JP2680054B2 - 異種構造のポリペプチドの分泌を指令するクルイベロミセスα−因子先導配列を有するDNA構成体 - Google Patents
異種構造のポリペプチドの分泌を指令するクルイベロミセスα−因子先導配列を有するDNA構成体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は組換えDNAの技術分野に属する。更に詳細に
は本発明は酵母の細胞の中で異種構造のポリペプチドの
分泌を指令するクルイベロミセス(Kluyveromyces)α
−因子先導配列の使用に関する。
は本発明は酵母の細胞の中で異種構造のポリペプチドの
分泌を指令するクルイベロミセス(Kluyveromyces)α
−因子先導配列の使用に関する。
米国特許第4546082号明細書はサッカロミセス セレ
ビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のα−因子前駆体
遺伝子について記載すると共に異種構造の遺伝子の分泌
発現に有用なS.セレビシエの先導配列のDNA構成体及び
異種構造遺伝子を示すことを企図している。
ビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のα−因子前駆体
遺伝子について記載すると共に異種構造の遺伝子の分泌
発現に有用なS.セレビシエの先導配列のDNA構成体及び
異種構造遺伝子を示すことを企図している。
欧州特許出願0116201号明細書はヒトの表皮成育因子
の分泌発現を酵母細胞中で達成するためのS.セレビシエ
α−因子先導配列の実際使用について記載している。19
83年8月12日出願の係属中の米国特許出願第522909号明
細書は異種構造の遺伝子の更に有効な分泌発現の達成の
ために“スペーサー(切取部分)不含有”のS.セレビシ
エα−因子先導配列の使用を記載している。
の分泌発現を酵母細胞中で達成するためのS.セレビシエ
α−因子先導配列の実際使用について記載している。19
83年8月12日出願の係属中の米国特許出願第522909号明
細書は異種構造の遺伝子の更に有効な分泌発現の達成の
ために“スペーサー(切取部分)不含有”のS.セレビシ
エα−因子先導配列の使用を記載している。
サイエンス誌〔Science(1985)229:1219−1224〕は
プロキモシンの分泌を指令するS.セレビシエα−因子配
列の使用を報告している。生成されたプロキモシンの大
部分は分泌型ではなく。細胞内での不溶型として存在し
ていたことが報告された。活性化可能のプロキモシンの
分泌を指令するに当りインベルターゼ先導配列がより一
そう有効であるけれども、プロキモシン分泌をかなりの
量で達成するには突然変異体について広汎にスクリーニ
ングを行なうことが必要であった。
プロキモシンの分泌を指令するS.セレビシエα−因子配
列の使用を報告している。生成されたプロキモシンの大
部分は分泌型ではなく。細胞内での不溶型として存在し
ていたことが報告された。活性化可能のプロキモシンの
分泌を指令するに当りインベルターゼ先導配列がより一
そう有効であるけれども、プロキモシン分泌をかなりの
量で達成するには突然変異体について広汎にスクリーニ
ングを行なうことが必要であった。
クルイベロミセス ラクチス(K.lactis)の細胞群又
は他のクルイベロミセス種による交配フェロモン(mati
ng pheromones)(α−因子及びa−因子)の産生につ
いては従前技術の開示は無い。K.ラクチスの該ペプチド
の同定の欠如の原因は部分的にはK.ラクチスにおける交
配が誘導不可能という事実にもとづくかも知れない;こ
れに反しS.セレビシエにおいては交配フェロモンは構成
的事由にもとづいて産生される。
は他のクルイベロミセス種による交配フェロモン(mati
ng pheromones)(α−因子及びa−因子)の産生につ
いては従前技術の開示は無い。K.ラクチスの該ペプチド
の同定の欠如の原因は部分的にはK.ラクチスにおける交
配が誘導不可能という事実にもとづくかも知れない;こ
れに反しS.セレビシエにおいては交配フェロモンは構成
的事由にもとづいて産生される。
酵母による異種構造のポリペプチド分泌を指令するた
めの上記の先導配列の利用可能性にもかかわらず特殊の
ポリペプチドをより効率的又はより実用的に産生する他
の配列に対する必要性が継続している。従って本発明は
K.ラクチスα−因子が存在すること、もし存在するなら
ば異種構造のポリペプチド、例えばプロキモシン、の酵
母中での分泌を指令するために有用であることの決定に
ついて追求した。
めの上記の先導配列の利用可能性にもかかわらず特殊の
ポリペプチドをより効率的又はより実用的に産生する他
の配列に対する必要性が継続している。従って本発明は
K.ラクチスα−因子が存在すること、もし存在するなら
ば異種構造のポリペプチド、例えばプロキモシン、の酵
母中での分泌を指令するために有用であることの決定に
ついて追求した。
本発明は異種構造のポリペプチドの酵母による分泌を
指令するためのクルイベロミセスα−因子先導配列にも
とづくDNA構成体を提供する。該DNA構成体を有するクル
イベロミセス形質転換体はポリペプチド、例えばプロキ
モシン、を効率良く分泌する。
指令するためのクルイベロミセスα−因子先導配列にも
とづくDNA構成体を提供する。該DNA構成体を有するクル
イベロミセス形質転換体はポリペプチド、例えばプロキ
モシン、を効率良く分泌する。
従って本発明の一態様は、タンパク質を異種構造ポリ
ペプチドの中へプロセッシング(分子加工)するための
酵母のプロセッシングシグナル(processing signals)
を介して、異種構造ポリペプチド配列へ連結している分
泌指令性のクルイベロミセスα−因子先導配列を有する
アミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNA構
成体を指向する。
ペプチドの中へプロセッシング(分子加工)するための
酵母のプロセッシングシグナル(processing signals)
を介して、異種構造ポリペプチド配列へ連結している分
泌指令性のクルイベロミセスα−因子先導配列を有する
アミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNA構
成体を指向する。
本発明の他の態様は、宿主酵母の中に複製可能又は統
合可能な系を有する発現ベクターを指向すると共に、タ
ンパク質を異種構造ポリペプチドの中へプロセッシング
するための酵母のプロセッシング用のシグナルを介して
異種構造ポリペプチド配列へ連結した分泌指令性クルイ
ベロミセスα−因子先導配列を有するアミノ酸配列を含
有するタンパク質をコードするDNA構成体を指向する。
合可能な系を有する発現ベクターを指向すると共に、タ
ンパク質を異種構造ポリペプチドの中へプロセッシング
するための酵母のプロセッシング用のシグナルを介して
異種構造ポリペプチド配列へ連結した分泌指令性クルイ
ベロミセスα−因子先導配列を有するアミノ酸配列を含
有するタンパク質をコードするDNA構成体を指向する。
本発明のなおその他の態様は、上記の発現ベクターを
有する酵母を、該異種構造ポリペプチドが“プロポリペ
プチド”として該酵母によって発現され分泌される条
件、及び該プロポリペプチドが異種構造ポリペプチドの
中へ少なくとも部分的にプロセッシングされる条件の下
で、培地中で生育させることから成る酵母の中で異種構
造ポリペプチドを産生する方法を指向する。
有する酵母を、該異種構造ポリペプチドが“プロポリペ
プチド”として該酵母によって発現され分泌される条
件、及び該プロポリペプチドが異種構造ポリペプチドの
中へ少なくとも部分的にプロセッシングされる条件の下
で、培地中で生育させることから成る酵母の中で異種構
造ポリペプチドを産生する方法を指向する。
本発明に従い“成熟した異種構造ポリペプチド”の産
生のために酵母細胞群が使用され、該ポリペプチドは普
通培地から直接収穫される。該ポリペプチドは、クルイ
ベロミセスα−因子先導体をコードするDNA構成体及び
目的の異種構造ポリペプチドに結合するプロセッシング
用シグナル配列の使用によって産生され、該ポリペプチ
ドはプロセッシング用のシグナル(複数)によって分別
された単数の異種構造ポリペプチドであるか又は複数の
異種構造ポリペプチドであり得る。得られた構成体はプ
レプロポリペプチドをコードし、該プレプロポリペプチ
ドはプレプロポリペプチドを分泌させるため、及びポリ
ペプチドを細胞内又は細胞外でプロセッシングして成熟
ポリペプチドを形成させるためのシグナル(複数)を有
する。
生のために酵母細胞群が使用され、該ポリペプチドは普
通培地から直接収穫される。該ポリペプチドは、クルイ
ベロミセスα−因子先導体をコードするDNA構成体及び
目的の異種構造ポリペプチドに結合するプロセッシング
用シグナル配列の使用によって産生され、該ポリペプチ
ドはプロセッシング用のシグナル(複数)によって分別
された単数の異種構造ポリペプチドであるか又は複数の
異種構造ポリペプチドであり得る。得られた構成体はプ
レプロポリペプチドをコードし、該プレプロポリペプチ
ドはプレプロポリペプチドを分泌させるため、及びポリ
ペプチドを細胞内又は細胞外でプロセッシングして成熟
ポリペプチドを形成させるためのシグナル(複数)を有
する。
本発明の構成体はプロポリペプチドをコードするため
