KR102241134B1 - Fgf2 또는 api5 유래 펩타이드를 발현하는 항암 바이러스 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 FGF2 또는 API5 유래 펩타이드를 발현하는 항암 바이러스 및 이의 용도에 대한 것이다.
본 발명의 FGF2 또는 API5 유래 펩타이드를 발현하는 바이러스는 mRNA 수송에 관여함으로써 항암제의 내성을 억제하고, 결과적으로 암세포의 생존을 억제할 수 있으며, BRD4 억제제를 병용하는 경우 시너지가 발생하여 더욱 효과적으로 암세포의 생존을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 FGF2 또는 API5 유래 펩타이드를 발현하는 바이러스는 항암 바이러스 내지 상기 항암 바이러스를 포함하는 항암제 내성 억제용 조성물, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 내지 항암보조제로서 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

FGF2 또는 API5 유래 펩타이드를 발현하는 항암 바이러스 및 이의 용도 {Oncolytic virus for expressing peptide derived from FGF2 or API5 and uses thereof}

본 발명은 FGF2 또는 API5 유래 펩타이드를 발현하는 항암 바이러스 및 이의 용도에 대한 것이다.

API5(Apoptosis inhibitor 5)은 세포사멸 억제 단백질로서, 암세포의 이동과 침윤에 관여하여 암의 전이와 관련이 깊고, 최근 암세포의 면역 회피에도 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀졌다. 이에, 암 치료제 내성에 관여하는 세포사멸 억제 단백질의 기전을 규명하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있는데, 구체적으로, API5를 발현하는 암 환자의 경우 예후가 좋지 못하며, API5가 사람의 암세포에서 FGFR 시그널링을 통해 항암제 내성을 유도하는 것이 보고되었다.

섬유아세포 성장 인자 2(fibroblast growth factor 2; FGF2)는 중추신경계 내의 FGF 구성원 중 가장 풍부하다. 이는 다양한 세포 형태에 있어서, 증식, 분화, 발달 및 생존의 조절 매개체로서 중요한 역할을 하고, 신경계에서 분열 촉진 활성(mitogenic activity)을 가진다. 또한, FGF2는 잠재적인 혈관형성(angiogenic) 효과, 평활근 세포(smooth muscle cells)의 성장 촉진, 상처 치유 및 조직 회복과 더불어, 인간 및 마우스 배아줄기(embryonic stem; ES) 세포의 다분화능(pluripotent) 상태를 유지하게 하는 것으로 보고되었다. 특히, FGF2는 종양 조직의 혈관신생에 깊게 관여하는데, 예컨대 신장암 등 혈관이 많은 종양에서 그 혈청 농도가 높다는 것이 보고되어 있고, 기타 전립선암, 유방암, 폐암 등 다양한 종양에도 존재하는 것으로 알려져 있다.

항암바이러스(Oncolytic virus)란 복제가 가능하고 감염력이 있는 바이러스로서 야생형(Wild-type) 혹은 약독화된 바이러스에 종양세포 내 유전적으로 비정상 부위를 타겟(Target)으로 하는 특정유전자를 삽입하여 암 치료에 사용하는 바이러스이다. 이러한 유전자 조작된 항암바이러스는 바이러스의 복제 후 세포 용해와 함께 조직을 통한 바이러스의 확산은 암세포와 암세포 주변 혈관 내에서 선택적으로 일어난다. 대표적인 항암 바이러스로는 2015년 10월 미국식품의약국(Food and Drug Administration, FDA)로부터 흑색종(Melanoma) 치료제로 승인을 받은 미국 암젠(Amgen)의 임리직(lmlygic, talimogene laherparepvec)이 있다.

대한민국 등록특허 제10-1845739호는 신규한 암용해 바이러스, 이의 제작 방법 및 이의 용도에 대한 것으로서, 암 자살유전자인 TRAIL 유전자 및 정상 혈관 생성 유전자인 Ang1을 코딩하는 서열을 각각 포함하는 듀얼 셔틀벡터를 제작하여 백시니아 바이러스에 도입한 암용해 바이러스를 제공한다.

그러나 FGF2 또는 API5 유래 펩타이드를 발현하는 항암 바이러스에 대한 연구 내지 기재는 개시된 바 없다.

