JP2008512121A - 腫瘍の診断および処置のための組成物および方法 - Google Patents

腫瘍の診断および処置のための組成物および方法 Download PDF

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ケネス ヒラン，
カートムト ケッペン，
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ポール ポラキス，
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チエ サカナカ，
ビクトリア スミス，
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トーマス ウー，
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Abstract

本発明は、哺乳動物における腫瘍の診断および治療で有用な組成物、およびそのために該組成物を用いる方法に関する。１以上のタイプの正常な非−癌細胞によるか、またはその表面におけると比較して１以上のタイプの癌細胞による、またはその表面でより大きな程度発現される種々の細胞ポリペプチド（およびそれらをコードする核酸またはその断片）を同定が記載される。本発明の１つの具体例において、本発明は、腫瘍−関連抗原性標的ポリペプチドまたはその断片（「ＴＡＴ」ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子を提供する。

Description

（関連出願）
本願は、一部継続出願であり、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２０の下で２００２年６月１９日に出願された米国特許出願第１０／１７７，４８８号に対する優先権を主張する。この米国特許出願第１０／１７７，４８８号は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２００１年６月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／２９９，５００号、２００１年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／３０１，８８０号、および２００１年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／３２３，２６８号に対する優先権を主張する。これらの開示は、本明細書中に参考として援用される。
（発明の分野）
本発明は、哺乳動物における腫瘍の診断および治療で有用な組成物、およびそのために該組成物を用いる方法に向けられる。
悪性腫瘍（癌）は心臓病の後に合衆国における死亡の第二の主な原因である（Ｂｏｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＣＡ Ｃａｎｃｅｌ Ｊ． Ｃｌｉｎ． ４３：７（１９９３））。癌は増殖して腫瘍塊を形成する正常な組織に由来する異常なまたは新形成細胞の数の増加、これらの新形成腫瘍細胞による隣接組織への侵入、および血液またはリンパ系を介して地域的リンパ節へ、および転移と呼ばれるプロセスを介して離れた部位へ結局は拡大する悪性細胞の発生によって特徴付けられる。癌状態においては、細胞は、正常な細胞が成長しないであろう条件下で増殖する。癌は、異なる程度の侵入性および攻撃性によって特徴付けられる広く種々の形態で自己を発現する。
癌の診断および治療用の効果的な細胞標的を発見する試みにおいて、研究者は、１以上の正常な非−癌細胞と比較して、１以上の特定タイプの癌細胞の表面に特異的に発現される膜貫通またはそうでなければ会合ポリペプチドを同定しようと求めてきた。しばしば、そのような膜−会合ポリペプチドは、非−癌細胞の表面と比較して、癌細胞の表面でより豊富に発現される。そのような腫瘍−関連細胞表面抗原ポリペプチドの同定は抗体−ベースの療法を介して破壊のために癌細胞を特異的に標的とする能力を生起させてきた。この点に関し、抗体−ベースの療法は、ある種の癌の治療で非常に有効なことが判明していることを注記する。例えば、（共にＧｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ製の）ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）およびＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）は、各々乳癌および非−ホジキンリンパ腫を治療するのに成功して用いられてきた抗体である。より具体的には、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）はヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）プロト−オンコジーンの細胞外ドメインに選択的に結合する組換えＤＮＡ−由来ヒト化モノクローナル抗体である。ＨＥＲ２蛋白質の過剰発現は、原発性乳癌の２５ないし３０％で観察される。ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）は正常および悪性Ｂリンパ球の表面に見出されるＣＤ２０抗原に対して向けられた遺伝子工学により作成されたキメラネズミ／ヒトモノクローナル抗体である。これらの抗体は共にＣＨＯ細胞において組換えにより生産される。
癌の診断および治療用の有効な細胞標的を発見するための他の試みにおいて、研究者は、（１）１以上の特定のタイプの非−癌性正常細胞によるのと比較して、１以上の特定のタイプの癌細胞によって特異的に生産される非−膜−会合ポリペプチド、（２）１以上の正常な非−癌細胞のそれよりもかなり高い発現レベルにて癌細胞によって生産されるポリペプチド、または（３）その発現が、癌および（例えば、正常な前立腺および前立腺腫瘍組織）の双方において単一の（または非常に限定された数の異なる）組織タイプのみに特異的に制限されるポリペプチドを同定するのを求めてきた。そのようなポリペプチドは細胞内に位置したままであり得、あるいは癌細胞によって分泌され得る。さらに、そのようなポリペプチドは、癌細胞に対して増強または成長を高める効果を有するポリペプチドを生産しおよび／または分泌する細胞によるよりはむしろ、癌細胞それ自体によって発現されないであろう。そのような分泌されたポリペプチドはしばしば、正常な細胞よりは成長利点を持つ癌細胞を供する蛋白質であり、例えば、脈管形成因子、細胞接着因子、増殖因子等のようなものを含む。そのような非−膜会合ポリペプチドのアンタゴニストの同定がそのような癌の治療用の有効な治療剤として働くことが予測されよう。さらに、そのようなポリペプチドの発現パターンの同定は、哺乳動物における特定の癌の診断および治療で有用であろう。
哺乳動物における遺伝子発現を変調する能力は依然として困難である。伝統的には、それは、宿主が欠如するポリペプチドを発現するであろうウイルスベクターのようなツールを用いてなされてきた。ウイルスベクターを遺伝子発現を低下させるであろう宿主に導入する能力は完成されていない。遺伝子発現の抑制は、伝統的には、「ノックアウト」様式で哺乳動物においてなされており、そこでは、テスト哺乳動物、通常はマウスは相同組換えの技術を介して切除され、「ノックアウトされた」遺伝子を有する。マウスにおけるこの技術は、ヒトにおいては遅く、煩わしくかつ困難であって、非現実的である。従って、出願人らは、干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を発現して、遺伝子発現を低下させるであろうベクター系に目を転じた。
ｓｉＲＮＡは、小分子または抗体のような伝統的なアンタゴニストが失敗した遺伝子発現を変調する研究でのツールとして有用なことが判明した。（非特許文献１）。長さが２１ないし２３ヌクレオチドであるイン・ビトロで合成された二本鎖ＲＮＡは干渉性ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）として作用することができ、特異的に遺伝子発現を阻害することができる（非特許文献２）。これらのｉＲＮＡは、それらの標的ＲＮＡの分解を媒介することによって作用する。それらは長さが３０ヌクレオチド未満であるが、それらは細胞の抗ウイルス防御メカニズムをトリガーしない。そのようなメカニズムはインターフェロンの生産、および宿主細胞蛋白質合成の一般的な遮断を含む。現実的には、ｓｉＲＮＡを合成し、次いで、ＤＮＡベクターにクローン化することができる。そのようなベクターをトランスフェクトし、高いレベルにて、および／または組織特異的にｓｉＲＮＡを発現するようにすることができる。ｓｉＲＮＡ発現の高いレベルを用いて、細胞で生産される蛋白質の量を「ノックダウンし」または有意に低下させ、かくして、それは、蛋白質の過剰発現が癌のような障害にリンクすると考えられている実験で有用である。哺乳動物癌療法の進歩にかかわらず、遺伝子発現の低下を介して新形成細胞増殖を効果的に阻害することができる治療剤に対して大きな要望が存在する。従って、本発明の目的は、遺伝子発現を変調するシステムを同定することにある。
イン・ビボおよびイン・ビトロ双方において、薬物および他の細胞、組織および腫瘍を標的として、最大効率および最小毒性を達成する薬物および他の剤の送達の改良は長年の間、かなりの研究の焦点であった。生物学的に活性な分子を細胞に輸入するための効果的な方法を開発するために多くの試みがなされてきたが、完全に満足ができることが判明したものは無い。薬物の、例えば、隣接する細胞への細胞間再分布を最小としつつ、薬物とその細胞内標的との会合を最適化することは、しばしば、困難であるかまたは不十分である。
現在患者に非経口投与されるほとんどの剤は標的化されておらず、その結果、それが不必要であり、しばしば望ましくない身体の細胞および組織への剤の全身送達が行われる。この結果、有害な薬物副作用がもたらされかねず、しばしば、投与できる薬物（例えば、化学療法剤（抗癌）、細胞傷害性の酵素阻害剤および抗ウイルスまたは抗微生物薬物）の用量を制限する。比較により、薬物の経口投与は便宜かつ経済的な投与形態と考えられるが、一旦薬物が全身循環系に吸収されると、それは冒されていない細胞に対して非−特異的毒性の同一の関心を有する。更に複雑なことは、経口生物学的利用性および薬物への腸のさらなる暴露および、よって腸毒性の危険性に導く腸における薬物の滞留に関する問題を含む。従って、主な目標は、剤を特異的に細胞および組織に対して標的化するための方法を開発するものであった。そのような治療の利点は、そのような剤の感染していない細胞のような他の細胞および組織への不適切な送達の一般的な生理学的効果を回避することを含む。細胞内標的化は、細胞内での生物学的に活性な剤、すなわち、活性な代謝産物の蓄積または滞留を可能とする方法、化合物および処方によって達成することができる。
モノクローナル抗体療法が、癌、免疫学的および脈管形成障害を持つ患者の標的化治療のために確立されている。
種々の入手可能な有用なトキシンがある。例えば、アウリスタチンペプチド、アウリスタチンＥ（ＡＥ）およびモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）、ドラスタチンの合成アナログは（ｉ）（癌腫上のＬｅｗｉｓ Ｙに特異的な）キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６；（ｉｉ）血液学的悪性疾患でのＣＤ３０に対して特異的なｃＡＣ１０（非特許文献３；非特許文献４；“Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｏ Ｌｉｇａｎｄｓ”；非特許文献５；ＵＳ ２００４／００１８１９４）；（ｉｉｉ）ＣＤ２０−発現癌および免疫障害の治療のためのリツキサン（ＷＯ０４／０３２８２８）のような抗−ＣＤ２０抗体；（ｉｖ）結直腸癌の治療のための抗−ＥｐｈＢ２抗体２Ｈ９および抗−ＩＬ−８（非特許文献６）；（ｖ）Ｅ−セレクチン抗体（非特許文献７）；および（ｖｉ）他の抗−ＣＤ３０抗体（ＷＯ０３／０４３５８３）に結合体化されたモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）は２Ｈ９、マウスおよびヒトの間で密接な相同性がある１型ＴＭチロシンキナーゼ受容体であって、結直腸癌細胞で過剰発現されるＥｐｈＢ２Ｒに対しても結合体化された（非特許文献６）。
モノメチルアウリスタチンＭＭＡＦ、Ｃ−末端においてフェニルアラニンを持つアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）の変種（特許文献１；特許文献２）は、ＭＭＡＥよりも優れていないが、モノクローナル抗体に結合体化した場合にはより優れていると報告されている（非特許文献８）。アウリスタチンＦフェニレンジアミン（ＡＦＰ）；ＭＭＡＥのフェニルアラニン変種は、フェニレンジアミンスペーサーを介して１Ｆ６のＣ−末端を介して抗−ＣＤ７０ ｍＡＢ、１Ｆ６に連結された（非特許文献９）。
哺乳動物癌療法における前記で確認された進歩にもかかわらず、各々、哺乳動物において腫瘍の存在を検出することができるさらなる診断および治療剤に対する、および新形成細胞増殖を効果的に阻害することに対する大きな要求が存在する。従って、本発明の目的は；（１）正常な細胞、または他の異なる癌と比較して、１以上のタイプの癌細胞でより豊富に発現される細胞膜−会合ポリペプチド、（２）１以上の特定のタイプの非−癌性正常細胞によるのと比較して１以上の特定のタイプの癌細胞によって（または癌細胞の成長に対して増強効果を有するプリペプチドを生産する他の細胞によって）特異的に生産される非−膜−会合ポリペプチド、（３）１以上の正常な非−癌細胞のそれよりも有意に高い発現レベルで癌細胞によって生産される非−膜−会合ポリペプチド、または（４）その発現が、癌および非−癌双方の状態（例えば、正常な前立腺および前立腺腫瘍組織）において単一の（または非常に限定された数の異なる）組織タイプのみに特異的に限定されるポリペプチドを同定し、それらのポリペプチドおよびそれらをコードする核酸を用い、哺乳動物における癌の治療的処置および診断検出で有用な組成物を生産することにある。また、本発明の目的は、その発現が単一または非常に限定された数の組織に制限される細胞膜−会合分泌または細胞内ポリペプチドを同定し、それらのポリペプチド、およびそれらをコードする核酸を用い、哺乳動物における癌の治療的処置および診断検出で有用な組成物を生産することにある。
米国特許第５，７６７，２３７号明細書 米国特許第６，１２４，４３１号明細書 Ｓｈｉ Ｙ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００３），１９（１）：９−１２ Ｆｉｒｅ Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９），３９１；８０６−８１０ Ｋｌｕｓｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４），１５（４）：７６５−７７３ Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００３），２１（７）：７７８−７８４ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（２００３）．１０２（４）：１４５８−１４６５ Ｍａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００４），６４（３）：７８１−７８８ Ｂｈａｓｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００３）６３：６３８７−６３９４ Ｓｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４年３月２８日プレゼンテーション，Ｖｏｌｕｍｅ４５ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６２３ Ｌａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４年３月２８日プレゼンテーション、Ｖｏｌｕｍｅ ４５ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６２５
Ａ．具体例
本明細書中において、出願人らは、１以上のタイプの正常な非−癌細胞によるか、またはその表面におけると比較して１以上のタイプの癌細胞による、またはその表面でより大きな程度発現される種々の細胞ポリペプチド（およびそれらをコードする核酸またはその断片）を同定を初めて記載する。あるいは、そのようなポリペプチドは、癌細胞に対する増強または成長−促進効果を有するポリペプチドを生産し、および／または分泌する細胞によって発現される。またあるいは、そのようなポリペプチドは同一組織タイプの正常な組織細胞と比較して腫瘍細胞によって過剰発現できないが、むしろ、単一または非常に限定された数の組織タイプ（好ましくは、生命に必須ではない組織、例えば、前立腺等）のみの腫瘍細胞および正常細胞双方によって特異的に発現され得る。前記ポリペプチドの全ては本明細書中においては、腫瘍−関連抗原性標的ポリペプチド（Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｔａｒｇｅｔ ｐｏｒｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）（「ＴＡＴ」ポリペプチド）といい、これは、哺乳動物において癌の治療および診断のための有効な標的として働くと予測される。
従って、本発明の１つの具体例において、本発明は、腫瘍−関連抗原性標的ポリペプチドまたはその断片（「ＴＡＴ」ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子を提供する。
ある態様において、単離された核酸分子は、（ａ）本明細書中に開示されたアミノ酸配列を有する全長ＴＡＴポリペプチド、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを含むまたは含まない膜貫通ＴＡＴポリペプチドの細胞の細胞外ドメインまたは本明細書中に開示された全長ＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列のいずれかの他の具体的に規定された断片をコードするＤＮＡ分子、または（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に対して少なくとも約８０％核酸配列同一性、別法として少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
他の態様において、単離された核酸分子は、（ａ）本明細書中で開示された全長ＴＡＴポリペプチドｃＤＮＡのコーディング配列、本明細書中で開示されたシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチドのコーディング配列、本明細書中で開示されたシグナルペプチドを含むまたは含まない膜貫通ＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメインのコーディング配列、または本明細書中で開示された全長ＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列のいずれかの他の具体的に定義された断片のコーディング配列を含むＤＮＡ分子、または（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、別法として、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
さらなる態様において、本発明は、（ａ）本明細書中に開示されたＡＴＣＣに寄託されたヒト蛋白質ｃＤＮＡのいずれかの全長コーディング領域によってコードされた同一の成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、または（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に対して、少なくとも約８０％核酸配列同一性、別法として、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％核酸配列同一性を
有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。
本発明のもう１つの態様は、膜貫通ドメイン−欠失または膜貫通ドメイン−不活化されたＴＡＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供し、あるいはそのようなコーディングヌクレオチド配列に相補的であり、ここに、そのようなポリペプチドの膜貫通ドメインは本明細書中で開示する。従って、ここに記載されたＴＡＴポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考えられる。
他の態様において、本発明は、（ａ）本明細書中に開示された全長アミノ酸配列を有するＴＡＴポリペプチド、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを含むまたは含まない膜貫通ＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメイン、または本明細書中に開示された全長ＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列のいずれかの他の具体的に規定された断片をコードするヌクレオチド配列、あるいは（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする単離された核酸分子に向けられる。この点に関し、本発明の具体例は、例えば、診断プローブ、アンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとして有用な、あるいは抗−ＴＡＴポリペプチド抗体、ＴＡＴ結合オリゴヌクレオチド、またはＴＡＴポリペプチドに結合する他の小さな有機分子用の結合部位を含むポリペプチドを所望によりコードしていてもよい全長ＴＡＴポリペプチドのコーディング断片のための、例えば、ハイブリダイゼーションプローブとして用途を見出すことができる。本明細書中に開示された、全長ＴＡＴポリペプチドコーディング配列の断片またはその相補体に向けられる。そのような核酸断片は、通常、長さが少なくとも５ヌクレオチド、別法として、長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００ヌクレオチドであり、ここに、この関係では、用語「約」はその参照される長さの±１０％の参照されたヌクレオチド配列の長さを意味する。ＴＡＴポリペプチド−コーディングヌクレオチド配列の新規な断片は、多数のよく知られた配列整列プログラムのいずれかを用いてＴＡＴポリペプチド−コーディングヌクレオチド配列を他の公知のヌクレオチド配列と整列させ、いずれのＴＡＴポリペプチド−コーディングヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することによって、ルーチン的に決定することができることを注記する。ＴＡＴポリペプチド−コーディングヌクレオチド配列のそのような新規な断片の全てがここで考えられる。また、これらのヌクレオチド分子断片によってコードされるＴＡＴポリペプチド断片、好ましくは、抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、またはＴＡＴに結合する他の小さな有機分子用の結合部位を含むＴＡＴポリペプチド断片も考えられる。
もう１つの具体例において、本発明は、前記にて同定された単離された核酸配列のいずれかによってコードされる単離されたＴＡＴポリペプチドを提供する。
ある具体例において、本発明は、本明細書中に開示された全長アミノ酸配列を有するＴＡＴポリペプチド、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを含むまたは含まない膜貫通ＴＡＴポリペプチド蛋白質の細胞外ドメイン、本明細書中に開示された核酸配列のいずれかによってコードされるアミノ酸配列、あるいは本明細書中に開示された全長ＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列のいずれかの他の具体的に規定された断片に対して、少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、別法として、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＴＡＴポリペプチドに関する。
更なる態様において、本発明は、本明細書中に開示されたＡＴＣＣに寄託されたヒト蛋白質ｃＤＮＡのいずれかによってコードされたアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、別法として、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＴＡＴポリペプチドに関する。
特別な態様において、本発明は、Ｎ−末端シグナル配列無しの、および／または開始メチオニン無しの単離されたＴＡＴポリペプチドを提供し、これは、前記したそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。それを生産する方法も本明細書中で記載され、ここに、その方法は、ＴＡＴポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコーディング核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養し、細胞培養からＴＡＴポリペプチドを回収することを含む。
本発明のもう１つの態様は、膜貫通ドメイン−欠失、または膜貫通ドメイン−不活化された単離されたＴＡＴポリペプチドを提供する。それを生産する方法も本明細書中に記載され、ここに、その方法は、ＴＡＴポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコーディング核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養し、細胞培養からＴＡＴポリペプチドを回収することを含む。
本発明の他の具体例において、本発明は、ここに記載されたポリペプチドのいずれかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。いずれかのそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。その例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、または酵母細胞であり得る。ここに記載されたポリペプチドのいずれかを生産する方法がさらに提供され、それは、所望のポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養から所望のポリペプチドを回収することを含む。
他の具体例において、本発明は、異種（非−ＴＡＴ）ポリペプチドに融合した本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドのいずれかを含む単離されたキメラポリペプチドを提供する。そのようなキメラ分子の例は、例えば、エピトープタグ配列または免疫グロブリンのＦｃ領域のような異種ポリペプチドに縮合した本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドのいずれかを含む。
もう１つの具体例において、本発明は、前記したまたは後に記載するポリペプチドのいずれかに好ましくは特異的に結合する抗体を提供する。所望により、抗体は、モノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、単一鎖抗体、あるいはその各抗原性エピトープへの抗−ＴＡＴポリペプチド抗体の結合を競合的に阻害する抗体である。本発明の抗体は、所望により、例えば、メイタンシノイドまたはカリケアミシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素等を含めた、トキシンのような成長阻害剤または細胞傷害性剤に結合体化することができる。本発明の抗体は、所望により、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において生産することができ、好ましくは、それらが結合する細胞の死滅を誘導する。診断目的では、本発明の抗体は、個体支持体に結合して、検出可能に標識することができる。
サイトトキシンに結合体化した抗体を含む本発明のもう１つの具体例において、トキシンは当該分野で知られたトキシンのいずれかから選択することができる。１つの具体例において、トキシンはペプチドまたはペプチドミメティックリンカーによって抗体に連結される。１つの具体例において、トキシンは、バリン−シトルリン（−ｖｃ−）を含むリンカーを介して抗体に連結される。１つの具体例において、トキシンはＭＭＡＥである。１つの具体例において、トキシンはＭＭＡＥである。１つの具体例において、トキシンはアウリスタチンペプチドである。
本発明の他の具体例において、本発明は、本明細書中に記載された抗体のいずれかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。いずれかのそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。その例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、または酵母細胞であり得る。本明細書中で記載された抗体のいずれかを生産する方法もさらに提供され、それは、所望の抗体の発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養から所望の抗体を回収することを含む。
もう１つの具体例において、本発明は、前記した、または後に記載するＴＡＴポリペプチドのいずれかに好ましくは特異的に結合するオリゴヌクレオチド（「ＴＡＴ結合オリゴヌクレオチド」）を提供する。所望により、本発明のＴＡＴ結合オリゴヌクレオチドは、例えば、メイタンシノイドまたはカリケアミシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素等を含めた、トキシンのような成長阻害剤または細胞傷害剤に結合体化させることができる。本発明のＴＡＴ結合オリゴヌクレオチドは、所望により、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において生産させることができ、好ましくは、それらが結合する細胞の死滅を誘導する。診断目的では、本発明のＴＡＴ結合オリゴペプチドは、固体支持体に結合して検出可能に標識することができる。
本発明の他の具体例において、本発明は、本明細書中に記載されたＴＡＴ結合オリゴペプチドのいずれかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。いずれかのそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。その例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、または酵母細胞であってよい。本明細書中に記載されたＴＡＴ結合オリゴペプチドのいずれかを生産する方法がさらに提供され、それは、所望のオリゴペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養から所望のオリゴペプチドを回収することを含む。
もう１つの具体例において、本発明は、前記した、または後に記載するＴＡＴポリペプチドのいずれかに好ましくは特異的に結合する小さな有機分子（「ＴＡＴ結合有機分子」）を提供する。所望により、本発明のＴＡＴ結合有機分子は、例えば、メイタンシノイドまたはカリケアミシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素等を含めた、トキシンのような成長阻害剤または細胞傷害性剤に結合体化させることができる。本発明のＴＡＴ結合有機分子は、好ましくは、それらが結合する細胞の死滅を誘導する。診断目的では本発明のＴＡＴ結合有機分子は検出可能に標識し、固体支持体に結合させ、等できる。
なお、さらなる具体例において、本発明は、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチド、本明細書中に記載されたキメラＴＡＴポリペプチド、本明細書中に記載された抗−ＴＡＴ抗体、本明細書中に記載されたＴＡＴ結合オリゴヌクレオチド、または本明細書中に記載されたＴＡＴ結合有機分子を、キャリアと組み合わせて含む組成物に関する。所望により、キャリアは薬学的に受容可能なキャリアである。
なおさらなる具体例において、本発明は、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチド、本明細書中に記載されたキメラＴＡＴポリペプチド、本明細書中に記載された抗−ＴＡＴ抗体、本明細書中に記載されたＴＡＴ結合オリゴペプチド、本明細書中に記載されたＴＡＴ結合干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはＴＡＴ結合有機分子を、キャリアと組み合わせて含む組成物に関する。所望により、キャリアは薬学的に受容可能なキャリアである。具体的には、ＴＡＴポリペプチドは本明細書中においてはＥ１６またはＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ともいうＴＡＴ１８８である。本発明の１つの具体例の（抗−Ｅ１６または抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）とも言う）抗−ＴＡＴ１８８は、限定されるものではないが、本明細書中に記載される３Ｂ５、１２Ｂ９、および１２Ｇ１２を含む。該具体例のｓｉＲＮＡは、本明細書中に記載された（ｓｉＥ１６またはｓｉＴＡＴ１８８（Ｅ１６またはＴＡＴ１８８ ｓｉＲＮＡまたはＥ１６ ｓｉＲＮＡまたはＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ｓｉＲＮＡ）ともいわれる）ｓｉＴＡＴ１８８を含む。
なおもう１つの具体例において、本発明は、容器、および該容器内に含まれる組成物を含む製品に関し、ここに、該組成物は本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチド、本明細書中に記載されたキメラＴＡＴポリペプチド、本明細書中に記載された抗−ＴＡＴ抗体、本明細書中に記載されたＴＡＴ結合オリゴヌクレオチドまたは本明細書中に記載されたＴＡＴ結合有機分子を含むことができる。該製品は、さらに、所望により、該容器に付着されたラベル、または該容器内に含まれる添付文書を含むこともでき、これは、腫瘍の治療的処置または診断検出のための組成物の使用に言及する。
本発明のもう１つの具体例は、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチド、本明細書中に記載されたキメラＴＡＴポリペプチド、本明細書中に記載された抗−ＴＡＴポリペプチド抗体、本明細書中に記載されたＴＡＴ結合オリゴヌクレオチド、または本明細書中に記載されたＴＡＴ結合有機分子の、該ＴＡＴポリペプチド、キメラＴＡＴポリペプチド、抗−ＴＡＴポリペプチド抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、またはＴＡＴ結合有機分子に応答性である疾患の治療で有用な医薬の製造のための使用に向けられる。
Ｂ．さらなる具体例
本発明のもう１つの具体例はＴＡＴポリペプチドを発現する細胞の成長を阻害する方法に向けられ、ここに、該方法は細胞を、ＴＡＴポリペプチドと結合する抗体、オリゴペプチドまたは小さな有機分子と接触させることを含み、およびここに、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子のＴＡＴポリペプチドへの結合はＴＡＴポリペプチドを発現する細胞の成長の阻害を引き起こす。好ましい具体例において、細胞は癌細胞であって、ＴＡＴポリペプチドへの該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の結合はＴＡＴポリペプチドを発現する細胞の死滅を引き起こす。所望により、該抗体はモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、または単一−鎖抗体である。本発明の方法で使用される抗体、ＴＡＴ結合オリゴヌクレオチド、およびＴＡＴ結合有機分子は、所望により、例えば、マンタンシノイドまたはカリケアミシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素等を含めたトキシンのような成長阻害剤または細胞傷害性剤と結合体化させることができる。本発明の方法で使用される抗体およびＴＡＴ結合オリゴヌクレオチドは、所望により、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において生産させることができる。
本発明のなおもう１つの具体例は、ＴＡＴポリペプチドを発現する細胞を含む癌性腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置する方法に向けられ、ここに、該方法は、哺乳動物に治療上有効量の、ＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴヌクレオチドまたは小さな有機分子を投与し、それにより、その結果、腫瘍の効果的な治療的処置がもたらされることを含む。所望により、抗体はモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、または単一−鎖抗体である。本発明の方法で使用される抗体、ＴＡＴ結合オリゴヌクレオチドおよびＴＡＴ結合有機分子は、所望により、例えば、マンタンシノイドまたはカリケアミシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素等を含めた、トキシンのような成長阻害剤または細胞傷害性剤に結合体化させることができる。本発明の方法で使用される抗体およびオリゴペプチドは、所望により、ＣＨＯ細胞または細菌細胞で生産させることができる。
本発明のなおもう１つの具体例は、ＴＡＴポリペプチドを含有することが疑われる試料中のＴＡＴポリペプチドの存在を判断する方法に向けられ、ここに、該方法は、試料を、ＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチドまたは小さな有機分子に暴露し、試料中のＴＡＴポリペプチドへの該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の結合を判断することができることを含み、ここに、そのような結合の存在は試料中でのＴＡＴポリペプチドの存在を示す。所望により、試料は、ＴＡＴポリペプチドを発現することが疑われる（癌細胞であり得る）細胞を含有することができる。該方法で使用される該抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子は、所望により、検出可能に標識し、固体支持体に結合させ、等ができる。
本発明のさらなる具体例は哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法に向けられ、ここに、該方法は、（ａ）該哺乳動物から得られた組織細胞のテスト試料における、および（ｂ）同一組織起源またはタイプの公知の正常な非−癌細胞における、ＴＡＴポリペプチドをコードする遺伝子の発現のレベルを検出することを含み、ここに、対照試料と比較して、テスト試料中のＴＡＴポリペプチドの高レベルの発現はテスト試料がそれから得られた哺乳動物における腫瘍の存在を示す。
本発明のもう１つの具体例は哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法に向けられ、ここに、該方法は（ａ）哺乳動物から得られた組織細胞を含むテスト試料を、ＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチドまたは小さな有機分子と接触させ、次いで、（ｂ）テスト試料中での、該抗体、オリゴペプチドまたは小さな有機分子とＴＡＴポリペプチドとの間の複合体の形成を検出することを含み、ここに、複合体の形成は哺乳動物における腫瘍の存在を示す。所望により、使用される該抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、またはＴＡＴ結合有機分子は検出可能に標識され、固体支持体に結合され、等され、および／または組織細胞のテスト試料は、癌性腫瘍を有することが疑われる個人から得られる。
本発明のなおもう１つの具体例は、ＴＡＴポリペプチドの改変された、好ましくは増加された発現または活性に関連した細胞増殖性障害を治療または予防する方法に向けられ、該方法はそのような治療を必要とする被験体に有効量のＴＡＴポリペプチドのアンタゴニストを投与することを含む。好ましくは、該細胞増殖性障害は癌であって、該ＴＡＴポリペプチドのアンタゴニストは抗−ＴＡＴポリペプチド抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ結合有機分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。細胞増殖性障害の効果的な治療および予防は、ＴＡＴポリペプチドを発現する細胞の直接的殺傷または増殖阻害の結果であり得るか、またはＴＡＴポリペプチドの細胞成長増強活性に拮抗することによるものであろう。
本発明のなおもう１つの具体例は、ＴＡＴポリペプチドを発現する細胞へ抗体、オリゴヌクレオチドまたは小さな有機分子を結合させる方法に向けられ、ここに、該方法は、ＴＡＴポリペプチドを発現する細胞を、該抗体、オリゴペプチドまたは小さな有機分子の該ＴＡＴポリペプチドへの結合に適した条件下で該抗体、オリゴペプチドまたは小さな有機分子と接触させ、その間での結合を行わせることを含む。
本発明の他の具体例は、（ｉ）癌または腫瘍の治療的処置または診断検出、または（ｉｉ）細胞増殖性障害の処置または予防で有用な医薬の調製における、（ａ）ＴＡＴポリペプチド、（ｂ）ＴＡＴポリペプチドをコードする核酸、またはその核酸を含むベクターまたは宿主細胞、（ｃ）抗−ＴＡＴポリペプチド抗体、（ｄ）ＴＡＴ−結合オリゴペプチド、または（ｅ）ＴＡＴ−結合小有機分子の使用に向けられる。
本発明のもう１つの具体例は、癌細胞の成長を阻害するための方法に向けられ、ここに、該癌細胞の成長は、少なくとも部分的には、ＴＡＴポリペプチドの成長増強効果に依存し（ここに、ＴＡＴポリペプチドは、癌細胞それ自体、あるいは癌細胞に対して成長増強効果を有するポリペプチドを生産する細胞いずれかによって発現され得る）、ここに、該方法はＴＡＴポリペプチドを、ＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチドまたは小さな有機分子と接触させ、それにより、ＴＡＴポリペプチドの成長−増強効果に拮抗し、今度は、癌細胞の成長を阻害することを含む。好ましくは、癌細胞の成長は完全に阻害される。なおより好ましくは、該抗体、オリゴペプチド、または小さな有機分子のＴＡＴポリペプチドへの結合は、癌細胞の死滅を誘導する。所望により、該抗体はモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、または単一−鎖抗体である。本発明の方法で使用される抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドおよびＴＡＴ結合有機分子は、所望により、例えば、メイタンシノイドまたはカリケアミシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素等を含めた、トキシンのような成長阻害剤または細胞傷害剤に結合体化することができる。本発明の方法で使用される抗体およびＴＡＴ結合オリゴペプチドは、所望により、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において生産され得る。
本発明のなおもう１つの具体例は、哺乳動物において腫瘍を治療的に処置する方法に向けられ、ここに、該腫瘍の成長は、少なくとも部分的には、ＴＡＴポリペプチドの成長増強効果に依存し、ここに、該方法は哺乳動物に治療上有効量の、ＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチドまたは小さな有機分子を投与し、それにより、該ＴＡＴポリペプチドの成長増強活性に拮抗し、その結果、腫瘍の効果的な治療的処置がもたらされることを含む。所望により、該抗体はモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、または単一−鎖抗体である。本発明の方法で使用される抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドおよびＴＡＴ結合有機分子は、所望により、例えば、メイタンシノイドまたはカリケアミシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素等を含めた、トキシンのような成長阻害剤または細胞傷害剤に結合体化させることができる。本発明の方法で使用される抗体およびオリゴペプチドは、所望により、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において生産することができる。
Ｃ．さらなる追加の具体例
なおさらなる具体例において、本発明は本出願についての潜在的請求項の以下の組に向けられる：
１．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードするＤＮＡ分子；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードするＤＮＡ分子；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域；または
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）の相補体；
に対して少なくとも８０％核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する単離された核酸。
２．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域；または
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）の相補体；
を有する単離された核酸。
３．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードする核酸；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードする核酸；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードする核酸；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードする核酸；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域；または
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）の相補体；
にハイブリダイズする単離された核酸。
４．ハイブリダイゼーションがストリンジェントな条件下で起こる請求項３記載の核酸。
５．長さが少なくとも約５ヌクレオチドである請求項３記載の核酸。
６．請求項１、２または３の核酸を含む発現ベクター。
７．該核酸が、該ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される対照配列に操作可能に連結された請求項６記載の発現ベクター。
８．請求項７記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
９．ＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞または酵母細胞である請求項８記載の宿主細胞。
１０．ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項８記載の宿主細胞を培養し、細胞培養から該ポリペプチドを回収することを含む、ポリペプチドを生産する方法。
１１．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
１２．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有する単離されたポリペプチド。
１３．異種ポリペプチドに融合された請求項１１または１２記載のポリペプチドを含むキメラポリペプチド。
１４．該異種ポリペプチドがエピトープタグ配列または免疫グロブリンＦｃ領域である請求項１３記載のキメラポリペプチド。
１５．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合する単離された抗体。
１６．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有するポリペプチドに結合する単離された抗体。
１７．モノクローナル抗体である請求項１５または１６の抗体。
１８．抗体断片である請求項１５または１６の抗体。
１９．キメラまたはヒト化である請求項１５または１６の抗体。
２０．成長抑制剤に結合体化した請求項１５または１６の抗体。
２１．細胞傷害性剤に結合体化した請求項１５または１６の抗体。
２２．該細胞傷害性剤がトキシン、抗生物質、放射性同位体およびヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項２１記載の抗体。
２３．該細胞傷害性剤がトキシンである請求項２１記載の抗体。
２４．該トキシンがメイタンシノイドまたはカリケアミシンよりなる群から選択される請求項２３記載の抗体。
２５．該トキシンがメイタンシノイドである請求項２３記載の抗体。
２６．細菌において生産される請求項１５または１６記載の抗体。
２７．ＣＨＯ細胞において生産される請求項１５または１６記載の抗体。
２８．それが結合する細胞の死滅を誘導する請求項１５または１６記載の抗体。
２９．検出可能に標識された請求項１５または１６記載の抗体。
３０．請求項１５または１６の抗体をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸。
３１．当該ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される対照配列
に操作可能に連結された請求項３０記載の核酸を含む発現ベクター。
３２．請求項３１記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
３３．ＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞または酵母細胞である請求項３２記載の宿主細胞。
３４．抗体の発現に適した条件下で請求項３２記載の宿主細胞を培養し、細胞培養から該抗体を回収することを含む、抗体を生産する方法。
３５．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合する単離されたオリゴペプチド。
３６．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有するポリペプチドに結合する単離されたオリゴペプチド。
３７．成長抑制剤に結合体化した請求項３５または３６記載のオリゴペプチド。
３８．細胞傷害性剤に結合体化した請求項３５または３６記載のオリゴペプチド。
３９．該細胞傷害性剤がトキシン、抗生物質、放射性同位体およびヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項３８記載のオリゴペプチド。
４０．該細胞傷害性剤トキシンである請求項３８記載のオリゴペプチド。
４１．該トキシンがメイタンシノイドおよびカリケアミシンよりなる群から選択される請求項４０記載のオリゴペプチド。
４２．該トキシンがメイタンシノイドである請求項４０記載のオリゴペプチド。
４３．それが結合する細胞の死滅を誘導する請求項３５または３６記載のオリゴペプチド。
４４．検出可能に標識された請求項３５または３６記載のオリゴペプチド。
４５．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合するＴＡＴ結合有機分子。
４６．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有するポリペプチドに結合する請求項４５記載の有機分子。
４７．成長抑制剤に結合体化した請求項４５または４６記載の有機分子。
４８．細胞傷害性剤に結合体化した請求項４５または４６記載の有機分子。
４９．該細胞傷害性剤がトキシン、抗生物質、放射性同位体およびヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項４８記載の有機分子。
５０．該細胞傷害性剤トキシンである請求項４８記載の有機分子。
５１．該トキシンがメイタンシノイドおよびカリケアミシンよりなる群から選択される請求項５０記載の有機分子。
５２．該トキシンがメイタンシノイドである請求項５０記載の有機分子。
５３．それが結合する細胞の死滅を誘導する請求項４５または４６記載の有機分子。
５４．検出可能に標識された請求項４５または４６記載の有機分子。
５５．キャリアと組み合わせた、
（ａ）請求項１１記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項１２記載のポリペプチド；
（ｃ）請求項１３記載のキメラポリペプチド；
（ｄ）請求項１５記載の抗体；
（ｅ）請求項１６記載の抗体；
（ｆ）請求項３５記載のオリゴペプチド；
（ｇ）請求項３６記載のオリゴペプチド；
（ｈ）請求項４５記載のＴＡＴ結合有機分子；または
（ｉ）請求項４６記載のＴＡＴ結合有機分子；
を含む組成物。
５６．該キャリアが薬学的に受容可能なキャリアである請求項５５記載の組成物。
５７．（ａ）容器；および
（ｂ）該容器内に含まれる請求項５５記載の組成物を含む製品。
５８．さらに、癌の治療的処置または診断検出用の該組成物の使用に言及する、該容器に付着された標識、または該容器に含まれる添付文書を含む請求項５７記載の製品。
５９．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する蛋白質を発現する細胞の成長を阻害する方法であって、該細胞を、該蛋白質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子と接触させることを含み、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の該蛋白質への結合が、それにより、該細胞の成長の阻害を引き起こすことを特徴とする該方法。
６０．該抗体がモノクローナル抗体である請求項５９記載の方法。
６１．該抗体が抗体断片である請求項５９記載の方法。
６２．該抗体がキメラまたはヒト化抗体である請求項５９記載の方法。
６３．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が成長阻害剤に結合体化した請求項５９記載の方法。
６４．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が細胞傷害性剤に結合体化した請求項５９記載の方法。
６５．該細胞傷害性剤がトキシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項６４記載の方法。
６６．該細胞傷害性剤がトキシンである請求項６４記載の方法。
６７．該トキシンがメイタンシノイドおよびカリケアミシンからなる群から選択される請求項６６記載の方法。
６８．該トキシンがメイタンシノイドである請求項６６記載の方法。
６９．該抗体が細菌において生産される請求項５９記載の方法。
７０．該抗体がＣＨＯ細胞において生産される請求項５９記載の方法。
７１．該細胞が癌細胞である請求項５９記載の方法。
７２．該癌細胞がさらに、放射線治療または化学療法剤に暴露される請求項７１記載の方法。
７３．該癌細胞が、乳癌細胞、結直腸癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、中枢神経系癌細胞、肝臓癌細胞、膀胱癌細胞、膵臓癌細胞、頚癌細胞、メラノーマ細胞および白血病細胞よりなる群から選択される請求項７１記載の方法。
７４．該蛋白質が、同一組織起源の正常な細胞と比較して、該癌細胞によってより豊富に発現される請求項７１記載の方法。
７５．該細胞の死滅を引き起こす請求項５９記載の方法。
７６．該蛋白質が：
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有する請求項５９記載の方法。
７７．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する蛋白質を発現する細胞を含む癌性腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、該哺乳動物に、治療上有効量の、該蛋白質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を投与し、それにより、該哺乳動物を効果的に治療することを含む該方法。
７８．該抗体がモノクローナル抗体である請求項７７記載の方法。
７９．該抗体が抗体断片である請求項７７記載の方法。
８０．該抗体がキメラまたはヒト化抗体である請求項７７記載の方法。
８１．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が成長阻害剤に結合体化した請求項７７記載の方法。
８２．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が細胞傷害性剤に結合体化した請求項７７記載の方法。
８３．該細胞傷害性剤がトキシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項８２記載の方法。
８４．該細胞傷害性剤がトキシンである請求項８２記載の方法。
８５．該トキシンがメイタンシノイドおよびカリケアミシンからなる群から選択される請求項８４記載の方法。
８６．該トキシンがメイタンシノイドである請求項８４記載の方法。
８７．該抗体が細菌において生産される請求項７７記載の方法。
８８．該抗体がＣＨＯ細胞において生産される請求項７７記載の方法。
８９．該腫瘍がさらに、放射線治療または化学療法剤に暴露される請求項７７記載の方法。
９０．該腫瘍が乳房腫瘍、結直腸腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、中枢神経系腫瘍、肝臓腫瘍、膀胱腫瘍、膵臓腫瘍、または頚部腫瘍である請求項７７記載の方法。
９１．該蛋白質が、同一組織起源の正常な細胞と比較して、該腫瘍の癌性細胞によってより豊富に発現される請求項７７記載の方法。
９２．該蛋白質が：
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有する請求項７７記載の方法。
９３．蛋白質を含有することが疑われる試料中の蛋白質の存在を測定する方法であって、ここに、該蛋白質は；
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有し、該方法は、該試料を該蛋白質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子に暴露し、該試料中の該蛋白質への該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の結合を測定することを含み、ここに、該蛋白質への抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の結合は該試料中の該蛋白質の存在を示すことを特徴とする該方法。
９４．該試料は該蛋白質を発現することが疑われる細胞を含む請求項９３記載の方法。
９５．該細胞が癌細胞である請求項９４記載の方法。
９６．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が検出可能に標識される請求項９３記載の方法。
９７．該蛋白質が；
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有する請求項９３記載の方法。
９８．哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法であって、該方法は、該哺乳動物から得られた組織細胞のテスト試料における、および同一組織起源の公知の正常な細胞の対照試料における、
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現のレベルを測定することを含み、ここに、対照試料と比較した、テスト試料中の該蛋白質の発現のより高いレベルはテスト試料がそれから得られた哺乳動物における腫瘍の存在を示すことを特徴とする該方法。
９９．該蛋白質をコードする遺伝子の発現のレベルを測定する抗体が、イン・サイチュハイブリダイゼーションまたはＲＴ−ＰＣＲ分析においてオリゴヌクレオチドを使用することを含む請求項９８記載の方法。
１００．該蛋白質をコードする遺伝子の発現のレベルを測定する工程が、免疫組織化学またはウエスタンブロット分析を使用することを含む請求項９８記載の方法。
１０１．該蛋白質が：
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有する請求項９８記載の方法。
１０２．哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法であって、該方法は、該哺乳動物から得られた組織細胞のテスト試料を、
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する蛋白質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子と接触させ、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子と、テスト試料中の該蛋白質との間の複合体の形成を検出することを含み、ここに、複合体の形成は該哺乳動物における腫瘍の存在を示すことを特徴とする該方法。
１０３．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が検出可能に標識された請求項１０２記載の方法。
１０４．組織細胞の該テスト試料が、癌性腫瘍を有することが疑われる個体から得られる請求項１０２記載の方法。
１０５．該蛋白質が：
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有する請求項１０２記載の方法。
１０６．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する蛋白質の増大した発現または活性に関連した細胞増殖性障害を治療または予防する方法であって、該方法は、そのような処置を必要とする被験体に有効量の該蛋白質のアンタゴニストを投与し、それにより、該細胞増殖性障害を効果的に治療または予防することを特徴とする該方法。
１０７．該細胞増殖性障害が癌である請求項１０６記載の方法。
１０８．該アンタゴニストが抗−ＴＡＴポリペプチド抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ結合有機分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項１０６記載の方法。
１０９．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する蛋白質を発現する細胞へ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を結合させる方法であって、該方法は、該細胞を、該蛋白質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子と接触させ、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の該蛋白質への結合を起こさせ、それにより、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を該細胞に結合させることを特徴とする該方法。
１１０．該抗体がモノクローナル抗体である請求項１０９記載の方法。
１１１．該抗体が抗体断片である請求項１０９記載の方法。
１１２．該抗体がキメラまたはヒト化抗体である請求項１０９記載の方法。
１１３．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が成長阻害剤に結合体化した請求項１０９記載の方法。
１１４．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が細胞傷害性剤に結合体化した請求項１０９記載の方法。
１１５．該細胞傷害性剤がトキシン、抗生物質、放射性同位体、およびヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項１１４記載の方法。
１１６．該細胞傷害性剤がトキシンである請求項１１４記載の方法。
１１７．該トキシンがメイタンシノイドおよびカリケアミシンからなる群から選択される請求項１１６記載の方法。
１１８．該トキシンがメイタンシノイドである請求項１１６記載の方法。
１１９．該抗体が細菌において生産される請求項１０９記載の方法。
１２０．該抗体がＣＨＯ細胞において生産される請求項１０９記載の方法。
１２１．該細胞が癌細胞である請求項１０９記載の方法。
１２２．該癌細胞が、さらに、放射線治療または化学療法剤に暴露される請求項１２１記載の方法。
１２３．該癌細胞が、乳癌細胞、結直腸癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、中枢神経系癌細胞、肝臓癌細胞、膀胱癌細胞、膵臓癌細胞、頚癌細胞、メラノーマ細胞および白血病細胞よりなる群から選択される請求項１２１記載の方法。
１２４．該蛋白質が、同一組織起源の正常な細胞と比較して、該癌細胞によってより豊富に発現される請求項１２３記載の方法。
１２５．該細胞の死滅を引き起こす請求項１０９記載の方法。
１２６．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項１ないし５または３０いずれか記載の核酸の使用。
１２７．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項１ないし５または３０いずれか記載の核酸の使用。
１２８．細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項１ないし５または３０いずれか記載の核酸の使用。
１２９．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項６、７または３１いずれか記載の発現ベクターの使用。
１３０．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項６、７または３１いずれか記載の発現ベクターの使用。
１３１． 細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項６、７または３１いずれか記載の発現ベクターの使用。
１３２．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項８、９、３２または３３いずれか記載の宿主細胞の使用。
１３３．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項８、９、３２または３３いずれか記載の宿主細胞の使用。
１３４．細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項８、９、３２または３３いずれか記載の宿主細胞の使用。
１３５．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項１１ないし１４いずれか記載のポリペプチドの使用。
１３６．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項１１ないし１４いずれか記載のポリペプチドの使用。
１３７．細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項１１ないし１４いずれか記載のポリペプチドの使用。
１３８．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項１５ないし２９いずれか記載の抗体の使用。
１３９．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項１５ないし２９いずれか記載の抗体の使用。
１４０．細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項１５ないし２９いずれか記載の抗体の使用。
１４１．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項３５ないし４４いずれか記載のオリゴペプチドの使用。
１４２．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項３５ないし４４いずれか記載のオリゴペプチドの使用。
１４３．細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項３５ないし４４いずれか記載のオリゴペプチドの使用。
１４４．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項４５ないし５４いずれか記載のＴＡＴ結合有機分子の使用。
１４５．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項４５ないし５４いずれか記載のＴＡＴ結合有機分子の使用。
１４６．細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項４５ないし５４いずれか記載のＴＡＴ結合有機分子の使用。
１４７．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項５５または５６いずれか記載の組成物の使用。
１４８．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項５５または５６いずれか記載の組成物の使用。
１４９．細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項５５または５６いずれか記載の組成物の使用。
１５０．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項５７または５８いずれか記載の製品の使用。
１５１．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項５７または５８いずれか記載の製品の使用。
１５２．細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項５７または５８いずれか記載の製品の使用。
１５３．細胞の成長を阻害する方法であって、該細胞の増殖が、
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する蛋白質の成長増強効果に少なくとも部分的に依存し、該方法は、該蛋白質を、該蛋白質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子と接触させ、それにより、該細胞の増殖を阻害することを特徴とする該方法。
１５４．該細胞が癌細胞である請求項１５３記載の方法。
１５５．該蛋白質が該細胞によって発現される請求項１５３記載の方法。
１５６．該蛋白質への該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の結合が、該蛋白質の細胞成長−増強活性に拮抗する請求項１５３記載の方法。
１５７．該蛋白質への該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の結合が該細胞の死滅を誘導する請求項１５３記載の方法。
１５８．該抗体がモノクローナル抗体である請求項１５３記載の方法。
１５９．該抗体が抗体断片である請求項１５３記載の方法。
１６０．該抗体がキメラまたはヒト化抗体である請求項１５３記載の方法。
１６１．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が成長阻害剤に結合体化した請求項１５３記載の方法。
１６２．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が細胞傷害性剤に結合体化した請求項１５３記載の方法。
１６３．該細胞傷害性剤がトキシン、抗生物質、放射性同位体、およびヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項１６２記載の方法。
１６４．該細胞傷害性剤がトキシンである請求項１６２記載の方法。
