JP5607528B2 - 肝炎患者の血液に見出される核酸およびそれがコードするポリペプチドならびにそれらの利用 - Google Patents
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Description
(1) 配列番号1の塩基配列からなる核酸。
(2) 配列番号1の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸。
(3) 配列番号1の塩基配列において、20アミノ酸以上の長さのタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの塩基配列からなる核酸。
(4) 前記核酸のオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列またはその20アミノ酸以上の長さの断片のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(5) 10塩基以上のヌクレオチド長を有し、配列番号1の塩基配列又はその塩基配列に相補的な塩基配列の部分塩基配列を含み、前記の核酸に特異的にハイブリダイゼーションできるポリヌクレオチド。
(6) 50塩基以下のヌクレオチド長を有する前記のポリヌクレオチド。
(7) 配列番号18〜38のいずれかの塩基配列を含む前記のポリヌクレオチド。
(8) 配列番号1の塩基配列もしくはその相補的な配列またはそれらの部分配列を含む核酸を検出する方法であって、前記のポリヌクレオチドの1種以上をプライマーおよび/またはプローブに使用することを特徴とする方法。
(9) 前記ポリヌクレオチドをプライマーとして使用して前記核酸を増幅することを含む前記の方法。
(10) 前記プライマーとして使用する前記ポリヌクレオチドの組み合わせが、配列番号18と19、配列番号19と20、配列番号21と22、配列番号23と24、配列番号25と26、配列番号27と28、配列番号29と30、配列番号31と32、配列番号33と34、配列番号35と36、及び、配列番号37と38のいずれかである前記の方法。
(11) 第1段階として配列番号18と19の組み合わせをプライマーの組み合わせとして用いた第1増幅を行い、続いて前記増幅の産物を配列番号19と20の組み合わせをプライマーの組合わせとして用いた第2増幅を行うことを含む、前記の方法。
(12) 前記の核酸を含む発現ベクター。
(13) 前記の核酸の導入により形質転換された、前記核酸がコードするポリペプチドを発現する細胞。
(14) 前記の細胞を培養し、培養物から前記ポリペプチドを回収することを含む、前記ポリペプチドの製造方法。
(15) 前記のポリペプチドに対する抗体。
さらに具体的には、上記構造および非構造遺伝子としては、配列番号2〜9の塩基配列のいずれかからなる核酸が挙げられる。上記遺伝子産物としては、配列番号10〜17のアミノ酸配列のいずれかからなるポリペプチドが挙げられる。
2.5×SSC,1%SDS,1×denhardt液(標識プローブを含む)に浸し、65℃、2時間処理する。
3.更に、65℃で一晩保温する。
4.約100mLの2×SSC,0.1%SDS溶液に浸し、室温で浸透する。
5.0.2×SSC,0.1%SDS溶液に換え、65℃、30分保温し、再度溶液を交換して保温する。
6.2×SSCで洗浄し、風乾後、オートラジオグラフィーを行う。
肝機能を表すマーカーであり、輸血用血液のスクリーニング検査の一つとして用いられているALT検査の値が異常でありながら、既知の血液伝播性肝炎ウイルスであるB型肝炎およびC型肝炎ウイルスのスクリーニング検査については結果が陰性であった血液中には未知の肝炎病原体が存在している可能性が高いと考えた。かくして、未知の肝炎病原体を得るための出発材料として、ALT異常/肝炎ウイルスマーカー陰性の血液を選択した。
IV-3(リバースプライマー):CTI CCM gTg CgI CCI CgS CgY Tg(配列番号41)
III R-2(リバースプライマー):CCI ggR IIg TIg CIg TRg C(配列番号42)