이에 본 발명자들은 유의적인 항암제 내성 완화 효과를 제공함으로써 궁극적으로 높은 항암효과를 나타낼 수 있는 항암 바이러스(oncolytic virus)를 제공하고자 예의 노력한 결과, FGF2 또는 API5 유래 펩타이드를 발현하는 항암 바이러스, 특히 렌티 바이러스는 암 세포의 생존을 유의적으로 억제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 FGF2 또는 API5 유래 펩타이드를 발현하는 항암 바이러스 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 발현하는 항암 바이러스(oncolytic virus) 및 이를 포함하는 항암제 내성 억제용 조성물, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 내지 항암보조제를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 API5(apoptosis inhibitor 5)와 FGF2(fibroblast growth factor-2)의 결합을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 서열번호 3의 폴리뉴클레오타이드 서열로 암호화 되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 4의 폴리뉴클레오타이드 서열로 암호화 되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 항암 바이러스는 폭스바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 볼거리 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파보바이러스, 홍역 바이러스, 인간 한타 바이러스, 점액종 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 렌티바이러스, 콕사키바이러스, 에코바이러스, 세네카 밸리 바이러스 및 신드비스 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 암은 위암, 폐암, 자궁경부암, 대장암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 간암, 췌장암, 난소암, 갑상선암 및 방광암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 항암제는 독소루비신, 5-플루오로우라실, 카르보플라틴, 시스플라틴, 카르무스틴, 다카바진, 에토포사이드, 비노렐빈, 토포테칸, 이리노테칸 및 에스트라무스틴으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 암은 위암, 폐암, 자궁경부암, 대장암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 간암, 췌장암, 난소암, 갑상선암 및 방광암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물에 항암제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 추가적으로 포함되는 항암제는 BET(Bromodomain and Extra-Terminal motif) 억제제일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 항암보조제에 BET(Bromodomain and Extra-Terminal motif) 억제제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 FGF2 또는 API5 유래 펩타이드를 발현하는 바이러스는 mRNA 수송에 관여함으로써 항암제의 내성을 억제하고, 결과적으로 암세포의 생존을 억제할 수 있으며, BRD4 억제제를 병용하는 경우 시너지가 발생하여 더욱 효과적으로 암세포의 생존을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 FGF2 또는 API5 유래 펩타이드를 발현하는 바이러스는 항암 바이러스 내지 상기 항암 바이러스를 포함하는 항암제 내성 억제용 조성물, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 내지 항암보조제로서 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 API5-FGF2 복합체 크리스탈의 형태를 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 2는 API5-FGF2 복합체의 전체적인 구조(overall structure)를 도시한 것이다.
도 3은 API5-FGF2의 결합 부위(interaction interface)를 구체적으로 도시한 것이다.
도 4는 API5 또는 FGF2의 야생형(WT) 또는 돌연변이(3Mut)를 이용하여 GST-풀다운 어세이(pull down assay)를 수행한 결과이다. API5 또는 FGF2의 야생형(WT) 사이의 강한 친화도를 확인할 수 있었다.
도 5는 API5 또는 FGF2의 야생형(WT) 또는 돌연변이(3Mut)를 이용하여 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance; SPR)을 수행한 결과이다. API5 또는 FGF2의 야생형(WT) 사이의 강한 친화도를 확인할 수 있었다.
도 6은 도 5의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 API5-FGF2 복합체의 기능 및 기전을 알아내기 위한 실험과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 8 내지 도 10은 API5-FGF2 복합체와 결합하는 단백질들(interactome)의 분석 및 이들 단백질들의 경로 분석 결과이다.
도 12는 UAP56, API5, 및 FGF2를 이용하여 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance; SPR)을 수행한 결과이다. UAP56과 API5-FGF2 복합체와의 강한 친화도를 확인할 수 있었다.
도 13은 UAP56, API5, 및 FGF2를 이용하여 GST-풀다운 어세이(pull down assay)를 수행한 결과이다. UAP56과 API5-FGF2 복합체와의 강한 친화도를 확인할 수 있었다.
도 14는 API5-FGF2 결합은 벌크(bulk) mRNA의 핵 수송(nuclear export)에 관여함을 poly(A) 꼬리(tail)를 갖는 벌크 mRNA에 대한 RNA-FISH(RNA Fluorescence In Situ Hybridization) 방법을 이용하여 확인한 결과이다.
도 15는 유전자 mRNA 4E-SE 엘리먼트를 포함하는 MYC, CCND1, CCNE1 또는 MALAT1의 mRNA 수송을 RT-qPCR을 통해 분석한 결과이다. API5가 하향 조절된 경우와 API5 3Mut로 치환된 경우에 핵에서 세포질로 RNA가 이동하지 못하고 핵에 정체됨을 확인할 수 있었다.
도 16은 유전자 mRNA 4E-SE 엘리먼트를 갖는 MYC 또는 CCND1의 단백질 발현양과 API5의 발현 내지 돌연변이 여부와의 관계를 나타낸다. RNA가 핵에서 세포질로 이동하지 못하여 리보솜에 의해 단백질이 합성되지 못하기 때문에 c-MYC 또는 CCND1 단백질 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다.
도 17은 API5 고갈(depletion)에 의한 시스플라틴(cisplatin)에 대한 내성 감소 효과를 나타낸 것이다.
도 18은 API5 과발현에 의한 시스플라틴에 대한 내성 증가 효과를 나타낸 것이다.
도 19은 삼차원 구조 분석을 통한 API5 결합 펩타이드와 FGF2 결합 펩타이드의 결합위치 및 펩타이드 서열을 나타낸 것이다.
도 20는 HeLa 세포를 이용하여 IC₂₀ 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 21는 API5 또는 FGF2 유래 펩타이드의 항암제 내성 세포에 항암제 내성 감소효과 실험방법을 나타낸 것이다.
도 22는 API5 또는 FGF2 유래 펩타이드에 의한 시스플라틴 내성감소효과를 그래프로 나타낸 것이다. API5 또는 FGF2 유래 펩타이드의 농도 의존적으로 세포생존률이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
도 23은 항암 바이러스에서 발현하는 API5 유래 펩타이드(API5-segment 2)의 FGF2 에 대한 결합력 및 FGF2 유래 펩타이드(FGF2-segment 1)의 API5에 대한 결합력을 확인한 결과를 나타낸다. API5 유래 펩타이드는 FGF2에, FGF2 유래 펩타이드는 API5에 직접적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
도 24는 항암 바이러스에서 수득한 API5 유래 펩타이드(API5-segment 2)의 유전자 mRNA 4E-SE 엘리먼트를 갖는 MYC 또는 CCND1의 단백질 발현양에 대한 영향 나타낸다. RNA가 핵에서 세포질로 이동하지 못하여 리보솜에 의해 단백질이 합성되지 못하기 때문에 c-MYC 또는 CCND1 단백질 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다.
도 25는 본 발명에서 API5 또는 FGF2 유래 펩타이드를 발현 하는 렌티바이러스를 제조하여 암세포에서 항암 효과를 확인한 실험 방법을 나타낸다.
도 26은 API5 또는 FGF2 유래 펩타이드를 발현하는 렌티바이러스가 자궁경부암, 간암, 신장암 및 췌장암 세포주의 생존률에 미치는 영향을 나타낸다. 렌티바이러스 처리에 따라 각 암 세포주의 생존률이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.
도 27은 BET 브로모 영역(bromodomain) 저해제인 OTX015와 API5 또는 FGF2 유래 펩타이드를 발현하는 렌티바이러스를 간암 세포주에 병용 처리한 결과를 나타낸다. OTX015 및 렌티바이러스 병용 처리에 의하여 항암 효과에 시너지가 발생한 것을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용하는 용어 “항암제 내성 억제”는 암세포의 항암제에 대한 저항 내지 내성을 감소 내지 완화시켜 항암제의 암세포에 대한 항암 효과가 완전히 나타날 수 있도록 하는 모든 효과를 의미한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "API5(Apoptosis inhibitor 5)"는 AAC-11이라고도 불린다. API5는 여러 암세포에서 암의 생존 증가에 관여한다고 보고되었는데, Acinus(ACIN1)와 물리적인 결합을 통해 Acinus 매개성 DNA 절편을 통한 세포사멸 유도를 억제하고 세포사멸 단백질인 Caspase-3의 활성을 막는다. 뿐만 아니라 E2F1에 유도되는 세포사멸을 효과적으로 억제하며 API5 발현을 저하하면 항암제의 세포독성이 증가되는 것이 확인되었다. 또한, 암세포의 이동과 침윤에 관여하여 암의 전이와 관련이 깊고, 최근 암세포의 면역 회피에도 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀졌다.

본 발명에서 사용하는 용어 "FGF2(fibroblast growth factor 2)"는 23개의 FGF 구성원으로 이루어진 커다란 섬유아세포 성장 인자들 패밀리 중의 하나로서, 중추신경계 내의 FGF 구성원 중 가장 풍부하다. 이는 다양한 세포 형태에 있어서, 증식, 분화, 발달 및 생존의 조절 매개체로서 중요한 역할을 하고 신경계에서 분열 촉진 활성(mitogenic activity)을 가진다. 또한, FGF2는 잠재적인 혈관형성(angiogenic) 효과, 평활근 세포(smooth muscle cells)의 성장 촉진, 상처 치유 및 조직 회복과 더불어, 인간 및 마우스 배아줄기(embryonic stem; ES) 세포의 다분화능(pluripotent) 상태를 유지하는 것으로 보고되었다. FGF2는 고분자량(high molecular weight; 22, 22.5, 24 또는 34 kDa) 및 저분자량(low molecular weight; 18 kDa) 두 종류가 존재한다. 고분자량 FGF2는 N 말단에 핵 위치 신호(nuclear localization signal; NLS)가 존재하여 고분자량 FGF2가 핵에 위치하도록 하는 반면, 저분자량 FGF2는 N 말단에 NLS는 존재하지 않는 반면 C 말단의 비전형적인 이분 NLS로 인해 일부 저분자량 FGF2가 핵에 위치하도록 조절한다.

본 발명에서 사용하는 용어 “API5-FGF2 복합체”는 API5와 FGF2가 결합하여 형성하는 복합체를 의미한다.

본 발명에서 사용하는 용어 “항암 바이러스(oncolytic virus)”는 복제가 가능하고 감염력이 있는 바이러스로서 야생형(Wild-type) 혹은 약독화된 바이러스에 종양세포 내 특정 부위를 타겟(Target)으로 하는 특정 유전자를 삽입하여 암 치료에 사용하는 바이러스를 의미한다.

