CN110790835A - 一种包虫重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种包虫重组蛋白及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域，包括包虫抗原和包虫单链抗体；所述包虫抗原为含有主要抗原决定簇的AgB8/2抗原；所述包虫单链抗体为scFv，包括以下步骤:(1)查找包虫中含有主要抗原决定簇的AgB8/2抗原；(2)优化包虫AgB8/2抗原基因的密码子，合成核酸序列并进行表达；(3)构建针对包虫AgB8/1抗原的单链抗体，调取单链抗体scFv的基因；(4)重组优化的包虫AgB8/2抗原基因和针对包虫AgB8/1抗原的单链抗体scFv的基因，并进行表达；(5)纯化及复性包虫重组蛋白。本发明在开发单克隆抗体的基础上又进行重组抗体技术开发单链抗体，易于在细胞中表达，可以在真核或者原核细胞中表达，可大量生产，成本较低。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种包虫重组蛋白。
背景技术
包虫病分为囊性包虫病和泡型包虫病,其中70％的泡型包虫病患者在5年内死亡,10年内的死亡率高达92％。因其高感染率和高致死率,包虫病又有“虫癌”之称。净水工程和犬类管理被视为切断虫卵源头的关键。
棘球蚴病又称为包虫病。包虫病是人感染棘球绦虫的幼虫(棘球蚴)所致的慢性寄生虫病。本病的临床表现视包虫囊部位、大小和有无并发症而不同。长期以来,包虫病被认为是一种人畜共患寄生虫病,称之为动物源性疾病。根据近年来流行病学调查,称之地方性寄生虫病；在流行区带有职业性损害的特点,被列为某些人群的职业病；从全球范围讲包虫病为少数民族或宗教部落所特有的一种常见病和多发病。
体外诊断核心原料的开发是开发相应诊断试剂的前提，只有开发出具有高活性、高性能的抗原抗体，体外诊断试剂产品才能成为现实。因此，针对包虫抗体和抗原开发出能够用以生产诊断试剂的原料迫在眉睫，从某种程度上说，原料的开发也必将成为降低包虫病蔓延的首要解决问题。
发明内容
本发明提供一种包虫重组蛋白，所述重组蛋白包括包虫抗原和包虫单链抗体。
进一步地，本发明所述包虫抗原为含有主要抗原决定簇的AgB8/2抗原，所述包虫单链抗体为scFv。
本发明还提供了一种包虫重组蛋白的制备方法，其制备步骤如下：
(1)查找包虫中含有主要抗原决定簇的AgB8/2抗原和AgB8/1抗原
从NCBI(美国国立生物技术信息中心)中查找到包虫含有主要抗原决定簇的AgB8/2抗原和AgB8/1抗原。
(2)优化包虫AgB8/2抗原和AgB8/1抗原基因的密码子，合成核酸序列并进行表达
在大肠杆菌中表达蛋白时，不同密码子使用的频率有较大区别，为了使重组蛋白的表达量达到最大，需将包虫AgB8/2和AgB8/1抗原基因序列进行密码子优化，然后合成优化后的核酸序列并进行表达。
(3)构建针对包虫AgB8/1抗原的单链抗体，调取单链抗体scFv的基因
将纯化之后的AgB8/1抗原蛋白免疫小鼠获得高活性的单克隆抗体，再调取单链抗体scFv 的基因。
(4)重组优化的包虫AgB8/2抗原基因和针对包虫AgB8/2抗原的单链抗体scFv基因，并进行表达
将优化后的包虫AgB8/2抗原基因(11-250aa)和针对包虫AgB8/2抗原的单链抗体scFv基因(能够针对结合AgB8/2抗原蛋白的3-10aa部分)通过递归PCR技术连接起来，测序分析序列正确后，把重组蛋白的基因片段插入到表达载体上进行表达。
(5)纯化及复性包虫重组蛋白。
本发明的表达系统为大肠杆菌表达系统，它具有周期短，费用低，表达量大等特点。
为了使得重组蛋白更好地保持活性位点，本发明选择比较温和的培养和诱导条件，其表达时的诱导温度为20℃、25℃、28℃、37℃，进一步优选的诱导温度为25℃、37℃，更进一步优选的诱导温度为25℃。诱导转速为250rpm，诱导的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷) 浓度为0.1mM。这样使得重组蛋白有了更加缓慢的表达，有充分的时间进行空间构象的形成。
本发明可以采用超声的方式破碎细菌。在破碎菌体的时候，为了避免剧烈条件，将破碎条件定为200w，每次超声6s，间隔3s超声一次，共180次。
本发明重组蛋白的纯化方式有离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析等方法，进一步优选为亲和层析。
本发明在重组蛋白中加入了6XHis标签，使亲和层析纯化方式能够达到较高的纯度。
本发明的重组蛋白利用基因工程重组技术，在大肠杆菌系统中表达包虫抗原和单链抗体的重组蛋白方法，具有生产周期短、产量高、成本低等优点。
本发明的包虫重组蛋白可做为包虫免疫诊断试剂盒的一部分。
本发明具有以下优点及有益效果：
(1)首次开发针对包虫主要抗原AgB8/2的单链抗体scFv。
本发明在开发单克隆抗体的基础上又进行重组抗体技术开发单链抗体，单链抗体具有以下优点：1)具有完整的抗原结合位点，不含抗体恒定区；2)分子量小，减少了抗体的非特异性结合，降低了诊断产品的假阳性风险；3)结构简单，易于基因工程改造；4)易于在细胞中表达，可以在真核或者原核细胞中表达，可大量生产，成本较低。
(2)国内外首次开发包虫主要抗原表位及针对AgB8/2抗原的scFv重组蛋白。
由于感染包虫初期不产生抗体，致使在此段时间我们检测不到相应的包虫抗体，从而导致漏检，为了解决此问题必须在检测包虫抗体的同时增加对抗原的检测，开发针对包虫 AgB8/2抗原的抗体成为关键。
(3)制备了同时结合包虫抗体和抗原的高活性、高灵敏度和高特异性的重组蛋白。
在主要抗原表位和针对包虫AgB8/2抗原的抗体开发出后，利用基因工程技术将筛选出的高效抗原表位(包虫AgB8/2抗原)和针对包虫AgB8/1抗原的单链抗体scFv(3-10aa)重组，制备成具有同时结合包虫抗体和抗原的高活性、高灵敏度和高特异性的重组蛋白，该重组蛋白具有以下优点：1)在快诊试剂条中只需要使用一种原料即可，这样可以避免多种原料间的交叉反应；2)在原料的生产上，只需要稳定一种原料的生产工艺即可，这样可以减少生产成本的投入，缩短原料生产周期，降低生产批间差；3)节省了开发包虫诊断试剂的成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但并不将本发明局限于这些具体实施方式。本领域技术人员应该认识到，本发明涵盖了权利要求书范围内所可能包括的所有备选方案、改进方案和等效方案。