ヘリカーゼ遺伝子検出用プライマーを用いて、500例のALT異常ヒト血液検体についてヘリカーゼ遺伝子(未知病原体候補の遺伝子断片)の増幅を試みた。
図2に、本発明の遺伝子配列を決定したプライマーウオーキング法の概略を示す。<2>により決定された、未知病原体候補の遺伝子配列に基づき、複数のフォワードプライマー(A、B、C)およびリバースプライマー(D、E、F)を作製した。これらプライマーを、DNA Walking SpeedUP Premixキット-II(Seegene)と共に、キット添付の取り扱い説明書に従って使用し、まだ決定されていない未知病原体候補の遺伝子配列(図2中では未知のSeqと表示)を決定した。具体的には、キット付属のプライマー1とプライマーAを用い、未知病原体候補遺伝子断片が増幅された核酸分画を鋳型として核酸(DNA)増幅を実施し(1s t PCR)、次にこの1s t PCRで増幅されたDNAを鋳型として、キット付属のプライマー2とプライマーBを用いて2回目のDNA増幅(2nd PCR)を行い、更にこの2nd PCRで増幅したDNAを鋳型に、キット付属のプライマー3とプライマーCを用いて3回目のDNA増幅(3r d PCR)を行う。各増幅で得られたDNAをゲル精製し、上記の配列決定換作により増幅されたヌクレオチドの配列を決定する。この作業を、新たな配列が決定されなくなるまで繰り返し実施し、未知病原体候補遺伝子の全核酸配列(配列番号1:以下発明の核酸配列と言う)を決定した。1st PCR、2nd PCR、および3rd PCRの反応溶液の組成および反応条件は次の通りであった。
実施例1において明らかとなった核酸配列に基づいて複数のポリヌクレオチドを作成し、プライマーとして使用可能であるか検討した。具体的には、配列番号18〜39のオリゴヌクレオチドを合成し、配列番号18と19、19と20、22と23、24と25、26と27、28と29、30と31、32と33、34と35、36と37、38と39の組み合わせについて、発明の核酸配列の増幅能力について試験し、これらが同等に使用できることを確認した。試験の条件は図3のとおりであった。従って、これらのプライマーを用いるPCRにより本発明の核酸配列を検出できることが確認された。
本発明の核酸配列が、原因不明肝炎の病原体に由来するものであれば、正常人には検出されず、原因不明の肝炎症例には検出されることが期待された。発明の核酸配列の臨床有用性を検証するために、正常人、非A、非B、非C肝炎患者の検体、および既知ウイルス性肝炎(HBVおよびHCV)患者、ならびに肝疾患である脂肪肝、胆汁うっ滞型肝炎、原発性胆汁性肝炎、アルコール性肝炎、およびアルコール性肝硬変患者の検体(血漿)について、実施例2で確立した核酸配列検出法(使用プライマー:配列番号18及び19(1st PCR)と20及び21(2nd PCR))を用いて本発明の核酸配列が存在するか調べた。結果を下表に示す。
(1)逆転写の可否
検体からの核酸抽出はExR&Dスマイテストキット(医学生物研究所)を用いた。血漿100μLにキットのI液(酵素溶液)15μL,II液(検体希釈液)380μL、およびIV液(共沈剤溶液)5μLを加えて55℃で30分間インキュベーションした。次にIII液(蛋白質溶解液)250μLを加えて55℃で15分間インキュべーションした後、イソプロパノール600μLを加えて氷中で10分間インキュべーションした。終了後、15,000rpmで10分遠心し、沈殿に75%エタノールを600μL加えた。再度15,000rpmで10分遠心し、沈殿を乾固した。乾固した沈殿に蒸留水を30μL加えて溶解した。核酸抽出後、最終濃度10U DNaseと最終濃度10mMマグネシウムを加え、37℃で30分間処理した。処理液にフェノール:クロロホルム(1:1)混合液50μLを加え、撹拌し、15,000rpmで15分遠心し、上清に1/10容積の8M酢酸アンモニウムと2.5倍容積のエタノールを添加後、−80℃で20分間静置し、15,000rpmで20分の遠心を行い沈殿を核酸とし、回収した。得られた核酸に蒸留水20μLを加えた。核酸溶液10μLに0.1M DTTを2μL、10mMのdNTP 1μL、RNA分解酵素阻害剤40U/μL(Rnasin,PROMEGA 社)を1μL、逆転写酵素 200U/μL(SuperScriptII,GIBCO−BRL社)を1μL加え42℃で50分間反応させcDNA合成を行った。さらに1stPCR反応を行った後、ゲル電気泳動により目的増幅産物を検出した。結果は、増幅産物は検出されなかった。よって目的の核酸はRNAでななく、DNAと判断した。