상기 기재한 바와 같이, 본 발명자들은 항암제 내성을 유도하는 API5가 FGF2와 결합함으로써 항암제에 대한 내성을 증가시킴을 확인하고, X-선 결정학을 이용한 단백질 삼차원 구조 규명을 통하여 API5와 FGF2의 결합부위를 확인하여 결합에 직접적으로 관여하는 특정 부위 펩타이드를 선별하였다. 또한 본 발명자들이 선별한 상기 펩타이드 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 API5 또는 FGF2 유래 펩타이드를 발현하는 항암 바이러스를 제작하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 발현하는 항암 바이러스(oncolytic virus)를 제공한다.

본 발명의 일실시예에서, API5-FGF2 복합체의 3차원 구조 및 결합을 검증하였으며 상기 결합에 직접적으로 관여하는 결합 부위를 확인하였으며(실시예 1), 단백질 3차원 구조를 기반으로 하여 API5에 결합하는 FGF 유래 펩타이드 및 FGF2에 결합하는 API5 유래 펩타이드의 서열을 도출하였다(실시예 4).

본 발명의 다른 일실시예에서, API5-FGF2 복합체가 mRNA 핵 수송(nuclear export)에 작용함을 확인하였는데(실시예 2), API5 고갈(depletion)시 시스플라틴에 대한 내성이 감소하고 과발현시 시스플라틴에 대한 내성이 증가하고 API5 돌연변이체의 과발현에서는 내성 증가 현상이 사라짐을 확인하였다(실시예 3).

상기 서열번호 1은 API5와 FGF2의 결합과 직접적인 관련이 있는 API5 유래 펩타이드 서열로서, LEDVTGEEF 이며 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이라면 제한없이 사용될 수 있으나 서열번호 3의 폴리뉴클레오타이드 서열인 것이 바람직하다.

상기 서열번호 2는 API5와 FGF2의 결합과 직접적인 관련이 있는 FGF2 유래 펩타이드 서열로서, KRTGQYKLGSKT 이며 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이라면 제한없이 사용될 수 있으나 서열번호 4의 폴리뉴클레오타이드 서열인 것이 바람직하다.

본 발명의 일실시예에서, API5 또는 FGF2 유래 펩타이드에 의해 시스플라틴 내성 감소 효과가 나타남을 확인하였다(실시예 5). 따라서 상기 항암제 내성 억제용 펩타이드는 API5 및/또는 FGF2와 결합하여 API5-FGF2 복합체 형성을 억제하여 항암제 내성을 억제하는 것 일 수 있다.

상기 염기서열의 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함되며, 구체적으로, 상기 염기서열과 각각 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 바이러스는 항암 바이러스(oncolytic virus)로 사용될 수 있는 바이러스라면 제한없이 사용 가능하지만 바람직하게는 폭스바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 볼거리 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파보바이러스, 홍역 바이러스, 인간 한타 바이러스, 점액종 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 렌티바이러스, 콕사키바이러스, 에코바이러스, 세네카 밸리 바이러스 및 신드비스 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 렌티바이러스인 것이 바람직하다.

본 발명의 항암 바이러스는 상기 기재한 바와 같이 API5-FGF2 복합체 형성을 억제하는 API5 또는 FGF2 유래 펩타이드를 발현함으로써 항암제 내성을 억제하여 궁극적으로 암세포의 생존을 억제하는 항암 효과를 제공할 수 있다(실시예 8).

본 발명의 상기 항암 바이러스가 항암효과를 나타내는 상기 암은 위암, 폐암, 자궁경부암, 대장암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 간암, 췌장암, 난소암, 갑상선암 및 방광암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 암에 항암 효과를 나타낼 수 있다. 상기 암은 보다 바람직하게 자궁경부암, 간암, 신장암 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 항암제는 독소루비신, 5-플루오로우라실, 카르보플라틴, 시스플라틴, 카르무스틴, 다카바진, 에토포사이드, 비노렐빈, 토포테칸, 이리노테칸 및 에스트라무스틴으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항암 바이러스를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

상기 암은 상기 항암 바이러스가 대상으로 하는 암과 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.

상기 약학적 조성물에는 항암제가 추가적으로 포함될 수 있는데, 상기 항암제는 BET(Bromodomain and Extra-Terminal motif) 억제제일 수 있으며, 바람직하게는 BRD4(Bromodomain-containing protein 4) 억제제인 것이 바람직하다.

상기 BET(Bromodomain and Extra-Terminal motif)는 BRD2, BRD3, BRD4 또는 BRDT 등으로 이루어진 단백질이며, BET 억제제는 암 또는 다발성 경화증 치료 효과가 있음이 알려져 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용; 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사하는 주사제 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.

상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS (phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 약제학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량으로는, 비경구 투여 시 항암제 내성 억제용 펩타이드를 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항암 바이러스를 포함하는 항암 보조제를 제공할 수 있다.

상기 항암 보조제는 BET(Bromodomain and Extra-Terminal motif) 억제제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 상기 BET 억제제는 상기 약학적 조성물에서 기재된 것과 동일하므로 설명은 상기 기재로 대신한다.

상기 항암보조제는 항암제의 항암효과를 증대시키거나 항암제의 부작용을 억제 또는 개선시키기 위한 모든 형태를 의미한다. 본 발명의 항암보조제는 다양한 종류의 항암제 또는 항암보조제와 병용투여될 수 있으며, 병용투여시 통상적인 항암제의 투여량보다 낮은 수준으로 항암제를 투여하더라도 동등한 수준의 항암치료효과를 나타낼 수 있으므로 보다 안전한 항암치료를 수행할 수 있다.

상기 항암보조제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 항암보조제는 목적하는 바에 따라 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 항암보조제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 항암보조제는 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 항암보조제로 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 항암치료 보조제에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항암보조제는 비경구 투여를 위한 제제일 수 있으며, 제제에 대한 설명은 상기 약학적 조성물의 제제에 대한 기재로 대신한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.

API5와 FGF2 결합체의 3차원 구조 및 결합 검증

<1-1> API5-FGF2 복합체의 삼차원 구조 분석

API5 전장(1-504) 및 저분자량(low molecular weight; LMW) FGF2(135-288)를 pET 28b 벡터에 각각 클로닝 하여 대장균에서 발현하였다. FGF2는 대장균에 코돈 최적화(codon optimize)한 합성 유전자를 사용하였으며 대장균 발현을 용이하게 하기 위하여 이황화물(disulfide) 결합을 이루는 시스테인(cysteine)은 세린(serine)으로 치환하였다(C211S/C229S, Uniport P09038-4 기준, 해당 아미노산 치환은 FGF2의 기능 및 구조에 영향을 미치지 않아 본 발명에서 FGF2라 명명하였다). API5-FGF2 복합체 구조를 규명하기 위하여 API5와 FGF2 재조합 단백질을 Ni-NTA resin(Qiagen, Germany)과 HiLoad 16/600 Superdex 200 또는 75 prepgrade(GE Healthcare, USA) 컬럼을 이용하려 대량 발현 정제하였으며 최종 정제된 API5는 15.5 mg/㎖ 100 ㎕ 및 FGF2 5.3 mg/㎖ 300 ㎕를 섞어서 4℃에서 하루동안 인큐베이션한 후 결정화를 시도하였다. 폴리에틸렌글리콜(Polyethyleneglycol; PEG) 6000을 침전제로 결정화하였을 경우 API5-FGF2 복합체 결정을 얻을 수 있었으며 최적의 결정화는 100 mM Na-HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 10%(v/v) 폴리에틸렌글리콜 6000 조건이었으며, 그 결과 [도 1]과 같은 결정을 얻을 수 있었다.