の下式: (XY−(ZW)n−Gene*)y 〔但し式中Xはリジン又はアルギニンに関するコドンで
あり; Yはアルギニンに関するコドンであり; Wはアラニン又はプロリンに関するコドンであり; Zはアミノ酸に関するコドンであるが好ましくはWが
プロリンをコードする場合にはセリン、リジン又はアス
パラギンに関するコドンであってWがアラニンをコード
する場合にはグルタミン酸、アスパラギン、アスパラギ
ン酸又はセリンに関するコドンであり; yはモノマー及びマルチマー(multimer)の生成のた
めに、少なくとも1、通常は10以下、更に通常の場合に
4以下の数値であり; Gene*は“宿主酵母に対して外来の先導配列である先
導配列”と組合された野生型クルイベロミセスα−因子
以外の遺伝子、通常は植物源又は哺乳動物源の遺伝子で
あり; nは0又は一般に1〜8、通常は3〜7の範囲内で変
化する数値であり、好ましくは0である〕 を有するDNA配列を含有する。
の下式: (XY−(ZW)n−Gene*)y 〔但し式中Xはリジン又はアルギニンに関するコドンで
あり; Yはアルギニンに関するコドンであり; Wはアラニン又はプロリンに関するコドンであり; Zはアミノ酸に関するコドンであるが好ましくはWが
プロリンをコードする場合にはセリン、リジン又はアス
パラギンに関するコドンであってWがアラニンをコード
する場合にはグルタミン酸、アスパラギン、アスパラギ
ン酸又はセリンに関するコドンであり; yはモノマー及びマルチマー(multimer)の生成のた
めに、少なくとも1、通常は10以下、更に通常の場合に
4以下の数値であり; Gene*は“宿主酵母に対して外来の先導配列である先
導配列”と組合された野生型クルイベロミセスα−因子
以外の遺伝子、通常は植物源又は哺乳動物源の遺伝子で
あり; nは0又は一般に1〜8、通常は3〜7の範囲内で変
化する数値であり、好ましくは0である〕 を有するDNA配列を含有する。
上式においてX,Y,Z及びWによってコードされるアミ
ノ酸はα−因子プロセッシング用のシグナルを決定し、
この場合にX及びYによってコードされるアミノ酸はペ
プチド開裂部位を決定し、Z及びWによってコードされ
るアミノ酸はオリゴペプチド スペーサーを決定する。
nはZであり得るという事実で示される通り、スペーサ
ーの存在は任意である。もしスペーサーが存在するなら
ば構成体は“スペーサーにより決定されるN−末端残基
の除去を許し、その結果Gene*によってコードされる成
熟タンパク質を生成させる追加の配列”を有することが
典型的である。
ノ酸はα−因子プロセッシング用のシグナルを決定し、
この場合にX及びYによってコードされるアミノ酸はペ
プチド開裂部位を決定し、Z及びWによってコードされ
るアミノ酸はオリゴペプチド スペーサーを決定する。
nはZであり得るという事実で示される通り、スペーサ
ーの存在は任意である。もしスペーサーが存在するなら
ば構成体は“スペーサーにより決定されるN−末端残基
の除去を許し、その結果Gene*によってコードされる成
熟タンパク質を生成させる追加の配列”を有することが
典型的である。
大部分については、本発明の構成体はプレプロポリペ
プチドをコードするための少なくとも下式; L−(XY−(ZW)n−Gene*)y 〔但し式中Lはプレプロポリペプチドの分泌を達成させ
るクルイベロミセス先導配列であり、その他の記号は前
定義の通りである〕を有する構成体である。プレプロポ
リペプチド分泌を達成するいかなるクルイベロミセス先
導配列も使用可能であり、該先導体配列は約20〜120個
のアミノ酸、通常は約30〜100個のアミノ酸を有し、疎
水域を有すると共にそのN−末端にメチオニンを有す
る。
プチドをコードするための少なくとも下式; L−(XY−(ZW)n−Gene*)y 〔但し式中Lはプレプロポリペプチドの分泌を達成させ
るクルイベロミセス先導配列であり、その他の記号は前
定義の通りである〕を有する構成体である。プレプロポ
リペプチド分泌を達成するいかなるクルイベロミセス先
導配列も使用可能であり、該先導体配列は約20〜120個
のアミノ酸、通常は約30〜100個のアミノ酸を有し、疎
水域を有すると共にそのN−末端にメチオニンを有す
る。
先導配列Lはクルイベロミセス属のいかなる菌種、例
えばK.ラクチス及びK.フラジリス(K.fragilis)、の完
全な長さのα−因子先導配列であってもよく、又は機能
性(即ち分泌指令可能)の断片(フラグメント)、突然
変異体、伝統的(conservative)又は非伝統的のもの、
通常は5以下、更に通常の場合に3以下の数値をもつ異
なるアミノ酸、或はそれらの同族体であってもよい。機
能性断片は、野生型の種々の長さの完全長の配列を有す
る構成体を調製して分泌指令能についてそれらをスクリ
ーニングすることによって同定され得る。野生型のK.ラ
クチスのα−因子に関する遺伝子配列は、第2図に示さ
れており、その先導配列はDNAをコードするアミノ酸1
〜83を有する。第2図のDNA配列は本来的(essential)
ではない。機能性のクルイベロミセス先導オリゴペプチ
ドをコードするいかなる配列も充分に使用され得る。種
々の配列が多かれ少なかれ効率的に翻訳され得る。酵母
の好適なコドンの少なくとも大部分が配列の中で使用さ
れることが望ましい。
えばK.ラクチス及びK.フラジリス(K.fragilis)、の完
全な長さのα−因子先導配列であってもよく、又は機能
性(即ち分泌指令可能)の断片(フラグメント)、突然
変異体、伝統的(conservative)又は非伝統的のもの、
通常は5以下、更に通常の場合に3以下の数値をもつ異
なるアミノ酸、或はそれらの同族体であってもよい。機
能性断片は、野生型の種々の長さの完全長の配列を有す
る構成体を調製して分泌指令能についてそれらをスクリ
ーニングすることによって同定され得る。野生型のK.ラ
クチスのα−因子に関する遺伝子配列は、第2図に示さ
れており、その先導配列はDNAをコードするアミノ酸1
〜83を有する。第2図のDNA配列は本来的(essential)
ではない。機能性のクルイベロミセス先導オリゴペプチ
ドをコードするいかなる配列も充分に使用され得る。種
々の配列が多かれ少なかれ効率的に翻訳され得る。酵母
の好適なコドンの少なくとも大部分が配列の中で使用さ
れることが望ましい。
発現のためのカセット(定位置間移動DNA配列)とし
て有用なDNA配列を提供する場合に下式: Tr−L−(XY−(ZW)n−Gene*)α)y 〔但し式中Trは転写調節シグナルをコードするDNA配
列、特にプロモーター(促進シグナル)及びその他の調
節用シグナル例えばオペレーター(作動シグナル)、ア
クチベーター(活性化シグナル)、キャップシグナル
(cap signal)又は転写又は翻訳制御用のシグナルと共
に含まれる他の配列であり; dは0又は1であってyが1より大である場合に1で
あり; Tr配列は一般に少なくとも約100bpであって約2000bp
以下であり;その他の記号は前定義の通りである〕 を有する配列を便利に使用し得る。特に有用なものは先
導配列Lと連合するTr配列であり、かようにしてDNA断
片は、宿主に対して内因性のシグナル配列と連合した転
写用及び翻訳用シグナル配列として使用され得る。或は
別法として発現産生物の製造の増大のために他の転写シ
グナル及び翻訳シグナルを使用し得る。
て有用なDNA配列を提供する場合に下式: Tr−L−(XY−(ZW)n−Gene*)α)y 〔但し式中Trは転写調節シグナルをコードするDNA配
列、特にプロモーター(促進シグナル)及びその他の調
節用シグナル例えばオペレーター(作動シグナル)、ア
クチベーター(活性化シグナル)、キャップシグナル
(cap signal)又は転写又は翻訳制御用のシグナルと共
に含まれる他の配列であり; dは0又は1であってyが1より大である場合に1で
あり; Tr配列は一般に少なくとも約100bpであって約2000bp
以下であり;その他の記号は前定義の通りである〕 を有する配列を便利に使用し得る。特に有用なものは先
導配列Lと連合するTr配列であり、かようにしてDNA断
片は、宿主に対して内因性のシグナル配列と連合した転
写用及び翻訳用シグナル配列として使用され得る。或は
別法として発現産生物の製造の増大のために他の転写シ
グナル及び翻訳シグナルを使用し得る。
Gene*の3′−末端は、構成体の独自の制御部位の中
へのGene*の挿入を許す該構成体の形状において、更に
容易に操作され得る。かような好ましい構成体は、Gene
*が挿入される制限部位を提供し、開始コドンを有する
フレーム(解読枠)をなしている。この構成体は下式: (Tr)a−L−XY−(ZW)n−(SC)b−Te 〔但し式中既述と同じ記号は前定義の通りであり; aは0又は1であってこの構成体が転写シグナル及び
翻訳シグナルを有するか又は有しないことを表し; SCは終止コドンを表し; Teは転写終止指定配列であって他のシグナル例えば多
連アデニル形式(poly adenylation)のシグナルであ
り;及び bは一般に約0〜4、更に通常の場合に0〜3の範囲
内で変化する数値であり、Gene*が独自の終止コドンを
有することを理解させるものである〕 によって記号化され得る。
へのGene*の挿入を許す該構成体の形状において、更に
容易に操作され得る。かような好ましい構成体は、Gene