血漿100μLに最終濃度8U Cloned DNase1(TaKaRa)を4μLと最終濃度10mMマグネシウムを加え、37℃で30分間処理した。対照として血漿ではなく抽出したDNAをDNase1処理したものをおいた。処理後検体からの核酸抽出はExR&Dスマイテストキット(医学生物研究所)を用いて次ぎのように行った。血漿100μLにキットのI液(酵素溶液)15μL、II液(検体希釈液)380μL、およびIV液(共沈剤溶液)5μLを加えて55℃で30分間インキュべーションした。次にIII液(蛋白質溶解液)250μLを加えて55℃で15分間インキュベーションした後、イソプロパノール600μLを加えて4℃で10分間インキュベーションした。終了後、15,000rpmで10分間遠心分離し、沈殿に75%エタノールを600μL加えた。再度15,000rpmで10分の遠心を行い、沈殿を乾固した。乾固した沈殿に蒸留水を30μL加えて溶解した。溶解した核酸の10倍の希釈系列を作りエンドタイターを測定し。1stPCRの条件で、配列番号18と19のプライマーを用い、2ndPCRには配列番号20と21を用いた。結果は、DNase未処理とDNase処理検体はエンドタイターは同じ値で検出された。また、DNaseの作用効果を測定するために抽出DNAをDNase処理した検体は増幅が検出されなかった。これはDNaseが十分に作用している結果であった。これらの結果からDNAは血漿中でFreeの状態で存在するのではなく、殻に包まれた状態で存在していると証明できた。
検体からの核酸抽出はExR&Dスマイテストキット(医学生物研究所)を用いた。血漿100μLにキットのI液(酵素溶液)15μL,II液(検体希釈液)380μL、およびIV液(共沈剤溶液)5μLを加えて55℃で30分間インキュべーションした。次にIII液(蛋白質溶解液)250μLを加えて55℃で15分間インキュべーションした後、イソプロパノール600μLを加えて氷中で10分間インキュべーションした。終了後、15,000rpmで10分遠心し、沈殿に75%エタノールを600μL加えた。これを再度15,000rpmで10分遠心し、沈殿を乾固した。乾固した沈殿に蒸留水を45μL加えて溶解した。溶解した後に、10倍濃度のH緩衝液(制限酵素付属緩衝液)(宝酒造製)5μL、SalI(宝酒造製)(20,000U/mL)4μLを添加し、混合して37℃で90分間反応させた。反応液にフェノール:クロロホルム(1:1)混合液50μLを加え、撹拌し、15,000rpmで15分遠心を行い、上清に1/10容積の8M酢酸アンモニウムと2.5倍容積のエタノールを添加後、−80℃で20分間静置した。15,000rpmで20分遠心を行い核酸を沈殿として回収した。対照にはSalI酵素処理しないDNAをおいて検討した。制限酵素切断サイトを挟むプライマーでPCRを行った。結果は、SalI消化DNAは増幅が検出されないが、SalI消化をしないDNAでは増幅が検出された。このことから目的のDNAは制限酵素により切断され、二重鎖DNAであると証明できた。
実施例2でPCR陽性となった臨床検体について塩基配列の検索を行った。抽出した核酸について初めにLong-PCR(LA-taq)を行った。反応液の組成はLA-taq 0.5μL,2×GC(1)バッファー25μL,2.5mM dNTP 8μL,配列番号22のプライマー0.5μL,配列番号39のプライマー0.5μL,抽出核酸液16μLで、以下のPCR条件で行った。
(1) 発現ベクターの構築
配列番号1の塩基配列に存在するORFのうち、5つのORF(No.1 3070〜3669bp No.2 3826〜4293bp No.3 5233〜6117bp No.4 7198〜7872bp No.5 7888〜8610bpのORF)を含むターゲット遺伝子を下記表に示すプライマーにて増幅させ、XbaI、DraI制限酵素サイトをもつ6×His PCR産物を得た。