１６５．該トキシンがメイタンシノイドおよびカリケアミシンからなる群から選択される請求項１６４記載の方法。
１６６．該トキシンがメイタンシノイドである請求項１６４記載の方法。
１６７．該抗体が細菌において生産される請求項１５３記載の方法。
１６８．該抗体がＣＨＯ細胞において生産される請求項１５３記載の方法。
１６９．該蛋白質が；
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有する請求項１５３記載の方法。
１７０．哺乳動物において腫瘍を治療的に処置する方法であって、ここに、該腫瘍の成長は；
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する蛋白質の成長増強効果に少なくとも部分的に依存し、該方法は、該蛋白質を該蛋白質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子と接触させ、それにより、該腫瘍を効果的に治療することを特徴とする該方法。
１７１．該蛋白質が該腫瘍の細胞によって発現される請求項１７０記載の方法。
１７２．該蛋白質への該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の結合が、該蛋白質の細胞成長−増強活性に拮抗する請求項１７０記載の方法。
１７３．該抗体がモノクローナル抗体である請求項１７０記載の方法。
１７４．該抗体が抗体断片である請求項１７０記載の方法。
１７５．該抗体がキメラまたはヒト化抗体である請求項１７０記載の方法。
１７６．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が成長阻害剤に結合体化した請求項１７０記載の方法。
１７７．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が細胞傷害性剤に結合体化した請求項１７０記載の方法。
１７８．該細胞傷害性剤がトキシン、抗生物質、放射性同位体、およびヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項１７７記載の方法。
１７９．該細胞傷害性剤がトキシンである請求項１７７記載の方法。
１８０．該トキシンがメイタンシノイドおよびカリケアミシンからなる群から選択される請求項１７９記載の方法。
１８１．該トキシンがメイタンシノイドである請求項１７９記載の方法。
１８２．該抗体が細菌において生産される請求項１７０記載の方法。
１８３．該抗体がＣＨＯ細胞において生産される請求項１７０記載の方法。
１８４．該蛋白質が；
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有する請求項１７０記載の方法。
１８５．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合する単離された抗体。
１８６．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有するポリペプチドに結合する単離された抗体。
１８７．モノクローナル抗体である請求項１８５記載の抗体。
１８８．抗体断片である請求項１８５記載の抗体。
１８９．キメラまたはヒト化抗体である請求項１８５記載の抗体。
１９０．成長阻害剤に結合体化した請求項１８５記載の抗体。
１９１．細胞傷害性剤に結合体化した請求項１８５記載の抗体。
１９２．該細胞傷害性剤がトキシン、抗体、放射性同位体およびヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項１９１記載の抗体。
１９３．該細胞傷害性剤がトキシンである請求項１９１記載の抗体。
１９４．該トキシンがアウリスタチン、メイタンシノイドおよびカリケアミシンよりなる群から選択される請求項１９３記載の抗体。
１９５．該トキシンがメイタンシノイドである請求項１９３記載の抗体。
１９６．細菌において生産される請求項１８５記載の抗体。
１９７．ＣＨＯ細胞において生産される請求項１８５記載の抗体。
１９８．それが結合する細胞の死滅を誘導する請求項１８５記載の抗体。
１９９．検出可能に標識される請求項１８５記載の抗体。
２００．該トキシンがＭＭＡＥ（モノ−メチルアウリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ、（アウリスタチンＥバレリルベンジルヒドラゾン）、およびＡＦＰ（アウリスタチンＦフェニレンジアミン）よりなる群から選択される請求項１９３記載の抗体。
２０１．該トキシンが、リンカーによって抗体に共有結合している請求項１９３記載の抗体。
２０２．該リンカーがマレイミドカプロイル（ＭＣ）バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ、ｖｃ）シトルリン（２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸）、ＰＡＢ（Ｐ−アミノベンジルカルバモイル）、Ｍｅ（Ｎ−メチル−バリンシトルリン）、ＭＣ（ＰＥＧ）６−ＯＨ（マレイミドカプロイル−ポリエチレングリコール）、ＳＰＰ（４−（２−ピリジルチオ）ペンタン酸Ｎ−スクシンイミジル）、ＳＭＣＣ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボン酸Ｎ−スクシンイミジル）、およびＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢよりなる群から選択される請求項２０１記載の抗体。
２０３．該トキシンがＭＭＡＥである請求項２００記載の抗体。
２０４．該トキシンがＭＭＡＦである請求項２００記載の抗体。
２０５．該リンカーがＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢであって、該トキシンがＭＭＡＥまたはＭＭＦＥである請求項２０２記載の抗体。
２０６．該抗体がＴＡＴ１８８ポリペプチドに結合する請求項１８５ないし２０５いずれか１項に記載の抗体。
２０７．該抗体が増殖を阻害し、あるいはＴＡＴ１８８を発現する細胞の細胞死滅を促進する請求項２０６記載の抗体。
２０８．該細胞が癌細胞である請求項２０７記載の抗体。
２０９．該癌細胞が乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓よりなる群から選択される請求項２０８記載の方法。
２１０．３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産された抗体によって結合されたＴＡＴ１８８ポリペプチドのエピトープへの結合に競合する単離された抗体。
２１１．３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産された抗体の生物学的活性を有する単離された抗体であって、ここに、該生物学的活性が細胞増殖の阻害、あるいはＴＡＴ１８８を発現する細胞における細胞死滅の促進であることを特徴とする該単離された抗体。
２１２．３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産された抗体のＣＤＲの少なくとも１、２、３、４、５または６のアミノ酸配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を有するアミノ酸配列を、対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）中に含む単離された抗体。
２１３．該抗体が、対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）中に、３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産された抗体のＣＤＲの少なくとも１、２、３、４、５または６のアミノ酸配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を有するアミノ酸配列を含む請求項１８５ないし２０５いずれか１項に記載の抗体。
２１４．該抗体が、３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産された抗体の生物学的活性を呈し、ここに、該生物学的活性は細胞増殖の阻害、またはＴＡＴ１８８を発現する細胞における細胞死滅の促進である請求項１８５ないし２０５いずれか１項に記載の抗体。
２１５．細胞が癌細胞である、請求項２１４記載の抗体。
２１６．該癌細胞が乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓よりなる群から選択される請求項２１５記載の抗体。
２１７．ＴＡＴ１８８を発現する細胞の成長を阻害する方法であって、該方法は該細胞を請求項１８５ないし２０５いずれか１項に記載の抗体と接触させることを含む該方法。
２１８．該細胞が癌細胞である請求項２１７記載の方法。
２１９．該癌細胞が乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓よりなる群から選択される請求項２１８記載の方法。
２２０．該癌細胞が哺乳動物細胞である請求項２１９記載の方法。
２２１．該哺乳動物細胞がヒト細胞である請求項２２０記載の方法。
２２２．ＴＡＴ１８８を発現する細胞の成長を阻害する方法であって、該方法は請求項１８５ないし２０５いずれか１項に記載の抗体と該細胞とを接触させることを含み、ここに、該抗体は対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）において、３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産された抗体のＣＤＲの少なくとも１、２、３、４、５または６のアミノ酸配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする該方法。
２２３．対照細胞に対する試験細胞で発現されるＴＡＴ１８８ポリペプチドのレベルを検出する方法であって、該方法は：
（ａ）該試験細胞および対照細胞を、請求項２１０記載の単離された抗−ＴＡＴ１８８抗体と接触させ；
（ｂ）該抗体の結合を検出し；次いで、
（ｃ）該テストおよび対照細胞への該抗体の相対的結合を測定する；
ことを特徴とする該方法。
２２４．該試験細胞および対照細胞が溶解される請求項２２３記載の方法。
２２５．該試験細胞が組織中のものである請求項２２３記載の方法。
２２６．該組織が腫瘍組織である請求項２２５記載の方法。
２２７．該腫瘍組織が乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓よりなる群から選択される請求項２２６記載の方法。
２２８．対照細胞に対するＴＡＴ１８８ポリペプチド、または試験細胞における図１１５（配列番号１１５）に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドのレベルを検出する方法であって該方法は：
（ａ）該試験細胞および該対照細胞を、請求項１８５ないし１８９、１９６ないし１９９、および２１０ないし２１２いずれか１項に記載の単離された抗体と接触させ；
（ｂ）該抗体の結合を検出し；次いで、
（ｃ）該テストおよび対照細胞への該抗体の相対的結合を測定する；
ことを特徴とする該方法。
２２９．該試験細胞におけるＴＡＴ１８８ポリペプチドのレベルが、対照細胞におけるそれよりも大きい請求項２２８記載の方法。
２３０．該方法が、試験細胞を含有する、または含有された試験細胞を有する組織における癌を診断する請求項２２９記載の方法。
２３１．（ａ）図３７（配列番号３７）に示されたヌクレオチド配列；および
（ｂ）（ａ）の相補体；
に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸に結合するＴＡＴ結合干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であって、ここに、該ｓｉＲＮＡはＴＡＴ１８８の発現を低下させることを特徴とする該ｓｉＲＮＡ。
２３２．請求項２３１記載のｓｉＲＮＡを含む発現ベクター。
２３３．該ｓｉＲＮＡが当該ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞によって認識される対照配列に操作可能に連結された請求項２３２記載の発現ベクター。
２３４．請求項２３３記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
２３５．キャリアと組み合わせて、
（ａ）請求項１８５記載の抗体、または
（ｂ）請求項２３１記載のｓｉＲＮＡ；
を含む組成物。
２３６．該キャリアが薬学的に受容可能なキャリアである請求項２３５記載の組成物。
２３７．（ａ）容器；および
（ｂ）該容器内に含有された請求項２３５記載の組成物；
を含む製品。
２３８．さらに、癌の治療的処置または診断検出のための該組成物の使用に言及する、該容器に付着されたラベルまたは該容器に含まれた添付文書を含む請求項２３７記載の製品。
２３９．図１１５（配列番号１１５）に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを発現する癌細胞の成長を阻害する方法であって、該方法は該癌細胞において該アミノ酸をコードする核酸に結合するｓｉＲＮＡと該癌細胞とを接触させ、それにより、該癌細胞の成長を阻害することを特徴とする該方法。
２４０．該核酸が図３７（配列番号３７）に示された配列を有する請求項２３９記載の方法。
２４１．該ポリペプチドの発現のレベルの検出が、免疫組織化学分析において抗体を試用することを含む請求項２２８記載の方法。
２４２．図１１５（配列番号１１５）に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドの増大した発現または活性に関連する細胞増殖性障害を治療または予防する方法であって、該方法は、そのような処置を必要とする被験体に有効量のＴＡＴ１８８ポリペプチドのアゴニストを投与することを特徴とする該方法。
２４３．該アンタゴニストが請求項１ないし２１および２３ないし２８いずれか１項に記載の単離された抗−ＴＡＴ１８８ポリペプチド抗体である請求項２４２記載の方法。
２４４．該細胞増殖性障害が癌である請求項２４３記載の方法。
２４５．該癌が乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚及び肝臓よりなる群から選択される請求項２４４記載の方法。
本発明のなおさらなる具体例は、本明細書を読むと当業者に明らかであろう。
Ｉ．定義
本明細書中で用い、かつ数字表示が直後に続く場合、用語「ＴＡＴポリペプチド」および「ＴＡＴ」は、種々のポリペプチドをいい、ここに、完全な表示（すなわち、ＴＡＴ／数字）とは、本明細書中に記載された具体的なポリペプチド配列をいう。本明細書中で用いるように用語「数字」が現実の数字表示として供される用語「ＴＡＴ／数字ポリペプチド」および「ＴＡＴ／数字」は、天然配列ポリペプチド、天然配列ポリペプチド変種、ならびに天然配列ポリペプチドおよび（さらに本明細書中で定義される）ポリペプチド変種の断片を含む。本明細書中で記載されるＴＡＴポリペプチドは、ヒト組織タイプから、またはもう１つの源からのように、種々の源から単離することができ、あるいは組換えまたは合成方法によって調製することができる。用語「ＴＡＴポリペプチド」とは、本明細書中に開示された各個々のＴＡＴ／数ポリペプチドをいう。「ＴＡＴポリペプチド」をいう本明細書中における全ての開示は、個々にならびに一緒にポリペプチドの各々をいう。例えば、病気の処置を含む組成物の調製、精製、誘導、それに対する抗体の形成、それに対するＴＡＴ結合オリゴペプチドの形成、それに対するＴＡＴ結合有機分子の形成、その投与は、個々に、本発明の各ポリペプチドに関する。用語「ＴＡＴポリペプチド」は、本明細書中に開示されたＴＡＴ／数ポリペプチドの変種も含む。
「天然配列ＴＡＴポリペプチド」は、天然に由来する対応するＴＡＴポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列ＴＡＴポリペプチドは天然から単離することができるか、あるいは組換えまたは合成手段によって生産することができる。用語「天然配列ＴＡＴポリペプチド」は、具体的には、特定のＴＡＴポリペプチドの天然に生じる切形されたまたは分泌された形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、ポリペプチドの天然に生じる変種形態（例えば、別法として、スプライスされた形態）および天然に生じる対立遺伝子変種を含む。本発明のある具体例において、本明細書中に開示される天然配列ＴＡＴポリペプチドは、添付の図面に示された全長アミノ酸配列を含む成熟または全長天然配列ポリペプチドである。（もし示されていれば）開始および停止コドンは、太文字のフォントで示され、および図面中では下線が施される。添付の図面中で、「Ｎ」と示される核酸残基はいずれかの核酸残基である。しかしながら、添付の図面に開示されたＴＡＴポリペプチドは、図面中のアミノ酸位置１としてのここに指定されるメチオニン残基で開始することが示されるが、図面中のアミノ酸位置１から上流または下流に位置する他のメチオニン残基を、ＴＡＴポリペプチドについての開始アミノ酸残基として使用することができると考えられ、かつそれが可能である。
ＴＡＴポリペプチド「細胞該ドメイン」または「ＥＣＤ」とは、膜貫通および細胞質ドメインを実質的に含まないＴＡＴポリペプチドの形態をいう。通常、ＴＡＴポリペプチドＥＣＤは１％未満のそのような膜貫通および／または細胞質ドメインを有し、好ましくは、０．５％未満のそのようなドメインを有する。本発明のＴＡＴポリペプチドで同定されるいずれの膜貫通ドメインも疎水性ドメインのそのタイプを同定するための当該分野でルーチン的に使用される基準に従って同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの正確な境界は変化し得るが、最もありそうには、本明細書中において最初に同定されたドメインのいずれかの末端において約５以下のアミノ酸だけである。所望により、従って、ＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメインは、実施例および明細書中で同定された膜貫通ドメイン／細胞外ドメイン境界のいずれか側に約５以下のアミノ酸を含有することができ、会合するシグナルペプチドを含むまたは含まないそのようなポリペプチドおよびそれをコードする核酸が本発明で考えられる。
本明細書中で開示された種々のＴＡＴポリペプチドの「シグナルペプチド」の近似的な位置は、本明細書および／または添付の図面中で示すことができる。しかしながら、シグナルペプチドのＣ−末端境界は変化し得るが、最もありそうには、本明細書中で最初に同定されたシグナルペプチドＣ−末端境界のいずれか側において約５以下のアミノ酸だけであり、他方、シグナルペプチドのＣ−末端境界は、アミノ酸配列の要素のそのタイプを同定するための当該分野でルーチン的に使用される基準に従って同定できることを注記する（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：１−６（１９９７）およびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９６（１９８６））。さらに、ある場合には、分泌されたポリペプチドからのシグナル配列の切断は全く均一というのではなく、その結果、１を超える分泌された種が生じることも認識される。シグナルペプチドは本明細書中で同定されたシグナルペプチドのＣ−末端境界いずれか側で約５以下のアミノ酸内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドが本発明で考えられる。
「ＴＡＴポリペプチド変種」は、ＴＡＴポリペプチド、好ましくは、本明細書中に開示される全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列に対して少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性を有するとここに定義されるＴＡＴポリペプチド、本明細書中に開示されるシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチド配列、本明細書中で開示されるシグナルペプチドを含むまたは含まないＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメイン、または（全長ＴＡＴポリペプチドについての完全なコーディング配列の一部のみを表す核酸によってコードされるもののような）本明細書中で開示される全長ＴＡＴポリペプチド配列のいずれかの他の断片を意味する。そのようなＴＡＴポリペプチドは、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ−またはＣ−末端において、１以上のアミノ酸残基が付加され、または欠失されたＴＡＴポリペプチドを含む。通常、ＴＡＴポリペプチド変種は、本明細書中に開示された全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列、本明細書中で開示されたシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチド配列、本明細書中で開示されたシグナルペプチドを含むまたは含まないＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメイン、または本明細書中で開示された全長ＴＡＴポリペプチド配列のいずれかの他の具体的に定義された断片に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％アミノ酸配列同一性を有するであろう。通常、ＴＡＴ変種ポリペプチドは長さが少なくとも約１０アミノ酸であり、あるいは、長さが少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００アミノ酸またはそれ以上である。所望により、ＴＡＴ変種ポリペプチドは、天然ＴＡＴポリペプチド配列と比較して、１以下保存的アミノ酸置換、あるいは天然ＴＡＴポリペプチド配列と比較して２、３、４、５、６、７、８、９または１０以下の保存的アミノ酸置換を有するであろう。
本明細書中で確認されるＴＡＴポリペプチド配列に関して「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要であれば、ギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成した後、配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮せず、特定のＴＡＴポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的での整列は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ （ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを用い、当該分野における技量内の種々の方法で達成することができる。当業者であれば、比較すべき配列の全長にわたって最大整列を達成するのに必要ないずれかのアルゴリズムを含めた、整列を測定するための適当なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的では、％アミノ酸配列同一性値は配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて作り出され、ここに、ＡＬＩＧＮ−２プログラムのための完全な源コードは後に表１に供される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって著作されており、後の表１に示される源コードは合衆国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９のユーザードキュメンテーションに申請されており、そこで、それは合衆国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通じて公に入手可能であり、あるいは後の表１に供される源コードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＵＮＩＸ（登録商標）操作システム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄで用いるためにコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変化しない。
ＡＬＩＧＮ−２をアミノ酸配列比較で使用する状況では、（与えられたアミノ酸配列Ｂに対してある％アミノ酸配列同一性を有し、またはそれを含む与えられたアミノ酸配列Ａと別法として表現できる）与えられたアミノ酸配列Ｂに対する与えられたアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性は以下のように計算される：
１００×分率Ｘ／Ｙ
ここに、Ｘは、ＡおよびＢのそのプログラムの整列における配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２による同一マッチとしてスコアが与えられたアミノ酸残基の数であり、およびここに、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の合計数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが認識されよう。この方法を用いる％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２および３は、「ＴＡＴ」と命名されたアミノ酸配列に対する「比較蛋白質」と命名されたアミノ酸配列の％アミノ酸配列同一性をどのようにして計算するかを示し、ここに、「ＴＡＴ」は注目する仮定ＴＡＴポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較蛋白質」は、それに対して注目する「ＴＡＴ」ポリペプチドが比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を表し、および「Ｘ」、「Ｙ」および「Ｚ」は、各々、異なる仮定アミノ酸残基を表す。特に断りのない限り、本明細書中で用いる全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて直前のパラグラフに記載したように得られる。
「ＴＡＴ変種ポリヌクレオチド」または「ＴＡＴ変種核酸配列」は、本明細書中で定義されたＴＡＴポリペプチド、好ましくは活性ＴＡＴポリペプチドをコードし、かつ本明細書中に開示された全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを含むまたは含まないＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメイン、または（全長ＴＡＴポリペプチドについての完全なコーディング配列の一部のみを表す核酸によってコードされたもののような）本明細書中に開示された全長ＴＡＴポリペプチド配列のいずれかの他の断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約８０％核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常、ＴＡＴ変種ポリヌクレオチドは、本明細書中に開示された全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列、本明細書中で開示されたシグナル配列を含むまたは含まないＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメイン、または本明細書中で開示された全長ＴＡＴポリペプチド配列のいずれかの他の断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約８０％核酸配列同一性、別法として、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％核酸配列同一性を有するであろう。変種は天然ヌクレオチド配列を含まない。
通常、ＴＡＴ変種ポリヌクレオチドは長さが少なくとも５ヌクレオチドであり、別法として、長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００ヌクレオチドであり、ここに、この関係では用語「約」は言及されたヌクレオチド配列長さ±その言及された長さの１０％を意味する。
本明細書中で確認されるＴＡＴ−コーディング核酸配列に関して「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列を整列させ、もし必要であればギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後に、注目するＴＡＴ核酸配列におけるヌクレオチドに対して同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージと定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的での整列は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを用い、当該分野における技量内である種々の方法で達成することができる。しかしながら、この目的では、％核酸配列同一性は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて作り出され、ここに、ＡＬＩＧＮ−２プログラムについての完全な源コードを後に表１に供する。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって著作され、後の表１に示された源コードは合衆国著作権局，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９におけるユーザードキュメンテーションに申請され、そこで、それは合衆国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通じて公に入手可能であり、あるいは後の表１に供された源コードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＵＮＩＸ（登録商標）操作システム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄで用いるためにコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、変化しない。
ＡＬＩＧＮ−２が核酸配列比較で使用される状況では、（与えられた核酸配列Ｄに対してある％核酸配列同一性を有する、またはそれを含む与えられた核酸配列Ｃと別法としていうことができる）与えられた核酸配列Ｄに対して与えられた核酸配列Ｃの％核酸配列同一性は以下のように計算される：
１００×分率Ｗ／Ｚ
ここに、Ｗは、ＣおよびＤのそのプログラムの整列における配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一のマッチとしてスコアが与えられたヌクレオチドの数であり、およびここに、ＺはＤにおけるヌクレオチドの合計数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さが等しくない場合、Ｄに対するＣの％核酸配列同一性はＣに対するＤの％核酸配列同一性に等しくないことが認識されよう。％核酸配列同一性計算の例として、表４および５は、「ＴＡＴ−ＤＮＡ」と命名された核酸配列に対する「比較ＤＮＡ」と命名された核酸配列の％核酸配列同一性をどのようにして計算するかを示し、ここに、「ＴＡＴ−ＤＮＡ」は注目する仮定ＴＡＴ−コーディング核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」は、それに対して注目する「ＴＡＴ−ＤＮＡ」核酸分子が比較される核酸分子のヌクレオチド配列を表し、および「Ｎ」、「Ｌ」および「Ｖ」は、各々、異なる仮定ヌクレオチドを表す。特に断りのない限り、本明細書中で用いる全ての％核酸配列同一性は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて直前のパラグラフに記載されたようにして得られる。
他の具体例において、ＴＡＴ変種ポリヌクレオチドは、ＴＡＴポリペプチドをコードし、かつ好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、本明細書中に開示された全長ＴＡＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる核酸分子である。ＴＡＴ変種ポリペプチドはＴＡＴ変種ポリヌクレオチドによってコードされるものであり得る。
用語「全長コーディング領域」とは、ＴＡＴポリペプチドをコードする核酸に言及して用いられる場合、（添付の図面において、包括的に、開始および停止コドンの間にしばしば示される）本発明の全長ＴＡＴポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列をいう。用語「全長コーディング領域」とは、ＡＴＣＣ寄託核酸に言及して用いられる場合、（添付の図面において、包括的に、開始および停止コドンの間でしばしば示される）ＡＴＣＣに寄託されたベクターに挿入されるｃＤＮＡのＴＡＴポリペプチド−コーディング部分をいう。
「単離された」は、本明細書中に開示された種々のＴＡＴポリペプチドを記載するのに用いる場合、その天然環境の成分から同定され、かつ分離されおよび／または回収されたポリペプチドを意味する。その天然環境の汚染成分は、典型的には、ポリペプチドについての診断または治療用途に典型的には干渉する材料であり、酵素、ホルモン、および他の蛋白質性または非−蛋白質性溶質を含むことができる。好ましい具体例において、ポリペプチドは、（１）スピニングカップセケネータの使用によってＮ−末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、あるいは（２）クーマシーブルー、あるいは好ましくは銀染色を用いて、非−還元または還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一となるまで精製されるであろう。単離されたポリペプチドは、組換え細胞内のイン・サイチュポリペプチドを含む。というのは、ＴＡＴポリペプチド天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないからである。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。
「単離された」ＴＡＴポリペプチド−コーディング核酸または他のポリペプチド−コーディング核酸は、それが、通常は、ポリペプチド−コーディング核酸の天然源において会合する少なくとも１つの汚染核酸分子から同定され、分離された核酸分子である。単離されたポリペプチド−コーディング核酸分子は、天然で見出される形態または設定以外である。従って、単離されたポリペプチド−コーディング核酸分子は、特定のポリペプチド−コーディング核酸分子から区別される。というのは、それは天然細胞に存在するからである。しかしながら、単離されたポリペプチド−コーディング核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のそれとは異なる染色体位置にある場合に、通常はポリペプチドを発現する細胞に含有されたポリペプチド−コーディング核酸分子を含む。
用語「制御配列」とは、特定の宿主生物において操作可能に連結されたコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列を言う。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモータ、所望によりオペレータ配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞はプロモータ、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、それがもう１つの核酸配列とで機能的な関係に入った場合に、「操作可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーについてのＤＮＡは、もしそれがポリペプチドの分泌に参画するプレ蛋白質として発現されるならば、ポリペプチドについてのＤＮＡに操作可能に連結されており；プロモータまたはエンハンサーは、もしそれが配列の転写に影響するならば、コーディング配列に操作可能に連結されており；あるいはリボソーム結合部位は、もしそれが転写を促進するように位置しているならば、コーディング配列に操作可能に連結されている。一般に、「操作可能に連結された」は、連結されるＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合には、連続しており、かつリーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要はない。連結は便宜な制限部位における連結によって達成される。もしそのような部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを慣用的なプラクティスに従って用いられる。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は当業者によって決定可能であり、一般には、プローブの長さ、洗浄温度および塩濃度に依存した経験的な計算である。一般に、より長いプローブは適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、他方、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般には、相補的なストランドがその融解温度未満の環境に存在する場合に、再度アニールする変性ＤＮＡの能力に依存する。プローブおよびハイブリダイゼーション配列の間の所望の相同性の程度がより高くなれば、用いることができる相対的温度がより高くなる。その結果、より高い相対的温度は反応条件をよりストリンジェントとする傾向があり、他方、より低い温度は余りストリンジェントではないということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）参照。
本明細書中で定義される「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は；（１）洗浄のために低いイオン強度および高温、例えば、５０℃における０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用し；（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミドのような変性剤、例えば、４２℃における、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／ｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を使用し；あるいは（３）０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中での４２℃における１０分間の洗浄を伴う、４２℃において５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロ硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）０．１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸を使用する溶液中での一晩のハイブリダイゼーション、引き続いての、５５℃における、ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣよりなる１０分間の高−ストリンジェンシー洗浄を使用することによって同定することができる。
「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９によって記載されているように同定することができ、それは前記したものより余りストリンジェントでない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液１０％デキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での３７℃における一晩のインキュベーション、続いての、約３７ないし５０℃における１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄である。当業者であれば、温度、イオン強度等をどのようにして調整して、必要であれば、プローブ長等のような因子を受け入れるかを認識するであろう。
用語「エピトープタグド」は、本明細書中で用いる場合、「タグポリペプチド」に融合したＴＡＴポリペプチドまたは抗−ＴＡＴ抗体を含むキメラポリペプチドをいう。タグポリペプチドは、それに対して抗体を作成することができるエピトープを供するのに十分な残基を有するが、それが、縮合するポリペプチドの活性に干渉しないように十分短い。タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープに実質的に交差しないようにかなりユニークである。適当なタグポリペプチドは、一般には、少なくとも６のアミノ酸残基、通常、約８および５０アミノ酸の間の残基（好ましくは、約１０および２０アミノ酸の間の残基）を有する。
ここでの目的のためには「活性な」または「活性」とは、天然または天然に生じるＴＡＴの生物学的および／または免疫学的値を保持するＴＡＴポリペプチドの形態を言い、ここに、「生物学的」活性とは、天然または天然に生じるＴＡＴによって保有された抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘導する能力以外の天然または天然に生じるＴＡＴによって引き起こされた生物学的機能（阻害性または刺激性いずれか）をいい、「免疫学的」活性とは、天然または天然に生じるＴＡＴによって保有される抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘導する能力をいう。
用語「アンタゴニスト」は最も広い意味で用いられ、本明細書中に開示される天然ＴＡＴポリペプチドの生物学的活性を部分的にまたは十分にブロックし、阻害し、中和するいずれの分子も含む。同様に、用語「アゴニスト」は最も広い意味で用いられ、本明細書中に開示された天然ＴＡＴポリペプチドの生物学的活性を模倣するいずれの分子も含む。適当なアゴニストまたはアンタゴニスト分子は、具体的には、アゴニストまたはアンタゴニスト抗体または抗体断片、天然ＴＡＴポリペプチドの断片またはアミノ酸配列変種、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小有機分子等を含む。ＴＡＴポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための方法は、ＴＡＴポリペプチドを候補アゴニストまたはアンタゴニスト分子と接触させ、次いで、ＴＡＴポリペプチドに通常は関連する１以上の生物学的活性における検出可能な変化を測定することを含むことができる。
「治療する」または「治療」または「軽減」とは、治療的処置および予防的または予防手段を共にいい、ここに、目的は標的となる病理学的状態または障害を妨げ、または遅延させる（低める）ことにある。処置を必要とする者は、障害を既に持つ者、ならびに障害を有する傾向がある者、障害を予防すべき者を含む。被験体または哺乳動物は、もし、本発明の方法に従った治療量の抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子を受けた後に、患者が以下の：癌細胞の数の低下、または癌細胞の不存在；腫瘍サイズの低下；柔軟組織または骨への癌の拡大を含めた、末梢器官への癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、ある程度遅くすること、好ましくは停止させること）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度遅くすること、好ましくは停止させること）；腫瘍成長のある程度の阻害；および／または特定の癌に関連する徴候の１以上のある程度までの緩和；低下した罹患率および死亡率および生活の質の論点の改善の１以上における観察可能なおよび／または測定可能な低下、あるいはその不存在を示せば、ＴＡＴポリペプチド−発現癌について首尾よく「治療」されている。抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴ結合オリゴペプチドが存在する癌細胞の成長を妨げ、および／または死滅させることができる程度に、それは細胞静止および／または細胞傷害性であり得る。これらの徴候または症状の低下もまた患者は感じることができるであろう。
成功した処置および病気の改善を評価するための前記パラメータは、医師が精通したルーチン的な手法によって容易に測定可能である。癌療法では、効率は、例えば、病気進行までの時間（ＴＴＰ）を評価することによって、および／または応答速度（ＲＲ）を決定することによって測定することができる。転移は、ステージグテストによって、および骨スキャン、ならびに骨への拡大を決定するためのカルシウムレベルおよび他の酵素についてのテストによって決定することができる。ＣＴスキャンを行って、当該領域における骨盤およびリンパ節への拡大を探すこともできる。胸部Ｘ−線、および公知の方法による肝臓酵素レベルの測定を用いて、各々、肺および肝臓への転移を探す。病気をモニターするための他のルーチン的な方法は、経肛門ウルトラソノグラフィー（ＴＲＵＳ）および経肛門ニードルバイオプシー（ＴＲＮＢ）を含む。
より局所化された癌である膀胱癌では、病気の進行を判断するための方法は、膀胱鏡検査による泌尿器細胞学的評価、尿中の血液の存在についてのモニタリング、ソノグラフィーまたは静脈内腎盂Ｘ線像による生殖器上皮管の可視化、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、および磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を含む。遠く離れた転移の存在は、腹部のＣＴ、胸部Ｘ−線、または骨格の放射性核種イメージングによって評価することができる。
「慢性」投与とは、長時間の初期治療効果（活性）を維持するような、急性様式とは反対の連続的様式での剤の投与をいう。「間歇的」投与は、中断することなく連続的には行われず、むしろ性質としてサイクル的である処置である。
癌の治療、癌の徴候の軽減、または癌の診断の目的での「哺乳動物」とは、ヒト、家畜および農場動物、ならびにイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどのような動物園、スポーツまたは愛玩動物を含めた、哺乳動物に分類されるいずれの動物もいう。
１以上の更なる治療剤「と組み合わせた」投与は、同時（共働）およびいずれかの順序での順次の投与を含む。
本明細書中で用いられる「キャリア」は、使用される用量および濃度においてそれに暴露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、安定化剤を含む。しばしば、生理学的に受容可能なキャリアはｐＨ緩衝化水溶液である。生理学的に受容可能なキャリアの例は、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような蛋白質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩−形成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）のような非イオン性界面活性剤を含む。
「固相」または「固体支持体」は、それに対して本発明の抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子が接着し、または結合することができる非−水性マトリックスを意味する。ここに含まれる固相の例は、ガラス（例えば、制御されたポアのガラス）、多糖（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーンから部分的にまたは全体が形成されたものを含む。ある具体例においては、文脈に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを含むことができ；他の具体例においては、それは精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語は米国特許第４，２７５，１４９号に記載されたもののような、離散的な粒子の不連続的固相を含む。
「リポソーム」は、（ＴＡＴポリペプチド、それに対する抗体、またはＴＡＴ結合オリゴペプチドのような）薬物の哺乳動物への送達でいうような種々のタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成される小さな小胞である。リポソームの成分は、生物学的膜の脂質配置と同様に、通常は、二層形成にて配置される。
「小」分子または「小」有機分子は、本明細書中においては、約５００ダルトン未満の分子量を有すると定義される。
本明細書中で開示されるポリペプチド、抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ結合有機分子、あるいはそのアゴニストもしくはアンタゴニストの「有効量」は、具体的に述べられた目的を実行するのに十分な量である。「有効量」は、述べられた目的との関連で、経験的に、およびルーチン的に決定することができる。
用語「治療上有効量」とは、被験体または哺乳動物において病気または障害を「治療」するのに有効な、抗体、ポリペプチド、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ結合有機分子、または他の薬物の量をいう。癌の場合には、薬物の治療上有効量は、癌細胞の数を低下させ；腫瘍のサイズを低下させ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害し（すなわち、ある程度遅くし、好ましくは停止させ）；腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度遅くし、好ましくは停止させ）；腫瘍の成長をある程度阻害し；および／または癌に伴う徴候の１以上をある程度軽減することができる。「治療する」の定義を参照。薬物が存在する癌細胞の成長を妨げ、および／または該細胞を殺傷することができる程度に、それは細胞静止性および／または細胞傷害性であり得る。
抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴポリペプチド、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、（ＴＡＴ１８８ ｓｉＲＮＡのような）ＴＡＴ ｓｉＲＮＡ、またはＴＡＴ結合有機分子の「成長阻害量」は、イン・ビトロまたはイン・ビボいずれかにて、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の成長を阻害できる量である。新形成細胞成長を阻害する目的での、抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴポリペプチド、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、（ＴＡＴ１８８ ｓｉＲＮＡのような）ＴＡＴ ｓｉＲＮＡ、またはＴＡＴ結合有機分子の「成長阻害量」は、経験的に、およびルーチン的に決定することができる。
抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴポリペプチド、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、（ＴＡＴ１８８ ｓｉＲＮＡのような）ＴＡＴ ｓｉＲＮＡ、またはＴＡＴ結合有機分子の「細胞傷害性量」は、イン・ビトロまたはイン・ビボいずれかで、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の破壊を引き起こすことができる量である。新形成細胞成長を阻害する目的での、抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴポリペプチド、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、（ＴＡＴ１８８ ｓｉＲＮＡのような）ＴＡＴ ｓｉＲＮＡ、またはＴＡＴ結合有機分子の「細胞傷害性量」は、経験的に、およびルーチン的に決定することができる。
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、具体的には、例えば、それらが所望の生物学的または免疫学的活性を呈する限り、（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体を含めた）単一の抗−ＴＡＴモノクローナル抗体、ポリエピトープ特異性を持つ抗−ＴＡＴ抗体組成物、ポリクローニル抗体、単一鎖抗−ＴＡＴ抗体、および抗−ＴＡＴ抗体の断片（後記参照）を網羅する。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書中においては、抗体と総合交換可能に用いられる。
「単離された抗体」は、その天然環境の成分から同定され、分離されおよび／または回収されたものである。その天然環境の汚染成分は、抗体についての診断または治療用途に干渉するであろう物質である、酵素、ホルモン、および他の蛋白質性または非蛋白質性溶質を含むことができる。好ましい具体例において、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ方法によって測定して抗体の９５重量％を超えるまで最も好ましくは９９重量％を超えて、（２）スピニングカップセケネータの使用によってＮ−末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに十分な程度まで、あるいは（３）クーマシーブルー、または好ましくは銀染色を用いる、還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一となるまで精製されるであろう。単離された抗体は、組換え細胞内のイン・サイチュ抗体を含む。というのは、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないだろうからである。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。
基本的な４−鎖抗体ユニットは、２つの同一の軽鎖（Ｌ）および２つの同一の重鎖（Ｈ）から構成されるヘテロテトラマー糖蛋白質である（ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる更なるポリペプチドと共に、５つの基本的なヘテロテトラマーユニットからなり、従って、１０の抗原結合部位を含有し、他方、分泌されたＩｇＡ抗体は、重合して、Ｊ鎖と共に基本的な４−鎖ユニットの２ないし５を含む多価アセンブラージを形成することができる）。ＩｇＧの場合には４−鎖ユニットは、一般には、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は１つの共有結合ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結され、他方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖イソタイプに応じて、１以上のジスルフィド結合によって相互に連結される。各ＨおよびＬ鎖は、規則的に感覚が設けられた鎖内ジスルフィドブリッジも有する。各Ｈ鎖はＮ−末端、可変ドメイン（ＶＨ）、続いて、αおよびγ鎖の各々についての３つの定常ドメイン（ＣＨ）、およびμおよびεイソタイプについての４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ−末端、可変ドメイン（ＶＬ）、続いてのその他の端部における定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列する。特別なアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメインの間で界面を形成すると考えられている。ＶＨおよびＶＬの対合は、一緒になって、単一の抗原−結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造および特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｍｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ．Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，ｐａｇｅ ７１ ａｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ ６参照。
いずれの脊椎動物種からのＬ鎖も、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる、２つの明瞭に区別されるタイプの１つに帰属させることができる。それらの重鎖（ＣＨ）の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを異なるクラスまたはイソタイプに帰属させることができる。５つのクラスの免疫グロブリン：各々、α、δ、ε、γおよびμと命名される重鎖を有するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがある。該γおよびαクラスは、ＣＨ配列および機能の比較的重要でない差に基づいてサブクラスにさらに分けられ、例えば、ヒトは以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を表す。
用語「可変」とは、可変ドメインのあるセグメントが抗体の間で配列がかなり異なる事実をいう。Ｖドメインは抗原の結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの１１０−アミノ酸スパンを横切って均一には分布しない。その代わり、Ｖ領域は、各々９ないし１２アミノ酸の長さである「超可変領域」と呼ばれる極端な可変性のより短い領域によって分離された１５ないし３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチよりなる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、β−シート構造を結合し、ある場合には該構造の一部を形成するループを形成する、３つの超可変領域によって連結された、β−シート立体配置を大いに採用する４つのＦＲを含む。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって近接して一緒に保持され、他の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原−結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）参照）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接的には関与しないが、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における抗体の参画のような種々のエフェクター機能を呈する。
用語「超可変領域」は、本明細書中で用いる場合、抗原−結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域（ＨＶＲ）は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、ＶＬ中の約残基２４ないし３４（Ｌ１）、５０ないし５６（Ｌ２）および８９ないし９７（Ｌ３）、およびＶＨ中の約１ないし３５（Ｈ１）、５０ないし６５（Ｈ２）および９５ないし１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））、および／または「超可変ループ」からの残基（例えば、ＶＬ中の残基２６ないし３２（Ｌ１）、５０ないし５２（Ｌ２）および９１ないし９６（Ｌ３）、およびＶＨ中の２６ないし３２（Ｈ１）、５３ないし５５（Ｈ２）および９６ないし１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＨＶＲは、ここに引用してその全体を援用する、２００４年２月１９日に出願された米国出願番号に開示された配列を含むようにも定義され、ここに、拡大されたＨＶＲは、複雑な結晶構造の分析に基づいて、抗体の結合したリガンドと接触していると定義される可変領域内のアミノ酸配列位置のいくつかを含む。本明細書中で用いるように、用語「ＨＶＲ」および「ＣＤＲ」は、以下のように定義される拡大したＨＶＲを含むように相互交換的に用いられる。
用語「超可変領域」は本明細書中で用いる場合、配列が超可変であり、および／または構造的に規定されるループを形成する抗体可変ドメインの領域をいう。一般には、抗体は６つの超可変領域；ＶＨにおける３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、およびＶＬにおける３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。多数の超可変領域の表示が用いられており、それらはここに含まれる。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列可変性に基づき、最も普通に用いられる（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、その代わり、構造ループの位置に言及している（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ長可変領域はＫａｂａｔ ＣＤＲおよびＣｈｏｔｈｉａ構造ループの間の折衷を表し、これは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられる。「接触」長超可変領域は、入手可能な複雑な結晶の構造の分析に基づく。これらの超可変領域の各々からの残基を以下に示す。
Figure 2008512121
 超可変領域は以下のように「拡大された超可変領域」を含むことができる：ＶＬ中の２４ないし３４（Ｌ１）、５０ないし５６（Ｌ２）および８９ないし９７（Ｌ３）、およびＶＨ中の２６ないし３５（Ｈ１）、５０ないし６５または４９なし６５（Ｈ２）、および９３ないし１０２、９４ないし１０２または９５ないし１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、それらの定義の各々につき、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａに従ってナンバリングされる。
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書中で定義された超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
本明細書中で用いられる用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわち、該集団を含む個々の抗体は、微量で存在しえる可能な天然に生じる突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、抗原部位に対して向けられる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含むポリクローナル抗体集団とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらは他の抗体によって汚染されていない合成できる点で有利である。修飾語「モノクローナル」はいずれかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明で言うようなモノクローナル抗体は、最初、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載されたハイリドーマ方法によって調製させることができるか、あるいは細菌、真核生物動物または植物細胞において、組換えＤＮＡ方法を用いて作成することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することができる。
ここに、モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖が、特定の種に由来する、あるいは特定の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一である、またはそれと相同であり、他方、該鎖の残りは、もう１つの種に由来する、あるいはもう１つの抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であり、またはそれと相同である「キメラ」抗体、ならびに所望の生物学的活性を呈する限りそのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）参照）。ここに、注目するキメラ抗体は、非−ヒト霊長類（例えば、旧世界のサル、猿人など）に由来する可変ドメイン抗原−結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む。
「無傷」抗体は、抗原−結合部位、ならびにＣＬおよび少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変種であり得る。好ましくは、無傷抗体は１以上のエフェクター機能を有する。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部、好ましくは無傷抗体の抗原結合もしくは可変領域を含む。抗体断片の例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディー；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］参照）；単一−鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多特異的抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、２つの同一の抗原−結合断片、いわゆる「Ｆａｂ」断片、および残りの「Ｆｃ」断片を生じ、表示は容易に結晶化する能力を反映する。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）および１つの重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）と共に全Ｌ鎖よりなる。各Ｆａｂ断片は抗原結合に関して一価であり、すなわち、それは単一の抗原−結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、二価抗原−結合活性を有する２つのジスルフィド連結Ｆａｂ断片に大まかに対応し、依然として、抗原を架橋させることができる単一の大きなＦ（ａｂ‘）２断片を生じる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインを含めた、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において更なる少数の残基を有することによってＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書中においては、定常ドメインのシステイン残基が有利チオール基を担うＦａｂ’についての表示である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、それらの間でヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生じた。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
Ｆｃ断片は、ジスルフィドによって一緒に保持された双方のＨ鎖のカルボキシ−末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域における配列によって決定され、その領域は、細胞のあるタイプで見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。
「Ｆｖ」は、完全な抗原−認識および−結合部位を含有する最小抗体断片である。この断片は、密に非共有結合を会合した、１つの重鎖および１つの軽鎖可変領域ドメインのダイマーよりなる。これらの２つのドメインの折畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗原結合特異性を抗体に付与する６つの超可変ループ（各々、ＨおよびＬ鎖からの３つのループ）が放出される。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、完全な結合部位よりも低い親和性においてではあるが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも省略される「単一−鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖へと連結されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能とする、ＶＨおよびＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖのレビューについては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ １９９５，ｉｎｆｒａ参照。
用語「ダイアボディー」とは、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間の対合が達成され、その結果、二価断片、すなわち、２つの抗原−結合部位を有する断片がもたらされるように、ＶＨおよびＶＬドメインの間の短いリンカー（約５ないし１０残基）でｓＦｖ断片（先のパラグラフ参照）を構築することによって調製された小さな抗体断片をいう。二特異的ダイアボディーは、２つの抗体のＶＨおよびＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖に存在する２つの「クロスオーバー」ｓＦｖ断片のヘテロダイマーである。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により十分に記載されている。
非−ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非−ヒト抗体に由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域が、所望の抗体特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非−ヒト霊長類のような非−ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非−ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、受容者抗体またはドナー抗体に見いだされない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能をさらに精巧なものとするようになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的には全てを含む。ここに、超可変ループの全てまたは実質的に全ては非−ヒト免疫グロブリンのものに対応し、およびＦＲの全てまたは実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、所望により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）参照。
「種−依存性抗体」、例えば、哺乳動物非−ヒトＩｇＥ抗体は、それが第二の哺乳動物種からのその抗原のホモロブのために有するよりも、第一の哺乳動物種からの抗原に対するより強い結合親和性を有する抗体である。通常、種−依存性抗体はヒト抗原に対して「特異的に結合する」（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは１×１０−８、最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有し）が、ヒト抗原に対するその結合親和性よりも弱い、少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍である第二の非−ヒト哺乳動物種からの抗原のホモロブに対する結合親和性を有する。種−依存性抗体は、前記定義の種々のタイプの抗体のいずれかであり得るが、好ましくは、ヒト化またはヒト抗体である。
