ES2227525T3 - Virus de la esclerosis multiple. - Google Patents

Virus de la esclerosis multiple.

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ES2227525T3
ES2227525T3 ES94915674T ES94915674T ES2227525T3 ES 2227525 T3 ES2227525 T3 ES 2227525T3 ES 94915674 T ES94915674 T ES 94915674T ES 94915674 T ES94915674 T ES 94915674T ES 2227525 T3 ES2227525 T3 ES 2227525T3
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Jeremy Univ. College London Med. School GARSON
Philip Univ. College London Med. School TUKE
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Biomerieux SA
University College London
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Biomerieux SA
University College London
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

EN LA PRESENTE INVENCION SE PRESENTA UN POLINUCLEOTIDO DE FORMA SUSTANCIALMENTE AISLADA QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS CAPAZ DE HIBRIDARSE SELECTIVAMENTE AL GENOMA DEL VIRUS DE LA ESCLEROSIS MULTIPLE HUMANA (HMSV) O EL COMPLEMENTO DEL MISMO, EN DONDE EL HMSV SE CARACTERIZA POR: (I) UN GENOMA DE ARN RAMIFICADO POSITIVO; (II) DICHO GENOMA COMPRENDE UNO O MAS MARCOS DE LECTURA ABIERTOS (ORF) QUE CODIFICAN PROTEINA(S) O POLIPROTEINA(S); (III) DICHO GENOMA CODIFICA UNA ENZIMA DE TRANSCRIPTASA INVERSA; Y (IV) DICHO GENOMA CONTIENE SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE SON HOMOLOGAS O HIBRIDABLES SELECTIVAMENTE CON CUALQUIERA DE LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS ILUSTRADAS EN LOS N{SUP,OS} DE ID DE SEC 1 A 6.