25cm2フラスコに播いた1.0×106cellsのSf9細胞(日本農産工業社)に発現ベクターDNA約2μg、Linear AcNPV DNA(日本農産工業社) 85ng、及びInsect GeneJuice(Merck社)5μLを含むSf900II(Invitrogen社)200μL を加えた。28℃で6日間程度培養後、培養上清を回収した(コトランスフェクション溶液)。
1.5×106cells/mLになるようにSf900IIで希釈したSF+細胞(日本農産工業社)を250mL三角フラスコに100mL用意した。これに(2)で作製したコトランスフェクション溶液を加え、130回転、28℃で振とう培養した。72時間後に細胞培養液を回収し、3.000×g,4℃で30分間遠心分離を行い沈殿と上清に分画した。
3.000×gで遠心分離された沈殿および上清をNoVagen社のHis Trap Affinity Columnsを使用し、HisTrapの方法に準じて精製した。
実施例6で精製したタンパク質を固定した固相を用いるEIAにより、検体に含まれる抗体を検出した。検体(血漿)としては、下記のものを用いた。
一般検体:ALT値が61IU/L以下の正常者検体
ALT異常者検体:ALT値が61IU/L異常で肝障害がある検体
EIA(抗体の測定)
方法:タンパク質量5μg / ウェルとなるように0.2M Carbonate Buffer pH9.5に希釈し、96穴プレートに4℃で一晩置き固相化する。固相化後、洗浄液(Na2HPO4・12H2O 23.8g、NaH2PO4・2H2O 5.23g、NaCL 42.5g、Tween20 2.5mL /L)で3回洗浄し、20% ウシ血清/PBS 100μLを加え、60分間ブロッキングする。ブロッキング後、3回洗浄し、20% ウシ血清/PBS で50倍希釈した検体を50μL加えて60分間反応させる。反応後、5回洗浄し、20% ウシ血清/PBS で5000倍希釈したanti-Human IgG Peroxidase標識抗体(Jackson Immuno Reseach社)を加えて60分間反応させる。反応後、5回洗浄し、OPDにて発色(暗所30分)発色後、492nmと640nmの二波長にて測定する。
1st PCR :配列番号18 プライマー101-C
:配列番号19 プライマーN101-B
2nd PCR :配列番号20 プライマーKS−2
:配列番号21 プライマーN101-D
現タンパク質に対する抗体が存在することが分かる。
実施例6で発現タンパクNo.1,2,3,4に対して陽性を示す検体3例及び陰性検体3例を用いて、下記の方法によりウイルスの免疫沈降反応を調べた。
配列番号1:KIV9496の塩基配列(9496ヌクレオチド)
配列番号2:推定ORF-Aの塩基配列
配列番号3:推定ORF-Bの塩基配列
配列番号4:推定ORF-Cの塩基配列
配列番号5:推定ORF-Dの塩基配列
配列番号6:推定ORF-Eの塩基配列
配列番号7:推定ORF-Fの塩基配列
配列番号8:推定ORF-Gの塩基配列
配列番号9:推定ORF-Hの塩基配列
配列番号10:推定ORF-Aのアミノ酸配列
配列番号11:推定ORF-Bのアミノ酸配列
配列番号12:推定ORF-Cのアミノ酸配列
配列番号13:推定ORF-Dのアミノ酸配列
配列番号14:推定ORF-Eのアミノ酸配列
配列番号15:推定ORF-Fのアミノ酸配列
配列番号16:推定ORF-Gのアミノ酸配列
配列番号17:推定ORF-Hのアミノ酸配列
配列番号18:プライマー101-C CAACACCgCAATCACAAAgT (3007-3026)
配列番号19:プライマーN101-B AACATTgAAACgTCATgTCC(3445-3464)
配列番号20:プライマーKS-2 CTCgTCTCgTCgTCATCgTA(3082-3101)
配列番号21:プライマーN101-D CATTTgCTCCCgCTggAgATg(3365-3385)
配列番号22:プライマーK-5 AACgATCCggACATCCACCACCA(145-167)
配列番号23:プライマーKIV-21 gCgATCgAggCATggCTCAA(536-555)