*が挿入される制限部位を提供し、開始コドンを有する
フレーム(解読枠)をなしている。この構成体は下式: (Tr)a−L−XY−(ZW)n−(SC)b−Te 〔但し式中既述と同じ記号は前定義の通りであり; aは0又は1であってこの構成体が転写シグナル及び
翻訳シグナルを有するか又は有しないことを表し; SCは終止コドンを表し; Teは転写終止指定配列であって他のシグナル例えば多
連アデニル形式(poly adenylation)のシグナルであ
り;及び bは一般に約0〜4、更に通常の場合に0〜3の範囲
内で変化する数値であり、Gene*が独自の終止コドンを
有することを理解させるものである〕 によって記号化され得る。
Gene*から上流に在る配列は、与えられた種(スペシ
イス)のGene*が他の種のGene*によって代替されるこ
とを許すのに便利な制限部位を提供するために設計され
たものである。必要に応じ該代替の達成のためにリンカ
ー(結合手段)及びアダプター(受容手段)を使用し得
る。
イス)のGene*が他の種のGene*によって代替されるこ
とを許すのに便利な制限部位を提供するために設計され
たものである。必要に応じ該代替の達成のためにリンカ
ー(結合手段)及びアダプター(受容手段)を使用し得
る。
本発明の構成体はベクターの中へ挿入されるための移
動可能な配列を提供するがこれは所望の複製系を提供す
る。既述の通り或場合にはシグナル配列に連合した野生
型プロモーターを別異のプロモーターで代替させること
が望まれる。酵母の場合において解糖経路の中の酵素群
を有するプロモーターは高速度の転写を達成し得る。こ
れらのプロモーターは酵素群例えばホスフォグルコイソ
メラーゼ、ホスフォフラクトキナーゼ、ホスフォトリオ
ースイソメラーゼ、ホスフォグルコミユターゼ、エノラ
ーゼ、ピルビックキナーゼ、グリセルアルデヒド−3−
ホスフェートデヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロ
ゲナーゼと連合している。これらのプロモーターはシグ
ナル配列から上流の所で挿入される。先導配列の5′側
に存在する領域は維持されるか又は他の代りにプロモー
ターの3′配列によって代替され得る。ベクター(複
数)が調製され得るがこれは既述の構成体挿入のための
プロモーターから下流側にある便利な制限部位を有する
プロモーター(複数)を具えていることが報告されてい
る。
動可能な配列を提供するがこれは所望の複製系を提供す
る。既述の通り或場合にはシグナル配列に連合した野生
型プロモーターを別異のプロモーターで代替させること
が望まれる。酵母の場合において解糖経路の中の酵素群
を有するプロモーターは高速度の転写を達成し得る。こ
れらのプロモーターは酵素群例えばホスフォグルコイソ
メラーゼ、ホスフォフラクトキナーゼ、ホスフォトリオ
ースイソメラーゼ、ホスフォグルコミユターゼ、エノラ
ーゼ、ピルビックキナーゼ、グリセルアルデヒド−3−
ホスフェートデヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロ
ゲナーゼと連合している。これらのプロモーターはシグ
ナル配列から上流の所で挿入される。先導配列の5′側
に存在する領域は維持されるか又は他の代りにプロモー
ターの3′配列によって代替され得る。ベクター(複
数)が調製され得るがこれは既述の構成体挿入のための
プロモーターから下流側にある便利な制限部位を有する
プロモーター(複数)を具えていることが報告されてい
る。
最終の発現ベクターは発現カセット及び複製可能系又
は統合可能系を有するが該系は機能性であって宿主酵母
中に安定に保持される。該ベクターは、原核の中でクロ
ーニングさせる複製系を任意に有する。更に選択のため
の単数又は複数のマーカー(目印)を含有し、該マーカ
ーは宿主の中で保持されるための選択的加圧(selectiv
e pressure)を許す。更に該ベクターは高度又は低度の
コピイ数を有し、該コピイ数は一般に約1〜200の範囲
内にある。高度コピイ数のベクターは一般に少なくとも
10、好ましくは少なくとも20、通常は約150以下、更に
通常の場合に約100以下のコピイ数を有する。Gene*に
依存するが高度コピイ数又は低度コピイ数が望ましく、
これは宿主に対するベクターの効果に影響する。宿主の
生育能に対して有害な影響を及ぼすベクターの発現生成
物が存在する場合には低度コピイ数が示されることがあ
り得る。
は統合可能系を有するが該系は機能性であって宿主酵母
中に安定に保持される。該ベクターは、原核の中でクロ
ーニングさせる複製系を任意に有する。更に選択のため
の単数又は複数のマーカー(目印)を含有し、該マーカ
ーは宿主の中で保持されるための選択的加圧(selectiv
e pressure)を許す。更に該ベクターは高度又は低度の
コピイ数を有し、該コピイ数は一般に約1〜200の範囲
内にある。高度コピイ数のベクターは一般に少なくとも
10、好ましくは少なくとも20、通常は約150以下、更に
通常の場合に約100以下のコピイ数を有する。Gene*に
依存するが高度コピイ数又は低度コピイ数が望ましく、
これは宿主に対するベクターの効果に影響する。宿主の
生育能に対して有害な影響を及ぼすベクターの発現生成
物が存在する場合には低度コピイ数が示されることがあ
り得る。
各種の宿主を使用し得るが特に所望の性質を具える突
然変異株を使用し得る。本発明の構成体の発現生成物の
産生速度に依存して、産生程度(レベル)におけるプロ
セッシングのためにプロセッシング用酵母の使用が適当
であるか又は適当でないかもしれないことを知識すべき
である。従ってプロセッシング用酵素(ジペプチジル
アミノペプチターゼA及び/又はlys−arg−エンドペプ
チダーゼ)の産生増大をもたらす変異株を提供し得る
し、或はベクターの使用により酵素の産生増大を達成し
得る。一般に酵素産生は所望の発現産生物の産生よりも
低いオーダーに止まるべきである。
然変異株を使用し得る。本発明の構成体の発現生成物の
産生速度に依存して、産生程度(レベル)におけるプロ
セッシングのためにプロセッシング用酵母の使用が適当
であるか又は適当でないかもしれないことを知識すべき
である。従ってプロセッシング用酵素(ジペプチジル
アミノペプチターゼA及び/又はlys−arg−エンドペプ
チダーゼ)の産生増大をもたらす変異株を提供し得る
し、或はベクターの使用により酵素の産生増大を達成し
得る。一般に酵素産生は所望の発現産生物の産生よりも
低いオーダーに止まるべきである。
別の場合として、細胞内のプロセッシングを望まない
場合があり得る。この場合には“分泌を生起させるけれ
ども産生物をプロセッシングしない突然変異株”が有用
である。かようにして産生物をインビトロで順次工程で
プロセッシングし得る。
場合があり得る。この場合には“分泌を生起させるけれ
ども産生物をプロセッシングしない突然変異株”が有用
である。かようにして産生物をインビトロで順次工程で
プロセッシングし得る。
制御された調節による発現を提供する突然変異株の宿
主を有利に使用し得る。例えば融合によるタンパク質を
発現する本発明の構成体を用いる場合には形質転換体は
融合タンパク質の毒性の結果とみなされる遅い(緩徐
な)生育を示す。従って生育の過程において発現を阻止
することにより、発現のための自由寛大な諸条件へ諸条
件を変更する以前に、宿主を高密度に生育させ得る。
主を有利に使用し得る。例えば融合によるタンパク質を
発現する本発明の構成体を用いる場合には形質転換体は
融合タンパク質の毒性の結果とみなされる遅い(緩徐
な)生育を示す。従って生育の過程において発現を阻止
することにより、発現のための自由寛大な諸条件へ諸条
件を変更する以前に、宿主を高密度に生育させ得る。
更に既述の通りGene*は複数の配列を重複し(隣り合
せ)て有してよく、配列は同一又は異なる配列であって
もよく、介在するプロセッシング用シグナルを有しても
よい。かようにして産生物は全体的に又は部分的にプロ
セッシングされ得るし、その結果、単独の又は重複し
(隣り合せ)ている各種の配列を次工程のプロセッシン
グ用として得るであろう。多くの場合においては異なる
各種の配列を得ることが望ましく、該配列の夫々は或る
特別なタンパク質製品のサブユニットとなるわけであ
る。
せ)て有してよく、配列は同一又は異なる配列であって
もよく、介在するプロセッシング用シグナルを有しても
よい。かようにして産生物は全体的に又は部分的にプロ
セッシングされ得るし、その結果、単独の又は重複し
(隣り合せ)ている各種の配列を次工程のプロセッシン
グ用として得るであろう。多くの場合においては異なる
各種の配列を得ることが望ましく、該配列の夫々は或る
特別なタンパク質製品のサブユニットとなるわけであ
る。
Gene*は目的のいかなる型のポリペプチドをもコード
し得る。該ポリペプチドは8個のアミノ酸から成る可及
的に小さいオリゴペプチドであるか又は100,000ダルト
ン或はそれ以上を有するポリペプチドであり得る。通常
は単一の連鎖が約300,000ダルトン以下、更に通常の場
合に約150,000ダルトン以下である。特別に有利な場合
のポリペプチドは約5,000〜150,000ダルトン、更に特別
な場合に約5,000〜100,000ダルトンを有する。有利なポ
リペプチドの例はホルモン及びファクター例えば生長ホ
ルモン、ソマトメジン及び表皮生育ファクター;内分泌