实施例1包虫AgB8/2和AgB8/1抗原抗原基因的密码子优化及表达载体构建
1.1从NCBI查找AgB8/2抗原，蛋白质序列如下：
MRTYILLSLALVAFVAVVQAKDEPKAHMGQVVKKRWGELRDFFRNDPLGQRLVALGNDLTAICQKLQLKIREVLKKYVKNSVEEKDDDSK
经过密码子优化后序列如下：
ATGCGTACCTATATTCTGCTGAGCCTGGCACTGGTTGCATTTGTGGCAGTTGTGCAGGCAAAAGATGAACCGAAAGCAC ACATGGGTCAGGTTGTGAAAAAACGTTGGGGCGAACTGCGTGATTTTTTTCGTAATGATCCGCTGGGTCAGCGCCTGGT GGCCCTGGGTAATGATCTGACCGCAATTTGTCAGAAACTGCAGCTGAAAATTCGTGAAGTGCTGAAAAAATATGTGAAA AATAGCGTGGAAGAGAAAGATGATGATAGTAAA
设计引物如下：
P1u：GGCCATATGATGCGTACCTATATTCTGCTGAGCCTGGCACTGGTTGCATTTGTGG
P1d：GTGCTTTCGGTTCATCTTTTGCCTGCACAACTGCCACAAATGCAACCA
P2u：ATGAACCGAAAGCACACATGGGTCAGGTTGTGAAAAAACGTTGGGGCG
P2d：CCAGCGGATCATTACGAAAAAAATCACGCAGTTCGCCCCAACGTTTTTT
P3u：GTAATGATCCGCTGGGTCAGCGCCTGGTGGCCCTGGGTAATGATC
P3d：ACGAATTTTCAGCTGCAGTTTCTGACAAATTGCGGTCAGATCATTACCCAGGG
P4u：CAGCTGAAAATTCGTGAAGTGCTGAAAAAATATGTGAAAAATAGCGT
P4d：GCCCTCGAGTTTACTATCATCATCTTTCTCTTCCACGCTATTTTTCACAT
实验方法如下：
将引物P1u,P1d,P2u,P2d混合，进行PCR反应，所得产物命名为W1；将引物P3u,P3d,P4u,P4d混合，进行PCR反应，所得产物命名为W2；然后将上述两个产物W1,W2 混合做为模板，用引物P1u,P4d进行PCR反应即得到优化后包虫的AgB8/2基因。上述四个PCR(TOYOBO公司产品，货号：02510D1)反应条件如下：94℃，2分钟X1个循环；(98℃， 15秒，55℃，30秒，68℃，15秒)X30个循环；72℃，7分钟X1个循环。测序证明序列正确后，将此PCR产物用NdeI和XhoI限制性内切酶(购自NEB公司)进行双酶切之后，插入到用相同两个酶切处理的pET30a(Novagen产品,货号69909-3)载体中。
1.2从NCBI查找AgB8/1抗原，蛋白质序列如下：
MLLALALVSFVVVTQADDGLTSTSRSVMKMFGEVKYFFERDPLGQKVVDLLKELEEVFQLLRKKLRMALRSHLRGLIAEGE
经过密码子优化后序列如下：
ATGCTGCTGGCCCTGGCACTGGTGAGCTTTGTTGTGGTGACCCAGGCCGATGATGGCCTGACCAGCACCAGCCGTAGCG TGATGAAAATGTTTGGCGAAGTTAAATATTTCTTCGAACGCGATCCGCTGGGCCAGAAAGTTGTGGATCTGCTGAAAGA ACTGGAAGAAGTTTTTCAGCTGCTGCGTAAAAAACTGCGCATGGCACTGCGTAGCCATCTGCGTGGCCTGATTGCCGAA GGTGAA
设计引物如下：
P5u：GGCCATATGCTGCTGGCCCTGGCACTGGTGAGCTTTGTTGTGGTGACCCAGGCCGA
P5d：CCAAACATTTTCATCACGCTACGGCTGGTGCTGGTCAGGCCATCATCGGCCTGGGTCACC
P6u：GATGAAAATGTTTGGCGAAGTTAAATATTTCTTCGAACGCGATCCGCTGGGCCAGAA
P6d：GCTGAAAAACTTCTTCCAGTTCTTTCAGCAGATCCACAACTTTCTGGCCCAGCGGA
P7u：AAGAAGTTTTTCAGCTGCTGCGTAAAAAACTGCGCATGGCACTGCGTAGCCAT
P7d：GCCCTCGAGTTCACCTTCGGCAATCAGGCCACGCAGATGGCTACGCAGTGC
实验方法如下：
将引物P5u,P5d,P6u,P6d混合，进行PCR反应，所得产物命名为W3；将引物P7u,P7d混合，进行PCR反应，所得产物命名为W4；然后将上述两个产物W3,W4混合做为模板，用引物P5u,P8d进行PCR反应即得到优化后包虫的AgB8/1基因。上述四个PCR(TOYOBO公司产品，货号：02510D1)反应条件如下：94℃，2分钟X1个循环；(98℃，15秒，55℃， 30秒，68℃，15秒)X30个循环；72℃，7分钟X1个循环。测序证明序列正确后，将此PCR 产物用NdeI和XhoI限制性内切酶(购自NEB公司)进行双酶切之后，插入到用相同两个酶切处理的pET30a(Novagen产品,货号69909-3)载体中。
实施例2构建针对包虫核心蛋白包虫AgB8/1抗原的单链抗体
(1)单克隆抗体(针对结合AgB8/1抗原蛋白3-10aa的抗体)细胞株的获得
a.将构建成功的pET30a-AgB8/1载体转化至BL21表达菌种表达纯化后获得AgB8/1抗原蛋白
b.用获得的AgB8/1抗原蛋白免疫小鼠
c.用单克隆抗体技术筛选到只针对结合AgB8/1抗原蛋白3-10aa的抗体细胞株
