DE3908802C2 - Verfahren zur Gewinnung von PDGF-AA - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufarbeitung von PDGF-AA.

Platelet Derived Growth Factor (PDGF) ist ein Hauptmitogen im Serum, das das Wachstum von Fibroblasten und glatten Muskelzellen in vitro fördert. In vivo wird PDGF in den alpha-Granula der Thrombozyten gespeichert und nach Stimu­ lation der Thrombozyten freigesetzt. Hochgereinigtes PDGF ist ein basisches Protein, das eine beträchtliche Hetero­ genität hinsichtlich seines Molekulargewichts aufweist (Kb 27 000 bis 31 000 d). Die Gründe für diese Heterogenität sind Alterung, Prozessierung und die Existenz verschie­ dener Isoformen des Typs AA, AB oder BB. Die biologische Aktivität aller dieser Formen wird durch Reduktion der Disulfidbrücken zerstört. Human-PDGF aus Thrombozyten be­ steht hauptsächlich aus AB-Heterodimeren; vgl. Heldin 1984, Deuel et al. 1985 und Ross et al. 1986).

Aminosäuresequenzierungen in Verbindung mit DNA-Sequen­ zierungen der Gene zeigten, daß A und B homolog sind. PDGF- B ist nahezu identisch mit dem transformierenden Genprodukt p28^vsis des Simian-Sarcoma-Virus (SSV). In SSV-trans­ formierten Zellen wurden entsprechende Homodimere des Types BB nachgewiesen, die ähnliche Eigenschaften wie thrombo­ zytäres PDGF zeigten. Allerdings wurden diese BB-Dimeren nur zum geringen Teil aus den infizierten Zellen sekretiert. PDGF-AA-Formen werden hingegen effizient von produzierenden Zellen sekretiert. Es gibt eine zunehmende Zahl von Hin­ weisen, daß die drei Isoformen AA, AB und BB unterschied­ liche Funktionen wahrnehmen. Für eingehende Untersuchungen war daher die Entwicklung einer neuen Lehre notwendig, mit der sich größere Mengen an PDGF-AA gewinnen lassen.

Arch. Imm. Ther. Exp., 32 (1994) 589-598 kann man entnehmen, daß sich PDGF durch eine Säure/Ethanol-Extraktion eines Platelet-Lysats isolieren und konzentrieren läßt. Das Konzentrat kann man einer Ionenaustauschchromatographie an DEAE-Sephadex und an CM-Sephadex unterwerfen, wonach man die Fraktion aus der CM-Sephadex-Chromatographie an Glas (CPG-10) adsorbieren kann. Anregungen zur Aufarbeitung von PDGF aus Expressionskulturen werden nicht gegeben. Für eine Reinigung von PDGF und verwandten Faktoren aus Zellkulturüberständen läßt sich wiederum Nature, 319 (1986) 511-514 und J. Biol. Chem. 263 (1988) 16 202-16 208 ein vierstufiges Chromatographieverfahren entnehmen, dessen Erfolg jedoch noch verbesserungsbedürftig ist.

Erfindungsgemäß wird nun ein Verfahren zur Aufarbeitung von PDGF-AA aus Expressionskulturen vorgesehen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man PDGF-AA aus dem wässerigen Medium der Expressionskultur an einem keramischen Material adsorbiert.

Vorzugsweise verwendet man Glas als keramisches Material und insbesondere poröses Glas.

Zusätzlich zur genannten Aufarbeitungsmaßnahme kann man das adsorbierte PDGF-AA eluieren und danach einer Gelpermeationschromatographie und/oder einer HPLC-Chromatographie an einer Umkehrphase unterwerfen.

Nachstehend wird die Erfindung durch experimentelle Daten und 3 Figuren näher erläutert.

