CN107033240A - 一种新的棘球蚴病诊断抗原及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的棘球蚴病诊断抗原及其应用。具体地，本发明提供了细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Echinococcus granulosus Cystatin,EgCystatin)或其基因、或其检测试剂的用途，它们被(i)用于制备细粒棘球绦虫(或细粒棘球蚴)的阳性抗原；和/或(ii)用于制备诊断细粒棘球绦虫(或细粒棘球蚴)的试剂或试剂盒。本发明的该抗原对细粒棘球绦虫的诊断敏感性和特异性均非常高，诊断效能远高于其他常规的细粒棘球绦虫抗原。

Description

一种新的棘球蚴病诊断抗原及其应用

技术领域

本发明涉及寄生虫病诊断领域。具体地，本发明涉及一种可用于诊断细粒棘球绦虫(或细粒棘球蚴)的新抗原。

相关资助

本发明受到以下基金的资助：国家自然科学基金(81201315)；国家重大科技专项(2009ZX10004-302)；甘肃省科技支撑计划(1304FKCA120)；卫计委寄生虫病原与媒介生物学重点实验室开放课题(WSBKTKT201305)。

背景技术

细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)的幼虫(棘球蚴)寄生于人体所引起的细粒棘球蚴病(Cyst echinococcosis)，也叫囊型包虫病(Cystichydatid disease)，是一种严重危害人体健康和生命安全、影响社会经济发展的人兽共患病，是世界棘球蚴病的主要疾病负担，也是我国重点防治的寄生虫病之一。该病呈全球性分布，具不完全报道，全球至少100个国家存在细粒棘球绦虫的流行。高度流行区主要在欧亚大陆，非洲的北部和东部，澳大利亚及南美洲。我国是世界细粒棘球蚴病的高发区，预计我国该病的疾病负担占据全球的40％。2004年全国人体重要寄生虫病调查表明，棘球蚴病的人均患病率1.08％，据估算我国有60～130万棘球蚴病人，受威胁人口约6600万，27个省、自治区、直辖市有病例报道，98％是细粒棘球蚴病例，每年细粒棘球蚴病手术病例约2000例。

目前对棘球蚴病的诊断主要以患者自述症状、医生局部体检为依据。由于细粒棘球蚴呈封闭性寄生于人体的内部脏器，传统的病原学方法无法诊断，须辅以物理和其他实验方法。

现行诊断主要以医学影像法为判断标准。B超诊断是目前棘球蚴病诊断与流行病调查的主要方法，但采用B超进行疾病筛查仍存在问题。例如，对检验人员技术水平及经验要求高，极易与肝癌、肝血管瘤及肝囊肿混淆，且很难对2厘米以内的包囊进行准确诊断。

免疫学检测是人体棘球蚴病重要的辅助诊断方法。当包囊的影像学形态不典型时，免疫诊断具有鉴别诊断的意义；免疫学检测的敏感性和特异性对患者的及时发现与治疗后随访也起到了重要作用；对流行区的流行病学调查、防治规划的制定及防治效果的考核免疫学诊断更具有重要的参考价值。棘球蚴病血清学诊断有着长久的发展史，几乎所有已经出现的免疫学诊断方法都被用于人体棘球蚴病诊断。然而，至今没有一种可行的诊断工具、试剂盒或方法可以普遍应用到棘球蚴病临床实践中。提高人体棘球蚴病血清学诊断试剂的检测效能是我国棘球蚴病防治中亟待解决的问题。

由于循环抗原检测的低敏感性，抗体检测仍然是棘球蚴病临床诊断和流行病普查中使用最广泛的方法。抗体检测的敏感性和特异性与实验中所用的抗原密切相关。细粒棘球蚴病的抗原可来源于囊液、原头蚴、囊壁。其中囊液抗原研究的最多，是目前最主要的诊断抗原来源。囊液成分复杂，有虫体分泌物及虫体表面脱落的物质，具有很强的抗原性。但不同宿主及同一宿主的不同寄生部位，囊液的抗原性相差很大，据报道其敏感性可达75％～95％，但其特异性不高，且常与其他绦虫、线虫和吸虫有交叉反应。

天然来源的粗囊液成分复杂性，不宜于进行质量控制和标准化，产量低，是目前细粒棘球蚴病血清学诊断试剂效能低，产品不能标准化的重要原因。

分析粗抗原组分，采用基因工程的方法制备重组抗原替代天然抗原，是解决上述问题，提高细粒棘球蚴病诊断试剂效能的一种重要途径。

抗原B(AgB)是细粒棘球蚴包囊液中含量最丰富的组分之一，其亚单位EgAgB1和EgAgB2的重组蛋白是目前公认的最有前景的细粒棘球蚴病诊断抗原。目前报道的天然抗原B对囊型包虫病诊断有一定的敏感性和特异性，但往往敏感性较低，但AgB为基础制备的多肽抗原如P176、P175、P177等虽然可以提高诊断的特异性，但灵敏性往往降低。