性分泌物例えば黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモ
ン、オキシトシン、インスリン、バソプレシン、レニ
ン、カルシトニン、卵胞刺激ホルモン、プロラクチン及
びその他;血液産生因子例えばエリスロポイエチン、コ
ロニイ刺激因子及びその他;リンホカイン;グロビン;
グロブリン例えば免疫グロブリン;アルブミン例えば血
清アルブミン例えばヒト血清アルブミン;インターフェ
ロン例えばα,β及びδ型のもの;リプレッサー(抑制
物質);酵素例えばキモシン又はそのチモゲン、α−及
びβ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、
キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、
リパーゼ、ホスフォリパーゼ及びその他;エンドルフィ
ン例えばβ−エンドルフィン、エンセファリン、ダイノ
ルフィン及びその他を含有する。
し得る。該ポリペプチドは8個のアミノ酸から成る可及
的に小さいオリゴペプチドであるか又は100,000ダルト
ン或はそれ以上を有するポリペプチドであり得る。通常
は単一の連鎖が約300,000ダルトン以下、更に通常の場
合に約150,000ダルトン以下である。特別に有利な場合
のポリペプチドは約5,000〜150,000ダルトン、更に特別
な場合に約5,000〜100,000ダルトンを有する。有利なポ
リペプチドの例はホルモン及びファクター例えば生長ホ
ルモン、ソマトメジン及び表皮生育ファクター;内分泌
性分泌物例えば黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモ
ン、オキシトシン、インスリン、バソプレシン、レニ
ン、カルシトニン、卵胞刺激ホルモン、プロラクチン及
びその他;血液産生因子例えばエリスロポイエチン、コ
ロニイ刺激因子及びその他;リンホカイン;グロビン;
グロブリン例えば免疫グロブリン;アルブミン例えば血
清アルブミン例えばヒト血清アルブミン;インターフェ
ロン例えばα,β及びδ型のもの;リプレッサー(抑制
物質);酵素例えばキモシン又はそのチモゲン、α−及
びβ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、
キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、
リパーゼ、ホスフォリパーゼ及びその他;エンドルフィ
ン例えばβ−エンドルフィン、エンセファリン、ダイノ
ルフィン及びその他を含有する。
本発明の構成体を有するベクターを調製した後に該ベ
クターを宿主酵母の中へ導入する。酵母の属及び種は臨
界的でない。酵母宿主の例はクルイベロミセス属及びサ
ッカロミセス属である。導入方法は慣用方法である。酵
母宿主中へのDNA導入のためには各種の方法がある。文
献〔例えばHinnen et al.,Proc.Acad.Natl.Sci.USA(19
78)75:1919−1933又はDas et al.,J.Bacteriol.(198
4)158:1165−1167又はStinchcomb et al.,EPA 004557
3〕参照のこと。得られた形質転換体は次にこれを適宜
の普通培地に生育させ、この場合に適宜の選択的加圧を
形質転換体上に維持させる。発現を誘導するに当り酵母
を高密度に生育させることが可能であり、次いで発現を
誘導する。かような場合において実質的比率の産生物を
周辺質領域に保持させてよく。酵素例えばチモラーゼ又
はリチカーゼを用いて酵母細胞群を処理することにより
産生物を放出させ得る。
クターを宿主酵母の中へ導入する。酵母の属及び種は臨
界的でない。酵母宿主の例はクルイベロミセス属及びサ
ッカロミセス属である。導入方法は慣用方法である。酵
母宿主中へのDNA導入のためには各種の方法がある。文
献〔例えばHinnen et al.,Proc.Acad.Natl.Sci.USA(19
78)75:1919−1933又はDas et al.,J.Bacteriol.(198
4)158:1165−1167又はStinchcomb et al.,EPA 004557
3〕参照のこと。得られた形質転換体は次にこれを適宜
の普通培地に生育させ、この場合に適宜の選択的加圧を
形質転換体上に維持させる。発現を誘導するに当り酵母
を高密度に生育させることが可能であり、次いで発現を
誘導する。かような場合において実質的比率の産生物を
周辺質領域に保持させてよく。酵素例えばチモラーゼ又
はリチカーゼを用いて酵母細胞群を処理することにより
産生物を放出させ得る。
産生物を便宜の手段、例えばクロマトグラフィによる
タンパク質精製、電気泳動、透析、溶媒−溶媒抽出等に
よって収穫し得る。
タンパク質精製、電気泳動、透析、溶媒−溶媒抽出等に
よって収穫し得る。
下文においてはK.ラクチスも例示されるが、ここでは
クルイベロミセス属の種からのα−因子をコードする遺
伝子を得るために遂行し得る操作を述べると下記の通り
である。第1図の構造を有する放射性物質の標識をもつ
オリゴヌクレオチドのプローブ(探索子)を調製してこ
れを他の菌株からの染色体のDNAの切断物を探索するた
めに使用した。別法としてはS.セレビシエのα−因子遺
伝子のニックトランスレーションによって生成された断
片(nick tanslated fragment)をプローブとして使用
し得る。有用な一技法としては染色体のDNAの制限され
たエンドヌクレアーゼによる切断物からのセグメト(se
gment)をプラスミドの中へ挿入してこれらのプラスミ
ドを大腸菌(E.coli)又はその他の細菌株の形質転換の
ために使用して、プラスミドのライブラリイ(保存庫)
を得るのである。次いでコロニイからのDNAとプローブ
とをニトロセルロース濾紙上で便宜にハイブリダイゼー
ション(雑種分子形成)させ得る。
クルイベロミセス属の種からのα−因子をコードする遺
伝子を得るために遂行し得る操作を述べると下記の通り
である。第1図の構造を有する放射性物質の標識をもつ
オリゴヌクレオチドのプローブ(探索子)を調製してこ
れを他の菌株からの染色体のDNAの切断物を探索するた
めに使用した。別法としてはS.セレビシエのα−因子遺
伝子のニックトランスレーションによって生成された断
片(nick tanslated fragment)をプローブとして使用
し得る。有用な一技法としては染色体のDNAの制限され
たエンドヌクレアーゼによる切断物からのセグメト(se
gment)をプラスミドの中へ挿入してこれらのプラスミ
ドを大腸菌(E.coli)又はその他の細菌株の形質転換の
ために使用して、プラスミドのライブラリイ(保存庫)
を得るのである。次いでコロニイからのDNAとプローブ
とをニトロセルロース濾紙上で便宜にハイブリダイゼー
ション(雑種分子形成)させ得る。
上記のようにプローブとのハイブリダイゼーションに
よって同定されたセグメントを各種の制限酵素により切
断し、得られた断片について、サザンブロット(Southe
rn blot)法又は類似の分析法に従い、DNA配列分析に適
する寸法の制限断片を同定するための同種の雑種分子形
成プローブを用いて分析する。次に、同定された切断を
精製し、DNA配列分析用として充分量のDNAを調製するた
めに便宜なベクターを用いてクローニングを行なう。
よって同定されたセグメントを各種の制限酵素により切
断し、得られた断片について、サザンブロット(Southe
rn blot)法又は類似の分析法に従い、DNA配列分析に適
する寸法の制限断片を同定するための同種の雑種分子形
成プローブを用いて分析する。次に、同定された切断を
精製し、DNA配列分析用として充分量のDNAを調製するた
めに便宜なベクターを用いてクローニングを行なう。
上記の諸技法の使用下に、本発明で特異的に同定され
た菌株以外の菌株からクルイベロミセスα−因子遺伝子
を得ることが可能である。
た菌株以外の菌株からクルイベロミセスα−因子遺伝子
を得ることが可能である。
本発明に従い、産生物収量の著大な増加、精製操作の
単純化、所望製品の劣化の最少化、及びプロセッシン
グ、装置及び機械等の要請に関する単純化の達成ために
広汎な種類のポリペプチド分泌物を提供し得る。更に生
産性にもとづく栄養素の利用性を増加させるので、より
経済的でより効率的なポリペプチド製造を達成し得る。
しかも酵母の使用は原核と共に存在するかもしれない内
毒素を回避し、長い年代にわたって発達した既知の酵母
発酵技術(この技術は酵母産物の単離技術を含む)を使
用することによる多くの利益をもたらす。
単純化、所望製品の劣化の最少化、及びプロセッシン
グ、装置及び機械等の要請に関する単純化の達成ために
広汎な種類のポリペプチド分泌物を提供し得る。更に生
産性にもとづく栄養素の利用性を増加させるので、より
経済的でより効率的なポリペプチド製造を達成し得る。
しかも酵母の使用は原核と共に存在するかもしれない内
毒素を回避し、長い年代にわたって発達した既知の酵母
発酵技術(この技術は酵母産物の単離技術を含む)を使
用することによる多くの利益をもたらす。
下記の諸例は本発明の例示する。該諸例はいかなる方
式においても本発明の範囲を限定するものではないこと
を当業者は理解すべきである。
式においても本発明の範囲を限定するものではないこと
を当業者は理解すべきである。