「ＴＡＴ結合オリゴペプチ」は、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドに好ましくは特異的に結合するオリゴペプチドである。ＴＡＴ結合オリゴペプチドは、公知のオリゴペプチド合成方法を用いて化学的に合成することができるか、あるいは組換え技術を用いて精製することができる。ＴＡＴ結合オリゴペプチドは、通常、長さが少なくとも５アミノ酸であり、別法として、長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００アミノ酸以上であり、ここに、そのようなオリゴペプチドは本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができる。ＴＡＴ結合オリゴペプチドは、よく知られた技術を用いて過度な実験無くして同定することができる。この点に関して、ポリペプチド標的に特異的に結合することができるオリゴペプチドについてのオリゴペプチドライブラリをスクリーミングする技術は当該分野で良く知られていることを注記する（例えば、米国特許第５，５５６，７６２号、第５，７５０，３７３号、第４，７０８，８７１号、第４，８３３，０９２号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５７１，６８９号、第５，６６３，１４３号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ８４／０３５０６およびＷＯ ８４／０３５６４；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：３９９８−４００２（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１７８−１８２（１９８５）；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，１３０−１４９（１９８６）；Ｇｅｙｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９−２７４（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｆｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：６１１−６１６（１９８８），Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３６３，およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８参照）。
「ＴＡＴ結合有機分子」は、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドに好ましくは特異的に結合する本明細書中に提示されたオリゴポリペプチとまたは抗体以外の有機分子である。ＴＡＴ結合有機分子は、公知の方法を用いて同定し、化学的に合成することができる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ００／００８２３およびＷＯ ００／３９５８５参照）。ＴＡＴ結合有機分子は、通常、サイズが約２０００ダルトン未満、あるいはサイズが約１５００、７５０、５００、２５０または２００ダルトン未満であり、ここに、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができるそのような有機分子は、よく知られた技術を用い過度な実験なくして同定することができる。この点に関し、ポリペプチド標的に結合することができる分子についての有機分子ライブラリをスクリーニングするための技術は当該分野で良く知られていることを注記する（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ００／００８２３およびＷＯ ００／３９５８５参照）。
「干渉性ＲＮＡ」または「小さな干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」は、標的遺伝子の発現を低下させる長さが３０ヌクレオチド未満の二本鎖ＲＮＡ分子である。「ＴＡＴ干渉性ＲＮＡ」または「ＴＡＴ ｓｉＲＮＡ」はＴＡＴ核酸に好ましくは特異的に結合し、その発現を低下させる。これは、干渉性ＲＮＡが存在しない対照におけるＴＡＴ分子の発現と比較して、ＴＡＴ分子の発現が存在する干渉性ＲＮＡでより低いことを意味する。ＴＡＴ干渉性ＲＮＡは公知の方法を用いて同定し、合成することができる（Ｓｈｉ Ｙ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９（１）：９−１２（２００３）、ＷＯ ２００３０５６０１２およびＷＯ ２００３０６４６２１）。
注目する抗原、例えば、腫瘍−関連ポリペプチド抗原標的に「結合する」抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは他の有機分子は、該抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子が、該抗原を発現する細胞または組織を標的化するにおいて、診断および／または治療剤として有用であり、他の蛋白質と有意には交差反応しないように、十分な親和性でもって抗原と結合するものである。そのような具体例において、「非−標的」蛋白質への抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは他の有機分子の結合の程度は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析または放射性免疫沈澱（ＲＩＡ）によって測定して、その特定の標的蛋白質への抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは他の有機分子の結合の約１０％未満であろう。標的分子への抗原、オリゴペプチドまたは他の有機分子の結合に関しては、用語「特異的結合」、あるいは特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープ「に特異的に結合する」または「に対して特異的である」は、非−特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般には、結合活性を有しない同様な構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的、例えば、過剰な非−標識標的と同様な対照分子との競合によって決定することができる。この場合、もしプローブへの標識標的の結合が過剰な非標識標的によって競合的に阻害されるならば、特異的結合が示される。用語「特異的結合」、あるいは本明細書中で用いられる特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」または「に対して特異的である」は、例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれ以上の標的に対するＫｄを有する分子によって阻害されえる。１つの具体例において、用語「特異的結合」は、分子が、いずれかの他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合をいう。
「ＴＡＴポリペプチドを発現する腫瘍細胞の成長を阻害する」抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは他の有機分子、あるいは「成長阻害性」抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子は、適当なＴＡＴポリペプチドを発現する、または過上発現する癌細胞の測定可能な成長阻害をもたらすものである。ＴＡＴポリペプチドは癌細胞の表面で発現される膜貫通ポリペプチドであり得るか、あるいは癌細胞によって生産され、分泌されるポリペプチドでありえる。好ましい成長阻害性抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は、適当な対照と比較して、２０％を超えて、好ましくは約２０％ないし約５０％だけ、なおより好ましくは５０％を超えて（例えば、約５０％ないし約１００％だけ）ＴＡＴ−発現腫瘍細胞の成長を阻害し、該対照は、典型的には、テストすべき抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子で処理されていない腫瘍細胞である。１つの具体例において、成長阻害は、細胞培養中の約０．１ないし３０μｇ／ｍｌまたは約０．５ｎＭないし２００ｎＭの抗体濃度にて測定することができ、ここに、成長阻害は抗体への腫瘍細胞の暴露から１ないし１０日後に測定される。イン・ビボでの腫瘍細胞の成長阻害は、後に実験実施例セクションに記載されるように、種々の方法で測定することができる。もし、約１μｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ体重における抗−ＴＡＴ抗体の投与の結果、抗体の最初の投与から約５日ないし３ヶ月以内に、好ましくは約５ないし３０日以内に腫瘍のサイズまたは腫瘍細胞の増殖の低下がもたらされれば、該抗体はイン・ビボにて成長阻害性である。
「アポトーシスを誘導する」抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは他の有機分子は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の膨張、細胞断片化、および／または膜小胞（アポトーシス体と呼ばれる）の形成によって測定して、プトグラムされた細胞の死滅を誘導するものである。該細胞は、通常、ＴＡＴポリペプチドを過剰発現するものである。好ましくは、該細胞は腫瘍細胞、例えば、前立腺、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、肺、腎臓、結腸、結直腸、膀胱細胞である。アポトーシスに伴う細胞事象を評価するために種々の方法が利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）トランスローケイションはアネキシン結合によって測定することができ；ＤＮＡ断片化はＤＮＡラダリングを介して評価することができ；およびＤＮＡ断片化に伴う核／クロマチン凝縮はハイポジプロイド細胞のいずれかの増加によって評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子は、アネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞に対するアネキシン結合の約２ないし５０倍、好ましくは約５ないし５０倍、最も好ましくは約１０ないし５０倍の誘導をもたらすものである。
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変種Ｆｃ領域）に帰すことができる生物学的活性をいい、抗体イソタイプで変化する。抗体エフェクター機能の例は：Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害性；Ｆｃ受容体結合；抗体−依存性細胞−媒介細胞傷害性（ＡＴＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；およびＢ細胞活性化を含む。
「抗体−依存性細胞−媒介細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌されたＩｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を担う標的細胞に特異的に結合し、引き続いて、サイトトキシンで標的細胞を殺すのを可能とする細胞傷害性の形態をいう。抗体は細胞傷害性細胞を「同伴し」、それはそのような殺傷に絶対的に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞、ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、他方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３にまとめられている。注目する分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されたもののようなイン・ビトロＡＤＣＣアッセイを行うことができる。そのようなアッセイについての有用なエフェクター細胞は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。別法として、あるいは加えて、注目する分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されたもののような動物モデルにおいてイン・ビボで評価することができる。
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。好ましいＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマー受容体）に結合するものであり、これらの受容体の対立遺伝子変種、あるいはスプライスされた形態を含めた、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、その細胞質ドメインにおいて主として異なる同様なアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含む。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシン−ベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシン−ベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｍ．Ｄａeｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）中のレビュー参照）。ＦｃＲはＲａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５−３４（１９９４）；およびＨａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）にレビューされている。将来同定されるものを含めた他のＦｃＲは、本明細書中における用語「ＦｃＲ」によって含まれる。該用語は、母性ＩｇＧの胎児への移動を担う新生児受容体ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。
「ヒトエフェクター細胞」は１以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を行う白血球である。好ましくは、該細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を行う。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球を含み；ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、天然源から、例えば、血液から単離することができる。
「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解をいう。古典的な補体経路の活性化は、それらの同族抗原に結合する（適当なサブクラスの）抗体への補体系（Ｃ１ｑ）の最初の成分の結合によって開始される。補体活性化を評価するためには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されたＣＤＣアッセイを行うことができる。
用語「癌」および「癌性」とは、典型的には調節されていない細胞成長によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的疾患をいい、またはそれを記載する。癌の例は、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞種、肉腫、および白血病またはリンパ系悪性疾患を含む。そのような癌のより特別な例は扁平細胞（例えば、上皮扁平細胞癌）、小細胞肺癌、非−小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平癌腫を含めた肺癌、腹腔の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含めた胃癌、膵臓癌、神経膠芽細胞種、頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、泌尿器管の癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、子宮内膜または子宮癌種、唾液腺癌腫、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌種、肛門癌腫、陰茎癌、メラノーマ、多発性骨髄腫およびＢ−細胞リンパ腫、脳、ならびに頭部および首癌、および関連する転移を含む。
用語「細胞増殖性障害」および「増殖性傷害」とは、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害をいう。１つの具体例において、細胞増殖性障害は癌である。
本明細書中で用いる「腫瘍」とは、悪性または良性を問わず全て新形成細胞成長および増殖、および全てのプレ−癌性および癌性の細胞および組織をいう。
「細胞の死滅を誘導する」抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子は、生存細胞が生存しなくなるようにするものである。該細胞は、ＴＡＴポリペプチドを発現するもの、好ましくは、同一組織タイプの正常な細胞と比較して、ＴＡＴポリペプチドを過剰発現する細胞である。ＴＡＴポリペプチドは、癌細胞の表面に発現された膜貫通ポリペプチドでありえ、あるいは癌細胞によって生産され、分泌されたポリペプチドでありえる。好ましくは、該細胞は癌細胞、例えば、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、結直腸、胸腺、膵臓または膀胱細胞である。イン・ビトロでの細胞死滅は、補体および免疫エフェクター細胞の存在下で測定して、抗体−依存性細胞−媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）によって誘導される細胞死滅を区別することができる。かくして、細胞死滅についてのアッセイは、（補体不存在下で）加熱不活化血清を用い、免疫エフェクター細胞の不存在下で行うことができる。抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子が細胞死滅を誘導できるか否かを判断するために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：１−１１（１９９５））または７ＡＡＤの接種によって評価される膜一体性の喪失は、未処理細胞に対して評価することができる。好ましい細胞死滅−誘導抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子は、ＢＴ４７４細胞におけるＰＩ接種アッセイでのＰＩ接種を誘導するものである。
「ＴＡＴ−発現細胞」は、細胞表面での、または分泌された形態における内因性またはトランスフェクトされたＴＡＴポリペプチドを発現する細胞である。「ＴＡＴ−発現癌」は、細胞表面に存在するＴＡＴポリペプチドを有する、あるいはＴＡＴポリペプチドを生産し分泌する細胞を含む癌である。「ＴＡＴ−発現癌」は、抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子がそれに結合でき、癌に関する治療効果を有するように、所望により、その細胞の表面で十分なレベルのＴＡＴポリペプチドを生産する。もう１つの具体例において、「ＴＡＴ−発現癌」は、抗−ＴＡＴ抗体、オリゴヌクレオチドまたは他の有機分子アゴニストがそれに結合でき、癌に関する治療効果を有するように、所望により、十分なレベルのＴＡＴポリペプチドを生産し、分泌する。後者に関しては、アンタゴニストは、腫瘍細胞によって分泌されたＴＡＴポリペプチドの生産および分泌を低下させ、阻害し、または妨げるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。ＴＡＴポリペプチドを「過剰発現」する癌は、同一組織タイプの非癌性細胞と比較して、その細胞表面で有意により高いレベルのＴＡＴポリペプチドを有し、あるいはそれを生産し、分泌するものである。そのような過剰発現は、遺伝子増幅によって、または増大した転写または翻訳によって引き起こされる。ＴＡＴポリペプチド過剰発現は、（例えば、ＴＡＴポリペプチドをコードする単離された核酸から組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる単離されたＴＡＴポリペプチドに対して調製された抗−ＴＡＴ抗体を用いる免疫組織化学アッセイ；ＦＡＣＳ分析などを介して）細胞の表面に存在する、または該細胞によって分泌されたＴＡＴ蛋白質の増大したレベルを評価することによって、診断または予後アッセイで測定することができる。別法として、あるいは加えて、例えば、ＴＡＴ−コーディング核酸に対応する核酸ベースのプローブ、またはその相補体を用いる蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公表されたＷＯ ９８／４５４７９参照）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、またはリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のようなポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術を介して、細胞中でのＴＡＴポリペプチド−コーディング核酸またはｍＲＮＡのレベルを測定することができる。また、例えば、抗体−ベースのアッセイを用い、血清のような生物学的流体中の放出された抗原を測定することによって、ＴＡＴポリペプチド過剰発現を調べることもできる（例えば、１９９０年６月１２日に発行された米国特許第４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日に公開されたＷＯ ９１／０５２６４；１９９５年３月２８日に発行された米国特許第５，４０１，６３８号；およびＳｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３２：７３−８０（１９９０）も参照。前記アッセイとは別に、種々のイン・ビボアッセイが当業者に利用できる。例えば、患者の身体内の細胞を、検出可能な標識、例えば、放射性同位体で所望により標識された抗体へ暴露することができ、患者における細胞への抗体の結合は、例えば、放射能についての外部スキャンニングによって、あるいは抗体に先に暴露された患者から採取したバイオプシーを分析することによって評価することができる。
本明細書中で用いるように、用語「免疫アドヘシン」は、異種蛋白質（「アドヘシン」）の結合特異性を、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせる抗体−様分子を示す。構造的には、免疫アドヘシンは、抗体の抗原認識部位および結合部位以外である（すなわち、「異種」である）所望の結合特異性を持つアミノ酸配列、および免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合を含む。免疫アドヘシン分子のアドヘシン部分は、典型的には、受容体またはリガンドの少なくとも結合部位を含む連続アミノ酸配列である。免疫アドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、またはＩｇＧ−４サブタイプ、（ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２を含めた）ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭのようないずれかの免疫グロブリンから得ることができる。
用語「標識」は、本明細書中で用いる場合には、抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子に著癖区的にまたは間接的に結合体化して、「標識された」抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子を生じる検出可能な化合物または組成物をいう。該標識はそれ自体によって検出でき（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、あるいは酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒することができる。
本明細書中で用いる用語「細胞傷害性剤」は、細胞の機能を阻害し、または妨げ、および／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。該用語は放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレーディング剤、ヌクレオ溶解酵素のような酵素およびその断片、抗生物質、小分子トキシン、あるいはその断片および／または変種を含めた細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性なトキシンのようなトキシン、および後に開示する種々の抗腫瘍または抗癌剤を含める意図である。他の細胞傷害性剤を以下に記載する。殺腫瘍剤は腫瘍細胞の破壊を引き起こす。サイトトキシンは抗体に共有結合させて、トキシンを、抗原を発現する注目する特定の細胞へ標的化することができる。有用なサイトトキシンは、限定されるものではないが、以下のものを含めたそれらのリンカーである：
リンカー：
ＭＣ＝マレイミドカプロイル
Ｖａｌ Ｃｉｔ＝バリン−シトルリン、プロテアーゼ切断可能リンカーにおけるジペプチド部位
シトルリン＝２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸
ＰＡＢ＝ｐ−アミノベンジルカルバモイル（リンカーの「自己犠牲」部分）
Ｍｅ＝リンカーペプチド結合が修飾されて、カテプシンＢによるその切断を妨げるＮ−メチル−バリンシトルリン
ＭＣ（ＰＥＧ）６−ＯＨ＝抗体システインに結合したマレイミドかプロイド−ポリエチレングリコール
ＳＰＰ＝４−（２−ピリジルチオ）ペンタン酸Ｎ−スクシンイミジル
ＳＭＣＣ＝Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート
細胞傷害性薬物：
ＭＭＡＥ＝モノ−メチルアウリスタチンＥ（ＭＷ７１８）
ＭＭＡＦ＝薬物のＣ−末端にフェニルアラニンを持つアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）の変種（ＭＷ７３１．５）
ＡＥＶＢ＝アウリスタチンＥバレリルベンジルヒドラゾン、ＡＥのＣ−末端を通る酸不安定リンカー（ＭＷ７３２）
ＡＦＰ＝アウリスタチンＦフェニレンジアニン；（フェニレンジアニンスペーサーを介してＣ−末端を通じて抗体に連結されたフェニルアラニン変種）（ＭＷ７３２）
「成長阻害剤」は、本明細書中で用いる場合、イン・ビトロまたはイン・ビボいずれかにて、細胞、特にＴＡＴ−発現癌細胞の成長を阻害する化合物または組成物をいう。かくして、成長阻害剤は、Ｓ相においてＴＡＴ−発現細胞のパーセンテージを有意に低下させるものであり得る。成長阻害剤の例は、Ｇ１阻止およびＭ−相阻止を誘導する剤のような、（Ｓ相以外の場所で）細胞周期の進行をブロックする剤を含む。古典的なＭ−相ブロッカーは、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキセン、ならびにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンのようなトポイソベラーゼＩＩ阻害剤を含む。ＧＩを阻止する剤は、Ｓ−相阻止を破壊する。例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−ＣのようなＤＮＡアルキル化剤。更なる情報はＴｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ａｎｄ Ｉｓｒａｅｌ，ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １，Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．による表題“Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｒａｔｉｏｎ， ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ”（ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）、特に１３ページに見出すことができる。タキセン（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、共にイチイ樹木に由来する抗癌薬剤である。セイヨウイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成アナログである。パクリタキセルおよびドセタキセルはチューブリンダイマーからの微小管の組立を促進し、脱重合を阻害することによって微小管を安定化させ、その結果、細胞における有糸分裂の阻害がもたらされる。
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学的名称は（８Ｓ−シス）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキサピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラー６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−５，１２−ナフタセンジオンである。
用語「サイトカイン」は、細胞間メディエーターとしてもう１つの細胞に作用する１つの細胞集団によって放出される蛋白質についての総称用語である。そのようなサイトカインの例はリンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体ホルモン（ＬＨ）のような糖蛋白質ホルモン；肝臓成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよびβ；ヌレリアン−阻害物質；マウスゴナドトロピン−関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＨ−βのような神経成長因子；血小板−成長因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン−用成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスドポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、−βおよび−γのようなインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、Ｉｌ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｉｌ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のようなインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βのような腫瘍壊死因子；ＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含めた他のポリペプチド因子がある。本明細書中で用いるように用語サイトカインは、天然源からの、または組換え細胞培養からの蛋白質、および生物学的に活性な当量の天然配列サイトカインを含む。
用語「添付文書」は、治療製品の使用に関しての症例、用法、投与量、投与、禁忌および／または警告についての情報を含む、治療製品の商業的パッケージに慣用的に含ませる指示書をいうように用いる。
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 ％アミノ酸配列同一性＝
（ＡＬＩＧＮ−２によって判断された２つのポリペプチドの間の同一にマッチするアミノ酸残基の数）÷（ＴＡＴポリペプチドのアミノ酸残基の合計数）＝
５÷１５＝３３．３％
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 ％アミノ酸配列同一性＝
（ＡＬＩＧＮ−２によって判断された２つのポリペプチドの間の同一にマッチするアミノ酸残基の数）÷（ＴＡＴポリペプチドのアミノ酸残基の合計数）＝
５÷１０＝５０％
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 ％アミノ酸配列同一性＝
（ＡＬＩＧＮ−２によって判断された２つの核酸配列の間の同一にマッチするヌクレオチドの数）÷（ＴＡＴ−ＤＮＡ核酸配列のヌクレオチドの合計数）＝
９÷１４＝４２．９％
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 （２）％核酸配列同一性＝
（３）（ＡＬＩＧＮ−２によって判断された２つの核酸配列の間の同一にマッチするヌクレオチドの数）÷（ＴＡＴ−ＤＮＡ核酸配列のヌクレオチドの合計数）＝
４÷１２＝３３．３％
ＩＩ．本発明の組成物および方法
Ａ．抗−ＴＡＴ抗体
１つの具体例において、本発明は、治療および／または診断剤としてここに用途を見い出すことができる抗−ＴＡＴ抗体を提供する。例示的な抗体はポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二特異的、およびヘテロ結合体化抗体を含む。
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物において生起させる。関連する抗原を（特に、合成ペプチドを用いる場合に）免疫化すべき種において免疫原性である蛋白質に結合体化させるのが有用であろう。例えば、抗原は、二官応性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲおよびＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシチログロビン、または大豆トリプシン阻害剤に結合体化することができる。
例えば、１００μｇまたは５μｇの蛋白質または結合体化（各々、ウサギまたはマウス用）を３容量のフロイントの完全アジュバントと組み合わせ、溶液を複数部位にて皮内注射することによって、動物を抗原、免疫原性結合体化、または誘導体に対して免疫化する。１ケ月後、複数部位における皮下注射によって、フロイントの完全アジュバント中の元の量の１／５ないし１／１０のペプチドまたは結合体化をブースター注射する。７ないし１４日後、動物を出血させ、血清を抗体力価についてアッセイする。力価がプラトーとなるまで動物をブースター注射する。結合体化は、蛋白質融合として組換え細胞培養においても作成することができる。また、ミョウバンのような凝集剤は、免疫応答を促進するのに適切に用いられる。
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法を用いて作成することができ、あるいは組換えＤＮＡ方法によって作成することができる（米国特許第４，８１６，５６７号）。
ハイブリドーマ方法において、マウス、またはハムスターのような他の適当な宿主細胞を、前記したように、免疫化して、免疫化で用いる蛋白質に特異的に結合する抗体を生産する、または生産することができるリンパ球を誘導する。別法として、リンパ球をイン・ビトロにて免疫化することができる。免疫化の後、リンパ球を単離し、次いで、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて、骨髄腫細胞系と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｈｒｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｌａｃｅ，１９８６））。
かく調製したハイブリドーマを、適当な培養基に撒き、そこで増殖させ、その培地は、好ましくは、（融合パートナーともいう）融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１以上の物質を含有する。例えば、もし親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＡＴまたはＨＰＲＴ）を欠くならば、ハイブリドーマのための選択培養基は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、その物質は、ＨＧＰＲＴ−欠乏細胞の成長を妨げる。
好ましい融合パートナー骨髄腫細胞は、効果的に融合し、選択された抗体−生産細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支持し、融合していない親細胞に対して選択される選択培地に対して感受性であるものである。好ましい骨髄腫細胞系は、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｕｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、ＳＰ−２および誘導体、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃａｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡから入手可能なＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞のようなネズミ骨髄腫系である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系もまた、ヒトモノクローナル抗体の生産について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；およびＢｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養基を、抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の生産についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈澱によって、あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のような、イン・ビトロ結合アッセイによって測定される。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｌａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）に記載されたＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって測定することができる。
一旦、所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞が同定されたならば、限界希釈手法によってクローンをサブクローンし、標準的な方法によって増殖させる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的での適当な培養基は、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。加えて、ハイブリドーマ細胞は、例えば、該細胞のマウスへの腹腔内注射によって、動物における腹水腫瘍としてイン・ビボで増殖させることができる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いる）アフィニティークロマトグラフィー、またはイオン−交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などのような慣用的な抗体精製手法によって培養基、腹水液、または血清から適切に分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）慣用的な手法を用いて容易に単離し、配列決定される。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい源として供される。一旦単離されれば、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次いで、これを、そうでなければ抗体蛋白質を生産しないＥ．ｃｏｌｉ細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現についてのレビュー論文は、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６−２６２（１９９３）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｌｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１−１８８（１９９２）を含む。
更なる具体例において、モノクローナル抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）を用いて生じさせた抗体ファージライブラリから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）は、ファージライブラリを用いる、各々、ネズミおよびヒト抗体の単離を記載する。引き続いての刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の生産（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに非常に大きなファージライブラリを構築するための戦略としてのコンビナトーリアル感染およびイン・ビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３））を記載する。かくして、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する有力な代替方である。
該抗体をコードするＤＮＡを修飾して、例えば、相同ネズミ配列に代えてヒト重鎖および軽鎖定常ドメイン（ＣＨおよびＣＬ）配列で置き換えることによって（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、あるいは免疫グロブリンコーディング配列を、非−免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）についてのコーディング配列の全てまたは一部と融合させることによって、キメラまたは融合抗体ポリペプチドを生産することができる。非−免疫グロブリンポリペプチド配列を抗体の定常ドメインに代えて置き換えることができる、あるいはそれらを抗体の１つの抗原−組合せ部位の可変ドメインに代えて置き換えて、異なる抗原についての特異性を有する抗原およびもう１つの抗原−組合せ部位に対する特異性を有する１つの抗原−組合せ部位を含むキメラ二価抗体を作成する。
３．ヒトおよびヒト化抗体
本発明の抗−ＴＡＴ抗体は、さらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含むことができる。非−ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化形態は、非−ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、あるいは（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原−結合サブ配列のような）その断片である。ヒト化抗体は、受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非−ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置き換えられた免疫グロブリン（受容者抗体）を含む。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非−ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体は、受容者抗体においても、あるいは輸入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見出されない残基を含むこともできる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここに、ＣＤＲ領域の全て、または実質的に全ては非−ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、およびＦＲ領域の全て、または実質的に全てはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう［Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。
非−ヒト抗体をヒト化する方法は当該分野で良く知られている。一般に、ヒト化抗体は、非−ヒトである源からそれに導入された１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非−ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「輸入」残基といい、これは、典型的には、「輸入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、実質的には、ヒト抗体の対応する配列に代えてげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置き換えることによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法［Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］に従って行うことができる。従って、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、そこでは、実質的に無傷ヒト可変ドメイン未満が、非−ヒト種からの対応する配列によって置き換えられている。現実には、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であり、そこでは、いくつかのＣＤＲ残基および、おそらくは、いくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体において同様な部位からの残基によって置き換えられている。
ヒト化抗体を作成するにおいて用いるべき重鎖および軽鎖双方のヒト可変ドメインの選択は、抗体をヒト治療用途で意図している場合には、抗原性およびＨＡＭＡ応答（ヒト抗−マウス抗体）を低下させるのに非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」方法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングする。げっ歯類のそれに最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、それ内のヒトフレームワーク領域（ＲＦ）は、ヒト化抗体について受容可能である（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。もう１つの方法は、軽鎖または重鎖の特定の亜群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を用いる。同一のフレームワークは、いくつかの異なるヒト化抗体について用いることができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９０）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３））。
抗体は、抗原に対する高い結合親和性および他の好都合な生物学的特性を保持してヒト化されるのがさらに重要である。この目標を達成するには、好ましい方法に従うと、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いる親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析の方法によって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは通常利用でき、当業者が精通している。選択された候補免疫グロブリン配列のポータブル三次元立体配座構造を説明し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイの精査は、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基のありそうな役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響する残基の分析を可能とする。このようにして、標的抗原に対する増大した親和性のような所望の抗体特徴が達成されるようにＦＲ残基を選択し、受容者および輸入配列から組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接的かつ最も実質的に関与する。
ヒト化抗−ＴＡＴ抗体の種々の形態が考えられる。例えば、ヒト化抗体は、１以上の細胞傷害性剤と所望により結合体化して、免疫結合体を作成するＦａｂのようなもう１つの断片であり得る。別法として、ヒト化抗体は、無傷ＩｇＧ１抗体のような無傷抗体であり得る。
ヒト化に対する代替法として、ヒト抗体を作成することができる。例えば、今や、免疫化に際して、内因性免疫グロブリンの生産の不存在下でヒト抗体の十分なレパートリーを生産することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を生産することが可能である。例えば、キメラおよび生殖系突然変異体マウスにおける抗体の重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失の結果、内因性抗体の生産が完全に阻害されることが記載されている。ヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイの生殖系突然変異体マウスへの導入の結果、抗原の攻撃に際してヒト抗体が生産される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許５４，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，５９１，６６９（全てＧｅｎＰｈａｒｍのもの）；第５，５４５，８０７号；およびＷＯ ９７／１７８５２参照。
別法として、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｗｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３［１９９０］）を用いて、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからイン・ビトロにてヒト抗体および抗体断片を生産することができる。この技術に従い、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄのようなフィラメント状バクテリオファージの主たるまたは従たる被膜蛋白質遺伝子いずれかにイン・フレームにてクローン化し、ファージ粒子の表面に機能的抗体断片として表示する。フィラメント状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有する故に、抗体の機能的特性に基づく選択の結果、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子が選択される。かくして、ファージはＢ−細胞の特性をいくらか模倣する。ファージディスプレイは、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ．ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５６４−５７１（１９９３）にレビューされた種々の様式で行うことができる。Ｖ−遺伝子セグメントのいくつかの源は、ファージディスプレイのために用いることができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムなコンビナトーリアルライブラリからの抗−オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫化されていないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、（自己−抗原を含めた）抗原の多様なアレイに対する抗体を、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載された技術に実質的に従って単離することができる。また、米国特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号も参照。
前記したように、ヒト抗体は、イン・ビトロ活性化Ｂ細胞によって作成することもできる（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号）。
４．抗体断片
ある状況では、全抗体よりはむしろ抗体断片を用いる利点がある。断片のより小さなサイズは迅速なクリアランスを可能とし、固体腫瘍への改善されたアクセスに導くことができる。
種々の技術が、抗体断片の生産のために開発されている。伝統的には、これらの断片は無傷抗体の蛋白質分解消化を介して誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）。しかしながら、これらの断片が今や、組換え宿主細胞によって直接的に生産することができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片は全てのＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、それから分泌させることができ、かくして、大量のこれらの断片の容易な生産が可能となる。抗体断片が、前記した抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ’−ＳＨ断片はＥ．Ｃｏｌｉから直接的に回収することができ、形態Ｆ（ａｂ’）２に化学的にカップリングさせることができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２））。もう１つのアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）２断片は組換え宿主細胞培養から直接的に単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む増大したイン・ビボ半減期を持つＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片の生産のための他の技術は当業者に明らかであろう。他の具体例において、選択された抗体は単一鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号参照。ＦｖおよびｓＦｖは定常領域を欠く無傷組合せ部位を持つ唯一の種であり；かくして、それらは、イン・ビボ使用の間の低下した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合蛋白質を構築して、ｓＦｖのアミノまたはカルボキシ末端いずれかにおいてエフェクター蛋白質の融合を得ることができる。Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｓｕｐｒａ参照。該抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているように「線状抗体」でもあり得る。そのような線状抗体断片は一特異的または二特異的であり得る。
５．二特異的抗体
二特異的抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープについての結合特異性を有する抗体である。例示的な二特異的抗体は、本明細書中に記載されるように、ＴＡＴ蛋白質の２つの異なるエピトープに結合することができる。他のそのような抗体は、もう一つの蛋白質のための結合部位とＴＡＴ結合部位とを組み合わせることができる。別法として、抗−ＴＡＴアームを、Ｔ−細胞受容体分子（例えば、ＣＤ３）のような白血球上のトリガリング分子に結合するアーム、あるいはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のようなＩｇＧのようなＦｃ受容体（ＦｃγＲ）と組み合わせて、細胞防御メカニズムをＴＡＴ−発現細胞に焦点を合わせ、そこへ局所化することができる。また、二特異的抗体を用いて、ＴＡＴを発現する細胞へ細胞傷害性剤を局所化することもできる。これらの抗体はＴＡＴ−結合アーム、および細胞傷害性剤（例えば、サポリン、抗−インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセートまたは放射性同位体ハプテン）に結合するアームを保有する。二特異的抗体は、全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異的抗体）として調製することができる。
ＷＯ ９６／１６６７３は二特異的抗−ＥｒｂＢ２／抗−ＦｃγＲＩＩＩ抗体を記載し、米国特許第５，８７３，２３４号は二特異的抗−ＥｒｂＢ２／抗−ＦｃγＲＩ抗体を開示する。二特異的抗−ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体はＷＯ９８／０２４６３に示されている。米国特許第５，８２１，３３７号は二特異的抗−ＥｒｂＢ２／抗−ＣＤ３抗体を教示する。
二特異的抗体を作成する方法は当該分野で知られている。全長二特異的抗体の伝統的な生産は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づき、そこでは２つの鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな分類のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）、そのうち１つのみが正しい二特異的構造を有する、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産する。通常は、アフィニティークロマトグラフィー工程によってなされる正しい分子の精製はむしろ煩雑であり、生成物の収率は低い。同様な手法は、ＷＯ ９３／０８８２９において、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
異なるアプローチによると、所望の結合特異性を持つ抗体可変ドメイン（抗体―抗原組み合わせ部位）を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合させる。好ましくは、融合は、ヒンジの少なくとも一部ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインとである。融合の少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有するのが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合および、所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞に共−トランスフェクトする。これは、構築で用いる３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二特異的抗体の最適な収率を供する場合の具体例において、３つのポリペプチド断片の相互の割合を調整するにおいてより大きな柔軟性を提供する。しかしながら、等しい比率の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現の結果高い収率がもたらされる場合、あるいは該比率が所望の鎖組合せの収率に対して有利な効果を有しない場合、２つのまたは全ての３つのポリペプチド鎖についてのコーディング配列を単一の発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチの好ましい具体例において、二特異的抗体は、１つのアームにおける第一の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他のアームにおける（第二の結合特異性を供する）ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対から構成される。この非対称構造は、望まない免疫グロブリン鎖組合せからの所望の二特異的化合物の分離を容易とすることが判明した。というのは、二特異的分子の１つの半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在は、分離の容易な方法を供するからである。このアプローチはＷＯ ９４／０４６９０に開示されている。二特異的抗体を作成する更なる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０（１９８６）参照。
米国特許第５，７３１，１６８号に記載されたもう１つのアプローチによると、抗体分子の対の間の界面は、組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大とするように作成することができる。好ましい界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法においては、第一の抗体分子の界面からの１以上の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換える。大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって、大きな側鎖に対する同一または同様なサイズの補償「キャビティー」を第二の抗体分子の界面に作り出す。これは、ホモダイマーのような他の望まない最終生成物よりもヘテロダイマーの収率を増加させるメカニズムを提供する。
二特異的抗体は架橋したまたは「ヘテロ結合体」抗体を含む。例えば、ヘテロ結合体における抗体の１つをアビジンにカップリングさせることができ、他方、ビオチンにカップリングさせることができる。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を望まない細胞に標的化させるように（米国特許第４，６７６，９８０号）およびＨＩＶ感染の治療のために（ＷＯ ９１／００３６０、ＷＯ ９２／２００３７３、およびＥＰ ０３０８９）提案されている。ヘテロ結合体抗体は、いずれかの便宜な架橋方法を用いて作成することができる。適当な架橋剤は当該分野で良く知られており、多数の架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
二特異的抗体を抗体断片から作成するための技術もまた文献に記載されている。例えば、二特異的抗体は科学的結合を用いて調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）は無傷抗体を蛋白質分解により切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を生じさせる手法を記載する。これらの断片はジチオール複合体化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で低下して隣接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を妨げる。次いで、生じたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをメルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再度変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二特異的抗体を形成する。生じた二特異的抗体を、酵素の選択的固定化用の剤として用いることができる。
最近のプログラムは、化学的にカップリングさせて二特異的抗体を形成することができる。Ｅ．ｃｏｌｉからのＦａｂ’−ＳＨ断片の直接的な回収を容易とした。Ｓａｌｅｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、十分にヒト化された二特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生産を記載する。各Ｆａｂ’断片を別々にＥ．Ｃｏｌｉから分泌させ、イン・ビトロでの指令された化学的カップリングに付して、二特異的抗体を形成した。かく形成された二特異的抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞、および正常なヒトＴ細胞に結合することができならびにヒト乳癌標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性をトリガーすることができる。
組換え細胞培養から直接的に二特異的抗体断片を作成し、それを単離するための種々の技術も記載されている。例えば、二特異的抗体はロイシンジッパーを用いて生産されてきた。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎ蛋白質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合によって２つの異なる抗体Ｆａｂ’部分に連結した。抗体ホモダイマーをヒンジ領域において還元して、モノマーを形成し、次いで、再度酸化して、抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法は、抗体ホモダイマーの生産で利用することもできる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって記載された「ダイアボディー」技術は、二特異的抗体断片を作成するための代替メカニズムを提供している。該断片は、同一鎖上の２つのドメインの間での対合を可能とするには余りにも短いリンカーによってＶＬに連結されたＶＨを含む。従って、１つの断片のＶＨおよびＶＬドメインはもう１つの断片の相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対合させられ、それにより、２つの抗原−結合部位を形成する。単一−鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二特異的抗体断片を作成するためのもう１つの戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）参照。
２を超える価数を持つ抗体が考えられる。例えば、三特異的抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
６．ヘテロ結合体抗体
ヘテロ結合体抗体もまた本発明の範囲内にある。ヘテロ結合体抗体は２つの共有結合により連結された抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、望まない細胞に対して免疫系細胞を標的化するために［米国特許第４，６７６，９８０号］、およびＨＩＶ感染の治療のために［ＷＯ ９１／０３３６０；ＷＯ ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９］提案されている。該抗体は架橋剤に関連するものを含めた合成蛋白質化学における公知の方法を用いてイン・ビトロで調製することができると考えられる。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的で適した試薬の例は、イムノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートおよび、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されたものを含む。
７．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって二価抗体よりも速く内部化（および／または異化）され得る。本発明の抗体は３以上の抗原結合部位（例えば、四価抗体）を持つ（ＩｇＭクラスのもの以外である）多価抗体とすることができ、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に生産することができる。多価抗体は、二量体化ドメインおよび３以上の抗原結合部位を含むことができる。好ましい二量体化ドメインはＦｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはそれよりなる）。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域、該Ｆｃ領域に対してアミノ末端側の３以上の抗原結合部位を含むであろう。好ましい多価抗体は、ここでは、３ないし約８、好ましくは４つの抗原結合部位を含む（またはそれよりなる）。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖（好ましくは、２つのポリペプチド鎖）を含み、そこでは、ポリペプチド鎖は２以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含むことができ、ここに、ＶＤ１は第一の可変ドメインであり、ＶＤ２は第二の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２はアミノ酸またはポリペプチドを表し、およびｎは０または１である。例えば、ポリペプチド鎖は：ＶＨ−ＣＨ１−フレキシブルリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含むことができる。本明細書中において、多価抗体は、好ましくは、さらに少なくとも２つの（好ましくは４つの）軽鎖可変ドメインポリペプチドを含む。多価抗体は、本明細書中においては、例えば、約２ないし約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含むことができる。ここに考えられる軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインおよび、所望により、さらに、ＣＬドメインを含む。
８．エフェクター機能エンジニアリング
エフェクター機能に関しては、本発明の抗体を修飾して、例えば、抗体の抗原−依存性細胞−媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を高めるのが望ましいであろう。これは、１以上のアミノ酸置換を抗体のＦｃ領域に導入することによって達成することができる。別法として、または加えて、システイン残基をＦｃ領域に導入することができ、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能とすることができる。かく生じたホモダイマー抗体は、改良された内部化能力および／または増大した補体−媒介細胞殺傷および抗体−依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有することができる。Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）参照。また、増強された抗−腫瘍活性を持つホモダイマー抗体をＷｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されたようにヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することもできる。別法として、デュアルＦｃ領域を有し、それにより、増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有することができる抗体を作り出すことができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９−２３０ （１９８９）参照。抗体の血清半減期を増加させるためには、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されたように、サルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に、抗体断片）に一体化させることができる。本明細書中で用いるように、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」とは、ＩｇＧ分子のイン・ビボ血清半減期を増加させることを担うＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを言う。
９．免疫結合体