除此之外，也陆续有新的诊断抗原被发现，但到目前为止，这些已经报道的抗原对细粒棘球蚴病检测的灵敏度和特异性在实际诊断中仍在很大局限性，无法满足实际诊断的要求。

因此，本领域迫切需要开发一种可有效提高细粒棘球绦虫诊断灵敏度和特异性的抗原。

发明内容

本发明的目的就是提供一种可有效提高细粒棘球蚴病的诊断灵敏度和特异性的抗原，及其制法和应用。

本发明第一方面提供了一种细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Echinococcus granulosus Cystatin,EgCystatin)或其基因、或其检测试剂的用途，(i)用于制备细粒棘球绦虫(或细粒棘球蚴)的阳性抗原；和/或(ii)用于制备诊断细粒棘球绦虫(或细粒棘球蚴)的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(EgCystatin)选自下组：

(a)如SEQ ID NO.:1所示的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的具有免疫原性的衍生多肽；

(c)与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的同源性≥90％，较佳地≥95％的具有免疫原性的多肽；或

(d)具有免疫原性的多肽(a)-(c)的片段。

在另一优选例中，所述抗原组合中的抗原针对的抗体不相同。

在另一优选例中，所述的EgCystatin基因的GenBank登陆号为LK028576。

在另一优选例中，所述的EgCystatin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了SEQ ID NO.:1所示多肽至少80％、90％、95％以上的免疫原性。

在另一优选例中，所述的衍生多肽由SEQ ID NO.:1所示多肽经1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个氨基酸取代、缺失或添加而形成，且所述的衍生多肽具有免疫原性。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的抗体、检测细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂编码序列的探针、或其组合。

在另一优选例中，所述的试剂盒含有一容器，所述的容器内含有EgCystatin或与EgCystatin特异性结合的抗原-抗体复合物。

在另一优选例中，所述容器内含有与EgCystatin特异性结合的抗原-抗体复合物作为阳性对照。

本发明第二方面提供了一种抗体，所述的抗体能与SEQ ID NO.:1所示的多肽特异性结合。

本发明第三方面提供了一种抗原-抗体复合物，所述的复合物包括：

(i)SEQ ID NO.:1所示的多肽；

(ii)与(i)中的多肽特异性结合的抗体。

本发明第四方面提供了本发明第三方面所述抗原-抗体复合物的用途，它被用于：

(a)制备检测细粒棘球绦虫(或细粒棘球蚴)的试剂或试剂盒；和

(b)用作检测细粒棘球绦虫(或细粒棘球蚴)的阳性对照。

本发明第五方面提供了一种细粒棘球绦虫(或细粒棘球蚴)检测试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述的容器中含有细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂或其基因。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括酶结合液、反应底物和任选的说明书，较佳地，所述的试剂盒还可包括选自下组的组分：反应终止液、样本稀释液、和洗涤液。

本发明第六方面提供了一种诊断或非诊断性的检测样本中是否感染细粒棘球绦虫(或细粒棘球蚴)的方法，包括步骤：

(1)制备SEQ ID NO.:1所示的细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂作为抗原；

(2)将步骤(1)中得到的抗原与待检测样本接触；

(3)检测样本中是否含有本发明第三方面所述的抗原-抗体复合物；

其中，若步骤(3)中的样本出现所述的抗原-抗体复合物，则表明所述的样本感染了细粒棘球蚴绦虫(或细粒棘球蚴)。

在另一优选例中，所述的样本包括血液样本(包括全血,血清,血浆样本)、组织液样本、尿液样本、唾液样本、粪便样本。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了EgCystatin基因PCR扩增电泳图，其中，M:分子量标准，1：EgCystatin基因扩增产物(箭头所示)。

图2显示了重组质粒pET28a-EgCystatin电泳图，其中，M：分子量标准，2,3,4,6：pET28a-EgCystatin质粒扩增产物(箭头所示)。

图3显示了重组蛋白EgCystatin表达与纯化分析结果，其中图3A中，M：标准分子量蛋白，1：未诱导菌体蛋白，2：诱导后菌体蛋白(箭头所示为目标蛋白)，3：诱导后菌体裂解上清(箭头所示为目标蛋白)，4：诱导后菌体裂解沉淀；图3B中，M：标准分子量蛋白，1：纯化前裂解上清蛋白，2,3：流出液中的蛋白，4：纯化后的重组EgCystatin蛋白(箭头所示)。