(2)细胞RNA的提取
用TRIzol LS(invitrogen产品,货号10296-010)试剂，按照说明书操作步骤提取细胞总 RNA。
cDNA第一链的合成
取1μg RNA做逆转录模板，Oligo(d)T 1μl做逆转录引物，
加DEPC水至总体积12μl，混匀；
70℃变性5min，迅速冰浴冷却；
依次加入5×缓冲液4μl，RNase抑制剂1μl，dNTP(10mM each)2μl，混匀
37℃孵育5min；
加入AMV逆转录酶1μl，
37℃反转录60min；
70℃10min终止反应；
冰上冷却
(3)以逆转录cDNA为模板，按照以下引物，用RT-PCR扩增重链轻链基因。
mHVu1:GATGTGAAGCTTCAGGAGTC
mHVu2:CAGGTGCAGCTGAAGGAGTC
mHVu3:CAGGTGCAGCTGAAGCAGTC
mHVu4:CAGGTTACTCTGAAAGAGTC
mHVu5:AAGGTCCAGCTGCAACAATC
mHVu6:GAGGTCCAGCTGCAGCAGTC
mHVu7:CAGGTCCAACTGCAGCAGCC
mHVu8:GAGGTGAAGCTGGTGGAGTC
mHVu9:GAGGTGAAGCTGGTGGAATC
mHVu10:GATGTGAACTTGGAAGTGTC
mHVd1:TGCAGAGACAGTGACCAGAGT
mHVd2:TGAGGAGACTGTGAGAGTGGT
mHVd3:TGAGGAGACGGTGACTGAGGT
mHVd4:TGAGGAGACGGTGACCGTGGT
mKVu1:GATGTTTTGATGACCCAAACT
mKVu2:GATATTGTGATGACGCAGGCT
mKVu3:GATATTGTGATAACCCAG
mKVu4:GACATTGTGCTGACCCAATCT
mKVu5:GACATTGTGATGACCCAGTCT
mKVu6:GATATTGTGCTAACTCAGTCT
mKVu7:GATATCCAGATGACACAGACT
mKVu8:GACATCCAGCTGACTCAGTCT
mKVu9:CAAATTGTTCTCACCCAGTCT
mKVd1:CCGTTTCAGCTCCAGCTTG
mKVd2:CCGTTTTATTTCCAGCTTGGT
mKVd3:CCGTTTTATTTCCAACTTTG
用引物mHVu1—mHVu10分别与mHVd1—mHVd4组合；mKVu1—mKVu9分别与 mKVd1—mKVd4组合做PCR反应。
PCR反应体系25μl，其中cDNA 0.5μl，上游引物0.25μl下游引物0.25μl，Taq酶0.2μl dNTP 2μl 10×buffer 2.5μl。
PCR(TOYOBO公司产品，货号：02510D1)，PCR条件为：94℃，2分钟X1个循环； (98℃，5秒，55℃，30秒，68℃，15秒)X30个循环；72℃，7分钟X1个循环。
经测序验证后确定重链和轻链基因，然后通过递归PCR将重链和轻链基因连接起来，此重组基因为rscFv。rscFv序列如下:
CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCTGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCTCCTCGGTGAAGGTC TCCTGCACCAGCAGCGAAGTGACCTTCAGCAGCTTCGCTATCAGCTGGGTGCGCCAGGCCC CGGGTCAAGGCCTGGAGTGGCTGGGTGGTATTAGCCCGATGTTTGGCACCCCGAACTATGCA CAGAAGTTCCAGGGCCGCGTCACGATTACCGCGGACCAGAGCACCCGCACCGCGTATATGG ATCTGCGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGCAGCCCGAGCTAT ATTTGCAGCGGCGGCACCTGCGTGTTTGATCATTGGGGCCAGGGCACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGCGGCGGCGGCAGCGATATTGTGATAACCCAGCCGTCGGTGTCCAAGGGCTTGCGC CAGACCGCCACACTGACCTGCACTGGTAACAGCAACAATGTGGGCAACCAAGGTGCAGCTT GGCTGCAGCAGCACCAGGGCCACCCTCCCAAACTGCTGTCCTACAGGAATAACGATCGCCC CTCAGGTATTTCAGAGCGCTTTTCTGCATCCCGCTCAGGTAACACAGCCTCCCTGACCATTAC TGGCCTGCAGCCTGAGGACGAGGCTGACTATTACTGCTCAACCTGGGACAGCAGCCTCAGT GCTGTGGTGTTCGGCGGCACAAAGTTGGAAATAAAACGG
实施例3含有包虫AgB8/2抗原基因和针对包虫AgB8/1抗原的单链抗体基因(3-10aa)重组，并进行表达
(1)通过递归PCR将有包虫AgB8/2抗原基因和针对包虫AgB8/1抗原的单链抗体基因(3-10aa)连接在一起，用NdeI和XhoI限制性内切酶(购自NEB公司)进行双酶切之后，插入到用相同两个酶切处理的pET30a(Novagen产品，货号69909-3)载体中。AgB8/2-rscFv 融合序列如下:
ATGCGTACCTATATTCTGCTGAGCCTGGCACTGGTTGCATTTGTGGCAGTTGTGCAGGCAAA AGATGAACCGAAAGCACACATGGGTCAGGTTGTGAAAAAACGTTGGGGCGAACTGCGTGA TTTTTTTCGTAATGATCCGCTGGGTCAGCGCCTGGTGGCCCTGGGTAATGATCTGACCGCAAT TTGTCAGAAACTGCAGCTGAAAATTCGTGAAGTGCTGAAAAAATATGTGAAAAATAGCGTG GAAGAGAAAGATGATGATAGTAAACAGGTGCAGCTGAAGCAGTCTGGCGCTGAGGTGAAG AAGCCTGGCTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCACCAGCAGCGAAGTGACCTTCAGCAGCTTCGCTATCAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCGGGTCAAGGCCTGGAGTGGCTGGGTGGTATTAGCCC GATGTTTGGCACCCCGAACTATGCACAGAAGTTCCAGGGCCGCGTCACGATTACCGCGGAC CAGAGCACCCGCACCGCGTATATGGATCTGCGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACGGCCGTGTA TTACTGTGCGCGCAGCCCGAGCTATATTTGCAGCGGCGGCACCTGCGTGTTTGATCATTGGG GCCAGGGCACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGCGGCGGCGGCAGCGATATTGTGATAACCCA GCCGTCGGTGTCCAAGGGCTTGCGCCAGACCGCCACACTGACCTGCACTGGTAACAGCAAC AATGTGGGCAACCAAGGTGCAGCTTGGCTGCAGCAGCACCAGGGCCACCCTCCCAAACTGC TGTCCTACAGGAATAACGATCGCCCCTCAGGTATTTCAGAGCGCTTTTCTGCATCCCGCTCAG GTAACACAGCCTCCCTGACCATTACTGGCCTGCAGCCTGAGGACGAGGCTGACTATTACTGC TCAACCTGGGACAGCAGCCTCAGTGCTGTGGTGTTCGGCGGCACAAAGTTGGAAATAAAAC GG
(2)将上述重组蛋白基因的表达载体转化至大肠杆菌BL21中，涂布于含100ug/ml硫酸卡那霉素(上海生工生物工程服务有限公司，货号：KB0286)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落，用含有相同浓度的硫酸卡那霉素的300mlLB培养基37℃培养至OD600达 0.6左右，用浓度为0.1mM的IPTG(生工，货号：IB0168)进行诱导表达，诱导条件为：37℃，转速250rpm，5h。诱导之后，将培养液4℃5000rpm离心20min收集菌体。
实施例4含有包虫重组蛋白的纯化及复性
将菌体用50ml包涵体抽提液(20mM Tris-HCl，0.5MUreapH 7.5，0.5M NaCl,2％Triton X-100)重悬，然后超声破碎，条件为每次超声3s，间隔6s，共180次，12000rpm，4℃离心收集包涵体沉淀。用上样缓冲液Binding Buffer(50mM Tris，8M Urea，0.5M Nacl，20mM咪唑pH8.0)50ml破碎包涵体，上柱纯化，用洗脱缓冲液Elution Buffer(50mM Tris，8MUrea，0.5M Nacl，300mM咪唑pH8.0)洗脱目的蛋白。将纯化后的重组蛋白用透析缓冲液(1mM氧化型谷胱甘肽GSSH，2mM还原型谷胱甘肽GSH，2mMEDTA，20mM Tris,pH8.5)透析, 每隔48h换一次透析液。取出透析后的蛋白液，经据乙醇-20000进行浓缩，于-20℃保存备用。
序列表
<110> 杭州亿米诺生物科技有限公司
<120> 一种包虫重组蛋白及其制备方法和应用
<130> 2
<160> 45
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 90
<212> PRT
<213> AgB8/2抗原
<400> 1
Met Arg Thr Tyr Ile Leu Leu Ser Leu Ala Leu Val Ala Phe Val Ala
1 5 10 15
Val Val Gln Ala Lys Asp Glu Pro Lys Ala His Met Gly Gln Val Val
20 25 30
Lys Lys Arg Trp Gly Glu Leu Arg Asp Phe Phe Arg Asn Asp Pro Leu
35 40 45
Gly Gln Arg Leu Val Ala Leu Gly Asn Asp Leu Thr Ala Ile Cys Gln
50 55 60
Lys Leu Gln Leu Lys Ile Arg Glu Val Leu Lys Lys Tyr Val Lys Asn
65 70 75 80
Ser Val Glu Glu Lys Asp Asp Asp Ser Lys
85 90
<210> 2
<211> 270
<212> PRT
<213> AgB8/2经过密码子优化
<400> 2
Ala Thr Gly Cys Gly Thr Ala Cys Cys Thr Ala Thr Ala Thr Thr Cys
1 5 10 15
Thr Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys Ala Cys Thr
20 25 30
Gly Gly Thr Thr Gly Cys Ala Thr Thr Thr Gly Thr Gly Gly Cys Ala
35 40 45
Gly Thr Thr Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Ala Ala Ala Ala Gly
50 55 60
Ala Thr Gly Ala Ala Cys Cys Gly Ala Ala Ala Gly Cys Ala Cys Ala
65 70 75 80