また、本発明は、化学治療剤、成長阻害剤、トキシン（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性なトキシン、またはその断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性結合体）のような細胞傷害性剤に結合体化した抗体を含む免疫結合体にも関する。
そのような免疫結合体の作成に有用な化学治療剤は前記した用いることができる酵素的に活性なトキシンおよびその断片はジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非−結合性活性断片、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの）エンドトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ蛋白質、ジアンチン蛋白質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを含む。種々の放射性核種が放射性結合体化された抗体の生産で利用することができる。その例は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを含む。抗体および細胞傷害性剤の結合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、（ジメチルアジピミデートＨＣＬのような）イミドエステルの二官能性誘導体、（ジスクシンイミジルスベレートのような）活性エステル、（グルタルアルデヒドのような）アルデヒド、（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）ビス−アジド化合物、（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンのような）ビス−ジアゾニウム誘導体、（トリレン２，６−ジイソシアネートのような）ジイソシアネート、および（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのような）ビス−活性フッ素化合物のような種々の二官能性蛋白質−カップリング剤を用いて作成される。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されたように調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンゾイル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。ＷＯ ９４／１１０２６参照。
抗体、およびカリケアミシン、メイタンシノイド、トリコテン、およびＣＣ１０６５のような１以上の小分子トキシン、およびトキシン活性を有するこれらのトキシンの誘導体の結合体もまたここでは考えられる。
メイタンシンおよびメイタンシノイド
１つの好ましい具体例において、本発明の抗−ＴＡＴ抗体（全長または断片）は、１以上のメイタンシノイド分子に結合体化される。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａから単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。引き続いて、ある種の微生物もまた、メイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステルのようなメイタンシノイドを生産することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成メイタンシノールおよびその誘導体およびアナログは、例えば、その開示をここに引用して明示的に援用する（米国特許第４，１３７，２３０号；第４，２４８，８７０号；第４，２５６，７４６号；第４，２６０，６０８号；第４，２６５，８１４号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３０８，２６８号；第４，３０８，２６９号；第４，３０９，４２８号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３１７，８２１号；第４，３２２，３４８号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６４，８６６号；第４，４２４，２１９号；第４，４５０，２５４号；第４，３６２，６６３号；および第４，３７１，５３３号）に開示されている。
メイタンシノイド−抗体結合体
それらの治療指標を改良する試みにおいてメイタンシンおよびメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体に結合体化されてきた。メイタンシノイドを含有する免疫結合体、およびそれらの治療的使用は、その開示をここに引用して明示的に援用する、米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号および欧州特許ＥＰ ０ ４２５ ２３５ Ｂ１に開示されている。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８−８６２３（１９９６）は、ヒト結直腸癌に対して向けられたモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結されたＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含む免疫結合体を記載した。該結合体は、培養された結腸癌細胞に対して高度に細胞傷害性であることが判明し、イン・ビボ腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。Ｃｈｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２）は、ジスルフィドリンカーを介してメイタンシノイドが、ヒト結腸癌細胞系上の抗原に結合するネズミ抗体Ａ７、あるいはＨＥＲ−２／ｎｅｕオンコジーンに結合するもう１つのネズミモノクローナル抗体ＴＡ．１に結合体化した免疫結合体を記載する。ＴＡ．１−メイタンシノイド結合体の細胞傷害性は、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞系ＳＫ−ＢＲ−３でイン・ビトロでテストした。薬物結合体は、遊離メイタンシノイド薬物と同様な程度の細胞傷害性を達成し、これは、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることによって増加させることができた。Ａ７−メイタンシノイド結合体は、マウスにおいて低い全身細胞傷害性を示した。
抗−ＴＡＴポリペプチド抗体−メイタンシノイド結合体（免疫結合体）
抗−ＴＡＴ抗体−メイタンシノイド結合体は、抗体またはメイタンシノイド分子いずれかの生物学的活性を有意に減少させることなく、抗−ＴＡＴ抗体をメイタンシノイド分子に化学的に連結することによって調製される。抗体分子当たりの結合体化された３−４メイタンシノイド分子の平均は、トキシン−抗体の１つの分子でさえ、裸の抗体の使用よりも細胞傷害性を高めると予測されるであろうが、抗体の機能または溶解性に負に影響することなく、標的細胞の細胞傷害性を高めるにおいて効果を示した。メイタンシノイドは当該分野で良く知られており、公知の技術によって合成することができるか、あるいは天然源から単離することができる。適当なメイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号において、および先に言及した他の特許および非−特許刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノールおよび種々のメイタンシノールエステルのような、芳香族環において、またはメイタンシノール分子の他の位置において修飾されたメイタンシノールアナログである。
例えば、米国特許第５，２０８，０２０号またはＥＰ特許０ ４２５ ２３５ Ｂ１、およびＣｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示されたものを含めた、抗体−メイタンシノイド結合体を作成するための当該分野で知られた多くの連結基がある。連結基は、前記した特許に開示されたようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基、またはエステラーゼ不安定性基を含み、ジスルフィドおよびチオエーテル基が好ましい。
抗体およびメイタンシノイドの結合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、（ジメチルアジピミデートＨＣＬのような）イミドエステルの二官能性誘導体、（ジスクシンイミジルスベレートのような）活性エステル、（グルタルアルデヒドのような）アルデヒド、（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）ビス−アジド化合物、（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンのような）ビス−ジアゾニウム誘導体、（トルエン２，６−ジイソシアネートのような）ジイソシアネート、（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのような）ビス−活性フッ素化合物のような種々の二官能性蛋白質カップリング剤を用いて作成することができる。特に好ましいカップリング剤は、ジスルフィド結合を提供するためのＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７［１９７８］）、およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）を含む。
リンカーは、リンクのタイプに応じて、種々の位置においてメイタンシノイド分子に結語させることができる。例えば、エステル結合は、慣用的なカップリング技術を用い、ヒドロキシル基との反応によって形成することができる。反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位置、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位置、およびヒドロキシル基を有するＣ−２０位置で起こり得る。好ましい具体例において、結合は、メイタンシノールまたはメイタンシノールアナログのＣ−３位置において形成される。
カリケアミシン
注目するもう１つの免疫結合体は、１以上のカリケアミシン分子に結合体化した抗−ＴＡＴ抗体を含む。抗体のカリケアミシンファミリーは、ピコモラー下濃度において二本鎖ＤＮＡ破壊を生じさせることができる。カリケアミシンファミリーの結合体の調製については、（全て、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙに対する）米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、第５，８７７，２９６号参照。用いることができるカリケアミシンの構造的アナログは、限定されるものではないが、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１ Ｉ、ＰＳＡＧおよびθＩ １を含む（Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：２９２５−２９２８（１９９８）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄに対する前記した米国特許）を含む。抗体が結合体化することができるもう１つの抗−腫瘍薬物は、抗−葉酸であるＱＦＡである。カリケアミシンおよびＱＦＡは共に細胞内作用部位を有し、原形質膜を容易に横切らない。従って、抗体媒介内部化を通ってのこれらの剤の細胞摂取はそれらの細胞傷害性効果を大いに増強させる。
他の細胞傷害性剤
本発明の抗−ＴＡＴ抗体に結合体化させることができる他の抗腫瘍剤はＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、第５，７７０，７１０号に記載された集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として知られた剤のファミリー、ならびにエスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号）を含む。
用いることができる酵素的に活性なトキシンおよびその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非−結合活性断片、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの）エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ蛋白質、ジアンチン蛋白質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを含む。例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ ９３／２１２３２参照。
本発明では、さらに、抗体、およびヌクレオ溶解性活性を持つ化合物（例えば、リボヌクレアーゼ、またはデオキシリボヌクレアーゼのようなＤＮＡエンドヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）との間で形成された免疫結合体が考えられる。
腫瘍の選択的破壊のためには、抗体は高度に放射性の原子を含むことができる。放射性結合体化抗−ＴＡＴ抗体の生産のためには、種々の放射性同位体が入手できる。その例はＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体を含む。結合体を診断で用いる場合、それは、シンチグラフィー実験用の放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、または再度ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、ヨウ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄のような、（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られた）核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング用のスピン標識を含むことができる。
放射性または他の標識は公知の方法で結合体に取り込むことができる。例えば、ペプチドは生合成することができるか、あるいは、例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む適当なアミノ酸前駆体を用いて化学的アミノ酸合成によって合成することができる。ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１のような標識を、ペプチド中のシステイン残基を介して結合させることができる。イッテリウム−９０はリシン残基を介して結合させることができる。ＩＯＤＯＧＥＮ方法（Ｆｒａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７８） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）を用いて、ヨウ素１２３を取り込むことができる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）は他の方法を詳細に記載する。
抗体および細胞傷害性剤の結合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、（ジメチルアジピミデートＨＣＬのような）イミドエステルの二官能性誘導体、（ジスクシンイミジルスベレートのような）活性エステル、（グルタルアルデヒドのような）アルデヒド、（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）ビス−アジド化合物、（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンのような）ビス−ジアゾニウム誘導体、（トリレン２，６−ジイソシアネートのような）ジアソシアネートおよび（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのような）ビス−活性フッ素化合物のような種々の二官能性蛋白質カップリング剤を用いて作成することができる。例えば、リシンイムノトキシンはＶｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンゾイル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーション用の例示的なキレート剤である。ＷＯ ９４／１１０２０参照。リンカーは、細胞中で細胞傷害性薬物の放出を容易とする「切断可能リンカー」であり得る。例えば、酸−不安定性リンカー、ペプチダーゼ−感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を用いることができる。
別法として、抗−ＴＡＴ抗体および細胞傷害性剤を含む融合蛋白質は、例えば、組換え技術またはペプチド合成によって作成することができる。ＤＮＡの長さは、もう１つのものに隣接するか、あるいは結合体の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離された結合体の２つの部分をコードする各領域を含むことができる。
なおもう１つの具体例において、抗体は、抗体−受容体結合体が患者に投与される腫瘍−プレ−標的化で利用される（ストレプトアビジンのような）「受容体」に結合体化させ、続いて、キレート剤を用いて未結合結合体を循環から除去し、次いで、細胞傷害性剤（例えば、放射性ヌクレオチド）に結合体化した「リガンド」（例えば、アビジン）を投与することができる。
１０．イムノリポソーム
本明細書中で開示された抗−ＴＡＴ抗体はイムノリポソームとして処方することもできる。「リポソーム」は薬物の哺乳動物への送達で有用な種々のタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成される小さな小胞である。リポソームの成分は、生物学的膜の脂質配置と同様に、二層形成において通常配置される。抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；および１９９７年１０月２３日に公開されたＷＯ ９７／３８７３１に記載されているように、当該分野で知られた方法によって調製される。増強された循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発方法によって作成することができる。リポソームは規定されたポアサイズのフィルターを通して押し出されて、所望の直径を持つリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されたようなリポソームに結合体化させることができる。化学療法剤は、所望により、リポソームに含ませる。Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１（１９）：１４８４（１９８９）参照。
Ｂ．ＴＡＴ結合オリゴペプチド
本発明のＴＡＴ結合オリゴペプチドは、本明細書中に記載したように、ＴＡＴポリペプチドに好ましくは特異的に結合するオリゴペプチドである。ＴＡＴ結合オリゴペプチドは、公知のオリゴペプチド合成方法を用いて化学的に合成することができるか、あるいは組換え技術を用いて調製し精製することができる。ＴＡＴ結合オリゴペプチドは長さが通常少なくとも約５アミノ酸、別法として、長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００アミノ酸以上であり、ここに、そのようなオリゴヌクレオチドは本明細書中に記載したようにＴＡＴポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができる。ＴＡＴ結合オリゴペプチドは、よく知られた技術を用い、過度な実験なくして同定することができる。この点に関し、ポリペプチド標的に特異的に結合することができるオリゴペプチドについてのオリゴペプチドライブラリをスクリーニングする技術は当該分野で良く知られていることを注記する（例えば、米国特許第５，５５６，７６２号、第５，７５０，３７３号、４，７０８，８７１号、第４，８３３，０９２号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５、５７１，６８９号、第５，６６３，１４３号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ８４／０３５０６およびＷＯ ８４／０３５６４；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：３９９８−４００２（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１７８−１８２（１９８５）；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，１３０−１４９（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９−２７４（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｏｆｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：６１１−６１６（１９８８），Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：６３７８；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：８３６３，およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８参照）。
この点に関して、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大きなオリゴペプチドライブラリをスクリーニングして、ポリペプチド標的に特異的に結合することができるライブラリのメンバーを同定するのを可能とする１つのよく知られた技術である。ファージディスプレイは、それにより、変種ポリペプチドが、バクテリオファージ粒子の表面の被膜蛋白質への融合蛋白質としてディスプレイされる技術である（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６）。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化された蛋白質変種（またはランダムにクローン化されたｃＤＮＡ）の大きなライブラリが、高い親和性でもって標的分子に結合する配列について迅速かつ効果的にソーティングできるという事実にある。ファージについてのペプチド（Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：６３７８）または蛋白質（Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：８３６３）ライブラリは、特異的結合特性を持つものについての数百万のポリペプチドまたはオリゴペプチドをスクリーニングするのに用いられてきた（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８）。ランダム突然変異体のソーティングファージライブラリは、非常に多数の変種を構築し、増殖させるための戦略、標的受容体を用いるアフィニティー精製のための手法および結合豊富化の結果を評価する手段を必要とする。米国特許第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５７１，６８９号および第５，６６３，１４３号。
ほとんどのファージディスプレイ方法はフィラメント状ファージを用いてきたが、ラムダ字形のファージディスプレイシステム（ＷＯ ９５／３４６８３；米国特許第５，６２７，０２４号）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（Ｒｅｎ，Ｚ−Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｇｅｎｅ ２１５：４３９；Ｚｈｕ，Ｚ．（１９９７） ＣＡＮ ３３：５３４；Ｊｉａｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９７） １２８：４４３８０；Ｒｅｎ，Ｚ−Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９７） ＣＡＮ １２７：２１５６４４；Ｒｅｎ，Ｚ−Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．５：１８３３；Ｅｆｉｍｏｖ，Ｖ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １０：１７３）およびＴ７ファージディスプレイシステム（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１７，２２８−２５７；米国特許第５，７６６，９０５号）も知られている。
基本的なファージディスプレイ概念の多くの他の改良および変形は今日開発されている。これらの改良は、選択された標的分子への結合につきペプチドライブラリをスクリーニングし、および所望の特性につきこれらの蛋白質をスクリーニングする潜在能力を持つ機能的蛋白質をディスプレイするディスプレイシステムの能力を高める。ファージライブラリ反応についてのコンビナトーリアル反応デバイスが開発されており（ＷＯ ９８／１４２７７）、ファージディスプレイライブラリを用いて対照生体分子相互作用（ＷＯ ９８／２０１６９；ＷＯ ９８／２０１５９）および拘束された螺旋ペプチドの特性（ＷＯ ９８／２００３６）を分析し、制御するのに用いられてきた。ＷＯ ９７／３５１９６は、アフィニティーリガンドを単離する方法を記載し、ここに、ファージディスプレイライブラリが、リガンドが標的分子に結合する１つの溶液およびアフィニティーリガンドが標的分子に結合しない第２の溶液と接触されて、結合リガンドを選択的に単離する。ＷＯ ９７／４６２５１は、ランダムファージディスプレイライブラリを親和性精製抗体で培養パニングし、次いで、結合ファージを単離し、続いて、マイクロプレートウェルを用いてミクロパニングプロセスを行って、高親和性結合ファージを単離する方法を記載する。Ｓｔａｐｈｌｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ蛋白質Ａのアフィニティータグとしての使用もまた報告されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９：１８７）。ＷＯ ９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリであり得るコンビナトーリアルライブラリを用いて酵素特異性を区別するための基質減算ライブラリの使用を記載する。ファージディスプレイを用いる洗剤で使用するのに適した酵素を選択する方法はＷＯ ９７／０９４４６に記載されている。特異的結合蛋白質を選択する更なる方法は米国特許第５，４９８，５３８号、第５，４３２，０１８号、およびＷＯ ９８／１５８３３に記載されている。
ペプチドライブラリを作成し、これらのライブラリをスクリーニングする方法もまた、米国特許第５，７２３，２８６号、第５，４３２，０１８号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，４９８，５３０号、第５，７７０，４３４号、第５，７３４，０１８号、第５，６９８，４２６号、第５，７６３，１９２号、および第５，７２３，３２３号に開示されている。
Ｃ．ＴＡＴ結合有機分子
ＴＡＴ結合有機分子は、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドに好ましくは特異的に結合する本明細書中で定義されたオリゴペプチドまたは抗体以外の有機分子である。ＴＡＴ結合有機分子は、公知の技術を用いて同定し、化学的に合成することができる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ００／００８２３およびＷＯ ００／３９５８５参照）。ＴＡＴ結合有機分子は長さが通常約２０００ダルトン未満、別法として、長さが約１５００、７５０、５００、２５０または２００ダルトン未満であり、ここに、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができるそのような有機分子は、よく知られた技術を用い、過度な実験なくして同定することができる。この点に関し、ポリペプチド標的に結合することができる分子についての有機分子ライブラリをスクリーニングする技術は当該分野で良く知られていることを注記する（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ００／００８２３およびＷＯ ００／３９５８５参照）。ＴＡＴ結合有機分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、第一級アミン、第２級アミン、第３級アミン、Ｎ−置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カルボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハライド、アリールスルホネート、アルキルハライド、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、アキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニルクロライド、ジアゾ化合物、酸クロライド等であり得る。
Ｄ．所望の特性を持つ抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドおよびＴＡＴ結合有機分子についてのスクリーニング
ＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチドおよび有機分子を作成するための技術は前記した。さらに、望むように、ある種の生物学的特徴を持つ抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子を選択することができる。
本発明の抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子の成長阻害効果は、例えば、内因的に、あるいはＴＡＴ遺伝子でのトランスフェクションに続いてＴＡＴポリペプチドを発現する細胞を用いて当該分野で公知の方法によって評価することができる。例えば、適当な腫瘍細胞系およびＴＡＴ−トランスフェクト細胞を、種々の濃度にて、本発明の抗−ＴＡＴモノクローナル抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子で数日間（例えば、２ないし７日間）処理し、クリスタルバイオレットまたはＭＴＴで染色し、あるいはいくつかの他の非色アッセイによって分析することができる。増殖を測定するもう１つの方法は、本発明の抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子の存在下または不存在下で処理された細胞による３Ｈ−チミジン摂取を比較することによるであろう。処理の後、細胞を収穫し、ＤＮＡに取り込まれた放射能の量をシンチレーションカウンターで定量する。適当な陽性対照は、その細胞系の増殖を阻害することが知られている成長阻害抗体での選択された細胞系の処理を含む。イン・ビボでの腫瘍細胞の増殖阻害は、当該分野で知られた種々の方法で測定することができる。好ましくは、腫瘍細胞はＴＡＴポリペプチドを過剰発現するものである。好ましくは、抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子は、１つの具体例において、約０．５ないし３０μｇ／ｍｌの抗体濃度において、未処理腫瘍細胞と比較して、約２５ないし１００％だけ、より好ましくは、約３０ないし１００％だけ、なおより好ましくは、５０ないし１００％、または７０ないし１００％だけ、イン・ビトロまたはイン・ビボにてＴＡＴ−発現腫瘍細胞の細胞増殖を阻害するであろう。増殖阻害は、細胞培養中の約０．５ないし３０μｇ／ｍｌ、または約０．５ｎＭないし２００ｎＭの抗体濃度で測定することができ、ここに、増殖阻害は腫瘍細胞の抗体への暴露から１ないし１０日後に測定される。抗体は、もし約１μｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与の結果、腫瘍サイズの低下、または腫瘍細胞増殖の低下が、抗体の最初の投与から約５日ないし３ヶ月以内、好ましくは約５ないし３０日以内にもたらせられれば、イン・ビボにて増殖阻害性である。
細胞死滅を誘導する抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子を選択するためには、例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルーまたは７ＡＡＤ摂取によって示される膜一体性の喪失を対照に対して評価することができる。ＰＩ摂取アッセイは、補体および免疫エフェクター細胞の不存在下で行うことができる。ＴＡＴポリペプチド−発現腫瘍細胞は、培地単独、あるいは（例えば、約１０μｇ／ｍｌの）適当な抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子を含有する培地と共にインキュベートする。細胞を３日間インキュベートする。各処理の後に、細胞を洗浄し、細胞クランプの除去のために、３５ｍｍストレーナー−キャップド１２×７５チューブ（チューブ当たり１ｍｌ、処理群あたり３チューブ）にアリコットする。次いで、チューブにＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を与える。ＦＡＣＳＣＡＮ（登録商標）フローサイトメーターおよびＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（登録商標）ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用い、試料を分析することができる。ＰＩ摂取によって測定して統計学的に有意なレベルの細胞死滅を誘導する抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子は、細胞死滅−誘導抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子として選択することができる。
注目する抗体によって結合されたＴＡＴポリペプチド上のエピトープに結合する抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子についてスクリーニングするためには、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されたもののようなルーチン的交差−ブロッキングアッセイを行うことができる。このアッセイを用いて、テスト抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子が公知の抗−ＴＡＴ抗体と同一の部位またはエピトープに結合するかを判断することができる。別法として、あるいは加えて、エピトープマッピングは、当該分野で知られた方法によって行うことができる。例えば、抗体配列をアラニンスキャニングによるなどして突然変異誘発させて、接触残基を同定することができる。突然変異体抗体は、まず、ポリクローナル抗体との結合についてテストして、適切な折畳みを確実とする。異なる方法において、ＴＡＴポリペプチドの異なる領域に対応するペプチドを、テスト抗体で、またはテスト抗体および特徴付けられたまたは公知のエピトープを持つ抗体での競合アッセイで用いることができる。
Ｅ．抗体依存性酵素媒介プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）
また、本発明の抗体を、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ ８１／０１１４５参照）を活性な抗癌薬物に変換するプロドラッグ−活性化酵素へ抗体を結合体化することによって、ＡＤＥＰＴで用いることもできる。例えば、ＷＯ ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号参照。
ＡＤＥＰＴで有用な免疫結合体の酵素成分は、それをそのより活性な細胞傷害性形態に変換するようにプロドラッグに作用することができるいずれの酵素も含む。
本発明の方法で有用な酵素は、限定されるものではないが、ホスフェート−含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルフェート−含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアビールスルファターゼ；非−毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬物である５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンでアミナーゼ；ペプチド−含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用な、セラチアプロテアーゼ、テルモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよび（カテプシンＢおよびＬのような）カテプシンのようなプロテアーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なβ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼのような炭水化物−切断酵素；β−ラクタムで誘導体化した薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ−ラクタマーゼ；および各々、フェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基でそれらのアミン窒素において誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼのようなペニシリンアミダーゼを含む。別法として、「アブザイム」として当該分野においてやはり知られている酵素活性を持つ抗体を用いて、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換することができる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ ３２８：４５７−４５８（１９８７）参照）。抗体アブザイム結合体は、アブザイムの腫瘍細胞集団への送達のために本明細書中で記載されるように調製することができる。
本発明の酵素は、前記したヘテロ二官能的架橋剤の使用のような当該分野で良く知られた技術によって、抗−ＴＡＴ抗体に共有結合させることができる。別法として、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結された本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合蛋白質は、当該分野で良く知られた組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）参照）。
Ｆ．全長ＴＡＴポリペプチド
本発明は、ＴＡＴポリペプチドとして本出願において言及されたポリペプチドをコードする新しく同定され、かつ単離されたヌクレオチド配列も提供する。特に、種々のＴＡＴポリペプチドをコードするｃＤＮＡ（部分および全長）は、後の実施例にさらに詳細に開示するように同定され単離されている。
後の実施例に開示されているように種々のｃＤＮＡクローンはＡＴＣＣに寄託されている。それらのクローンの現実のヌクレオチド配列は、当該分野におけるルーチン的方法を用いて寄託されたクローンの配列決定によって、当業者によって容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列はルーチン的技量を用いてヌクレオチド配列から決定することができる。本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドおよびコーディング核酸ではいくつかの場合においては、出願人らはその時に入手可能な情報でもって最良に同定可能なリーディングフレームは何であるかと考えられるかを同定した。
Ｇ．抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド変種
本明細書中で記載した抗−ＴＡＴ抗体および全長天然配列ＴＡＴポリペプチドに加えて、抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド変種を調製することができると考えられる。抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド変種は、適当なヌクレオチド変化をコーディングＤＮＡに導入し、および／または所望の抗体またはポリペプチドを合成することによって調製することができる。当業者であれば、アミノ酸の変化は、グリコシル化部位の数または位置を変化させる、または膜係留特徴を改変するような、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの翻訳後プロセスを改変することができることを認識するであろう。
本明細書中に記載された抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドにおける変異は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載された保存的および非−保存的突然変異についての技術およびガイドラインのいずれかを用いてなすことができる。変異は、天然配列の抗体またはポリペプチドと比較して、アミノ酸配列において変化をもたらす抗体またはポリペプチドをコードする１以上のコドンの置換、欠失または挿入であり得る。所望により、変異は、少なくとも１つのアミノ酸の、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドのドメインの１以上におけるいずれかの他のアミノ酸での置換による。いずれのアミノ酸残基が、所望の活性に悪影響することなく挿入、置換または欠失できるかを決定するガイドラインは、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの配列を、相同な公知の蛋白質分子のそれと比較し、高相同性の領域においてなされたアミノ酸配列変化の数を最小とすることができることによって見出すことができる。アミノ酸の置換は、ロイシンのセリンでの置換、すなわち、保存的アミノ酸置換のような、同様な構造的および／または化学的特性を有するもう１つのアミノ酸で１つのアミノ酸を置き換える結果であり得る。挿入または欠失は、所望により、約１ないし５のアミノ酸の範囲にあり得る。許された該変異は、配列中のアミノ酸の挿入、欠失または置換を系統的になし、全長または成熟天然配列によって呈される活性につき得られた変種をテストすることによって決定することができる。
抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド断片がここに提供される。そのような断片はＮ−末端またはＣ−末端において切形することができるか、あるいは、例えば、全長天然抗体または蛋白質と比較した場合に内部残基を欠いてもよい。ある種の断片は、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの所望の生物学的活性に対して必須でないアミノ酸残基を欠く。
抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド断片は、多数の慣用的な技術のいずれかによって調製することができる。所望のペプチド断片は化学的に合成することができる。代替アプローチは、酵素消化によって、例えば、特定のアミノ酸残基によって規定される部位にて蛋白質を切断することが知られている酵素で蛋白質を処理することによって、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化し、所望の断片を単離することができることによって抗体またはポリペプチド断片を生じさせることを含む。なおもう１つの適当な技術は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって所望の抗体またはポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し、増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲにおいて５’および３’プライマーにおいて使用する。好ましくは、抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド断片は、本明細書中に開示された天然抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドと少なくとも１つの生物学的および／または免疫学的活性を共有する。
特別な具体例において、注目する保存的置換は、好ましい置換の見出しの下で表６に示す。もしそのような置換の結果生物学的活性が変化すれば、表６における、またはアミノ酸クラスを参照してさらに以下に記載するような、より多い実質的変化、支配的な例示的置換が導入され、生成物をスクリーニングする。
Figure 2008512121
 抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの機能または免疫学的同一性における実質的修飾は、（ａ）例えば、シートまたはラセン立体配座としての、置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩を維持するに対するそれらの効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に生じる残基は、通常の側鎖の特性：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の向きに影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
に基づいて群に分けられる。
非−保存的置換は、もう１つのクラスに代えてこれらのクラスの１つのメンバーで交換することを含むであろう。そのような置換された残基は保存的置換部位へ、より好ましくは残りの（非−）保存的部位へ導入することもできる。
変異は、オリゴヌクレオチド−媒介（部位−特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、およびＰＣＲ突然変異誘発のような当該分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位−特異的突然変異誘発［Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）］、カセット突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３４：３１５（１９８５）］、制限選択突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｉｌｏｓ，Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６）］または他の公知の技術をクローン化されたＤＮＡに対して行って、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチド変種ＤＮＡを得ることができる。
スキャンニングアミノ酸分析を使用して、連続配列に沿って１以上のアミノ酸を同定することもできる。好ましいスキャンニングアミノ酸の中には比較的小さな中性のアミノ酸がある。そのようなアミノ酸はアラニン、グリシン、セリンおよびシステインを含む。アラニンはこの群の中で好ましいスキャンニングアミノ酸である。なぜならば、それはベータ−炭素を超える側鎖を排除し、変種の主鎖立体配座を余り改変しないようだからである［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）］。アラニンもまた典型的には好ましい。なぜならば、それは最も普通のアミノ酸だからである。さらに、それは頻繁に埋もれたおよび露出した位置双方で見出される［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９７６）］。もしアラニン置換が適当な量の変種を生じないならば、等電子アミノ酸を用いることができる。
抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの適切な立体配座を維持するに関与しないいずれのシステイン残基もまた、一般には、セリンで置換して、当該分子の酸化的安定性を改良し、異常な架橋を妨げることもできる。逆に、システイン結合を抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドに加えて、（特に、抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合に）その安定性を改良することができる。
置換的変種の特に好ましいタイプは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１以上超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる開発のために選択される得られた変種は、それからそれが作られた親抗体に対して改良された生物学的特性を有するであろう。そのような置換的変種を作り出すための便宜ナ方法は、ファージディスプレイを用いるアフィニティー成熟を含む。簡単に述べれば、いくつかの超可変領域部位（例えば、６ないし７部位）を突然変異させて、各部位において全ての可能なアミノ酸置換を生じさせる。かく生じた抗体変種は、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合としてフィラメント状ファージ粒子から一価的にディスプレイされる。次いで、本明細書中に開示されたように、ファージ−ディスプレイされた変種をそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を行って、有意に抗原結合に寄与する超可変領域残基を同定することができる。別法として、あるいは加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体およびヒトＴＡＴポリペプチドの間の接触点を同定するのが便宜であろう。そのような接触残基および隣接する残基は、本明細書中における精巧な技術に従う置換のための候補である。一旦そのような変種が生じたならば、変種のパネルを本明細書中に記載されたスクリーニングに付し、１以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を持つ抗体をさらなる開発のために選択することができる。
抗−ＴＡＴ抗体のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、当該分野で耕地の種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定されるものではないが、天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列変種の場合）、またはオリゴヌクレオチド−媒介または部位−特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および抗−ＴＡＴ抗体のより早く調製された変種または非−変種バージョンのカセット突然変異誘発による調製を含む。
Ｈ．抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの修飾
抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合修飾の１つのタイプは、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの標的化アミノ酸残基を、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの選択された側鎖、またはＮ−またはＣ−末端残基に反応することができる。有機誘導体化剤と反応させることを含む。二官能性基での誘導体化は、例えば、抗−ＴＡＴ抗体を精製するための方法で用いられる水溶性支持体マトリックスまたは表面へ抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドを架橋するのに有用であり、その逆も成立する。通常使用される架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタロアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のようなジスクシンイミジルエステルを含めたホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミド、およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような剤を含む。
他の修飾は、各々、対応するグルタミルおよびアスパルチルへのグルタミルおよびアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ酸のメチル化［Ｔ．Ｅ．Ｃｅｒｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３）］、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびいずれかのＣ−末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲内に含まれる抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの共有結合修飾のもう１つのタイプは、抗体またはポリペプチドの天然グリコシル化パターンを改変することである。「天然グリコシル化パターンを改変」は、本明細書中においては、（基礎となるグリコシル化部位を除去することによって、あるいは化学的および／または酵素的手段によりグリコシル化を欠失することによって）天然配列抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドで見出される１以上の炭水化物部位を欠失すること、および／または天然配列抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドに存在しない１以上のグリコシル化部位を加えることを意味する目的を意図する。加えて、該フレーズは、存在する種々の炭水化物部位の性質および割合の変化に関連する、天然蛋白質のグリコシル化における定性的な変化を含む。
抗体および他のポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ−結合またはＯ−結合いずれかである。Ｎ−結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部位の付着をいう。Ｘがプロリンを除くいずれかのアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、炭水化物部位のアスパラギン側鎖への酵素的付着のための認識配列である。かくして、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。Ｏ−結合グリコシル化とは、糖のＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も普通にはセリンまたはスレオニンへの付着をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを用いることもできる。
抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、それが（Ｎ−結合グリコシル化部位のために）前記したトリペプチド配列の１以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって便宜には達成される。該改変は、１以上のセリンまたはスレオニン残基の、（Ｏ−結合グリコシル化部位のための）元来の抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの配列への付加、あるいはそれによる置換をなすこともできる。抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドのアミノ酸配列は、所望により、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生じるように、予め選択された塩基において抗−ＴＡＴまたはＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることによって、ＤＮＡレベルでの変化を通じて改変することもできる。
抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチド上の炭水化物部位の数を増加させるもう１つの手段が、ポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。そのような方法は、例えば、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ ８７／０５３３０、およびＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）において当該分野で記載されている。
抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドに存在する炭水化物部位の除去は、化学的にまたは酵素的に、あるいはグリコシル化のための標的として働くアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異的置換によって達成することができる。化学的脱グリコシル化技術は当該分野で知られており、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）によって、およびＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部位の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０（１９８７）によって記載されているように、種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用によって達成することができる。
抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの共有結合修飾のもう１つのタイプは、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号または第４，１７９，３３７号に記載されているような方法で、抗体またはポリペプチドを、種々の非蛋白質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンの１つに連結させることを含む。抗体またはポリペプチドは、例えば、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ−粒子およびナノカプセル）において、またはマイクロエマルジョンにおいて、コアセルベーション技術によって、または界面重合（例えば、各々、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロスフィア）によって調製されたマイクロカプセル中に捕獲することもできる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０）に開示されている。
本発明の抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドは、もう１つの異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合した抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾することもできる。
１つの具体例において、そのようなキメラ分子は、抗−タグ抗体が選択的に結合することができるエピトープを供するタグポリペプチドと、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的に抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に置かれている。抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドのそのようなエピトープ−タグド形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドが、エピトープタグに結合する抗−タグ抗体またはもう１つのタイプのアフィニティーマトリックスを用いるアフィニティー精製によって容易に精製されるのを可能とする。種々のタグポリペプチドおよびそれらの各抗体は当該分野で良く知られている。その例はポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０−３６１６（１９８５）］；および単純疱疹ウイルス糖蛋白質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｅｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３（１９９０）］を含む。他のタグポリペプチドはＦｌａｇ−ペプチド［Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｇｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４（１９９２）］；α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５２６３−１５１６６（１９９１）］；およびＴ７遺伝子１０蛋白質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７（１９９０）］を含む。
別の具体例において、キメラ分子は、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドと、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合を含むことができる。（「免疫接着」とも言われる）キメラ分子の二価形態では、そのような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであろう。Ｉｇ融合は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりの抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの可溶性（膜貫通ドメイン欠失または不活化）形態の置換を含む。特に好ましい具体例において、免疫グロブリン融合はＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３、またはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合の生成については、１９９５年６月２７日に発行された米国特許第５，４２８，１３０号も参照。
Ｉ．抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの調製
以下の記載は、主として、抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドをコードする核酸を含有するベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を培養することによる、抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの生産に関する。もちろん、当該分野で良く知られた別の方法を使用して、抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドを調製することができるのが考えられる。例えば、適当なアミノ酸配列またはその部分は、固相技術を用いる直接的ペプチド合成によって生産することができる［例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）参照］。イン・ビトロ蛋白質合成は、手動技術を用い、または自動化によって行うことができる。自動合成は、例えば、製造業者の指示を用いるＡｐｐｌｅｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて達成することができる。抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの種々の部分は別々に化学的に合成し、化学的または酵素的方法を用いて組み合わせて、所望の抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドを生産することができる。
１．抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡは、該−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドのｍＲＮＡを保有し、それを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒト−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドＤＮＡは、便宜には、ヒト組織から調製されたＤＮＡライブラリから得ることができる。該−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードする遺伝子は、ゲノムライブラリから、あるいは公知の合成手法（例えば、自動核酸合成）によって得ることもできる。
ライブラリは、注目する遺伝子、またはそれによってコードされる蛋白質を同定するために形成された（少なくとも約２０ないし８０塩基のオリゴヌクレオチドのような）プローブでスクリーニングすることができる。選択されたプローブでのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリのスクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されているような標準的な手法を用いて行うことができる。抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードする遺伝子を単離するための別の手段は、ＰＣＲ方法を用いることである［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）］
ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするための技術は当該分野で良く知られている。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、擬陽性を最小とするのに十分な長さおよび十分な非不明瞭性とすべきである。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、スクリーニングされるライブラリにおけるＤＮＡへのハイブリダイゼーションに際してそれを検出することができるように標識される。標識する方法は当該分野で良く知られており、３２Ｐ−標識ＡＴＰのような放射性標識、ビオチニル化または酵素標識の使用を含む。中程度のストリンジェンシーおよび高いストリンジェンシーを含めたハイブリダイゼーション条件はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａに供される。
そのようなライブラリスクリーニング方法で同定された配列を比較し、ＧｅｎＢａｎｋのような公のデータベースまたは他の個人的な配列データベースに寄託され、そこで入手可能な他の公知の配列に対して整列させることができる。分子の規定された領域内の、または全長配列を横切っての（アミノ酸またはヌクレオチドレベルいずれかの）配列同一性は、当該分野で知られ、かつ本明細書中に記載された方法を用いて決定することができる。
蛋白質コーディング配列を有する核酸は、最初に本明細書中で開示された推定アミノ酸配列を用い、もし必要であれば、ｃＤＮＡへ逆転写することができないｍＲＮＡの前駆体およびプロセッシング中間体を検出するためのＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａのような慣用的なプライマー延長手法を用い、選択されたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリによって得ることができる。
２．宿主細胞の選択および形質転換
宿主細胞は、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチド生産のための本明細書中に記載された発現またはクローニングベクターでトランスフェクトまたは形質転換し、プロモータを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適した修飾された慣用的な栄養培地中で培養する。培地、温度、ｐＨなどのような培養条件は、過度な実験なくして当業者によって選択され得る。一般に、細胞培養の生産性を最大とするための原理、プロトコルおよび実際的な技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ；ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ，ｅｄ．（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９１）およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａに見出すことができる。
真核生物細胞トランスフェクションおよび原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム−媒介およびエレクトポレーションは当業者に知られている。用いる宿主細胞に依存し、形質転換はそのような細胞に対して適当な標準的な技術を用いて行う。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａに記載された塩化カルシウムを使用するカルシウム処理、またはエレクトロポレーションは一般には原核生物で用いられる。Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２３：３１５（１９８３）および１９８９年６月２９日に公開されたＷＯ ８０／０５８５９によって記載されているように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓでの感染はある種の植物細胞の形質転換で用いられる。そのような細胞壁が無い哺乳動物細胞では、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈殿を使用することができる。哺乳動物細胞宿主系トランスフェクションの一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６に記載されている。酵母への形質転換は、典型的には、Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１３０：９４６（１９７７）およびＨｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７６：３８２９（１９７９）の方法に従って行われる。しかしながら、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷細胞との細菌プロトプラスト融合、またはポリカチオン、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンによるような、ＤＮＡを細胞に導入する他の方法を用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７−５３７（１９９０）およびＭａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２（１９８８）参照。