图4显示了蛋白浓度测定标准曲线。

图5显示了HCF、AgB1、EgCystatin抗原的ELISA检测结果。

图6显示了HCF、EgCystatin抗原与囊虫病诊断的交叉反应图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(EgCystatin)可以作为免疫原性极强的用于诊断细粒棘球绦虫抗原，该抗原对细粒棘球绦虫的诊断敏感性和特异性均非常高。基于本发明，可将EgCystatin作为细粒棘球绦虫的诊断抗原，从而进一步将其用于制备诊断和检测细粒棘球蚴绦虫(或细粒棘球蚴)的试剂或试剂盒。在此基础上，完成了本发明。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin)抗原

半胱氨酸蛋白酶抑制剂是半胱氨酸蛋白酶可逆性紧密结合的天然抑制剂，具有独特的酶抑制活性，可特异性抑制木瓜蛋白酶和组织蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶类的活性。该蛋白在寄生虫逃避宿主免疫应答，适应寄生生活中起着重要作用。一些寄生虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂能抑制抗原提呈，调节细胞因子分泌，刺激γ干扰素活化巨噬细胞分泌NO，具有潜在的过敏原作用。

在本发明中，首次将细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂应用为抗原，作为细粒棘球蚴病诊断标志物，并通过实验证明，该细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂有助于显著提高细粒棘球蚴病诊断的灵敏度和特异性。

细粒棘球绦虫Cystatin的氨基酸序列和核苷酸序列的信息如下：

EgCystatin的氨基酸序列：

MNRFVLLFLSFLVAISLACRQQERSVAVPSSRGIVGGITPITKEDMNEMMFQDALTEVMKNLDEVNECHSFRLVKVIEATQQVVAGMKYVVKLEVTPIYSSDNGEECSKPCYHGLSGNKQAIAAIVYQPWRDPKHHITFKPNNEGSADFSKNGKLITSCELPEGTILSPKEMTSEQFQEVVRSGIERLDRNASRCFRYELMDVIEGKRMMTSNLKYEWRMKVKRIYDESMLGCIGACADDCSGIEIYRASAFASPFHGGTPEILSIEYQDPTAL(SEQ ID NO.:1)

EgCystatin核苷酸序列：

TCATAGGGCTGTGGGGTCTTGATACTCAATACTCAGGATCTCTGGTGTTCCGCCGTGGAACGGACTTGCGAAGGCACTGGCCCTGTAAATTTCAATGCCTGAGCAGTCGTCGGCGCAGGCACCAATACAACCAAGCATAGACTCATCGTAAATTCTCTTCACTTTCATCCTCCATTCATACTTCAGGTTCGAGGTCATCATTCTCTTTCCTTCAATCACATCCATGAGCTCGTACCGAAAGCATCTGCTGGCATTTCTATCCAATCTTTCGATACCACTTCGGACCACCTCTTGAAATTGTTCTGATGTCATTTCTTTAGGGGACAGAATCGTCCCTTCTGGTAATTCACAGCTAGTAATTAGCTTTCCATTTTTACTGAAATCTGCAGAACCTTCATTGTTGGGCTTAAAAGTGATGTGATGCTTGGGATCCCTCCATGGTTGATACACAATCGCAGCTATTGCTTGCTTATTTCCACTTAAACCATGGTAGCAAGGCTTCGAACATTCCTCGCCATTATCACTGGAATAGATAGGAGTGACCTCTAGCTTTACGACATATTTCATTCCAGCGACAACCTGTTGTGTAGCTTCAATAACTTTGACAAGTCGGAAGGAGTGACATTCGTTCACTTCGTCTAAATTCTTCATTACCTCTGTAAGAGCGTCCTGAAACATCATCTCATTCATGTCCTCCTTGGTTATGGGAGTAATACCGCCGACTATGCCTCTCGAGGAAGGGACAGCAACGCTGCGCTCTTGCTGTCTGCACGCAAGCGAGATGGCGACAAGGAAGGAGAGGAACAGAAGAACAAACCGATTCAT(SEQ ID NO.:2)

阳性抗原

在本发明中，术语“抗原”或“阳性抗原”可互换使用，都指能够与细粒棘球绦虫抗体特异结合的蛋白或多肽。抗原是指能够刺激产生(特异性)免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应(特异性反应)的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。“分离的阳性抗原”是指所述抗原基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化阳性抗原。基本上纯的蛋白抗原在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。抗原的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的抗原可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的抗原可以是糖基化的和非糖基化的。本发明的抗原还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括抗原的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然抗原相同的生物学功能或活性的抗原。本发明的抗原片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的抗原，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的抗原，或(iii)抗原与另一个化合物(比如延长抗原半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的抗原，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此抗原序列而形成。这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“抗原”还包括具有相同功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的抗原的化学衍生形式如乙酰化、羧基化、糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