상기 결정을 포항 방사광 가속기의 BL-7A 빔라인을 이용하여 API5-FGF2 복합체 회절 데이터를 획득하였으며 이를 이용하여 삼차원 구조를 2.6 Å 해상도로 규명하였으며 결정 공간군은 P2₁2₁2₁으로 셀 파라미터(cell parameter)는 a=46.862, b=76.523, c=208.158 Å 이었다. 기존에 본 발명자 그룹에서 규명한 API5 구조와 이미 알려진 FGF2 구조를 이용하여 분자 치환법으로 CCP4 프로그램 패키지의 MOLREP 프로그램을 이용하여 위상문제를 해결하였다. 사용된 구조 모델의 PDB code는 3U0R(API5) 와 1BAS(FGF2)이며 모델빌딩(Model building)은 COOT 프로그램을 이용하였고, 구조모델 정밀화는 REFMAC5와 PHENIX 프로그램을 이용하였다.

그 결과, [도 2] 및 [도 3]에 나타난 바와 같이 구조를 규명하였다. 구체적으로, API5 및 FGF2의 결합에 직접적으로 관여하는 결합부위는 API5의 경우 D145, E184, D185, E190, E219, R237 및 N228 이며; FGF2의 경우 K277, K267, R262, T263, K261, K271 및 R181 인 것을 확인할 수 있었다.

<1-2> API5 및 FGF2 단백질의 결합 검증

상기 실시예 <1-1>에서 확인한 API5 및 FGF2의 결합 부위와 관련하여 API5 및 FGF2의 결합력을 검증하고자 하였다.

구체적으로, 풀다운 어세이(Pulldown assay)를 위하여 GST-API5 야생형(GST-API5 WT) 및 돌연변이(GST-API5 3Mut(E184A/D185A/E190A))를 이용하였고, 대조군으로 GST(Glutathione-S-Transferase) 단백질을 준비하였다. 상기 3개의 단백질을 각 2개씩, 총 6개의 글루타티온-아가로스 레진(glutathione-agarose resin)이 50 ㎕씩 담겨진 튜브에 10 ㎍씩 넣고 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음 PBS(phosphatebuffered saline) 버퍼를 500 ㎕씩 6개의 튜브에 넣고 섞어준 다음 10,000 rpm으로 1분간 원심분리하고 상청액을 버리는 워싱 스텝(washing step)을 2회 수행하였다. GST 단백질이 담긴 2개의 튜브에 FGF2 WT(C211S/C229S) 및 FGF2 돌연변이(FGF2 3Mut, C211S/C229S/R262A/T263A/K271A)를 각각 10 ㎍ 넣고 나머지 API5 WT 가 담긴 2개의 튜브와 API5 3Mut가 담긴 2개의 튜브에 FGF2를 동일하게 넣은 다음 1시간 더 4℃에서 인큐베이션 하였다. 그 다음, 각 튜브에 PBS 버퍼를 500 ㎕씩 넣어서 2회 워싱을 한 다음, 상청액을 버리고 5X 샘플버퍼(sample buffer, 250 mM Tris-HCl pH 6.8, 10% SDS, 0.05% 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 10% 글리세롤(glycerol), 5% 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 50 ㎕씩 넣고 SDS-폴리아크릴아마이드겔(SDS-polyacrylamide gel)을 이용하여 분석하였다.

그 결과, [도 4]에 나타난 바와 같이 API5-FGF2 결합 부위(Interaction interface) 돌연변이의 경우 API5-FGF2간 결합 감소를 확인할 수 있었다.

또한, 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance; SPR) 분광광도법(SR7000DC, Reichert Analytical Instrument, USA)을 위하여, 우선 두개의 카복시메틸 덱스트란 하이드로겔 서페이스 센서칩(carboxymethyl dextran hydrogel surface sensor Chip)에 각각 단백질을 고정하기 위해서 API5 WT 40 ㎍ 및 API5 3Mut 10 ㎍를 부동화 버퍼(immobilization buffer, 20 mM sodium acetate pH 5.5)와 함께 20 ㎕/min로 포화(saturation)될 때까지 흘렸으며, 그 다음 PBS 버퍼를 30분 동안 흘리면서 평형(equilibration) 시켰다. 모든 실험은 25℃에서 실행하였으며, API5 WT 칩에 다양한 농도의 FGF2(C211S/C229S) 및 FGF2 Mut(C211S/C229S/R262A/T263A/K271A)를 3분 동안 30 ㎕/min으로 흘렸으며 API5 3 돌연변이(API5 3Mut) 칩에도 동일한 방법으로 흘려주었다. 칩의 리제너레이션(regeneration)은 10-50 mM 소듐 하이드록사이드(sodium hydroxide) 용액을 이용하였으며 상기 실험은 두 번 반복하였다. 결합력은 칩 표면에 리프렉티브 인덱스(refractive index)의 변화를 통해 측정하였고, 리스폰스 유닛(response units, μRIU)값으로 표시하였으며 SPR 데이터는 Scrubber2 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

그 결과, [도 5] 및 [도 6]에 나타난 바와 같이 상기 풀다운 어세이와 마찬가지로 동정된 결합자리의 돌연변이에서는 API5와 FGF2 사이의 결합력이 줄어든 것을 확인하였다.

API5와 FGF2 결합체의 기능 및 작용기전 분석

<2-1> API5-FGF2 복합체에 존재하는 단백질 동정

① CRISPR/Cas9 시스템으로 내재된 API5를 제거하고 외인성 API5 야생형 및 돌연변이를 발현하는 세포주 제작

API5-FGF2 결합체의 기능을 확인하기 위해서, 세포에 내재된 API5를 API5 야생형 및 돌연변이로 치환하는 세포를 제작하였다.

구체적으로, CRISPR/Cas9 시스템으로 내재된 API5의 발현을 억제할 수 있는 벡터를 CRISPR V2 벡터(Plasmid #52961, Addgene)에 가이디드(guided) RNA(5′-CACCGTGTTTTGCAGGGACTTTAGG-3′, 서열번호 5)를 도입하여 제작하였다. 그 다음, 야생형 및 돌연변이 API5를 발현시키기 위해 pCAG-Flag-IRES-Blasticidin 벡터에 API5 WT 및 FGF2와 결합할 수 없는 돌연변이 3Mut(E184A/D185A/E190A) 및 4Mut(D145A/E184A/D185A/E190A)를 각각 삽입하였다. 그 다음, API5 guided RNA, Cas9, 및 퓨로마이신 내성유전자를 동시에 포함하는 렌티바이러스(Lentivirus)를 제작하여 HeLa 세포에 형질감염시키고, 퓨로마이신을 처리하여 형질감염된 세포만 살아남게 하였다. 이후 Flag-API5 정상 및 돌연변이와 블라스티시딘(blasticidine) 내성 유전자를 동시에 발현시킬 수 있는 재조합 벡터를 리포펙타민(Lipofectamine) 3000(Thermefisher)을 이용하여 삽입하고, 블라스티시딘을 처리하여 2차 형질전환된 세포를 선택했다. 상기 선택된 세포를 PBS를 이용하여 세척하고, 세포용해 완충용액(lysis buffer; 20mM Tris-Cl(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1%(v/v) Triton X-100 및 단백질 분해효소 억제제(protease inhibitors)를 이용하여 세포를 용해시킨 후에 API5 항체(Abcam) 및 Flag 항체(Cell Signaling)를 이용하여 SDS-page 및 웨스턴 블롯팅으로 확인하였으며 대조군으로는 엑틴(Actin) 항체(Abcam)를 사용하였다(도 7).