Cys Ala Thr Gly Gly Gly Thr Cys Ala Gly Gly Thr Thr Gly Thr Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Gly Thr Thr Gly Gly Gly Gly Cys Gly
100 105 110
Ala Ala Cys Thr Gly Cys Gly Thr Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr
115 120 125
Thr Cys Gly Thr Ala Ala Thr Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys Thr Gly
130 135 140
Gly Gly Thr Cys Ala Gly Cys Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly
145 150 155 160
Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Ala Ala Thr Gly Ala Thr Cys Thr
165 170 175
Gly Ala Cys Cys Gly Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gly Thr Cys Ala Gly
180 185 190
Ala Ala Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala
195 200 205
Thr Thr Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala
210 215 220
Ala Ala Ala Ala Thr Ala Thr Gly Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Thr
225 230 235 240
Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly
245 250 255
Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Ala Gly Thr Ala Ala Ala
260 265 270
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（P1u）
<400> 3
ggccatatga tgcgtaccta tattctgctg agcctggcac tggttgcatt tgtgg 55
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列（P1d）
<400> 4
gtgctttcgg ttcatctttt gcctgcacaa ctgccacaaa tgcaacca 48
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列（P2u）
<400> 5
atgaaccgaa agcacacatg ggtcaggttg tgaaaaaacg ttggggcg 48
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（P2d）
<400> 6
ccagcggatc attacgaaaa aaatcacgca gttcgcccca acgtttttt 49
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（P3u）
<400> 7
gtaatgatcc gctgggtcag cgcctggtgg ccctgggtaa tgatc 45
<210> 8
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（P3d）
<400> 8
acgaattttc agctgcagtt tctgacaaat tgcggtcaga tcattaccca ggg 53
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列（P4u）
<400> 9
cagctgaaaa ttcgtgaagt gctgaaaaaa tatgtgaaaa atagcgt 47
<210> 10
<211> 81
<212> PRT
<213> AgB8/1抗原
<400> 10
Met Leu Leu Ala Leu Ala Leu Val Ser Phe Val Val Val Thr Gln Ala
1 5 10 15
Asp Asp Gly Leu Thr Ser Thr Ser Arg Ser Val Met Lys Met Phe Gly
20 25 30
Glu Val Lys Tyr Phe Phe Glu Arg Asp Pro Leu Gly Gln Lys Val Val
35 40 45
Asp Leu Leu Lys Glu Leu Glu Glu Val Phe Gln Leu Leu Arg Lys Lys
50 55 60
Leu Arg Met Ala Leu Arg Ser His Leu Arg Gly Leu Ile Ala Glu Gly
65 70 75 80
Glu
<210> 11
<211> 243
<212> PRT
<213> AgB8/1抗原经过密码子优化
<400> 11
Ala Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly
1 5 10 15
Cys Ala Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gly Cys Thr Thr Thr Gly Thr
20 25 30
Thr Gly Thr Gly Gly Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys
35 40 45
Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala
50 55 60
Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly Thr Ala Gly Cys Gly Thr
65 70 75 80
Gly Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr Thr Gly Gly Cys
85 90 95
Gly Ala Ala Gly Thr Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr Cys Thr
100 105 110
Thr Cys Gly Ala Ala Cys Gly Cys Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Thr Gly
130 135 140
Gly Ala Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Cys
145 150 155 160
Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Thr Thr Thr Thr Thr Cys Ala
165 170 175
Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Gly Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Cys Thr Gly Cys Gly Cys Ala Thr Gly Gly Cys Ala Cys Thr Gly Cys
195 200 205
Gly Thr Ala Gly Cys Cys Ala Thr Cys Thr Gly Cys Gly Thr Gly Gly
210 215 220
Cys Cys Thr Gly Ala Thr Thr Gly Cys Cys Gly Ala Ala Gly Gly Thr
225 230 235 240
Gly Ala Ala
<210> 12
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（P5u）
<400> 12
ggccatatgc tgctggccct ggcactggtg agctttgttg tggtgaccca ggccga 56
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（P5d）
<400> 13
ccaaacattt tcatcacgct acggctggtg ctggtcaggc catcatcggc ctgggtcacc 60
<210> 14
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（P6u）
<400> 14
gatgaaaatg tttggcgaag ttaaatattt cttcgaacgc gatccgctgg gccagaa 57
<210> 15
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（P6d）
<400> 15
gctgaaaaac ttcttccagt tctttcagca gatccacaac tttctggccc agcgga 56
<210> 16
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（P7u）
<400> 16
aagaagtttt tcagctgctg cgtaaaaaac tgcgcatggc actgcgtagc cat 53
<210> 17
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列（P7d）
<400> 17
gccctcgagt tcaccttcgg caatcaggcc acgcagatgg ctacgcagtg c 51
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（mHVU1）
<400> 18
gatgtgaagc ttcaggagtc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（mHVu2)
<400> 19
caggtgcagc tgaaggagtc 20
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（mHVu3）
<400> 20
caggctgaag cagtc 15
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（mHVu4）
<400> 21
caggttactc tgaaagagtc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（mHVu5）
<400> 22
aaggtccagc tgcaacaatc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（mHVu6）
<400> 23
gaggtccagc tgcagcagtc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（mHVu7）
<400> 24
caggtccaac tgcagcagcc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（mHVu8）
<400> 25
gaggtgaagc tggtggagtc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（mHVu9）
<400> 26
