NO330491B1 - Rekombinant polynukleotid som koder for et polypeptid, eller antigent fragment derav, som indusere en immunrespons som er spesifikk for gruppe B streptococcus, vektor omfattende polynukleotidet, vertscelle transfektert med vektoren, fremgangsmate for fremstilling av polypeptidet, isolert polypeptid, vaksinesammensetning som omfatter polypeptidet,anvendelse av polypeptid ifolge oppfinnelsen for fremstilling av en vaksinesammensetning, isolert antistoff, eller antigenbindende fragment derav, som spesifikt binder til polypeptidet, fremgangsmate for pavisning av gruppe B Streptococcus i en biologisk prove, fremgangsmate for pavisning av et antistoff som spesifikt binder til polypeptidet. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler antigener, mer spesielt proteinantigener av gruppe B Streptococcus (GBS) bakteriepatogen, som er nyttige som vaksinekomponenter for terapi og/eller profylakse.

Streptokoccus er gram (+) bakterier som er differensiert ved gruppespesifikke karbohydratantigener A via O som finnes på deres celleoverflate. Streptokoccusgrupper blir videre skilt ved typespesifikk kapselpolysakkarid antigener. Flere serumtyper har blitt identifisert for gruppen B Streptokoccus (GBS): Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII og VIII. GBS inneholder også antigenproteiner kjent som «C-proteiner» (alfa, beta, gamma og delta) der noen av disse har blitt klonet.

Til tross for at GBS er en vanlig komponent i den normale human vaginale og kolonfloraen, har dette patogenet lenge vært kjent som en viktig årsak til neonatal sepsis og meningitt, sent-startet meningitt i nyfødte, post partum endometritt, så vel som mastitt i meieribuskap. Vordende mødre som blir eksponert for GBS har risiko for post partum infeksjon, og kan overføre infeksjonen til sitt barn når barnet passerer gjennom fødselskanalen. Selv om organismen er sensitiv for antibiotika, resulterer den høye angrepshastigheten og raske starten på sepsis i nyfødte, og meningitt i barn, i høy sykelighet og dødelighet.

For å finne en vaksine som kan beskytte individer fra GBS infeksjon, har forskere vendt seg mot de typespesifikke antigenene. Uheldigvis har disse polysakkaridene vist seg å være lite immunogene i mennesker, og er begrenset til den spesielle serumtypen som polysakkaridene opprinner fra. Videre utløser kapselpolysakkarid en T celle uavhengig respons, det vil si ingen IgG produksjon. Følgelig er kapselpolysakkaridantigener ikke passende som en vaksinekomponent for beskyttelse mot GBS infeksjon.

Andre har fokusert på C-protein betaantigenet som viser immunogene egenskaper i mus og kaninmodeller. Dette proteinet ble funnet å være upassende som en menneskelig vaksine som følge av sin uønskede egenskap ved å interagere med høy affinitet og på en ikke-immunogen måte med Fc regionen til human IgA. Det C-protein alfaantigenet er sjeldent i type III serumtyper i GBS, som er den serumtypen som er ansvarlig for de fleste GBS medierte tilstander, og er derfor til liten nytte som en vaksinekomponent.

Den kjente teknikken er bl.a. beskrevet i WO 98/18931 som beskriver polynukleotidsekvenser fra et Streptococcus pneumoniae-genom og utledede aminosyre sekvenser, og i Muchel et al., Infect. Immun. 59:2023-28 (1991) som beskriver kloning og karakterisering av to gruppe-B-streptococcus C-proteinantigener, alfa og beta.

Derfor gjenstår det et umøtt behov for GBS antigener som kan bli benyttet som vaksinekomponenter for profylaksen og/eller terapien ved GBS infeksjon.

I henhold til et aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et rekombinant polynukleotid som koder for et polypeptid som har minst 95 % identitet til et annet polypeptid, som omfatter en sekvens valgt fra gruppen som består av: SEKV. ID NR.: 37, SEKV. ID NR.: 39, SEKV. ID NR.: 42, SEKV. ID NR.: 43, og SEKV. ID NR.: 44 eller fragmenter derav.

I andre aspekter tilveiebringes vektorer som omfatter polynukleotider i henhold til oppfinnelsen som er operabelt koblet til en ekspresjonskontrollregion, så vel som vertsceller transfektert med nevnte vektorer, og fremgangsmåter for å fremstille polypeptider som omfatter å dyrke nevnte vertsceller under forhold som er passende for ekspresjon.

I enda et annet aspekt, tilveiebringes isolerte polypeptider kodet for av polynukleotider som angitt i foreliggende oppfinnelse.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE.

Figur la er DNA sekvensen til klon 1 (SEKV. ID NR.: 1) med korresponderende aminosyresekvenser for åpne leserammer;

figur lb er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 2;

figur lc er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 3;

figur ld er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 4;

figur le er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 5;

figur lf er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 6;

Figur 2a er DNA sekvensen til klon 2 (SEKV. ID NR.: 7) med korresponderende aminosyresekvenser for åpne leserammer;

figur 2b er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 8;

figur 2c er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 9;

figur 2d er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 10;

figur 2e er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 11;

figur 2f er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 12;

Figur 3a er DNA sekvensen til klon 3 (SEKV. ID NR.: 13) med korresponderende aminosyresekvenser for åpne leserammer;

figur 3b er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 14;

figur 3c er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 15;

figur 3d er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 16;

figur 3e er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 17;

figur 3f er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 18;

figur 3g er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 19;

figur 3h er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 20;

figur 3i er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 21;

Figur 4a er DNA sekvensen til klon 4 (SEKV. ID NR.: 22) med korresponderende aminosyresekvenser for åpne leserammer;

figur 4b er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 23;

figur 4c er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 24;

figur 4d er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 25;

figur 4e er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 26;

Figur 5a er DNA sekvensen til klon 5 (SEKV. ID NR.: 27) med korresponderende aminosyresekvenser for åpne leserammer;

figur 5b er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 28;

figur 5c er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 29;

figur 5d er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 30;

figur 5e er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 31;

Figur 6a er DNA sekvensen til klon 6 (SEKV. ID NR.: 32);

figur 6b er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 33;

figur 6c er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 34;

figur 6d er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 35;

figur 6e er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 36;

Figur 7a er DNA sekvensen til klon 7 (SEKV. ID NR.: 37);

figur 7b er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 38;

figur 7c er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 39;

figur 7d er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 40;

figur 7e er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 41; Figur 8 er DNA sekvensen til en del av klon 7 inkludert en signalsekvens (SEKV. ID NR.: 42); Figur 9 er DNA sekvensen til en del av klon 7 uten en signalsekvens (SEKV. ID. NR.: 43);

figur 9A er aminosyresekvensen SEKV. ID NR.: 44;

Figur 10 representerer distribusjonen av anti-GBS ELISA titer i serum fra CD-1 mus immunisert med rekombinant GBS protein som korresponderer til SEKV. ID NR.: 39.

Foreliggende oppfinnelse omhandler nye antigene polypeptider av gruppe B streptokokkus (GBS)karakterisert vedaminosyresekvensen valgt fra gruppen som består av: SEKV. ID NR.: 39 og SEKV. ID NR.: 44 eller fragmenter, analoger eller derivater derav.

En foretrukket utforming av oppfinnelsen er SEKV. ID NR.: 39.

En videre foretrukket utforming av oppfinnelsen er SEKV. ID NR.: 44.

Som benyttet heri inkluderer «fragmenter», «derivater» eller «analoger» av polypeptidene i henhold til oppfinnelsen, de polypeptidene der en eller flere av aminosyrerestene er substituert med en konservert eller ikke-konservert aminosyrerest (fortrinnsvis konservert), og som kan være naturlig eller ikke-naturlig.

Begrepet «fragmenter», «derivater» eller «analoger» av polypeptider i henhold til den foreliggende oppfinnelsen inkluderer også polypeptider som er modifisert ved addisjon, delesjon, substitusjon av aminosyrer, gitt at polypeptidene beholder kapasiteten til å indusere en immunrespons.

Med begrepet «konservert aminosyre» menes en substitusjon av en eller flere aminosyrer for en annen, der den antigene determinanten (inkludert dens sekundære struktur og hydropatiske natur) til et gitt antigen er fullstendig eller delvis konservert til tross for substitusjonen.

For eksempel kan en eller flere aminosyrerester inni sekvensen være substituert av en annen aminosyre med en lignende polaritet, som virker som en funksjonell ekvivalent, og resulterer i en stille endring. Substituenter for en aminosyre inni sekvensen kan bli valgt fra andre medlemmer av klassen som aminosyren tilhører. For eksempel inkluderer de ikke-polare (hydrofobe) aminosyrene alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan og metionin. De polare nøytrale aminosyrene inkluderer glycin, serin, treonin, cystein, tyrosin, aspargin og glutamin. De positivt ladede (basiske) aminosyrene inkluderer argenin, lysin og histidin. De negativt ladede (sure) aminosyrene inkluderer aspartatsyre og glutamatsyre.