Verwendetes Lebendmaterial
Referenz
SV40-Promotor bzw. Vektor mit SV40-Promotor
Pharmacia
pPFa-1=pPFG-1	FEBS Lett., 223 (1987) 243-246
pBEH	Gene, 68 (1988) 213-219
pAG60 @	AKR-2B	Beispiel für Maus-Fibroblasten
BHK 21	ATCC-CCL 10
LTK

Material und Methoden

Zellkulturen waren von Gibco. Chromatographiematerialien: poröses Glas PG 120-200, Sigma; Bio-Gel P100, 200-400 mesh, Bio-Rad; modifiziertes Kiesgelgel 214 TP54, 10 µm (=Vydac C4) von Vydac (Macherey & Nagel); Harnstoff war von Sigma. Ethylenglykol und Puffersubstanzen waren von Merck. Restrik­ tionsendonukleasen und Ligasen wurden von Boehringer bzw. BRL bezogen.

Analytische Methoden

Wachstumsfördernde Aktivität wurde nach Shipley et al. (1984) durch die Bestimmung der [³H]Thymidinrate in dichtearretierte Maus AKR-2B Fibroblasten ermittelt. Proteingehalt wurde nach Bradford bestimmt. Aminoterminale Sequenzanalyse wurde mittels eines Gas-Flüssig-Phasen-Protein-Sequenators (Applied Biosystems) durchgeführt. PTH Aminosäuren wurden "on line" durch HPLC- Chromatographie bestimmt. Polyacrylamidgelelektrophorese in Gegenwart von Natrium Dodecylsulfat wurde wie beschrieben (Hoppe et al., 1986) durchgeführt. Standard DNA-Techniken wurden nach Maniatis (1982) durchgeführt.

Zusammenfassung

Ein 712 Basenpaar langes RsaI Fragment aus dem Vektor pPFa-1 (= pPFG-1) (Hoppe et al., 1987), das den für PDGF-A kodierenden Bereich enthält, wurde in die SmaI Schnittstelle des SV40 Ex­ pressionsvektors pBEH (Artel et al., 1988) integriert und somit unter die Kontrolle des SV40 Promotors gebracht.

Dieses Plasmid wurde durch Kotransfer mit dem Plasmid pAG60 (Colb´re-Garapin et al., 1988) stabil chromosomal in BHK21-Zellen integriert. Nach Subklonierung wurde eine Zellinie erhalten, die bis zu 1 mg/l PDGF-AA/Tag in das Nährmedium sekretierte. Aus Überständen dieser Zellkulturen konnte PDGF-AA durch ein Drei­ stufenverfahren zur Homogenität gereinigt werden. Der erste Schritt war Adsorption an poröses Glas, der zweite Schritt Gelpermeations-Chromatographie an Bio-Gel P100. Die Endreinigung wurde durch Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie an reverser Phase erzielt. Die Ausbeuten waren ca. 0,2 mg PDGF-AA/l Zellkulturüberstand. Die spezifische Aktivität war 4 ng/ml für 50% Aktivierung des [³H]Thymidineinbaus in Maus AKR-2B Fibro­ blasten.

Beispiel Konstruktion des Expressionsvektors pODa

Aus dem 1,2 Kb langen Bam HI Fragment des Plasmides pPFa-1 (Hoppe et al., 1987), das den vollständigen für PDGF-A kodierenden Bereich enthält, wurde durch RsaI-Verdau ein 712 Basenpaar langes Fragment erhalten, das ebenfalls noch den gesamten kodierenden Bereich beinhaltet. Dieses Fragment wurde in die SmaI Schnittstelle im Polylinker des Plasmides pBEH integriert. Die Orientierung wurde durch SalI-Spaltung ermittelt. Ein Plasmid wurde erhalten, das das PDGF-A-Gen in korrekter Orientierung unter Kontrolle des SV40 Promoters im Plasmid pBEH enthielt. Dieses Plasmid wurde pODa genannt.

