘤体积的比率。

对所有组进行肿瘤体积(TV)、达到“TV”的时间、肿瘤加倍时间(DT)、相对肿瘤体积(RTV)和肿瘤生长抑制(T/C)的统计学分析。数据表示为平均值±SD。数据组正常分布。进行单变量分析来评估组间的差异。然后使用Student’s t检验来确定统计学显著性。P＜0.05为统计学显著。使用XLSTAT(Addinsoft，法国)进行统计分析。

体重

如表3所示，载体无影响：小鼠的行为和体重增长正常，没有动物过早死亡。以15mg/kg的剂量用测试物质168A-T2进行处理的过程中，未观察到毒性，观察到体重略有增长(+2.45g)。

相反，使用CDDP处理的组2和4中观察到严重的毒性(体重分别降低-2.70g和-2.35g)。组1与组2/组4之间、以及组3与组2/组4之间的差异存在统计学意义(p＜0.0001)，但是组2与组4之间的差异没有统计学意义。

表2

组	测试物质	处理剂量(mg/kg)	第12天的MBW(g)	第28天的MBW(g)	第12-28天的MBWC(g)
组	测试物质	处理剂量(mg/kg)	第12天的MBW(g)	第28天的MBW(g)	第12-28天的MBWC(g)	1	载体	0	22.35±1.17	24.40±1.19	+2.36(±0.59)
2	顺铂	5.00	21.40±0.85	18.69±1.97	-2.70(±1.57)	1	载体	0	22.35±1.17	24.40±1.19	+2.36(±0.59)
2	顺铂	5.00	21.40±0.85	18.69±1.97	-2.70(±1.57)	33	168A-T2	15.0	21.74±0.89	24.20±1.37	+2.45(±0.65)
4	168A-T2+顺铂	15.0+5.00	20.74±1.41	18.39±0.74	-2.35(±1.99)	33	168A-T2	15.0	21.74±0.89	24.20±1.37	+2.45(±0.65)

表3：在第12天和第28天测量到的使用载体、5mg/kg CDDP(方案Q2DX8，G2)、10.0mg/kg 168A-T2(方案Q2DX8，G3)、联合使用10.0mg/kg 168A-T2和5mg/kg CDDP(方案Q2DX8，G4)进行处理的携带CALU-6肿瘤的小鼠的平均体重(MBW)。

平均肿瘤体积(MTV)、平均相对肿瘤体积(MRTV)和肿瘤生长参数(T/C)的结果示于图6、7和表4、5和6中。

与载体组1中的小鼠(1233.44mm³)相比，使用CDDP处理的组2中的小鼠在第28天的MTV(742.44mm³)减小(表4，图6)。使用15mg/kg的测试物质168A-T2每两天注射一次处理的组3的MTV在第28天也减小了(615.96mm³)。MTV减小最多的为组4中的动物(317.17mm³)。组1和使用测试物质治疗的两个组之间的差异达到统计学显著(p＜0.0001与组4-p＝0.003与组3)。组2和组4之间的差异也是显著的(p＝0.001)。相反，组2(CDDP单独)和组3(168A-T2单独)之间未观察到统计学意义上的差异。

表4：携带CALU-6细胞且根据治疗方案Q2DX8使用载体(组1)、CDDP单独(组2)、168A-T2(10.0mg/kg)(组3)或168A-T2和CDDP(组4)联合进行处理的动物的平均肿瘤体积(MTV)。

这些结果得到MRTV分析的确认(表5，图7)。在第28天，组1中动物的MRTV为8.24。在第28天，使用CDDP处理的组2动物的MRTV为5.98；在第28天，使用168A-T2(15mg/kg)处理的组3动物的MRTV为4.51；最后，在第28天，使用CDDP和168A-T2联合处理的组4中动物的MRTV为2.18。

表5：携带CALU-6细胞并根据治疗方案Q2DX8使用载体(组1)、CDDP单独(组2)、168A-T2(10.0mg/kg)(组3)或168A-T2和CDDP(组4)联合进行处理的动物的平均相对肿瘤体积(MRTV)。

如表5和图7所示，在第28天，组4中动物的MRTV达到2,18，这证明了168A-T2与顺铂具有协同效应。而且，单独使用顺铂(组2)或单独使用168A-T2(组3)在第28天显示出接近的MRTV，表明168A-T2也是一种有效的单治疗抗肿瘤剂。

表6：基于T/C比率的生长抑制

作为肿瘤生长抑制参数的T/C比率(表6)显示了测试物质作为单一治疗时的轻微抗肿瘤活性，因为与载体处理的组1相比，它降低肿瘤大小的27％。但是当与CDDP联合使用时，相对于载体处理组1而言，抑制率达肿瘤大小降低74％。