抗原编码序列

编码本发明抗原的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。术语“编码本发明抗原的多核苷酸”可以是包括编码此抗原的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。

本发明的核苷酸序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。可以完全通过化学合成来得到编码本发明抗原(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明抗原序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。

抗原制备方法

本发明抗原的制备方法有以下步骤：

(1).用编码本发明阳性抗原的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化本发明抗原。

本发明中，多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含抗原编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。包含上述适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明抗原蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

抗原蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化抗原蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

试剂盒

本发明还提供了一种检测细粒棘球绦虫的试剂盒。一般地，本发明的试剂盒包括以下组分：容器或载体；以及位于所述容器内或载体上的EgCystatin蛋白、基因或其检测试剂。在另一优选例中，所述试剂盒还包括酶结合液、反应底物和任选的说明书。较佳地，所述的试剂盒还可包括选自下组的组分：反应终止液、样本稀释液、和洗涤液。一种优选的可用于检测细粒棘球绦虫的试剂盒包括：容器以及位于容器内的包被液、辣根过氧化物酶标记的鼠(或羊)抗人IgG(H+L)抗体、底物液TMB、稀浓硫酸反应终止液和样本稀释液。更佳地，还含有空白对照、阳性和阴性对照和作以监控检测过程是否符合标准。

本发明的主要优点包括：

1.抗原灵敏度高，不受检测样本感染度的影响，敏感度较高。

2.高特异性，本发明的抗原检测待测样本，其假阳率极低。

3.操作简便，抗原可以使用通用的ELISA法读取荧光强度值。

4.结果稳定，重复性高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和分数按重量计算。

通用方法和材料

主要试剂：

主要仪器：

试验材料：

细粒棘球绦虫cDNA、大肠杆菌DH5a、Rosetta-gami(DE3)pLysS感受态细胞、质粒pET-28a、评估用细粒棘球蚴病人血清和健康人血清、囊液粗抗原(HCF)、重组AgB1抗原均由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供。

实施例1：细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(EgCystatin)基因的克隆

1.1EgCystatin基因的扩增：

1.1.1目的基因引物设计：

根据EgCystatin的核酸序列(GenBank登陆号:LK028576)，利用PrimerPremier 5软件设计引物：

EgCystatin-F:5’-AATGGGTCGCGGATCCTGCAGACAGCAAGAGCG-3’(SEQ IDNO.:3)，斜体为与载体同源序列，下划线为XhoI酶切位点。

EgCystatin-R:5’-GGTGGTGGTGCTCGAGTTATAGGGCTGTGGGGTCTT-3’(SEQ IDNO.:4)，斜体为与载体同源序列，下划线为BamHI酶·切位点(上海华大公司合成)。

1.1.2PCR扩增目的基因：

以细粒棘球绦虫cDNA为模板，进行PCR扩增目的基因，PCR反应体系如下：

dNTP Mixture(2.5mM each)	2.0μl
		5x Buffer	5.0μl
Template DNA	1.0μl
		Primer F	1.0μl
Primer R	1.0μl
		DNA Polymerase	1.0μl
ddH2O	9.0μl
		总体积	20.0μl

反应条件如下：

PCR产物使用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳，130V，约30min。结果如图1所示。PCR结果显示，约768bp处有一条清晰的目的条带，与预期片段的大小相符，表明成功扩增出EgCystatin目的基因。

1.2目的基因纯化：

采用QIAGEN公司的胶回收试剂盒对PCR扩增的目的基因进行纯化，步骤如下：

(1)电泳结束后，用干净、锋利的刀片将DNA目的片段从琼脂糖凝胶上切割下来。

(2)将切割下来的凝胶块捣碎置于离心管中并称重，加入3倍于凝胶体积的Buffer QG。

(3)将离心管置于50℃水浴中孵育10min，为加速凝胶溶解，每隔2～3min将离心管取出上下颠倒混匀。

(4)待凝胶完全溶解后，观察离心管内液体颜色是否与Buffer QG未溶胶前的颜色基本一致；若管内液体变为橙色或紫色，需加入10ul 3M的醋酸钠(pH5.0)调节pH值。

(5)向离心管中加入1倍凝胶体积的异丙醇并混匀。

(6)试剂盒中的QIAquick spin column置于2ml收集管中；将离心管中的液体加入QIAquick spin column中，13000rpm，离心1min，弃滤液。

