JP2010526549A - 抗腫瘍性の薬物、医薬、組成物、およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
配列番号87に対応する。
配列番号28に対応する。
a)配列番号3の長さの全体にわたり少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、およびより好ましくは少なくとも90%の同一な残基のパーセンテージ、ならびに、
b)該アミノ酸配列 配列番号Xの長さの全体にわたり少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、およびより好ましくは少なくとも95%の同一な残基のパーセンテージ、
を有する核酸配列、
または少なくとも60個の連続するヌクレオチドを有するその断片に関する。
a)配列番号3の該断片の長さの全体にわたり少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、およびより好ましくは少なくとも90%の同一な残基のパーセンテージ、ならびに、
b)該核酸断片の長さの全体にわたり少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、およびより好ましくは少なくとも90%の同一な残基のパーセンテージ、
を有し、
かつ抗血管形成活性および抗腫瘍活性を有するペプチドをコードする、
核酸断片をも包含する。
配列番号87に対応する。
a)配列番号4の長さの全体にわたり少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、およびより好ましくは少なくとも90%の同一な残基のパーセンテージ、ならびに、
b)該アミノ酸配列 配列番号Yの長さの全体にわたり少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、およびより好ましくは少なくとも90%の同一な残基のパーセンテージ、
を有するアミノ酸配列 配列番号Y、
または少なくとも20個の連続するアミノ酸を有するその断片に関する。
a)配列番号4の該断片の長さの全体にわたり少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、およびより好ましくは少なくとも90%の同一な残基のパーセンテージ、ならびに、
b)該ペプチドの長さの全体にわたり少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、およびより好ましくは少なくとも90%の同一な残基のパーセンテージ、
を有し、
かつ抗腫瘍活性を有する、
ペプチドをも包含する。
- 上記のようなポリペプチド、断片、および/またはペプチド、ならびに、
- シスプラチンおよびカルボプラチンからなる群より選択される白金錯体、
を含む薬学的組成物に関する。
- 上記のようなポリペプチド、断片、および/またはペプチド、ならびに、
- シスプラチンおよびカルボプラチンからなる群より選択される白金錯体、
を投与する工程を含む治療の方法に関する。
タンパク質168A-T2の産生
挿入物168A-T2の合成:
第1に、公知の手順に従って、遺伝子168AをpGEM(登録商標)-T・イージーベクターシステム(Promega(登録商標))にクローニングした(得られたベクターを「pGEM-T-168A」と名付けた)。
タンパク質168A-T2は細菌の不溶性画分中に産生されたので、それを変性条件で抽出する必要があった。
20 mM、尿素 8 M、イミダゾール 5 mM、NaCl 0.5 M、GSH 5 mM、pH 8.0で処置した。この処置の後、懸濁液を遠心分離し、上清を回収し、0.45 μm膜で濾過し、不溶物を捨てた。その後、濾過された抽出物を用いて、HPLCシステム(Amersham)に接続されたHis-Trapカラム(Amersham(登録商標))を用いることによりタンパク質168A-T2を精製した。
インビトロでの168A-T2による内皮細胞増殖の阻害の試験
HUVEC細胞を、完全EGM2-MV培地(Cambrex)中、37℃で、5% CO2の加湿雰囲気中でコンフルエンシーまで培養した。その後、細胞をトリプシン-EDTA消化(Versene, Eurobio)により回収した。5分後、酵素反応を、5% FCSを含む3 mlの培養培地を添加することにより停止させた。その後、細胞を220 gで10分間、室温で遠心分離し、5 mlの培養培地で2回洗浄し、完全培養培地に懸濁し、計数し、50000細胞/mlに調整した。その後、ウェル当たり100 μLを96-ウェルの細胞培養等級マイクロプレートに配分し(5000細胞/ml)、150 mM NaClおよび尿素 2 Mを含む、Tris-HCl 20 mM 緩衝液(pH 8)中の異なる濃度の精製タンパク質168A-T2と共にインキュベートし;この緩衝液を対照として用いた。
168A-T2によるインビトロ血管形成の阻害
精製タンパク質168A-T2を、FGF2およびVEGFによってMatrigel上で誘導されるHUVECの血管形成についてインビトロで試験した。