这些结果直接表明，当单独使用或与细胞毒性剂(例如CDDP)联合使用时，168A-T2具有有效的抗肿瘤活性。

序列表

<110>基因信号国际公司

<120>抗肿瘤药物、药剂、组合物及其用途

<130>BCT

<160>23

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>6160

<212>DNA

<213>人类

<400>1

ctcgcgagga gagcggagca ggcgcgcggc ccaggcggag gagcgccgac tctggagcag 60

ccggagctgg aagaggagga ggaggagagg cggcggggaa ggaggaggag ggggagagtc 120

gctcccgccg ggcgagcatg gggcgcctgg cctcgaggcc gctgctgctg gcgctcctgt 180

cgttggctct ttgccgaggg cgtgtggtga gagtccccac agcgaccctg gttcgagtgg 240

tgggcactga gctggtcatc ccctgcaacg tcagtgacta tgatggcccc agcgagcaaa 300

actttgactg gagcttctca tctttgggga gcagctttgt ggagcttgca agcacctggg 360

aggtggggtt cccagcccag ctgtaccagg agcggctgca gaggggcgag atcctgttaa 420

ggcggactgc caacgacgcc gtggagctcc acataaagaa cgtccagcct tcagaccaag 480

gccactacaa atgttcaacc cccagcacag atgccactgt ccagggaaac tatgaggaca 540

cagtgcaggt taaagtgctg gccgactccc tgcacgtggg ccccagcgcg cggcccccgc 600

cgagcctgag cctgcgggag ggggagccct tcgagctgcg ctgcactgcc gcctccgcct 660

cgccgctgca cacgcacctg gcgctgctgt gggaggtgca ccgcggcccg gccaggcgga 720

gcgtcctcgc cctgacccac gagggcaggt tccacccggg cctggggtac gagcagcgct 780

accacagtgg ggacgtgcgc ctcgacaccg tgggcagcga cgcctaccgc ctctcagtgt 840

cccgggctct gtctgccgac cagggctcct acaggtgtat cgtcagcgag tggatcgccg 900

agcagggcaa ctggcaggaa atccaagaaa aggccgtgga agttgccacc gtggtgatcc 960

agccatcagt tctgcgagca gctgtgccca agaatgtgtc tgtggctgaa ggaaaggaac 1020

tggacctgac ctgtaacatc acaacagacc gagccgatga cgtccggccc gaggtgacgt 1080

ggtccttcag caggatgcct gacagcaccc tacctggctc ccgcgtgttg gcgcggcttg 1140

accgtgattc cctggtgcac agctcgcctc atgttgcttt gagtcatgtg gatgcacgct 1200

cctaccattt actggttcgg gatgttagca aagaaaactc tggctactat tactgccacg 1260

tgtccctgtg ggcacccgga cacaacagga gctggcacaa agtggcagag gccgtgtctt 1320

ccccagctgg tgtgggtgtg acctggctag aaccagacta ccaggtgtac ctgaatgctt 1380

ccaaggtccc cgggtttgcg gatgacccca cagagctggc atgccgggtg gtggacacga 1440

agagtgggga ggcgaatgtc cgattcacgg tttcgtggta ctacaggatg aaccggcgca 1500

gcgacaatgt ggtgaccagc gagctgcttg cagtcatgga cggggactgg acgctaaaat 1560

atggagagag gagcaagcag cgggcccagg atggagactt tattttttct aaggaacata 1620

cagacacgtt caatttccgg atccaaagga ctacagagga agacagaggc aattattact 1680

gtgttgtgtc tgcctggacc aaacagcgga acaacagctg ggtgaaaagc aaggatgtct 1740

tctccaagcc tgttaacata ttttgggcat tagaagattc cgtgcttgtg gtgaaggcga 1800

ggcagccaaa gcctttcttt gctgccggaa atacatttga gatgacttgc aaagtatctt 1860

ccaagaatat taagtcgcca cgctactctg ttctcatcat ggctgagaag cctgtcggcg 1920

acctctccag tcccaatgaa acgaagtaca tcatctctct ggaccaggat tctgtggtga 1980

agctggagaa ttggacagat gcatcacggg tggatggcgt tgttttagaa aaagtgcagg 2040

aggatgagtt ccgctatcga atgtaccaga ctcaggtctc agacgcaggg ctgtaccgct 2100

gcatggtgac agcctggtct cctgtcaggg gcagcctttg gcgagaagca gcaaccagtc 2160

tctccaatcc tattgagata gacttccaaa cctcaggtcc tatatttaat gcttctgtgc 2220

attcagacac accatcagta attcggggag atctgatcaa attgttctgt atcatcactg 2280

tcgagggagc agcactggat ccagatgaca tggcctttga tgtgtcctgg tttgcggtgc 2340

actcttttgg cctggacaag gctcctgtgc tcctgtcttc cctggatcgg aagggcatcg 2400

tgaccacctc ccggagggac tggaagagcg acctcagcct ggagcgcgtg agtgtgctgg 2460

aattcttgct gcaagtgcat ggctccgagg accaggactt tggcaactac tactgttccg 2520

tgactccatg ggtgaagtca ccaacaggtt cctggcagaa ggaggcagag atccactcca 2580

agcccgtttt tataactgtg aagatggatg tgctgaacgc cttcaagtat cccttgctga 2640

tcggcgtcgg tctgtccacg gtcatcgggc tcctgtcctg tctcatcggg tactgcagct 2700

cccactggtg ttgtaagaag gaggttcagg agacacggcg cgagcgccgc aggctcatgt 2760

cgatggagat ggactaggct ggcccgggag gggagtgaca gagggacgtt ctaggagcaa 2820

ttggggcaag aagaggacag tgatatttta aaacaaagtg tgttacacta aaaaccagtc 2880

ctctctaatc tcaggtggga cttggcgctc tctcttttct gcatgtcaag ttctgagcgc 2940

ggacatgttt accagcacac ggctcttctt cccacggcac tttctgatgt aacaatcgag 3000

tgtgtgtttt cccaactgca gctttttaat ggttaacctt catctaattt tttttctccc 3060

actggtttat agatcctctg acttgtgtgt gtttatagct tttgtttcgc ggggttgtgg 3120

tgaggaaggg gtgatggcat gcggagttct ttatcttcag tgagaatgtg cctgcccgcc 3180