(7)将QIAquick spin column置回原离心管中，加入500ulBufferQG,13000rpm离心1min，弃滤液。

(8)向QIAquick spin column中加入750ul Buffer PE洗柱，静置2～5min，13000rpm离心1min，弃滤液。

(9)于13000rpm，再次离心2min，以除去残留的Buffer PE。

(10)将QIAquick spin column置于新的1.5ml离心管中；加入30ulBufferEB于QIAquick spin column的膜中央，静置4min，13000rpm，离心1min，收集洗脱液，保存于-20℃。

(11)用琼脂糖凝胶电泳检测回收效率，并估算DNA片段的浓度。

实施例2：目的基因重组质粒的构建

2.1制备空载质粒pET-28a：

将pET-28a质粒的载体菌(Novagen)涂板，PCR鉴定单菌落后提取质粒，双酶切使质粒线性化，操作如下：

(1)将1μl保种载体菌液用500μl ddH₂O稀释，吸取100μl涂板至Kana抗性的LB固体培养基上。37℃放置约1h至表面液体吸收，倒置平板，37℃培养16h。

(2)随机挑取4个单菌落，分别吹打至2μl LB培养液中，取3μl作为模板，进行PCR验证，体系如下：

Template DNA	3.0μl
		Primer F(10μM each)	1.0μl
Primer R(10μM each)	1.0μl
		2×MasterMix	12μl
ddH2O	8μl
		总体积	25.0μl

反应条件：

反应完毕后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(2μl EB替代物/40ml)，130V，25min。

(3)将PCR鉴定正确的菌液加入5ml Kana抗性LB培养液中，混匀后置于37℃摇床，200rpm/min，振荡培养12-16h。

(4)依据Axygen质粒DNA小量提取试剂盒说明提取pET-28a载体，操作如下：

①取约4ml过夜培养的菌液，12 000×g，1min离心，弃去上清；

②加入250μl Buffer S1，使细菌沉淀悬浮，并吹打均匀且无小的菌块残留；

③加入250μl Buffer S2，上下温和翻转4-6次，均匀混合从而使菌体充分裂解。此过程不超过5min；

④加入350μl Buffer S3，上下温和翻转混合6-8次，12 000×g，10min离心；

⑤将④中离心上清转移到制备管(制备管置于离心管内)，12 000×g，1min离心，弃去滤液；

⑥重新将上述制备管置于离心管，加入500μl Buffer W1，12 000×g，1min离心，并弃去滤液；

⑦重新将上述制备管置于离心管，加入700μl Buffer W2，12 000×g，1min离心，弃去滤液。该步重复一次。

⑧重新将上述制备管置于离心管，12 000×g，1min空转离心；

⑨将制备管置于新的1.5ml离心管中，于制备管中央加入30μlEluent，室温放置1min，12 000×g，1min离心。

⑩测定质粒浓度。

2.2空载质粒pET-28a的双酶切：

(1)将步骤(4)中抽提的质粒进行Xho I/BamH I双酶切：

(2)参照E.Z.N.A.Ultra-Sep Gel Extraction胶回收产物试剂盒说明书纯化双酶切后的质粒产物，操作如下：

①琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段。

②片段完全分离后，在紫外灯下迅速切取所需条带，DNA在紫外灯下爆光时间不超过30s。

③称取凝胶块的重量，按照每1g凝胶加入1ml Binding Buffer对应量，加入适量体积的Binding Buffer，55-60℃水浴至凝胶完全溶解(约7-10min)。每隔2-3min振荡一次。

④把HiBind DNA柱子套在2ml收集管。

⑤将DNA/凝胶混合液转移至套在2ml收集管的HiBind DNA柱子中，10,000×g离心1min。

⑥倒去滤液，把柱子装回收集管中。

⑦把柱子重新装回收集管，加入300ul Binding Buffer，按上述条件离心，弃去滤液。

⑧把柱子重新装回收集管，加入700ul SPW Wash Buffer，按上述条件离心，弃去滤液。注意：使用前Wash Buffer必须用无水乙醇稀释。可重复此步骤一次。

⑨弃去滤液，把柱子重新装回收集管，13 000×g离心空柱2min以甩干柱子基质。

⑩把柱子装在干净的1.5ml离心管上，加入30-50μl，65℃预热的Elution Buffer到柱子基质上，室温静置2min。13 000×g离心2min洗脱出DNA。