配列番号24:プライマー101-1a CTgCAgAgCATCATgCggAg(796-815)
配列番号25:プライマー101-T TCgATCCgCTTTCggTACgT(1383-1402)
配列番号26:プライマーX-2 ACCTAATgAAgACgCCgAAT(2290-2309)
配列番号27:プライマーKS-1 gAgACATggTgTAAgAgTCg(3057-3076)
配列番号28:プライマー101-11 AgTggATgAAgCTggACCTT(3887-3906)
配列番号29:プライマーOp-3 gATCTTgATCCTgTACTCTT(4416-4435)
配列番号30:プライマー101-21 gCgAAAgAggATTCTCgACT(4788-4807)
配列番号31:プライマーX-7 TgggAgTATggAgTCgACAT(5331-5350)
配列番号32:プライマー101-23 TACACTAAAATCgACTCCTCC(6047-6067)
配列番号33:プライマーX-13 ATgAgTTTgAgAACgATCTT(6733-6752)
配列番号34:プライマー101-29 ACCTgCgCCTgAggCTACgA(6888-6907)
配列番号35:プライマーX-17 gCAgATCgTTTCCgTTTggg(7564-7583)
配列番号36:プライマー101-38 AACATCgAAAgATTAAAgAAA(7940-7960)
配列番号37:プライマー101-6R CACgCgATTCCCATATCCCT(8789-8808)
配列番号38:プライマーKIV-14 CgTgTACTAACTATACTgAC(9255-9274)
配列番号39:プライマーKIV-16 CTCAAATTCCATCCgAATAg(9425-9444)
配列番号40:ヘリカーゼ遺伝子検出用プライマーIA-3
配列番号41:ヘリカーゼ遺伝子検出用プライマーIV-4
配列番号42:ヘリカーゼ遺伝子検出用プライマーIII R-2
配列番号43:プライマー1-1F
配列番号44:プライマー1-2F
配列番号45:プライマー1-3F
配列番号46:プライマー1-4F
配列番号47:プライマー1-5F
配列番号48:プライマー1-1R
配列番号49:プライマー1-2R
配列番号50:プライマー1-3R
配列番号51:プライマー1-4R
配列番号52:プライマー1-5R
Claims (7)
- 配列番号1の塩基配列からなる核酸。
- 配列番号1の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸。
- 10塩基以上のヌクレオチド長を有し、配列番号1の塩基配列又はその塩基配列に相補的な塩基配列の部分塩基配列を含み、請求項1又は2に記載の核酸に特異的にハイブリダイゼーションできるポリヌクレオチドであって、配列番号18〜38のいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド。
- 50塩基以下のヌクレオチド長を有する請求項3記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号1の塩基配列もしくはその相補的な配列またはそれらの部分配列を含む核酸を検出する方法であって、請求項3又は4に記載のポリヌクレオチドを下記の組み合わせのいずれかでプライマーとして使用して前記核酸を増幅することを含む方法。
配列番号18と19、配列番号19と20、配列番号21と22、配列番号23と24、配列番号25と26、配列番号27と28、配列番号29と30、配列番号31と32、配列番号33と34、配列番号35と36、及び、配列番号37と38 - 第1段階として配列番号18と19の組み合わせをプライマーとして用いた第1増幅を行い、続いて前記増幅の産物を鋳型とし、配列番号19と20の組み合わせをプライマーとして用いた第2増幅を行うことを含む、請求項5記載の方法。
- 請求項1又は2に記載の核酸を含む発現ベクター。
Priority Applications (1)
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