gaggtgaagc tggtggaatc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（mHVu10）
<400> 27
gatgtgaact tggaagtgtc 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（mHVd1）
<400> 28
tgcagagaca gtgaccagag t 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（mHVd2）
<400> 29
tgaggagact gtgagagtgg t 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（mHVd3）
<400> 30
tgaggagacg gtgactgagg t 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（mHVd4）
<400> 31
tgaggagacg gtgaccgtgg t 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（mKVu1）
<400> 32
gatgttttga tgacccaaac t 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（mKVu2）
<400> 33
gatattgtga tgacgcaggc t 21
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（mKVu3）
<400> 34
gatattgtga taacccag 18
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（mKVu4）
<400> 35
gacattgtgc tgacccaatc t 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（mKVu5）
<400> 36
gacattgtga tgacccagtc t 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（mKVu6）
<400> 37
gatattgtgc taactcagtc t 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（mKVu7）
<400> 38
gatatccaga tgacacagac t 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（mKVu8）
<400> 39
gacatccagc tgactcagtc t 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（mKVu9）
<400> 40
caaattgttc tcacccagtc t 21
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（mKVd1）
<400> 41
ccgtttcagc tccagcttg 19
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（mKVd2）
<400> 42
ccgttttatt tccagcttgg t 21
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（mKVd3）
<400> 43
ccgttttatt tccaactttg 20
<210> 44
<211> 714
<212> DNA
<213> recFv
<400> 44
caggtgcagc tgaagcagtc tggcgctgag gtgaagaagc ctggctcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcacca gcagcgaagt gaccttcagc agcttcgcta tcagctgggt gcgccaggcc 120
ccgggtcaag gcctggagtg gctgggtggt attagcccga tgtttggcac cccgaactat 180
gcacagaagt tccagggccg cgtcacgatt accgcggacc agagcacccg caccgcgtat 240
atggatctgc gcagcctgcg ctctgaggac acggccgtgt attactgtgc gcgcagcccg 300
agctatattt gcagcggcgg cacctgcgtg tttgatcatt ggggccaggg cacctcagtc 360
accgtctcct caggcggcgg cggcagcgat attgtgataa cccagccgtc ggtgtccaag 420
ggcttgcgcc agaccgccac actgacctgc actggtaaca gcaacaatgt gggcaaccaa 480
ggtgcagctt ggctgcagca gcaccagggc caccctccca aactgctgtc ctacaggaat 540
aacgatcgcc cctcaggtat ttcagagcgc ttttctgcat cccgctcagg taacacagcc 600
tccctgacca ttactggcct gcagcctgag gacgaggctg actattactg ctcaacctgg 660
gacagcagcc tcagtgctgt ggtgttcggc ggcacaaagt tggaaataaa acgg 714
<210> 45
<211> 984
<212> DNA
<213> AgB8/2-recFV
<400> 45
atgcgtacct atattctgct gagcctggca ctggttgcat ttgtggcagt tgtgcaggca 60