实施例3：重组质粒的构建与鉴定

3.1重组质粒的构建与鉴定：

使用HD Cloning Kit对1.1扩增成功的基因进行无缝克隆。步骤如下：

(1)于5μl PCR产物中加入2μl Cloning Enhancer。

(2)将上述混合物置于PCR仪中，首先37℃反应15min，然后80℃反应15min。

(3)克隆反应体系如下：

(4)将上述配好的反应体系放入PCR仪中，37℃孵育15min，50℃孵育15min后，取出放冰上。

(5)将上述体系加至含100μl DH5a感受态细胞的离心管中，缓慢吹打3～5次，冰浴30min。

(6)装有DH5a感受态细胞的离心管42℃水浴60s，然后快速冰浴2min。

(7)向每管DH5a感受态细胞中加入900μl不含抗性的LB培养基，混匀后置于37℃，150rpm/min震荡培养45min。

(8)5 000×g离心30s，取800μl上清，吹打混匀沉淀分别涂板至卡那霉素抗性的LB固体培养基上。37℃正置1h至液体吸收，倒置平板，37℃过夜培养。

(9)每个平板随机挑取单菌落，至于20μl LB培养液中，吸取3μl作为模板进行PCR验证，反应体系如下：

Template	3.0μl
		T7	1.0μl
T7ter	1.0μl
		2×MasterMix	12.5μl
ddH2O	9.5μl
		总体积	25.0μl

反应条件如下：

PCR反应产物使用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳130V约30min。其结果显示成功克隆出目的基因。如图2所示。

(10)将条带大小正确的菌液加至3ml含卡那霉素的LB培养液中，37℃，200rpm/min振荡培养过夜。

(11)取700μl菌液并加300μl 50％甘油保种。

3.2抽提重组质粒及鉴定：

本研究采用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒(Axygen，美国)，具体操作过程如下。

(1)取约4ml过夜培养的菌液，12 000×g，1min离心，弃去上清。优化一：每一重组质粒对应的菌液平行两管。

(2)加入250μl Buffer S1，使细菌沉淀悬浮，并吹打均匀且无小的菌块残留。

(3)加入250μl Buffer S2，上下温和翻转4-6次，均匀混合从而使菌体充分裂解。

(4)加入350μl Buffer S3，上下温和翻转混合6-8次，12 000×g，10min离心。

(5)将(4)中离心上清转移到制备管(制备管置于离心管内)，12 000×g，1min离心，弃去滤液。优化二：每一重组质粒对应两管菌液裂解后的离心上清转移至同一制备管。

(6)重新将上述制备管置于离心管，加入500μl Buffer W1，12 000×g，1min离心，并弃去滤液；

(7)重新将上述制备管置于离心管，加入700μl Buffer W2，12 000×g，1min离心，弃去滤液。该步重复一次。

(8)重新将上述制备管置于离心管，12 000×g，1min空转离心。

(9)将制备管置于新的1.5ml离心管中，于制备管中央加入30μlEluent，室温放置1min，12 000×g，1min离心。

(10)测定质粒浓度并送公司测序验证插入片段序列是否正确，测序分析结果表明插入片段序列正确，成功构建重组质粒pET-28a-EgCystatin。

实施例4：重组质粒在E.coli中的诱导表达及鉴定

4.1重组质粒pET-28a-EgCystatin在E.coli中的诱导表达及鉴定

4.1.1重组质粒的诱导表达及鉴定：

(1)将测序正确的重组质粒pET-28a-EgCystatin约40ng转化至大肠杆菌Rosetts-gami(DE3)pLysS感受态细胞中37℃培养过夜(转化方法同实施例3.1.3)。

(2)次日，随机挑取3个单菌落接种于3ml LB(含卡那霉素65μg/ml，四环素12.5μg/ml，氯霉素34μg/ml)中，37℃，180rpm，培养至A₆₀₀约接近0.8-1.0。

(3)取出300ul加700ul甘油作为菌种，再取1ml作为诱导前对照，剩余菌液中加终浓度为0.7mM的IPTG进行诱导，37℃，200rpm，继续培养4h。

(4)将诱导前和诱导后菌液各取10μl，加入2X SDS-PAGE上样缓冲液10μl，混匀后于100℃煮沸5min变性。每个样品中加入15μl的样品，进行SDS-PAGE分析，分离胶12％，浓缩胶5％，凝胶配方如下：

12％分离胶

蒸馏水	1.3ml
		30％Acr-Bis(1:29)	1.7ml
1M Tris pH 8.8	1.9ml
		10％SDS	0.05ml
10％过硫酸铵	0.05ml
		TEMED 0.002	0.05ml
总体积	5.0ml

5％分离胶

电压设置为：分离胶80V，30min；浓缩胶120V，60min。取下凝胶后用染色液液染色1小时，再用脱色液脱色至蛋白条带清晰可见。

(5)如图3A所示，经IPTG诱导表达后较诱导前的菌体出现了一条分子量约36kDa的清晰表达条带，与预期蛋白大小相符，即为重组质粒pET-28a-EgCystatin表达蛋白。