Fortrinnsvis vil derivater og analoger av polypeptider i henhold til foreliggende oppfinnelse ha minst 95 % identitet med de sekvensene som er illustrert i figurene, eller fragmentene derav. I en annen utforming vil derivatene og analogene til polypeptidene i henhold til foreliggende oppfinnelse ha mindre enn omkring 20 aminosyrerestsubstitusjoner, modifikasjoner eller delesjoner, og mer fortrinnsvis mindre enn 10. Foretrukne substitusjoner er de som er kjent i faget som konserverte, det vil si de substituerte restene deler fysiske eller kjemiske egenskaper så som hydrofobisitet, størrelse, ladning eller funksjonelle grupper.

Videre kan det i de situasjonene der aminosyreregioner blir funnet å være polymorfe, være ønskelig å variere en eller flere spesielle aminosyrer for mer effektivt å etterligne de ulike epitopene til de forskjellige GBS stammene.

Også inkludert er polypeptider som har fusjonert derpå andre forbindelser som endrer polypeptidenes biologiske eller farmakologiske egenskaper, det vil si polyetylenglykol (PEG) for å øke halveringstiden; ledende (leader) eller sekretoriske aminosyresekvenser for å forenkle rensingen; prepro- og pro-sekvenser; og (poly) sakkarider.

Videre kan polypeptidene i den foreliggende oppfinnelsen bli modifisert ved terminal -NH2acylering (for eksempel ved acetylering eller tioglykolsyreamidering, terminal karboksyamidering, for eksempel med ammoniakk eller metylamin) for å tilveiebringe stabilitet, økt hydrofobisitet for kobling eller binding til et støtte- eller annet molekyl.

Betraktet er også hetero- og homopolypeptidmultimerer og polypeptidfragmentene, analoger og derivater. Disse polymere formene inkluderer for eksempel et eller flere polypeptider som har blitt krysskoblet med krysskoblere så som avidin/biotin, gluteraldehyd eller dimetylsuperimidat. Slike polymere former inkluderer også polypeptider som inneholder to eller flere tandem eller inverterte tilstøtende sekvenser, dannet fra multicistroniske mRNA'er generert ved rekombinant DNA teknologi. Fortrinnsvis vil et fragment, analog eller derivat av et polypetid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen inneholde minst en antigen region, det vil si minst en epitope.

For å oppnå dannelsen av antigene polymerer (det vil si syntetiske multimerer) må det benyttes polypeptider som har bishalogensubstituerte acetylgrupper, nitroarylhalider eller lignende, der reagensene er spesifikke for tiogrupper. Derfor kan koblingen mellom to merkaptogrupper på de forskjellige peptidene være en enkelbinding, eller kan bestå av en koblingsgruppe på minst to, vanligvis minst fire, og ikke mer enn 16, men vanligvis ikke mer enn 14, karbonatomer.

I en spesiell utforming inneholder polypeptidfragmenter, analoger og derivater i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, ikke en metionin (Met) startaminosyre. Fortrinnsvis vil polypeptider ikke inkorporere en leder eller sekretorisk sekvens (signalsekvens). Signaldelen av et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan bli bestemt i henhold til etablerte molekylærbiologiske teknikker. Generelt kan polypeptidet av interesse bli isolert fra en GBS kultur og deretter sekvensert for å bestemme den innledende aminosyren til det modne proteinet, og derfor sekvensen til det modne polypeptidet.

I henhold til et annet aspekt tilveiebringes vaksinesammensetninger som omfatter et eller flere GBS polypeptider i henhold til oppfinnelsen, i en tilblanding med et farmasøytisk akseptabelt bærerfortynningsmiddel eller adjuvans.

Passende adjuvanser inkluderer oljer, det vil si Freund's komplette eller ukomplette adjuvans; salter, det vil si A1K(S04)2, AlNa(S04)2, A1NH4(S04)2, Al(OH)3, A1P04, silica, kaolin; saponinderivat; karbon polynukleotider, det vil si poly IC og poly AU, og også detoksifisert koleratoksin (CTB) og E. coli varmelabilt toksin for induksjon av slimhinneimmunitet. Foretrukne adjuvanser inkluderer QuilA™, Alhydrogel og Adjuphos . Vaksiner i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan bli administrert parenteralt ved injeksjon, rask infusjon, nasofaryngeal absorpsjon, hudabsorpsjon eller munnhule eller oral.

Vaksinesammensetninger i henhold til den foreliggende oppfinnelsen blir benyttet for behandlingen eller profylakse av streptokokkinfeksjon og/eller sykdommer og symptomer mediert av streptokokkusinfeksjon, spesielt gruppe A Streptokoccus (pyogener), gruppe B Streptokoccus (GBS eller agalasitiae), dysgalasitiae, uberis, nokardia, så vel som Stafylokoccus aureus. Generell informasjon om Streptokoccus er tilgjengelig i Manual of Clinical Microbiology av P. R. Murray et al. (1995, 6. utgave, ASM Press, Washington, D.C). Mer spesielt gruppe B Streptokoccus, agalasitiae. I en spesiell utforming blir vaksiner administrert til personer med risiko for GBS infeksjon, så som gravide kvinner og nyfødte for sepsis, meningitt og lungebetennelse, så vel som immunkompromitterte personer så som de med diabetes, leversykdommer eller kreft. Vaksiner kan også ha veterinær anvendelse så som for behandlingen av mastitt i kveg, som er mediert av de ovennevnte bakteriene, så vel som E. coli.

Vaksinen i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan også bli benyttet i produksjonen av et medikament som benyttes til behandlingen eller profylaksen av streptokokkinfeksjon og/eller sykdommer og symptomer mediert av streptokokkinfeksjon, spesielt gruppe A Streptokoccus (pyogener), gruppe B Streptokoccus (GBS eller agalsitiae), dysgalasitiae, uberis, nokardia så vel som Stafylokoccus aureus. Mer spesielt gruppe B Streptokoccus, agalasitiae.

Vaksinesammensetninger er fortrinnsvis i enhetsdose form på omkring 0, 001 til 100 ug/kg (antigen/kroppsvekt), og mer fortrinnsvis 0, 01 til 10 ug/kg og mest fortrinnsvis 0, 1 til 1 ug/kg, 1 til 3 ganger med et intervall på omkring 1 til 12 uker intervaller mellom immuniseringer, og mer fortrinnsvis 1 til 6 uker.

Det skal forstås at polynukleotidsekvensene illustrert i figurene kan bli endret med degenererte kodon, og fremdeles kode for polypeptidene i henhold til oppfinnelsen. Som en følge av degenereringen av nukleotidkodende sekvenser kan andre polynukleotidsekvenser som koder for i det vesentlige de samme polypeptidene som i den foreliggende oppfinnelsen, bli benyttet i praktiseringen av den foreliggende oppfinnelsen. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, nukleotidsekvenser som er endret ved substitusjonen i forskjellige kodon som koder for de samme aminosyrerestene inni sekvensen, og som derved gir en stille forandring (silent c hange).

I henhold til dette tilveiebringer foreliggende oppfinnelse videre polynukleotider som hybrididserer til polynukleotidsekvensene heri over beskrevet (eller komplementsekvensene derav) som har 50 %, og fortrinnsvis minst 70 %, identitet mellom sekvenser. Mer fortrinnsvis er polynukleotider hybridiserbare under stringente forhold, det vil si har minst 95 % identitet og mest fortrinnsvis mer enn 97 % identitet.

Med i stand til å hybridisere under stringente forhold, menes sammenføying av et nukleotidsyremolekyl til minst en region på en annen nukleotidsyresekvens (enten som cDNA, mRNA eller genomisk DNA), eller til dens komplementære tråd under standard forhold, for eksempel høy temperatur og/eller lavt saltinnhold, som tenderer til å disfavorisere hybridisering av ikke-komplementære nukleotidsekvenser. En passende protokoll er beskrevet i Maniatis T. et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, 1982.

Videre kan polynukleotider som koder for polypeptider i henhold til foreliggende oppfinnelse, eller fragmenter, analoger eller derivater derav, bli benyttet i en DNA immuniseringsmetode. Det vil si de kan bli inkorporert inn i en vektor som er replikerbar og uttrykkbar ved injeksjon, og derved produserer det antigene polypeptidet in vivo. For eksempel kan polynukleotider bli inkorporert i en plasmidvektor under kontrollen av CMV promotoren som er funksjonell i eukarote celler. Fortrinnsvis blir vektoren injisert intramuskulært.

I henhold til et annet aspekt tilveiebringes en fremgangsmåte for å fremstille polypeptider i henhold til oppfinnelsen ved rekombinante teknikker, ved å uttrykke et polynukleotid som koder for nevnte polypeptid i en vertscelle, og å gjenvinne det uttrykte polypeptidproduktet. Alternativt kan polypeptidene produseres i henhold til etablerte syntetiske kjemiske teknikker, det vil si løsningsfase eller fastfasesyntese av oligopeptider som er ligert for å produsere fullengde polypeptidet (blokkligering).

