CN105343872A - 抗绵羊包虫病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗绵羊包虫病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗，是从细粒棘球蚴中国株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg.myophilin基因，再通过克隆、诱导表达、纯化获得的疫苗，其保藏号为：CCTCC？M2015426。本发明还涉及rEg.myophilin基因分子应用于制备抗绵羊包虫病感染的疫苗。本发明在细粒棘球蚴重组疫苗myophilin在绵羊身上进行免疫保护验证，免疫保护力达到了92％。该疫苗有望在肝包虫防治中发挥巨大的作用。

Description

抗绵羊包虫病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及抗绵羊包虫病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗、其制备方法及应用技术
背景技术
细粒棘球蚴虫病，俗称包虫病，目前尚没有商品化的疫苗。当前已有十余种候选分子，如Eg95、rEg14-3-3重组疫苗、铁蛋白重组疫苗、GST重组疫苗等，其中最早证实EG95是一种绵羊保护性细粒棘球蚴疫苗，其对绵羊的保护力为96-98％，其中国内康强等也在绵羊身上对EG95进行保护力验证，得到了90％的保护力。遗憾的是Eg95首先由国外研发成功的，即使开发成为真正的商品，其知识产权也不属于我们。而目前绝大部分包虫病候选疫苗分子都是通过小鼠继发感染实验完成，缺乏直接的应用价值，因为包虫感染主要通过其虫卵经消化道感染而不是继发感染；再者，小鼠亦不是细粒棘球蚴病(包虫病)主要的天然适宜宿主。
由于细粒棘球蚴主要寄生于人的肝脏，故该病又称为肝包虫病。它呈世界性分布，是全球性的公共卫生问题。据近年普查，我国有25个省、市和自治区有该病的病例报道，其中以新疆、宁夏、甘肃、青海、西藏、四川、内蒙古7个省(区)流行最为严重，高发区约占全国面积的44％，受威胁人口约5千万。该病已被列为我国重点防治的寄生虫病之一。
包虫病严重危害人类的健康和农牧业经济的发展。包虫病对人危害主要表现为在肝脏、肺、脑或肾等器官形成占位性包囊病变，以机械压迫与营养消耗等形式造成这些重要器官的严重损害，甚至导致个体死亡；而对于家畜而言，包虫病将会造成家畜的减产、品质下降等重大经济问题，并且作为寄生虫感染生活史的重要一个环节对人民生命财产安全带来巨大隐患。
目前，人包虫病的首选治疗方法是外科手术，但由于该病发病早期可无自觉症状，等到入院就诊时，相应的脏器已经受到严重的损伤并且手术本身对机体也有损伤，从而使患者在健康和经济上都蒙受了极大的损害。对于较早期小棘球蚴或有手术禁忌的病例可采用阿苯哒唑或甲苯咪唑等药物进行化疗，临床发现这些药物存在严重的毒副作用，部分患者不能耐受，同时某些化疗患者可产生耐药性。因此，无论是手术治疗，还是药物治疗，对于包虫病治疗都有很大的不足。对于家畜而言，目前很少有相应的诊疗措施。
要想从源头上防控包虫病，疫苗的研发将是必然选择。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展及在医学科学中的广泛应用，利用基因工程技术对病原体进行分子疫苗的预防研究引起了人们的广泛关注。从目前的研究情况来看，国内外对细胞粒棘球蚴虫研究较为成功的重组疫苗有Eg95，它已在人工感染的牛和羊群获得了较好的免疫保护水平，免疫保护力达到96-98％。
羊作为细粒棘球绦虫最主要的天然中间宿主，是细粒棘球蚴绦虫感染生活史的重要环节，制备出羊的包虫病疫苗，预防家畜羊的感染，阻断寄生虫生活史进而减少传染给人的几率，具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前没有羊包虫病疫苗的现状，提供一种基因分子rEg.myophilin在制备抗绵羊包虫病感染疫苗上的应用，同时提供这种疫苗及其制备方法。
本发明技术方案如下：
抗绵羊包虫病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗，是从细粒棘球蚴中国株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg.myophilin基因，再通过克隆、诱导表达、纯化获得的疫苗，其保藏号为：CCTCCM2015426。
一种抗绵羊包虫病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗的制备方法，首先从细粒棘球蚴中国株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg.myophilin基因，该基因收录在GenBank数据库，序列号：DQ679473，Eg.myophilin亚克隆于表达载体pET-28a，再转化到大肠杆菌BL21(DE3)plysS中诱导表达，再用含Ni2+的His-bind树脂纯化试剂盒纯化蛋白；
rEg.myophilin基因分子应用于制备抗绵羊包虫病感染的疫苗。
本发明在细粒棘球蚴重组疫苗myophilin在小鼠身上进行免疫保护验证，免疫保护力达到了92％。该疫苗有望在肝包虫防治中发挥巨大的作用。
附图说明
图1显示采用ELISA法分别检测了血清中rEg.myophilin抗原特异性IgG、IgG1、IgG2与IgE抗体水平。
图2显示ELISA细胞因子试剂盒检测结果，疫苗组IFN-γ与IL-2显著升高，表明Th1型介导的细胞免疫应答显著激活；而与Th2型细胞因子IL-4亦显著升高，表明体液免疫应答亦明显上调，与抗体升高结果一致。
具体实施方式
疫苗制备：