tgagagccag cttccgcgtt ggaggcacgt gttcagagag ctgctgagcg ccaccctcta 3240

cccggctgac agacaacaca gacctgtgcc gaaggctaat ttgtggcttt tacgacccta 3300

ccccaccccc tgttttcagg ggtttagact acatttgaaa tccaaacttg gagtatataa 3360

cttcttattg agcccaactg cttttttttt tttttttttt gcttctctgc cccttttcca 3420

tttcttttgt atttgttttc tgtgagagca ctgaaatggc agccctggaa tctacaattt 3480

ggctctccac tgagcacctt atcttgccac cttagcctta agaatgaata tgaagaaaaa 3540

tacacagcca cctctgtcca gggcagtaag aagggctgca aggaagggga ggatggggac 3600

aaggaaagga tcagatacct gctccagtag ttgtgaggcc actgtgtctc aggggactcc 3660

aggaggagca gaagagggat cccacgaagt tattcttacg cagctggggc caggagggtc 3720

agagtggtgc caggtgcaag ttaggctaaa gaagccacca ctattcctct ctcttgccca 3780

ttgtgggggg caaaggcatt ggtcaccaag agtcttgcag ggggacccac agatatgcca 3840

tgtccttcac acgtgcttgg gctccttaac ctgaaggcaa attgctactt gcaagactga 3900

ctgacttcaa ggaatcagaa attacctaga agcaccatgt tttttctatg accttttcag 3960

tccttcaggt cattttaagg tccactgcag ggggttagtg agaaagggta tactttgtgg 4020

tatgttttgc tttcctaata gggacatgaa ggaaacccag caatttgctg ttatgtgaat 4080

ggcctgtaga gcagagtcaa gagcggtgtg ctttgcccga ctgctcccat caggaatagg 4140

agagtagaca gagatcttcc acatcccagg cttctgctgc tgctttaaaa gctctgtcct 4200

tggagcctcc cgctccctga agtgtctcgc cccctgcaca gcactggcct ttcggaagca 4260

tcccagtagg gttttctgag gctcgctggt gactcatgcc ctaattgcaa tcctctgctt 4320

ttatcttgac tttgaaggat ctaacactgc tctctcttcc aaaggggaaa aaaagattca 4380

tttgttttga gcaataaact aatacaaaat gatggccatt catgtgcagc tctttgtcac 4440

catgggccgg atgagttgtg ctcctcctgg ctcaccattt ccccctgctc ccccacagcc 4500

ggttctgcac ttatcaccga gtcgcccctg gaagcagatt cccattgagt tttccccacc 4560

aaggggacca tgcacatggt agaaacatta gattctgcat tgacagtagc ctttccttgg 4620

cccgggcctg tggtgggaag acgggcaaca agtatacccc accagggcct gagtgactag 4680

aggaagagga cgaggccttg ttggcactag atttgggtat tttctgcatg tcataacata 4740

tcctaactgc tatttcagaa gaggcagctt gtaggtgatt gtacaagtga gaattaaaga 4800

gagaacagat atttaaacag gtgctgtatt agtaacagcc agtgcccttt cagcccttgc 4860

atctattaaa aggagattca ggattttatt ggcacaggcc cttcttagta ggaagaaagg 4920

gtgcttagct ttggacctga ccgggtgtgt gtaaaaccat ggactgagtc acagcagaca 4980

ctcgatggtg gtaaatgtga tgggtgctta cacactgtac cttttccttt catactgatg 5040

ctgcagttca gggctggagt tgttaaggca ttgacctcca cccacctgcc ccatgtccac 5100

tgggctgccc aagctgcatg tcacctgagg gctggcagga aggggcgaga aatcccaggg 5160

cattgtacca aggacctagt tccttctagg gatataaatt tccaggaatg tgtattttta 5220

atgtggtgag atgcactctt ttgttgtacc aaatagggct ccccacccca cccctgcgac 5280

aagtgctctt ctagaacagg ttcctaccag cagcactggt gtgaatgaaa gagagaccca 5340

gccgcgtctc acacaggtgg aattgcactt cttaacaaaa aggaacttta taaaagtttg 5400

ggattttttt tcctaatcat aaaaatagcc ccagaaagag cctaagctat gttcagatag 5460

aagcctcgaa attcctgtaa attgtttact ttatgatgtt tacatacacg tttcactttg 5520

aaaaaaaatg caaatcgact ttttaacaac tgttgagatg tttcatggga cagtagaact 5580

ctgactcacc aactgggcta aattttaatt taaaaatgta tttatttgag tgtctttccc 5640

cccctcaccc tcaccatctg aggggctccc tgagatcttg gtagaggagg cccctcctgc 5700

ccagaccttc gtttgtttcc ccggtggccc ttgcttcttg ctttgcagac tgcctgcagc 5760

catgattttg tcactgacat ctgtgagcca aagactgagc ctttttggca ggaataataa 5820

gcaatactac acaacttgct actttcagaa aacttttttt tagcttcacc gatgacaaca 5880

gaggaagaag ggaactggga tttgggtaag ttctcctcca ctgtttgacc aaattctcag 5940

tgataaatat gtgtgcagat ccctagaaga gaaaacgctg actttctttt taagtgtggc 6000

acataaggat ctgcagaatt ttccgtagac aaagaaagga tcttgtgtat ttttgtccat 6060

atccaatgtt atatgaacta attgtattgt tttatactgt gaccacaaat attatgcaat 6120

gcaccatttg ttttttattt cattaaagga agtttaattt 6160

<210>2

<211>924

<212>PRT

<213>人类

<400>2

Arg Glu Glu Ser Gly Ala Gly Ala Arg Pro Arg Arg Arg Ser Ala Asp

1 5 10 15

Ser Gly Ala Ala Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gly Gly Glu Ala Ala Gly

20 25 30

Lys Glu Glu Glu Gly Glu Ser Arg Ser Arg Arg Ala Ser Met Gly Arg

35 40 45

Leu Ala Ser Arg Pro Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ala Leu Cys