For rekombinant fremstilling blir vertsceller transfektert med vektorer som koder for polypeptidet, og deretter dyrket i et næringsmedium modifisert på en passende måte for å aktivere promotorer, selektere for transformanter eller oppformere genene. Passende vektorer er de som er levedyktige og replikerbare i den valgte verten, og inkluderer kromosomale-, ikke-kromosomale- og syntetiske DNA sekvenser, for eksempel bakterieplasmider, fag DNA, baculovirus, gjærplasmider, vektorer avledet fra kombinasjoner av plasmider og fag DNA. Polypeptidsekvensen kan bli inkorporert i vektoren på det passende stedet ved å benytte restriksjonsenzymer slik at den blir operabelt koblet til en ekspresjonskontroll region som inneholder en promoter, ribosombindende sete (konsensusregion eller Shine-Dalgarno sekvens), og eventuelt en operator (kontrollelement). Man kan velge individuelle komponenter av ekspresjonskontroll regionen som er passende for en gitt vert, og vektor i henhold til etablerte molekylærbiologiske prinsipper (Sambrook et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989). Passende promoterer inkluderer, men er ikke begrenset til, LTR eller SV40 promoter, E. coli lac, tac eller trp promotorer og fag lambda Pl promoteren. Vektorer vil fortrinnsvis inkorporere et startpunkt for replikasjon så vel som seleksjonsmarkører, det vil si ampicillin resistent gen. Passende bakterievektorer inkluderer pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pbs, pDIO fagskript, psiX174, pblueskript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 og eukaryote vektorer pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG og pSVL. Vertsceller kan være bakterier, det vil si E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces; sopp, det vil si Aspergillus niger, Aspergillus nidulins; gjær, det vil si Saccharomyces eller eukaryot, det vil si CHO, COS.

Ved ekspresjon av polypeptidet i kultur blir cellene vanligvis høstet ved sentrifugering, deretter ødelagt ved fysiske eller kjemiske metoder (dersom det uttrykte polypeptidet ikke skilles ut i mediumet), og det resulterende råekstraktet oppbevart for å isolere polypeptidet av interesse. Rensing av polypeptidet fra dyrkningsmediumet eller lysatet kan oppnås ved etablerte teknikker avhengig av egenskapene til polypeptidet, det vil si ved å benytte ammoniumsulfat eller etanolutfelling, syreekstraksjon, anion eller kation utbyttekromatografi, fosfocellulosekromatografi, hydrofob interaksjonkromatografi, hydroksylapatitkromatografi og lektinkromatografi. Endelig rensing kan bli oppnådd ved å benytte HPLC.

Polypeptidet kan bli uttrykt med eller uten en leder - (leader) eller sekresjonssekvens. I det første tilfellet kan lederen bli fjernet ved å benytte post-translasjonell prosessering (se US 4,431,739; 4,425,437; og 4,338,397), eller bli kjemisk fjernet etter rensing av det uttrykte polypeptidet.

GBS polypeptidene i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan bli benyttet i en diagnostisk test for streptokokkusinfeksjon, spesielt GBS infeksjon. Flere diagnostiske metoder er mulige, for eksempel å detektere streptokokkorganisme i en biologisk prøve, den følgende prosedyren kan være som følger:

a) oppnå en biologisk prøve fra en pasient; b) å inkubere et antistoff eller fragment derav, reaktivt med et GBS polypeptid i

henhold til oppfinnelsen, med den biologiske prøven for å danne en

blanding; og

c) å detektere spesifikt bundet antistoff eller bundet fragment i blandingen som indikerer nærværet av streptokokker.

Alternativt kan en metode for deteksjonen av antistoff spesifikt mot et streptokokkantigen i en biologisk prøve som inneholder, eller antas å inneholde, nevnte antistoff bli utført som følger: a) å isolere en biologisk prøve fra en pasient; b) å inkubere et eller flere GBS polypeptider i henhold til oppfinnelsen, eller fragmenter derav, med den biologiske prøven for å danne en blanding; og c) å detektere spesifikt bundet antigen eller bundet fragment i blandingen som indikerer nærværet av antistoff spesifikt mot streptokokker.

En med kunnskaper i faget vil gjenkjenne at denne diagnostiske testen kan utføres på flere måter, inkludert en immunologisk test så som et enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA), et radioimmunoassay eller et lateks agglutineringsassay, i det vesentlige for å bestemme hvorvidt antistoffer spesifikke for proteinet er til stede i en organisme.

DNA sekvensene som koder for polypeptider i henhold til oppfinnelsen kan også bli benyttet for å konstruere DNA prober for anvendelse til å detektere nærværet av streptokokker i en biologisk prøve som antas å inneholde slike bakterier. Deteksjonsmetoden kan omfatte: a) å isolere den biologiske prøven fra en pasient; b) å inkubere en eller flere DNA prober som har en DNA sekvens som koder for et polypeptid i henhold til oppfinnelsen, eller fragmenter derav, med den

biologiske prøven for å danne en blanding; og

c) å detektere spesifikt bundet DNA probe i blandingen som indikerer nærværet av streptokokkbakterier.

DNA probene kan også bli benyttet for å detektere sirkulerende streptokokker, det vil si GBS nukleinsyrer i en prøve, for eksempel ved å benytte en polymerase kjedereaksjon som en metode for å diagnostisere streptokokkinfeksjon. Proben kan være syntetisert ved å benytte tradisjonelle teknikker og kan bli immobilisert på en fast fase, eller kan bli merket med et detekterbart merke. En foretrukket DNA probe for denne applikasjonen er en oligomer som har en sekvens komplementær til minst omkring 6 tilstøtende nukleotider til GBS polypeptidene i henhold til oppfinnelsen.

En annen diagnostisk metode for deteksjonen av streptokokker i en pasient omfatter:

a) å merke et antistoff som er reaktivt med et polypeptid i henhold til oppfinnelsen eller fragment derav med et detekterbart merke; b) å administrere det merkede antistoffet eller merkede fragmentet til pasienten; og c) å detektere spesifikt bundet merket antistoff eller merket fragment i pasienten, som indikerer nærværet av streptokokker.

Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen er anvendelsen av GBS polypeptidene i henhold til oppfinnelsen som immunogener for produksjonen av spesifikke antistoffer for diagnostiseringen og spesielt behandlingen av streptokokkusinfeksjon. Passende antistoffer kan bli bestemt ved å benytte passende screeningsmetoder, for eksempel ved å måle evnen til et spesielt antistoff til passivt å beskytte mot streptokokkinfeksjon i en testmodell. Et eksempel på en dyremodell er musemodellen beskrevet i eksemplene heri. Antistoffet kan være et helt antistoff eller et antigenbindende fragment derav, og kan generelt tilhøre enhver immunoglobulinklasse. Antistoffet eller fragmentet kan bli av dyre opprinnelse, spesifikt av pattedyropprinnelse og mer spesifikt av muse-, rotte- eller human opprinnelse. Det kan være et naturlig antistoff eller fragment derav, eller dersom ønsket, et rekombinant antistoff eller antistoff fragment. Begrepet rekombinant antistoff eller antistoff fragment betyr antistoff eller antistoff fragment som er produsert ved å benytte molekylærbiologiske teknikker. Antistoffet eller antistoff fragmentene kan være polyklonale, eller fortrinnsvis monoklonale. Det kan være spesifikt for et antall epitoper assosiert med GBS polypeptidene, men er fortrinnsvis spesifikt for ett.

Således vedrører foreliggende oppfinnelse et rekombinant polynukleotid som er kjennetegnet ved at det koder for: (a) et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som er minst 95 % identisk med aminosyresekvensen som er valgt fra SEKV. ID NR.:39 og SEKV. ID NR.:44, der polypeptidet det er kodet for opprettholder kapasiteten til å indusere en immunrespons som er spesifikk for gruppe B streptococcus, eller (b) et polypeptid som omfatter et antigent fragment av aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.:39 og SEKV. ID NR.:44, der det antigene fragmentet opprettholder kapasiteten til å indusere en immunrespons som er spesifikk for gruppe B Streptococcus.

I en utførelse gjelder oppfinnelsen et rekombinant polynukleotid som omfatter en nukleotidsekvens som er minst 95 % identisk med nukleotidsekvensen ifølge enhver av SEKV. ID NR.:37, SEKV. ID NR.:42 og SEKV. ID NR.:43.

Foreliggende oppfinnelse gjelder også en vektor som omfatter det rekombinante polynukleotidet ifølge oppfinnelsen, der nevnte polynukleotid er opererbart koblet til en ekspresjonskontrollregion.