② API5 정상 및 돌연변이에 결합하는 단백질 동정

상기 실시예 <2-1>의 ①에서 제작한, 내재된 API5 대신 Flag-tagged API5 WT 및 FGF2 4Mut을 발현하는 HeLa 세포에서 anti-Flag 항체를 이용하여 API5 WT 및 4Mut 복합체를 각각 정제한 후 LC-MS/MS를 이용하여 복합체에 포함된 단백질들을 확인하였다. 복합체 정제를 위해 HeLa 세포를 단일 세포로 분리 후 IP150 버퍼(150 mM NaCl, 25 mM Tris(pH 8.0), 0.1% NP-40, 10% 글리세롤, 1 mM EDTA)로 현탁(suspension)한 후 음파처리(sonication, SONICS vibra cell)을 통해 세포를 용해(lysis)하고, 15,000rpm으로 10분간 원심분리 하여 상청액을 얻었다.

상기 얻어진 상청액에 anti-Flag 항체가 결합된 플래그 컨쥬게이티드 아가로스 비드(Flag conjugated agarose bead; Sigma-Aldrich, USA)를 각 샘플당 20 ㎕ 넣고 4℃에서 4시간 반응 후, 스핀다운(spin-down) 하여 상청액을 제거했다. 그 다음, BC150 버퍼(20 mM Tris(pH 7.9), 15% 글리세롤, 1 mM EDTA, 0.05% NP-40, 150 mM KCl)로 2회, BC300 버퍼(20 mM Tris pH 7.9, 15% 글리세롤, 1 mM EDTA, 0.05% NP-40,300 mM KCl)로 2회 세정 후, 3X Flag-펩타이드(Sigma, F4799)를 0.1 ㎍/㎕ 를 포함한 TBS(150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.4) 버퍼로 용리(Elution) 하였다.

상기 용리된 복합체의 단백질들을 트립신(Trypsin)으로 자른 후, 액체크로마토그래피(Ultimate 3000 RSLCnano system, Thermo Fisher Scientific) 및 질량분석기(Q Exactive TM hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 분석하고, Proteome Discoverer 21 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 단백질을 확인하였다.

그 결과, [도 7]에 나타난 바와 같이 237개의 단백질이 API5 WT과 결합하였고, 그 중 112개의 단백질은 API5 4Mut와는 결합하지 않음을 확인할 수 있었다.

③ API5 정상 및 돌연변이에 결합하는 단백질들의 인터엑톰 분석

API5 WT 및 4Mut의 인터액톰(interactome)을 인제뉴어티 패스웨이 분석(Ingenuity Pathways Analysis(IPA); Ingenuity System)을 통해 분석하였다. 코어 분석에서 질병 및 기능에 따른 분류 결과 [도 8] 및 [도 9]에 나타난 바와 같이 mRNA 수송(export)와 관련된 기능에 가장 많은 단백질들이 분류되었다.

또한, mRNA 수송 머시너리(machinery) 단백질들 중 API5 WT에 FGF2 결합 의존적 혹은 비의존적으로 결합하는 단백질들을 확인하여 [도 10]에 나타내었다.

<2-2> API5 및/또는 FGF2와 UAP56의 직접적인 결합 확인

표면 플라스몬 공명 분광광도법(SR7000DC, Reichert Analytical Instrument, USA)을 이용하여 UAP56 과 API5, FGF2 또는 API5-FGF2 복합체의 결합력을 분석하였다. 하나의 폴리에틸렌글리콜(PEG)-베이스드 센서 서페이스 센서칩(Polyethylene glycol(PEG)-based sensor surface sensor Chip)에 UAP56 단백질을 고정하기 위해서 42 ㎍의 부동화 버퍼(20 mM 소듐 아세테이트(sodium acetate, pH 5.5)와 함께 20 ㎕/min로 포화(saturation)될 때 까지 흘린 다음 PBST 버퍼(1X PBS, 0.005% tween 20)로 30분 동안 흘리면서 평형(equilibration)시켰다.

모든 실험은 25℃에서 실행하였으며 UAP56 칩에 다양한 농도의 API5, FGF2 또는 API5-FGF2 복합체를 각각 3분 동안 30 ㎕/min으로 흘렸으며 칩의 리제너레이션(regeneration)은 10 mM 글리신(Glycine) pH 1.5을 이용하였다. 상기 실험은 두번 반복하였으며 결합력은 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 확인하였다.

그 결과, [도 12]와 같이 UAP56은 API5 단독 또는 FGF2 단독에 비하여 API5-FGF2 복합체와 보다 강한 친화력을 갖는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 풀다운 어세이(Pulldown assay)를 위하여 GST-UAP56을 이용하였고, 대조군으로 GST 단백질을 준비하였다. 준비된 단백질은 3개의 튜브에 GST-UAP56 10 ㎍과 HIS-API5, HIS-FGF2 또는 HIS-API5+HIS-FGF2 를 각각 10 ㎍씩 넣고 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션 하였다. 나머지 3개의 튜브에 GST 단백질을 넣고 위와 동일하게 섞어주고 다음날 총 6개의 튜브에 글루타티온-아가로스 레진(glutathione-agarose resin)을 50 ㎕씩 담고 버퍼로 워싱하여 준비하였다. 6개의 튜브에 미리 준비한 샘플(GST-UAP56+HIS-API5, GST-UAP56+HIS-FGF2, GST-UAP56+HIS-API5+HIS-FGF2, GST+HIS-API5, GST+HIS-FGF2, GST+HIS-API5+HIS-FGF2)을 각각 넣고, 4℃에서 2시간 보관 후 10,000 rpm으로 1분간 원심분리하고 상청액을 버리고 남은 레진을 PBS 버퍼로 500 ㎕씩 6개의 튜브에 넣고 섞어준 후 10,000 rpm으로 1분간 원심분리 후 상청액을 버렸으며 상기 워싱 방법을 두 번 반복하였다. 그 후, 일루션(Elution) 버퍼(1X PBS, 20 mM 글루타티온) 150 ㎕을 첨가하고 5분간 얼음에 넣고 인큐베이션 한 후 10,000 rpm으로 2분간 원심분리 하였다. 그 다음, 상청액을 새로운 튜브에 옮기고 50 ㎕씩 5X 샘플 버퍼(250 mM Tris-HCl pH 6.8, 10% SDS, 0.05% 브로모페놀블루, 10% 글리세롤, 5% 베타-머캅토에탄올)를 넣어서 웨스턴 블롯팅(Western blotting)으로 분석 하였으며 이때 Anti-His 마우스(Abm, G020, Canada) 및 Anti-GST 마우스(Abm, G018, Canada)을 이용하였다.

그 결과, [도 13]과 같이 UAP56은 API5 단독 또는 FGF2 단독에 비하여 API5-FGF2 복합체와 보다 강한 친화력을 갖는 것을 확인할 수 있었다.

상기 [도 12] 및 [도 13]의 결과를 통하여 API5-FGF이 mRNA 수송에 중요한 단백질인 UAP56(DDX39)와 직접 결합함을 확인하였다.