例1 K.ラクチスα−因子の同定及び単離 供試菌株としてS.セレビシエMat a sst2−3菌株RC68
7を使用するユリウス等の記載〔Julius et al.,Cell(1
983)32:839〕のようにして、培養物の上澄液について
生物学的試験を行なった。0.5%グルコース、0.17%酵
母用含チッ素塩基(硫酸アンモニウム不含有)(Difc
o)、0.002%硫酸アンモニウムから成る培地上にK.ラク
チス菌株CBS141(α)を生育させた。遠心分離によって
細胞群を取出した後に培養物上澄液に対して酢酸を濃度
0.1Mになるまで加えてこの培養物上澄液をビオレクス
〔Bio−Rex70(Biorad)〕のコラムへ通過させた。コラ
ムを0.1M酢酸で洗ってからα−因子を80%EtOH/10mM H
Clを用いて溶出した。溶出液を蒸発乾燥してから0.1%
TFA/20%アセトニトリルに溶かし逆相HPLCコラム(re
verse−phase HPLC guard column)にかけた。このコラ
ムを0.1%TFA及び20%、40%、60%並びに80%アセトニ
トリルを含む各溶液を用いて順次に洗浄した。次にα−
因子活性を呈する60%アセトニトリルのフラクションを
分析用C−18HPLCコラムで処理し、0.1%TFA中の20%〜
80%アセトニトリルの勾配溶液を用いて溶出した。各フ
ラクションを集めてα−因子活性を検した。α−因子含
有フラクションを乾燥し、分析装置(Applied Biosyst
em gas phase protein sequencer Model 470A c
oupled to Model 120 A PTH analyzer)を用い
てアミノ酸配列について分析した。
7を使用するユリウス等の記載〔Julius et al.,Cell(1
983)32:839〕のようにして、培養物の上澄液について
生物学的試験を行なった。0.5%グルコース、0.17%酵
母用含チッ素塩基(硫酸アンモニウム不含有)(Difc
o)、0.002%硫酸アンモニウムから成る培地上にK.ラク
チス菌株CBS141(α)を生育させた。遠心分離によって
細胞群を取出した後に培養物上澄液に対して酢酸を濃度
0.1Mになるまで加えてこの培養物上澄液をビオレクス
〔Bio−Rex70(Biorad)〕のコラムへ通過させた。コラ
ムを0.1M酢酸で洗ってからα−因子を80%EtOH/10mM H
Clを用いて溶出した。溶出液を蒸発乾燥してから0.1%
TFA/20%アセトニトリルに溶かし逆相HPLCコラム(re
verse−phase HPLC guard column)にかけた。このコラ
ムを0.1%TFA及び20%、40%、60%並びに80%アセトニ
トリルを含む各溶液を用いて順次に洗浄した。次にα−
因子活性を呈する60%アセトニトリルのフラクションを
分析用C−18HPLCコラムで処理し、0.1%TFA中の20%〜
80%アセトニトリルの勾配溶液を用いて溶出した。各フ
ラクションを集めてα−因子活性を検した。α−因子含
有フラクションを乾燥し、分析装置(Applied Biosyst
em gas phase protein sequencer Model 470A c
oupled to Model 120 A PTH analyzer)を用い
てアミノ酸配列について分析した。
例2 プラスミド ライブラリイの交雑スクリーニング
(hybridization screening) γ〔32P〕−ATP及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用
いてオリゴヌクレオチドのプール(pools)を標識し
た。これらのオリゴヌクレオチドプローブをサザンブロ
ット法について、又は下記構成: 4×SSC、50mM KH2PO4 pH7、1%サルコシル、10%
デキストラン硫酸塩、200μg/mlの音波処理され、変性
されたサケ精子のDNAをもつ交雑用溶液中の42℃におけ
る細菌コロニイについて探索するために使用した。フィ
ルターを2×SSC、0.1%SDS中で42℃において洗浄し
た。
(hybridization screening) γ〔32P〕−ATP及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用
いてオリゴヌクレオチドのプール(pools)を標識し
た。これらのオリゴヌクレオチドプローブをサザンブロ
ット法について、又は下記構成: 4×SSC、50mM KH2PO4 pH7、1%サルコシル、10%
デキストラン硫酸塩、200μg/mlの音波処理され、変性
されたサケ精子のDNAをもつ交雑用溶液中の42℃におけ
る細菌コロニイについて探索するために使用した。フィ
ルターを2×SSC、0.1%SDS中で42℃において洗浄し
た。
>5000bpの断片を精製するために大きさによって分別
されたK.ラクチス菌株SD11(trpllac 4)からの染色体D
NAの制限されたSau3A I切断物から得られた挿入物を含
有するクローニング用ベクターpJS109(このpJS109の代
りに例えばpUC18及びpBR322のような他の標準的クロー
ニング用ベクターを使用してもよい)の中でプラスミド
ライブラリイを、100μg/mlのアムピシリンを含むL−
寒天の8mmの平板1個当り500〜2000個のコロニイの密度
において大腸菌(E.コリ)菌株 HB101の平板培養形質
転換体によるプローブを用いてスクリーニングした。こ
れらのコロニイからDNAをニトロセルロースフィルター
へ移しこれらのフィルターについて既述のようにして交
雑を行なった。フィルター上の交雑シグナルの領域に対
応する基の平板培養上の領域を採取して再度平板培養を
行なってから交雑による再度のテストを行ない、かよう
にして交雑配列を含むプラスミドを有する単一のコロニ
イ(複数)を単離した。陽性を示すコロニイについて更
に、小規模培養物から精製されたDNAに関するサザンブ
ロット分析法によってテストを行なった。
されたK.ラクチス菌株SD11(trpllac 4)からの染色体D
NAの制限されたSau3A I切断物から得られた挿入物を含
有するクローニング用ベクターpJS109(このpJS109の代
りに例えばpUC18及びpBR322のような他の標準的クロー
ニング用ベクターを使用してもよい)の中でプラスミド
ライブラリイを、100μg/mlのアムピシリンを含むL−
寒天の8mmの平板1個当り500〜2000個のコロニイの密度
において大腸菌(E.コリ)菌株 HB101の平板培養形質
転換体によるプローブを用いてスクリーニングした。こ
れらのコロニイからDNAをニトロセルロースフィルター
へ移しこれらのフィルターについて既述のようにして交
雑を行なった。フィルター上の交雑シグナルの領域に対
応する基の平板培養上の領域を採取して再度平板培養を
行なってから交雑による再度のテストを行ない、かよう
にして交雑配列を含むプラスミドを有する単一のコロニ
イ(複数)を単離した。陽性を示すコロニイについて更
に、小規模培養物から精製されたDNAに関するサザンブ
ロット分析法によってテストを行なった。
交雑陽性コロニイから精製されたプラスミドを各種の
制限酵素を用いて切断し、得られた断片を、同じ交雑用
プローブを用いるサザンブロット分析法によって分析し
た。これはDNA配列の分析に適切な大きさをもつ制限断
片を同定するためである。かようにして同定された断片
をアガロースゲル電気泳動法によって精製し、適宜のMP
18ベクター及びMP19ベクターへクローニングしてDNA配
列分析を行なった。
制限酵素を用いて切断し、得られた断片を、同じ交雑用
プローブを用いるサザンブロット分析法によって分析し
た。これはDNA配列の分析に適切な大きさをもつ制限断
片を同定するためである。かようにして同定された断片
をアガロースゲル電気泳動法によって精製し、適宜のMP
18ベクター及びMP19ベクターへクローニングしてDNA配
列分析を行なった。
例3 (a)培養物の上澄液のキモシン試験 遠心分離によって細胞群を培養物から分離し、得られ
た上澄液を1M H2SO4の添加によってpH2となるまで産生
化し、室温下に2時間恒温を保持させた。次に2Mのトリ
ス(Tris)塩基添加により、この溶液をpH6にまで中和
した。10mM CaCl2中の乾燥脱脂乳(12%)の懸濁物(20
0μ)に対して、上記中和液の適宜の希釈物(容積50
μ)を添加し、凝塊が形成されるまで37℃に恒温保持
させた。1単位のキモシン活性は上記条件下に10分間放
置した際の凝塊生成に要する活性キモシン量として定義
される。
た上澄液を1M H2SO4の添加によってpH2となるまで産生
化し、室温下に2時間恒温を保持させた。次に2Mのトリ
ス(Tris)塩基添加により、この溶液をpH6にまで中和
した。10mM CaCl2中の乾燥脱脂乳(12%)の懸濁物(20
0μ)に対して、上記中和液の適宜の希釈物(容積50
μ)を添加し、凝塊が形成されるまで37℃に恒温保持
させた。1単位のキモシン活性は上記条件下に10分間放
置した際の凝塊生成に要する活性キモシン量として定義
される。
(b)試験結果 K.ラクチスα−因子の最初の10個のアミノ酸はS.セレ
ビシエからのα−因子(6個の残基を有する)と決定的
な相同を示した。この配列は下記の通りである: Trp−Ser−Trp−Ile−Thr−Leu−Arg−Pro−Gly−Gln 上記のタンパク質アミノ酸配列を、第1図に示す構造