I tillegg gjelder foreliggende oppfinnelse en isolert vertscelle som er transfektert med vektoren ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen gjelder videre en fremgangsmåte for fremstilling av polypeptidet som er kodet for av det rekombinante polynukleotidet ifølge oppfinnelsen, der nevnte fremgangsmåte omfatter dyrking av vertscellen ifølge oppfinnelsen ved betingelser som er passende for uttrykking av nevnte polypeptid.

Foreliggende oppfinnelse gjelder også et isolert polypeptid som er valgt fra:

(a) et isolert polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som er minst 95 % identisk med aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.:39 eller SEKV. ID NR.:44, der polypeptidet opprettholder kapasiteten til å indusere en immunrespons som er spesifikk for gruppe B Streptococcus, (b) et isolert polypeptid som omfatter et antigent fragment av aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.:39 eller SEKV. ID NR.:44, der det antigene fragmentet opprettholder kapasiteten til å indusere en immunrespons som er spesifikk for gruppe B Streptococcus, og (c) et isolert polypeptid som omfatter to eller flere antigene fragmenter av SEKV. ID NR.:44, der polypeptidet opprettholder kapasiteten til å indusere en immunrespons som er spesifikk for gruppe B Streptococcus.

Også omfattet er en vaksinesammensetning som omfatter polypeptidet ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel.

Oppfinnelsen gjelder også anvendelse av polypeptid ifølge oppfinnelsen for fremstilling av en vaksinesammensetning til den terapeutiske eller profylaktiske behandlingen av en gruppe B Stretococcus- infeksjon hos et dyr.

Videre omfatter oppfinnelsen isolert antistoff, eller antigenbindende fragment derav, som spesifikt binder til et polypeptid som består av aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.:39 eller SEKV. ID NR.:44.

Også omfattet er en fremgangsmåte for påvisning av gruppe B Streptococcus i en biologisk prøve, der nevnte fremgangsmåte omfatter: (a) inkubering av antistoffet, eller det antigenbindende fragmentet derav, ifølge ethvert av kravene 24-27 med den biologiske prøven for å danne en blanding, og (b) påvisning av spesifikt bundet antistoff, eller antigenbindende fragment derav, i blandingen, noe som tyder på tilstedeværelsen av gruppe B Streptococcus, fremgangsmåte for påvisning av et antistoff som spesifikt binder til et polypeptid som består av aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.:39 eller SEKV. ID NR.:44, der fremgangsmåte omfatter: (a) inkubering av det isolerte polypeptidet ifølge ethvert av kravene 12-17 med en biologisk prøve som inneholder antistoffet, eller som er misstenkt å inneholde antistoffet, for å danne en blanding, og (b) påvisning av spesifikt bundet polypeptid i blandingen, noe som tyder på tilstedeværelsen av antistoffet, og fremgangsmåte for påvisning av gruppe B Streptococcus i en biologisk prøve, der nevnte fremgangsmåte omfatter: (a) inkubering av polynukleotidet ifølge ethvert av kravene 1-7 og den biologiske prøven for å danne en blanding, og (b) påvisning av spesifikt bundet polynukleotid i blandingen, noe som tyder på tilstedeværelsen av gruppe B Streptococcus.

EKSEMPEL 1 Musemodell for dødelig gruppe B streptokokk (GBS) infeksjon Musemodellen for GBS infeksjon er beskrevet i detalj i Lancefield et al (J Exp Med 142: 165-179, 1975). GBS stamme C388/90 (klinisk isolat oppnådd i 1990 fra cefalorasidinvæsken til en pasient som led av meningitt, Children's Hospital of Eastern Ontario, Ottawa, Canada) og NCS246 (National Center for Streptococcus, Provincial Laboratory of Public Health for Northern Alberta, Edmonton, Canada) ble serumtypet som henholdsvis type Ia/c og type II/R.

For å øke virulensen ble GBS stammene C388/90 (serumtype Ia/c) og NCS 246 (serumtype II/R) serielt passert gjennom mus som tidligere beskrevet (Lancefield et al, J Exp Med 142: 165-179, 1975). I korthet ble økningen av virulens monitorert ved å benytte intraperitoneal inokulasjon av seriefortynninger av en subkultur i Todd-Hewitt næringsmedium oppnådd fra enten blodet eller milten til infiserte mus. Etter den siste passasjen ble infiserte blodprøver benyttet for å inokulere Todd-Hewitt næringsmedium. Etter inkubering på 2 timer ved 37°C med 7 % CO2, ble glyserol tilsatt til kulturen til en sluttkonsentrasjon på 10 % (volum/volum). Kulturen ble deretter porsjonert og lagret ved -80°C for anvendelsen i GBS utfordringeksperimenter. Antallet cfu av GBS tilstede i disse frosne prøvene ble bestemt. Bakteriekonsentrasjonen som var nødvendig for å drepe 100 % (LD 100) av de 18 uker gamle musene ble bestemt å være 3, 5 X 10<5>og 1, 1 X 10<5>for henholdsvis GBS stamme C388/90 og NCS246, som korresponderte til en signifikant økning i virulens for begge stammene. LD 100 opptegnet før passasjene for disse to stammene var høyere enn IO<9>cfu.

I en bakterieutfordring ble en nylig tint porsjon av en virulent GBS stamme tilpasset til den passende bakterekonsentrasjonen ved å benytte Todd-Hewitt næringsmedium, og 1 ml ble injisert intraperitonealt til hver hunn CD-1 mus. Musene benyttet for de passive beskyttelseseksperimentene var 6 til 8 uker gamle, mens de som ble benyttet for de aktive beskyttelseseksperimentene var omkring 18 uker gamle på utfordringstidspunktet. Alle inokulater ble verifisert ved kolonitellinger. Dyr ble observert for et hvert tegn på infeksjon fire ganger daglig i de første 48 timene etter utfordringen, og deretter daglig i de neste 12 dagene. Ved slutten av perioden ble blodprøver oppnådd fra de overlevende og frosset ved -20° C. Milten oppnådd fra hver mus som overlevde utfordringen ble dyrket for å identifisere mulig gjenværende GBS.

EKSEMPEL 2 Immunisering og beskyttelse i mus med formaldehyd-drepte

hele GBS celler

Formaldehyd-drepte GBS hele celler ble fremstilt i henhold til prosedyrene beskrevet i Lancefield et al. (J Exp Med 142: 165-179, 1975). I korthet ble en overnatt kultur på saueblod agarplater (Quelab Laboratories, Montreal, Canada) av en GBS stamme vasket to ganger i PBS buffer (fosfatbufret saltløsning, pH 7, 2), justert til omkring 3 X IO<9>cfu/ml og inkubert over natt i PBS som inneholdt 0, 3 %

(volum/volum) formaldehyd. Den drepte GBS suspensjonen ble vasket med PBS og holdt frosset ved -80°C.

Hunn CD-1 mus, 6 til 8 uker gamle (Charles River, St-Constant, Québec, Canada) ble injisert subkutant tre ganger med to ukers intervaller med 0, 1 ml av formaldehyd-drepte celler av GBS stamme C388/90 (~6 X IO7 GBS), eller 0, 1 ml med PBS for kontrollgruppen. Dagen før immuniseringen ble Alhydrogel™

(Superfos Biosector, Fredrikssund, Danmark) i en sluttkonsentrasjon på 0, 14 mg eller 0, 21 mg av Al, tilsatt til disse prepareringene og inkubert over natt ved 4°C med røring. Serumprøver ble oppnådd fra hver mus før starten av immuniseringsprotokollen, og to uker etter den siste injeksjonen. Serum ble frosset ved -20°C.

Åtte mus i hver kontrollgruppe injisert med PBS og gruppen immunisert med formaldehyd-drepte hele celler GBS stamme C388/90 (Ia/c) ble utfordret med 1, 5 X IO<4>cfu av GBS stamme C388/90 (Ia/c) en uke etter den tredje injeksjonen. Alle musene som var immunisert med de formaldehyd-drepte GBS hele cellene overlevde den homologe utfordringen mens, innen 5 dager etter utfordringen, overlevde bare 4 av de 8 musene injisert med PBS infeksjonen. For å øke dødelighetshastigheten i kontrollgruppene, måtte bakterie suspensjonen bli justert i

henhold til alderen på musene på tidspunktet for bakterieutfordring. I påfølgende utfordringseksperimenter, når musene var eldre enn 15 uker, ble bakterieinokulatet øket til konsentrasjoner mellom 3, 0 X IO<5>og 2, 5 X IO<6>cfu.

I et annet eksperiment ble en gruppe på 12 mus som korresponderte til en kontrollgruppe injisert med PBS, mens en annen gruppe på 12 mus ble injisert med formaldehyd-drepte hele celler av GBS stamme C388/90 (Ia/c). Seks mus fra hver av disse to gruppene ble utfordret med 2, 1 X IO<6>cfu av GBS stammen C388/90 (Ia/c) (tabell 1). Som det første utfordringseksperimentet overlevde alle musene immunisert med GBS stammen C388/90 (Ia/c) den homologe utfordringen. Bare 2 av de 6 musene injisert med PBS overlevde infeksjonen.