- 図2a:対照(緩衝液尿素 2 M)
- 図2b:168A-T2 3.5 μg/mL(0.2 μM)
- 図2c:168A-T2 6.9 μg/mL(0.4 μM)
- 図2d:168A-T2 13.6 μg/mL(0.8 μM)
168A-T2によるヒト内皮細胞の遊走の阻害
細胞遊走を、若干の変更を加えてSatoおよびRifkin(J Cell Biol. 1988; 107: 1199)により説明された創傷アッセイによって試験した。成長培地EGM- 2MV(Cambrex)中で成長させたHUVECを、500μLの成長培地中にウェル当たり80000細胞で24-ウェルプレートに播種し、37℃で、5% CO2を含む加湿雰囲気中でコンフルエンスまで成長させた。細胞をプラスチックの先端で線1本だけこすって傷つけた。傷をつけた後、培養培地を新鮮な培地(対照、図3a)かまたは
- 図3b:168A-T2 12 μg/mL(0.7 μM)
- 図3c:168A-T2 17 μg/mL(1 μM)
- 図3d:168A-T3 23 μg/mL(1.35 μM)
を補充した新鮮な培地と取り替えた。
インビトロでの168A-T2による腎癌細胞株増殖の阻害の試験
50000細胞/mLのBizX細胞調製物を完全培地中に調製した。96ウェルプレート中、100 mLの細胞調製物を各ウェルに配分し、その後、異なる濃度の168A-T2と共にインキュベートした(各濃度を3通りで試験した)。37℃で48時間のインキュベーションの後、10 mLのMTT(水の中に5mg/L)を各ウェルに添加した。37℃で3時間のインキュベーションの後、培養培地を除き、100 mLのDMSOを添加し、MMT結晶を可溶化した。その後、KC4(Bio-Tek)ソフトウェアに連結されたμQuantマイクロプレートリーダー(Bio-Tek Instrument gmbh, Colmar, France)を用いて、570 nmでの光学密度(OD)を測定した。ブランクのウェルのOD値(細胞を含まないウェルから得られるOD値)を差し引くことによってODを修正し、細胞増殖の阻害を対照に対して測定した(処置していない腎腫瘍細胞を含むウェルから得られるODは、最大増殖応答、すなわち100%に相当する)。
インビトロでの168A-T2による肺癌細胞株増殖の阻害の試験
Calu6細胞を、実施例5に記載されたように培養し、処置した。
腫瘍試料におけるタンパク質168Aの発現
多数の異なるヒト腫瘍試料を遺伝子168Aの発現についてスクリーニングした。各々の病理試料について、腫瘍の周囲を腫瘍の中心部から分離し、これら2つの部分における遺伝子168Aの発現を、mRNA抽出後のRT-PCRによって比較した。
腎腫瘍由来の19の病理生検を解析した。19人の患者中11人において、168Aの発現が腫瘍の周囲でよりも中心部でずっと高かった。19人の患者中8人において、168Aの発現が中心部でよりも腫瘍の周囲でずっと高かった。
ヒト肺腫瘍由来の40の病理生検を解析した。40人の患者中23人において、168Aの発現が腫瘍の周囲でよりも中心部でずっと高かった。
ヒト結腸腫瘍由来の33の病理生検を解析した。33人の患者中13人において、168Aの発現が腫瘍の中心部でよりも周囲でずっと高かった。
インビボでのswiss系ヌードマウスにおけるヒト非小細胞肺癌(CALU-6)異種移植モデルでの168A-T2の試験
CALU-6細胞の調製
CALU-6細胞を、完全EMEM培地(型番CM1MEM18-01, バッチ番号462502, Eurobio, France) 10% 胎仔ウシ血清(FCS;型番CVFSVFOO-01, バッチ番号S13021, Eurobio, France)中で37℃、5% CO2の加湿雰囲気下で付着細胞として培養した。それらを90×106細胞に達するよう75 cm2-フラスコの中で増幅させた。
mlのトリプシン-EDTA(型番CEZTDA00-0U, バッチ番号633920, Eurobio, France)を添加することによって、CALU-6細胞(ヒト肺癌)を75 cm2-フラスコから回収した。37℃で5分のインキュベーションの後、細胞はプラスチックから剥がれており、10% 胎仔ウシ血清を含む3 mlのEMEM培地を添加することによって酵素反応を停止させた。その後、細胞を700 gで5分間、室温で遠心分離した。それらを、血清を含まないEMEM培養培地に再懸濁した。細胞を計数し、トリパンブルー排出(型番CSTCOL03-OU, バッチ番号434511, Eurobio, France)によって生存率を評価した。生存しているCALU-6細胞の数は、>99%であった。その後、細胞の数を、血清を含まない培地中で25×106細胞/mlに調整した。
30匹の健康なメスのSwiss系ヌードマウスにケタミン-キシラジン(80 mg/kg - 12 mg/kg;型番K-113, Sigma, France)の腹腔内注射により麻酔をかけた。その後、CALU-6細胞(200 μlの血清を含まない培地中に5×106細胞/マウス)を各マウスの右脇腹に皮下移植した。移植後2時間、マウスを観察した。