ここに、ベクター中のＤＮＡをクローン化する、または発現するのに適した宿主細胞は原核生物、酵母、高等真核生物細胞を含む。適当な原核生物は、限定されるものではないが、グラム−陰性またはグラム−陽性生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのようなＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅのようなユーバクテリアを含む。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）；Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）およびＫ５ ７７２（ＡＴＣＣ ５３，６３５）のような種々のＥ．ｃｏｌｉ株が公に入手可能である。他の適当な原核生物宿主細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのようなＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのようなＢａｃｉｌｌｉ（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ ２６６，７１０に開示されたＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ４１Ｐ）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのようなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを含む。これらの例は限定的というよりはむしろ説明的である。株Ｗ３１１０は１つの特に好ましい宿主または親宿主である。なぜならばそれは、組換えＤＮＡ産物醗酵のための普通の宿主株だからである。好ましくは、宿主細胞は最小量の蛋白質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を修飾して、宿主に対して内因性の蛋白質をコードする遺伝子において遺伝的突然変異を行うことができ、そのような宿主の例は、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有するＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｋａｎｒを有するＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ （ａｒｇＦ−ｌａｃ（１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ ｉｌｖＧ ｋａｎｒを有するＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非−カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失突然変異を持つ株３７Ｄ６であるＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株４０Ｂ４；および１９９０年８月７日に発行された米国特許第４，９４６，７８３号に開示された突然変異体ペリプラズムプロテアーゼを有するＥ．ｃｏｌｉ株を含む。別法として、クローニングのイン・ビトロ方法、例えば、ＰＣＲまたは他の核酸ポリメラーゼ反応が適している。
全長抗体、抗体断片、および抗体融合蛋白質は、特に、治療抗体が細胞傷害性剤（例えば、トキシン）に結合体化された場合のような、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要でない場合に、細菌で生産することができ、免疫結合体はそれ自体が腫瘍細胞破壊において効果を示す。全長抗体は、循環においてより大きな半減期を有する。Ｅ．ｃｏｌｉにおける生産はより速く、かつよりコストが効果的である。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、発現および分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）およびシグナル配列を記載する米国特許第５，６４８，２３７号（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，，７８９，１９９号（Ｊｏｌｙ ｅｔ ａｌ．）、および米国特許第５，８４０，５２３号（Ｓｉｍｍｎｌｓ ｅｔ ａｌ．）参照（これらの特許はここに引用して援用する）。発現の後、抗体は可溶性画分中のＥ．ｃｏｌｉ細胞ペーストから単離され、イソタイプに応じて、例えば、プロテインＡまたはＧカラムを通して精製することができる。最終的な精製は、例えば、ＣＨＯ細胞において発現された抗体を精製するためのプロセスと同様に行うことができる。
原核生物に加えて、フィラメント状真菌または酵母のような真核生物微生物は、抗−ＴＡＴ抗体−またはＴＡＴポリペプチドをコードするベクターのための適当なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは通常に用いられる下等真核生物宿主微生物である。他の例はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ （Ｂｅａｃｈ ａｎｄ Ｎｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：１４０［１９８１］；１９８５年５月２日に公開されたＥＰ １３９，３８３）；例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ （ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４（２）：７３７−７４２［１９８３］）、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ （ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ （ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ （ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ （ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ （ＡＴＣＣ ３６，９０６；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０））、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓのようなＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１））；ｙａｒｒｏｗｉａ （ＥＰ ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ （ＥＰ １８３，０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，；２８：２６５−２７８［１９８８］）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ （Ｃａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５２５９−５２６３［１９７９］）；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓのようなＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ （１９９０年１０月３１日に公開されたＥＰ ３９４，５３８）；および例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ （１９９１年１月１０日公開されたＷＯ ９１／００３５７）、およびＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓのようなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２：２８４−２８９［１９８３］；Ｔｉｌｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２６：２０５−２２１［１９８３］；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１４７０−１４７４［１９８４］）およびＡ．ｎｉｇｅｒ（Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｈｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．，４：４７５−４７９［１９８５］）のようなフィラメント状真菌を含む。メチロ向性酵母がここでは適当であり、限定されるものではないが、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、およびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａよりなる属から選択されるメチロールでの増殖が可能な酵母を含む。このクラスの酵母の例である具体的な種のリストは、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｙｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，２６９（１９８２）に見出すことができる。
グリコシル化抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９のような昆虫細胞、ならびに綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマトおよびタバコの細胞培養のような植物細胞を含む。多数のバキュロウイルス株および変種、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （青虫）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｔｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉのような宿主からの対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１変種、およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株が公に入手可能であり、そのようなウイルスは、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、本発明に従って、ここではウイルスとして用いることができる。
しかしながら、脊椎動物細胞において興味は最大であり、培養（組織培養）での脊椎動物細胞での増殖はルーチン的な手法となった。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓系（懸濁培養での増殖のためにサブクローンされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベイビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスｓｅｒｔｏｌｉ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頚癌腫細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳頭腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝臓腫系（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
宿主細胞は、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチド生産のための前記した発現またはクローニングベクターで形質転換し、プロモータを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修飾された慣用的な栄養培地中で培養する。
３．複製可能なベクターの選択および使用
抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を、クローニング（ＤＮＡの増幅）のための、または発現のための複製可能なベクターに挿入することができる。種々のベクターは公に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子またはファージの形態とすることができる。適当な核酸配列は、種々の手法によってベクターに挿入することができる。一般に、ＤＮＡは、当該分野で公知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクターの成分は、一般には、限定されるものではないが、シグナル配列、複製起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモータ、および転写終止配列のうちの１以上を含む。これらの成分の１以上を含有する適当なベクターの構築は、当業者に知られた標準的な連結技術を使用する。
ＴＡＴは、直接的のみならず、成熟蛋白質またはポリペプチドのＮ−末端に特異的な切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドであり得る、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生産することができる。一般に、シグナル配列はベクターの成分であってよく、あるいはそれは、ベクターに挿入される抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡの一部であり得る。シグナル配列は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母分泌では、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ α−因子リーダーを含めた；後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）アルファ因子リーダー、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日に公開されたＥＰ ３６２，１７９）、または１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ ９０／１３６４６に記載されたシグナルでありえる。哺乳動物細胞発現では、同一または関連種の分泌されたポリペプチドからのシグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダーのような、哺乳動物シグナル配列を用いて、蛋白質の分泌を指令することができる。
発現およびクローニングベクターは、該ベクターが１以上の選択された宿主細胞において複製できるようにする核酸配列を含む。そのような配列は種々の細菌、酵母およびウイルスでよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点はほとんどのグラム−陰性菌で適当であり２μプラスミド起点は酵母で適当であり、および種々のウイルスの起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターで有用である。
発現およびクローニングベクターは、典型的には、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有するであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与し、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、または（ｃ）複合培地から利用できない臨界的な栄養素を供給する蛋白質をコードする。例えば、ＢａｃｉｌｌｉについてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子。
哺乳動物細胞のための適当な選択マーカーの例は、ＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼのような、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードする核酸を取る能力がある細胞の同定を可能とするものである。野生型ＤＨＦＲを使用する場合、適当な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０）によって記載されているように調製し、増殖させた、ＤＨＦＲ活性が欠乏したＣＨＯ細胞系である。酵母で用いられる適当な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するＴＲＰ遺伝子である［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９ （１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０）］。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異体株のための選択マーカーを提供する。例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１［Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）］。
発現およびクローニングベクターは、通常、ｍＲＮＡ合成を指令するための、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードする核酸配列に操作可能に連結されたプロモータを含有する。種々の潜在的宿主細胞によって認識されるプロモータはよく知られている。原核生物宿主で用いるのに適したプロモータは、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモータ系［Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９）］、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系［Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）；ＥＰ ３６，７７６］、ｔａｃプロモータのようなハイブリッドプロモータ［ｄｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５（１９８３）］を含む。細菌系で用いられるプロモータは、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡに操作可能に連結されたシャイン−ダルガルノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有するであろう。
酵母宿主で用いられる適当な促進配列の例は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ［Ｈｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３（１９８０）］、あるいはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような他の解糖系［Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．，７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：４９００（１９７８）］についてのプロモータを含む。
増殖条件によって制御される転写の更なる利点を有する誘導性プロモータである他の酵母プロモータは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタルチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース資化を担う酵素についてのプロモータ領域である。酵母発現で用いる適当なベクターおよびプロモータは、さらに、ＥＰ ７３，６５７に記載されている。
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開されたＵＫ ２，２１１，５０４）、（アデノウイルス２のような）アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモータ、例えば、アクチンプロモータまたは免疫グロブリンプロモータから、および熱ショックから得られたプロモータによって制御され、但し、そのようなプロモータは宿主細胞系に適合するものとする。
高等真核生物による抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加させることができる。エンハンサーは、プロモータに作用してその転写を増大させる、通常は約１０ないし３００ｐｐのＤＮＡのシス−作用性エレメントである。多くのエンハンサー配列が、今日、哺乳動物遺伝子から知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）。しかしながら、典型的には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを用いるであろう。その例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ １００ないし２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモータ、エンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。エンハンサーは抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドコーディング配列に対して５’または３’側の位置においてベクターにスプライスできるが、好ましくは、プロモータから５’側の部位に位置する。
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核細胞）で用いられる発現ベクターもまた、転写の終止に、およびｍＲＮＡを安定化するのに必要な配列を含有するであろう。そのような配列は、通常、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および、場合によっては、３’非翻訳領域から入手できる。これらの領域は、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。
組換え脊椎動物細胞培養において抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの合成に対する適合に適したなお他の方法、ベクターおよび宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０−４６（１９７９）；ＥＰ １１７，０６０；およびＥＰ １１７，０５８に記載されている。
４．宿主細胞の培養
本発明の抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドを生産するのに用いる宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。ハムのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ））、およびダルベッコの修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）のような商業的に入手可能な培地は、宿主細胞を培養するのに適している。加えて、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；または第５，１２２，４６９号；ＷＯ ９０／０３４３０；ＷＯ ８７／００１９５；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載された培地のいずれも、宿主細胞のための培養基として用いることができる。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／または（インスリン、トランスフェリン、または表皮成長因子のような）他の成長因子、（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびホスフェートのような）塩、（ＨＥＰＥＳのような）緩衝液、（アデノシンおよびチミジンのような）ヌクレオチド、（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ薬物のような）抗生物質、（マイクロモラー範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物と定義される）微量元素、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補強することができる。いずれの他の必要な補充物も、当業者によく知られた適当な濃度で含めることもできる。温度、ｐＨ等のような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で従前用いられたものであり、当業者に明らかであろう。
５．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅および／または発現は、例えば、慣用的な本明細書中に供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用いる、慣用的なサザンブロッティングｍＲＮＡの転写を低了するためのノーザンブロッティング［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５（１９８０）］、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはイン・サイチュハイブリダイゼーションによって直接的に試料中で測定することができる。別法として、ＤＮＡデュプレックス、ＲＮＡデュプレックス、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドデュプレックス、またはＤＮＡ−蛋白質デュプレックスを含めた、特異的デュプレックスを認識することができる抗体を使用することができる。該抗体は、今度は、標識することができ、アッセイを行うことができ、そこでは、表面でのデュプレックスの形成に際して、デュプレックスに結合した抗体の存在を検出することができるように、デュプレックスを表面に結合させる。
別法として、遺伝子発現は、細胞または組織セクションの免疫組織化学的染色、および細胞培養または体液のアッセイのような免疫学的方法によって測定して、遺伝子産物の発現を直接的に定量することができる。試料流体の免疫組織化学的染色および／またはアッセイで有用な抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであってよく、いずれかの哺乳動物で調製することができる。便宜には、抗体は、天然配列ＴＡＴポリペプチドに対して、あるいは本明細書中で提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、あるいはＴＡＴ ＤＮＡに融合し、かつ特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製することができる。
６．抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの精製
抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの形態は、培養基から、または宿主細胞溶解物から回収することができる。もし膜に結合すれば、それは、適当な洗剤溶液（例えば、トリトン−Ｘ１００）を用い、あるいは酵素切断によって膜から放出させることができる。抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの発現で使用される細胞は、凍結−解凍サイクリング、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤のような種々の物理的または化学的手段によって破壊することができる。
組換え細胞蛋白質またはポリペプチドから抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドを精製するのが望ましいであろう。以下の手法は適当な精製手法の例である：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ、またはＤＥＡＥのようなカチオン−交換樹脂でのクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除去するためのプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム；および抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドのエピトープ−タグド形態に結合するための金属キレート化カラム。蛋白質精製の種々の方法を使用することができ、そのような方法は当該分野で知られており、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）に記載されている。選択された精製工程は、例えば、用いる生産プロセスの性質および生産される特定の抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドに依存するであろう。
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内に、ペリプラズム空間へ生産することができるか、あるいは直接的に培地に分泌させることができる。もし抗体が細胞内で生産されれば、最初の工程として、宿主細胞または溶解された断片いずれかの粒状デブリスは、例えば、遠心または限外濾過によって除去されるＣａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手法を記載する。簡単に述べれば、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）ＥＤＴＡ、およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で細胞ペーストを３０分間にわたって解凍する。細胞デブリスは遠心によって除去することができる。抗体を培地に分泌させる場合、そのような発現系からの上清は、一般には、まず、商業的に入手可能な蛋白質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて濃縮させる。ＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害剤をこれまでの工程のいずれかに含ませて、蛋白質分解を阻害することができ、抗体を含ませて、不慮の汚染物の成長を妨げることができる。
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーは好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適当性は、抗体に存在するいずれかの免疫グロブリンＦｃドメインの種およびイソタイプに依存する。プロテインＡを用いて、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスのイソタイプについておよびヒトγ３について推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７−１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドが付着されるマトリックスは最もしばしばはアガロースであるが、他のマトリックスは利用可能である。制御されたポアのガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成することができるよりも速い流速および短い処理時間を可能とする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂｅｒｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）は精製で有用である。イオン交換カラム、エタノールでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、（ポリアスパラギン酸カラムのような）アニオンまたはカチオン交換樹脂でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿のような蛋白質精製のための他の技術も回収すべき抗体に応じて利用できる。
いずれかの予備的な精製工程に続いて、注目する抗体および汚染物を含むマトリックスを、低塩濃度（例えば、約０ないし０．２５Ｍ塩）で好ましくは行われる、約２．５ないし４．５の間のｐＨで溶出緩衝液を用いる低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに付すことができる。
Ｊ．医薬処方
本発明に従って用いられる抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ ｓｉＲＮＡ、ＴＡＴ結合有機分子および／またはＴＡＴポリペプチドの治療処方は、凍結乾燥処方または水溶液の形態にて、所望の程度の純度を有する抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を任意の薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって貯蔵用に調製される。受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は使用する用量および濃度において受容者に対して非毒性であり、酢酸塩、トリス、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンのようなアラキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールのような）保存剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのような蛋白質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含めた単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；トレハロースおよび塩化ナトリウムのような等張剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖；ポリソルベートのような界面活性剤；ナトリウムのような塩−形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−蛋白質錯体）および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非−イオン性界面活性剤を含む。該抗体は、好ましくは、５ないし２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０ないし１００ｍｇ／ｍｌの間の濃度の抗体を含む。
ここに、処方は、必要に応じて、治療すべき特定の症状のための１を超える活性化合物、好ましくは、相互に悪影響しない補充的活性を持つものを含有することもできる。例えば、抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ ｓｉＲＮＡまたはＴＡＴ結合有機分子に加えて、１つの処方に、さらなる抗体、例えば、ＴＡＴ抗体上の異なるエピトープに結合する第二の抗−ＴＡＴ抗体、または特定の癌の成長に影響する成長因子のようなある他の標的に対する抗体を含むのが望ましいであろう。別法として、あるいは加えて、組成物は、さらに、化学療法剤、細胞傷害性剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗−ホルモン剤、および／または心臓保護剤を含めることができる。そのような分子は、適切には、意図する目的で有効な量で組み合わせて存在させる。
有効成分は、例えば、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマイクロエマルジョンにおいて、各々、コアセルベーション技術によって、または界面重合、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルによって調製されるマイクロカプセル中に捕獲することもできる。そのような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
維持−放出製剤を調製することができる。維持−放出製剤の適当な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは成型製品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。維持−放出マトリックスの例はポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非−分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリド酢酸より成る注射マイクロスフィア）のような分解性乳酸−グリコール酸子ポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
イン・ビボ投与で用いるべき処方は滅菌されなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
Ｋ．抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ ｓｉＲＮＡおよびＴＡＴ結合有機分子での診断および治療
癌におけるＴＡＴ発現を測定するためには種々の診断アッセイが利用できる。１つの具体例において、ＴＡＴポリペプチド過剰発現は免疫組織化学（ＩＨＣ）によって分析することができる。腫瘍バイオプシーからのパラフィン包埋組織セクションをＩＨＣアッセイに付し、以下のようにＴＡＴ蛋白質染色強度基準に従うことができる：
スコア０−染色は観察されず、または膜染色は腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋−弱い／辛うじて認識できる膜染色が腫瘍細胞の１０％を超えて検出される。細胞はその膜の一部分に染色されるに過ぎない。
スコア２＋−弱いないし中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を超えて観察される。
スコア３＋−中程度ないし強力な完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を超えて観察される。
ＴＡＴポリペプチド発現につき０または１＋スコアを持つ腫瘍はＴＡＴを過剰発現しないと特徴付けることができ、他方、２＋または３＋スコアを持つ腫瘍はＴＡＴを過剰発現すると特徴付けることができる。
別法として、あるいは加えて、（Ｖｅｎｔａｎａ，Ａｒｉｚｏｎａによって販売される）ＩＮＦＯＲＭ（登録商標）またはＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（登録商標）（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）のようなＦＩＳＨアッセイをホルマリン−固定、パラフィン−包埋腫瘍組織で行って、腫瘍におけるＴＡＴ過剰発現の程度（もしあれば）を決定することができる。
ＴＡＴ過剰発現または増幅は、イン・ビボ診断アッセイを用い、例えば、分子に結合して検出され、かつ検出可能な標識（例えば、放射性同位体または蛍光標識）のタグを付した（抗体、オリゴペプチドまたは有機分子のような）分子を投与し標識の場所について患者を外部からスキャンすることによって評価することができる。
前記したように、本発明の抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドおよび有機分子は種々の非−治療適用を有する。本発明の抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドおよび有機分子は、（例えば、放射性イメージングにおいて）ＴＡＴポリペプチド−発現癌の診断およびステージ決定に有用であり得る。該抗体、オリゴペプチドおよび有機分子は、他の細胞の精製における工程として混合細胞の集団からＴＡＴ−発現細胞を死滅させ、それを排除するための、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにおける、細胞からのＴＡＴポリペプチドの精製または免疫沈澱で、イン・ビトロでのＴＡＴポリペプチドの検出および定量でやはり有用である。
現在、癌のステージに依存して、癌の治療は以下の療法：癌性組織を除去するための外科的処置、放射線療法、および化学療法のうちの一つ、またはその組み合わせを含む。抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子療法は、化学療法の毒性および副作用をよく許容しない老人患者、または放射線療法が制限された有用性を有する転移性病気で特に望ましいであろう。本発明の腫瘍標的化抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡおよび有機分子は、病気の最初の診断に際して、または再発の間にＴＡＴ−発現癌を軽減するのに有用である。治療的適用では、抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子は単独で、あるいは例えば、ホルモン、抗−アンジオゲン、または放射性標識化合物との、あるいは外科的処置、低温療法および／または放射線療法との組合せで用いることができる。抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子治療は、プレ−、ポスト−または慣用的療法と同時にて、慣用的療法の他の形態と組み合わせて投与することができる。ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドセタキセル）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（パクリタキセル）、エストラムスチンおよびマイトキサントロンのような化学療法薬物は、特に、良好な危険性の患者において癌を治療するのに用いられる。癌を治療し、または軽減するための本発明の方法において、癌患者に、１以上のこれまでの化学療法剤での処置と組み合わせて抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を投与することができる。特に、パリクタキセルおよび修飾された誘導体（例えば、ＥＰ０６００５１７）との組合せ療法が考えられる。抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子は、治療上有効量の化学療法剤と共に投与されるであろう。もう１つの具体例において、抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子は化学療法と組み合わせて投与して、化学療法剤、例えば、パクリタキセルの活性および効力を増強させる。Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ （ＰＤＲ）は、種々の癌の治療で用いられてきたこれらの剤の用量を開示する。治療的に効果的なこれらの前記化学療法薬物の投与方法および用量は、治療すべき特定の癌、病気の程度、および当該分野において技量がある医師が精通した他の因子に依存し、医師によって決定することができる。
１つの特別な具体例において、細胞傷害性剤と組み合わせた抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ、または有機分子を含む結合体が患者に投与される。好ましくは、ＴＡＴ蛋白質に結合した免疫結合体は、細胞によって内部化され、その結果、それが結合する癌細胞を殺すにおける免疫結合体の増大した治療効果がもたらされる。好ましい具体例において、細胞傷害性剤は、癌細胞中の核酸を標的とし、それに干渉する。そのような細胞傷害性剤の例は先に記載され、メイタンシノイド、カリケアミシン、リボヌクレアーゼおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。
抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、有機分子またはそのトキシン結合体が、例えば、ボーラスとして静脈内投与のような公知の方法に従って、あるいは長時間にわたる連続的注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、クモ膜下腔内、経口、局所または吸入経路によって患者に投与される。該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の静脈内または皮下投与が好ましい。
他の治療方法を該抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の投与と組み合わせることができる。組み合わせた投与は、別々の処方または単一の医薬処方を用いる共投与、いずれかの順序での順次の投与を含み、ここに、好ましくは、双方（または全ての）活性な剤が同時にそれらの生物学的活性を発揮する時間がある。好ましくは、そのような組合せ療法の結果、相乗的な治療効果がもたらされる。
該抗−ＴＡＴ抗体または複数抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の投与を、特定の癌に関連するもう１つの腫瘍抗原に向けられた抗体の投与と組み合わせるのも望ましいであろう。
もう１つの具体例において、本発明の治療的処置の方法は、異なる化学療法剤のカクテルの共投与を含めた抗−ＴＡＴ抗体（または複数抗体）、オリゴペプチドまたは有機分子、および１以上の化学療法剤または成長阻害剤の組合せ投与を含む。化学療法剤はエストラムスチン硫酸、プレドニムスチン、シスプラチン、５−フルオロウラシル、メルファラン、シクロホスファミド、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキセン（例えば、パクリタキセルおよびドキセタキセル）および／またはアントラサイクリン抗生物質を含む。そのような化学療法剤のための調製および投与スケジュールは、製造業者の指示に従って用いることができるか、あるいは技量のある実務化によって経験的に決定することができる。そのような化学療法についての調製および投与スケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９２）にも記載されている。
該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は抗−ホルモン化合物；例えば、タモキシフェンのような抗−エストロゲン化合物；オナプリストン（ＥＰ６１６８１２）のような抗−プロゲステロン；またはフルタミドのような抗−アンドロゲンと、そのような分子について知られた用量において組み合わせることができる。治療すべき癌がアンドロゲン非依存性癌である場合、患者が先に抗−アンドロゲン療法に付されており、癌がアンドロゲン非依存性となった後に、該抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子（および、所望により、本明細書中に記載された他の剤）を患者に投与することができる。
時々、（療法に関連する心筋不全を予防し、または低下させるための）心臓保護剤または１以上のサイトカインを患者に共投与するのも有益であろう。前記治療方法に加えて、患者は、抗体、オリゴペプチドまたは有機分子療法の前に、それと同時にまたはその後に、癌細胞の外科的除去および／または放射線療法に付すことができる。前記した共投与された剤のいずれかの適当な用量は現在用いられているものであり、該剤と、抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の組合せ作用（相乗作用）により低下させることができる。
病気の予防または治療では、用量および投与の形態は、公知の基準に従って医師によって選択されるであろう。抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の適当な用量は、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が予防的または治療的目的で投与されるかを問わず、前記定義の治療すべき病気のタイプ、病気の重症度およびコース、従前の療法、患者の臨床的履歴および該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子に対する応答、および主治医の裁量に依存するであろう。該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は、適切には、一度に、または一連の処置にわたって患者に投与される。好ましくは、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は静脈内注入によって、または皮下注射によって投与される。病気のタイプおよび重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇないし約５０ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、約０．１ないし１５ｍｇ／ｋｇ用量）の抗体は、例えば、１以上の別々の投与によるかまたは連続的注入によるかを問わず、患者への投与のための初期の候補用量であり得る。投与方法は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量、続いての、約２ｍｇ／ｋｇの抗−ＴＡＴ抗体の毎週の維持用量を投与することを含むことができる。しかしながら、他の用量方法も有用であろう。典型的な未知用量は、前記した因子に応じて、約１μｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。数日間以上の間の反復投与は、疾患に応じて、病気徴候の所望の抑制が起こるまで処置を維持する。この療法の進行は慣用的な方法およびアッセイによって、かつ医師または当該分野で技量のある他の者に公知の基準に従って容易にモニターすることができる。
患者への抗体蛋白質の投与とは別に、本発明の適用では、遺伝子治療による抗体の投与が考えられる。該抗体をコードする核酸のそのような投与は、表現「治療上有効量の抗体の投与」に含まれる。例えば、細胞内抗体を生じさせるための遺伝子治療の使用に関する１９９６年３月１４日に公開されたＷＯ ９６／０７３２１参照。
（所望によりベクターに含有された）核酸を患者の細胞へイン・ビボおよびエクス・ビボにて入れる２つの主なアプローチがある。イン・ビボ送達では、核酸は、通常、抗体を必要とする部位にて患者に直接的に注射される。エクス・ビボ治療では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を直接的に患者に投与し、あるいは例えば、患者に移植される多孔性膜内にカプセル化する（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号参照）。核酸を生きた細胞に導入するために利用できる種々の技術がある。該技術は、核酸がイン・ビトロにて培養された細胞に、あるいは意図した宿主の細胞にイン・ビボにて導入されるかに応じて変化する。核酸のイン・ビトロでの哺乳動物細胞への導入に適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿方法等の使用を含む。遺伝子のエクス・ビボ送達のための通常に使用されるベクターはレトロウイルスベクターである。
現在好ましいイン・ビボ核酸導入技術は、（アデノウイルス、単純疱疹Ｉウイルス、またはアデノ−関連ウイルスのような）ウイルスベクター、および脂質−ベースの系（例えば、遺伝子の脂質−媒介導入のための有用な脂質はＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌ）でのトランスフェクションを含む。現在公知の遺伝子マーキングおよび遺伝子治療プロトコルのレビューについては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）参照。また、ＷＯ ９３／２５６７３およびそこに引用された文献参照。
本発明の抗−ＴＡＴ抗体は、ここに、「抗体」の定義に含まれる種々の形態であり得る。かくして、抗体は全長または無傷抗体、抗体断片、天然配列抗体またはアミノ酸変種、ヒト化、キメラまたは融合抗体、免疫結合体、およびその機能的断片を含む。融合抗体において、抗体配列は異種ポリペプチド配列に融合される。抗体はＦｃ領域において修飾され、所望のエフェクター機能を供することができる。適当なＦｃ領域に関しては本明細書中のセクションにおいてより詳細に議論するように細胞表面に結合した裸の抗体は、例えば、抗体−依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して、または補体依存性細胞傷害性または何らかの他のメカニズムにて補体を動員することによって、細胞傷害性を誘導することができる。別法として、エフェクター機能を排除し、または低下させて、副作用または治療的合併症を最小化するのが望ましい場合、ある種の他のＦｃ領域を用いることができる。
１つの具体例において、該抗体は、本発明の抗体と同一のエピトープへの結合に対して競合し、またはそれに対して実質的に結合する。本発明の抗−ＴＡＴ抗体の生物学的特徴を有する抗体も考えられ、これは、具体的には、イン・ビボ腫瘍標的化およびいずれかの細胞の増殖阻害または細胞傷害性特徴を含む。
前記抗体を生産する方法をここに詳細に記載する。
本発明の抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡおよび有機分子は、ＴＡＴ−発現癌を治療するのに、あるいは哺乳動物において癌の１以上の徴候を軽減するのに有用である。そのような癌は前立腺癌、生殖器管の癌、肺癌、乳癌、結腸癌、結直腸癌、および卵巣癌、より具体的には前立腺腺癌、腎臓細胞癌腫、結直腸腺癌、肺腺癌、肺扁平細胞癌腫、および腹腔中皮腫を含む。癌はこれまでのいずれの転移性癌も含む。該抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子は、哺乳動物においてＴＡＴポリペプチドを発現する癌細胞の少なくとも一部に結合することができる。好ましい具体例において、該抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子は、細胞上のＴＡＴポリペプチドへの結合に際して、イン・ビトロまたはイン・ビボにて、ＴＡＴ−発現腫瘍細胞を破壊し、または殺傷し、あるいはそのような腫瘍細胞の増殖を阻害するのに効果的である。そのような抗体は（いずれの剤にも結合体化していない）裸の抗−ＴＡＴ抗体を含む。細胞傷害性または細胞増殖阻害特性を有する裸の抗体は、細胞傷害性剤とさらに結び付けられて、それらを腫瘍細胞破壊においてより優れたものとすることができる。細胞傷害性特性は、例えば、抗体を細胞傷害性剤と結合体化させて、本明細書中で記載された免疫結合体を形成することによって、抗−ＴＡＴ抗体に付与され得る。細胞傷害性剤または増殖阻害剤は、好ましくは、小分子である。カリケアミシンまたはメイタンシノイドおよびそのアナログまたは誘導体のようなトキシンが好ましい。
本発明は、本発明の抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子、およびキャリアを含む組成物を提供する。癌を治療する目的では、組成物をそのような治療を必要とする患者に投与することができ、ここに、組成物は免疫結合体として、または裸の抗体として存在する１以上の抗−ＴＡＴ抗体を含むことができる。更なる具体例において、組成物は、化学療法剤を含めた、細胞傷害性または増殖阻害剤のような他の治療剤と組み合わせて、これらの抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ、または有機分子を含むことができる。本発明は、本発明の抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子、およびキャリアを含む処方も提供する。１つの具体例において、該処方は、薬学的に受容可能なキャリアを含む治療的処方である。
本発明のもう１つの態様は、抗−ＴＡＴ抗体をコードする単離された核酸である。ＨおよびＬの双方の鎖、特に超可変領域残基をコードする核酸、天然配列抗体をコードする鎖、ならびに該抗体の変種、修飾およびヒト化バージョンが含まれる。
本発明は、治療上有効量の抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を哺乳動物に投与することを含む。哺乳動物においてＴＡＴポリペプチド−発現癌を治療し、または該癌の１以上の徴候を軽減するのに有用な方法を提供する。該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の治療組成物は、医師によって指令されるように短期間（急性）または慢性または間欠的に投与することができる。またはＴＡＴポリペプチド−発現細胞の増殖を阻害し、およびそれを殺傷する方法も提供する。
また、本発明は、少なくとも１つの抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を含むキットおよび製品も提供する。抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を含有するキットは、例えば、ＴＡＴ細胞殺傷アッセイで、細胞からのＴＡＴポリペプチドの精製または免疫沈澱で用途を見出す。例えば、ＴＡＴの単離および精製のためには、該キットはビーズ（例えば、セファロースビーズ）にカップリングされた抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を含有することができる。例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにおいて、イン・ビトロでのＴＡＴの検出および定量のための該抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を含有するキットが提供され得る。検出で有用なそのような抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子は、蛍光または放射性標識のような標識と共に供することができる。
Ｌ．製品およびキット
本発明のもう１つの具体例は、抗−ＴＡＴ発現癌の治療で有用な材料を含有する製品である。該製品は容器、および該容器上のまたはそれに会合させたラベルまたは添付文書を含む。適当な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジなどを含む。該容器は硝子またはプラスチックのような種々の材料から形成することができる。該容器は、癌疾患を治療するのに効果的な組成物を保有し、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、該容器は皮下注射針によって刺すことができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性な剤は、本発明の抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子である。該ラベルまたは添付文書は、組成物が癌を治療するのに用いられることを示す。該ラベルまたは添付文書は、さらに、癌患者へ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子組成物を投与するための指示を含む。加えて、該製品は、さらに、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸−緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液のような薬学的に受容可能な緩衝液を含む第二の容器を含むことができる。それは、さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジを含めた、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料を含むことができる。
例えば、ＴＡＴ−発現細胞殺傷アッセイのための、ＴＡＴポリペプチドの細胞からの精製または免疫沈澱のための種々の目的で有用なキットも提供される。ＴＡＴポリペプチドの単離および精製では、該キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）にカップリングされた抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を含有することができる。例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにおける、イン・ビトロでのＴＡＴポリペプチドの検出および定量のための該抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を含有するキットが提供され得る。該製品に関しては、該キットは容器、および該容器上の、またはそれに会合させたラベルまたは添付文書を含む。該容器は、本発明の少なくとも１つの抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を含む組成物を保持する。例えば、希釈剤および緩衝液、対照抗体を含有する更なる容器を含めることができる。該ラベルまたは添付文書は組成物の記載、ならびに意図したイン・ビトロまたは診断的使用のための指示を供することができる。
Ｍ．ＴＡＴ−ポリペプチド、およびＴＡＴ−ポリペプチドをコードする核酸の使用
ＴＡＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（またはそれらの相補体）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含めた分子生物学の分野において、染色体および遺伝子マッピングにおいて、およびアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびＤＮＡプローブの作成において種々の適用を有する。ＴＡＴ−コーディング核酸は、本明細書中に記載された組換え技術によるＴＡＴポリペプチドの調製でやはり有用であり、ここに、それらのＴＡＴポリペプチドは、例えば、本明細書中で記載されたような抗−ＴＡＴ抗体の調製で用途を見出すことができる。
全長天然配列ＴＡＴ遺伝子、またはその部分は、ｃＤＮＡライブラリ用のハイブリダイゼーションプローブとして用いて、全長ＴＡＴ ｃＤＮＡを単離し、あるいは本明細書中に開示された天然ＴＡＴ配列に対して所望の配列同一性を有するなお他のｃＤＮＡ（例えば、ＴＡＴの天然に生じる変種または他の種からのＴＡＴをコードするもの）を単離することができる。所望により、プローブの長さは約２０ないし約５０塩基であろう。ハイブリダイゼーションプローブは、全長天然ヌクレオチド配列の少なくとも部分的に新規な領域に由来し得、ここに、それらの領域は、過度の実験なくして、あるいは天然配列ＴＡＴのプロモータ、エンハンサーエレメントおよびイントロンを含めたゲノム配列から決定することができる。その例として、スクリーニング方法は、公知のＤＮＡ配列を用いてＴＡＴ遺伝子のコーディング領域を単離して、約４０塩基の選択されたプローブを構成することを含むであろう。ハイブリダイゼーションプローブは、アビジン／ビオチンカップリング系を介してプローブにカップリングされた、３２Ｂまたは３５Ｓのような放射性ヌクレオチド、またはアルカリ性ホスファターゼのような酵素標識を含めた種々の標識によって標識することができる。本発明のＴＡＴ遺伝子のそれに対して相補的な配列を有する標識されたプローブを用いて、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリをスクリーニングして、そのようなライブラリのいずれのメンバーがプローブにハイブリダイズするかを決定することができる。ハイブリダイゼーション技術は以下の実施例にさらに詳細に記載される。本出願で開示したいずれのＥＳＴ配列も同様に、本明細書中に開示された方法を用いてプローブとして使用することができる。
ＴＡＴ−コーディング核酸の他の有用な断片は、標的ＴＡＴ ｍＲＮＡ（センス）またはＴＡＴ ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合することができる一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを含む。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、本発明に従って、ＴＡＴ ＤＮＡのコーディング領域の断片を含む。そのような断片は、一般に、少なくとも約１４のヌクレオチド、好ましくは、約１４ないし３０ヌクレオチドを含む。与えられた蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列に基づき、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを駆動する能力は、例えば、Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ （Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８）およびｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８，１９８８）に記載されている。
標的核酸配列へのアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合の結果、デュプレックスの増強された分解、転写または翻訳の未成熟終止、または他の手段を含めたいくつかの手段の一つによって、標的配列の転写または翻訳をブロックするデュプレックスが形成される。そのような方法は本発明に含まれる。かくして、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＴＡＴ蛋白質の発現をブロックすることができ、ここに、それらのＴＡＴ蛋白質は、哺乳動物において癌の誘導において役割を演じるであろう。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、さらに、修飾された糖−ホスホジエステル骨格（ＷＯ ９１／０６６２９に記載されたような糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含み、ここに、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼに対して耐性である。耐性糖結合を持つそのようなオリゴヌクレオチドはイン・ビボで安定であり（すなわち、酵素分解に抵抗することができる）、しかし、標的ヌクレオチド配列に結合することができる配列特異性を保有する。
アンチセンス結合のための好ましい遺伝子内部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始／スタートコドン（５’−ＡＵＧ／５’−ＡＴＧ）または終止／停止コドン（５’−ＵＡＡ／５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ／５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡ）を取り込む領域を含む。これらの領域は、翻訳開始または終止コドンからいずれかの方向（すなわち５’または３’）いずれかに、約２５ないし約５０の連続したヌクレオチドを含むｍＲＮＡまたは遺伝子の一部をいう。アンチセンス結合のための他の好ましい領域は：イントロン；エクソン；イントロン−エクソン接合；翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの間の領域であるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コーディング領域」；５’−５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの最も５’側の残基に接合したＮ７−メチル化グアノシン残基を含み、５’キャップ構造それ自体、ならびに該キャップに隣接した最初の５０ヌクレオチドを含むｍＲＮＡの５’キャップ；５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡの部分、かくして、５’キャップ部位およびｍＲＮＡの翻訳開始コドンの間のヌクレオチド、または当該遺伝子上の対応するヌクレオチドを含み；３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、翻訳終止コドンから３’方向のｍＲＮＡの部分、かくして、翻訳終止コドンおよびｍＲＮＡの３’末端の間のヌクレオチド、または当該遺伝子上の対応するヌクレオチド；を含む。
ＴＡＴ蛋白質の発現を阻害するのに有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例は、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドを含む。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドは、該骨格にリン原子を保有するもの、および該骨格にリン原子を有しないものを含む。本明細書の目的では、かつ当該分野で時々言及されているように、それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を有しない修飾されたオリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであると考えることができる。好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めたメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含めたホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常な３’−５’結合を有するセレノホスホネートおよびボラノ−ホスフェート、これらの２’−５’結合アナログ、および１以上のヌクレオチド間結合が３’から３’、５’から５’、または２’から２’の結合である逆転した極性を有するものを含む。逆転したヌクレオシド極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、最も３’のヌクレオチド間結合において単一の３’から３’の結合、すなわち、無塩基性であり得る単一の逆転したヌクレオシド残基を含む（該ヌクレオベースは失われているか、またはその場所にヒドロキシル基を有する）。種々の塩、混合された塩および遊離酸形態も含まれる。リン−含有結合の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されるものではないが、その各々をここに引用して援用する、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５、４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５、４７６，９２５号；第５、５１９，１２６号；第５、５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，１９４，５９９号；第５，５６５，５５５号；第５，５２７，８９９号；第５，７２１，２１８号；第５，６７２，６９７号および第５，６２５，０５０号を含む。
その中にリン原子を含まない好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、短い鎖のアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１以上の短い鎖のヘテロ原子または複素環ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成された）モルホリノ結合；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合されたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ置換の２成分部分を有する他のものを有するものを含む。そのようなオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許は限定されるものではないが、その各々をここに引用して援用する、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５、６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；第５，７９２，６０８号；第５，６４６，２６９号および第５，６７７，４３９号を含む。