De gjenværende 6 musene i begge gruppene ble deretter benyttet en uke senere for å verifisere hvorvidt denne antigene prepareringen kunne overføre kryssbeskyttelse mot stamme NCS246 (II/R) som gir en serologisk distinkt kapsel. Ingen av musene infisert med denne andre GBS stammen overlevde infeksjonen. Det siste resultatet tydet på at det meste av den beskyttende immune responsen indusert av formaldehyd-drepte stamme C388/90 er dirigert mot kapselpolysakkaridet, og at det kunne bli begrenset til stammer av den spesielle serumtypen. Disse resultatene indikerer tydelig at denne spesiell modellen for interaksjon kan bli effektivt benyttet for å studere beskyttelsen som overdras ved vaksinering.

EKSEMPEL 3 Immunisering av kanin med formaldehyd-drepte hele GBS

celler, og passiv beskyttelse i mus

En New Zealand kanin (2, 5 kg, Charles River, St-Constant, Québec, Canada) ble immunisert med formaldehyd-drepte celler av GBS stamme C388/90 (Ia/c) for å oppnå hyperimmunt serum. Denne kaninen ble injisert subkutant tre ganger med tre ukers intervaller med omkring 1,5 IO<9>cfu av formaldehyd-drepte hele celler av GBS stamme C388/90 (Ia/c). Freund's komplette adjuvans (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, New York) ble benyttet som adjuvans for den første immuniseringen, mens Freund's ufullstendige adjuvans (Gibco BRL) ble benyttet for de følgende to injeksjoner. Serumprøver ble oppnådd før starten på immuniseringsprotokollen og to uker etter den siste injeksjonen. Serumet ble frosset ved -20°C.

Evnen til dette spesielle kaninhyperimmuniserte serumet til passivt å beskytte mus mot en dødelig infeksjon med GBS ble også evaluert. Intraperitoneal injeksjon av mus med enten 15 eller 25 fil av hyperimmunt kaninserum 18 timer før utfordringen, beskyttet 4 av 5 mus (80 %) mot infeksjonen. Til sammenligning ble overlevelsesrater på mindre enn 20 % registrert for mus i kontrollgruppen injisert med PBS eller serum oppnådd fra en kanin immunisert med meningokokk ytre membranpreparering. Dette resultatet indikerer tydelig at immuniseringen av en annen dyreart med drepte GBS celler kan indusere produksjonen av antistoffer som passivt kan beskytte mus. Dette reagenset vil også bli benyttet for å karakterisere kloner.

EKSEMPEL 4 Rekombinant produksjon av His.Tag-GBS fusjonsprotein Den kodende regionen til et GBS gen ble oppformert ved PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Eimer, San Jose, CA) fra det genomiske DNA'et til GBS stamme C388/90 (Ia/c), ved å benytte oligoer som inneholdt baseekstensjoner for addisjonen av restriksjonssetene til henholdsvis Bglll (AGATCT) og Hindlll (AAGCTT). PCR produktet ble renset fra agarosegel ved å benytte et Qiaex II gel ekstraksjonssett fra Qiagen (Chatsworth, CA), fordøyd med restriksjonsenzymer Bglll og Hindlll (Pharmacia Canada Inc. Baie d'Urfe, Canada) og ekstrahert med fenol:kloroform før etanolutfelling. pET-32b (+) vektoren (Novagen, Madison, WI) som inneholdt tioredoksin-His.Tag sekvensen ble fordøyd med restriksjonsenzymene Bglll og Hindlll, ekstrahert med fenol:kloroform, og deretter etanolutfelt. Det Bglll-Hindlll genomisk DNA fragmentet ble ligert til Bglll-Hindlll pET-32b (+) vektoren for å danne den kodende sekvensen for tioredoksin-His.Tag-GBS fusjonsproteinet, hvis gen var under kontroll av T7 promoteren. De ligerte produktene ble transformert inn i E. coli stamme XLI Blue MRF' (A(mcrA)183A(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endAl supE44 thi-1 recAl gyrA96 relAl lac [F'proAB ladqZAM15TnlO (Tet<r>)]<c>) (Stratagene, La Jolla, CA) i henhold til metoden til Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (red.), pp.

109-135). Det rekombinante pET plasmidet ble renset ved å benytte et Qiagen sett (Qiagen, Chatsworth, CA), og nuklotidsekvensen til DNA innskuddet ble verifisert ved DNA sekvensering (Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit, ABI, Foster City, CA). Det rekombinante pET plasmidet ble transformert ved elektroporering (Gene Pulser II apparat, BIO-RAD Labs, Mississauga, Canada) inn i E. coli stamme AD494 (DE3) (Aara leu7697 AlacX74 AphoA PvuII phoR AmalF3 F' [lac<+>(lacl<q>) pro] trxB: :Kan (DE3)) (Novagen, Madison, WI). I denne stammen med E. Coli er T7 promoteren, som kontrollerer ekspresjon av fusjonsproteinet, spesifikt gjenkjent av T7 RNA polymerasen (tilstede på XDE3 profagen), hvis gen er under kontrollen av lac promoteren som er induserbar av isopropyl-|3-D-tio-galaktopyranosid (IPTG).

Transformanten AD494 (DE3)/rpET ble dyrket ved 37°C med bevegelse ved 250 rpm i LB næringsmedium (pepton 1 Og/l, gjærekstrakt 5g/l NaCl 1 Og/l) som inneholdt 100 ug med ampicillin (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Canada) pr. ml. inntil A60onådde en verdi på 0, 6. For å indusere produksjonen av tioredoksin-His.Tag-GBS fusjonsproteinet ble cellene inkubert i ytterligere 2 timer i nærværet av IPTG ved en sluttkonsentrasjon på 1 mM. Bakteriecellene ble høstet ved sentrifugering.

Det rekombinante fusjonsproteinet produsert av AD494 (DE3)/rpET32 ved IPTG induksjon i 2 timer, ble delvis oppnådd som uløselige inklusjonslegemer som ble renset fra endogene E. coli proteiner ved isoleringen av uløselige aggregater (Gerlach, G.F. et al 1992, Infect. Immun. 60:892). Induserte celler fra en 500 ml kultur ble resuspendert i 20 ml med 25 % sukkrose-50 mM Tris-HCl buffer (pH 8, 0) og frosset ved -70°C. Lysering av celler i tint suspensjon ble oppnådd ved tilsetningen av 5 ml av en løsning av lysozym (10mg/ml) i 250 mM Tris-HCl buffer (pH 8, 0), etterfulgt av en inkubering på 10 til 15 minutter på is, og tilsetningen av 150 ml med detergentblanding (5 deler med 20 ml Tris-HCl buffer [pH 7, 4] -300 mM NaCl-2 % deoksykolinsyre-2 % Nonidet P-40 og 4 deler med 100 mM Tris-HCl buffer [pH 8] -50 mM EDTA-2 % Triton X-100), etterfulgt av 5 minutters inkubering på is. Ved sonikering ble proteinaggregater høstet ved sentrifugering i 30 min. ved 35 000 X g, og en prøve av den løselige cellulære fraksjonen ble beholdt. De aggregerte proteinene ble løst opp i 6M guanidin hydroklorid. Nærværet av fusjonsproteinet i både de løselige og uløselige fraksjonene ble vist ved Western Blot analyse ved å benytte serumet fra en mus injisert med formaldehyd-drepte celler av GBS stamme C388/90 (Ia/c) som overlevde en bakterieutfordring med den korresponderende GBS stammen.

Rensingen av fusjonsproteinet fra den løselige fraksjonen med IPTG-indusert AD494 (DE3)/rpET ble gjort ved affinitetskromatografi basert på egenskapene til His.Tag sekvensen (6 påfølgende histidinrester) til å binde til divalente kationer

(Ni<2+>) immobiliert på His.Bind metall gelationharpiks (Novagen, Madison, WI). Rensingsmetoden benyttet er de beskrevet i pET systemmanualen, 6. utgave (Novagen, Madison, WI). I korthet ble cellene som var i en pellet oppnådd fra en 100 ml kultur som var indusert med IPTG, resuspendert i 4 ml med bindingsbuffer (5 mM imidazol-500 mM NaCl-20 mM Tris-HCl pH 7, 9), sonikert og spunnet ved 39 000 X g i 20 minutter for å fjerne rester. Supernatanten ble filtrert (0, 45 nm porestørrelsemembran) og avsatt på en kolonne med His.Bind harpiks ekvilibrert i bindingsbuffer. Kolonnen ble deretter vasket med 10 kolonnevolumer av bindingsbuffer etterfulgt av 6 kolonnevolumer med vaskebuffer (20 mM imidazol-500 mM NaCl-20 mM Tris-HCl pH 7, 9). Tioredoksin-His.Tag-GBS fusjonsproteinet ble eluert med elveringsbuffer (IM imidazol-500 mM NaCl-20 mM Tris-HCl pH 7, 9). Fjerningen av saltet og imidazol fra prøven ble gjort ved dialyse mot 3 X 1 liter PBS ved 4°C.