<2-3> API5-FGF2 복합체가 mRNA 수송에 미치는 영향 확인

① 컨디셔널 shRNA 발현을 통해 내재된 API5를 제거하고 외인성 API5 정상 및 돌연변이를 발현하는 세포주 제작

API5를 표적하는 짧은 헤어핀 RNA(shAPI5 #1, 5′- CCACAAGGTTTGTGACATATT-3', 서열번호 6)를 Tet-pLKO-puro 벡터(Plasmid #21915, Addgene)에 넣어 독시사이클린(doxycycline) 의존적으로 shRNA(short hairpin RNA) #1이 발현되고 항상 퓨로마이신(puromycin) 내성 유전자를 발현시키는 렌티바이러스 생산용 재조합 벡터(Tet-PLKO-puro-shAPI5)를 제작하였다. 상기 실시예 <2-1>의 ①에서 제작한 pCAG-Flag-IRES-Blasticidin API5 WT 및 3Mut에 부위 특이적 변이(site-directed mutagenesis)를 통해 shAPI5에 의해 저해되지 않는 침묵 돌연변이(silent mutation)로서 API5 WT-R 및 API5 3Mut-R을 제작하였다. 두 벡터는 모두 API5의 939-944번째 뉴클레오타이드 acaagg가 acGCgg로 치환되어 shAPI5가 결합하지 못하지만, 번역되는 아미노산의 서열 변화는 없다.

HeLa 세포에 상기 Tet-PLKO-puro-shAPI5에서 생산된 렌티바이러스를 감염 시키고, 퓨로마이신으로 형질전환된 세포를 고른 후, 추가로 API5 WT-R 및 API5 3Mut-R을 리포펙타민(Lipofectamine) 3000(Thermefisher)을 이용하여 상기 형질감염된 세포주에 2차적으로 형질주입하였다. 배지에 추가로 블라스티시딘을 처리하여 형질감염 및 주입된 세포주를 제작하였으며 상기 제작된 세포주에 독시사이클린을 처리하면 내인성 API5의 발현이 저해되고 외인성 API5 WT 혹은 3Mut는 계속 발현되는 것을 웨스턴 블롯팅을 통하여 확인하였다.

② API5-FGF2 복합체가 전반적인 mRNA 수송에 미치는 영향 확인

API5 단백질과 FGF2 단백질 결합체와 mRNA 수송(export)와의 연관관계를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <2-3>의 ① 방법으로 제작된 세포주를 이용하여 형광동소혼성화(Fluorescence in situ hybridization; FISH) 실험을 통해 mRNA의 핵에서 세포질로의 이동 정도를 조사하였다.

FISH는 Cy3-labeled Oligo(dT)50(FISH probe, Genelink, USA)을 사용하고 Stellaris RNA-FISH kit(LGC Bioresearch Technologies)을 이용하여 실험을 진행하였으며 세포(shAPI5, shAPI5/API5 WT, shAPI5/API5 3Mut)는 MEM/EBSS(Hyclone, USA)배지에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)과 1% 페니실린 스트렙토마이신(penicillin streptomycin; Gibco, USA)을 첨가하여 배양하였고, 배양시 독시사이클린(doxycycline)을 처리한 것과 처리하지 않은 것을 각각 배양하여, 3일 후 10μM 악티노마이신 D(Actinomycin D)를 2시간 동안 처리하였다. Mock는 shRNA를 발현하는 Tet-pLKO-puro empty 벡터를 형질전환한 것으로서 대조군으로 사용하였다.

그 다음, 상온에서 24-웰 커버 글라스 위의 세포들을 PBS 버퍼로 워싱한 후에, 픽스(Fix) 버퍼(1X PBS, 4% 포름알데히드)로 고정한 다음 PBS 버퍼로 두 번 워싱 하고 70% 에탄올을 넣고 4℃에서 16시간 보관하였다. 그 다음 RNA-FISH 키트에 1X워시 버퍼 A에 10% 포름아미드(formamide)를 넣고 24-웰 플렛에 1 ㎖씩 분주하여 워싱 하였다. 혼성화(Hybridization)를 위하여 12.5 μM FISH 프로브(probe)를 10% 포름아미드가 함유된 혼성화 버퍼로 125 nM이 되게 희석한 다음, 24-웰 플레이트에 200 ㎕씩 분주하고 37℃의 어두운 곳에서 4시간 보관하였다. 그 후 혼성화 버퍼를 버리고 각 웰에 10% 포름아미드가 함유된 1X 워시 버퍼 A를 1 ㎖ 씩 넣고 37℃에서 30분 동안 보관하였다.

그 후, 10% 포름아미드가 함유된 1X 워시 버퍼 A에 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)을 5 ng/㎖이 되게 녹였으며 상기 DAPI 솔루션을 1 ㎖씩 각 웰에 넣고 37℃에서 30분 동안 보관하였다. 30분 후 DAPI 솔루션을 버리고, RNA-FISH 키트에 있는 1X 워시 버퍼 B를 각 웰에 1 ㎖씩 넣고 상온에서 5분 동안 처리하였다.

마지막으로, 워시 버퍼 B를 버리고 마이크로스코프 슬라이드(microscope slide) 위에 벡타쉴드 마운팅 배지(Vectashield Mounting Medium; Invitrogen, USA)를 4 ㎕씩 분주하고, 24웰 플레이트에서 떼어 낸 커버 글라스를 올려놓았다. Poly(A)+RNA 측정하기 위한 이미지는 confocal-II LSM780(Carl Zeiss, Germany)에 의해 기록되었고, Zen 23 lite 프로그램을 이용하여 처리하였다.

그 결과, [도 14]에 나타난 바와 같이 API5-FGF2 결합은 벌크 mRNA(polyA tail을 갖는 일반적인 mRNA)의 핵 수송(nuclear export)에 관여함을 확인할 수 있었다.

③ API5-FGF2 복합체가 4E-SE 엘리먼트를 포함하는 mRNA의 수송에 미치는 영향 확인

API5-FGF2 복합체는 eIF4E/LRPPRC 복합체와 상호작용할 수 있기 때문에, 4E-SE 엘리먼트(element)를 포함하는 MYC, CCND1 또는 CCNE1 의 mRNA의 수준을 분석하여 API5-FGF2 복합체가 mRNA 수송(export)에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

상기 실시예 <2-3>의 ① 방법으로 제작된 세포주에 4일 이상 독시사이클린을 처리하여 내인성 API5의 발현을 저해한 후 트립신 처리를 통하여 단일 세포로 분리한 후에 각 1×10⁶ 개의 세포를 준비하고 세포 전체에 존재하는 RNA, 핵 내 RNA(N) 또는 세포질 내 RNA(C)를 RNA subcellular isolation kit(Active motif, cat104694)을 이용하여 추출하였다. 각 실험군 별로 상기 키트를 2개씩 준비하여 하나는 전체 RNA를 추출하였고, 다른 하나는 핵 RNA 와 세포질 RNA를 분리하여 추출하였다. 추출한 RNA는 역전사 효소(AMV)를 이용하여 DNA로 합성하였으며 합성한 DNA는 실시간 PCR을 통해 RNA 발현을 확인하였다. MALAT1은 항상 핵에 존재하는 ncRNA(noncoding RNA)로 mRNA 수송에 영향을 받지 않아 대조군으로 사용하였다.