他の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、糖およびヌクレオシド結合双方、すなわち、ヌクレオチドユニットの骨格は新規な基で置き換えられている。塩基ユニットは、適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。一つのそのようなオリゴマー化合物、すなわち、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチドミメティックを、ペプチド核酸（ＰＮＡ）という。ＰＮＡ化合物においては、オリゴヌクレオチドの糖−骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられている。ヌクレオベースは保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的にまたは間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されるものではないが、その各々をここに引用して援用する、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号を含む。ＰＮＡ化合物の更なる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に見出すことができる。
好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格および／またはヘテロ原子骨格、特に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知］、前記で引用した米国特許第５，４８９，６７７号に記載された−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［式中、天然ホスホジエステル骨格は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、および前記で引用した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を取り込む。また、好ましいのは、前記で引用した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
修飾されたオリゴヌクレオチドは、１以上の置換された糖部位も含有することができる。好ましいオリゴヌクレオチドは２’位置に以下のうちの１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、またはＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、またはＮ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、またはＮ−アルキニル；またはアルキル、アルケニルおよびアルキニルが置換されたまたは置換されていないＣ１ないしＣ１０アルキルまたはＣ２ないしＣ１０アルケニルおよびアルキニルであってよいＯ−アルキル−Ｏ−アルキル。特に好ましいのはＯ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、ここに、ｎおよびｍは１ないし約１０である。他の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは２’位置に以下のうちの１を含む：Ｃ１ないしＣ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改良するための基、および同様な特性を有する他の置換基。好ましい修飾は２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエトキシ）または２’−ＭＯＥとしても知られた２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。さらに好ましい修飾は、以下の実施例に記載された、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られた、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および（当該分野においては２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られた）２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）を含む。
さらなる好ましい修飾はロックされた核酸（ＬＮＡ）を含み、ここに、２’−ヒドロキシル基は糖環の３’または４’炭素原子に連結され、それにより、二環糖部位を形成する。該結合は、好ましくは、２’酸素原子および４’炭素原子を橋掛けするメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、ここに、ｎは１または２である。ＬＮＡおよびその調製はＷＯ ９８／３９３５２およびＷＯ ９９／１４２２６に記載されている。
他の好ましい修飾は２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。該２’−修飾はアラビノ（上方）位置またはリボ（下方）位置にあってよい。好ましい２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。同様な修飾をオリゴヌクレオチド上の他の位置において、特に、３’−末端ヌクレオチド上の、または２’−５’連結オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位置において、および５’末端ヌクレオチドの５’位置においてなすこともできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部位のような糖ミメティックを有することもできる。そのような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されるものではないが、その各々をここに引用してその全体を援用する、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；第５，７９２，７４７号；および第５，７００，９２０号を含む。
オリゴヌクレオチドは（しばしば、当該分野においては単に「塩基」と言われる）ヌクレオベース修飾または置換を含むこともできる。本明細書中で用いるように、「修飾されていない」または「天然」ヌクレオベースは、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾されたヌクレオベースは５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピミル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３または−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ）ウラシルおよびシトシン、およびピリミジン塩基の他のアルキミル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンのような他の合成および天然ヌクレオベースを含む。更なる修飾されたヌクレオベースはフェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換されたフェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）のようなＧ−クランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−オン）のような三環ピリミジンを含む。修飾されたヌクレオベースは、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンで置き換えられたものも含むことができる。更なるヌクレオベースは米国特許第３，６８７，８０８号に開示されたもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されたもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されたものを含む。これらのヌクレオベースのある種のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらは５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニンを含めたＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、５−プロピニルウラシルおよびプロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシン置換は、０．６ないし１．２度Ｃだけ核酸デュプレックス安定性を増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、なおより特別には、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合、好ましい塩基置換である。修飾されたヌクレオベースの調製を教示する代表的な米国特許は、限定されるものではないが、その各々をここに引用して援用する、米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６４５，９８５号；第５，８３０，６５３号；第５，７６３，５８８；第６，００５，０９６号；第５，６８１，９４１号；および第５，７５０，６９２号を含む。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのもう１つの修飾は、オリゴヌクレオチドに、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞摂取を高める１以上の部位または結合体を化学的に連結させる。本発明の化合物は、第一級または第二級ヒドロキシル基のような官能基に共有結合した結合体基を含むことができる。本発明の結合体基はインターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を高める基、およびオリゴマーの薬物動態学特性を高める基を含む。典型的な結合体基はコレステロール、脂質、カチオン脂質、リン脂質、カチオン性リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料を含む。本発明との関係で、薬力学特性を高める基は、オリゴマー摂取を改善し、分解に対するオリゴマー抵抗性を高め、および／またはＲＮＡとの配列−特異的ハイブリダイゼーションを強める基を含む。本発明との関係で、薬物動態学的特性を高める基は、オリゴマー摂取、分布、代謝または排出を改善する基を含む。結合体部位は、限定されるものではないが、コレステロール部位のような脂質部位（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたは１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸トリエチル−アンモニウム（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部位（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部位を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、活性な薬物物質、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツレート、セファロスポリン、スルファ薬物、抗糖尿病剤、抗菌剤または抗生物質に結合体化することもできる。オリゴヌクレオチド−薬物結合体およびそれらの調製は米国特許出願第０９／３３４，１３０号（１９９９年６月１５日出願）および米国特許第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７号；第５，５８０，７３１号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５、３７１，２４１号；第５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３号；第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５、５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号および第５，６８８，９４１号に記載されており、その各々を、ここに引用して援用する。
与えられた化合物中の全ての位置が均一に修飾されている必要は無く、事実、１を超える前記した修飾は単一の化合物に、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにおいてさえ閉じこむことができる。本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含む。「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、本発明との関係では、各々が少なくとも１つのモノマーユニット、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドで構成される、２以上の化学的に区別される領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、該オリゴヌクレオチドを修飾して、該オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解に対する増大した抵抗性、増大した細胞摂取、および／または標的核酸に対する増大した結合親和性を付与する少なくとも１つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドの更なる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質として働くことができる。その例として、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡデュプレックスのＲＮＡストランドを切断する細胞エンドヌクレアーゼである。ＲＮａｓｅ Ｈの活性化は、従って、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大いに高める。その結果、キメラオリゴヌクレオチドを用いる場合、同一の標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートでオキシオリゴヌクレオチドと比較して、より短いオリゴヌクレオチドで匹敵する結果がしばしば得ることができる。本発明のキメラアンチセンス化合物は、前記した２以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチドの複合構造として形成することができる。好ましいキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾糖（好ましくは、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３）を３’末端に取り込んで、ヌクレアーゼ抵抗性を付与し、少なくとも４つの連続する２’−Ｈ糖を持つ領域を取り込んで、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を付与する。そのような化合物はハイブリッドまたはギャップマーとも当該分野で言われてきた。好ましいギャップマーは、少なくとも４つの連続した２’−Ｈ糖を有する少なくとも１つの領域によって分離された３’末端および５’−末端において２’修飾糖（好ましくは、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３）の領域を有し、好ましくは、ホスホロチオエート骨格結合を取り込む。そのようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されるものではないが、その各々をここに引用してその全体を援用する、米国特許第５，０１３，８３０号；第５，１４９，７９７号；第５，２２０，００７号；第５，２５６，７７５号；第５，３６６，８７８号；第５，４０３，７１１号；第５，４９１，１３３号；第５，５６５，３５０号；第５，６２３，０６５号；第５，６５２，３５５号；第５，６５２，３５６号；および第５，７００，９２２号を含む。
本発明に従って用いられるアンチセンス化合物は、便宜には、固相合成のよく知られた技術を介してルーチン的に作成することができる。そのような合成のための器具は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を含めたいくつかの販売業者によって販売されている。当該分野で知られたそのような合成用のいずれの他の手段も、加えてまたは別法として使用することができる。同様な技術を用いて、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを調製するのはよく知られている。本発明の化合物は、摂取、分布および／または吸収を助けるために、例えば、リポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所または他の処方としての他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合し、それでカプセル化し、それと結合体化し、またはそうでなければそれと会合させることもできる。そのような摂取、分布および／または吸収援助処方の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されるものではないが、その各々をここに引用して援用する、米国特許第５，１０８，９２１号；第５，３５４，８４４号；第５，４１６，０１６号；第５，４５９，１２７号；第５，５２１，２９１号；第５，５４３，１５８号；第５，５４７，９３２号；第５，５８３，０２０号；第５，５９１，７２１号；第４，４２６，３３０号；第４，５３４，８９９号；第５，０１３，５５６号；第５，１０８，９２１号；第５，２１３，８０４号；第５，２２７，１７０号；第５，２６４，２２１号；第５，３５６，６３３号；第５，３９５，６１９号；第５，４１６，０１６号；第５，４１７，９７８号；第５，４６２，８５４号；第５，４６９，８５４号；第５，５１２，２９５号；第５，５２７，５２８号；第５，５３４，２５９号；第５，５４３，１５２号；第５，５５６，９４８号；第５，５８０，５７５号；および第５，５９５，７５６号を含む。
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、ＷＯ ９０／１００４８に記載されたもののような有機部位、およびポリ−（Ｌ−リシン）のような標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増大させる他の部位に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。なおさらに、エリプチシンのようなインタカレーティング剤、およびアルキル化剤または金属錯体をセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させて、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾することができる。
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４−媒介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含めたいずれかの遺伝子導入方法によって、あるいはエプスタイン−バールウイルスのような遺伝子導入ベクターを用いることによって、標的核酸配列を含有する細胞に導入することができる。好ましい手法において、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは適当なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含有する細胞をイン・ビボまたはエクス・ビボいずれかにて組換えレトロウイルスベクターと接触させる。適当なレトロウイルスベクターは、限定されるものではないが、ネズミレトロウイルスＭ−ＭｕＬｖ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶに由来するレトロウイルス）、またはＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃと命名される二重コピーベクター（ＷＯ ９０／１３６４１参照）に由来するものを含む。
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＷＯ ９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との結合体の形成によって、標的ヌクレオチド配列を含有する細胞に導入することができる。適当なリガンド結合分子は、限定されるものではないが、細胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子のコンジュゲーションは、その対応する分子または受容体に結合し、またはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合体化したバージョンの細胞への進入をブロックするリガンド結合分子の能力に実質的に干渉しない。
別法として、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ ９０／１０４４８に記載されているように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって、標的核酸配列を含有する細胞に導入することができる。該センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼによって細胞内で解離する。
アンチセンスまたはセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、一般には、長さが少なくとも約５ヌクレオチドであり、別法として、長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００ヌクレオチドであり、ここに、この関係で、用語「約」は、言及されたヌクレオチド配列の長さ±その言及された長さの１０％を意味する。
別法として、二本鎖ＲＮＡを表示させることができる。長さが３０ヌクレオチド未満の二本鎖ＲＮＡは、細胞に導入させると、特異的な遺伝子の発現を阻害する。このメカニズムはＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）として知られており、試薬として用いられる小さな（３０ヌクレオチド未満）ＲＮＡはｓｉＲＮＡとして知られている。ＴＡＴ干渉ＲＮＡは、公知の方法を用いて同定し、合成することができる（Ｓｈｉ ＹＴｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９（１）：９−１２（２００３）、ＷＯ／２００３０５６０１２およびＷＯ２００３０６４６２１）。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現の低下が疾患または病気を軽減するであろう疾患における遺伝子発現の量を低下させるのに有用である。
プローブをＰＣＲ技術で用いて、密接に関連するＴＡＴコーディング配列の同定用の配列のプールを表示させることもできる。
ＴＡＴをコードするヌクレオチド配列を用いて、そのＴＡＴをコードする遺伝子をマッピングするための、および遺伝的障害を持つ個体の遺伝的分析のためのハイブリダイゼーションプローブを構築することもできる。本明細書中に提供されたヌクレオチド配列を、イン・サイチュハイブリダイゼーション、公知の染色体マーカーに対する連鎖分析、およびライブラリでのハイブリダイゼーションスクリーニングのような公知の技術を用いて染色体、および染色体の特異敵領域にマッピングすることができる。
ＴＡＴにつてのコーディング配列がもう１つの蛋白質に結合する蛋白質をコードする場合（例えば、ＴＡＴが受容体である場合）、ＴＡＴをアッセイで用いて、結合相互作用に関与する他の蛋白質または分子を同定することができる。そのような方法によって、受容体／リガンド結合相互作用の阻害剤を同定することができる。そのような結合相互作用に関与する蛋白質を用いて、ペプチドまたは小分子阻害剤、あるいは結合相互作用のアゴニストについてスクリーニングすることもできる。また、受容体ＴＡＴを用いて、関連リガンドを単離することができる。スクリーニングアッセイは、天然ＴＡＴまたはＴＡＴについての受容体の生物学的活性を模倣するリード化合物を見出すように設計することができる。そのようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに使用できるアッセイを含み、それは、それらを小分子薬物候補を同定するのに特に適切であるようにする。考えられる小分子は、合成有機または無機化合物を含む。該アッセイは、当該分野で良く特徴付けられている、蛋白質−蛋白質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、イムノアッセイおよび細胞ベースのアッセイを含めた、種々の様式で行うことができる。
ＴＡＴまたはその修飾された形態をコードする核酸を用いて、治療的に言うような試薬の開発およびスクリーニングで言うようなトランスジェニック動物または「ノックアウト」動物を作り出すこともできる。トランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラット）は導入遺伝子を含有する細胞を有する動物であり、その導入遺伝子は誕生前、例えば、胚段階で動物、または該動物の先祖に導入された。導入遺伝子は、トランスジェニック動物がそれから発生した細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。１つの具体例において、ＴＡＴをコードするｃＤＮＡを用いて、確立された技術に従ってＴＡＴをコードするゲノムＤＮＡをクローン化することができ、ゲノミック配列を用いて、ＴＡＴをコードするＤＮＡを発現する細胞を含有するトランスジェニック動物を作り出すことができる。トランスジェニック動物、特にマウスまたはラットのような動物を作成するための方法は当該分野で慣用的になっており、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号に記載されている。典型的には、特別な細胞は、組織−特異的エンハンサーと一緒でのＴＡＴ導入遺伝子組込みのために標的化されるであろう。胚段階の動物の生殖系に導入されたＴＡＴをコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物を用いて、ＴＡＴをコードするＤＮＡの増大した発現の効果を調べることができる。そのような動物は、例えば、その過剰発現に関連する病理学的状態からの保護を付与すると考えられる試薬についてのテスター動物として用いることができる。本発明のこの局面に従い、党物を試薬で処理し、導入遺伝子を担う未処理動物と比較した、病理学的状態の低下した発生は、病理学的状態に対する潜在的治療介入を示すであろう。
別法として、ＴＡＴの非−ヒトホモログを用いて、ＴＡＴをコードする内因性遺伝子、および動物の胚性幹細胞に導入されたＴＡＴをコードする改変ゲノムＤＮＡの間での相同組換えの結果としてＴＡＴをコードする欠陥または改変遺伝子を有するＴＡＴ「ノックアウト」動物を構築することができる。例えば、ＴＡＴコードするｃＤＮＡを用いて、確立された技術に従って、ＴＡＴをコードするゲノムＤＮＡをクローン化することができる。ＴＡＴをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失するか、あるいは組込みをモニターするのに用いることができる選択マーカーをコードする遺伝子のようなもう１つの遺伝子を置き換えることができる。典型的には、（５’および３’両末端の）改変されていないフランキングＤＮＡの数キロベースを、ベクターに含ませる［例えば、相同組換えベクターの記載については、Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）参照］。該ベクターは（例えば、エレクトロポレーションによって）胚性幹細胞系に導入され、導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組換えされた細胞を選択する［例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）参照］。次いで、選択された細胞を動物（例えば、マウスまたはラット）の芽細胞に注射して、凝集キメラを形成する［例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，ｉｎ Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），ｐｐ．１１３−１５２参照］。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌借腹動物に移植し、該胚を出産予定日まで維持して、「ノックアウト」動物を作成する。その生殖細胞において相同組換えＤＮＡを保有する子孫は、標準的な技術によって同定することができ、これを用いて、動物の全ての細胞が相同組換えＤＮＡを含有する動物を育種することができる。ノックアウト動物は、例えば、ある種の病理学的状態に対して防御するその能力について、およびＴＡＴポリペプチドの不存在による病理学的状態のその発生について特徴付けることができる。
ＴＡＴポリペプチドをコードする核酸を遺伝子治療に用いることもできる。遺伝子治療適用において、遺伝子を細胞に導入して、例えば、欠陥遺伝子の置き換えにつき、治療上有効な遺伝子産物のイン・ビボ合成を達成する。「遺伝子治療」は、持続する効果が、治療上有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの一回または反復投与を含む、単一処理、および遺伝子治療剤の投与によって達成される双方の慣用的遺伝子治療を含む。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡは、イン・ビボでの、ある種の遺伝子の発現をブロックするための治療剤として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜によるその制限された摂取によって引き起こされるその低い細胞内濃度にも拘らず、それらが阻害剤として作用する細胞に輸入することができるのが既に示されている（Ｚａｍｅｃｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：４１４３−４１４６［１９８６］）。オリゴヌクレオチドを修飾して、例えば、その負に荷電したホスホジエステル基を荷電していない基で置き換えることによってその取り込みを増強することができる。
核酸を生きた細胞に導入するのに利用できる種々の技術がある。該技術は、核酸を意図した宿主の細胞において、イン・ビトロまたはイン・ビボにて培養細胞に導入されるか否かに応じて変化する。核酸のイン・ビトロでの哺乳動物細胞への導入に適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿方法等の使用を含む。現在好ましいイン・ビボ遺伝子導入技術は、ウイルス（典型的には、レトロウイルス）ベクターでのトランスフェクション、およびウイルス被膜蛋白質−リポソーム媒介トランスフェクション（Ｄｚａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１，２０５−２１０［１９９３］）を含む。いくつかの状況においては、核酸源に、細胞表面膜蛋白質または標的細胞に対して特異的な抗体、標的細胞上の受容体に対するリガンド等のような標的細胞を標的とする剤を供給するのが望ましい。リポソームを使用する場合、エンドサイトーシスに会合した細胞表面膜蛋白質に結合する蛋白質、例えば、特定の細胞型に対して親和性のキャプシド蛋白質またはその断片、サイクリングにおいて内部化を受ける蛋白質に対する抗体、細胞内局所化を標的化し、細胞内半減期を高める蛋白質、は標的化のために、および／または取り込みを容易とするために用いることができる。受容体−媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２（１９８７）；およびＷａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，３４１０−３４１４（１９９０）によって記載されている。遺伝子マーキングおよび遺伝子治療プロトコルのレビューについては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，８０８−８１３（１９９２）参照。
本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定で有用である。この点に関し、新しい染色体マーカーを同定する継続的な要望が存在する。と言うのは、比較的少数の染色体マーキング試薬しか、現実の配列データに基づいて、現在利用できないからである。本発明の各ＴＡＴ核酸分子は、染色体マーカーとして用いることができる。
本発明のＴＡＴポリペプチドおよび核酸分子は組織タイプ分けで診断的に用いることもでき、そこでは、本発明のＴＡＴポリペプチドは、もう１つのものと比較して１つの組織で異なって発現させることができ、好ましくは、同一組織タイプの正常な組織と比較して、病気の組織において異なって発現され得る。ＴＡＴ核酸分子は、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザーン分析およびウエスタン分析用のプローブの作成で用途が見出される。
本発明は、ＴＡＴポリペプチドを模倣するもの（アゴニスト）を同定し、あるいはＴＡＴポリペプチドの効果を妨げるもの（アンタゴニスト）を同定するために化合物をスクリーニングする方法を含む。アンタゴニスト薬物候補のためのスクリーニングアッセイは、本明細書中で確認される遺伝子によってコードされるＴＡＴポリペプチドに結合し、またはそれとで複合体を形成し、あるいはそうでなければ、例えば、細胞からのＴＡＴポリペプチドの発現の阻害を含めた、コードされたポリペプチドと他の細胞蛋白質との相互作用に干渉する化合物を同定するように設計される。そのようなスクリーニングアッセイは、化学ライブラリ高スループットスクリーニングに使用できるアッセイを含み、これは、それらが小分子薬物候補を同定するのに特に適したものとする。
該アッセイは、当該分野で良く特徴付けられている蛋白質−蛋白質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、および細胞ベースのアッセイを含めた種々の様式で行うことができる。
アンタゴニストのための全てのアッセイは、それらが、これらの２つの成分が相互作用するようにできるのに十分な条件下で、かつ十分な時間の間、本明細書中で確認される核酸によってコードされるＴＡＴポリペプチドと薬物候補を接触させることを必要とする点で共通する。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であって、形成される複合体を単離することができるか、あるいはそれは反応混合物中で検出することができる。特別な具体例において、本明細書中で確認される遺伝子によってコードされるＴＡＴポリペプチドまたは薬物候補は、共有結合または非共有結合によって、固相に、例えば、マイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般には、固相をＴＡＴポリペプチドの溶液でコーティングし、乾燥することによって達成される。別法として、固定化すべきＴＡＴポリペプチドに対して特異的な固定化抗体、例えば、モノクローナル抗体を用いて、それを固体表面に係留させることができる。アッセイは、検出可能な標識によって標識することができる非−固定化成分を固定化された成分、例えば、係留された成分を含有するコーティングされた表面に加えることによって行われる。反応が完了すると、例えば、洗浄によって反応しなかった成分を除去し、固体表面に係留された複合体を検出する。元来固定化されていない成分が検出可能な標識を運ぶ場合、表面に固定化された標識の検出は、複合体化が起こったことを示す。元来、固定化されていない成分が標識を運ばない場合、複合体化は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識された抗体を用いることによって検出することができる。
もし候補化合物が本明細書中で確認される遺伝子によってコードされる特定のＴＡＴポリペプチドと相互作用するが、それに結合しなければ、そのポリペプチドとのその相互作用は、蛋白質−蛋白質相互作用を検出するためのよく知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、例えば、架橋、共免疫沈澱、およびグラジエントまたはクロマトグラフィカラムを通す共精製のような伝統的なアプローチを含む。加えて、蛋白質−蛋白質相互作用は、Ｃｈｅｖｒａｙ ａｎｄ Ｎａｔｈａｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５７８９−５７９３（１９９１）によって開示されているように、Ｆｉｅｌｄｓおよび共同研究者によって記載された酵母−ベースの遺伝子系（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３４０：２４５−２４６（１９８９）；Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９５７８−９５８２（１９９１））を用いることによってモニターすることができる。酵母ＧＡＬ４のような多くの転写活性化は、２つの物理的に区別されるモジュラードメインよりなり、１つはＤＮＡ−結合ドメインとして作用し、他の一つは転写−活性化ドメインとして機能する。（一般には、「２−ハイブリッド系」と言われる）前記刊行物に記載された酵母発現系は、この特性を利用し、２つのハイブリッド蛋白質を使用し、１つは、そこでは標的蛋白質がＧＡＬ４のＤＮＡ−結合ドメインに融合されており、もう１つは、そこでは、候補活性化蛋白質が活性化ドメインに融合されている。ＧＡＬ４−活性化プロモータの制御下でのＧＡＬ１−ｌａｃＺ受容体遺伝子の発現は、蛋白質−蛋白質相互作用を介するＧＡＬ４活性の復元に依存する。相互作用ポリペプチドを含有するコロニーを、β−ガラクトシダーゼに対する発色性基質で検出する。２−ハイブリッド技術を用いる２つの特異的蛋白質の間の蛋白質−蛋白質相互作用を同定するための完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲＴＭ）はＣｌｏｎｔｅｃｈから商業的に入手可能である。この系を拡大して、特異的蛋白質相互作用に関与する蛋白質ドメインをマップし、ならびにこれらの相互作用で非常に重要なアミノ酸残基を突き止めることもできる。
本明細書中で確認されるＴＡＴポリペプチドをコードする遺伝子、および他の細胞内または細胞外成分の相互作用に干渉する化合物は以下のようにテストすることができる：通常、２つの蛋白質の相互作用および結合を可能とする条件および時間にて、当該遺伝子の産物および細胞内または細胞外成分を含有する反応混合物を調製する。結合を阻害する候補化合物の能力をテストするために、テスト化合物の不存在下および存在下で反応を実行する。加えて、プラセボを第３の反応混合物に加えて、陽性対照として供することができる。混合物中に存在するテスト化合物および細胞内または細胞外成分の間の結合（複合体形成）は、前記したようにモニターされる。テスト化合物を含有する反応混合物中ではなく、対照反応中での複合体の形成は、テスト化合物が、テスト化合物およびその反応パートナーの相互作用に干渉することを示す。
アンタゴニストについてアッセイするためには、パートナー活性についてスクリーニングすべき化合物と共にＴＡＴポリペプチドを細胞に加えることができ、ＴＡＴポリペプチドの存在下で注目する活性を阻害する化合物の能力は該化合物がＴＡＴポリペプチドに対してアンタゴニストであることを示す。別法として、競合阻害アッセイに適した条件下で、ＴＡＴポリペプチドおよび潜在的アンタゴニストと、膜−結合ＴＡＴポリペプチド受容体または組換え受容体と合わせることによってアンタゴニストを検出することができる。受容体に結合したＴＡＴポリペプチド分子の数を用いて、潜在的アンタゴニストの有効性を判断できるように、放射能によるように、ＴＡＴポリペプチドを標識することができる。受容体をコードする遺伝子は、当業者に知られた多数の方法、例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティングによって同定することができる。Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２）：Ｃｈａｐｔｅｒ ５（１９９１）。好ましくは、発現クローニングを使用し、そこでは、ポリアデニル化ＲＮＡをＴＡＴポリペプチドに応答性の細胞から調製し、このＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブラリをプールに分け、これを用いて、ＴＡＴポリペプチドに反応性でないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェクトする。スライドグラス上で増殖させるトランスフェクトされた細胞を、標識されたＴＡＴポリペプチドに暴露する。ＴＡＴポリペプチドは、部位特異的蛋白質キナーゼ用の認識部位をヨウ素化、または該部位を含めることを包含する種々の手段によって標識することができる。固定およびインキュベーションに続いて、スライドをオートラジオグラフィー分析に付す。陽性プールを同定し、サブ−プールを調製し、反応性サブ−プールおよび再スクリーニングプロセスを用いて再度トランスフェクトし、最終的に、推定受容体をコードする単一のクローンが得られる。
受容体同定のための代替アプローチとして、標識されたＴＡＴポリペプチドを、受容体分子を発現する細胞膜または抽出物の調製物と光親和性−連結させることができる。架橋された材料はＰＡＧＥによって分解し、Ｘ−線フィルムに暴露する。受容体を含有する標識された複合体を切り出し、ペプチド断片に分解し、蛋白質ミクロ−配列決定に付すことができる。ミクロ−配列決定から得られたアミノ酸配列を用いて、縮重オリゴヌクレオチドプローブ組を設計して、ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングし、推定受容体をコードする遺伝子を同定することとなろう。
アンタゴニストのためのもう１つのアッセイにおいて、受容体を発現する哺乳動物細胞または膜調製物を、候補化合物の存在下で標識されたＴＡＴポリペプチドと共にインキュベートする。次いで、この相互作用を増強し、またはブロックする化合物の能力を測定できよう。
潜在的アンタゴニストのより具体的な例は、免疫グロブリンとＴＡＴポリペプチドの融合に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限定されるものではないが、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体および抗体断片、単一−鎖抗体、抗−イディオタイプ抗体、およびそのような抗体または断片のキメラまたはヒト化バージョン、ならびにヒト抗体または抗体断片を含めた抗体を含む。別法として、潜在的アンタゴニストは密接に関連する蛋白質、例えば、受容体を認識するが、影響を与えず、それにより、ＴＡＴポリペプチドの作用を阻害するＴＡＴポリペプチドの突然変異した形態であり得る。
もう１つの潜在的ＴＡＴポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ構築体であり、ここに、例えば、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、標的化されたｍＲＮＡにハイブリダイズさせ、蛋白質翻訳を妨げることによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接的にブロックするように作用する。アンチセンス技術を用いて、三重ラセン形成またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを介して遺伝子発現を制御することができ、その方法は共に、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここに、成熟ＴＡＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コーディング部分を用いて、長さが約１０ないし４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に対して相補的なように設計され（三重ラセン−Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；Ｄｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１））、それにより、転写およびＴＡＴポリペプチドの生産を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはイン・ビボにてｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のＴＡＴポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８８））。前記したオリゴヌクレオチドを、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをイン・ビボで発現させて、ＴＡＴポリペプチドの生産を阻害するように、細胞に送達することもできる。アンチセンスＤＮＡを用いる場合、例えば、標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０および＋１０位置の間の、翻訳−開始部位に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
潜在的アンタゴニストは、ＴＡＴポリペプチドの活性部位、受容体結合部位、または成長因子もしくは他の関連結合部位に結合し、それにより、ＴＡＴポリペプチドの正常な生物学的活性をブロックする小分子を含む。小分子の例は、限定されるものではないが、小さなペプチドまたはペプチド−様分子、好ましくは可溶性ペプチド、および合成非−ペプチドの有機または無機分子を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列−特異的ハイブリダイゼーション、続いてのヌクレオチド内分解切断によって作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、公知の技術によって同定することができる。さらなる詳細については、例えば、Ｒｏｓｓｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：４６９−４７１（１９９４）、および（１９９７年９月１８日に公開された）ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９７／３３５５１参照。
転写を阻害するのに用いられる三重−ラセン形成された核酸分子は一本鎖であって、デオキシヌクレオチドで構成されるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、一般には、デュプレックスの１つのストランド上にプリンまたはピリミジンの相当の大きさのストレッチを必要とする、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基−対合則を介して三重−ラセン形成を促進するように設計される。更なる詳細については、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９７／３３５５１，ｓｕｐｒａ参照。
これらの小さな分子は、前記したスクリーニングアッセイのいずれかの１以上によって、および／または当業者によく知られたいずれかの他のスクリーニング技術によって同定することができる。
単離されたＴＡＴポリペプチド−コーディング核酸は、ここでは、当業者によく知られた、かつ本明細書中に記載された技術を用いてＴＡＴポリペプチドを組換えにより生産するために用いることができる。今度は、生産されたＴＡＴポリペプチドは、当該分野で良く知られ、かつ本明細書中に記載された技術を用いて抗−ＴＡＴ抗体を作成するために使用することができる。
本明細書中で確認されるＴＡＴポリペプチドに特異的に結合する抗体、ならびに先に開示されたスクリーニングアッセイによって同定される他の分子は、医薬組成物の形態にて、癌を含めた種々の障害の治療のために投与することができる。
もし、ＴＡＴポリペプチドが細胞内であって、全抗体を阻害剤として用いるならば内部化抗体が望ましい。しかしながら、リポフェクションまたはリポソームを用いて、抗体、または抗体断片を細胞に送達することもできる。抗体断片を用いる場合、標的蛋白質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい疎外性断片が好ましい。例えば、抗体の可変−領域配列に基づき、標的蛋白質配列に結合する能力を保有するペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは化学的に合成することができ、および／または組換えＤＮＡ技術によって生産することができる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）参照。
ここに、該処方は治療すべき特定の症状で必要な１を超える活性な化合物、好ましくは、相互に悪影響しない補充的な活性を持つ化合物を含有することもできる。別法として、あるいは加えて、該組成物は、例えば、細胞傷害性剤、サイトカイン、化学療法剤、または成長−阻害剤のようなその機能を高める剤を含むことができる。そのような分子は、適当には、意図した目的で効果的な量で組み合わせて存在させる。
以下の実施例は説明目的のためだけに提供され、断じて、本発明の範囲を限定する意図のものではない。
本明細書中で引用された全ての特許および刊行物文献は、ここに、引用してその全体を援用する。
実施例中で言及される商業的に入手可能な試薬は、特に断りのない限り、製造業者の指示に従って用いた。以下の実施例において確認され、本明細書を通じて、ＡＴＣＣ受託番号によって確認される細胞の源は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡである。
実施例１：ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）を用いる組織発現プロファイリング
その発現が、他の腫瘍および／または正常な組織と比較して注目する特定の腫瘍組織において有意にアップレギュレートされるポリペプチド（およびそれらをコードする核酸）を同定する試みにおいて、遺伝子発現情報を含む所有権があるデータベース（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標），Ｇｅｎｅ Ｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を分析した。具体的には、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）データベースと共に用いるためのＧｅｎｅ Ｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤを通じて入手できるソフトウェア、あるいはＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）データベースと共に用いるためのＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．で書かれ、開発された所有権のあるソフトウェアいずれかを用い、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）データベースの分析を行った。分析における陽性ヒトの率は、例えば、組織特異性、腫瘍特異性、および正常な必須のおよび／または正常な増殖組織における発現レベルを含めたいくつかの基準に基づくものである。以下に、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）データベースの分析から決定されたその組織発現プロファイルは、他の腫瘍および／または正常な組織と比較して特異的腫瘍または複数腫瘍における高い組織発現および発現の有意なアップレギュレーション、および所望により、正常な必須および／または正常な増殖性組織における比較的低い発現を証明する分子のリストを示す。それ自体、以下にリストする分子は、哺乳動物における癌の診断および治療のための優れたポリペプチド標的である。
Figure 2008512121
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 実施例２：癌性腫瘍におけるＴＡＴポリペプチドのアップレギュレーションを検出するためのマイクロアレイ分析
しばしば数千の遺伝子配列を含有する核酸マイクロアレイは、それらの正常なカウンターパートと比較して病気の組織において異なって発現される遺伝子を同定するのに有用である。核酸マイクロアレイを用い、テストおよび対照組織試料からのテストおよび対照ｍＲＮＡ試料を逆転写し、標識してｃＤＮＡプローブを作成する。次いで、ｃＤＮＡプローブを固体支持体に固定化された核酸のアレイにハイブリダイズさせる。アレイは、該アレイの各メンバーの配列および位置が知られているように構成する。例えば、ある種の病気状態で発現されることが知られている遺伝子の選択を、固体支持体上に配列することができる。特定のアレイメンバーと標識されたプローブとのハイブリダイゼーションは、プローブが由来する試料がその遺伝子を発現することを示す。もし、テスト（病気組織）試料からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルが対照（正常な組織）試料からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルよりも大きければ、病気組織において過剰発現される遺伝子または複数遺伝子が同定される。この関係の結果、病気組織における過剰発現された蛋白質は病気状態の存在についての診断マーカーとしてのみならず、病気状態の治療のための治療標的としても有用であることになる。
核酸のハイブリダイゼーションの方法およびマイクロアレイ技術は当該分野で良く知られている。１つの例において、ハイブリダイゼーションのための核酸およびプローブの具体的調製、スライド、およびハイブリダイゼーション条件は、ここに引用して援用する。２００１年３月２０日に出願されたＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／１０４８２において全て詳細に記載されている。
本実施例においては、種々のヒト組織に由来する癌性腫瘍を、特定の癌性腫瘍において過剰発現されるポリペプチドを同定する試みにおいて、異なる組織タイプおよび／または非−癌性ヒト組織からの癌性腫瘍に対するアップレギュレートされた遺伝子発現について調べた。ある実験においては、（しばしば同一患者からの）同一組織タイプの癌性ヒト腫瘍組織および非−癌性ヒト腫瘍組織を入手し、ＴＡＴポリペプチド発現について分析した。加えて、種々の異なるヒト腫瘍のいずれかからの癌性ヒト腫瘍組織を入手し、肝臓、腎臓および肺を含めた上皮起源の非−癌性ヒト組織をプールすることによって調製された「普遍的な」上皮対照試料と比較した。プールされた組織から単離されたｍＲＮＡは、これらの異なる組織からの発現された遺伝子産物の混合物を表す。プールされた対照試料を用いるマイクロアレイハイブリダイゼーション実験により、２−色分析において直線プロットが作成された。次いで、２−色分析において作成された線の傾きを用いて、各実験内で（テスト：対照検出）の比率を正規化した。次いで、種々の実験からの正規化された比率を比較し、これを用いて、遺伝子発現のクラスタリングを同定した。かくして、プールされた「普遍的対照」試料は、単純な２−試料比較において有効な相対的遺伝子発現の判断を可能としたのみならず、いくつかの実験を通じての多数の試料の比較も可能とした。
本実験においては、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドをコードする核酸配列に由来する核酸プローブを、マイクロアレイの作成で用い、種々の腫瘍組織からのＲＮＡをそれに対するハイブリダイゼーションで用いた。以下にこれらの実験の結果を示し、これは、本発明の種々のＴＡＴポリペプチドが、それらの正常なカウンターパート組織と比較して、種々のヒト腫瘍組織で有意に過剰発現されることを示す。さらに、以下に示す分子の全ては、「普遍的」上皮対照におけるのと比較してそれらの特異的腫瘍組織で有意に過剰発現される。前記したように、これらのデータは、本発明のＴＡＴポリペプチドが、１以上の癌性腫瘍の存在についての診断マーカーとして有用であるのみならず、それらの腫瘍の治療のための治療標的として働くことも示す。
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 実施例３：ＴＡＴ ｍＲＮＡ発現の定量的分析
このアッセイにおいては、５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標））およびリアルタイム定量的ＰＣＲ（例えば、ＡＢＩ Ｐｒｉｚｍ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））を用いて、他の癌性腫瘍または正常な非−癌性組織と比較して、癌性腫瘍または複数腫瘍において有意に過剰発現される遺伝子を見出した。５’ヌクレアーゼアッセイ反応は、蛍光ＰＣＲ−ベースの技術であり、これは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を利用して、リアルタイムで遺伝子発現をモニターした。（その配列が当該遺伝子または注目するＥＳＴ配列に基づく）２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲ反応に典型的なアンプリコンを作成する。第３のオリゴヌクレオチド、またはプローブは、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計される。該プローブはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって延長できず、レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素で標識する。レポーター色素からのいずれのレーザー−誘導発光も、２つの色素がプローブ上にあるように一緒に近くに位置する場合、クエンチング色素によって消光される。ＰＣＲ増幅反応の間に、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、鋳型−特異的にプローブを切断する。得られたプローブ断片は溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは、第２のフルオロフォアの消光効果はない。レポーター色素の１つの分子は、合成された各新しい分子について遊離され、消光されないレポーター色素の検出は、データの定量的な解釈のための基礎を提供する。
５’ヌクレアーゼ手法は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ＴＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎのようなリアルタイム定量的ＰＣＲデバイスで行う。該システムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷−結合デバイス（ＣＣＤ）カメラおよびコンピュータよりなる。該システムは、サーモサイクラー上で９６−ウェル様式で試料を増幅する。増幅の間に、レーザー−誘導蛍光シグナルが全ての９６ウェルについてのファイバーオプティックスケーブルを通してリアルタイムで収集され、ＣＣＤにおいて検出される。該システムは、該機器を実行するための、およびデータを分析するためのソフトウェアを含む。
スクリーニング用の出発物質は、種々の異なる癌性組織から単離されたｍＲＮＡであった。ｍＲＮＡは正確に、例えば、フルオロメトリーにより定量される。陰性対照として、ＲＮＡは、テストすべき癌性組織と同一の組織タイプの種々の正常な組織から単離した。
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初に、Ｃｔ、または閾値サイクルとして表す。これは、レポーターシグナルが蛍光のバックグラウンドレベルを超えて蓄積されるサイクルと定義される。ΔＣｔ値は、癌ｍＲＮＡの結果を正常なヒトｍＲＮＡの結果と比較した場合に、核酸試料中の特定の標的配列の出発コピーの相対的な数の定量的測定として用いられる。１つのＣｔ単位は、１ ＰＣＲサイクル、あるいは正常に対してほぼ２倍の相対的増加に対応し、２つの単位は４倍の相対的増加に対応し、３つの単位は８倍の相対的増加に対応し、および順次そのように対応するので、２以上の異なる組織の間のｍＲＮＡ発現の相対的倍増加を定量的に測定することができる。この技術を用い、以下にリストする分子は、（同一および異なる組織ドナー双方からの）それらの正常な非−癌性カウンターパート組織と比較して、特定の腫瘍において有意に過剰発現されると同定されており、かくして、哺乳動物における癌の診断および治療のための優れたポリペプチド標的を表す。
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 実施例４：イン・サイチュハイブリダイゼーション
イン・サイチュハイブリダイゼーションは、細胞または組織調製物内の核酸配列の検出および突止用の強力かつ多様な技術である。例えば、遺伝子発現の部位を同定し、転写の組織分布を分析し、ウイルス感染を同定し、突き止め、特異的なｍＲＮＡ合成の変化を追跡し、および染色体マッピングを援助するのに有用であろう。
イン・サイチュハイブリダイゼーションは、検出すべき標的配列に対する相同性を有するＰＣＲで生じた３３Ｐ−標識リボプローブを用い、Ｌｕ ａｎｄ Ｇｉｌｌｅｔｔ，Ｃｅｌｌ Ｖｉｓｉｏｎ １：１６９−１７６（１９９４）によるプロトコルの最適化されたバージョンに従って実行した。簡単に述べれば、ホルマリン固定されたパラフィン−包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィン化し、プロテイナーゼＫ２０ｇ／ｍｌにて３７℃にて１５分間除蛋白し、Ｌｕ ａｎｄ Ｇｉｌｌｅｔｔ，ｓｕｐｒａによって記載されているイン・サイチュハイブリダイゼーションのためにさらに処理した。［３３−Ｐ］ＵＴＰ−標識アンチセンスリボプローブはＰＣＲ産物から作成し、５５℃にて一晩ハイブリダイズさせた。スライドをＫｏｄａｋ ＮＴＢ２核トラックエマルジョンに浸漬し、４週間暴露した。
３３Ｐ−リボプローブ合成
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の３３Ｐ−ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｃｈａｍ ＢＦ １００２、ＳＡ＜２０００ Ｃｉ／ミリモル）をｓｐｅｅｄ ｖａｃ乾燥した。乾燥した３３Ｐ−ＵＴＰを含有する各チューブに、以下の成分を加えた：
２．０μｌの５×転写緩衝液
１．０μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）
２．０μｌのＮＴＰミックス（２．５ｍＭ：１０μ；１０ｍＭ ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＡＴＰの各々＋１０μｌのＨ２Ｏ）
１．０μｌのＵＴＰ（５０μＭ）
１．０μｌのＲｎａｓｉｎ
１．０μｌのＤＮＡ鋳型（１μｇ）
１．０μｌのＨ２Ｏ
１．０μｌＲＮＡポリメラーゼ（通常、ＰＣＲ産物Ｔ３＝ＡＳ、Ｔ７＝Ｓのため）
チューブを３７℃にて１時間インキュベートした。１．０μｌのＲＱ１ ＤＮａｓｅを加え、続いて、３７℃にて１５分間インキュベートした。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭトリスｐＨ ７．６／１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を加え、混合物をＤＥ８１紙の上にピペットで移した。残存する溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−５０限外濾過ユニットに負荷し、プログラム１０を用いて回転させた（６分）。濾過ユニットを第二のチューブ上に逆さにし、プログラム２を用いて回転させた（３分）。最終回収回転の後、１００μｌのＴＥを加えた。１μｌの最終産物をＤＥ８１紙上にピペットで移し、６ｍｌのＢｉｏｆｌｕｏｒ ＩＩ中でカウントした。
プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で泳動させた。１ないし３μｌのプローブまたは５μｌのＲＮＡ Ｍｒｋ ＩＩＩを３μｌの負荷緩衝液に加えた。９５℃の加熱ブロック上で３分間過熱した後、プローブを直ちに氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシュし、試料を負荷し、１８０ないし２５０ボルトで４５分間泳動させた。ゲルをサランラップ中に包み、−７０℃のフリーザー中で増感スクリーンにてＸＡＲフィルムに１時間ないし一晩暴露した。
３３Ｐ−ハイブリダイゼーション
Ａ．凍結したセクションの予備処理
スライドをフリーザーから取り出し、アルミニウムトレイ上に置き、室温で５分間解凍した。トレイを５５℃のインキュベーター中に５分間おいて、凝縮を低下させた。スライドをヒュームフード中で氷上の４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、０．５×ＳＳＣ中で室温にて５分間洗浄した（２５ｍｌ ２０×ＳＳＣ＋９７５ｍｌ ＳＱ Ｈ２Ｏ）。０．５μｌ／ｍｌプロテイナーゼＫ中での３７℃における「１０分間の除蛋白後に（２５０ｍｌの予め加温したＲＮａｓｅ−フリーＲＮＡｓｅ緩衝液中の１２．５μｌの１０ｍｇ／ｍｌストック）、セクションを０．５×ＳＳＣ中で室温にて１０分間洗浄した。セクションを７０％、９５％、１００％エタノール中で各々２分間脱水した。
Ｂ．パラフィン−包埋セクションの予備処理
スライドを脱パラフィン化し、ＳＱ Ｈ２Ｏ中に置き、２×ＳＳＣ中で室温にて毎回５分間２回濯いだ。セクションを２０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ−フリーＲＮａｓｅ緩衝液中の５００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ；３７℃，１５分）−ヒト胚、または８×プロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ緩衝液中１００μｌ，３７℃，３０分）−ホルマリン組織中で除蛋白した。０．５×ＳＳＣＳ中での引き続いての濯ぎおよび脱水を前記したように行った。
Ｃ．プレハイブリダイゼーション
スライドを、Ｂｏｘ緩衝液（４×ＳＳＣ，５０％ホルムアルデヒド）−飽和濾紙でライニングしたプラスチックボックス中に置いた。
Ｄ．ハイブリダイゼーション
スライド当たり１．０×１０６ｃｐｍのプローブおよび１．０μｌのｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を９５℃にて３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、４８μｌのハイブリダイゼーション緩衝液をスライド当たり加えた。ボルテキシングの後、５０μｌの３３Ｐミックスをスライド上の５０μｌのプレハイブリダイゼーションに加えた。スライドを５５℃にて一晩インキュベートした。
Ｅ．洗浄
洗浄は室温にて２×ＳＳＣ、ＥＤＴＡ（４００ｍｌの２０×ＳＳＣ＋１６ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ，Ｖｆ＝４Ｌ）で２×１０分行い、続いて、３７℃にて３０分間ＲＮａｓｅＡ処理した（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ緩衝液中の５００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを２×ＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温にて２×１０分洗浄した。ストリンジェンシー洗浄条件は以下の通りであった：５５℃にて２時間、０．１×ＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０×ＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ，Ｖｆ＝４Ｌ）。
Ｆ．オリゴヌクレオチド
イン・サイチュ分析は、本明細書中に開示された種々のＤＮＡ配列で行った。これらの分析で使用したオリゴヌクレオチドは、添付の図面に示した核酸に対して相補的であるように得られた（その相補体）。
Ｅ．結果
イン・サイチュ分析は本明細書中に開示された種々のＤＮＡ配列で行った。これらの分析からの結果を以下に示す。
（１）ＤＮＡ９５９３０（ＴＡＴ１１０）
１つの分析において、有意な発現は３／３肺腫瘍、３／３結直腸腺癌、１／１前立腺癌、３／３転移細胞癌腫および３／３子宮内膜腺癌で観察され、ここに、カウンターパート正常組織における発現のレベルは有意により低い。
第二の独立した分析において、有意な発現は７／７子宮内膜および１２／１５卵巣腺癌で観察され、ここに、カウンターパート正常組織における発現のレベルは有意により低い。
第三の独立した分析において、有意な発現は２４／２６結直腸腫瘍試料で観察され、ここに、カウンターパート正常組織における発現のレベルは有意により低い。
最後に、第四の独立した分析において、発現は非−悪性前立腺組織の８／２６試料、原発性前立腺癌の５５／８２試料、および転移性前立腺癌の５／２３試料において観察される。
（２）ＤＮＡ９５９３０−１（ＴＡＴ２１０）
１つの分析において、有意な発現は３／３肺腫瘍、３／３結直腸腺癌、１／１前立腺癌、３／３転移細胞癌腫および３／３子宮内膜腺癌で観察され、ここに、カウンターパート正常組織における発現のレベルは有意により低い。
第二の独立した分析において、有意な発現は７／７子宮内膜および１２／１５卵巣腺癌で観察され、ここに、カウンターパート正常組織における発現のレベルは有意により低い。
第三の独立した分析において、有意な発現は２４／２６結直腸腫瘍試料で観察され、ここに、カウンターパート正常組織における発現のレベルは有意により低い。
最後に、第四の独立した分析において、発現は非−悪性前立腺組織の８／２６試料、原発性前立腺癌の５５／８２試料、および転移性前立腺癌の５／２３試料において観察される。
（３）ＤＮＡ９６９３０（ＴＡＴ１１２）
結直腸癌における強力な発現。悪性上皮での発現は隣接する良性上皮におけるよりも有意に強く見える。加えて、強力な発現がテストした膵臓腺癌の２３試料の全ての２３で観察され、ここに、正常な膵臓組織における発現は検出できない。
（４）ＤＮＡ９６９３６（ＴＡＴ１４７）
１つの分析において、強く陽性のシグナルが６／６乳房腫瘍で観察された。もう１つの独立した分析において、陽性シグナルが４／４非小細胞肺癌腫で観察され、ここに、腫瘍は正常な肺と比較してより強い発現を有するように見える。１／１子宮内膜腺癌は強い発現を示し、３／３結直腸腺癌は可変発現を示す。
（５）ＤＮＡ１０８８０９（ＴＡＴ１１４）
テストした全ての腎臓細胞癌腫（ｎ＝３）において陽性シグナル。他方、正常な腎臓組織において発現は観察されない。加えて、陽性発現が５／１２胃腫瘍、５／２４結直腸腫瘍、３／８膵臓腫瘍および１／３肺腫瘍で観察される。正常な非−癌性組織発現は胃および小腸に制限される。
（６）ＤＮＡ１７６７６６（ＴＡＴ１３２）
テストした全ての子宮内膜腺癌（ｎ＝３）において陽性シグナル。他方、正常な子宮内膜組織において発現は観察されない。
（７）ＤＮＡ２３６４６３（ＴＡＴ１５０）
テストした全ての子宮内膜腺癌（ｎ＝３）において陽性シグナル。他方、正常な子宮内膜組織において発現は観察されない。
（８）ＤＮＡ１８１１６２（ＴＡＴ１２９）
新形成前立腺上皮は一般には陽性であり、シグナル強度は症例の間で弱いから強いまで変化する。非−前立腺組織は陰性である。
（９）ＤＮＡ１８８２２１（ＴＡＴ１１１）
悪性上皮にわたって結腸マルチ−腫瘍アレイにおいて強力なシグナルが見られる。正常な組織において、ある種のプローブは結腸陰窩の下方２／３をライニングする上皮細胞にわたって特異的シグナルを与え、シグナルの強度は結腸癌種におけるよりも有意により低く見えた。１２／１８結直腸腺癌、６／８転移性腺癌および２／９胃腺癌において陽性発現が観察される。
（１０）ＤＮＡ２３３８７６（ＴＡＴ１４６）
悪性上皮にわたって結腸マルチ−腫瘍アレイにおいて強力なシグナルが見られる。正常な組織において、ある種のプローブは結腸陰窩の下方２／３をライニングする上皮細胞にわたって特異的シグナルを与え、シグナルの強度は結腸癌種におけるよりも有意により低く見えた。１２／１８結直腸腺癌、６／８転移性腺癌および２／９胃腺癌において陽性発現が観察される。
（１１）ＤＮＡ２１０４９９（ＴＡＴ１２３）