Mengdene av fusjonsprotein oppnådd fra enten de løselige eller uløselige cytoplasmiske fraksjonene av E. coli ble estimert ved Coomassi farging av en natrium dodesylsulfat (SDS)-polyakrylamidgel med seriefortynninger av disse proteinene, og en bovin serumalbumin standard (Pierce Chemical Co. Rockford, 111.).

EKSEMPEL 5 Rekombinant produksjon av GBS protein under kontroll av

lambda Pl promoter

Den DNA kodende regionen til et GBS protein ble innskutt nedstrøms for promoteren ÅPl inn i translasjonsvektoren pURV22. Dette plasmidet var avledet fra p629 (George et al, 1987, Bio/Technology 5 : 600) hvorfra den kodende regionen for en del av herpes simpleks virus type I (HSV-1) glykoproteinet (gD-1) ble fjernet, og det ampicillinresistente genet erstattet av en kanamycin kassett oppnådd fra plasmidvektoren pUC4K (Pharmacia Biotech Canada Inc., Baie D'Urfe, Canada). Vektoren inneholdt en kassett med det bakteriofag X cI857 temperatursensitive repressorgenet som den funksjonelle Pr promoteren hadde blitt fjernet fra. Inaktiveringen av cI857 repressoren ved temperaturøkning fra områdene mellom 30-37°C til 37-42°C resulterte i induksjonen av genet under kontrollen av X Pl. Translasjonen av genet ble kontrollert av ribosombindingssetet cro etterfulgt nedstrøms av et Bglll restriksjonssete (AGATCT) og ATG:

ACTAAGGAGGTTAGATCTATG.

Restriksjonsenzymer og T4 DNA ligase ble benyttet i henhold til produsentene (Pharmacia Biotech Canada Inc., Baie D'Urfe, Canada; og New England Biolabs Ltd., Mississauga, Canada). Agarosegelelektroforese av DNA fragmenter ble utført som beskrevet av Sambrook et al. (Molecular cloning: A laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.). Kromosomalt DNA til GBS bakterien ble fremstilt i henhold til prosedyrer beskrevet i Jayarao et al (J. Clin. Microbiol., 1991, 29:2774). DNA oppformeringsreaksjoner ved polymerase kjedereaksjon (PCR) ble gjort ved å benytte DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400

(Perkin Eimer, San Jose, CA). Plasmider benyttet for DNA sekvensering blir renset ved å benytte plasmidsett fra Qiagen (Chatsworth, CA). DNA fragmenter ble renset fra agarosegeler ved å benytte Qiaex II gelekstraksjonssett fra Qiagen (Chatsworth, CA). Plasmidtransformasjoner ble utført ved metoden beskrevet av Hanahan (DNA Cloning, Glover (red.) pp, 109-135, 1985). Sekvenseringen av genomiske DNA inskudd i plasmider ble gjort ved å benytte syntetiske oligonukleotider som var syntetisert ved oligonukleotidsyntesemodell 394 (Perkin-Elmer Corp., Applied Biosystems Div. (ABI), Foster City, CA). Sekvenseringsreaksjonene ble utført ved PCR ved å benytte Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing settet (ABI, Foster City, CA), og DNA elektroforese ble utført på automatisert DNA sekvenserer 373A (ABI, Foster City, CA). Samlingen av DNA sekvensene ble gjort ved å benytte programmet Sequencer 3, 0 (Gene Godes Corporation, Ann Arbor, MI). Analyse av DNA sekvensene og deres foreslåtte polypeptider ble utført med programmet Gene Works versjon 2, 45 (Intelligenetics, Inc., Mountain View CA).

Den kodende regionen til GBS genet ble oppformert ved PCR fra GBS stamme C388/90 (Ia/c) genomisk DNA ved å benytte oligenukleotider som inneholdt baseekstensjoner for tilsetningen av restriksjonsseter, henholdsvis Bglll (AGATCT) og Xbal (TCTAGA). PCR produktet ble renset fra agarosegel ved å benytte et Qiaex II gelekstraksjonssett fra Qiagen (Chatsworth, CA), fordøyd med restriksjonsenzymene Bglll og Xbal og ekstrahert med fenol:kloroform før etanolpresipitering. pURV22 vektoren ble fordøyd med restriksjonsenzymene Bglll og Xbal, ekstrahert med fenol:kloroform, og etanolpresipitert. Det Bglll-Xbal genomiske DNA fragmentet ble ligert til Bglll-Xbal pURV22 vektoren, der GBS genet var under kontrollen av XPL promoteren. De ligerte produktene ble transformert inn i E. coli stamme XLI Blue MRF' (A (mcrA)183A(mcrCB-hdsSMR-mrr)173 endAl supE44 thi-1 recAl gyrA96 relAl lac[F'proAB lacl<q>ZAM15 TnlO(Tet<r>)]<c>) (Stratagene, La Jolla CA) i henhold til metodene beskrevet i Hanahan, supra. Transformanter som inneholdt plasmider med innskuddet ble identifisert ved analyse av lyserte celler som ble utsatt for elektroforese på agarosegel (Sambrook et al, supra). Det rekombinante pURV22 plasmidet ble renset ved å benytte et Qiagen sett (Qiagen, Chatsworth, CA), og nukletidsekvensen til DNA innskuddet ble verifisert ved DNA sekvensering.

Transformanten XLI Blå MRF7rpURV22 ble dyrket ved 34°C med bevegelse ved 250 rpm i LB næringsmedium som inneholdt 50 ug med kanamycin pr. ml., inntil A6oonådde en verdi på 0, 6. For å indusere produksjonen av fusjonsproteinet ble cellene inkubert i ytterligere 4 timer ved 39°C. Bakteriecellene ble høstet ved sentrifugering, resuspendert i prøvebuffer, kokt i 10 minutter og oppbevart ved -20°C.

EKSEMPEL 6 Å subklone GBS proteingenen i CMV plasmid pCMV-GH

Den DNA kodende regionen til et GBS protein ble innskutt i fase nedstrøms for det humane veksthormon (hGH) genet som var under den transkripsjonen kontrollen av cytomegalovirus (CMV) promoteren i plasmidvektoren pCMV-GH (Tang et al, Nature, 1992, 356:152). CMV promoteren er ikke-funksjonell i E. coli celler, men aktiv ved adminstrering av plasmidet i eukaryote celler. Vektoren inkorporerte også det ampicillinresistente genet.

Den kodende regionen til genet ble oppformert ved PCR fra genomisk DNA til GBS stamme C388/90 (Ia/c) ved å benytte oligoene som inneholdt baseekstensjoner for addisjonen av restriksjonssetene Bglll (AGATCT) og Hindlll (AAGCTT). PCR produktet ble renset fra agarosegel ved å benytte et Qiaex II gelekstraksjonssett fra Qiagen (Chatsworth, CA), fordøyd med restriksjonsenzymene Bglll og Hind III, og ekstrahert med fenol:kloroform før etanolpresipitering. pCMV-GH vektoren (laboratoriet til Dr. Stephen A. Johnston, Avdeling for Biokjemi, Universitetet i Texas, Dallas, Texas) som inneholdt det humane veksthormonet for å danne fusjonsproteiner, ble fordøyd med restriksjonsenzymene BamHI og Hindlll, ekstrahert med fenol:kloroform, og etanolpresipitert. Det 1, 3-kb Bglll-Hindlll genomiske DNA fragmentet ble ligert til BamHI-Hindlll pCMV-GH vektoren for å danne hGH-GBS fusjonsproteinet under kontrollen av CMV promoteren. De ligerte produktene ble transformert inn i E. coli stamme DH5a[C>80 lacZ AMI5 endAl recAl hsdR17 (<r>K'<m>K<+>) supE44 thi-U gyrA96 relAl A(lacZYA-argF)U169] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) i henhold til metodene beskrevet av Hanahan, supra. Transformanter som inneholdt plasmider med innskuddet ble identifisert ved analyse av lyserte celler utsatt for elektroforese på agarosegel (Sambrook, J. et al. supra). Det rekombinante pCMV plasmidet ble renset ved å benytte et Qiagen sett (Qiagen, Chatsworth, CA), og nukleotidsekvensen til DNA innskuddet ble verifisert ved DNA sekvensering.