Transfektion von BHK21 Zellen

Die Transfektion von BHK21 Zellen wurde im wesentlichen nach der Methode von Wigler et al., 1979, durchgeführt. Die zu transfi­ zierenden Zellen wurden in der exponentiellen Wachstumsphase vor Erreichen der Konfluenz abtrypsiniert, gezählt, in einer Zell­ dichte von 3×10⁵ Zellen pro Kulturflasche (25 cm² Bodenfläche) in 5 ml Kulturmedium neu ausgesät und 24 Std. bei 37°C inkubiert. Am darauffolgenden Tag, 4 Std. vor Zugabe der Präzipitate, wurde das Medium entfernt und durch frisches Wachstumsmedium ersetzt. Die Präzipitate wurden wie folgt hergestellt: 5 µg der zu trans­ formierenden DNS wurden unter sterilen Bedingungen zusammen mit 5 µg Träger-DNS aus LTK-Zellen mit 0,5 µg Selektions-DNS (pAG60, Bam HI geschnitten) in 0,25 ml 250 mM CaCl₂ gelöst. Diese Lösung wurde langsam, unter ständiger Verwirbelung durch über eine wattegestopfte Pasteurpipette eingeblasene Luft zu 250 µl 2×HEBS-Puffer (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM NaH₂PO₄, pH 7,1) getropft, wodurch sich ein DNS/Kalziumphosphat-Kopräzipitat ausbildet. Die so hergestellte Lösung wurde zur vollständigen Ausfällung für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend den zu transfizierenden Kulturen zugesetzt. Nach 16 Std. wurde das Medium gegen frisches Wachstumsmedium ausge­ tauscht. Am zweiten Tag nach Zugabe der Präzipitate begann die Selektion, in dem das Medium durch frisches Kulturmedium, dem 500 µg/ml G418 zugesetzt waren, ersetzt wurde. Das Selektionsmedium wurde alle 2-3 Tage erneuert. Nach 2-4 Wochen waren 2000 Kolonien erkennbar. Um auf eine stabile Transformation zu selektionieren, wurden die Zellen zweimal in Selektionsmedium passagiert. Diese Kolonien wurden vereinigt und durch Grenz­ verdünnung rekloniert. Einzelne Klone wurden hinsichtlich ihrer Produktivität an PDGF-AA untersucht. Ein Hochproduzent (Klon 39) wurde erhalten.

Kultivierung der Zellen und Isolierung von PDGF-AA

Zur Gewinnung größerer Mengen an Zellkulturüberständen wurden Zellen des Klon 39 in 15 Rollerflaschen (600 cm² Oberfläche, Falcon) in HG-DMEM/10% FCS, 25 mM HEPES, pH 7,4, angezogen (37°C). Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen zweimal mit HG-DMEM, 25 mM HEPES gewaschen und in diesem Medium 2 Tage gehalten. Danach wurden sie 12 Stunden in HG-DMEM, 25 mM HEPES, 10% FCS, kultiviert. Diese Prozedur wurden 4 Wochen lang durchge­ führt. Insgesamt wurden ca. 25 l Kulturüberstand erhalten. Proteine aus den vereinigten Überständen wurden quantitativ an poröses Glas CPG 120-200 absorbiert. Dazu wurde 1% w/v Glas zu dem Überstand gegeben und 1/2 h inkubiert. CPG-Glas wurde in einer Säule (5 cm ⌀) gesammelt und die Überstände wurden erneut über das CPG-Glas filtriert. Danach wurde solange mit 10 mM Natriumphosphat, 0,5 M NaCl-Puffer, pH 7,2, gewaschen, bis die OD₂₈₀ (1 cm) unter 0,005 gesunken war. Die Elution von PDGF-AA wurde durch 0,4 M Glycin/HCl, pH 2,0, 6% Harnstoff, 6% Etylen­ glykol, erreicht. Nach der Dialyse PDGF-AA enthaltenden Fraktionen gegen 10 mM Natriumphosphat, pH 7,5, wurde durch Zugabe von 80% Ammoniumsulfat (Sättigung) ausgefällt. Das Präzipitat wurde im kleinst möglichen Volumen 10 mM Essigsäure aufgenommen. Portionen von 10 ml wurden auf eine Säule 2 cm ⌀×140 cm (Bio-Gel P100 in 0,1 M Essigsäure) aufgetragen. Flußrate war ca. 15 ml/h. Fraktionen von 4 ml wurden gesammelt. Aliquots der Fraktionen wurden durch SDS-Gelelektrophorese analysiert. PDGF-AA-haltige Fraktionen wurden vereinigt und auf eine Vydac C4 Säule aufgetragen (0,8 cm ⌀×25 cm). Flußrate war 1 ml/min. Die Säule war vorher in 0,1% Trifluoressigsäure äquilibriert. Die Elution erfolgte durch einen linearen Gradienten von 14% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure/H₂O nach 35% Acetonitril in 0,1% Tri­ fluoressigsäure/H₂O während 70 min bei einer Flußrate von 0,7 ml/min. Die Extinktion bei 220 nm wurde kontinuierlich registriert und Fraktionen von 0,7 ml wurden gesammelt. PDGF-AA eluierte bei einem Acetonitrilgehalt von 26-27%. Aliquots der Fraktionen wurden gelelektrophoretisch untersucht und solche ohne Fremdproteingehalt wurden vereinigt.