１つの分析において、１２／１４卵巣腺癌は陽性であって、８／９子宮内膜腺癌は陽性である。正常な卵巣支質は子宮筋層のように陰性である。他の正常な卵巣および子宮組織は陰性である。
独立した分析において、１６／２７非小細胞肺癌腫は陽性であり、ここに、シグナルは中程度または強い。
（１２）ＤＮＡ２１９８９４（ＴＡＴ２１１）
１つの分析において。１２／１４卵巣腺癌は陽性であって、８／９子宮内膜腺癌は陽性である。正常な卵巣支質は子宮筋層のように陰性である。他の正常な卵巣および子宮組織は陰性である。
独立した分析において、１６／２７非小細胞肺癌腫は陽性であり、ここに、シグナルは中程度または強い。
（１３）ＤＮＡ２１５６０９（ＴＡＴ１１３）
強力なシグナルが結腸癌腫で観察され、正常な結腸では非常に低いレベルのシグナルに過ぎない。肺および乳房癌腫は陰性であった。
（１４）ＤＮＡ２２０４３２（ＴＡＴ１２８）
この遺伝子を発現する唯一の正常な成人組織は前立腺上皮である。発現は中程度ないし強い強度のものであって、病巣であり、それは過形成上皮においてより顕著である。
原発性前立腺癌の５０の症例は入手可能である１つの分析において、２９の症例（５８％）は陽性であり、１８の症例（３６％）は陰性であって、３症例（６％）ははっきりとしない。原発性前立腺癌の３７症例がレビューのために入手可能なもう１つの分析において、３３症例（８９％）は陽性であり、４つの症例（１１％）は陰性である。最後に、転移性前立腺癌の２７症例がレビューのために入手可能なもう１つの独立した分析において、１４症例（５２％）は陽性であり、１１の症例（４１％）は陰性であって、２つの症例（７％）ははっきりしない。
（１５）ＤＮＡ２２６２３７（ＴＡＴ１１７）
１つの分析において、３つの腎臓細胞癌腫の２つは陽性であり、ここに、正常な腎臓発現は陰性である。
（１６）ＤＮＡ２４６４５０（ＴＡＴ１６８）
１つの分析において、３つの腎臓細胞癌腫の２つは陽性であり、ここに、正常な腎臓発現は陰性である。
（１７）ＤＮＡ２２７０８７（ＴＡＴ１６３）
この分子についてのプローブは、肺、乳房、結腸、膵臓および子宮内膜癌腫の全てのテストした症例において、腫瘍−関連支質細胞の亜集団において陽性シグナルを示した。標識の強度はしばしばかなり強かった。隣接良性結腸での結腸腺癌の症例においては、標識は腫瘍−関連支質に制限され、正常な良性組織は陰性であった。乳房芽細胞の種もまたサブ上皮支質細胞の標識を示した。
（１８）ＤＮＡ２６６３０７（ＴＡＴ２２７）
この分子についてのプローブは、肺、乳房、結腸、膵臓および子宮内膜癌腫の全てのテストした症例において、腫瘍−関連支質細胞の亜集団において陽性シグナルを示した。標識の強度はしばしばかなり強かった。隣接良性結腸での結腸腺癌の症例においては、標識は腫瘍−関連支質に制限され、正常な良性組織は陰性であった。乳房芽細胞の種もまたサブ上皮支質細胞の標識を示した。
（１９）ＤＮＡ２６６３１１（ＴＡＴ２２８）
この分子についてのプローブは、肺、乳房、結腸、膵臓および子宮内膜癌腫の全てのテストした症例において、腫瘍−関連支質細胞の亜集団において陽性シグナルを示した。標識の強度はしばしばかなり強かった。隣接良性結腸での結腸腺癌の症例においては、標識は腫瘍−関連支質に制限され、正常な良性組織は陰性であった。乳房芽細胞の種もまたサブ上皮支質細胞の標識を示した。
（２０）ＤＮＡ２６６３１２（ＴＡＴ２２９）
この分子についてのプローブは、肺、乳房、結腸、膵臓および子宮内膜癌腫の全てのテストした症例において、腫瘍−関連支質細胞の亜集団において陽性シグナルを示した。標識の強度はしばしばかなり強かった。隣接良性結腸での結腸腺癌の症例においては、標識は腫瘍−関連支質に制限され、正常な良性組織は陰性であった。乳房芽細胞の種もまたサブ上皮支質細胞の標識を示した。
（２１）ＤＮＡ２６６３１３（ＴＡＴ２３０）
この分子についてのプローブは、肺、乳房、結腸、膵臓および子宮内膜癌腫の全てのテストした症例において、腫瘍−関連支質細胞の亜集団において陽性シグナルを示した。標識の強度はしばしばかなり強かった。隣接良性結腸での結腸腺癌の症例においては、標識は腫瘍−関連支質に制限され、正常な良性組織は陰性であった。乳房芽細胞の種もまたサブ上皮支質細胞の標識を示した。
（２２）ＤＮＡ２２７２２４（ＴＡＴ１２１）
発現は３つの子宮内膜腺癌の２つにおいて観察される。
（２３）ＤＮＡ２４７４８６（ＴＡＴ１８３）
発現は３つの子宮内膜腺癌の２つにおいて観察される。
（２４）ＤＮＡ２２７８００（ＴＡＴ１３１）
１つの分析において、４６／６４原発性前立腺癌は陽性であって、６／１４転移性前立腺癌は陽性である。弱いないし中程度の発現が前立腺上皮で観察される。
（２５）ＤＮＡ２２８１９９（ＴＡＴ１２７）
発現は１５の卵巣腫瘍（腺癌および表面上皮腫瘍）の１３で観察される。両性の卵巣表面上皮もまた陽性である。ほとんどの陽性腫瘍における発現レベルは強力または中程度であって、かなり均一である。発現は９つの子宮腺癌の８つにおいても観察される。２３の非小細胞肺癌腫の７つは陽性である。
（２６）ＤＮＡ２２８２０１（ＴＡＴ１１６）
１３／１６結直腸腺癌の悪性細胞はＴＡＴ１１６発現について陽性である。加えて、９／１０転移性腺癌は発現について陽性である。発現は正常な結腸陰窩の基底部分でも観察される。
（２７）ＤＮＡ２４７４８８（ＴＡＴ１８９）
１３／１６結直腸腺癌の悪性細胞はＴＡＴ１８９発現について陽性である。加えて、９／１０転移性腺癌は発現について陽性である。発現は正常な結腸陰窩の基底部分でも観察される。
（２８）ＤＮＡ２３６５３８（ＴＡＴ１９０）
１３／１６結直腸腺癌の悪性細胞はＴＡＴ１９０発現について陽性である。加えて、９／１０転移性腺癌は発現について陽性である。発現は正常な結腸陰窩の基底部分でも観察される。
（２９）ＤＮＡ２４７４８９（ＴＡＴ１９１）
１３／１６結直腸腺癌の悪性細胞はＴＡＴ１９１発現について陽性である。加えて、９／１０転移性腺癌は発現について陽性である。発現は正常な結腸陰窩の基底部分でも観察される。
（３０）ＤＮＡ２２８９９４（ＴＡＴ１２４）
非小細胞肺癌腫の６１症例のうち１３はＴＡＴ１２４の発現について陽性である。これらの陽性腫瘍試料における発現レベルは正常な成人組織において有意により高い。
（３１）ＤＮＡ２３１５４２（ＴＡＴ１００）
前記したように行ったイン・サイチュ分析は、正常な脳（および他の）組織と比較して、ヒト神経膠腫および神経膠芽細胞腫組織において有意にアップレギュレートされた発現を証明する。
（３２）ＤＮＡ２３１５４２−１（ＴＡＴ２８４）
前記したように行ったイン・サイチュ分析は、正常な脳（および他の）組織と比較して、ヒト神経膠腫および神経膠芽細胞腫組織において有意にアップレギュレートされた発現を証明する。
（３３）ＤＮＡ２３１５４２−２（ＴＡＴ２８５）
前記したように行ったイン・サイチュ分析は、正常な脳（および他の）組織と比較して、ヒト神経膠腫および神経膠芽細胞腫組織において有意にアップレギュレートされた発現を証明する。
（３４）ＤＮＡ２９７３９３（ＴＡＴ２８５−１）
前記したように行ったイン・サイチュ分析は、正常な脳（および他の）組織と比較して、ヒト神経膠腫および神経膠芽細胞腫組織において有意にアップレギュレートされた発現を証明する。
（３５）ＤＮＡ２３６５３４（ＴＡＴ１０２）
ＴＡＴ１０２の発現は、１５の卵巣上皮悪性疾患（腺癌、上皮細胞腫瘍、子宮内膜Ｃａ）の１４で観察される。また、子宮の９つの子宮内膜腺癌のうち８つはＴＡＴ１０２を発現する。さらに、ＴＡＴ１０２の発現は２７の非−小細胞肺癌の２４で観察され、陽性症例は扁平および腺癌を含む。これらの腫瘍組織における発現は、それらの正常組織カウンターパートにおけるよりも有意に高い。
（３６）ＤＮＡ２４６４３０（ＴＡＴ１０９）
９２の乳房腫瘍試料のうちの１４はＴＡＴ１０９発現について陽性である。全ての正常な組織における発現は検出可能よりも低い。
（３７）ＤＮＡ２６４４５４（ＴＡＴ１０６）
ＴＡＴ１０６の発現は３８／８８乳房腫瘍で観察される。正常な乳房組織における発現は弱い、または検出可能以下である。
（３８）ＤＮＡ９８５６５（ＴＡＴ１４５）
ＴＡＴ１４５についての陽性シグナルはほとんどの神経膠腫、神経膠芽細胞腫、いくつかのメラノーマ、および（主として神経膠星状細胞に局所化された）正常な脳で観察された。神経膠芽細胞腫におけるシグナル強度は、正常な神経膠星状細胞におけるよりも高いように見えた。テストした神経膠腫および神経膠芽細胞腫試料の大部分はＴＡＴ１４５発現について陽性であったが、テストした正常な脳試料の大部分はそのような発現について陰性であった。
（３９）ＤＮＡ２４６４３５（ＴＡＴ１５２）
ＴＡＴ１５２についての陽性シグナルはほとんどの神経膠芽細胞腫、いくつかのメラノーマ、および（主として神経膠星状細胞に局所化された）正常な脳で観察された。神経膠芽細胞腫におけるシグナル強度は、正常な神経膠星状細胞におけるよりも高いように見えた。テストした神経膠腫および神経膠芽細胞腫試料の大部分はＴＡＴ１５２発現について陽性であったが、テストした正常な脳試料の大部分はそのような発現について陰性であった。
（４０）ＤＮＡ１６７２３４（ＴＡＴ１３０）
前立腺の原発性腺癌の７０症例はレビューのために利用可能であった。これらの７０の症例のうち、５６症例（８０％）はＴＡＴ１３０発現について陽性である。非−前立腺組織におけるＴＡＴ１３０発現は弱いまたは検出可能以下である。
（４１）ＤＮＡ２３５６２１（ＴＡＴ１６６）
前立腺の原発性腺癌の７０症例がレビューのために入手可能であった。これらの７０の症例のうち、５６症例（８０％）がＴＡＴ１６６発現で陽性である。非−前立腺腫瘍におけるＴＡＴ１６６発現は弱いまたは検出可能以下である。
（４２）ＤＮＡ２３６４９３（ＴＡＴ１４１）
陽性発現は７０／１４８乳房癌腫、２／６３結直腸腺癌、４／４２卵巣腫瘍、９／６９非小細胞肺癌腫、９／６７前立腺腺癌および５／２５神経膠細胞腫において観察される。正常な非−癌性組織における発現は前立腺および乳房上皮に制限されるように見える。
（４３）ＤＮＡ２２６０９４（ＴＡＴ１６４）
３７の神経膠芽細胞腫試料のうち２１、および８つの神経膠腫試料はＴＡＴ１６４発現で陽性であり、他方、（正常な脳組織を含めた）調べた全ての他の腫瘍および正常な組織は陰性であった。
（４４）ＤＮＡ２２７５７８（ＴＡＴ１６５）
テストした２５の神経膠芽細胞腫試料のうち１５は発現につき陽性であったが、有意により弱い発現がテストした正常な脳試料で観察された。
実施例５：免疫組織化学分析
本明細書中で開示されたある種のＴＡＴポリペプチドに対する抗体を調製し、免疫組織化学分析を以下のように行った。組織セクションをまずアセトン／エタノール中で５分間固定した（凍結またはパラフィン−包埋）。次いで、セクションをＰＢＳ中で洗浄し、次いで、アビジンおよびビオチン（ベクターキット）で１０分間ブロックし、各々、続いてＰＢＳ中で洗浄する。次いで、セクションを１０％血清で２０分間ブロックし、次いで、ブロットして、過剰なものを除去した。次いで、初代抗体を１時間で１０μｇ／ｍｌの濃度でセクションに加え、次いで、セクションをＰＢＳ中で洗浄する。次いで、ビオチニル化二次抗体（抗−初代抗体）を３０分間でセクションに加え、次いで、セクションをＰＢＳで洗浄した。次いで、セクションをＶｅｃｔｏｒ ＡＢＣキットの試薬に３０分間暴露し、次いで、セクションをＰＢＳ中で洗浄した。次いで、セクションをジアミノベンジジン（Ｐｉｅｒｃｅ）に５分間暴露し、次いで、ＰＢＳ中で洗浄した。次いで、セクションをＭａｙｅｒｓヘマトキシリンで逆染色し、カバーグラスで被覆し、可視化した。免疫組織化学分析は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ ３．１６、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９７）に記載されているように行うこともできる。これらの分析からの結果を以下に示す。
（１）ＤＮＡ９６９３０（ＴＡＴ１１２）
有意により高い発現が、正常な結腸陰窩の先端表面よりも、結腸腫瘍の結腸陰窩の先端表面で検出された。加えて、ＴＡＴ１１２は、正常な前立腺細胞と比較して膵臓腺癌細胞において有意に過剰発現されることが判明した。最後に、前記したように行ったＩＨＣ分析は、ＴＡＴ１１２が正常な肺組織と比較して肺癌腫において、正常な肺組織と比較して非小細胞肺癌腫において、および正常な胃組織と比較して胃癌腫において有意に過剰発現されることを証明した。
（２）ＤＮＡ２２６５３９（ＴＡＴ１２６）
陽性発現は２／１０子宮腺癌，９／１７卵巣腺癌および２／２０非小細胞肺癌腫で観察される。この手法を用い、ＴＡＴ１２６の発現はいずれの正常な細胞においても観察できなかった。
（３）ＤＮＡ２３６５１１（ＴＡＴ１５１）
陽性発現は２／１０子宮腺癌，９／１７卵巣腺癌および２／２０非小細胞肺癌腫で観察される。この手法を用い、ＴＡＴ１５１の発現はいずれの正常な細胞においても観察できなかった。
実施例６：ＧＥＰＩＳによる異なるＴＡＴポリペプチド発現の確証および分析
前記した実施例の１以上で記載された腫瘍抗原として同定することができるＴＡＴポリペプチドを分析し、以下のように確証した。発現された配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標），Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）をサーチし、興味深いＥＳＴ配列をＧＥＰＩＳによって同定した。インシリコでの遺伝子発現プロファイリング（ＧＥＰＩＳ）は、新しい癌治療標的のための興味深い遺伝子を特徴付けるＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．で開発されたバイオインフォマティクツールである。ＧＥＰＩＳは多量のＥＳＴ配列およびライブラリ情報を利用して、遺伝子発現のプロフィールを決定する。ＧＥＰＩＳは、ＥＳＴデータベースにおけるその出現の数とのその比例した相関に基づいて遺伝子の発現プロフィールを決定することができ、それは、ストリンジェントかつ統計学的に意味のある方法で、ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）ＥＳＴ合理的データベースおよびＧｅｎｅｎｔｅｃｈの所有権のある情報を一体化することによって働く。本実施例において、ＧＥＰＩＳは非常に特異的な分析または広いスクリーニング仕事いずれかを行うように構成できるが、ＧＥＰＩＳを用いて、新規な腫瘍抗原を同定し、交差−有効化する。最初のスクリーニングにおいて、ＧＥＰＩＳを用いて、特定の組織または興味深い組織（しばしば、興味深い腫瘍組織）における発現に相関させるＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）データベースからＥＳＴ配列を同定する。次いで、この最初のスクリーニングで同定されたＥＳＴ配列（または整列多重関連から得られたコンセンサス配列、および最初のスクリーニングから得られた重複ＥＳＴ配列）を意図したスクリーニングに付して、コードされた蛋白質における少なくとも１つの膜貫通ドメインの存在を同定した。最後に、ＧＥＰＩＳを使用して、興味深い種々の配列についての完全な組織発現プロフィールを作り出した。このタイプのスクリーニングバイオインフォーマティックスを用い、種々のＴＡＴポリペプチド（およびそれらをコードする核酸分子）は、他の癌および／または正常な非−癌性組織と比較して、特定のタイプの癌またはある種の癌において有意に過剰発現すると同定された。ＧＥＰＩＳヒトの率は、例えば、組織特異性、腫瘍特異性、および正常な必須および／または正常な増殖する組織における発現レベルを含めた、いくつかの基準に基づく。以下に、ＧＥＰＩＳによって測定されたその組織発現プロフィールが、他の腫瘍および／または正常組織と比較して特定の腫瘍または複数腫瘍における高い組織発現および発現の有意なアップレギュレーション、および所望により、正常な必須および／または正常な増殖性組織における比較的低い発現を証明するリストを示す。それ自体、以下にリストする分子は、哺乳動物における癌の診断および治療のための優れたポリペプチド標的である。
Figure 2008512121
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 実施例７：ハイブリダイゼーションプローブとしてのＴＡＴの使用
以下の方法は、すなわち、哺乳動物における腫瘍の存在の診断用のハイブリダイゼーションプローブとしてのＴＡＴをコードするヌクレオチド配列の使用を記載する。
本明細書中に開示される全長または成熟ＴＡＴのコーディング配列を含むＤＮＡは、プローブとしても使用されて、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリまたはヒト組織ゲノムライブラリにおいて（天然に生じるＴＡＴの変種をコードするもののような）相同ＤＮＡについてスクリーニングすることができる。
いずれかのライブラリＤＮＡを含有するフィルターのハイブリダイゼーションおよび洗浄は、以下の高ストリンジェンシー条件下で行う。放射性標識ＴＡＴ−由来プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２×デンハルトの溶液、および１０％デキストラン硫酸の溶液中で４２℃にて２０時間行う。フィルターの洗浄は、４２℃にて０．１× ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの水溶液中で行う。
全長天然配列ＴＡＴをコードするＤＮＡに対する所望の配列同一性を有するＤＮＡを、次いで、当該分野で公知の標準的な技術を用いて同定することができる。
実施例８：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＴＡＴの発現
本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換え発現によるＴＡＴのグルコシル化されていない形態の調製を説明する。
ＴＡＴをコードするＤＮＡ配列は、選択されたＰＣＲプライマーを用いてまず増幅する。プライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含有する基である。種々の発現ベクターを使用することができる。適当なベクターの例は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含有する（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する；Ｂｏｌｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２：９５（１９７７））ｐＢＲ３２２である。該ベクターを制限酵素で消化し、脱リン酸化する。次いで、ＰＣＲ増幅配列をベクターに連結する。ベクターは、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモータ、（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、およびエンテロキナーゼ切断部位を含めた）ポリｈｉｓリーダー、ＴＡＴコーディング領域、ラムダ転写ターミネーター、およびａｒｇＵ遺伝子をコードする配列を含むであろう。
次いで、連結混合物を用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａに記載された方法を用いて選択されたＥ．ｃｏｌｉ株を形質転換する。形質転換体を、ＬＢプレート上で増殖する能力によって同定し、次いで、抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、制限分析およびＤＮＡ配列決定によって確認することができる。
選択されたクローンを、抗生物質を補足したＬＢブロスのような液体培養基中で一晩増殖させることができる。一晩培養を引き続いて用いて、より大きな規模の培養を接種することができる。次いで、細胞を所望の光学密度まで増殖し、その間に、発現プロモータのスイッチを入れる。
細胞をさらに７時間培養した後、細胞を遠心によって収穫することができる。遠心によって得られた細胞ペレットを当該分野で知られた種々の剤を用いて可溶化することができ、次いで、蛋白質の密接な結合を可能とする条件下で金属キレート化カラムを用いて精製することができる。
ＴＡＴは、以下の手法を用いて、ポリ−Ｈｉｓタグド形態にてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させることができる。選択されたＰＣＲプライマーを用いて、ＴＡＴをコードするＤＮＡをまず増幅する。プライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位、および効果的かつ信頼できる翻訳開始、金属キレート化カラムでの迅速な精製、およびエンテロキナーゼでの蛋白質分解除去を供する他の有用な配列を含むであろう。次いで、ＰＣＲ増幅されたポリ−Ｈｉｓタグド配列を発現ベクターに連結し、これを用いて、株５２（Ｗ３１１０ ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ） ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ）ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ）に基づくＥ．ｃｏｌｉ宿主を形質転換する。形質転換体を、まず、３ないし５のＯ．Ｄ．６００に到達するまで、振盪しつつ３０℃において５０ｍｇ／ｍｌカルベニシリンを含有するＬＢ中で増殖させる。次いで、培養を、３．５７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓｅ、ならびに１１０ｍＭ ＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび７ｍＭ ＭｇＳＯ４を混合することによって調製された）ＣＲＡＰ培地に５０ないし１００倍希釈し、振盪しつつ、３０℃にてほぼ２０ないし３０時間増殖させる。試料を取り出して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって発現を確認し、バルク培養を遠心して、細胞をペレット化する。細胞ペレットを精製および再折畳みまで凍結する。
０．５ないし１Ｌ醗酵からのＥ．ｃｏｌｉペースト（６ないし１０ｇのペレット）を７Ｍグアニジン、２０ｍＭトリス、ｐＨ８緩衝液中に１０容量（ｗ／ｖ）にて再懸濁させる。固体亜硫酸ナトリウムおよびテトラチオン酸ナトリウムを加えて、各々、０．１Ｍおよび０．０２Ｍの最終濃度とし、溶液を４℃にて一晩攪拌する。この工程の結果、全てのシステイン残基がスルフィトール化によってブロックされた変性蛋白質が得られる。該溶液をＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ中で４０，０００ｒｐｍにて３０分間遠心する。上清を３ないし５容量の金属キレートカラム緩衝液（６Ｍグアニジン、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４）で希釈し、０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過して、清澄化する。清澄化された抽出物を、金属キレートカラム緩衝液中で平衡化した５ｍｌのＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムに負荷する。カラムを、５０ｍＭのイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｕｔｒｏｌグレード）、ｐＨ７．４を含有するさらなる緩衝液で洗浄する。蛋白質を、２５０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液で溶出する。所望の蛋白質を含有する画分をプールし、４℃にて貯蔵する。そのアミノ酸配列に基づき、計算された消光係数を用い、蛋白質濃度を２８０ｎｍにおけるその吸光度によって見積もる。
試料を、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．６、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２．５Ｎ尿素、５ｍＭシステイン、２０ｍＭグリシンおよび１ｍＭ ＥＤＴＡよりなる新たに調製された再折畳み緩衝液にゆっくりと希釈することによって、蛋白質を再度折り畳む。再折畳み容量を、最終蛋白質濃度が５０ないし１００マイクログラム／ｍｌの間となるように選択する。再折畳み溶液を４℃にて軽く１２ないし３６時間攪拌する。再折畳み反応は、ＴＦＡの０．４％の最終濃度までの添加（ほぼ３のｐＨ）によってクエンチする。蛋白質のさらなる精製前に、溶液を０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを２ないし１０％最終濃度まで加える。再度折り畳まれた蛋白質を、１０ないし８０％のアセトニトリルのグラジエントで溶出する、０．１％ＴＦＡの移動緩衝液を用いるＰｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ逆相カラムでのクロマトグラフィーに付す。Ａ２８０吸光度での画分のアリコットをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、均一な再度折り畳まれた蛋白質を含有する画分をプールする。一般に、殆どの蛋白質の適切に再度折り畳まれた種は、アセトニトリルの最低濃度で溶出する。というのは、それらの種は、逆相樹脂との相互作用から守られた疎水性内部と最も緊密だからである。凝集した種は、通常、より高いアセトニトリル濃度で溶出される。所望の形態から蛋白質の誤って折り畳まれた形態を分解するに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンを除去もする。
所望の折り畳まれたＴＡＴポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に向けられた窒素の温和な流れを用いてアセトニトリルを除去する。蛋白質は、透析によって、処方緩衝液中にて平衡化されたＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いるゲル濾過によって、０．１４Ｍ塩化ナトリウムおよび４％マンニトールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ６．８に処方し、滅菌濾過する。
本明細書中で開示されたある種のＴＡＴポリペプチドは首尾よく発現され、この技術を用いて精製される。
実施例９：哺乳動物細胞におけるＴＡＴの発現
本実施例は、哺乳動物細胞における組換え発現によるＴＡＴの潜在的にグリコシル化された形態の調製を説明する。
ベクターｐＲＫ５（１９８９年３月１５日に公開されたＥＰ ３０７，２４７参照）を発現ベクターとして使用する。所望により、ＴＡＴ ＤＮＡを、選択された制限酵素でｐＲＫ５に連結して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａに記載されているような連結方法を用いるＴＡＴ ＤＮＡの挿入を可能とする。得られたベクターをｐＲＫ５−ＴＡＴと呼ぶ。
１つの具体例において、選択された宿主細胞は２９３細胞であってよい。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、胎児子牛血清および、所望により、栄養素成分および／または抗生物質を補足したＤＭＥＭのような培地での組織培養プレートで密集するまで増殖させる。約１０μｇのｐＲＫ５−ＴＡＴ ＤＮＡを、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子［Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３１：５４３（１９８２）］をコードする約１μｇのＤＮＡと混合し、５００μＬの１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ ＣａＣｌ２に溶解させる。この混合物に５０μＬの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．３５）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＮａＰＯ４を滴下し、沈殿を２５℃にて１０分間形成させる。沈殿を懸濁させ、２９３細胞に加え、３７℃にて約４時間沈降させる。培養基を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間で加える。次いで、２９３細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を加え、細胞を約５日間インキュベートする。
トランスフェクションから約２４時間後、培養基を除去し、培養基（単独）または２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−システインおよび２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンを含有する培養基と交換する。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を集め、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに負荷する。処理されたゲルを乾燥し、ＴＡＴポリペプチドの存在を明らかにするために選択された時間の間、フィルムに暴露することができる。トランスフェクトされた細胞を含有する培養はさらに（無血清培地中での）インキュベーションを受けることができ、培地を選択されたバイオアッセイでテストする。
別の技術において、Ｓｏｍｐａｒｙｒａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２：７５７５（１９８１）によって記載されたデキストラン硫酸方法を用い、ＴＡＴを２９３細胞に一過的に導入することができる。２９３細胞をスピナーフラスコ中で最大密度まで増殖させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＴＡＴ ＤＮＡを加える。細胞を、まず、遠心によってスピナーフラスコから濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿を細胞ペレット上で４時間インキュベートする。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養基で洗浄し、組織培養基、５μｇ／ｍｌのウシインスリンおよび０．１μｇ／ｍｌのウシトランスフェリンを含有するスピナーフラスコに再度導入する。約４日後に、条件培地を遠心し、濾過して、細胞およびデブリスを除去する。次いで、発現されたＴＡＴを含有する試料を濃縮し、透析および／またはカラムクロマトグラフィーのようないずれかの選択された方法によって精製することができる。
もう１つの具体例において、ＴＡＴをＣＨＯ細胞において発現させることができる。ＣａＰＯ４またはＤＥＡＥ−デキストランのような公知の試薬を用い、ｐＲＫ５−ＴＡＴをＣＨＯ細胞にトランスフェクトすることができる。前記したように、細胞培養をインキュベートすることができ、培地を培養基（単独）または３５Ｓ−メチオニンのような放射性標識を含有する培地で置き換えることができる。ＴＡＴポリペプチドの存在を測定した後、培養基を無血清培地で置き換えることができる。好ましくは、培養を約６日間インキュベートし、次いで、条件培地を収穫する。次いで、発現されたＴＡＴを含有する培地を濃縮し、いずれかの選択された方法によって精製することができる。
エピトープ−タグドＴＡＴを宿主ＣＨＯ細胞において発現させることもできる。ＴＡＴをｐＲＫ５ベクターからサブクローンすることができる。サブクローンインサートはＰＣＲを受けて、ポリ−ｈｉｓタグのような選択されたエピトープとイン・フレームにてバキュロウイルス発現ベクターに融合させることができる。次いで、ポリ−ｈｉｓタグドＴＡＴインサートを、安定なクローンの選択用のＤＨＦＲのような選択マーカーを含有するＳＶ４０駆動ベクターにサブクローンすることができる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０駆動ベクターで（前記したように）トランスフェクトすることができる。標識を前記したように行って、発現を確認することができる。次いで、発現されたポリ−ＨｉｓタグドＴＡＴを含有する培養基を濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティークロマトグラフィーによる等のいずれかの選択された方法によって精製することができる。
ＴＡＴは一過的発現手法によってＣＨＯおよび／またはＣＯＳ細胞において、あるいはもう１つの安定な発現手法によってＣＨＯ細胞において発現させることもできる。
ＣＨＯ細胞における安定な発現は、以下の手法を用いて行われる。蛋白質はＩｇＧ構築体（イムノアドヘシン）として発現され、ここに、各蛋白質の可溶性形態（例えば、細胞外ドメイン）についてのコーディング配列を、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ２ドメインを含有するＩｇＧ１定常領域配列に融合させ、および／またはそれはポリ−Ｈｉｓタグド形態である。
ＰＣＲ増幅に続き、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ３．１６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９７）に記載されたような標準的技術を用いて、各ＤＮＡをＣＨＯ発現ベクターにサブクローンする。ＣＨＯ発現ベクターを、注目するＤＮＡの５’および３’側の適合する制限部位を有して、ｃＤＮＡの便宜なシャッフリングを可能とするように構築する。ＣＨＯ細胞における発現で用いるベクターはＬｕｃａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４：９（１７７４−１７７９（１９９６））に記載されており、注目するｃＤＮＡおよびジヒドロ葉酸レタクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現を駆動するためにＳＶ４０初期プロモータ／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、トランスフェクションに続いてのプラスミドの安定な維持のための選択を可能とする。
所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、商業的に入手可能なトランスフェクション試薬Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｕｉａｇｅｎ）、Ｄｏｓｐｅｒ（登録商標）またはＦｕｇｅｎｅ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いてほぼ１千万のＣＨＯ細胞に導入する。細胞をＬｕｃａｓ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａに記載されたように増殖させる。ほぼ３×１０７細胞をさらなる増殖および生産のために後に記載するようにアンプル中で凍結させる。
プラスミドＤＮＡを含有するアンプルを、水浴へ入れることによって解凍し、ボルテキシングによって混合する。内容物を、１０ｍＬの培地を含有する遠心管にピペットに入れ、１０００ｒｐｍにおいて５分間遠心する。上清を吸引し、細胞を１０ｍＬの選択培地（５％０．２μｍ透析濾過胎児ウシ血清を含む０．２μｍ濾過ＰＳ２０）に再懸濁させる。次いで、細胞を、９０ｍＬの選択培地を含有する１００ｍＬのスピナーにアリコットする。１ないし２日後、細胞を、１５０ｍＬの選択増殖培地を充填した２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃にてインキュベートする。さらに２ないし３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬおよび２０００ｍＬスピナーを３×１０５細胞／ｍＬで接種する。細胞培地を、遠心および生産培地における再懸濁によって新鮮な培地と交換する。いずれの適当なＣＨＯ培地を使用することもできるが、１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５，１２２，４６９号に記載された生産培地を現実に用いることができる。３Ｌ生産スピナーは１．２×１０６細胞／ｍＬで接種する。０日において、細胞数ｐＨを測定する。１日において、スピナーをサンプリングし、濾過した空気での散布を開始する。２日に、スピナーをサンプリングし、温度を３３℃にシフトし、３０ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコースおよび０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば、３５％ポリジメチルシロキサンエマルジョン、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６５ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｒａｄｅ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を取る。生産を通じて必要であれば、ｐＨを調整して、それを７．２程度に維持する。１０日後あるいは生存率が７０％未満まで降下するまで細胞培養を遠心および０．２２μＭフィルターを通す濾過によって収穫する。濾液を４℃にて貯蔵するか、あるいは精製のために直ちにカラムに負荷した。
ポリ−Ｈｉｓタグド構築体では、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて蛋白質を精製する。精製の前に、イミダゾールを５ｍＭの濃度まで条件培地に加える。０．３Ｍ ＮａＣｌおよび５ｍＭイミダゾールを含有する２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４で平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに条件培地を４℃にて４ないし５ｍｌ／分の流速でポンプにより送液する。負荷の後、カラムを更なる平衡緩衝液で洗浄し、０．２５Ｍイミダゾールを含有する平衡緩衝液で蛋白質を溶出させる。高度に精製された蛋白質を、引き続いて、２５ｍｌのＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにて、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．１４Ｍ ＮａＣｌおよび４％マンニトールを含有する貯蔵緩衝液、ｐＨ６．８に脱塩し、−８０℃にて貯蔵する。
イムノアドヘシン（Ｆｃ−含有）構築体は以下のように条件培地から精製する。２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８平衡化した５ｍｌプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に条件培地をポンプ送液する。負荷の後、カラムを平衡緩衝液で十分に洗浄し、その後、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５で溶出する。２７５μＬの１Ｍトリス緩衝液ｐＨ９を含有するチューブへ１ｍｌ画分を集めることによって、溶出した蛋白質を直ちに中和する。高度に精製された蛋白質を引き続いて、ポリ−Ｈｉｓタグド蛋白質について前記したように貯蔵緩衝液に脱塩する。ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによって、およびエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定によって、均一性を評価する。
本明細書中で開示されたある種のＴＡＴポリペプチドは首尾よく発現され、この技術を用いて精製された。
実施例１０：酵母におけるＴＡＴの発現
以下の方法は酵母におけるＴＡＴの組換え発現を記載する。
まず、酵母発現ベクターは、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモータからのＴＡＴの細胞内生産または分泌のために構築する。ＴＡＴをコードするＤＮＡおよびプロモータを、選択されたプラスミドの適当な制限酵素部位へ挿入して、ＴＡＴの細胞内発現を指令する。分泌のためには、ＴＡＴをコードするＤＮＡを、ＴＡＴの発現のために、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモータ、天然ＴＡＴシグナルペプチドまたは他の哺乳動物シグナルペプチドまたは例えば、酵母アルファ−因子またはインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、および（必要であれば）リンカー配列をコードするＤＮＡと共に選択されたプラスミドにクローン化することができる。
次いで、酵母株ＡＢ１１０のような酵母細胞を、前記した発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養することができる。形質転換された酵母上清を、１０％トリクロロ酢酸での沈殿、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離、続いての、ゲルのクーマシーブルー色素での染色によって分析することができる。
引き続いて、遠心によって発酵培地から酵母細胞を除去し、次いで、選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって組換えＴＡＴを単離し、精製することができる。ＴＡＴを含有する濃縮物を、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製することができる。
本明細書中に開示されたある種のＴＡＴポリペプチドは、この技術を用いて首尾よく発現され、精製された。
実施例１１：バキュロウイルス−感染昆虫細胞におけるＴＡＴの発現
以下の方法は、バキュロウイルス−感染昆虫細胞におけるＴＡＴの組換え発現を記載する。
ＴＡＴをコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクター内に含まれるエピトープタグの上流に誘導する。そのようなエピトープタグは（ＩｇＧのＦｃ領域のように）ポリ−ｈｉｓタグおよび免疫グロブリンタグを含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような商業的に入手可能なプラスミドから由来するプラスミドを含めた種々のプラスミドを使用することができる。簡単に述べれば、ＴＡＴをコードする配列あるいは膜貫通蛋白質の細胞外ドメインをコードする配列、またはもし蛋白質が細胞外であれば成熟蛋白質をコードする配列のようなＴＡＴのコーディング配列の所望の部分は、５’および３’領域に対して相補的なプライマーでのＰＣＲによって増幅される。５’プライマーはフランキング（選択された）制限酵素部位を取り込むことができる。次いで、生成物をそれらの選択された制限酵素で消化し、発現ベクターにサブクローンする。
組換えバキュロウイルスは、（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから商業的に入手可能な）リポフェクチンを用い、前記プラスミドおよびＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に共−トランスフェクトすることによって作成される。２８℃における４ないし５日間のインキュベーションの後、放出されたウイルスを収穫し、更なる増幅のために用いる。ウイルス感染および蛋白質発現は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９４）によって記載されたように行われる。
次いで、発現されたポリ−ｈｉｓタグドＴＡＴは、例えば、Ｎｉ２＋キレートアフィニティークロマトグラフィによって以下のように精製することができる。抽出物は、Ｒｕｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：１７５−１７９（１９９３）によって記載されているように組換えウイルス−感染Ｓｆ９細胞から調製される。簡単に述べれば、Ｓｆ９細胞を洗浄し、音波処理緩衝液（２５ｍＬ Ｈｅｐｅｓ，ｐｈ７．９；１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％ＮＰ−４０；０．４Ｍ ＫＣｌ）に再懸濁させ、氷上で２０秒間２回音波処理する。音波処理物を遠心によって洗浄し、上清を負荷緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）中に５０倍に希釈し０．４５μｍフィルターを通して濾過する。（Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能な）Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラムを０．５ｍＬのベッド容量で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの負荷緩衝液で平衡化する。濾過された細胞抽出物を１分当たり０．５ｍＬにてカラムに負荷する。カラムを負荷緩衝液でベースラインＡ２８０まで洗浄し、その時点で画分の収集を開始する。次に、カラムを二次洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭ ＮａＣｌ，１０％グリセロール，ｐＨ６．０）で洗浄し、これは非特異的に結合した蛋白質を溶出させる。再度Ａ２８０ベースラインに到達した後、カラムを、二次洗浄緩衝液中の０ないし５００ｍＭイミダゾールグラジエントで展開する。１ｍＬ画分を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびアルカリ性ホスファターゼ（Ｑｉａｇｅｎ）に結合体化したＮｉ２＋−ＮＴＡでの銀染色またはウエスタンブロットによって分析する。溶出したＨｉｓ１０−タグドＴＡＴを含有する画分をプールし、負荷緩衝液に対して透析する。
別法として、ＩｇＧタグド（またはＦｃタグド）ＴＡＴの精製は、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含めた公知のクロマトグラフィー技術を用いて行うことができる。
本明細書中に開示したある種のＴＡＴポリペプチドは、この技術を用いて首尾よく発現され、精製された。
実施例１２：ＴＡＴに結合する抗体の調製
本実施例は、ＴＡＴ二特異的に結合することができるモノクローナル抗体の調製を示す。本実施例は、さらに、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体の調製を説明する。
モノクローナル抗体を生産するための技術は当業者に知られており、例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｓｕｐｒａに記載されている。使用することができる免疫原は、精製されたＴＡＴ、ＴＡＴを含有する融合蛋白質、および組換えＴＡＴを細胞表面に発現する細胞を含む。免疫原の選択は、過度な実験なくして当業者がなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃのようなマウスは、フロイントの完全なアジュバント中に乳化したＴＡＴ免疫原で免疫化し、１ないし１００マイクログラムの量で皮下または腹腔内注射する。別法として、免疫原はＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）中に乳化し、動物の後足に注射する。次いで、免疫化されたマウスを、１０ないし１２日後に、選択されたアジュバント中に乳化した更なる免疫原でブースター注射する。しかる後、数週間の間、マウスをさらなる免疫化注射でブースター注射することができる。ＥＬＩＳＡアッセイにおけるテストのために、血清試料を眼窩後出血によってマウスから周期的に得て、抗−ＴＡＴ抗体を検出することができる。
ＴＡＴ１８８ポリペプチドＥ１６は、細胞内にＣ−およびＮ−両末端が位置した１２回膜貫通蛋白質である。ＴＡＴ（Ｅ１６）は、共通重鎖４Ｆ２ｈｃ（ＣＤ９８ｈｃ）でヘテロダイマー化して、機能的ユニットを形成する、Ｎａ２＋独立大中性アミノ酸トランスポーターのサブユニットである（図１５５中のダイアグラム参照）。細胞外ドメインを標的化する抗−ＴＡＴ１８８（抗−Ｅ１６）抗体を調製するためには、内因的にはＥ１６を発現するＰＣ３細胞を免疫原として用いた。簡単に述べれば、ＰＣ３細胞（２２×１０６細胞／ｍｌ）をＢａｌｂ−ｃマウスに注射した。抗体力価は、対照２９３細胞および２９３−Ｅ１６細胞（Ｅ１６でトランスフェクトし、それを生産する２９３細胞）に対してテストした。６つのハイブリドーマが調製され、抗−Ｅ１６抗体を発現した。これらのうち、３つの抗体はＦＡＣＳ分析によってＥ１６に対する良好な特異性を有することが示され（図１５６参照）、ここに、細胞表面結合はＥ１６表面発現に平行した。具体的には、Ｅ１６ ｓｉＲＮＡトランスフェクションはＥ１６発現を阻害し（本明細書中の実施例１７参照）、ＰＣ３細胞の表面に結合した抗−１６抗体の量を減少させた。これらの抗体を、本明細書中においては、３Ｂ５．１（または３Ｂ５）、１２Ｇ１２．１（または１２Ｇ１２）、および１２Ｂ９．１（または１２Ｂ９）といい、本明細書中に開示された更なる実験で用いた。
本発明の抗体を発現するハイブリドーマは以下のように調製した。適当な抗体力価が検出された後、抗体に対して「陽性」である動物にＴＡＴの最終静脈内注射を注射することができる。３ないし４日後、マウスを犠牲にし、脾臓細胞を収穫する。次いで、脾臓細胞をＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １５９７から入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１のような選択されたネズミ骨髄腫細胞系に（３５％ポリエチレングリコールを用いて）融合させる。該融合によりハイブリドーマ細胞が生じ、これが、次いで、非−融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するためのＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）を含有する９６ウェル組織培養プレート中で平板培養することができる。
ハイブリドーマ細胞はＴＡＴに対する反応性について、ＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングした。ＴＡＴに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の測定は、当業者の技量内のものである。
陽性ハイブリドーマ細胞は同系Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射して、抗−ＴＡＴモノクローナル抗体を含有する腹水を生じさせることができる。別法として、ハイブリドーマ細胞を組織培養フラスコまたはローラーボトル中で増殖させることができる。腹水中で生産されたモノクローナル抗体の生成は、硫酸アンモニウム沈殿、続いての、ゲル排除クロマトグラフィーを用いて達成することができる。別法として、抗体のプロテインＡまたはプロテインＧへの結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーを使用することができる。
本明細書中に開示されたある種のＴＡＴポリペプチドに対して向けられた抗体はこの技術を用いて首尾よく生産された。より具体的には、（標準ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳソーティング分析および／または免疫組織化学分析によって測定されたように）ＴＡＴ蛋白質を認識し、それに結合することができる機能的モノクローナル抗体は、本明細書中に開示されたように以下のＴＡＴ蛋白質に対して首尾よく作成された：ＴＡＴ１１０（ＤＮＡ９５９３０）、ＴＡＴ２１０（ＤＮＡ９５９３０−１）、ＴＡＴ１１３（ＤＮＡ２１５６０９）、ＴＡＴ１２６（ＤＮＡ２２６５３９）、ＴＡＴ１５１（ＤＮＡ２３６５１１）、ＴＡＴ１１１（ＤＮＡ１８８２２１）、ＴＡＴ１４６（ＤＮＡ２３３８７６）、ＴＡＴ１１２（ＤＮＡ９６９３０）、ＴＡＴ１４５（ＤＮＡ９８５６５）、ＴＡＴ１５２（ＤＮＡ２４６４３５）、ＴＡＴ１４１（ＤＮＡ２３６４９３）、ＴＡＴ１１４（ＤＮＡ１０８８０９）、ＴＡＴ１０４（ＤＮＡ２３６３４３）、ＴＡＴ１００（ＤＮＡ２３１５４２）、ＴＡＴ２８４（ＤＮＡ２３１５４２−１）、ＴＡＴ２８５（ＤＮＡ２３１５４２−２）、ＴＡＴ２８５−１（ＤＮＡ２９７３９３），ＴＡＴ１４４（ＤＮＡ２２６４５６）、ＴＡＴ１８８（ＤＮＡ２３７６３７）、ＴＡＴ１２３（ＤＮＡ２１０４９９）、ＴＡＴ２１１（ＤＮＡ２１９８９４）、ＴＡＴ１０２（ＤＮＡ２３６５３４）、ＴＡＴ１２７（ＤＮＡ２２８１９９）およびＴＡＴ１２８（ＤＮＡ２２０４３２）。興味深いことには、出願人らは、ＴＡＴ１１１（ＤＮＡ１８８２２１）およびＴＡＴ１４６（ＤＮＡ２３３８７６）に対して調製されたモノクローナル抗体が、その関連するリガンドポリペプチドによる、ＤＮＡ１８８２２１およびＤＮＡ２３３８７６分子によってコードされるＥｐｈＢ２Ｒ受容体の活性化をブロックすることができることを突き止めた。それ自体、その関連するリガンドによる、ＥｐｈＢ２Ｒ受容体（すなわち、ＴＡＴ１１１およびＴＡＴ１４６ポリペプチド）の活性化をブロックするための抗体を用いる抗体および方法は、現在記載された発明内に含まれる。さらに、出願人らは、ＴＡＴ１１０（ＤＮＡ９５９３０）およびＴＡＴ２１０（ＤＮＡ９５９３０−１）ポリペプチド（すなわち、ＩＬ−２０受容体アルファポリペプチド）に対して向けられたモノクローナル抗体が、ＩＬ−１９蛋白質によるＩＬ−２０受容体アルファの活性化を阻害することができることを突き止めた。それ自体、ＩＬ−１９によるＩＬ−２０受容体アルファ（すなわち、ＴＡＴ１１０およびＴＡＴ２１０ポリペプチド）の活性化を阻害するための抗体を用いる抗体および方法は、現在記載された発明に含まれる。
本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドに対して向けられたモノクローナル抗体の成功した調製に加えて、それらのモノクローナル抗体の多くは、（イン・ビトロおよびイン・ビボ双方で）注目するＴＡＴポリペプチドを発現する細胞（または組織）に細胞トキシンを向けるのに用いられる細胞トキシンに首尾よく結合体化されている。例えば、トキシン（例えば、ＤＭ１）誘導体化モノクローナル抗体は、以下の本明細書中に記載されるＴＡＴポリペプチドに対して首尾よく作成された：ＴＡＴ１１０（ＤＮＡ９５９３０）、ＴＡＴ２１０（ＤＮＡ９５９３０−１）、ＴＡＴ１１２（ＤＮＡ９６９３０）、ＴＡＴ１１３（ＤＮＡ２１５６０９）、ＴＡＴ１１１（ＤＮＡ１８８２２１）およびＴＡＴ１４６（ＤＮＡ２３３８７６）。後に本明細書中に示すように、他の有用な結合体トキシンはアウリスタチンＭＭＡＥおよびＭＭＡＦを含む。
実施例１３：特異的抗体を用いるポリペプチドの精製
天然または組換えＴＡＴポリペプチドは、蛋白質精製の分野における種々の標準的な技術によって精製することができる。例えば、プロ−ＴＡＴポリペプチド、成熟ＴＡＴポリペプチド、またはプレ−ＴＡＴポリペプチドは、注目するＴＡＴポリペプチドに対して特異的な抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは、抗−ＴＡＴポリペプチド抗体を活性化されたクロマトグラフィー樹脂に共有結合カップリングすることによって構築される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿によってまたは固定化されたプロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）での精製によって免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿によって、または固定化されたプロテインＡでのクロマトグラフィーによってマウス腹水から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のようなクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体は樹脂にカップリングされ、樹脂はブロックされ、誘導体樹脂は製造業者の指示に従って洗浄される。
そのような免疫親和性カラムは、可溶性形態のＴＡＴポリペプチドを含有する細胞から画分を調製することによってＴＡＴポリペプチドの精製で利用される。この調製は、洗剤の負荷によって、または当該分野で良く知られた他の方法によって、分別遠心を介して得られた全細胞または細胞下画分の可溶化によって誘導される。別法として、シグナル配列を含有する可溶性ＴＡＴポリペプチドは、細胞が増殖する培地に有用な量で分泌させることができる。
可溶性ＴＡＴポリペプチド−含有調製は免疫親和性カラムを通過させ、ＴＡＴポリペプチドの優先的吸収を可能とする条件下でカラムを洗浄する（例えば、洗剤の存在下での抗イオン強度緩衝液）。次いで、抗体／ＴＡＴポリペプチド結合を破壊する条件下でカラムを溶出させ（例えば、ほぼｐＨ２ないし３のような低ｐＨ緩衝液または尿素またはチオシアネートイオンのような高濃度のカオトロープ）、ＴＡＴポリペプチドを収集する。
実施例１４：イン・ビトロ腫瘍細胞殺傷アッセイ
注目するＴＡＴポリペプチドを発現する哺乳動物細胞は、標準的な発現ベクターおよびクローニング技術を用いて得ることができる。別法として、注目するＴＡＴポリペプチドを発現する多くの腫瘍細胞系は、例えば、ＡＴＣＣを介して公に入手可能であり、標準的なＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析を用いてルーチン的に同定することができる。次いで、抗−ＴＡＴポリペプチドモノクローナル抗体（およびそのトキシン結合体化誘導体）をアッセイで使用して、イン・ビトロでＴＡＴポリペプチドを発現する細胞を殺傷する抗体の能力を測定することができる。
例えば、注目するＴＡＴポリペプチドを発現する細胞は前記したように得られ、９６ウェル皿に平板培養する。１つの分析において、抗体／トキシン結合体（または裸の抗体）を、４日間の間の細胞インキュベーションを通じて含ませる。第二の独立した分析において、細胞を抗体／トキシン結合体（または裸の抗体）と共に１時間インキュベートし、次いで、抗体／トキシン結合体の不存在下で４日間インキュベートする。次いで、ＰｒｏｍｅｇａからのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓｅｙ （カタログ番号Ｇ７５７１）を用いて細胞生存率を測定する。未処理細胞は陰性対照として供する。
１つの特別な分析において、ＴＡＴ１１２（ＤＮＡ９６９３０）に対して向けられたモノクローナル抗体の能力は、そのポリペプチドを発現する細胞を殺傷する能力について分析した。１つの分析において、ｇＤ．ＮＣＡと呼ばれる発現ベクターを調製した。そのベクターに挿入されたＴＡＴ１１２ポリペプチドコーディング配列は、ＳＶ４０プロモータによって駆動され、該ベクターはＳＶ４０初期ポリＡシグナルも含有する。ｇＤ．ＮＣＡベクターは、ＰＣ３細胞においてＮｅｏ耐性を発現するＳＶ４０ベクターと共にＰＣ３細胞に共−トランスフェクトし、陽性形質転換体を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８において選択した。陽性クローンは９６ウェルプレートにおいて単離し、前記したように調製され、３Ｅ６と呼ばれる抗−ＴＡＴ１１２モノクローナル抗体を用いるフローサイトメトリーによって分析した。クローン３は、その表面に高レベルのＴＡＴ１１２ポリペプチドを発現することが判明したので、該分析のために選択した。第二の独立した分析において、膵臓癌細胞系Ｈｐａｆ ＩＩはＡＴＣＣから入手し、該アッセイで使用した。
もう１つの特別な分析においては、ＴＡＴ１８８（ＤＮＡ２３７６３７）に対して向けられたモノクローナル抗体の能力は、そのポリペプチドを発現する細胞を殺傷する能力について分析した。
まず、細胞活性に影響する裸の抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）抗体の能力を証明した。
Ａ．抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）モノクローナル抗体は、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）内部化を刺激し、アミノ酸輸送活性を低下する。
Ｅ１６蛋白質を発言する細胞への抗−Ｅ１６抗体への結合は、アミノ酸輸送の低下と平行した抗体内部化を誘導した。ＰＣ３細胞を、３７℃においてプロテアソーム阻害剤（Ｓｉｇｍａ）に関して示された時間の間、１次抗体と共にインキュベートした。次いで、抗体を除去し、細胞をＰＢＳで数回洗浄する。細胞を４％ＰＦＡで固定し、次いで、ＰＢＳ／０．１％トリトンＸ−１００で浸透させる。１０％ヤギ血清でのブロッキングの後、細胞を２次抗体（ヤギ抗−マウスＩｇＧ−Ｃｙ３結合体（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ））で細胞を染色し、蛍光顕微鏡によって分析した。結果は、抗−Ｅ１６モノクローナル抗体が、その表面にＴＡＴ１８８（Ｅ１６）を発現するＰＣ３細胞に結合し、それによって内部化されることを示す（図１５７参照）。抗−ＴＡＴ１８８抗体内部化の証明は、抗体−Ｅ１６相互作用の有用な特徴を強調する。なぜならば、結合した抗体の内部化の結果、抗−ＴＡＴ１８８抗体に結合体化したトキシンが取り込まれ得る（この実施例１４のセクションＢおよびＣ参照）。
ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）のアミノ酸輸送蛋白質としての機能は、抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）抗体の結合によって阻害された。ロイシン輸送機能アッセイは以下のように行った。細胞を２４ウェルプレート中で増殖させ、抗−Ｅ１６抗体で一晩処理した。次いで、細胞を温かいＮａ＋＋フリーＨｅｐｅｓ−Ｒｉｎｇｅｒで濯ぎ、３７℃にて１０分間インキュベートした。緩衝液を、放射性標識アミノ酸（Ｌ−［２，３−３Ｈ］−アルギニンまたはＬ−［３，４，５−３Ｈ（Ｎ）］−ロイシン）５μＣｉ／ｍｌ、５０μＬナトリウム−フリーＨｅｐｅｓ−リンゲル）を含有する２００μＬアッセイ緩衝液に交換した。放射性混合物を３７℃にて３０秒間インキュベートした後、緩衝液を吸引によって除去し、細胞を氷冷ナトリウム−フリーＨｅｐｅｓ−リンゲル１ｍｌ／ウェルで４回洗浄した。プレートを乾燥し、これに０．２ｍｌ／ウェルの０．２％ＳＤＳ／０．２Ｎ ＮａＯＨを加えた各試料からの溶解物の０．１ｍｌアリコットを０．１ｍｌの０．２Ｎ ＨＣｌで中和し、その後、液体シンチレーションカクテルを乾燥した。溶解物の（［３Ｈ］）放射能をシンチレーションカウンターを用いてテストした。図１５８中の結果は、細胞表面のＥ１６蛋白質に結合する抗−Ｅ１６抗体は、ほぼ２４時間後にアミノ酸輸送の低下を引き起こすことを示す。該低下は、同時のＥ１６ポリペプチドの内部化、および輸送機能についての利用可能なＥ１６の喪失によるものである。
Ｂ．ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）を発現する細胞へのトキシン−結合体化抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）抗体の結合は細胞殺傷をもたらす。
抗−ＴＡＴ１８８およびＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのコンジュゲーションによる抗−ＴＡＴ１８８−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの調製
抗体は、組織特異的（または病気特異的または双方の）表面蛋白質のような細胞の比較的ユニークな特徴が、健康な細胞の殺傷を回避しつつ、細胞外細胞が殺傷に対して標的化されるようにする該細胞へサイトトキシンを送達する便宜かつ高度に特異的な方法を提供する。前記で開示されたＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢリンカーを介して抗体にカップリングしたアウリスタチンサイトトキシンは、抗体−トキシン結合体のＥ１６媒介内部化からの細胞殺傷を示すのに有用である。該手法は以下のように行った。ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢリンカーを用い、ＭＭＡＥトキシンを抗−ＴＡＴ１８８抗体上のシステイン残基に共有結合した。ｐＨ８．０の５００ｍＭホウ酸ナトリウムおよび５００ｍＭ塩化ナトリウムに溶解させた抗−ＴＡＴ１８８を過剰の１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理する。３７℃における約３０分間のインキュベーション後、緩衝液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂での溶出によって交換し、１ｍＭ ＤＴＰＡを含むＰＢＳで溶出した。溶液の２８０ｎｍにおける吸光度からの低下した抗体濃度、およびＤＰＮＢ（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）との反応によるチオール濃度を測定し、および４１２ｎｍにおける吸光度を測定することによって、チオール／Ａｂ値をチェックする。ＰＢＳに溶解させた低下した抗体を氷上で冷却する。
ＤＭＳＯに溶解させた、薬物リンカー試薬、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ＰＡＢ−モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、すなわち、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを既知の濃度でアセトニトリルおよび水に希釈し、ＰＢＳ中の冷却した低下した抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）抗体に加える。約１時間後、過剰のマレイミドを加えて、反応をクエンチし、いずれの未反応の抗体チオール基もキャップする。遠心限外濾過によって反応混合物を濃縮し、ＰＢＳ中のＧ２５樹脂を通す溶出によって抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを精製し、脱塩し、滅菌条件下で０．２μｍフィルターを通して濾過し、貯蔵のために凍結した。
抗−ＴＡＴ１８８およびＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦのコンジュゲーションによる抗−ＴＡＴ１８８−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦの調製
抗−ＴＡＴ１８８−ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦは、ＭＭＡＥのコンジュゲーションについて前記で開示した手法に従い、抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）およびＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦのコンジュゲーションによって調製した。ＭＭＡＦは、薬物のＣ−末端にフェニルアラニンを持つＭＭＡＥの誘導体である。
トキシン−結合体化抗−ＴＡＴ１８８のイン・ビトロ細胞傷害性の測定
本実験のためのトキシン−結合体化３Ｂ５、１２Ｂ９、および１２Ｇ１２抗体は、各々、３Ｂ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、１２Ｂ９−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、および３Ｂ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ結合体として調製した。抗体−トキシン結合体、アルファ−ＩＬ８−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥは陰性対照として用いた。ＰＣ３細胞（ＡＴＣＣから入手可能であって、その表面にＥ１６を内因的に発現した前立腺癌細胞系）およびＣｏｌｏ２０５細胞（ＡＴＣＣから入手可能であって、その表面にＥ１６を内因的に発現するヒト結腸癌細胞系）を、増大させる濃度のトキシン−結合体化抗体と接触させ、前記したように標準的な細胞生存性培養ルミネセンスアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏＴＭキット，Ｐｒｏｍｅｇａ）によって細胞殺傷についてモニターした。図１５９Ａ（ＰＣ３細胞）および図１５９Ｂ（Ｃｏｌｏ２０５細胞）に示される結果は、３つのトキシン−結合体化抗−Ｅ１６抗体が、Ｅ１６を発現する細胞の殺傷を促進することを示す。
もう１つのトキシンＭＭＡＦを抗体に連結させ、細胞傷害性についてテストした。本実験のためのトキシン−連結３Ｂ５抗体は３Ｂ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥおよび３Ｂ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦと命名した。抗体−トキシン結合体であるアルファ−ＩＬ８−ｖｃ−ＭＭＡＥを陰性対照として用いた。各抗体に付着したトキシン分子の平均数は、図１６０に示したように、抗体当たりほぼ４トキシン分子であったヒト結腸癌細胞計Ｃｏｌｏ２０５細胞を、５０μｌの培養基中で４０００細胞／ウェルにて９６ウェルプレートに撒いた。翌日、細胞を、５０μｌの培養基に希釈した段階的濃度にて３Ｂ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、３Ｂ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦまたはアルファ−ＩＬ８−ｖｃ−ＭＭＡＥと共に７２時間インキュベートした。細胞生存性は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭルミネセント細胞生存性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。図１６０に示される結果は、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥおよびＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ−結合体化抗−Ｅ１６抗体は、ＭＭＡＦトキシン（ＥＣ５０ほぼ０．０６μｇ／ｍｌ）で、Ｅ１６を発現する細胞を殺傷する能力を有することを示し、ＭＭＡＦ（ＥＣ５０ほぼ０．００７μｇ／ｍｌ）よりも大きな細胞殺傷を供する。
ヒトにおける治療剤としての本発明の抗体の開発は、サルおよび／または霊長類における初期の毒性実験を必要とする。Ｅ１６アミノ酸配列は、ヒトのような種を横切って変化し、サル、ラットおよびマウスＥ１６アミノ酸配列は各々、９６．２６％、９１．０５％および９０．６６％である。抗−ヒトＴＡＴ１８８（Ｅ１６）抗体が、やはり、サル細胞に結合し、それを殺傷することができるか否かを判断するために、以下のイン・ビトロ実験を行った。その表面で内因的にサルＥ１６を発現する（ＡＴＣＣから入手可能な）サル細胞系ＣＯＳ７を用いた。抗−Ｅ１６抗体３Ｂ５、１２Ｂ９および１２Ｇ１２を、各々、ヒト、サルおよびマウスＥ１６を内因的に発現するヒト、サルおよびマウス細胞と接触させ、標準的なＦＡＣＳ分析によって分析した。ＦＡＣＳは、３つの抗−ヒトＥ１６抗体３Ｂ５、１２Ｇ１２、および１２Ｂ９の各々が、ヒトＥ１６を発現するサルＣＯＳ７細胞（図１６１Ａ）ならびにヒトＥ１６を発現するヒト細胞（図１６１Ｂ）に結合するが、マウスＥ１６発現細胞に結合しない（図１６１Ｂ参照）ことを示した。かくして、本発明の抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）抗体は、臨床的活性、効率および毒性実験で有用である。
実施例１５：イン・ビボ腫瘍細胞殺傷アッセイ
抗−ＴＡＴ１１２抗体：
結合体化していない抗−ＴＡＴ１１２モノクローナル抗体の効率をテストするために、抗−ＴＡＴ１１２抗体を、側腹部に皮下的に（前記実施例１４に記載したように得られた）ＰＣ３．ｇＤ．ＮＣＡクローン３細胞を受ける２４時間前にヌードマウスに腹腔内注射した。抗体注射は、実験の残りのために１週間当たり２回継続した。腫瘍容量は１週間に２回測定した。
ＤＭ１−結合体化抗−ＴＡＴ１１２抗体の効率をテストするために、（前記実施例１４に記載されたように得られた）ＰＣ３．ｇＤ．ＮＣＡクローン３細胞をヌードマウスの側腹部に接種した。腫瘍がほぼ１００ｍｍ３の平均容量に到達すると、マウスを、ＤＭ１−結合体化抗−ＴＡＴ１１２抗体で１週間当たり１回または２回静脈内処理した。
前記分析の結果は、結合体化していない抗−ＴＡＴ１１２ならびにＤＭ１−結合体化抗−ＴＡＴ１１２抗体が、このイン・ビボモデルにおいて腫瘍容量を低下させるにおいてかなり効果的であったことを示した。これらの分析は、抗−ＴＡＴポリペプチドモノクローナル抗体が、注目するＴＡＴポリペプチドを発現する腫瘍細胞を殺傷するのに効果的であることを示す。
抗−ＴＡＴ１１８（Ｅ１６）活性：