50 55 60

Arg Gly Arg Val Val Arg Val Pro Thr Ala Thr Leu Val Arg Val Val

65 70 75 80

Gly Thr Glu Leu Val Ile Pro Cys Asn Val Ser Asp Tyr Asp Gly Pro

85 90 95

Ser Glu Gln Asn Phe Asp Trp Ser Phe Ser Ser Leu Gly Ser Ser Phe

100 105 110

Val Glu Leu Ala Ser Thr Trp Glu Val Gly Phe Pro Ala Gln Leu Tyr

115 120 125

Gln Glu Arg Leu Gln Arg Gly Glu Ile Leu Leu Arg Arg Thr Ala Asn

130 135 140

Asp Ala Val Glu Leu His Ile Lys Asn Val Gln Pro Ser Asp Gln Gly

145 150 155 160

His Tyr Lys Cys Ser Thr Pro Ser Thr Asp Ala Thr Val Gln Gly Asn

165 170 175

Tyr Glu Asp Thr Val Gln Val Lys Val Leu Ala Asp Ser Leu His Val

180 185 190

Gly Pro Ser Ala Arg Pro Pro Pro Ser Leu Ser Leu Arg Glu Gly Glu

195 200 205

Pro Phe Glu Leu Arg Cys Thr Ala Ala Ser Ala Ser Pro Leu His Thr

210 215 220

His Leu Ala Leu Leu Trp Glu Val His Arg Gly Pro Ala Arg Arg Ser

225 230 235 240

Val Leu Ala Leu Thr His Glu Gly Arg Phe His Pro Gly Leu Gly Tyr

245 250 255

Glu Gln Arg Tyr His Ser Gly Asp Val Arg Leu Asp Thr Val Gly Ser

260 265 270

Asp Ala Tyr Arg Leu Ser Val Ser Arg Ala Leu Ser Ala Asp Gln Gly

275 280 285

Ser Tyr Arg Cys Ile Val Ser Glu Trp Ile Ala Glu Gln Gly Asn Trp

290 295 300

Gln Glu Ile Gln Glu Lys Ala Val Glu Val Ala Thr Val Val Ile Gln

305 310 315 320

Pro Ser Val Leu Arg Ala Ala Val Pro Lys Asn Val Ser Val Ala Glu

325 330 335

Gly Lys Glu Leu Asp Leu Thr Cys Asn Ile Thr Thr Asp Arg Ala Asp

340 345 350

Asp Val Arg Pro Glu Val Thr Trp Ser Phe Ser Arg Met Pro Asp Ser

355 360 365

Thr Leu Pro Gly Ser Arg Val Leu Ala Arg Leu Asp Arg Asp Ser Leu

370 375 380

Val His Ser Ser Pro His Val Ala Leu Ser His Val Asp Ala Arg Ser

385 390 395 400

Tyr His Leu Leu Val Arg Asp Val Ser Lys Glu Asn Ser Gly Tyr Tyr

405 410 415

Tyr Cys His Val Ser Leu Trp Ala Pro Gly His Asn Arg Ser Trp His

420 425 430

Lys Val Ala Glu Ala Val Ser Ser Pro Ala Gly Val Gly Val Thr Trp

435 440 445

Leu Glu Pro Asp Tyr Gln Val Tyr Leu Asn Ala Ser Lys Val Pro Gly

450 455 460

Phe Ala Asp Asp Pro Thr Glu Leu Ala Cys Arg Val Val Asp Thr Lys

465 470 475 480

Ser Gly Glu Ala Asn Val Arg Phe Thr Val Ser Trp Tyr Tyr Arg Met

485 490 495

Asn Arg Arg Ser Asp Asn Val Val Thr Ser Glu Leu Leu Ala Val Met

500 505 510

Asp Gly Asp Trp Thr Leu Lys Tyr Gly Glu Arg Ser Lys Gln Arg Ala

515 520 525

Gln Asp Gly Asp Phe Ile Phe Ser Lys Glu His Thr Asp Thr Phe Asn

530 535 540

Phe Arg Ile Gln Arg Thr Thr Glu Glu Asp Arg Gly Asn Tyr Tyr Cys

545 550 555 560

Val Val Ser Ala Trp Thr Lys Gln Arg Asn Asn Ser Trp Val Lys Ser

565 570 575

Lys Asp Val Phe Ser Lys Pro Val Asn Ile Phe Trp Ala Leu Glu Asp

580 585 590

Ser Val Leu Val Val Lys Ala Arg Gln Pro Lys Pro Phe Phe Ala Ala

595 600 605

Gly Asn Thr Phe Glu Met Thr Cys Lys Val Ser Ser Lys Asn Ile Lys

610 615 620

Ser Pro Arg Tyr Ser Val Leu Ile Met Ala Glu Lys Pro Val Gly Asp

625 630 635 640

Leu Ser Ser Pro Asn Glu Thr Lys Tyr Ile Ile Ser Leu Asp Gln Asp

645 650 655

Ser Val Val Lys Leu Glu Asn Trp Thr Asp Ala Ser Arg Val Asp Gly

660 665 670

Val Val Leu Glu Lys Val Gln Glu Asp Glu Phe Arg Tyr Arg Met Tyr

675 680 685

Gln Thr Gln Val Ser Asp Ala Gly Leu Tyr Arg Cys Met Val Thr Ala

690 695 700

Trp Ser Pro Val Arg Gly Ser Leu Trp Arg Glu Ala Ala Thr Ser Leu

705 710 715 720

Ser Asn Pro Ile Glu Ile Asp Phe Gln Thr Ser Gly Pro Ile Phe Asn

725 730 735

Ala Ser Val His Ser Asp Thr Pro Ser Val Ile Arg Gly Asp Leu Ile

740 745 750

Lys Leu Phe Cys Ile Ile Thr Val Glu Gly Ala Ala Leu Asp Pro Asp

755 760 765

Asp Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser Phe Gly Leu

770 775 780

Asp Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val

785 790 795 800

Thr Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu Glu Arg Val

805 810 815

Ser Val Leu Glu Phe Leu Leu Gln Val His Gly Ser Glu Asp Gln Asp

820 825 830

Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser Val Thr Pro Trp Val Lys Ser Pro Thr

835 840 845

Gly Ser Trp Gln Lys Glu Ala Glu Ile His Ser Lys Pro Val Phe Ile

850 855 860

Thr Val Lys Met Asp Val Leu Asn Ala Phe Lys Tyr Pro Leu Leu Ile

865 870 875 880

Gly Val Gly Leu Ser Thr Val Ile Gly Leu Leu Ser Cys Leu Ile Gly

885 890 895

Tyr Cys Ser Ser His Trp Cys Cys Lys Lys Glu Val Gln Glu Thr Arg

900 905 910

Arg Glu Arg Arg Arg Leu Met Ser Met Glu Met Asp

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<210>3

<211>327

<212>DNA

<213>人类

<400>3

atggcctttg atgtgtcctg gtttgcggtg cactcttttg gcctggacaa ggctcctgtg 60

ctcctgtctt ccctggatcg gaagggcatc gtgaccacct cccggaggga ctggaagagc 120

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gaccaggact ttggcaacta ctactgttcc gtgactccat gggtgaagtc accaacaggt 240

tcctggcaga aggaggcaga gatccactcc aagcccgttt ttataactgt gaagatggat 300

gtgctgaacg ccttcaagta tccctga 327

<210>4

<211>108

<212>PRT

<213>人类

<400>4

Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp

1 5 10 15

Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val Thr

20 25 30

Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu Glu Arg Val Ser

35 40 45

Val Leu Glu Phe Leu Leu Gln Val His Gly Ser Glu Asp Gln Asp Phe

50 55 60

Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser Val Thr Pro Trp Val Lys Ser Pro Thr Gly

65 70 75 80

Ser Trp Gln Lys Glu Ala Glu Ile His Ser Lys Pro Val Phe Ile Thr

85 90 95

Val Lys Met Asp Val Leu Asn Ala Phe Lys Tyr Pro

100 105

<210>5

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<212>DNA

<213>人类

<220>

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<222>(960)..(960)

<223>n is a，c，g，or t

<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<222>(1047)..(1047)

<223>n is a，c，g，or t

<400>5

ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacatat gcaccatcat 60

catcatcatt cttctggtct ggtgccacgc ggttctggta tgaaagaaac cgctgctgct 120

aaattcgaac gccagcacat ggacagccca gatctgggta ccgatgacga cgacaagatg 180

gcctttgatg tgtcctggtt tgcggtgcac tcttttggcc tggacaaggc tcctgtgctc 240

ctgtcttccc tggatcggaa gggcatcgtg accacctccc ggagggactg gaagagcgac 300

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caggactttg gcaactacta ctgttccgtg actccatggg tgaagtcacc aacaggttcc 420

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agatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca 660

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gggctccctt tagggttccg atttagtgct tacggccctc gaccccaaaa acttgattan 960

ggngatggtt cacgtanngg ncatcccctg atannngntt ttcgcctttg anntggagnc 1020

ccnttcttna tagggnacct tgttccnaa 1049

<210>6

<211>151

<212>PRT

<213>人类

<400>6

Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser

1 5 10 15

Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp

20 25 30

Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Phe Asp Val

35 40 45

Ser Trp Phe Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp Lys Ala Pro Val Leu

50 55 60

Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val Thr Thr Ser Arg Arg Asp

65 70 75 80

Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu Glu Arg Val Ser Val Leu Glu Phe Leu

85 90 95

Leu Gln Val His Gly Ser Glu Asp Gln Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ser Val Thr Pro Trp Val Lys Ser Pro Thr Gly Ser Trp Gln Lys Glu

115 120 125

Ala Glu Ile His Ser Lys Pro Val Phe Ile Thr Val Lys Met Asp Val

130 135 140

Leu Asn Ala Phe Lys Tyr Pro

145 150

<210>7

<211>90

<212>PRT

<213>人类

<400>7

Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp

1 5 10 15

Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val Thr

20 25 30

Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu Glu Arg Val Ser

35 40 45

Val Leu Glu Phe Leu Leu Gln Val His Gly Ser Glu Asp Gln Asp Phe

50 55 60

Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser Val Thr Pro Trp Val Lys Ser Pro Thr Gly

65 70 75 80

Ser Trp Gln Lys Glu Ala Glu Ile His Ser

85 90

<210>8

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<212>PRT

<213>人类

<400>8

Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp

1 5 10 15

Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val Thr

20 25 30

Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu Glu Arg Val Ser

35 40 45

Val Leu Glu Phe Leu Leu Gln Val His Gly Ser Glu Asp Gln Asp Phe

50 55 60

Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser Val Thr Pro Trp Val Lys Ser

65 70 75

<210>9

<211>66

<212>PRT

<213>人类

<400>9

Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp

1 5 10 15

Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val Thr

20 25 30

Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu Glu Arg Val Ser

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Val Leu Glu Phe Leu Leu Gln Val His Gly Ser Glu Asp Gln Asp Phe