Resultate

Die Transfektion von BHK21 Zellen mit dem Vektor pODa ergab 2000 unabhängige Klone. Durch Reklonierung wurden Stämme erhalten, die sich stark in der Produktion von PDGF-AA unterschieden. Es wurden Klone erhalten, die bei optimalen Bedingungen bis zu 1 mg/l PDGF- AA im Kulturüberstand aufwiesen. Einer dieser Klone (Klon 39) wurde näher charakterisiert.

Durch eine einfache Kultivierungsprozedur in Rollerflaschen wurden 25 l Überstand erhalten. Die Adsorption der Proteine am porösen Glas erwies sich als optimal, sowohl hinsichtlich der effizienten Reduktion eines großen Volumens von 25 l auf 250 ml als auch der theoretischen Aktivitätsausbeute. Eine 5fache Anreicherung konnte erzielt werden. Durch zwei weitere chromatographische Schritte (Gelpermeationschromatographie und anschließend Hochdruckflüssigkeitschromatographie an umgekehrter Phase) konnte PDGF-AA in ca. 50%iger Ausbeute erhalten werden. Etwa 0,2 mg PDGF-AA wurde aus 1 l Überstand isoliert. Das so erhaltene Material ist einheitlich in der SDS-gelektrophorese (Abb. 2) und zeigte in der aminoterminalen Sequenzanalyse nur die erwartete Sequenz SIEE . . .

Es ist demnach eindeutig als PDGF-AA identifiziert. Dieses Material stimuliert den [³H]Thymidineinbau in dichtearretierte Mausfibroblasten AKR-2B halbmaximal bei einer Konzentration von 5 ng/ml.

Literatur

Artelt, P., Morelle, C., Ausmeier, M., Fitzek, M. and Hauser, H. (1988) Gene 68, 213-219.
Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248-253.
Colb´re-Garapin et al. (1981) J. Mol. Biol. 150, 1-14.
Hoppe, J., Gatti, D., Weber, H. and Sebald, W. (1986) Eur. J. Biochem. 155, 259-264.
Hoppe, J. Schumacher, L., Eichner, W. and Weich, H. A. (1987) FEBS Lett. 223, 243-246.
Maniatis, T., Fritsch, E. F. and Sambrook, J. (1982) in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
Shipley, G. C., Childs, C. B., Volkenant, M. E. und Moses, H. L. (1984) Cancer Res. 44, 710-716.
Wigler, M., Sweet, R., Sim, G. K., Wold, B., Pellicer, A., Lacy, E., Maniatis, T., Silverstein, S. und Axel, R. (1979) Cell 16, 777-785.

Reinigung von rPDGF-A aus Kulturüberständen (Aufarbeitungsschema)

Claims (3)

1. 2. Verfahren zur Aufarbeitung von PDGF-AA aus Expressionskulturen, dadurch gekennzeichnet, daß man PDGF-AA aus dem wässerigen Medium der Expressionskultur an einem keramischen Material adsorbiert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als keramisches Material Glas, insbesondere poröses Glas verwendet.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich das adsorbierte PDGF-AA eluiert und danach einer Gelpermeationschromatographie und/oder einer HPLC-Chromatograhie an einer Umkehrphase unterwirft.