4.1.2重组蛋白溶解性鉴定：

(1)将确定已有表达蛋白的菌种涂板(含卡那霉素65μg/ml，四环素12.5μg/ml，氯霉素34ug/ml)37℃过夜培养。

(2)次日，挑取单菌落接种到50ml LB培养基(含卡那霉素65μg/ml，四环素12.5μg/ml，氯霉素34μg/ml)中，37℃，165rpm过夜复活菌种。

(3)次日，按10％的接种量将复活菌种转接至500ml LB培养基(含卡那霉素65μg/ml，四环素12.5μg/ml，氯霉素34μug/ml)中，37℃，165rpm培养至A₆₀₀达到0.8-1.0时用0.7mM的IPTG，于20℃，190rpm进行低温诱导20h。

(4)将诱导后菌体于4℃，5000rpm，离心20min，弃上清，沉淀用20ml1xPBS重悬后再次4℃，8000rpm，离心20min后收集菌体-25℃冻存备用。

(5)向3ml菌液收集的菌体沉淀中加50μlBugBuster蛋白抽提剂(Novagen)和核酸酶(加1‰的量)，充分重悬沉淀后置摇床上室温裂解1h。

(6)将细菌裂解液于4μl，12000rpm，离心10min分上清和沉淀。沉淀用适当体积的1xPBS重悬，分别取出5μl上清和重悬的沉淀与2xSDS-PAGE上样缓冲液混匀后进行SDS-PAGE胶验证表达蛋白的溶解性，结果显示重组蛋白为可溶性表达。如图3A所示(箭头所示为目标蛋白)。

实施例5：重组蛋白的纯化

5.1重组蛋白的纯化：

(1)取步骤4.1.2的(4)中收集的菌体沉淀，加入蛋白酶抑制剂，用Tris-HCI缓冲液(pH 7.4)充分重悬沉淀后超声裂解：超声3s，间隔6s，共10min。

(2)将裂解液于4℃，13000rpm，离心45min，收集上清并过0.22umol滤膜。

(3)采用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，分别以基础缓冲液(20mmol/LTris-HCl，300mmol/L氯化钠，pH＝7.4)加50mmol/L和500mmol/L咪唑洗脱目的蛋白，收集每次洗脱穿出液。

(4)将收集的纯化蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。如图3B所示，其结果显示纯化效果达90％以上。

5.2纯化蛋白浓度测定：

采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度：

(1)标准曲线的绘制：用1x PBS稀释BSA标准蛋白(1mg/ml)，按1/15mg/ml，2/15mg/ml，1/5mg/ml，4/15mg/ml，1/3mg/ml,和空白做对照绘制标准曲线。

(2)待测样品稀释：将待测样品用PBS稀释至1:3、1:15、1:20。

(3)将上述已稀释的标准蛋白溶液和待测样品加到96孔聚苯乙烯酶标板，每孔加15ul样品，再加入285ul考马斯亮蓝溶液并混匀室温孵育室温孵育5-10min。

(4)用紫外分光光度度计于595nm处检测其吸光度。

(5)根据图4所示的标准曲线计算出样品蛋白浓度为0.159mg/ml。

实施例6重组纯化蛋白的抗原性鉴定：

6.1重组EgCystatin抗原的ELISA评估：

(1)采用包被液稀释重组EgCystatin抗原至1μg/ml，囊液粗抗原至10μg/ml，AgB1多肽抗原至2.19μg/ml，稀释后的抗原分别包被96孔酶标板，100μl/孔，4℃过夜。

(2)次日，用PBST洗板3次，每次5min，再加入2％BSA，100μl/孔，37℃，封闭2小时。

(3)用PBST洗板3次，每次5min，然后加入1:100稀释的棘球蚴病人血清和正常人血清，100μl/孔，37℃，反应1小时。每板同时设一个阳性对照、阴性对照和空白对照。

(4)用PBST洗板3次，每次5分钟，然后加入1:10000稀释的HRP标记的羊抗人IgG抗体(Sigma)100μl/孔，37℃，反应1小时。

(5)用PBST洗板3次，每次5分钟，后加入100μl/孔的TMB底物溶液(避光)，室温显色后加2M浓硫酸，100μl/孔，终止反应。

(6)用酶标仪读取450nm的数值。

(7)以正常人血清A₄₅₀平均值加2倍标准差(M+2×SD)为阈值(Cut off)，计算重组抗原蛋白的敏感性，特异性及约登指数(即正确指数)。其中，敏感性＝(真阳性血清数/病人血清数)×100％；特异性(特异性＝真阴性血清数/正常人血清数)×100％；约登指数(即正确指数)＝灵敏度+特异度-1；交叉反应性＝(真阳性血清数/囊虫病人血清数)×100％。