50 55 60

Gly Asn

65

<210>10

<211>51

<212>PRT

<213>人类

<400>10

Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp

1 5 10 15

Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val Thr

20 25 30

Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu Glu Arg Val Ser

35 40 45

Val Leu Glu

50

<210>11

<211>37

<212>PRT

<213>人类

<400>11

Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp

1 5 10 15

Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val Thr

20 25 30

Thr Ser Arg Arg Asp

35

<210>12

<211>20

<212>PRT

<213>人类

<400>12

Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp

1 5 10 15

Lys Ala Pro Val

20

<210>13

<211>270

<212>DNA

<213>人类

<400>13

atggcctttg atgtgtcctg gtttgcggtg cactcttttg gcctggacaa ggctcctgtg 60

ctcctgtctt ccctggatcg gaagggcatc gtgaccacct cccggaggga ctggaagagc 120

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<210>14

<211>231

<212>DNA

<213>人类

<400>14

atggcctttg atgtgtcctg gtttgcggtg cactcttttg gcctggacaa ggctcctgtg 60

ctcctgtctt ccctggatcg gaagggcatc gtgaccacct cccggaggga ctggaagagc 120

gacctcagcc tggagcgcgt gagtgtgctg gaattcttgc tgcaagtgca tggctccgag 180

gaccaggact ttggcaacta ctactgttcc gtgactccat gggtgaagtc a 231

<210>15

<211>198

<212>DNA

<213>人类

<400>15

atggcctttg atgtgtcctg gtttgcggtg cactcttttg gcctggacaa ggctcctgtg 60

ctcctgtctt ccctggatcg gaagggcatc gtgaccacct cccggaggga ctggaagagc 120

gacctcagcc tggagcgcgt gagtgtgctg gaattcttgc tgcaagtgca tggctccgag 180

gaccaggact ttggcaac 198

<210>16

<211>153

<212>DNA

<213>人类

<400>16

atggcctttg atgtgtcctg gtttgcggtg cactcttttg gcctggacaa ggctcctgtg 60

ctcctgtctt ccctggatcg gaagggcatc gtgaccacct cccggaggga ctggaagagc 120

gacctcagcc tggagcgcgt gagtgtgctg gaa 153

<210>17

<211>111

<212>DNA

<213>人类

<400>17

atggcctttg atgtgtcctg gtttgcggtg cactcttttg gcctggacaa ggctcctgtg 60

ctcctgtctt ccctggatcg gaagggcatc gtgaccacct cccggaggga c 111

<210>18

<211>60

<212>DNA

<213>人类

<400>18

atggcctttg atgtgtcctg gtttgcggtg cactcttttg gcctggacaa ggctcctgtg 60

<210>19

<211>37

<212>DNA

<213>人类

<400>19

gacgacgaca agatggcctt tgatgtgtcc tggtttg 37

<210>20

<211>43

<212>DNA

<213>人类

<400>20

gaggagaagc ccggttcagg gatacttgaa ggcgttcagc aca 43

<210>21

<211>6172

<212>DNA

<213>人类

<400>21

ctcgcgagga gagcggagca ggcgcgcggc ccaggcggag gagcgccgac tctggagcag 60

ccggagctgg aagaggagga ggaggagagg cggcggggaa ggaggaggag ggggagagtc 120

gctcccgccg ggcgagcatg gggcgcctgg cctcgaggcc gctgctgctg gcgctcctgt 180

cgttggctct ttgccgaggg cgtgtggtga gagtccccac agcgaccctg gttcgagtgg 240

tgggcactga gctggtcatc ccctgcaacg tcagtgacta tgatggcccc agcgagcaaa 300

actttgactg gagcttctca tctttgggga gcagctttgt ggagcttgca agcacctggg 360

aggtggggtt cccagcccag ctgtaccagg agcggctgca gaggggcgag atcctgttaa 420

ggcggactgc caacgacgcc gtggagctcc acataaagaa cgtccagcct tcagaccaag 480

gccactacaa atgttcaacc cccagcacag atgccactgt ccagggaaac tatgaggaca 540

cagtgcaggt taaagtgctg gccgactccc tgcacgtggg ccccagcgcg cggcccccgc 600

cgagcctgag cctgcgggag ggggagccct tcgagctgcg ctgcactgcc gcctccgcct 660

cgccgctgca cacgcacctg gcgctgctgt gggaggtgca ccgcggcccg gccaggcgga 720

gcgtcctcgc cctgacccac gagggcaggt tccacccggg cctggggtac gagcagcgct 780

accacagtgg ggacgtgcgc ctcgacaccg tgggcagcga cgcctaccgc ctctcagtgt 840

cccgggctct gtctgccgac cagggctcct acaggtgtat cgtcagcgag tggatcgccg 900

agcagggcaa ctggcaggaa atccaagaaa aggccgtgga agttgccacc gtggtgatcc 960

agccgacagt tctgcgagca gctgtgccca agaatgtgtc tgtggctgaa ggaaaggaac 1020

tggacctgac ctgtaacatc acaacagacc gagccgatga cgtccggccc gaggtgacgt 1080

ggtccttcag caggatgcct gacagcaccc tacctggctc ccgcgtgttg gcgcggcttg 1140

accgtgattc cctggtgcac agctcgcctc atgttgcttt gagtcatgtg gatgcacgct 1200

cctaccattt actggttcgg gatgttagca aagaaaactc tggctactat tactgccacg 1260

tgtccctgtg ggcacccgga cacaacagga gctggcacaa agtggcagag gccgtgtctt 1320

ccccagctgg tgtgggtgtg acctggctag aaccagacta ccaggtgtac ctgaatgctt 1380

ccaaggtccc cgggtttgcg gatgacccca cagagctggc atgccaggtg gtggacacga 1440

agagtgggga ggcgaatgtc cgattcacgg tttcgtggta ctacaggatg aaccggcgca 1500

gcgacaatgt ggtgaccagc gagctgcttg cagtcatgga cggggactgg acgctaaaat 1560

atggagagag gagcaagcag cgggcccagg atggagactt tattttttct aaggaacata 1620

cagacacgtt caatttccgg atccaaagga ctacagagga agacagaggc aattattact 1680

gtgttgtgtc tgcctggacc aaacagcgga acaacagctg ggtgaaaagc aaggatgtct 1740

tctccaagcc tgttaacata ttttgggcat tagaagattc cgtgcttgtg gtgaaggcga 1800

ggcagccaaa gcctttcttt gctgccggaa atacatttga gatgacttgc aaagtatctt 1860

ccaagaatat taagtcgcca cgctactctg ttctcatcat ggctgagaag cctgtcggcg 1920

acctctccag tcccaatgaa acgaagtaca tcatctctct ggaccaggat tctgtggtga 1980

agctggagaa ttggacagat gcatcacggg tggatggcgt tgttttagaa aaagtgcagg 2040

aggatgagtt ccgctatcga atgtaccaga ctcaggtctc agacgcaggg ctgtaccgct 2100

gcatggtgac agcctggtct cctgtcaggg gcagcctttg gcgagaagca gcaaccagtc 2160

tctccaatcc tattgagata gacttccaaa cctcaggtcc tatatttaat gcttctgtgc 2220