aaagatgaac cgaaagcaca catgggtcag gttgtgaaaa aacgttgggg cgaactgcgt 120
gatttttttc gtaatgatcc gctgggtcag cgcctggtgg ccctgggtaa tgatctgacc 180
gcaatttgtc agaaactgca gctgaaaatt cgtgaagtgc tgaaaaaata tgtgaaaaat 240
agcgtggaag agaaagatga tgatagtaaa caggtgcagc tgaagcagtc tggcgctgag 300
gtgaagaagc ctggctcctc ggtgaaggtc tcctgcacca gcagcgaagt gaccttcagc 360
agcttcgcta tcagctgggt gcgccaggcc ccgggtcaag gcctggagtg gctgggtggt 420
attagcccga tgtttggcac cccgaactat gcacagaagt tccagggccg cgtcacgatt 480
accgcggacc agagcacccg caccgcgtat atggatctgc gcagcctgcg ctctgaggac 540
acggccgtgt attactgtgc gcgcagcccg agctatattt gcagcggcgg cacctgcgtg 600
tttgatcatt ggggccaggg cacctcagtc accgtctcct caggcggcgg cggcagcgat 660
attgtgataa cccagccgtc ggtgtccaag ggcttgcgcc agaccgccac actgacctgc 720
actggtaaca gcaacaatgt gggcaaccaa ggtgcagctt ggctgcagca gcaccagggc 780
caccctccca aactgctgtc ctacaggaat aacgatcgcc cctcaggtat ttcagagcgc 840
ttttctgcat cccgctcagg taacacagcc tccctgacca ttactggcct gcagcctgag 900
gacgaggctg actattactg ctcaacctgg gacagcagcc tcagtgctgt ggtgttcggc 960
ggcacaaagt tggaaataaa acgg 984
Claims (9)
1.一种包虫重组蛋白，其特征在于包括包虫抗原和包虫单链抗体：
所述包虫抗原为含有主要抗原决定簇的AgB8/2抗原；
所述包虫单链抗体为scFv。
2.一种权利要求1所述的包虫重组蛋白的制备方法，其制备步骤如下：
(1)查找包虫中含有主要抗原决定簇的AgB8/2抗原；
(2)优化包虫AgB8/2抗原基因的密码子，合成核酸序列并进行表达；
(3)构建针对包虫AgB8/1抗原的单链抗体，调取单链抗体scFv的基因；
(4)重组优化的包虫AgB8/2抗原基因和针对包虫AgB8/1抗原的单链抗体scFv的基因，并进行表达；
(5)纯化及复性包虫重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的包虫重组蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤(2)和步骤(4)在大肠杆菌系统中表达。
4.根据权利要求2所述的包虫重组蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤(2)和步骤(4)表达时的诱导温度为20℃、25℃、28℃或37℃，诱导转速为250rpm，诱导的IPTG浓度为0.1mM。
5.根据权利要求4所述的包虫重组蛋白的制备方法，其特征在于所述诱导温度为25℃或37℃。
6.根据权利要求5所述的包虫重组蛋白的制备方法，其特征在于所述诱导温度为25℃。
7.根据权利要求2所述的包虫重组蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤(5)的纯化方式选自离子交换层析、凝胶过滤层析或亲和层析。
8.根据权利要求7所述的包虫重组蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤(5)的纯化方式为亲和层析。
9.一种权利要求1所述的包虫重组蛋白的应用，其特征在于所述重组蛋白用于制备包虫检测试剂盒。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107033240A (zh) * | 2016-02-04 | 2017-08-11 | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 | 一种新的棘球蚴病诊断抗原及其应用 |
| CN107286250A (zh) * | 2017-06-14 | 2017-10-24 | 杭州亿米诺生物科技有限公司 | 一种布鲁氏菌融合蛋白、其制备方法及应用 |
| CN108059684A (zh) * | 2017-12-25 | 2018-05-22 | 杭州亿米诺生物科技有限公司 | 一种牛病毒性腹泻重组蛋白、其制备方法及应用 |
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- 2018-12-26 CN CN201811604101.4A patent/CN109485725A/zh not_active Withdrawn
-
2019
- 2019-12-13 CN CN201911284591.9A patent/CN110790835A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| SUI,J.等: "《GenBank》", 10 October 2012 * |
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