그 결과, [도 15]에 나타난 바와 같이, 독시사이클린(Dox) 처리로 인해 API5가 억제되는 경우 RNA가 세포질(C)로 이동하지 못하고 핵(N)에 정체되어 있었다. 이에 API5 WT를 처리하는 경우(WT rescue) RNA가 다시 세포질로 이동하였으나, API5 3Mut를 처리하는 경우(Mut rescue)에는 여전히 RNA가 핵에 정체되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

또한 RNA 정체로 인한 단백질 발현량 감소를 웨스턴 블롯팅을 통하여 확인하였다. 상기 실시예 <2-1> 방법을 이용하여 세포를 용해시킨 후에 MYC 항체 및 CCND1 항체를 이용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅으로 확인하였으며 대조군으로는 ACTB(beta-Actin) 항체(Abcam)를 사용하였다.

그 결과, [도 16]에 나타난 바와 같이 독시사이클린(Dox) 처리로 인해 API5가 억제되는 경우 c-MYC 또는 CCND1 단백질 발현량이 감소하였으며, 이에 API5 WT를 처리하는 경우 상기 단백질들의 발현량이 증가하였으나 API5 3Mut를 처리하는 경우에는 여전히 상기 단백질들의 발현량이 감소된 상태인 것을 확인할 수 있었다.

API5와 FGF2 결합과 관련한 암세포 항암제 내성 증감 확인

<3-1> API5 발현 억제의 항암제 내성에 대한 영향

상기 실시예 <2-3>의 ① 방법과 유사한 방법으로 제작된 컨디셔널(Conditional) shRNA 발현을 통해 내재된 API5가 제거되는 세포주 및 외인성 API5 정상 및 돌연변이를 발현하는 세포주를 HeLa와 Caski-p3의 두 종류의 세포주를 이용하여 제작하였다. 짧은 헤어핀 RNA의 오프-타겟(off-target) 효과를 배제하기 위해 API5를 표적하는 짧은 헤어핀 RNA를 한개 더 추가로 제작하여 실시예 <2-3>의 ① 방법에 제시된 shAPI5는 #1으로, 추가 제작된 shAPI5는 #2로 명명하였다 (shAPI5 #2, 5′-GCAGCAATTTGGGCAACTTTA-3′, 서열번호 7). 상기 두 세포주에 4일 이상 독시사이클린을 처리하고 트립신 처리를 통하여 단일 세포로 분리한 후에 96-웰 플레이트에 각 웰 당 2×10³ 개의 세포를 분주하였다. 다음날 시스플라틴(Cisplatin)을 10 μM로 처리한 후 48-72시간 후에 세포 생존도를 MTT 분석을 통해 확인하였다.

그 결과, [도 17]에 나타난 바와 같이 API5 단백질의 하향 조절로 인해 시스플라틴에 대한 내성이 감소하였다.

<3-2> API5 과발현의 항암제 내성에 대한 영향

HeLa와 Caski-p3의 두 종류의 세포주에 상기 실시예 <2-1>의 ①에서 사용한 pCAG-Flag-IRES-Blasticidin 벡터에 API5 WT 및 FGF2와 결합할 수 없는 돌연변이 3Mut(E184A/D185A/E190A) 또는 4Mut(D145A/E184A/D185A/E190A) 벡터를 이용한 형질 전환을 통하여 API5 단백질을 과발현시킨 후 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 시스플라틴 내성 변화를 확인하였다.

그 결과, [도 18]에 나타난 바와 같이 정상 API5 과발현에 의해서는 시스플라틴 내성이 증가하였나, FGF2 결합불능 API5 돌연변이체의 과발현에서는 내성 증가가 없음을 확인할 수 있었다.

3차원 구조를 기반으로 한 API5에 결합하는 FGF 유래 펩타이드 및 FGF2에 결합하는 API5 유래 펩타이드 도출

상기 <실시예 1>에서 밝혀진 API5-FGF2 복합체 구조 좌표(PDB)를 Pymol 또는 COOT 과 같은 삼차원 구조 시각화 프로그램을 이용하여 발명자가 직접 시각적 분석을 통하여 두 단백질이 결합하는 부위를 확인하였다.

그 결과, [도 19]에 나타난 바와 같이 결합 부위 중 API5와 FGF2 단백질의 결합에 직접적으로 관여하는 아미노산 잔기 5개 이상을 포함하는 펩타이드를 도출하였다. 상기 펩타이드 중 API5-segment 2는 본 발명의 서열번호 1 아미노산 서열에 해당하며, FGF2-segment 1은 본 발명의 서열번호 2 아미노산 서열에 해당한다.

API5 또는 FGF2 유래 펩타이드의 항암제 내성 세포에 대한 효과

API5와 FGF2의 결합을 차단하는 펩타이드 2종의 항암제 내성극복 효과를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 우선 API5 발현이 높은 HeLa 세포주의 시스플라틴(Cisplatin)에 대한 세포생존도를 측정하고자 하였다. 96-웰 플레이트에 각 웰당 1×10⁴ 개의 HeLa 세포를 분주한 후 24시간 뒤에 시스플라틴(Cisplatin)을 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100 또는 1000 μM 으로 각각 처리하고 48시간 후에 세포생존도를 MTT 분석을 통해 확인하였다. 그 결과, [도 20]에서 나타나는 바와 같이 시스플라틴의 HeLa 세포에 대한 IC₂₀은 7.36±0.98 μM인 것을 확인할 수 있었다.

[도 21]에 명시된 실험군으로 96웰 플레이트에 각 웰당 1×10⁴ 개의 세포를 분주하였다. 다음날 PBS로 워싱 후 0.1% 소태아혈청(fetal bovine serum; Gibco, USA)이 첨가된 DEME(Hyclone, USA)배지에 Pierce protein transfection reagent kit(Thermo, USA)를 이용하여 API5 또는 FGF2 유래 펩타이드를 각각 처리하였다. 24시간 이후 기존 배지를 제거하고 0.1% 소태아혈청을 첨가한 DEME(Hyclone, USA)배지에 시스플라틴을 8 μM 처리하여 48시간 후 세포생존도를 MTT 분석으로 측정하였다. 상기 시스플라틴을 처리하는 48시간 동안 2회에 걸쳐 24시간 마다 상기 설명된 방법으로 API5 또는 FGF2 유래 펩타이드를 처리하였다.

그 결과, [도 22] 에 나타난 바와 같이 상기 펩타이드 처리로 인해 시스플라틴에 대한 내성이 사라졌으며, 해당결과는 펩타이드 농도 의존적임을 확인하였다.

항암 바이러스 제조

API5 또는 FGF2 유래 펩타이드가 EGFP-P2A-펩타이드 형태로 발현될 수 있도록 해당 DNA 서열을 pUltra 벡터(Addgene plasmid # 24129)에 넣은 재조합 벡터를 제조하였다. 이 경우 발현된 재조합 단백질은 세포내에서 P2A위치가 잘려 EGFP와 API5 또는 FGF2 유래 펩타이드로 나뉜다. 이를 통해 해당 세포에 펩타이드가 전달되었는지 여부를 EGFP 신호로 확인할 수 있다.

API5 또는 FGF2 유래 펩타이드를 암호화하고 있는 항암 렌티바이러스(Lentivirus)를 생성하기 위해, pUltra 재조합 벡터와 packaging 벡터(psPAX2; Addgene plasmid # 12260 ), envelop 벡터(pMD2.G; Addgene plasmid # 12259)를 동시에 폴리에틸렌이민(polyethylenimine; #24313, Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA)를 이용하여 293FT 세포에 삽입하였다. 48시간 후에 렌티바이러스를 함유하고 있는 세포배양액을 채취하여 0.45 ㎛ 주사기 필터로 거른 후 실험에 사용하였다.