attcagacac accatcagta attcggggag atctgatcaa attgttctgt atcatcactg 2280

tcgagggagc agcactggat ccagatgaca tggcctttga tgtgtcctgg tttgcggtgc 2340

actcttttgg cctggacaag gctcctgtgc tcctgtcttc cctggatcgg aagggcatcg 2400

tgaccacctc ccggagggac tggaagagcg acctcagcct ggagcgcgtg agtgtgctgg 2460

aattcttgct gcaagtgcat ggctccgagg accaggactt tggcaactac tactgttccg 2520

tgactccatg ggtgaagtca ccaacaggtt cctggcagaa ggaggcagag atccactcca 2580

agcccgtttt tataactgtg aagatggatg tgctgaacgc cttcaagtat cccttgctga 2640

tcggcatcgg tctgtccacg gtcatcgggc tcctgtcctg tctcatcggg tactgcagct 2700

cccactggtg ttgtaagaag gaggttcagg agacacggcg cgagcgccgc aggctcatgt 2760

cgatggagat ggactaggct ggcccgggag gggagtgaca gagggacgtt ctaggagcaa 2820

ttggggcaag aagaggacag tgatatttta aaacaaagtg tgttacacta aaaaccagtc 2880

ctctctaatc tcaggtggga cttggcgctc tctcttttct gcatgtcaag ttctgagcgc 2940

ggacatgttt accagcacac ggctcttctt cccacggcac tttctgatgt aacaatcgag 3000

tgtgtgtttt cccaactgca gctttttaat ggttaacctt catctaattt tttttctccc 3060

actggtttat agatcctctg acttgtgtgt gtttatagct tttgtttcgc ggggttgtgg 3120

tgaggaaggg gtgatggcat gcggagttct ttatcttcag tgagaatgtg cctgcccgcc 3180

tgagagccag cttccgcgtt ggaggcacgt gttcagagag ctgctgagcg ccaccctcta 3240

cccggctgac agacaacaca gacctgtgcc gaaggctaat ttgtggcttt tacgacccta 3300

ccccaccccc tgttttcagg ggtttagact acatttgaaa tccaaacttg gagtatataa 3360

cttttttttg agcccaactg cttttttttt tttttttttt gcttctctgc cccttttcca 3420

tttcttttgt atttgttttc tgtgagagca ctgaaatggc agccctggaa tctacaattt 3480

ggctctccac tgagcacctt atcttgccac cttagcctta agaatgaata tgaagaaaaa 3540

tacacagcca cctctgtcca gggcagtaag aagggctgca aggaagggga ggatggggac 3600

aaggaaagga tcagatacct gctccagtag ttgtgaggcc actgtgtctc aggggactcc 3660

aggaggagca gaagagggat cccacgaagt tattcttacg cagctggggc caggagggtc 3720

agagtggtgc caggtgcaag ttaggctaaa gaagccacca ctattcctct ctcttgccca 3780

ttgtgggggg caaaggcatt ggtcaccaag agtcttgcag ggggacccac agatatgcca 3840

tgtccttcac acgtgcttgg gctccttaac ctgaaggcaa attgctactt gcaagactga 3900

ctgacttcaa ggaatcagaa attacctaga agcaccatgt tttttctatg accttttcag 3960

tccttcaggt cattttaagg tccactgcag ggggttagtg agaaagggta tactttgtgg 4020

tatgttttgc tttcctaata gggacatgaa ggaaacccag caatttgctg ttatgtgaat 4080

ggcctgtaga gcagagtcaa gagcggtgtg ctttgcccga ctgctcccat caggaatagg 4140

agagtagaca gagatcttcc acatcccagg cttctgctgc tgctttaaaa gctctgtcct 4200

tggagcctcc cgctccctga agtgtctcgc cccctgcaca gcactggcct ttcggaagca 4260

tcccagtagg gttttctgag gctcgctggt gactcatgcc ctaattgcaa tcctctgctt 4320

ttatcttgac tttgaaggat ctaacactgc tctctcttcc aaaggggaaa aaaagattca 4380

tttgttttga gcaataaact aatacaaaat gatggccatt catgtgcagc tctttgtcac 4440

catgggccgg atgagttgtg ctcctcctgg ctcaccattt ccccctgctc ccccacagcc 4500

ggttctgcac ttatcaccga gtcgcccctg gaagcagatt cccattgagt tttccccacc 4560

aaggggacca tgcacatggt agaaacatta gattctgcat tgacagtagc ctttccttgg 4620

cccgggcctg tggtgggaag acgggcaaca agtatacccc accagggcct gagtgactag 4680

aggaagagga cgaggccttg ttggcactag atttgggtat tttctgcatg tcataacata 4740

tcctaactgc tatttcagaa gaggcagctt gtaggtgatt gtacaagtga gaattaaaga 4800

gagaacaaat atttaaacag gtgctgtatt agtaacagcc agtgcccttt cagcccttgc 4860

atctattaaa aggagattca ggattttatt ggcacaggcc cttcttagta ggaagaaagg 4920

gtgcttagct ttggacctga ccgggtgtgt gtaaaaccat ggactgagtc acagcagaca 4980

ctcgatggtg gtaaatgtga tgggtgctta cacactgtac cttttccttt catactgatg 5040

ctgcagttca gggctggagt tgttaaggca ttgacctcca cccacctgcc ccatgtccac 5100

tgggctgccc aagctgcatg tcacctgagg gctggcagga aggggcgaga aatcccaggg 5160

cattgtacca aggacctagt tccttctagg gatataaatt tccaggaatg tgtattttta 5220

atgtggtgag atgcactctt ttgttgtacc aaatagggct ccccacccca cccctgcgac 5280

aagtgctctt ctagaacagg ttcctaccag cagcactggt gtgaatgaaa gagagaccca 5340

gccgcgtctc acacaggtgg aattgcactt cttaacaaaa aggaacttta taaaagtttg 5400

ggattttttt tcctaatcat aaaaatagcc ccagaaagag cctaagctat gttcagatag 5460

aagcctcgaa attcctgtaa attgtttact ttatgatgtt tacatacacg tttcactttg 5520

aaaaaaaatg caaatcgact ttttaacaac tgttgagatg tttcatggga cagtagaact 5580

ctgactcacc aactgggcta aattttaatt taaaaatgta tttatttgag tgtctttccc 5640

cccctcaccc tcaccatctg aggggctccc tgagatcttg gtagaggagg cccctcctgc 5700

ccagaccttc gtttgtttcc ccggtggccc ttgcttcttg ctttgcagac tgcctgcagc 5760

catgattttg tcactgacat ctgtgagcca aagactgagc ctttttggca ggaataataa 5820

gcaatactac acaacttgct actttcagaa aacttttttt tagcttcacc gatgacaaca 5880

gaggaagaag ggaactggga tttgggtaag ttctcctcca ctgtttgacc aaattctcag 5940

tgataaatat gtgtgcagat ccctagaaga gaaaacgctg actttctttt taagtgtggc 6000

acataaggat ctgcagaatt ttccgtagac aaagaaagga tcttgtgtat ttttgtccat 6060

atccaatgtt atatgaacta attgtattgt tttatactgt gaccacaaat attatgcaat 6120

gcaccatttg ttttttattt cattaaagga agtttaattt aaaaaaaaaa aa 6172

<210>22

<211>863

<212>PRT

<213>人类

<400>22

Met Gly Arg Leu Ala Ser Arg Pro Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Ala Leu Cys Arg Gly Arg Val Val Arg Val Pro Asn Val Ser Asp Tyr