イン・ビトロでの細胞殺傷についての結合体化していない抗−ＴＡＴ１８８モノクローナル抗体、抗−ＴＡＴ１８８抗体３Ｂ５、１２Ｂ９、および１２Ｇ１２の効率をテストするために、以下の手法を行った。Ｅ１６を内因的に発現するＰＣ３細胞を、側腹部において無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）に注射した。細胞接種と同日に、抗体を２ｍｇ／ｋｇにて１週間に２回腹腔内注射した。対照マウスを抗体を含まないＰＢＳで注射した。各群における１０匹のマウスを４週間モニターし、腫瘍容量を１週間に２回測定した。腫瘍細胞および抗−Ｅ１６抗体を同時に注射することによって、この手法は、異種移植片マウスにおいて腫瘍の確立を阻害する投与された抗体の能力をテストした。図１６２における結果は、本実験において、平均腫瘍容量が対照抗体よりも有意に低くなかったことを示す。
ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥおよびＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ結合体化抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）抗体の効率をテストするために、Ｃｏｌｏ２０５細胞を無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）の側腹部に接種し、ほぼ１週間後、腫瘍がほぼ１００ないし２００ｍｍ３平均容量に到達すると、マウスに３ｍｇ／ｋｇにて結合体化抗体を１週間に１回注射した。以下の抗体処理を、腫瘍−含有マウスを３つの群に分けた日に行った：（１）モック対照−０．２ｍｌ以下のＰＢＳ、４週間の１週間当たり１回の静脈内注射；（２）抗体対照−０．２ｍｌ以下のＰＢＳ中の抗−ＩＬ８−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４週間の１週間当たり１回の静脈内注射；（３）抗体−０．２ｍｌ以下のＰＢＳ中の３Ｂ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４週間の１週間当たり１回の静脈内注射；（４）抗体−０．２ｍｌ以下のＰＢＳ中の３Ｂ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ、４週間の１週間当たり１回の静脈内注射。平均腫瘍容量を測定し、時間に対してプロットした。図１６３における結果は、ＭＭＡＥ−およびＭＭＡＦ−結合体化抗−Ｅ１６抗体がこのイン・ビボモデルにおいて腫瘍容量を有意に低下させたことを示す。これらの分析は、抗−１８８（Ｅ１６）抗体のような抗−ＴＡＴポリペプチドモノクローナル抗体が、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ポリペプチドのような注目するＴＡＴポリペプチドを発現する腫瘍細胞を殺傷するのに有効であることを示す。
実施例１６：ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、実質的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａによって記載されているように行った。ＤＮＡ２３１５４２、ＤＮＡ２３１５４２−１、ＤＮＡ２３１５４２−２およびＤＮＡ２９７３９３に由来するプローブを用いるノーザンブロット分析は、正常なヒト脳組織と比較して、ヒト神経膠組織における発現の有意なアップレギュレーションを示す。
ＤＮＡ２３７６３７（ＴＡＴ１８８、Ｅ１６）に由来するプローブを用いるノーザンブロット分析もまた行い、結果は、ヒト、乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓における発現が、同一組織タイプの正常なヒト組織と比較して、ヒト癌における発現の有意なアップレギュレーションを証明することを示した。
実施例１７：ｓｉＲＮＡによるＴＡＴ発現の変調
ｓｉＲＮＡは、小分子または抗体のような伝統的なアンタゴニストが失敗した遺伝子発現の変調の実験においてツールとして有用なことが判明した（Ｓｈｉ Ｙ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９（１）：９−１２（２００３））。長さが２１ないし２３ヌクレオチドであるイン・ビトロで合成された二本鎖ＲＮＡは干渉性ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）として作用することができ、遺伝子発現を有意に阻害することができる（Ｆｉｒｅ Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９１；８０６−８１０（１９９９））。これらのｉＲＮＡは、それらの標的ＲＮＡの分解を媒介することによって作用する。それらは長さが３０ヌクレオチド未満であるので、しかしながら、それらは細胞抗ウイルス防御メカニズムをトリガーしない。そのようなメカニズムはインターフェロンの生産、および宿主細胞蛋白質合成の一般的シャットダウンを含む。現実的には、ｓｉＲＮＡを合成することができ、次いで、ＤＮＡベクターにクローン化することができる。そのようなベクターをトランスフェクトし、ｓｉＲＮＡを高レベルで発現させることができる。高レベルのｓｉＲＮＡ発現を用いて、細胞で生産された蛋白質の量を「ノックダウンさせ」または有意に低下させ、かくして、それは、蛋白質の過剰発現が癌のような障害に関連すると考えられる実験に有用である。ＴＡＴは細胞表面発現腫瘍抗原である、ＴＡＴ過剰発現はマイクロアレイ、ＴａｑｍａｎＴＭおよびイン・サイチュハイブリダイゼーション分析によって示された。ＴＡＴ１８８のようなＴＡＴに結合する抗体は、本明細書中においては、腫瘍抗原の機能を阻害し、およびトキシン−結合体化抗体に関しては、細胞殺傷を引き起こすことが示されているが、ｓｉＲＮＡは、抗原の細胞生産を制限することによってＴＡＴ蛋白質に対して有用なアンタゴニストである。
実験の方法および結果：ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）
以下の実験は、（本明細書中においてはＥ１６ともいう）ＴＡＴ１８８に特異的なｓｉＲＮＡが、ＲＮＡ発現、蛋白質生産、細胞表面発現、および蛋白質機能を低下させることを示す。同一または同様な手法は有用であり、本発明の他のＴＡＴ ＲＮＡのｓｉＲＮＡダウンレギュレーションを示す。標的配列の選択は、いずれかの適当な手法によって行うことができる（例えば、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ，Ｍ．Ａｎｄ Ｐｒｙｄｚ，Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ３１６：１０５０−１０５８（２００４）参照）。
Ｅ１６ ｓｉＲＮＡの一過性トランスフェクションは、ＰＣ３−Ｅ１６−ＣＦＰ細胞におけるＥ１６−ＧＦＰの発現を低下させる。
前立腺癌細胞系であるＰＣ３を実験のこの組で用いた。というのは、それはＴＡＴ１８８を内因的に過剰発現するからである。ＰＣ３細胞は、ＴＡＴ１８８（ｓｉＴＡＴ１８８）に対して向けられた二本鎖２１量体ＲＮＡオリゴ、ラミンを用いてトランスフェクトし、あるいはモックトランスフェクトした。これらのオリゴは以下にリストする。
ｓｉＲＮＡオリゴ：
ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）
ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）のコーディング配列内の標的領域のＤＮＡ配列を以下に示し、続いて、二本鎖ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンスストランドの配列を示す。
ＡＡＧＧＡＡＧＡＧＧＣＧＣＧＧＧＡＧＡＡＧ（配列番号１５５）は、本明細書中に開示されたＴＡＴ１８８ ｓｉＲＮＡの例で用いられるｓｉＲＮＡオリゴによって標的化されたＴＡＴ１８８コーディング領域内の核酸配列である。他の配列は、ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンシングの分野での標準的なプラクティスに従って標的として選択することができる。
ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ｓｉＲＮＡオリゴ：
センス：ｒ（ＧＧＡＡＧＡＧＧＣＧＣＧＧＧＡＧＡＡＧ）ＴＴ（配列番号１５６）
アンチセンス：ｒ（ＣＵＵＣＵＣＣＣＧＣＧＣＣＵＣＵＵＣＣ）ＴＴ（配列番号１５７）
シラミンｓｉＲＮＡオリゴ：
センス：ｒ（ＣＵＧＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡ）ＴＴ（配列番号１５８）
アンチセンス：ｒ（ＵＧＵＵＣＵＧＧＡＡＧＵＣＣＡＧ）ＴＴ（配列番号１５９）
（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８（２００１）参照）
トランスフェクションから２日後に、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ポリペプチド ｖｓ Ｅ１６−ＥＧＦＰ発現のノックダウンの相対的レベルを、ＥＧＦＰ蛍光の蛍光顕微鏡モニタリングによって分析した。Ｅ１６発現の現象は、検出されたＥＧＦＰ生産およびバイオルミネセンスの低下に平行する。図１６４における結果は、ｓｉＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ｓｉＲＮＡでの一過的トランスフェクションはＥ１６−ＥＧＦＰ融合発現を低下させたことを示す。図１６４および１６４において「ＧＦＰ」という融合蛋白質は、Ｅ１６遺伝子をＢＤＣｌｏｎｔｅｃｈからのｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターにクローン化することによって生産されたＥ１６−ＥＧＦＰ融合という。
Ｂ．Ｅ１６ ｓｉＲＮＡの一過的トランスフェクションは、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ポリペプチド生産を低下させる。
Ｅ１６発現の低下は、ウエスタンブロット分析を用いてＥ１６蛋白質の低下によって示された。本実施例で用いたｓｉＴＡＴ１８８（ｓｉＥ１６）ＲＮＡオリゴ配列番号１５６および配列番号１５７、およびラミンｓｉＲＮＡオリゴ配列番号１５８および配列番号１５９は、本実施例のパートＡにて前記で示したのと同一であった。Ｅ１６−ＥＧＦＰで一過的にトランスフェクトされたＰＣ３細胞はトランスフェクションから３日後に収穫し、ウエスタンブロットをベータ−チューブリンバンドに対して行って、蛋白質負荷を示した。ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）−ＧＦＰ融合のウエスタンブロットは、検出可能に標識された抗−ＧＦＰ抗体を用いて可視化した（図１６５、左側レーン−モックトランスフェクション；右側レーン、Ｅ１６ ｓｉＲＮＡトランスフェクション参照）。結果は、Ｅ１６−ＧＦＰ融合蛋白質を発現する細胞におけるＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ｓｉＲＮＡは、Ｅ１６−ＧＦＰの発現を有意に低下させたことを示す。
Ｃ．Ｅ１６ ｓｉＲＮＡの一過的トランスフェクションは、ＰＣ３細胞において内因性Ｅ１６アミノ酸トランスポーター活性を阻害する。
ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ｓｉＲＮＡおよびラミンｓｉＲＮＡ（対照）の一過的トランスフェクションについて同一の手法を行った。テストおよび対照細胞は、本明細書中において前記したロイシン輸送アッセイを用いて、以下のように、アミノ酸輸送蛋白質としてのＥ１６活性についてテストした。図１６６における結果は、Ｅ１６ ＲＮＡおよび蛋白質生産におけるＥ１６ ｓｉＲＮＡ低下が、細胞におけるアミノ酸輸送での機能に対して利用できるＥ１６の量の低下と合致することを示す。
Ｄ．Ｅ１６ ｓｉＲＮＡの一過的トランスフェクションは、Ｅ１６の表面発現を低下させる。
本実施例は以下のように行った。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションから４８時間後に、細胞をＦＡＣＳによって分析した。簡単に述べれば、細胞を一次抗体と共に氷上で１時間インキュベートした。次いで、細胞を、（非限定的例であるＣｙ−３またはＰＥのような）蛍光色素と結合体化した二次抗体で標識し、ＦＡＣＳｃａｓｉｂｅｒＴＭまたはＦＡＣＳｃａｎＴＭでデータを収集した。収集されたデータは、非限定的例であるＣｅｌｌｑｕｅｓｔＴＭ（ＢＤ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはＦｌｏｗＪｏＴＭ （Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて分析した。本明細書中において、実施例１２に開示されたように、３つの抗−Ｅ１６モノクローナル抗体、３Ｂ５、１２Ｂ９、および１２Ｇ１２は、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後にＰＣ３細胞上で余り結合しないことが示され、これは、標的化ｓｉＲＮＡの存在下におけるＥ１６蛋白質の低下した発現と合致する（図１５６参照）。
Ｅ．ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ｓｉＲＮＡの一過的トランスフェクションは、ＰＣ３細胞増殖を阻害する。
ＴＡＴ１８８を標的化するｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＰＣ３細胞の増殖が、以下の商業的プロトコルに従ってアッセイすることができる（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＴＢ２８８；Ｍｅｎｄｏｚａ ｅｔ ａｌ．（２２０２） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：５４８５−５４８８）。例えば、ＰＣ３細胞を、６ウェルプレートにおいて３．５×１０５細胞／ウェルで平板培養した。翌日、１００ｎＭの最終濃度の（ｓｉＲＮＡオリゴ配列番号１５７および配列番号１５８を用いる）二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ，配列番号１５５および配列番号１５６）またはラミン対照ｓｉＲＮＡを用いて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（インビトロゲン）を用いて細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後に、細胞を９６ウェルプレートに再度撒き、細胞生存性を、図１６７に示した時点においてＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇキット−８ＴＭ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いて測定し、ここに、ＲＬＵ＝相対的ルミネセンスユニットである。この方法によってアッセイすることができる他の細胞がもしそれらが（内因的に、またはＴＡＴ１８８をコードする核酸でのトランスフェクションの後に）ＴＡＴ１８８を発現するならば、限定されるものではないが、ＳＫＢＲ−３、ＢＴ４７４、ＭＣＦ７またはＭＤＡ−ＭＢ−４６８を含み、乳癌細胞におけるＥ１６発現の結果、細胞殺傷が起こり、乳癌、ならびに前立腺、結直腸および他のタイプの癌は、Ｅ１６発現ノックダウンを用いる治療で望ましい標的であることを示す。
これらのデータは、ｓｉＲＮＡが、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）蛋白質のようなＴＡＴ蛋白質の発現を「ノックダウンし」または低下させることができることを示す。該低下は、（イン・サイチュハイブリダイゼーションアッセイにおける）ＲＮＡ発現の低下、（ウエスタンブロット分析に示されるような）低下した蛋白質生産、（ＦＡＣＳ分析および内部化アッセイによって示されるような）ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）の低下した細胞表面発現、および（アミノ酸輸送の低下によって示されるような）低下した機能によって示される。長時間にわたってのＴＡＴ１８８（Ｅ１６）のようなＴＡＴ蛋白質のｓｉＲＮＡ低下の結果、癌細胞系における細胞増殖の低下がもたらされる。従って、ｓｉＲＮＡは、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）のようなＴＡＴ蛋白質を低下させるのに有用である。ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）のようなＴＡＴ蛋白質のレベルの低下は、癌細胞系の増殖の低下を引き起こす。癌は細胞増殖性障害であるので、これらの結果は、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）のようなＴＡＴポリペプチドのアンタゴニストが、癌細胞増殖の低下で有用であろうことを示す。癌細胞増殖の低下は、哺乳動物における癌の軽減で有用であろう。
実施例１８：材料の寄託
以下のハイブリドーマ細胞系はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９ ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託してある：
ハイブリドーマ／抗体の命名 ＡＴＣＣ番号 寄託日
３Ｂ５．１ ＰＴＡ−６１９３ ２００４年９月８日
１２Ｂ９．１ ＰＴＡ−６１９４ ２００４年９月８日
１２Ｇ１２．１ ＰＴＡ−６１９５ ２００４年９月８日
この寄託は、特許手続の目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約、およびその下の規則（ブダペスト条約）の規定の下でなされた。これは、寄託日からの３０年の生きた培養の維持を保証する。細胞系は、ブダペスト条約の期間の下でＡＴＣＣによって利用可能とされ、（ａ）３７ ＣＦＲ §１．１４および３５ ＵＳＣ §１２２の下で、それに対して権限を有する長官によって決定されたものに対して、培養へのアクセスが特許出願の係属の間に利用可能となり、および（ｂ）そのように寄託された培養の公衆への利用可能性に対する全ての制限は特許の許可に際して最終的に解除されることを保証する、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．およびＡＴＣＣの間の合意に従う。
特許出願の譲受人は、寄託された培養がもし適当な条件下で培養した場合に死滅するか、または失われ、または破壊されるならば、それは同一培養の生きた検体で通知により迅速に置き換えられることに合意した。寄託された細胞系の入手可能性は、その特許法に従ったいずれの政府の権限の下で許可された権利に違反して本発明を実施するライセンスと解釈されるべきではない。
これまでの書面による明細書は、当業者が本発明を実施することができるのに十分であると考えられる。本発明は寄託された構築体によってその範囲が限定されるものではない。というのは、寄託された具体例は、本発明のある態様の単一の説明として意図され、機能的に同等ないずれの構築体も本発明の範囲内にあるからである。本明細書中における材料の寄託は、ここに含まれる書面による記載が、そのベストモードを含めた本発明のいずれの態様の実施を可能とするのに不適切であることを認めるものではなく、また、それを表す具体的説明に特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきものではない。事実、本明細書中に示し記載したものに加えて本発明の種々の修飾は、前記記載から当業者に明らかであり、それは特許請求の範囲の範囲内に入る。
図１はＴＡＴ１６１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示し、ここに、配列番号１は本明細書中において「ＤＮＡ７７５０７」と命名されるクローンである。 図２ＡないしＢは、ＴＡＴ１０１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）を示し、ここに、配列番号２は本明細書中において「ＤＮＡ８０８９４」と命名されるクローンである。 図３はＴＡＴ１５７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）を示し、ここに、配列番号３は本明細書中において「ＤＮＡ８２３４３」と命名されるクローンである。 図４はＴＡＴ１６０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４）を示し、ここに、配列番号４は本明細書中において「ＤＮＡ８７９９４」と命名されるクローンである。 図５はＴＡＴ１５８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５）を示し、ここに、配列番号５は本明細書中において「ＤＮＡ８８１３１」と命名されるクローンである。 図６はＴＡＴ１１０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６）を示し、ここに、配列番号６は本明細書中において「ＤＮＡ９５９３０」と命名されるクローンである。 図７はＴＡＴ２１０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７）を示し、ここに、配列番号７は本明細書中において「ＤＮＡ９５９３０−１」と命名されるクローンである。 図８はＴＡＴ１５９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号８）を示し、ここに、配列番号８は本明細書中において「ＤＮＡ９６９１７」と命名されるクローンである。 図９はＴＡＴ１１２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号９）を示し、ここに、配列番号９は本明細書中において「ＤＮＡ９６９３０」と命名されるクローンである。 図１０はＴＡＴ１４７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１０）を示し、ここに、配列番号１０は本明細書中において「ＤＮＡ９６９３６」と命名されるクローンである。 図１１はＴＡＴ１４５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１１）を示し、ここに、配列番号１１は本明細書中において「ＤＮＡ９８５６５」と命名されるクローンである。 図１２はＴＡＴ１５２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１２）を示し、ここに、配列番号１２は本明細書中において「ＤＮＡ２４６４３５」と命名されるクローンである。 図１３はＴＡＴ１６２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１３）を示し、ここに、配列番号１３は本明細書中において「ＤＮＡ９８５９１」と命名されるクローンである。 図１４はＴＡＴ１１４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１４）を示し、ここに、配列番号１４は本明細書中において「ＤＮＡ１０８８０９」と命名されるクローンである。 図１５はＴＡＴ１１９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１５）を示し、ここに、配列番号１５は本明細書中において「ＤＮＡ１１９４８８」と命名されるクローンである。 図１６はＴＡＴ１０３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１６）を示し、ここに、配列番号１６は本明細書中において「ＤＮＡ１４３４９３」と命名されるクローンである。 図１７ＡないしＢはＴＡＴ１３０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１７）を示し、ここに、配列番号１７は本明細書中において「ＤＮＡ１６７２３４」と命名されるクローンである。 図１８はＴＡＴ１６６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１８）を示し、ここに、配列番号１８は本明細書中において「ＤＮＡ２３５６２１」と命名されるクローンである。 図１９はＴＡＴ１３２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１９）を示し、ここに、配列番号１９は本明細書中において「ＤＮＡ１７６７６６」と命名されるクローンである。 図２０はＴＡＴ１５０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２０）を示し、ここに、配列番号２０は本明細書中において「ＤＮＡ２３６４６３」と命名されるクローンである。 図２１はＴＡＴ１２９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２１）を示し、ここに、配列番号２１は本明細書中において「ＤＮＡ１８１１６２」と命名されるクローンである。 図２２はＴＡＴ１１１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２２）を示し、ここに、配列番号２２は本明細書中において「ＤＮＡ１８８２２１」と命名されるクローンである。 図２３はＴＡＴ１４６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２３）を示し、ここに、配列番号２３は本明細書中において「ＤＮＡ２３３８７６」と命名されるクローンである。 図２４はＴＡＴ１４８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２４）を示し、ここに、配列番号２４は本明細書中において「ＤＮＡ１９３８９１」と命名されるクローンである。 図２５はＴＡＴ１８７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２５）を示し、ここに、配列番号２５は本明細書中において「ＤＮＡ２４８１７０」と命名されるクローンである。 図２６はＴＡＴ１１８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２６）を示し、ここに、配列番号２６は本明細書中において「ＤＮＡ１９４６２８」と命名されるクローンである。 図２７はＴＡＴ１６７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２７）を示し、ここに、配列番号２７は本明細書中において「ＤＮＡ２４６４１５」と命名されるクローンである。 図２８はＴＡＴ１２３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２８）を示し、ここに、配列番号２８は本明細書中において「ＤＮＡ２１０４９９」と命名されるクローンである。 図２９はＴＡＴ２１１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２９）を示し、ここに、配列番号２９は本明細書中において「ＤＮＡ２１９８９４」と命名されるクローンである。 図３０はＴＡＴ１１３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３０）を示し、ここに、配列番号３０は本明細書中において「ＤＮＡ２１５６０９」と命名されるクローンである。 図３１はＴＡＴ１２８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３１）を示し、ここに、配列番号３１は本明細書中において「ＤＮＡ２２０４３２」と命名されるクローンである。 図３２ＡないしＢはＴＡＴ１６４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３２）を示し、ここに、配列番号３２は本明細書中において「ＤＮＡ２２６０９４」と命名されるクローンである。 図３３はＴＡＴ１２２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３３）を示し、ここに、配列番号３３は本明細書中において「ＤＮＡ２２６１６５」と命名されるクローンである。 図３４はＴＡＴ１１７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３４）を示し、ここに、配列番号３４は本明細書中において「ＤＮＡ２２６２３７」と命名されるクローンである。 図３５はＴＡＴ１６８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３５）を示し、ここに、配列番号３５は本明細書中において「ＤＮＡ２４６４５０」と命名されるクローンである。 図３６はＴＡＴ１４４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３６）を示し、ここに、配列番号３６は本明細書中において「ＤＮＡ２２６４５６」と命名されるクローンである。 図３７はＴＡＴ１８８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３７）を示し、ここに、配列番号３７は本明細書中において「ＤＮＡ２３７６３７」と命名されるクローンである。 図３８はＴＡＴ１２６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３８）を示し、ここに、配列番号３８は本明細書中において「ＤＮＡ２２６５３９」と命名されるクローンである。 図３９はＴＡＴ１５１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３９）を示し、ここに、配列番号３９は本明細書中において「ＤＮＡ２３６５１１」と命名されるクローンである。 図４０はＴＡＴ１１５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４０）を示し、ここに、配列番号４０は本明細書中において「ＤＮＡ２２６７７１」と命名されるクローンである。 図４１はＴＡＴ１６３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４１）を示し、ここに、配列番号４１は本明細書中において「ＤＮＡ２２７０８７」と命名されるクローンである。 図４２はＴＡＴ２２７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４２）を示し、ここに、配列番号４２は本明細書中において「ＤＮＡ２６６３０７」と命名されるクローンである。 図４３はＴＡＴ２２８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４３）を示し、ここに、配列番号４３は本明細書中において「ＤＮＡ２６６３１１」と命名されるクローンである。 図４４はＴＡＴ２２９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４４）を示し、ここに、配列番号４４は本明細書中において「ＤＮＡ２６６３１２」と命名されるクローンである。 図４５はＴＡＴ２３０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４５）を示し、ここに、配列番号４５は本明細書中において「ＤＮＡ２６６３１３」と命名されるクローンである。 図４６はＴＡＴ１２１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４６）を示し、ここに、配列番号４６は本明細書中において「ＤＮＡ２２７２２４」と命名されるクローンである。 図４７はＴＡＴ１８３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４７）を示し、ここに、配列番号４７は本明細書中において「ＤＮＡ２４７４８６」と命名されるクローンである。 図４８はＴＡＴ１６５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４８）を示し、ここに、配列番号４８は本明細書中において「ＤＮＡ２２７５７８」と命名されるクローンである。 図４９はＴＡＴ１３１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４９）を示し、ここに、配列番号４９は本明細書中において「ＤＮＡ２２７８００」と命名されるクローンである。 図５０はＴＡＴ１４０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５０）を示し、ここに、配列番号５０は本明細書中において「ＤＮＡ２２７９０４」と命名されるクローンである。 図５１はＴＡＴ１２７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５１）を示し、ここに、配列番号５１は本明細書中において「ＤＮＡ２２８１９９」と命名されるクローンである。 図５２はＴＡＴ１１６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５２）を示し、ここに、配列番号５２は本明細書中において「ＤＮＡ２２８２０１」と命名されるクローンである。 図５３はＴＡＴ１８９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５３）を示し、ここに、配列番号５３は本明細書中において「ＤＮＡ２４７４８８」と命名されるクローンである。 図５４はＴＡＴ１９０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５４）を示し、ここに、配列番号５４は本明細書中において「ＤＮＡ２３６５３８」と命名されるクローンである。 図５５はＴＡＴ１９１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５５）を示し、ここに、配列番号５５は本明細書中において「ＤＮＡ２４７４８９」と命名されるクローンである。 図５６はＴＡＴ１３３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５６）を示し、ここに、配列番号５６は本明細書中において「ＤＮＡ２２８２１１」と命名されるクローンである。 図５７はＴＡＴ１８６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５７）を示し、ここに、配列番号５７は本明細書中において「ＤＮＡ２３３９３７」と命名されるクローンである。 図５８はＴＡＴ１２０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５８）を示し、ここに、配列番号５８は本明細書中において「ＤＮＡ２２８９９３」と命名されるクローンである。 図５９はＴＡＴ１２４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５９）を示し、ここに、配列番号５９は本明細書中において「ＤＮＡ２２８９９４」と命名されるクローンである。 図６０はＴＡＴ１０５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６０）を示し、ここに、配列番号６０は本明細書中において「ＤＮＡ２２９４１０」と命名されるクローンである。 図６１ＡないしＢはＴＡＴ１０７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６１）を示し、ここに、配列番号６１は本明細書中において「ＤＮＡ２２９４１１」と命名されるクローンである。 図６２ＡないしＢはＴＡＴ１０８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６２）を示し、ここに、配列番号６２は本明細書中において「ＤＮＡ２２９４１３」と命名されるクローンである。 図６３ＡないしＢはＴＡＴ１３９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６３）を示し、ここに、配列番号６３は本明細書中において「ＤＮＡ２２９７００」と命名されるクローンである。 図６４はＴＡＴ１４３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６４）を示し、ここに、配列番号６４は本明細書中において「ＤＮＡ２３１３１２」と命名されるクローンである。 図６５はＴＡＴ１００ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６５）を示し、ここに、配列番号６５は本明細書中において「ＤＮＡ２３１５４２」と命名されるクローンである。 図６６はＴＡＴ２８４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６６）を示し、ここに、配列番号６６は本明細書中において「ＤＮＡ２３１５４２−１」と命名されるクローンである。 図６７はＴＡＴ２８５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６７）を示し、ここに、配列番号６７は本明細書中において「ＤＮＡ２３１５４２−２」と命名されるクローンである。 図６８はＴＡＴ２８５−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６８）を示し、ここに、配列番号６８は本明細書中において「ＤＮＡ２９７３９３」と命名されるクローンである。 図６９はＴＡＴ１２５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６９）を示し、ここに、配列番号６９は本明細書中において「ＤＮＡ２３２７５４」と命名されるクローンである。 図７０はＴＡＴ１４９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７０）を示し、ここに、配列番号７０は本明細書中において「ＤＮＡ２３４８３３」と命名されるクローンである。 図７１はＴＡＴ２３１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７１）を示し、ここに、配列番号７１は本明細書中において「ＤＮＡ２６８０２２」と命名されるクローンである。 図７２はＴＡＴ１５３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７２）を示し、ここに、配列番号７２は本明細書中において「ＤＮＡ２３６２４６」と命名されるクローンである。 図７３はＴＡＴ１０４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７３）を示し、ここに、配列番号７３は本明細書中において「ＤＮＡ２３６３４３」と命名されるクローンである。 図７４はＴＡＴ１４１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７４）を示し、ここに、配列番号７４は本明細書中において「ＤＮＡ２３６４９３」と命名されるクローンである。 図７５はＴＡＴ１０２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７５）を示し、ここに、配列番号７５は本明細書中において「ＤＮＡ２３６５３４」と命名されるクローンである。 図７６はＴＡＴ１０９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７６）を示し、ここに、配列番号７６は本明細書中において「ＤＮＡ２４６４３０」と命名されるクローンである。 図７７はＴＡＴ１４２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７７）を示し、ここに、配列番号７７は本明細書中において「ＤＮＡ２４７４８０」と命名されるクローンである。 図７８ＡないしＢはＴＡＴ１０６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７８）を示し、ここに、配列番号７８は本明細書中において「ＤＮＡ２６４４５４」と命名されるクローンである。 図７９は、図１に示された配列番号１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号７９）を示す。 図８０は、図２に示された配列番号２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８０）を示す。 図８１は、図３に示された配列番号３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８１）を示す。 図８２は、図４に示された配列番号４のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８２）を示す。 図８３は、図５に示された配列番号５のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８３）を示す。 図８４は、図６に示された配列番号６のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８４）を示す。 図８５は、図７に示された配列番号７のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８５）を示す。 図８６は、図８に示された配列番号８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８６）を示す。 図８７は、図９に示された配列番号９のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８７）を示す。 図８８は、図１０に示された配列番号１０のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８８）を示す。 図８９は、図１１に示された配列番号１１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８９）を示す。 図９０は、図１２に示された配列番号１２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９０）を示す。 図９１は、図１３に示された配列番号１３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９１）を示す。 図９２は、図１４に示された配列番号１４のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９２）を示す。 図９３は、図１５に示された配列番号１５のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９３）を示す。 図９４は、図１６に示された配列番号１６のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９４）を示す。 図９５は、図１７ＡないしＢに示された配列番号１７のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９５）を示す。 図９６は、図１８に示された配列番号１８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９６）を示す。 図９７は、図１９に示された配列番号１９のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９７）を示す。 図９８は、図２０に示された配列番号２０のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９８）を示す。 図９９は、図２１に示された配列番号２１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９９）を示す。 図１００は、図２２に示された配列番号２２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１００）を示す。 図１００は、図２２に示された配列番号２２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１００）を示す。 図１０１は、図２３に示された配列番号２３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０１）を示す。 図１０１は、図２３に示された配列番号２３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０１）を示す。 図１０２は、図２４に示された配列番号２４のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０２）を示す。 図１０３は、図２５に示された配列番号２５のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０３）を示す。 図１０４は、図２６に示された配列番号２６のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０４）を示す。 図１０５は、図２７に示された配列番号２７のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０５）を示す。 図１０６は、図２８に示された配列番号２８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０６）を示す。 図１０７は、図２９に示された配列番号２９のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０７）を示す。 図１０８は、図３０に示された配列番号３０のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０８）を示す。 図１０９は、図３１に示された配列番号３１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０９）を示す。 図１１０ＡないしＢは、図３２ＡないしＢに示された配列番号３２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１０）を示す。 図１１０ＡないしＢは、図３２ＡないしＢに示された配列番号３２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１０）を示す。 図１１０ＡないしＢは、図３２ＡないしＢに示された配列番号３２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１０）を示す。 図１１１は、図３３に示された配列番号３３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１１）を示す。 図１１２は、図３４に示された配列番号３４のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１２）を示す。 図１１３は、図３５に示された配列番号３５のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１３）を示す。 図１１４は、図３６に示された配列番号３６のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１４）を示す。 図１１５は、図３７に示された配列番号３７のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１５）を示す。 図１１６は、図３８に示された配列番号３８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１６）を示す。 図１１７は、図３９に示された配列番号３９のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１７）を示す。 図１１８は、図４０に示された配列番号４０のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１８）を示す。 図１１９は、図４１に示された配列番号４１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１９）を示す。 図１２０は、図４２に示された配列番号４２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２０）を示す。 図１２１は、図４３に示された配列番号４３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２１）を示す。 図１２２は、図４４に示された配列番号４４のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２２）を示す。 図１２３は、図４５に示された配列番号４５のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２３）を示す。 図１２４は、図４６に示された配列番号４６のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２４）を示す。 図１２５は、図４７に示された配列番号４７のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２５）を示す。 図１２６は、図４８に示された配列番号４８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２６）を示す。 図１２７は、図４９に示された配列番号４９のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２７）を示す。 図１２７は、図４９に示された配列番号４９のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２７）を示す。 図１２８は、図５０に示された配列番号５０のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２８）を示す。 図１２９は、図５１に示された配列番号５１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２９）を示す。 図１２９は、図５１に示された配列番号５１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２９）を示す。 図１３０は、図５２に示された配列番号５２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３０）を示す。 図１３１は、図５３に示された配列番号５３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３１）を示す。 図１３２は、図５４に示された配列番号５４のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３２）を示す。 図１３３は、図５５に示された配列番号５５のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３３）を示す。 図１３４は、図５６に示された配列番号５６のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３４）を示す。 図１３５は、図５７に示された配列番号５７のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３５）を示す。 図１３６は、図５８に示された配列番号５８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３６）を示す。 図１３７は、図５９に示された配列番号５９のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３７）を示す。 図１３８は、図６０に示された配列番号６０のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３８）を示す。 図１３９は、図６１ＡないしＢに示された配列番号６１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３９）を示す。 図１４０は、図６２ＡないしＢに示された配列番号６２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４０）を示す。 図１４１は、図６３ＡないしＢに示された配列番号６３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４１）を示す。 図１４２は、図６４に示された配列番号６４のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４２）を示す。 図１４３は、図６６に示された配列番号６６のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４３）を示す。 図１４４は、図６７に示された配列番号６７のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４４）を示す。 図１４５は、図６８に示された配列番号６８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４５）を示す。 図１４６は、図６９に示された配列番号６９のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４６）を示す。 図１４７は、図７０に示された配列番号７０のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４７）を示す。 図１４７は、図７０に示された配列番号７０のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４７）を示す。 図１４８は、図７１に示された配列番号７１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４８）を示す。 図１４８は、図７１に示された配列番号７１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４８）を示す。 図１４９は、図７３に示された配列番号７３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４９）を示す。 図１５０は、図７４に示された配列番号７４のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１５０）を示す。 図１５１は、図７５に示された配列番号７５のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１５１）を示す。 図１５２は、図７６に示された配列番号７６のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１５２）を示す。 図１５３は、図７７に示された配列番号７７のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１５３）を示す。 図１５４は、図７８ＡないしＢに示された配列番号７８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１５４）を示す。 図１５４は、図７８ＡないしＢに示された配列番号７８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１５４）を示す。 図１５５は、ナトリウムイオン独立性の大きな中性アミノ酸トランスポーターのサブユニットとしてのＥ１６ポリペプチド（ＴＡＴ１８８）の三次元構造を示すダイアグラムである。 図１５６は、ＰＣ３細胞表面への抗−ＴＡＴ１８８（抗−Ｅ１６）抗体の結合（緑色プロット）およびＴＡＴ１８８発現の低下に伴う結合の低下（赤色プロット）を示すＦＡＣＳプロットのグラフ結果を示す。 図１５７は、ＴＡＴ１８８−発現ＰＣ３細胞の表面への結合後の抗−ＴＡＴ１８８抗体の内部化を示す。 図１５８は、経時的な、抗−ＴＡＴ１８８抗体の存在下におけるＴＡＴ１８８アミノ酸輸送活性の変化を示す棒グラフである。 図１５９は、ＰＣ３およびＣｏｌｏ２０５細胞における増大する量のＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥトキシン−結合体化された抗−ＴＡＴ１８８抗体の存在下での細胞生存性のプロットを供する。 図１６０は、Ｃｏｌｏ２０５細胞における、増大する量のＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥまたはＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦトキシン−結合体化された抗−ＴＡＴ１８８抗体の存在下での細胞生存性のプロットである。 図１６１は、Ｅ１６ポリペプチドを内因的に発現する抗−ヒトＥ１６抗体結合細胞の結果を示し、ここに、細胞はサルＣＯＳ７細胞、ヒトＭＣＦ１０Ａ乳癌細胞、およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。図１６１Ａは、サルＣＯＳへの抗−Ｅ１６抗体３Ｂ５、１２Ｂ９、および１２Ｇ１２の結合のＦＡＣＳ結果を示す。図１６１Ｂは、ヒト乳癌細胞系ＭＣＦ１０Ａへの抗−Ｅ１６ ３Ｂ５の結合を示し、およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞への結合が無いことを示す。 図１６２は、裸の（トキシンが結合体化していない）抗−Ｅ１６抗体が投与された異種移植片マウスにおける経時的な平均腫瘍容量変化のプロットである。 図１６３は、トキシン−結合体化された抗−Ｅ１６抗体が投与された異種移植片マウスにおける経時的な平均腫瘍容量変化のグラフであり、ここに、トキシンはＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥまたはＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦいずれかであった。 図１６４は、Ｅ１６−ＧＦＰ融合ポリペプチドの発現がＥ１６遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞で低下することを示す。頂部パネルは、ＧＦＰの存在についてのバイオルミネセンスアッセイの結果の写真である。下方パネルは、ＧＦＰバイオルミネセンス低下が細胞数の低下によって引き起こされなかったことを示す移送コントラスト可視化の写真である。 図１６５は、Ｅ１６−ＧＦＰ融合ポリペプチド発現が、Ｅ１６ ｓｉＲＮＡで一過的にトランスフェクトされたＰＣ３細胞で阻害されることを示すウエスタンブロットである。β−チューブリンはゲル負荷対照である。 図１６６は、ＰＣ３細胞のＥ１６ ｓｉＲＮＡでの一過的なトランスフェクションがアミノ酸輸送機能の低下に関連し、Ｅ１６の低下した発現と合致することを示す。 図１６７は、Ｅ１６ ｓｉＲＮＡでの一過的なトランスフェクションの有りおよび無しでの経時的な細胞増殖のプロットである。細胞増殖は、Ｅ１６で一過的にトランスフェクトされたＰＣ３細胞で低下する。

Claims (61)

  1. （ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
    （ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されたポリペプチド；
    （ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されたポリペプチドの細胞外ドメイン；
    （ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されたポリペプチドの細胞外ドメイン；
    （ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されたヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
    （ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されたヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
    に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合する、単離された抗体。
  2. （ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されたアミノ酸配列；
    （ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されたアミノ酸配列；
    （ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
    （ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
    （ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列；または
    （ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されたヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされたアミノ酸配列；
    を有するポリペプチドに結合する、単離された抗体。
  3. モノクローナル抗体である、請求項１記載の抗体。
  4. 抗体断片である、請求項１記載の抗体。
  5. キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１記載の抗体。
  6. 成長阻害剤に結合体化された、請求項１記載の抗体。
  7. 細胞傷害性剤に結合体化された、請求項１記載の抗体。
  8. 前記細胞傷害性剤が、トキシン、抗体、放射性同位体およびヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される、請求項７記載の抗体。
  9. 前記細胞傷害性剤がトキシンである、請求項７記載の抗体。
  10. 前記トキシンが、アウリスタチン、メイタンシノイドおよびカリケアミシンよりなる群から選択される、請求項９記載の抗体。
  11. 前記トキシンがメイタンシノイドである、請求項９記載の抗体。
  12. 細菌において生産される、請求項１記載の抗体。
  13. ＣＨＯ細胞において生産される、請求項１記載の抗体。
  14. 結合する細胞の死滅を誘導する、請求項１記載の抗体。
  15. 検出可能に標識される、請求項１記載の抗体。
  16. 前記トキシンは、ＭＭＡＥ（モノ−メチルアウリスタチンＥ）、ＭＭＡＦおよびＡＥＶＢ（アウリスタチンＥバレリルベンジルヒドラゾン）、およびＡＦＰ（アウリスタチンＦフェニレンジアミン）よりなる群から選択される、請求項９記載の抗体。
  17. 前記トキシンがリンカーによって抗体に共有結合した、請求項９記載の抗体。
  18. 前記リンカーが、マレイミドカプロイル（ＭＣ）、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ，ｖｃ）、シトルリン（２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸）、ＰＡＢ（ｐ−アミノベンジルカルバモイル）、Ｍｅ（Ｎ−メチル−バリンシトルリン）、ＭＣ（ＰＥＧ）６−ＯＨ（マレイミドカプロイル−ポリエチレングリコール）、ＳＰＰ（４−（２−ピリジルチオ）ペンタン酸Ｎ−スクシンイミジル）、ＳＭＣＣ（Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート）、およびＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢよりなる群から選択される、請求項１７記載の抗体。
  19. 前記トキシンがＭＭＡＥである、請求項１６記載の抗体。
  20. 前記トキシンがＭＭＡＦである、請求項１６記載の抗体。
  21. 前記リンカーがＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢである、請求項１９または２０記載の抗体。
  22. 前記抗体がＴＡＴ１８８ポリペプチドに結合する、請求項１ないし２１いずれか１項に記載の抗体。
  23. 前記抗体が、ＴＡＴ１８８を発現する細胞の増殖を阻害するか、または該細胞の細胞死滅を誘導する、請求項２２記載の抗体。
  24. 前記細胞が癌細胞である、請求項２３記載の抗体。
  25. 前記癌細胞が、乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚、および肝臓よりなる群から選択される請求項２４記載の抗体。
  26. ＴＡＴ１８８ポリペプチドのエピトープとの結合に競合する単離された抗体であって、該ＴＡＴ１８８ポリペプチドは、３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産された抗体によって結合されている、抗体。
  27. ３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産される抗体の生物学的活性を有する単離された抗体であって、ここで、該生物学的活性が、ＴＡＴ１８８を発現する細胞における細胞増殖の阻害または細胞死滅の促進である、抗体。
  28. ３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産される抗体のＣＤＲの少なくとも１、２、３、４、５または６のアミノ酸配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を有するアミノ酸配列を、対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）において含む、単離された抗体。
  29. 前記抗体が、３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産される抗体のＣＤＲの少なくとも１、２、３、４、５または６のアミノ酸配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を有するアミノ酸配列を、対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）において含む、請求項１ないし２１いずれか１項に記載の抗体。
  30. 前記抗体が、３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産される抗体の生物学的活性を呈し、ここで、該生物学的活性は、ＴＡＴ１８８を発現する細胞における細胞増殖の阻害または細胞死滅の促進である、請求項１ないし２１いずれか１項に記載の抗体。
  31. 前記細胞が癌細胞である、請求項３０記載の抗体。
  32. 前記癌細胞が、乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓よりなる群から選択される、請求項３１記載の方法。
  33. ＴＡＴ１８８を発現する細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、該細胞を請求項１ないし２１いずれか１項に記載の抗体と接触させる工程を包含する、方法。
  34. 前記細胞が癌細胞である、請求項３３記載の方法。
  35. 前記癌細胞が、乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓よりなる群から選択される、請求項３４記載の方法。
  36. 前記癌細胞が哺乳動物細胞である、請求項３５記載の方法。
  37. 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項３６記載の方法。
  38. ＴＡＴ１８８を発現する細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、該細胞を、請求項１ないし２１いずれか１項に記載の抗体と接触させる工程を包含し、ここで、該抗体は、３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産された抗体のＣＤＲの少なくとも１、２、３、４、５または６のアミノ酸配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を有するアミノ酸配列を、対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）において含む、方法。
  39. 試験細胞で発現されるＴＡＴ１８８ポリペプチドのレベルを検出する方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）試験細胞および対照細胞を、請求項２６記載の単離された抗−ＴＡＴ１８８抗体と接触させる工程；
    （ｂ）該抗体の結合を検出する工程；ならびに
    （ｃ）該試験細胞および対照細胞への抗体の相対的結合を決定する工程；
    を包含する、方法。
  40. 前記試験細胞および対照細胞が溶解される、請求項３９記載の方法。
  41. 前記試験細胞が組織である、請求項３９記載の方法。
  42. 前記組織が腫瘍組織である、請求項４１記載の方法。
  43. 前記腫瘍組織が、乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓よりなる群から選択される請求項４２記載の方法。
  44. 対照細胞に対する、試験細胞における、ＴＡＴ１８８ポリペプチドまたは図１１５（配列番号１１５）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドのレベルを検出する方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）試験細胞および対照細胞を、請求項１ないし５、１２ないし１５、および２６ないし２８いずれか１項に記載の単離された抗体と接触させる工程；
    （ｂ）該抗体の結合を検出する工程；ならびに
    （ｃ）該試験細胞および対照細胞に対する抗体の相対的結合を決定する工程；
    を包含する、方法。
  45. 前記試験細胞におけるＴＡＴ１８８ポリペプチドのレベルが、前記対照細胞におけるＴＡＴ１８８ポリペプチドのレベルよりも大きい、請求項４４記載の方法。
  46. 前記方法が、試験細胞を含有する組織、または試験細胞が含有されていた組織における癌を診断する、請求項４５記載の方法。
  47. （ａ）図３７（配列番号３７）に示されるヌクレオチド配列；および
    （ｂ）（ａ）の相補体、
    に対して、少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸に結合するＴＡＴ結合干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であって、
    ここで、該ｓｉＲＮＡはＴＡＴ１８８の発現を低下させる、ｓｉＲＮＡ。
  48. 請求項４７記載のｓｉＲＮＡを含む、発現ベクター。
  49. 前記ｓｉＲＮＡが、前記ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞によって認識される制御配列に操作可能に連結された、請求項４８記載の発現ベクター。
  50. 請求項４９記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  51. （ａ）請求項１記載の抗体、または
    （ｂ）請求項４７記載のｓｉＲＮＡ；
    を、キャリアと組み合わせて含む、組成物。
  52. 前記キャリアが、薬学的に受容可能なキャリアである、請求項５１記載の組成物。
  53. （ａ）容器；および
    （ｂ）該容器内に含有される請求項５１記載の組成物；
    を含む、製品。
  54. 癌の治療的処置、または癌の診断検出のための前記組成物の使用に言及する、前記容器に付着されたラベル、または該容器に含まれた添付文書をさらに含む、請求項５３記載の製品。
  55. 図１１５（配列番号１１５）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを発現する癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、該癌細胞を、該癌細胞において該アミノ酸をコードする核酸に結合するｓｉＲＮＡと接触させ、それにより、該癌細胞の増殖を阻害する工程を包含する、方法。
  56. 前記核酸が図３７（配列番号３７）に示される配列を有する、請求項５５記載の方法。
  57. 前記ポリペプチドの発現のレベルの検出が、免疫組織化学分析において抗体を使用する工程を包含する、請求項４４記載の方法。
  58. 図１１５（配列番号１１５）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドの増大した発現または活性に関連する細胞増殖性障害を治療または予防する方法であって、該方法は、有効量のＴＡＴ１８８ポリペプチドのアンタゴニストを、そのような治療を必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
  59. 前記アンタゴニストが、請求項１ないし２１および２３ないし２８いずれか１項に記載の単離された抗−ＴＡＴ１８８ポリペプチド抗体である、請求項５８記載の方法。
  60. 前記細胞増殖性障害が癌である、請求項５９記載の方法。
  61. 前記癌が、乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓よりなる群から選択される、請求項６０記載の方法。
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