遺伝子に相補的であることが推論される1セットのオリ
ゴヌクレオチドの製造計画のために使用した。α−因子
ペプチドのセグメント(区域)に対応する可能なすべて
のコドンを有するオリゴヌクレオチド(複数)を2個の
プール(pools)の96及び48個の異なる分子として合成
した。
ビシエからのα−因子(6個の残基を有する)と決定的
な相同を示した。この配列は下記の通りである: Trp−Ser−Trp−Ile−Thr−Leu−Arg−Pro−Gly−Gln 上記のタンパク質アミノ酸配列を、第1図に示す構造
遺伝子に相補的であることが推論される1セットのオリ
ゴヌクレオチドの製造計画のために使用した。α−因子
ペプチドのセグメント(区域)に対応する可能なすべて
のコドンを有するオリゴヌクレオチド(複数)を2個の
プール(pools)の96及び48個の異なる分子として合成
した。
γ〔32P〕−ATP及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用
いて上記の2個のプールを放射性標識し、これらの夫々
をK.ラクチスDNAの制限切断に関するサザンブロット分
析の探索に使用した。プール2は数個の異なる切断物に
おける単一断片に対して強い交雑を与えたことが見出さ
れた。よってプール2がK.ラクチス染色体DNAのプラス
ミドライブラリイのスクリーニングのために選択され
た。
いて上記の2個のプールを放射性標識し、これらの夫々
をK.ラクチスDNAの制限切断に関するサザンブロット分
析の探索に使用した。プール2は数個の異なる切断物に
おける単一断片に対して強い交雑を与えたことが見出さ
れた。よってプール2がK.ラクチス染色体DNAのプラス
ミドライブラリイのスクリーニングのために選択され
た。
プラスミドライブラリイのストリーニング用の上記の
プローブの使用によって数多の交雑されたクローンが単
離された。これらのクローンの中のひとつについてのDN
A配列分析の結果、S.セレビシエα−因子ペプチドの前
駆体と著しく類似するα−因子−関連ペプチドをコード
することが証明された。交雑セグメントは約1000bpのPs
t I−EcoR I断片上にあることが見出された。この断片
の該配列を第2図に示す。
プローブの使用によって数多の交雑されたクローンが単
離された。これらのクローンの中のひとつについてのDN
A配列分析の結果、S.セレビシエα−因子ペプチドの前
駆体と著しく類似するα−因子−関連ペプチドをコード
することが証明された。交雑セグメントは約1000bpのPs
t I−EcoR I断片上にあることが見出された。この断片
の該配列を第2図に示す。
この断片の推論されたα−因子前駆体に関する比較を
第3及び4図に示す。図から判る通り、両者はかなりの
相同性をもつ同じ長さの先導配列(第3図のアミノ酸1
−83)を有する。けれどもK.ラクチス前駆体はN−連結
炭水化物鎖の添加のための部位を2個だけ有するに過ぎ
ない(第4図)。K.ラクチスの反復鎖のスペーサーはS.
セレビシエの反復鎖のスペーサーよりも長く、S.セレビ
シエに見出されるGlu/Asp−Alaを有するのではなく、パ
ターンX−Ala/Proを有する異なる配列を示す。DNA配列
(第5図)と比較するとコードする領域の全体を通じて
強度の相同性をも示している。
第3及び4図に示す。図から判る通り、両者はかなりの
相同性をもつ同じ長さの先導配列(第3図のアミノ酸1
−83)を有する。けれどもK.ラクチス前駆体はN−連結
炭水化物鎖の添加のための部位を2個だけ有するに過ぎ
ない(第4図)。K.ラクチスの反復鎖のスペーサーはS.
セレビシエの反復鎖のスペーサーよりも長く、S.セレビ
シエに見出されるGlu/Asp−Alaを有するのではなく、パ
ターンX−Ala/Proを有する異なる配列を示す。DNA配列
(第5図)と比較するとコードする領域の全体を通じて
強度の相同性をも示している。
第6図に示される一連のプラスミドは、強いプロモー
ターの転写制御の下で発現されたプロキモシンに対する
K.ラクチスα−因子先導体の融合を行なわせるために構
成されたものである。先ず第一に、αfk18bからの673bp
のSsp I−EcoR I断片を、クレナウ酵素(Klenow enzym
e)によるEcoR Iの懸垂物の充満によって、及び付着末
端に対するBgl IIのリンカー(結合鎖)の添加によって
修飾した。次にこの断片をBgl IIの部位に挿入してS.セ
レビシエのグリセルアルデヒド−3−ホスフェート デ
ヒドロゲナーゼ遺伝子(GAP)のプロモーター領域とタ
ーミネーター領域とを結合させた。このカセットをpUC1
8中のBamH I断片としてクローニングしてpAB307を得
た。
ターの転写制御の下で発現されたプロキモシンに対する
K.ラクチスα−因子先導体の融合を行なわせるために構
成されたものである。先ず第一に、αfk18bからの673bp
のSsp I−EcoR I断片を、クレナウ酵素(Klenow enzym
e)によるEcoR Iの懸垂物の充満によって、及び付着末
端に対するBgl IIのリンカー(結合鎖)の添加によって
修飾した。次にこの断片をBgl IIの部位に挿入してS.セ
レビシエのグリセルアルデヒド−3−ホスフェート デ
ヒドロゲナーゼ遺伝子(GAP)のプロモーター領域とタ
ーミネーター領域とを結合させた。このカセットをpUC1
8中のBamH I断片としてクローニングしてpAB307を得
た。
次にα−先導体をコードする配列とウシのプロキモシ
ンをコードする配列とを融合させた。先ずpAB307をNco
Iを用いて切断し、粘性末端をマング豆(mung bean)の
ヌクレアーゼによって処理することで鈍化させた。次
に、得られた産生物をSal Iを用いて切断した。これに
対して2000bp EcoR V−Sal I断片(第7及び8図に示
された配列)を連結させた。該EcoR V−Sal I断片はプ
ロキモシンをコードする配列とS.セレビシエGAP転写用
の終了領域をコードする配列とを有する断片である。こ
の断片をプラスミドpJS111から誘導したがその場合にXb
a I−BamH Iアダプターを、S.セレビシエGAP転写終止領
域に融合したプロキモシン cDNAを有する断片の5′末
端に対して添加した。この連結混合物を使用して大腸菌
(E.コリ)菌株HB101を形質転換させ、プラスミドpAB30
9を有する形質転換体を単離した。この融合体の結合周
辺の配列を第7図に示し、BamH I−Sal Iの挿入されたp
AB309の全体の配列を第8図に示す。
ンをコードする配列とを融合させた。先ずpAB307をNco
Iを用いて切断し、粘性末端をマング豆(mung bean)の
ヌクレアーゼによって処理することで鈍化させた。次
に、得られた産生物をSal Iを用いて切断した。これに
対して2000bp EcoR V−Sal I断片(第7及び8図に示
された配列)を連結させた。該EcoR V−Sal I断片はプ
ロキモシンをコードする配列とS.セレビシエGAP転写用
の終了領域をコードする配列とを有する断片である。こ
の断片をプラスミドpJS111から誘導したがその場合にXb
a I−BamH Iアダプターを、S.セレビシエGAP転写終止領
域に融合したプロキモシン cDNAを有する断片の5′末
端に対して添加した。この連結混合物を使用して大腸菌
(E.コリ)菌株HB101を形質転換させ、プラスミドpAB30
9を有する形質転換体を単離した。この融合体の結合周
辺の配列を第7図に示し、BamH I−Sal Iの挿入されたp
AB309の全体の配列を第8図に示す。
K.ラクチス株の形質転換の達成のために、K.ラクチス
LAC4の3′領域の中に挿入されたS.セレビシエADH1プロ
モーターの転写制御の下でE.コリのカナマイシン抵抗性
遺伝子を有する3560bp Hind III断片をpAB309の中へ挿
入してプラスミドpAB312を得た。挿入のためのスクリー
ニングを制御切断分析によって遂行し、正確なオリエン
テーションのためのチェックを行なった。
LAC4の3′領域の中に挿入されたS.セレビシエADH1プロ
モーターの転写制御の下でE.コリのカナマイシン抵抗性
遺伝子を有する3560bp Hind III断片をpAB309の中へ挿
入してプラスミドpAB312を得た。挿入のためのスクリー
ニングを制御切断分析によって遂行し、正確なオリエン
テーションのためのチェックを行なった。
該3560bp Hind III断片はプラスミドpGB901から誘導
され、それを第9図に示す。プラスミドpGB901は、
(1)pUCla56(下文参照)から単離されたラクターゼA
TG出発コドンから約−90の位置にあるラクターゼ プロ
モーターを有する3・6kb Xba I−Hae II断片、(2)
下記のヌクレオチド配列を有するHae II−Sal I断片: (3)プロキモシンとpGB900(下文参照)からの抗生物
質G418に対する抵抗性を付与する遺伝子とをコードする
5・1kb Sal I−Xba I断片、及び(4)Xba Iを用いる
開裂されたpUC19、を、連結することによって構成され
た。
され、それを第9図に示す。プラスミドpGB901は、
(1)pUCla56(下文参照)から単離されたラクターゼA
TG出発コドンから約−90の位置にあるラクターゼ プロ