CALU-6細胞の移植後12日目に、30匹のマウスを無作為に5匹のマウスの4群に分けた。腫瘍体積は54〜296 mm3 に達しており、平均腫瘍体積は無作為化後の群間で統計的に異ならなかった。
- 第1群の動物は、ビヒクル溶液(Tris-HCl pH 7.5、2 M 尿素、150 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2)で処置し;
- 第2群の動物は、生理的血清中の0.5 mg/mLの濃度のシスプラチン(CDDP, cis-ジアミン白金(II)ジクロリド, 型番P4394, バッチ番号014K0993, Sigma, France, 純度100%, MW. 300)の溶液で処置し、
- 第3群の動物は、15 mg/kgの用量の試験物質168A-T2を補充したビヒクルで処置し、
- 第4群の動物は、15 mg/kgの用量の試験物質168A-T2を補充したビヒクルで処置し、さらに5 mg/kgのCDDPを与えた。
以下に概略が説明されるデータを計算した:
- 平均腫瘍体積(MTV)を用いて腫瘍成長曲線を引き、
- 時間tでのMTVと注射の時点(t=D12)での体積の間の比として平均相対腫瘍体積(MRTV)を計算し、
- 処置群対ビヒクル群の腫瘍体積中央値の比として腫瘍成長阻害(T/C、%)を評価した。
表3に示すように、ビヒクルは全く影響がなかった:マウスの行動および体重増は正常であり、どの動物も早死にすることがなかった。15 mg/kgの用量の試験物質168A-T2による処置の過程の間に毒性は全く観察されず、わずかな体重増が観察された(+2.45 g)。
Claims (15)
- 配列番号3の核酸配列、
または配列番号3と整列させた時に、
a)配列番号3の長さの全体にわたり少なくとも50%同一な残基のパーセンテージ、および、
b)配列番号Xのアミノ酸配列の長さの全体にわたり少なくとも80%同一な残基のパーセンテージ、
を有する該配列番号Xの核酸配列、
または少なくとも60個の連続するヌクレオチドを有するその断片。 - 請求項1に記載の少なくとも1つの核酸配列を含む発現ベクター。
- 配列番号4の活性ポリペプチド、
または配列番号4と整列させた時に、
a)配列番号4の長さの全体にわたり少なくとも50%同一な残基のパーセンテージ、および、
b)配列番号Yのアミノ酸配列の長さの全体にわたり少なくとも65%同一な残基のパーセンテージ、
を有する該配列番号Yのアミノ酸配列、
または少なくとも20個の連続するアミノ酸を有するその断片。 - 請求項2に記載の発現ベクターによって産生されることを特徴とする、請求項3に記載の活性ポリペプチド。
- 該ポリペプチドが抗血管形成活性および抗腫瘍活性を有する、請求項3または4に記載のポリペプチド。
- 請求項1に記載の少なくとも1つの核酸配列、または請求項2に記載の少なくとも1つの発現ベクター、または請求項3〜5のいずれか一項に記載の少なくとも1つのポリペプチドを含む医薬。
- 請求項1に記載の少なくとも1つの核酸配列、または請求項2に記載の少なくとも1つの発現ベクター、または請求項3〜5のいずれか一項に記載の少なくとも1つのポリペプチド、および1つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
- ヒトまたは動物の体の癌および/または腫瘍の治療の方法で使用するための、請求項1に記載の少なくとも1つの核酸配列、または請求項2に記載の少なくとも1つの発現ベクター、または請求項3〜5のいずれか一項に記載の少なくとも1つのポリペプチド、および1つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
- 抗血管形成物質または抗腫瘍物質より選択される少なくとも1つの別の活性物質をさらに含む、請求項7または8に記載の薬学的組成物。
- 有効量の、
- 請求項3〜5のいずれか一項に記載のポリペプチド、ならびに、
- シスプラチンおよびカルボプラチンからなる群より選択される白金錯体、
を含む薬学的組成物。 - 局所、全身、経口、皮下、経皮、筋肉内、または腹腔内の投与に好適な形状である、請求項7〜10のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 該ポリペプチドが、重量にして0.01〜90%、好ましくは重量にして0.1%〜10%、より好ましくは重量にして1%〜5%の量で存在する、請求項7〜11のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 癌および/または腫瘍の治療のための、請求項1に記載の核酸、請求項2に記載の発現ベクター、請求項3〜5に記載のポリペプチド、または請求項6に記載の医薬、または請求項7〜12記載の薬学的組成物の使用。
- 腫瘍が固形腫瘍である、請求項13に記載の使用。
- 固形腫瘍が、肉腫、癌腫、およびリンパ腫より選択される、請求項14に記載の使用。
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