항암 바이러스에서 발현된 단백질 확인

상기 [실시예 6]에서 제조된 항암 바이러스에서 발현되는 API5 또는 FGF2 유래 펩타이드가 FGF2 또는 API5 와 직접적으로 결합하는지 여부 및 mRNA 수송에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <1-2>와 동일한 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance; SPR) 분광광도법을 사용하여 API5 또는 FGF2 유래 펩타이드와 FGF2 또는 API5 와의 결합력을 측정하였다. 또한, 상기 실시예 <2-3>의 ③과 동일한 방법으로 API5 유래 펩타이드가 MYC 또는 CCND1의 발현에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다. 대조군으로 사용한 서열은 서열번호 8(DRQLQLSTLQRML)이며, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9이다.

그 결과, API5 유래 펩타이드는 FGF2에, FGF2 유래 펩타이드는 API5에 직접적으로 결합하며(도 23), API5 유래 펩타이드를 발현하는 바이러스는 유의적으로 c-MYC 및 CCND1의 발현을 억제하는 확인할 수 있었다(도 24).

항암 바이러스의 항암 효과 확인

상기 <실시예 6>에서 렌티바이러스(Lentivirus)로 제조한 항암 바이러스의 암세포주에 대한 항암 효과를 확인하고자 하였다.

96-웰 플레이트에 8 웰씩 5×10³ ~ 10×10³개의 자궁경부암 세포주(HeLa, Caski), 간암 세포주(Hep3B, PLCPFR5), 신장암 세포주(ACHN, CAKI2) 및 췌장암 세포주(MIAPACA2, ASPC1)를 각각 분주하고 5% 이산화탄소의 37 ℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 이때 배양액은 10% FBS, 1×Cellmaxin(5 ㎍/㎖), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/Streptomycin)이 들어있는 base media를 사용하였다(HeLa: MEM/EBSS, ACHN/APSC1: RPMI-1640, Caki2/MIAPACA2: DMEM/High glucose). 24시간 후 base media를 제거하고 base media로 희석한 렌티바이러스(API5 유래 펩타이드, FGF2 유래 펩타이드 발현)를 200 ㎕씩 각 웰에 분주한 후, 24시간 동안 인큐베이터에서 배양한 다음 base media로 교체하였다. 48시간 후 PBS(Phosphate-buffered saline; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄)로 희석한 12 mM MTT 용액(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) 20 ㎕를 각 웰에 넣고, 37 ℃에서 4시간 반응시킨 후 MTT 및 배지를 제거하고, 200 ㎕ DMSO로 살아있는 세포에 의해 형성된 formazan crystal을 녹여내고 Infinte M200 PRO(TECAN Group Ltd, Switzerland)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다(도 25).

그 결과, [도 26]에서 나타나는 바와 같이, API5 유래 펩타이드(API5) 또는 FGF2 유래 펩타이드(FGF2)는 자궁경부암, 간암, 신장암 또는 췌장암 세포주에 대하여 항암효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다(*** p<0.001, ** p<0.01, * p<0.05).

항암바이러스와 항암제 병용 처리

상기 <실시예 6>에서 제조한 항암바이러스와 항암제를 암세포주에 병용처리하는 경우 시너지 효과가 발생하는지 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 96-웰 플레이트에 8 웰씩 5×10³ ~ 10×10³개의 간암 세포주 (Hep3B, PLCPFR5)를 각각 분주하고 5% 이산화탄소의 37 ℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 이때 배양액은 10% FBS, 1×Cellmaxin(5 ㎍/㎖), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/Streptomycin)이 들어있는 base media를 사용하였다. 24시간 후 base media를 제거하고 base media로 희석한 렌티바이러스(API5 유래 펩타이드 발현)를 200 ㎕씩 각 웰에 분주한 후, 24시간 동안 인큐베이터에서 배양한 다음 base media로 교체하였다. 이 때 OTX015 병용처리 샘플의 경우 1 μM OTX015가 포함된 base media로 교체하였다. 48시간 후 PBS(Phosphate-buffered saline; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄)로 희석한 12 mM MTT 용액(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) 20 ㎕를 각 웰에 넣고, 37 ℃에서 4시간 반응시킨 후 MTT 및 배지를 제거하고, 200 ㎕ DMSO로 살아있는 세포에 의해 형성된 formazan crystal을 녹여내고 Infinte M200 PRO(TECAN Group Ltd, Switzerland)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다(*p<0.05).

	Control(%)	otx(%)	API5(%)	o-API5(%)
Hep3B	100	63.6	68.7	51.9
PLCPRF5	100	70.6	78.9	53.7

그 결과, 상기 [표 1] 또는 [도 27]에서 나타나는 바와 같이 항암바이러스와 OTX015를 병용처리하는 경우 암세포 생존 억제 효과가 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

<110> NATIONAL CANCER CENTER <120> Oncolytic virus for expressing peptide derived from FGF2 or API5 and uses thereof <130> 1065945 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides derived from API5 <400> 1 Leu Glu Asp Val Thr Gly Glu Glu Phe 1 5 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides derived from FGF2 <400> 2 Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> API5 DNA sequence <400> 3 ttggaggatg tgacaggcga ggagttc 27 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF2 DNA sequence <400> 4 aagcgcaccg gccagtacaa gctgggcagc aagacc 36 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> guided RNA <400> 5 caccgtgttt tgcagggact ttagg 25 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shAPI5 #1 <400> 6 ccacaaggtt tgtgacatat t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shAPI5 #2 <400> 7 gcagcaattt gggcaacttt a 21 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> control_aminoacid <400> 8 Asp Arg Gln Leu Gln Leu Ser Thr Leu Gln Arg Met Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control_polynucleotide <400> 9 gaccggcagc tgcagctgtc caccctgcag cggatgctg 39

Claims (14)

1. 서열번호 1 의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 발현하는 항암 바이러스(oncolytic virus).
   
2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 API5(apoptosis inhibitor 5)와 FGF2(fibroblast growth factor-2)의 결합을 억제하는 것을 특징으로 하는 항암 바이러스.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 서열번호 3의 폴리뉴클레오타이드 서열로 암호화 되는 것을 특징으로 하는 항암 바이러스.
   
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 항암 바이러스는 폭스바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 볼거리 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파보바이러스, 홍역 바이러스, 인간 한타 바이러스, 점액종 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 렌티바이러스, 콕사키바이러스, 에코바이러스, 세네카 밸리 바이러스 및 신드비스 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항암 바이러스.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 암은 위암, 폐암, 자궁경부암, 대장암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 간암, 췌장암, 난소암, 갑상선암 및 방광암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항암 바이러스.
   
7. 제1항의 항암 바이러스를 포함하는, 시스플라틴의 내성 억제용 조성물.
   
8. 삭제
9. 제1항의 항암 바이러스를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 암은 위암, 폐암, 자궁경부암, 대장암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 간암, 췌장암, 난소암, 갑상선암 및 방광암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
    
11. 제9항에 있어서, 상기 약학적 조성물에 항암제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 항암제는 BET(Bromodomain and Extra-Terminal motif) 억제제인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
    
13. 제1항의 항암 바이러스를 포함하는 항암보조제.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 항암보조제에 BET(Bromodomain and Extra-Terminal motif) 억제제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암보조제.
    
    

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