EKSEMPEL 7 Immunologisk aktivitet til GBS protein for GBS utfordring

Fire grupper med 12 hunn CD-1 mus (Charles River, St-Constant, Québec, Canada) på 6 til 8 uker ble injisert subkutant tre ganger med tre ukers intervaller med 0, 1 ml av de følgende antigene prepareringene: formaldehyd-drepte celler av GBS stamme C388/90 (~6 X IO<7>cfu), 20 ug med tioredoksin-His.Tag-GBS fusjonsprotein oppnådd fra det uløselige (inklusjonslegemer), eller 20 ug av fusjonsproteinet, affinitetsrenset (nikkelkolonne), fra den løselige cytoplasmiske fraksjonen i E. coli, eller 20 fig med affinitetsrenset (nikkelkolonne) tioredoksin-His.Tag kontrollpolypeptid. 20 fig med QuilA™ (Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Canada) ble tilsatt til hver antigene preparering som adjuvanser. Serumprøver ble oppnådd fra hver mus før immunisering (PB) og på dagene 20 (TB1), 41 (TB2) og 54 (TB3) under immuniseringsprotokollene. Serum ble frosset ved -20°C.

En økning av ELISA titer ble registrert etter hver injeksjon av fusjonsproteinet, og indikerer en god primærrespons og en økning (boost) av den spesifikke humorale immunresponsen etter hver av den andre og tredje administreringen. Ved slutten av immuniseringsperioden var målene for resiproke ELISA titer 456145 for gruppen immunisert med 20 ug med fusjonsprotein oppnådd fra inklusjonslegemer, sammenlignet med 290133 for gruppen med mus immunisert med proteinet fra løselig fraksjon i E. coli. Det siste resultatet tyder på at proteinet oppnådd fra inklusjonslegemer kan være mer immunogent enn det løselige proteinet. Analyse av museserum i ELISA ved å benytte affinitetsrenset tioredoksin-His.Tag for å belegge plater, viste at ubetydelige antistoff-titer dannes mot tioredoksin-His.Tag delen av fusjonsproteinet. Reaktiviteten til serumet fra mus injisert med det rekombinante fusjonsproteinet ble også testet med ELISA mot formaldehyd-drepte hele celler av GBS stamme C388/90. Antistoffene indusert ved immunisering med rekombinant fusjonsprotein gjenkjente også deres spesifikke epitoper på GBS celler, og indikerer at deres konformasjon er nær nok til det native streptokokkproteinet for å indusere kryssreaktive antistoffer.

For å verifisere hvorvidt immunresponsen indusert ved immunisering kunne beskytte mot GBS infeksjon, ble mus utfordret med 3, 5 X IO<5>cfu av GBS stamme C388/90 (Ia/c), og 1, 2 X IO<5>cfu av stamme NSC246 (II/R), resultatene som er illustrert i henholdsvis tabell 3 og 4. Mus immunisert med kontroll tioredoksin-His.Tag peptid ble ikke beskyttet mot utfordring med noen GBS stamme, mens de immunisert med formaldehyd-drepte C388/90 hele celler bare tilveiebragte beskyttelse mot homolog utfordring. Tioredoksin-His.Tag-GBS fusjonsproteinet i henhold til oppfinnelsen beskyttet mus fra utfordring med begge GBS stammene. Blod og miltkultur fra disse musene viste ikke nærværet av noe GBS.

EKSEMPEL 8 Immunisering med rekombinant GBS protein overdrar

beskyttelse mot eksperimentell GBS infeksjon

Dette eksempelet illustrerer beskyttelsen av mus mot dødelig GBS infeksjon ved immunisering med det rekombinante proteinet som korresponderer til SEKV. ID NR.: 39.

Grupper på 10 hunn CD-1 mus (Charles River) ble immunisert subkutant tre ganger med tre ukers intervaller med 20 ug av rekombinant protein renset fra E. coli stamme BLR (Novagen), som hadde i seg den rekombinante pURV22 plasmidvektoren som inneholdt GBS genet som korresponderer til SEKV. ID NR.: 42, i nærvær av 20 ug av QuilA™ adjuvans (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canada) eller, som kontroll, med QuilA™ adjuvans alene, i PBS. Blodprøver ble samlet fra den orbitale sinus på dag 1, 22 og 43 før hver immunisering, og 14 dager (dag 57) etter den tredje injeksjonen. En uke senere ble musene utfordret med omkring IO<4>til IO6 cfu av ulike virulente GBS stammer. Prøver av GBS utfordringsinokulatet ble platet på TSA/5 % saueblod agarplater for å bestemme cfu, og for å verifisere utfordringsdosen. Dødsfall ble registrert i en periode på 14 dager, og på dag 14 etter utfordringen, de overlevende musene ble ofret og blod og milt ble testet for nærværet av GBS organismer. Overlevelsesdataene er vist i tabell 5.

Preutfordringsserum ble analysert for nærværet av antistoffer reaktive med GBS ved standard immunoassay. ELISA og immunoblotanalyser indikerte at immunisering med rekombinant GBS protein produsert i E. coli utløste antistoffer reaktive med både rekombinant og nativt GBS protein. Antistoffrespons mot GBS er beskrevet i eksempel 9.

Alle hemokulturer fra overlevende mus var negative ved dag 14 etter utfordring. Miltkulturer fra overlevende mus var negative, bortsett fra noen få mus fra eksperiment MB-11

EKSEMPEL 9 Vaksinering med det rekombinante GBS proteinet utløser en

immunrespons mot GBS

Grupper på 10 hunn CD-1 mus ble immunisert subkutant med rekombinant GBS protein som korresponderer til SEKV. ID NR.: 39, som beskrevet i eksempel 8. For å vurdere antistoffresponsen til nativt GBS protein ble serum fra blodprøver, som var samlet før immunisering og 14 dager etter den tredje immuniseringen, testet for antistoff reaktivitet med GBS celler ved ELISA, ved å benytte plater belagt med formaldehyd-drepte GBS celler fra type III stamme NCS 954, type Ib stamme ATCC12401, type V stamme NCS 535 eller type VI stamme NCS 9842. Spesifisiteten til de produserte antistoffene for GBS protein ble bekreftet ved Western blot analyser av GBS celleektstrakter og rensede rekombinante antigener. Resultatene vist i figur 10 demonstrerer tydelig at dyr responderte kraftig mot rekombinant GBS protein benyttet som immunogener, med midlere resiproke antistofftiter varierende mellom 12000 og 128000 for serum samlet etter den tredje immuniseringen, avhengig av beleggingsantigenet. Alle preimmune serum var negative når de ble testet ved en fortynning på 1:100. GBS-reaktive antistoffer var detekterbare i serumet til hvert dyr etter en enkelt injeksjon med rekombinant GBS protein.

EKSEMPEL 10 Antigenkonservering av GBS proteinet i henhold til

foreliggende oppfinnelse

Monoklonale antistoffer (MAb'er) spesifikke for GBS proteinet i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, ble benyttet for å demonstrere at dette overflateantigenet blir produsert av alle GBS, og at det også er antigenisk godt konservert.

En samling av 68 GBS isolater ble benyttet for å evaluere aktiviteten til de GBS-spesifikke MAb'ene. Disse stammene ble oppnådd fra National Center for Streptokoccus, Provincial Laboratory of Public Health i Nord Alberta, Canada; Centre Hospitalier Universitaire de Quebec, Pavillon CHUL, Quebec, Canada; American Type Culture Collection, USA; Laboratorie de Sante Publique du Quebec, Canada; og Avdeling for infeksjonssykdommer, Children's Hospital and Medical Center, Seattle, USA. Alle 8 MAb'er ble testet mot det følgende panel av stammer: 6 isolater av serumtype Ia eller Ia/c, 3 isolater av serumtype Ib, 4 isolater av serumtype II, 14 isolater av serumtype III, 2 isolater av serumtype IV, 2 isolater av serumtype V, 2 isolater av serumtype VI, 2 isolater av serumtype VII, 1 isolat av serumtype VIII, 10 isolater som ikke var serumtypet, og 3 bovine S. agalactiae stammer. MAb 3A2 ble også reagert med ytterligere GBS: 9 isolater av serumtype Ia/c og 10 isolater av serumtype V. Stammene ble dyrket overnatt på blod agarplater ved 37°C i en atmosfære på 5 % CO2. Kulturene ble lagret ved -70°C i hjerteinfusjonsnæringsmedium med 20 % (volum/volum) glyserol.

For å oppnå de GBS proteinspesifikke MAb'ene, ble mus immunisert tre ganger med tre ukers intervaller med 20 ug av renset rekombinant GBS protein ( SEKV. ID NR.: 44) i nærværet av 20 % QuilA™ adjuvans. Hybridomcellelinjer ble generert ved fusjon av miltceller gjenvunnet fra immuniserte mus med den ikke-utskillende SP2/0 myelomcellelinjen som beskrevet tidligere (Hamel, J. et al. 1987. J. Med. Microbiol. 23:163-170). Hybridklon supernatanter ble testet for spesifikk antistoffproduksjon ved ELISA, ved å benytte formaldehyd-inaktivert GBS og renset rekombinant GBS protein (SEKV. ID NR.: 39 eller 44) som beleggende antigen, som tidligere beskrevet (Hamel, J. et al. 1987. J. Med. Microbiol. 23:163-170). Spesifikke hybrider ble klonet ved begrensende fortynninger, ekspandert og frosset i flytende nitrogen. Produksjon av rekombinant GBS protein ble presentert i eksemplene 4 og 5. Renset rekombinant GBS protein eller formaldehyd-inaktivert GBS ble løst opp ved elektroforese ved å benytte det diskontinuerlige buffersystemet til Laemmli som rekommandert av produsenten, og deretter overført til nitrocellulosemembran for Western immunblotting som beskrevet tidligere (Martin et al. 1992. Infect. Immun. 60:2718-2725).