(8)检测结果如图5和表1所示。

表1重组EgCystatin,EgAgB1及囊液抗原(HCF)ELISA检测结果

重组EgCystatin的ELISA检测Cut off为0.07，敏感性为95％，特异性为96％，约登指数0.91；囊液粗抗原(HCF)ELISA检测Cut off为0.22，敏感性为97％，特异性为98％，约登指数0.95；EgAgB1多肽抗原ELISA检测Cut off为0.106，敏感性为69％，特异性为96％，约登指数0.65。EgCystatin的ELISA检测效能与囊液粗抗原接近，显著优于AgB1。

(9)与囊虫病交叉反应结果如图6和表2所示。

表1重组EgCystatin及囊液抗原(HCF)交叉反应的检测结果

抗原名称	与囊虫的交叉反应
		EgCystatin	26％
HCF	70％

结果显示，重组EgCystatin的ELISA检测Cut off为0.321，与囊虫交叉反应26％；囊液粗抗原(HCF)ELISA检测Cut off为0.22，与囊虫交叉反应70％。结果表明，EgCystatin与囊虫病的交叉反应显著低于粗囊液抗原。

对比例1

钙网蛋白(Calreticulin，CRT)是内质网主要的钙结合蛋白之一。存在于除红细胞之外的所有细胞中。结合钙的能力极强。由于钙网蛋白的基因组成和氨基酸序列高度保守，提示其在维持细胞功能中具有重要地位。最近几年研究发现，钙网蛋白与寄生虫感染免疫有密切关系，例如包括抗凝血作用，参与宿主免疫应答，参与宿主自身免疫，进行免疫逃避等重要功能。

本发明人除对本发明中提到的EgCystatin,HCF,EgAgB1进行了ELISA评估外,还对包括细粒棘球绦虫的钙网蛋白基因(GenBank登陆号:EF587757.1)在内的几十种蛋白采用本发明中提及的克隆、表达方法进行了重组蛋白的制备，并获得了电泳纯度≥90％重组蛋白。

采用与本发明相同的血清样本对这些不同的重组的细粒棘球绦虫蛋白进行分析，结果表明绝大多数候选蛋白都缺乏足够的灵敏度和特异性。例如，以钙网蛋白抗原为例，其ELISA评价结果显示，该重组抗原对细粒棘球蚴病检测的灵敏度仅为56％，特异性96％，约登指数0.52。与此相反，同一实验条件下EgCystatin的约登指数高达0.91。本发明中的重组EgCystatin抗原的诊断效能远远高于重组的细粒棘球绦虫钙网蛋白做为抗原检测细粒棘球蚴病的诊断效能。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Echinococcus granulosusCystatin,EgCystatin)或其基因、或其检测试剂的用途，其特征在于，(i)用于制备细粒棘球绦虫(或细粒棘球蚴)的阳性抗原；和/或(ii)用于制备诊断细粒棘球绦虫(或细粒棘球蚴)的试剂或试剂盒。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂EgCystatin选自下组：

(a)如SEQ ID NO.:1所示的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的具有免疫原性的衍生多肽；

(c)与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的同源性≥90％，较佳地≥95％的具有免疫原性的多肽；或

(d)具有免疫原性的多肽(a)-(c)的片段。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的EgCystatin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

4.一种抗体，其特征在于，所述的抗体能与SEQ ID NO.:1所示的多肽特异性结合。

5.一种抗原-抗体复合物，其特征在于，所述的复合物包括：

(i)SEQ ID NO.:1所示的多肽；

(ii)与(i)中的多肽特异性结合的抗体。

6.如权利要求5所述抗原-抗体复合物的用途，其特征在于，它被用于：

(a)制备检测细粒棘球绦虫(或细粒棘球蚴)的试剂或试剂盒；和

(b)用作检测细粒棘球绦虫(或细粒棘球蚴)的阳性对照。

7.一种细粒棘球绦虫(或细粒棘球蚴)检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有一容器，所述的容器中含有细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂或其基因。

8.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶结合液、反应底物和任选的说明书，较佳地，所述的试剂盒还可包括选自下组的组分：反应终止液、样本稀释液、和洗涤液。

9.一种诊断或非诊断性的检测样本中是否感染细粒棘球绦虫(或细粒棘球蚴)的方法，包括步骤：

(1)制备SEQ ID NO.:1所示的细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂作为抗原；

(2)将步骤(1)中得到的抗原与待检测样本接触；

(3)检测样本中是否含有权利要求5所述的抗原-抗体复合物；

其中，若步骤(3)中的样本出现所述的抗原-抗体复合物，则表明所述的样本感染了细粒棘球蚴绦虫(或细粒棘球蚴)。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的样本包括血液样本(包括全血,血清,血浆样本)、组织液样本、尿液样本、唾液样本、粪便样本。