20 25 30

Asp Gly Pro Ser Glu Gln Asn Phe Asp Trp Ser Phe Ser Ser Leu Gly

35 40 45

Ser Ser Phe Val Glu Leu Ala Ser Thr Trp Glu Val Gly Phe Pro Ala

50 55 60

Gln Leu Tyr Gln Glu Arg Leu Gln Arg Gly Glu Ile Leu Leu Arg Arg

65 70 75 80

Thr Ala Asn Asp Ala Val Glu Leu His Ile Lys Asn Val Gln Pro Ser

85 90 95

Asp Gln Gly His Tyr Lys Cys Ser Thr Pro Ser Thr Asp Ala Thr Val

100 105 110

Gln Gly Asn Tyr Glu Asp Thr Val Gln Val Lys Val Leu Ala Asp Ser

115 120 125

Leu His Val Gly Pro Ser Ala Arg Pro Pro Pro Ser Leu Ser Leu Arg

130 135 140

Glu Gly Glu Pro Phe Glu Leu Arg Cys Thr Ala Ala Ser Ala Ser Pro

145 150 155 160

Leu His Thr His Leu Ala Leu Leu Trp Glu Val His Arg Gly Pro Ala

165 170 175

Arg Arg Ser Val Leu Ala Leu Thr His Glu Gly Arg Phe His Pro Gly

180 185 190

Leu Gly Tyr Glu Gln Arg Tyr His Ser Gly Asp Val Arg Leu Asp Thr

195 200 205

Val Gly Ser Asp Ala Tyr Arg Leu Ser Val Ser Arg Ala Leu Ser Ala

210 215 220

Asp Gln Gly Ser Tyr Arg Cys Ile Val Ser Glu Trp Ile Ala Glu Gln

225 230 235 240

Gly Asn Trp Gln Glu Ile Gln Glu Lys Ala Val Glu Val Ala Thr Val

245 250 255

Val Ile Gln Pro Thr Val Leu Arg Ala Ala Val Pro Lys Asn Val Ser

260 265 270

Val Ala Glu Gly Lys Glu Leu Asp Leu Thr Cys Asn Ile Thr Thr Asp

275 280 285

Arg Ala Asp Asp Val Arg Pro Glu Val Thr Trp Ser Phe Ser Arg Met

290 295 300

Pro Asp Ser Thr Leu Pro Gly Ser Arg Val Leu Ala Arg Leu Asp Arg

305 310 315 320

Asp Ser Leu Val His Ser Ser Pro His Val Ala Leu Ser His Val Asp

325 330 335

Ala Arg Ser Tyr His Leu Leu Val Arg Asp Val Ser Lys Glu Asn Ser

340 345 350

Gly Tyr Tyr Tyr Cys His Val Ser Leu Trp Ala Pro Gly His Asn Arg

355 360 365

Ser Trp His Lys Val Ala Glu Ala Val Ser Ser pro Ala Gly Val Gly

370 375 380

Val Thr Trp Leu Glu Pro Asp Tyr Gln Val Tyr Leu Asn Ala Ser Lys

385 390 395 400

Val Pro Gly Phe Ala Asp Asp Pro Thr Glu Leu Ala Cys Gln Val Val

405 410 415

Asp Thr Lys Ser Gly Glu Ala Asn Val Arg Phe Thr Val Ser Trp Tyr

420 425 430

Tyr Arg Met Asn Arg Arg Ser Asp Asn Val Val Thr Ser Glu Leu Leu

435 440 445

Ala Val Met Asp Gly Asp Trp Thr Leu Lys Tyr Gly Glu Arg Ser Lys

450 455 460

Gln Arg Ala Gln Asp Gly Asp Phe Ile Phe Ser Lys Glu His Thr Asp

465 470 475 480

Thr Phe Asn Phe Arg Ile Gln Arg Thr Thr Glu Glu Asp Arg Gly Asn

485 490 495

Tyr Tyr Cys Val Val Ser Ala Trp Thr Lys Gln Arg Asn Asn Ser Trp

500 505 510

Val Lys Ser Lys Asp Val Phe Ser Lys Pro Val Asn Ile Phe Trp Ala

515 520 525

Leu Glu Asp Ser Val Leu Val Val Lys Ala Arg Gln Pro Lys Pro Phe

530 535 540

Phe Ala Ala Gly Asn Thr Phe Glu Met Thr Cys Lys Val Ser Ser Lys

545 550 555 560

Asn Ile Lys Ser Pro Arg Tyr Ser Val Leu Ile Met Ala Glu Lys Pro

565 570 575

Val Gly Asp Leu Ser Ser Pro Asn Glu Thr Lys Tyr Ile Ile Ser Leu

580 585 590

Asp Gln Asp Ser Val Val Lys Leu Glu Asn Trp Thr Asp Ala Ser Arg

595 600 605

Val Asp Gly Val Val Leu Glu Lys Val Gln Glu Asp Glu Phe Arg Tyr

610 615 620

Arg Met Tyr Gln Thr Gln Val Ser Asp Ala Gly Leu Tyr Arg Cys Met

625 630 635 640

Val Thr Ala Trp Ser Pro Val Arg Gly Ser Leu Trp Arg Glu Ala Ala

645 650 655

Thr Ser Leu Ser Ash Pro Ile Glu Ile Asp Phe Gln Thr Ser Gly Pro

660 665 670

Ile Phe Asn Ala Ser Val His Ser Asp Thr Pro Ser Val Ile Arg Gly

675 680 685

Asp Leu Ile Lys Leu Phe Cys Ile Ile Thr Val Glu Gly Ala Ala Leu

690 695 700

Asp Pro Asp Asp Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser

705 710 715 720

Phe Gly Leu Asp Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys

725 730 735

G1y Ile Val Thr Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu

740 745 750

Glu Arg Val Ser Val Leu Glu Phe Leu Leu Gln Val His Gly Ser Glu

755 760 765

Asp Gln Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser Val Thr Pro Trp Val Lys

770 775 780

Ser Pro Thr Gly Ser Trp Gln Lys Glu Ala Glu Ile His Ser Lys Pro

785 790 795 800

Val Phe Ile Thr Val Lys Met Asp Val Leu Asn Ala Phe Lys Tyr Pro

805 810 815

Leu Leu Ile Gly Ile Gly Leu Ser Thr Val Ile Gly Leu Leu Ser Cys

820 825 830

Leu Ile Gly Tyr Cys Ser Ser His Trp Cys Cys Lys Lys Glu Val Gln

835 840 845

Glu Thr Arg Arg Glu Arg Arg Arg Leu Met Ser Met Glu Met Asp

850 855 860

<210>23

<211>2197

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<222>(1037)..(1037)