Western immunblottingseksperimenter indikerte tydelig at alle 8 MAb'ene gjenkjente et proteinbånd som korresponderte til det rensede rekombinante GBS proteinet (SEKV. ID NR.: 39). Disse MAb'ene reagerte også med et proteinbånd tilstede i et hvert GBS isolat testet til nå. Reaktiviteten til disse GBS-spesifikke MAb'ene er presentert i tabell 6. Hver MAb reagerte godt med alle 46 GBS. I tillegg gjenkjente disse MAb'ene også den 3 S. agalactiae stammen av bovin opprinnelse som var testet. MAb 3A2 gjenkjente også 19 GBS; 9 isolater av serumtype Ia/c og 10 av serumtype V. De andre MAb'ene ble ikke testet mot disse ytterligere stammene.

Disse resultatene demonstrerte at GBS proteinet (SEKV. ID NR.: 39) ble produsert av alle de 65 GBS, og de 3 S. agalactiae stammene av bovin opprinnelse som er testet til nå. Mer viktig demonstrerer disse resultatene tydelig at epitopene som gjenkjennes av disse 8 GBS-spesifikke MAb'ene var distribuert i utstrakt grad, og konservert blant GBS. Disse resultatene indikerer også at disse epitopene ikke var begrenset til serologisk relaterte isolater, siden representativer for alle kjente GBS serumtyper, inkludert den viktigste sykdomsfremkallende gruppen, ble testet.

I konklusjon demonstrerer dataene presentert i dette eksempelet tydelig at GBS proteinet i henhold til den foreliggende oppfinnelsen blir dannet av alle GBS, og at det antigenmessig sett er godt konservert.

Claims (30)

1. Rekombinant polynukleotid,karakterisert vedat det koder for (a) et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som er minst 95 % identisk med aminosyresekvensen som er valgt fra SEKV. ID NR.:39 og SEKV. ID NR.:44, der polypeptidet det er kodet for opprettholder kapasiteten til å indusere en immunrespons som er spesifikk for gruppe B streptococcus, eller (b) et polypeptid som omfatter et antigent fragment av aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.:39 og SEKV. ID NR.:44, der det antigene fragmentet opprettholder kapasiteten til å indusere en immunrespons som er spesifikk for gruppe B Streptococcus.

2. Rekombinant polynukleotid ifølge krav 1,karakterisert vedat polypeptidet det er kodet for omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.:39 eller SEKV. ID NR.:44.

3. Rekombinant polynukleotid ifølge krav 1,karakterisert vedat polypeptidet det er kodet for er i stand til å generere antistoffer som har bindingsspesifisitet for et polypeptid som består av aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.:39 eller SEKV. ID NR.:44.

4. Rekombinant polynukleotid ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter en nukleotidsekvens som er minst 95 % identisk med nukleotidsekvensen ifølge enhver av SEKV. ID NR.:37, SEKV. ID NR.:42 og SEKV. ID NR.:43.

5. Rekombinant polynukleotid som ifølge krav 4,karakterisert vedat det omfatter nukleotidsekvensen ifølge enhver av SEKV. ID NR.:37, SEKV. ID NR.:42 og SEKV. ID NR.:43.

6. Rekombinant polynukleotid,karakterisert vedat det er komplementært med polynukleotidet ifølge ethvert av kravene 1-5.

7. Rekombinant polynukleotid ifølge ethvert av kravene 1-5,karakterisert vedat nevnte polynukleotid er DNA.

8. Rekombinant polynukleotid ifølge ethvert av kravene 1-5,karakterisert vedat nevnte polynukleotid er RNA.

9. Vektor, karakterisert vedat den omfatter det rekombinante polynukleotidet ifølge ethvert av kravene 1-5, der nevnte polynukleotid er opererbart koblet til en ekspresjonskontrollregion.

10. Isolert vertscelle, karakterisert vedat den er transfektert med vektoren ifølge krav 9.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptidet som er kodet for av det rekombinante polynukleotidet ifølge ethvert av kravene 1-5,karakterisert vedat nevnte fremgangsmåte omfatter dyrking av vertscellen ifølge krav 10 ved betingelser som er passende for uttrykking av nevnte polypeptid.

12. Isolert polypeptid, karakterisert vedat det er valgt fra (a) et isolert polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som er minst 95 % identisk med aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.:39 eller SEKV. ID NR.:44, der polypeptidet opprettholder kapasiteten til å indusere en immunrespons som er spesifikk for gruppe B Streptococcus, (b) et isolert polypeptid som omfatter et antigent fragment av aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.:39 eller SEKV. ID NR.:44, der det antigene fragmentet opprettholder kapasiteten til å indusere en immunrespons som er spesifikk for gruppe B Streptococcus, og (c) et isolert polypeptid som omfatter to eller flere antigene fragmenter av SEKV. ID NR.:44, der polypeptidet opprettholder kapasiteten til å indusere en immunrespons som er spesifikk for gruppe B Streptococcus.

13. Isolert polypeptid ifølge krav 12, karakterisert vedat det omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.:39.

14. Isolert polypeptid ifølge krav 12, karakterisert vedat det omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.: 44.

15. Isolert polypeptid ifølge krav 12, karakterisert vedat det isolerte polypeptidet er i stand til å generere antistoffer som har bindingsspesifisitet for et polypeptid som består av aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.:39 eller SEKV. ID NR.:44.

16. Isolert polypeptid ifølge krav 13, karakterisert vedat den N-terminale Met-residien er fjernet.

17. Isolert polypeptid ifølge krav 13, karakterisert vedat den sekretoriske aminosyresekvensen er fjernet.

18. Vaksinesammensetning, karakterisert vedat den omfatter polypeptidet ifølge ethvert av kravene 12-17 og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel.

19. Vaksinesammensetning ifølge krav 18, karakterisert vedat den ytterligere omfatter en farmasøytisk akseptabel adjuvans.

20. Anvendelse av polypeptid ifølge ethvert av kravene 12-17 for fremstilling av en vaksinesammensetning til den terapeutiske eller profylaktiske behandlingen av en gruppe B Stretococcus- infeksjon hos et dyr.

21. Anvendelse ifølge krav 20, der dyret er et menneske.

22. Anvendelse ifølge krav 20 der dyret er et oksedyr.

23. Anvendelse av en vaksinesammensetning ifølge krav 18 eller 19, for fremstilling av et preparat som induserer en immunrespons mot gruppe B Streptococcus.

24. Isolert antistoff, eller antigenbindende fragment derav,karakterisert vedat det spesifikt binder til et polypeptid som består av aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.:39 eller SEKV. ID NR.:44.

25. Isolert antistoff, eller antigenbindende fragment derav, ifølge krav 24,karakterisert vedat antistoffet er et polyklonalt antistoff.

26. Isolert antistoff, eller antigenbindende fragment derav, ifølge krav 24,karakterisert vedat antistoffet er et monoklonalt antistoff.

27. Isolert antistoff, eller antigenbindende fragment derav, ifølge krav 24,karakterisert vedat antistoffet, eller det antigenbindende fragmentet derav, er rekombinant.

28. Fremgangsmåte for påvisning av gruppe B Streptococcus i en biologisk prøve, karakterisert vedat nevnte fremgangsmåte omfatter: (a) inkubering av antistoffet, eller det antigenbindende fragmentet derav, ifølge ethvert av kravene 24-27 med den biologiske prøven for å danne en blanding, og (b) påvisning av spesifikt bundet antistoff, eller antigenbindende fragment derav, i blandingen, noe som tyder på tilstedeværelsen av gruppe B Streptococcus.

29. Fremgangsmåte for påvisning av et antistoff som spesifikt binder til et polypeptid som består av aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.:39 eller SEKV. ID NR.:44,karakterisert vedat nevnte fremgangsmåte omfatter: (a) inkubering av det isolerte polypeptidet ifølge ethvert av kravene 12-17 med en biologisk prøve som inneholder antistoffet, eller som er misstenkt å inneholde antistoffet, for å danne en blanding, og (b) påvisning av spesifikt bundet polypeptid i blandingen, noe som tyder på tilstedeværelsen av antistoffet.

30. Fremgangsmåte for påvisning av gruppe B Streptococcus i en biologisk prøve, karakterisert vedat nevnte fremgangsmåte omfatter: (a) inkubering av polynukleotidet ifølge ethvert av kravene 1-7 og den biologiske prøven for å danne en blanding, og (b) påvisning av spesifikt bundet polynukleotid i blandingen, noe som tyder på tilstedeværelsen av gruppe B Streptococcus.