モーターを有する3・6kb Xba I−Hae II断片、(2)
下記のヌクレオチド配列を有するHae II−Sal I断片: (3)プロキモシンとpGB900(下文参照)からの抗生物
質G418に対する抵抗性を付与する遺伝子とをコードする
5・1kb Sal I−Xba I断片、及び(4)Xba Iを用いる
開裂されたpUC19、を、連結することによって構成され
た。
上記のプラスミドの構成に際し、Hae II部位からのCG
配列は不注意に除去されたので、この位置にHind III部
位が生成された。
配列は不注意に除去されたので、この位置にHind III部
位が生成された。
プラスミドpUCla56は下記のようにして構成された。
クロモソームのDNAをK.ラクチス菌株CBS2360から単離
し、Xho Iを用いて開裂させ、ショ糖勾配上で大きさに
従って分別した。ラクトース遺伝子を有するフラクショ
ンを、ニトロセルロースフィルター上にDNAをスポット
した後にLAC4プローブを用いて検出した。LAC4遺伝子を
有するDNAをプラスミドpPA153−215〔P.M.Andreoli,Mo
l.Gen.Genet.(1985)199:372−380〕のXho I部位の中
へクローニングさせてプラスミドpPA31を得た。ラクト
ース遺伝子を有するpPA31のXba I断片をpUC19〔Yanisch
−Perron et al.,Gene(1985)33:103−119〕のXba I部
位の中へ二次的にクローニングさせ、かようにしてプラ
スミドpUCla56を産生させた。
クロモソームのDNAをK.ラクチス菌株CBS2360から単離
し、Xho Iを用いて開裂させ、ショ糖勾配上で大きさに
従って分別した。ラクトース遺伝子を有するフラクショ
ンを、ニトロセルロースフィルター上にDNAをスポット
した後にLAC4プローブを用いて検出した。LAC4遺伝子を
有するDNAをプラスミドpPA153−215〔P.M.Andreoli,Mo
l.Gen.Genet.(1985)199:372−380〕のXho I部位の中
へクローニングさせてプラスミドpPA31を得た。ラクト
ース遺伝子を有するpPA31のXba I断片をpUC19〔Yanisch
−Perron et al.,Gene(1985)33:103−119〕のXba I部
位の中へ二次的にクローニングさせ、かようにしてプラ
スミドpUCla56を産生させた。
プラスミドpGB900は、(1)418抵抗性遺伝子を有す
るプラスミドpGB Te G418(第10図及び下文参照)から
の3・6bp Hind III−Xba I断片及び(2)Sal I及びX
ba Iによって開裂されたpUC19の中にプロキモシン遺伝
子を有するプラスミドpGB123からのSal I−Hind III断
片、を連結することによって構成された。
るプラスミドpGB Te G418(第10図及び下文参照)から
の3・6bp Hind III−Xba I断片及び(2)Sal I及びX
ba Iによって開裂されたpUC19の中にプロキモシン遺伝
子を有するプラスミドpGB123からのSal I−Hind III断
片、を連結することによって構成された。
プラスミドpGB Te G418(第10図)はプラスミドpPa21
5〔Andreoli,Mol.Gene.Genet.(1985)199:372−380参
照〕及び3・7kb BamH I K.ラクチスラクターゼタ
ーミネーター断片〔Breuning et al.,Nucleic Acids Re
s.(1984)12:2327−2341〕とTn 5遺伝子〔Reiss et a
l.,EMBO J.(1984)3:3317−3322〕とから成る5・6kb
断片から構成され、酵母からのプロモーター アルコー
ル デヒドロゲナーゼI(ADHI)の指令の下にG418に対
する抵抗性を与えられているがこれは文献の記載〔Benn
etzen and Hall,J.Biol.Chem.(1982)257:3018−302
5〕と同様である。プラスミドpGBTeG418はCBS184・87の
受託番号の下に1987年2月26日付でCBSに寄託された。
5〔Andreoli,Mol.Gene.Genet.(1985)199:372−380参
照〕及び3・7kb BamH I K.ラクチスラクターゼタ
ーミネーター断片〔Breuning et al.,Nucleic Acids Re
s.(1984)12:2327−2341〕とTn 5遺伝子〔Reiss et a
l.,EMBO J.(1984)3:3317−3322〕とから成る5・6kb
断片から構成され、酵母からのプロモーター アルコー
ル デヒドロゲナーゼI(ADHI)の指令の下にG418に対
する抵抗性を与えられているがこれは文献の記載〔Benn
etzen and Hall,J.Biol.Chem.(1982)257:3018−302
5〕と同様である。プラスミドpGBTeG418はCBS184・87の
受託番号の下に1987年2月26日付でCBSに寄託された。
プラスミドpAB312はEcoR Vを用いて(K.ラクチス染色
体のLAC4領域への統合を目的として)切断されてからG4
18に対して抵抗性を有するようにするK.ラクチス菌株2U
V21(ura3 trpl lac 4〔Kil゜〕)の形質転換のために
使用され、この際にLiCl技法〔Das et al.,J.Bacterio
l.(1984)158:1165−1167〕が使用された。
体のLAC4領域への統合を目的として)切断されてからG4
18に対して抵抗性を有するようにするK.ラクチス菌株2U
V21(ura3 trpl lac 4〔Kil゜〕)の形質転換のために
使用され、この際にLiCl技法〔Das et al.,J.Bacterio
l.(1984)158:1165−1167〕が使用された。
多数の形質転換体並びに形質転換されなかった対照菌
株を、1%酵母エキス、2%ペプトン、2%グルコー
ス、0.17%酵母含チッ素塩基、50μg/mlトリプトファン
及び50%μg/mlウラシルから成る1mlの培地中で36時間
生育させた。次に培養物の上澄液について酸活性化の後
に、キモシン活性に関して試験した。すべての形質転換
体が100〜120単位/mlの活性化可能キモシンを分泌する
ことが見出された。
株を、1%酵母エキス、2%ペプトン、2%グルコー
ス、0.17%酵母含チッ素塩基、50μg/mlトリプトファン
及び50%μg/mlウラシルから成る1mlの培地中で36時間
生育させた。次に培養物の上澄液について酸活性化の後
に、キモシン活性に関して試験した。すべての形質転換
体が100〜120単位/mlの活性化可能キモシンを分泌する
ことが見出された。
例4 インビトロでの突然変異生成によるスペーサーコ
ドンの分離 pAB309から1900bpのSac I−Hind III断片を単離して
これをMP19〔Yanisch−Perron et al.,Gene(1985)3
3:103〕の中へクローニングした。一本鎖のファージDNA
を調製し、第11図に示されたオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いるインビトロでの突然変異生成のための鋳型
として使用した。プライマー#1及びプライマー#2を
夫々使用してM13ファージ MP19/αk11・5及びMP19/α
k12・2を調製した。
ドンの分離 pAB309から1900bpのSac I−Hind III断片を単離して
これをMP19〔Yanisch−Perron et al.,Gene(1985)3
3:103〕の中へクローニングした。一本鎖のファージDNA
を調製し、第11図に示されたオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いるインビトロでの突然変異生成のための鋳型
として使用した。プライマー#1及びプライマー#2を
夫々使用してM13ファージ MP19/αk11・5及びMP19/α
k12・2を調製した。
上記の2種のファージから二本鎖RF DNAを調製し、
これらの夫々から1100bp Sac I−Stu I断片(複数)を
調製した。これらの断片をpAB312からの7100bp Sac I
−Stu I断片へ連結させた。得られたプラスミドpAB313
及びpAB314を、第12図に例示された配列交替によって単
離した。
これらの夫々から1100bp Sac I−Stu I断片(複数)を
調製した。これらの断片をpAB312からの7100bp Sac I
−Stu I断片へ連結させた。得られたプラスミドpAB313
及びpAB314を、第12図に例示された配列交替によって単
離した。
上記プラスミドpAB313及びpAB314を使用して菌株2UV2
1をG418に対する抵抗性付与のために形質転換させた。
転換体2UV21:pAB312、2UV21:pAB313及び2UV21:pAB314の
培養物を生育させてから培養物の上澄液について既述の
ようにキモシン活性に関して試験した。その結果を第1
表に示す。
1をG418に対する抵抗性付与のために形質転換させた。
転換体2UV21:pAB312、2UV21:pAB313及び2UV21:pAB314の
培養物を生育させてから培養物の上澄液について既述の
ようにキモシン活性に関して試験した。その結果を第1
表に示す。