一种抗绵羊包虫病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗的制备方法，首先从细粒棘球蚴中国株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg.myophilin基因，该基因收录在GenBank数据库，序列号：DQ679473，Eg.myophilin亚克隆于表达载体pET-28a，再转化到大肠杆菌BL21(DE3)plysS中诱导表达，再用Novagen公司的含Ni2+的His-bind树脂纯化试剂盒纯化蛋白；
为了证实重组抗原疫苗rEg.myophilin的抗包虫病感染的免疫保护力，本发明以绵羊天然感染包虫虫卵为基础，通过初次免疫-加强免疫(prime-boost)进行预防接种rEg.myophilin，采用分子生物学、细胞生物学、免疫学等手段，评价该疫苗抗包虫感染的保护力及其免疫保护机制。
1、实验动物与细粒棘球虫卵的准备
4-6月龄雄性绵羊，利用原头蚴粗抗原包被检测绵羊血清(ELISA)阴性的入组，随机分为3组：疫苗rEg.myophilin接种组、FCA(完全褔氏佐剂)组、PBS组，每组10只。细粒棘球绦虫虫卵由兰州兽医所提供，具体制备过程如下：从新疆购买6月龄土犬3只，于兰州兽医所试验站隔离饲养，用吡喹酮对实验犬进行驱虫，并注射地塞米松以降低其免疫力。一周后，给实验犬喂食含有原头蚴的包囊，感染后45d对其进行粪便检测，粪便细粒棘球绦虫虫卵阳性时，注射乌拉坦安乐处死(实验犬于处死之前禁食24h，以减少小肠内容物)，沿腹中线剖开腹部，自幽门至小肠下段结扎，剪下小肠，分离肠系膜，将其纵向剪成大小适宜的片段4-5段，放在含有37℃生理盐水的小烧杯中稍微晃动以洗掉其内容物，再次更换新的生理盐水，将其放在水浴锅中37℃孵育1h，使细粒棘球绦虫成虫从小肠肠壁自行脱落。用注射器将细粒棘球绦虫虫体吸出，滴数滴于载玻片上，在显微镜下检测并判断其是否成熟，收集成熟的细粒棘球绦虫虫体于生理盐水中，用注射器吸取，每管吸取20个成熟虫体，保存备用，用于实验绵羊包虫病的人工感染。(细粒棘球绦虫虫卵获取的整个实验过程中，操作人员均穿戴一次性防护服，实验完后对隔离的实验犬舍地面及周围喷洒碱石灰糊状液(1:4)，并对整个实验过程中用到的所有实验器材喷洒10.0％次氯酸钠溶液以杀灭有可能残留的细粒棘球绦虫虫卵，另外，实验过程中用到的一次性防护用品全部销毁，以消除对周围环境的污染。)
2、免疫接种与细粒棘球虫卵感染
分别在第1周与第4周免疫接种绵羊。疫苗过滤除菌，用PBS调节浓度至50μg/ml，颈部注射1ml的疫苗。第一次免疫：重组疫苗:完全弗氏佐剂(CFA)＝1:1。第二次免疫：第一次免疫后四周，重组疫苗:不完全弗氏佐剂(IFA)＝1:1。虫卵37℃孵育40min，采用胶囊包装的形式经口攻击感染细粒棘球虫卵。每只羊攻入约3000个左右虫卵。
3、不同时间点采血
以第一次免疫作为0周起始点，分别在0、1、2、4、6、9、12w、20、36与44周进行采颈部静脉血5ml离心收集血清-80℃保存，共计10次(在0、4、8和44周先采血然后相对应的进行两次免疫、攻虫感染和剖杀处理)。
4、包囊统计及保护力的计算
包囊检测：把绵羊处死之后取肝，首先仔细检查并记录肝脏表面的包囊个数，然后再用刀把肝切成片，3mm左右/片，仔细检查并记录肝脏内部包囊个数。纤维化和钙化的包囊视为不可用包囊。保护力的计算，通过减囊率来计算保护力，保护力计算公式：免疫保护力(％)＝(1-免疫组包囊均数/对照组包囊均数)×100％。经包囊统计与计算，该疫苗获得了92％的保护力，具体如下表所示。
5、检测血清抗体
采用ELISA法分别检测了血清中rEg.myophilin抗原特异性IgG、IgG1、IgG2与IgE抗体水平。结果发现经免疫接种后，疫苗组这四种特异性抗体显著升高。如图1所示。
6、检测血清细胞因子
ELISA细胞因子试剂盒检测表明，经免疫接种后，疫苗组IFN-γ与IL-2显著升高，表明Th1型介导的细胞免疫应答显著激活；而与Th2型细胞因子IL-4亦显著升高，表明体液免疫应答亦明显上调，与抗体升高结果一致。如2图所示。
本申请所涉及的生物保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心地址：中国湖北省武汉市武汉大学；保藏日前:2015年7月3日；保藏编号：CCTCCNO：M2015426；分类命名：大肠杆菌BL21/pET-28a/Eg.MyophilinEscherichiacoliBL21/pET-28a/Eg.Myophilin。

Claims (3)

1.抗绵羊包虫病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗，是从细粒棘球蚴中国株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg.myophilin基因，再通过克隆、诱导表达、纯化获得的疫苗，其保藏号为：CCTCCM2015426。
2.一种抗绵羊包虫病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗的制备方法，首先从细粒棘球蚴中国株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg.myophilin基因，该基因收录在GenBank数据库，序列号：DQ679473，Eg.myophilin亚克隆于表达载体pET-28a，再转化到大肠杆菌BL21(DE3)plysS中诱导表达，再用含Ni2+的His-bind树脂纯化试剂盒纯化蛋白。
3.rEg.myophilin基因分子应用于制备抗绵羊包虫病感染的疫苗。
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