<223>n is a，c，g，or t

<220>

<221>misc_feature

<222>(1236)..(1236)

<223>n is a，c，g，or t

<400>23

gtgcattcag acacaccatc agtaattcgg ggagatctga tcaaattgtt ctgtatcatc 60

actgtcgagg gagcagcact ggatccagat gacatggcct ttgatgtgtc ctggtttgcg 120

gtgcactctt ttggcctgga caaggctcct gtgctcctgt cttccctgga tcggaagggc 180

atcgtgacca cctcccggag ggactggaag agcgacctca gcctggagcg cgtgagtgtg 240

ctggaattct tgctgcaagt gcatggctcc gaggaccagg actttggcaa ctactactgt 300

tccgtgactc catgggtgaa gtcaccaaca ggttcctggc agaaggaggc agagatccac 360

tccaagcccg tttttataac tgtgaagatg gatgtgctga acgccttcaa gtatcccttg 420

ctgatcggcg tcggtctgtc cacggtcatc gggctcctgt cctgtctcat cgggtactgc 480

agctcccact ggtgttgtaa gaaggaggtt caggagacac ggcgcgagcg ccgcaggctc 540

atgtcgatgg agatggacta ggctggcccg ggaggggagt gacagaggga cgttctagga 600

gcaattgggg caagaagagg acagtgatat tttaaaacaa agtgtgttac actaaaaacc 660

agtcctctct aatctcaggt gggacttggc gctctctctt ttctgcatgt caagttctga 720

gcgcggacat gtttaccagc acacggctct tcttcccacg gcactttctg atgtaacaat 780

cgagtgtgtg ttttcccaac tgcagctttt taatggttaa ccttcatcta attttttttc 840

tcccactggt ttatagatcc tctgacttgt gtgtgtttat agcttttgtt tcgcggggtt 900

gtggtgagga aggggtgatg gcatgcggag ttctttatct tcagtgagaa tgtgcctgcc 960

cgcctgagag ccagcttccg cgttggaggc acgtgttcag agagctgctg agcgccaccc 1020

tctacccggc tgacagncaa cacagacctg tgccgaaggc taatttgtgg cttttacgac 1080

cctaccccac cccctgtttt caggggttta gactacattt gaaatccaaa cttggagtat 1140

ataacttctt attgagccca actgcttttt tttttttttt ttttttgctt ctctgcccct 1200

tttccatttc ttttgtattt gttttctgtg agagcnctga aatggcagcc ctggaatcta 1260

caatttggct ctccactgag caccttatct tgccacctta gccttaagaa tgaatatgaa 1320

gaaaaataca cagccacctc tgtccagggc agtaagaagg gctgcaagga aggggaggat 1380

ggggacaagg aaaggatcag atacctgctc cagtagttgt gaggccactg tgtctcaggg 1440

gactccagga ggagcagaag agggatccca cgaagttatt cttacgcagc tggggccagg 1500

agggtcagag tggtgccagg tgcaagttag gctaaagaag ccaccactat tcctctctct 1560

tgcccattgt ggggggcaaa ggcattggtc accaagagtc ttgcaggggg acccacagat 1620

atgccatgtc cttcacacgt gcttgggctc cttaacctga aggcaaattg ctacttgcaa 1680

gactgactga cttcaaggaa tcagaaatta cctagaagca ccatgttttt tctatgacct 1740

tttcagtcct tcaggtcatt ttaaggtcca ctgcaggggg ttagtgagaa agggtatact 1800

ttgtggtatg ttttgctttc ctaataggga catgaaggaa acccagcaat ttgctgttat 1860

gtgaatggcc tgtagagcag agtcaagagc ggtgtgcttt gcccgactgc tcccatcagg 1920

aataggagag tagacagaga tcttccacat cccaggcttc tgctgctgct ttaaaagctc 1980

tgtccttgga gcctcccgct ccctgaagtg tctcgccccc tgcacagcac tggcctttcg 2040

gaagcatccc agtagggttt tctgaggctc gctggtgact catgccctaa ttgcaatcct 2100

ctgcttttat cttgactttg aaggatctaa cactgctctc tcttccaaag gggaaaaaaa 2160

gattcatttg ttttgagcaa taaactaata caaaatg 2197

Claims

1.一种核酸序列SEQ ID NO：3，

或者与SEQ ID NO：3比对时具有以下特征的核酸序列SEQ IDNO X：

a)在SEQ ID NO：3长度上相同残基的百分比至少为50％；和

b)在所述氨基酸序列SEQ ID NO X长度上相同残基的百分比至少为80％，

或者其具有至少60个连续核苷酸的片段。

2.一种包含至少一种如权利要求1所述的核酸序列的表达载体。

3.一种活性多肽SEQ ID NO：4，

或者与SEQ ID NO：4比对时具有以下特征的氨基酸序列SEQ IDNO Y：

a)在SEQ ID NO：4长度上相同残基的百分比至少为50％；和

b)在所述氨基酸序列SEQ ID NO Y长度上相同残基的百分比至少为65％，

或者其具有至少20个连续氨基酸的片段。

4.根据权利要求3所述的活性多肽，其特征在于它是通过如权利要求2所述的表达载体制备的。

5.根据权利要求3或4所述的活性多肽，其中，所述多肽具有抗血管生成和抗肿瘤活性。

6.一种包含至少一种如权利要求1所述的核酸序列、或至少一种如权利要求2所述的表达载体、或至少一种如权利要求3至5中任一项所述的多肽的药物。

7.一种包含至少一种如权利要求1所述的核酸序列、或至少一种如权利要求2所述的表达载体、或至少一种如权利要求3至5中任一项所述的多肽和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

8.一种用于治疗人体或动物体的癌症和/或肿瘤的药物组合物，包含至少一种如权利要求1所述的核酸序列、或至少一种如权利要求2所述的表达载体、或至少一种如权利要求3至5中任一项所述的多肽和一种或多种药学上可接受的赋形剂。

9.根据权利要求7或8所述的药物组合物，进一步包含至少一种选自抗血管生成物质或抗肿瘤物质的另外的活性物质。

10.一种药物组合物，包含有效量的

-权利要求3至5中任一项所述的多肽，和

-选自顺铂和卡铂的铂配合物。

11.根据权利要求7-10中任一项所述的药物组合物，其为适于局部、全身、口服、皮下、透皮、肌肉内或腹膜内给药的形式。

12.根据权利要求7-11中任一项所述的药物组合物，其中，所述多肽的存在量为0.01％至90％重量，优选为0.1％至10％重量，更优选为1％至5％重量。

13.根据权利要求1所述的核酸、或如权利要求2所述的表达载体、或如权利要求3至5中任一项所述的多肽、或如权利要求6所述的药物、或如权利要求7-12中任一项所述的药物组合物在治疗癌症和/或肿瘤中的用途。

14.根据权利要求13所述的用途，其中，所述肿瘤为实体瘤。

15.根据权利要求14所述的用途，其中，所述实体瘤选自肉瘤、癌瘤和淋巴瘤。