夫々の転換体は、トリクロロ酢酸−沈澱化−培養物上
澄液のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法により判
定される通りの単一のプロキモシン−関連種を分泌する
ことが見出された。pAB312転換体によって分泌されたプ
ロキモシン−関連タンパク質は、電気泳動における泳動
状況によって決定される通り、pAB313転換体及びpAB314
転換体により分泌されたプロキモシン−関連タンパク質
よりもその分子量においてやや高値を示すようである。
澄液のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法により判
定される通りの単一のプロキモシン−関連種を分泌する
ことが見出された。pAB312転換体によって分泌されたプ
ロキモシン−関連タンパク質は、電気泳動における泳動
状況によって決定される通り、pAB313転換体及びpAB314
転換体により分泌されたプロキモシン−関連タンパク質
よりもその分子量においてやや高値を示すようである。
上記の菌株(複数)のセルペレット(cell pellets)
についてキモシン活性を分析した結果は上澄液中の測定
された活性値の2%以下の活性値を含むことが見出され
た。従ってクルイベロミセスα−因子はクルイベロミセ
スラクチスからのプロキモシンの分泌に関する指令にお
いて約98%の有効率を有する。
についてキモシン活性を分析した結果は上澄液中の測定
された活性値の2%以下の活性値を含むことが見出され
た。従ってクルイベロミセスα−因子はクルイベロミセ
スラクチスからのプロキモシンの分泌に関する指令にお
いて約98%の有効率を有する。
KRN303−1及びKRN304−4によって分泌される主な種
(スペシイス)を電気泳動(preparative SDS polyacry
lamide gel electro phoresis)によって精製し、これ
らについて気相アミノ酸配列分析を行なった。これらの
種のN−末端配列は下記の通りである: 上記の結果は、KRN303−1によって分泌されたプロキ
モシン−関連種はアミノ−末端スペーサー配列のプロセ
ッシングを受けないこと、他方においてKRN304−4から
分泌された種は真正の成熟したキモシンアミノ末端を有
することを示すものである。
(スペシイス)を電気泳動(preparative SDS polyacry
lamide gel electro phoresis)によって精製し、これ
らについて気相アミノ酸配列分析を行なった。これらの
種のN−末端配列は下記の通りである: 上記の結果は、KRN303−1によって分泌されたプロキ
モシン−関連種はアミノ−末端スペーサー配列のプロセ
ッシングを受けないこと、他方においてKRN304−4から
分泌された種は真正の成熟したキモシンアミノ末端を有
することを示すものである。
下記の有機体は1987年6月30日付でアメリカンタイプ
カルチュアコレクションへ寄託された:HB101 pAB307、
ATCC寄託番号67454;HB101 pAB312、ATCC寄託番号6745
5。
カルチュアコレクションへ寄託された:HB101 pAB307、
ATCC寄託番号67454;HB101 pAB312、ATCC寄託番号6745
5。
本発明は諸例についてかなり詳記されたけれどもそれ
は理解を充分にするための例示に過ぎず本発明の範囲内
で変更及び修正が可能であることが自明であろう。
は理解を充分にするための例示に過ぎず本発明の範囲内
で変更及び修正が可能であることが自明であろう。
添付図面の第1図はK.ラクチスα−因子DNAの同定のた
めに使用されるオリゴヌクレオチドプローブの設計用の
手段を示し; 第2図はK.ラクチスα−因子をコードするDNA断片の完
全な配列を示し; 第3図はK.ラクチスα−因子と、S.セレビシエα−因子
のタンパク質配列の比較を示し; 第4図はK.ラクチスα−因子及びS.セレビシエα−因子
の模式図であり; 第5図はK.ラクチスα−因子及びS.セレビシエα−因子
のDNA配列の比較を示し; 第6図は3種のプラスミド(これらの構成体についての
説明は諸例において詳記されている)の模式図であり; 第7図は、K.ラクチスα−因子先導体に関するDNAと、
プロキモシンに関するDNAとの連結を示す反応模式図で
あり; 第8図は、pUC18中へのpAB309 BamH I/Sal I挿入物の
配列を示し; 第9図はプラスミドpGB901を示し; 第10図はプラスミドpGBTeG418を示し; 第11図はK.ラクチスα−因子先導体DNAの突然変異形成
のために使用されるプライマー配列を示し; 第12図はK.ラクチスα−因子先導体/プロキモシンDNA
融合における連結点の周辺のDNA配列を示す。
めに使用されるオリゴヌクレオチドプローブの設計用の
手段を示し; 第2図はK.ラクチスα−因子をコードするDNA断片の完
全な配列を示し; 第3図はK.ラクチスα−因子と、S.セレビシエα−因子
のタンパク質配列の比較を示し; 第4図はK.ラクチスα−因子及びS.セレビシエα−因子
の模式図であり; 第5図はK.ラクチスα−因子及びS.セレビシエα−因子
のDNA配列の比較を示し; 第6図は3種のプラスミド(これらの構成体についての
説明は諸例において詳記されている)の模式図であり; 第7図は、K.ラクチスα−因子先導体に関するDNAと、
プロキモシンに関するDNAとの連結を示す反応模式図で
あり; 第8図は、pUC18中へのpAB309 BamH I/Sal I挿入物の
配列を示し; 第9図はプラスミドpGB901を示し; 第10図はプラスミドpGBTeG418を示し; 第11図はK.ラクチスα−因子先導体DNAの突然変異形成
のために使用されるプライマー配列を示し; 第12図はK.ラクチスα−因子先導体/プロキモシンDNA
融合における連結点の周辺のDNA配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:645) (72)発明者 アントニー ジェイ ブレイク アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94707 バークレー ロサンゼルス ア ベニュー 2115 (72)発明者 ヨハネス アー ファン デン ベルグ オランダ国 2811 アーデー レーウィ ーク ハーネッヘヴェッヒト 8
Claims (11)
- 【請求項1】下記(a)又は(b)のペプチドをコード
するDNA。 (a)MetLysPheSerThr IleLeuAlaAlaSer ThrAlaLeuIle
Ser ValValMetAlaAla ProValSerThrGlu ThrAspIleAspAs
p LeuProIleSerVal ProGluGluAlaLeu IleGlyPheIleAsp
LeuThrGlyAspGlu ValSerLeuLeuPro ValAsnAsnGlyThr Hi
sThrGlyIleLeu PheLeuAsnThrThr IleAlaGluAlaAla PheA
laAspLysAsp AspLeuLys 又は、 (b)上記(a)のアミノ酸配列において、少なくとも
1個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配
列からなり、且つ分泌指令可能なペプチド - 【請求項2】請求項1記載のDNA及び異種構造のポリペ
プチドをコードするDNAを含有するDNA構成体であって、
異種構造のポリペプチドをコードするDNAが請求項1記
載のDNAの3′末端に連結しているDNA構成体。 - 【請求項3】請求項1記載のDNA及び酵母のプロモータ
ーを含有するDNA構成体であって、該酵母のプロモータ
ーが請求項1記載のDNAの5′末端に連結しているDNA構
成体。 - 【請求項4】上記異種構造のポリペプチドがプロキモシ
ンである、請求項2記載のDNA構成体。 - 【請求項5】請求項1記載のDNA及び上記異種構造のポ
リペプチドをコードするDNAの間に、更にプロセッシン
グするための酵母のプロセッシングシグナルを含有す
る、請求項2記載のDNA構成体。 - 【請求項6】上記酵母のプロセッシングシグナルが基礎
的ジペプチド開裂部位及びスペーサーを有する、請求項
5記載のDNA構成体。 - 【請求項7】上記酵母のプロセッシングシグナルが、請
求項1記載のDNAのN−末端に直接に融合した基礎的ジ
ペプチド開裂部位を有する、請求項5記載のDNA構成
体。 - 【請求項8】上記基礎的ジペプチドが少なくとも1つの
アルギニンを含有する、請求項6記載のDNA構成体。 - 【請求項9】上記基礎的ジペプチドがリジン−アルギニ
ン又はアルギニン−アルギニンである、請求項6記載の
DNA構成体。 - 【請求項10】酵母中に安定に保持される複製可能系又
は統合可能系、及び請求項2記載のDNA構成体を含有す
る発現ベクター。 - 【請求項11】酵母の中で異種構造ポリペプチドを生産
する方法において、請求項10記載の発現ベクターを有す
る酵母を、該異種構造ポリペプチドが、該異種構造ポリ
ペプチドに少なくとも部分的にプロセッシングされるプ
ロポリペプチドとして該酵母によって発現されかつ分泌
される条件の下で、培地中で生育させることを特徴とす
る上記の方法。
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