Description

Virus de la esclerosis múltiple.
La presente invención se refiere a esclerosis múltiple y en particular a un virus asociado con esta enfermedad.
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad degenerativa debilitante que ataca generalmente a sus víctimas un tiempo después de la adolescencia. La enfermedad está asociada con la degeneración de las vainas de mielina que rodean a las células nerviosas, lo que conduce a una pérdida de función motora y sensorial.
No existen curas para la EM e incluso los intentos para mejorar los síntomas y hacer más lento el progreso de la enfermedad han tenido, hasta el momento, un éxito limitado.
Se han expuesto muchas teorías distintas con el transcurso de los años para explicar la causa de la EM, tales como factores ambientales y/o genéticos. También se ha postulado un origen vírico aunque no se han aportado datos concluyentes que apoyen esta teoría por encima de las demás.
Se ha demostrado ahora que la EM está asociada con un retrovirus. Se ha usado material de pacientes de EM, preparado ADNc y amplificado este material por PCR con cebadores oligonucleótidos degenerados basados en una región altamente condensada de genes de polimerasa retroviral (pol). Mediante estos procedimientos se han obtenido secuencias retrovirales de un retrovirus previamente desconocido que se ha llamado virus de la esclerosis múltiple humana (HMSV). Nuestro aislado de HMSV se describe a continuación como HMSV-1.
La presente invención se refiere a ácidos nucleicos tales como ADN o ARN que codifican todo o parte del genoma de HMSV. La invención también proporciona polipéptidos y fragmentos de los mismos de HMSV. La invención proporciona adicionalmente anticuerpos (incluyendo anticuerpos policlonales, monoclonales, de domino único y humanizados) y fragmentos de los mismos (especialmente fragmentos que contienen un sitio de unión a antígeno tal como fragmentos Fab' o F(ab)_{2}) contra tales péptidos.
Los péptidos, anticuerpos y fragmentos de los mismos de la invención pueden incorporarse en kits para el inmunodiagnóstico del HMSV.
Las porciones de las secuencias del ácido nucleico derivadas del HMSV son útiles como sondas para diagnosticar la presencia del virus en muestras y para aislar las variantes de origen natural del virus. Estas secuencias también hacen posible disponer de secuencias de polipéptidos de antígenos del HMSV codificadas dentro del genoma del HMSV y permite la producción de polipéptidos que son útiles como patrones o reactivos en ensayos diagnósticos y/o como componentes de vacunas. Los anticuerpos, policlonales y monoclonales, dirigidos contra epítopos del HMSV contenidos en estas secuencias de polipéptidos también son útiles para ensayos diagnósticos, como agentes terapéuticos, para la selección de agentes antivirales y para el asilamiento del agente HMSV del que se derivan estas secuencias. Además, utilizando sondas derivadas de estas secuencias, es posible aislar y secuenciar otras porciones del genoma del HMSV, dando lugar a otras sondas y polipéptidos que son útiles en el diagnóstico y/o tratamiento, tanto profiláctico como terapéutico, de la EM.
De esta forma, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre cualquiera de
(i) SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 ó 6;
(ii) una secuencia polinucleotídica complementaria a cualquiera de dicha SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
(iii) una secuencia polinucleotídica que es homóloga al menos en un 60% a cualquiera de las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 o a cualquiera de las secuencias complementarias a cualquiera de las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
El polinucleótido de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse selectivamente con el genoma del virus de la esclerosis múltiple humana (HMSV) o el complemento del mismo, donde el HMSV se caracteriza por:
(i) un genoma ARN de cadena positiva;
(ii) dicho genoma comprende uno o más marcos abiertos de lectura (ORF) que codifican proteínas o poliproteínas;
(iii) dicho genoma codifica una enzima transcriptasa inversa; y
(iv) dicho genoma comprende secuencias nucleotídicas que son homólogas o hibridables selectivamente con cualquiera de las secuencias nucleotídicas ilustradas en las SEC ID Nº 1 a 6.
Las secuencias nucleotídicas homólogas a las secuencias de cualquiera de las SEC ID Nº 1 a 6 serán aquellas en las que hay al menos una homología del 60%, por ejemplo, 70, 75, 80, 85, 90 ó 95% de la longitud de la secuencia ejemplificada. Los especialistas en la técnica apreciarán que como las figuras ilustran secuencias de ADNc y el virus es un virus de ARN, las bases representadas por las letras T y U del código genético deben considerarse equivalentes para los propósitos de medición de homología.
De forma similar, una secuencia que se hibrida de forma selectiva con cualquiera de las secuencias de SEC ID Nº 1 a 6 tendrá un grado de homología con la hebra complementaria de la secuencia con la que puede hibridar similar a la homología mencionada anteriormente.
Por consiguiente, las características (i) a (iv) proporcionan una "huella digital" que puede ser interpretada por un especialista en la técnica para identificar si un retrovirus es o no HMSV.
Aunque la presencia de una región de secuencia de cualquiera de las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 indicará una "huella digital" positiva, puede ser deseable confirmar que un virus particular es un cepa de HMSV mediante estudios epidemiológicos confirmatorios.
Por consiguiente, otros aspectos a los que se refiere la invención son: un polinucleótido de HMSV purificado; un polinucleótido de HMSV recombinante o sintético; un polinucleótido recombinante que comprende una secuencia derivada de un genoma de HMSV o de ADNc de HMSV; un polinucleótido recombinante que codifica un epítopo de HMSV; un vector de clonación o expresión recombinante que contiene cualquiera de los polinucleótidos recombinantes anteriores y una célula hospedadora transformada con cualquiera de estos vectores.
La invención también proporciona un polipéptido codificado por la secuencia de polinucleótido de la invención. El polipéptido comprende una secuencia contigua de al menos 10 aminoácidos codificada con el genoma del HMSV, comprendiendo dichos al menos 10 aminoácidos un determinante antigénico de HMSV, donde HMSV se caracteriza por:
(i) un genoma ARN de cadena positiva;
(ii) dicho genoma comprende uno o más marcos abiertos de lectura (ORF) que codifican proteínas o poliproteínas;
(iii) dicho genoma codifica una enzima transcriptasa inversa; y
(iv) dicho genoma comprende secuencias nucleotídicas que son homólogas o hibridables selectivamente con cualquiera de las secuencias nucleotídicas ilustradas en las SEC ID Nº 1 a 6.
Preferiblemente, el polipéptido codifica 15, 20 ó 25 o más aminoácidos.
Otros aspectos a los que se refiere la invención son: un sistema de expresión recombinante que comprende un marco abierto de lectura (ORF) de ADN que tiene una secuencia derivada de un genoma de HMSV o de ADNc de HMSV, donde el ORF está unido operativamente a una secuencia de control compatible con una célula hospedadora deseada, una célula transformada con el sistema de expresión recombinante y un polipéptido producido con la célula transformada.
La invención se puede utilizar para obtener partículas purificadas del HMSV, una preparación de polipéptidos del HMSV purificado; un polipéptido de HMSV purificado; un polipéptido purificado que comprende un epítopo que es identificable inmunológicamente con un epítopo contenido es HMSV.
De esta forma, la invención proporciona un polipéptido en forma sustancialmente aislada que comprende una secuencia contigua de al menos 10 aminoácidos codificada con el genoma del virus de la esclerosis múltiple humana (HMSV), comprendiendo dicha secuencia contigua un determinante antigénico del HMSV, donde el HMSV se caracteriza por:
(i) un genoma ARN de cadena positiva;
(ii) dicho genoma comprende uno o más marcos abiertos de lectura (ORF) que codifican proteínas o poliproteínas;
(iii) dicho genoma codifica una enzima transcriptasa inversa; y
(iv) dicho genoma comprende secuencias nucleotídicas que son homologas o hibridables selectivamente con cualquiera de las secuencias nucleotídicas ilustradas en las SEC ID Nº 1 a 6.
Algunos aspectos incluidos en la invención son un polipéptido de HMSV recombinante; un polipéptido recombinante que comprende una secuencia derivada de un genoma de HMSV o de ADNc de HMSV; un polipéptido recombinante que comprende un epítopo de HMSV; y un polipéptido de fusión que comprenden un polipéptido de HMSV. El polipéptido puede estar unido a un marcador detectable.
También se incluyen en esta invención una composición anticuerpo anti-HMSV que comprende anticuerpos que se unen a dicho determinante antigénico de un polipéptido de acuerdo con la invención que es (a) una preparación purificada de anticuerpos policlonales o (b) una composición de anticuerpo monoclonal.
Otro aspecto de la invención es una partícula de tipo virus que es inmunógena frente a una infección por HMSV que comprende un polipéptido no-HMSV que tiene una secuencia de aminoácidos que puede formar una partícula cuando dicha secuencia se produce en un hospedador eucariótico, y un epítopo de HMSV.
Otro aspecto más de la invención es una sonda polinucleotídica para el HMSV, comprendiendo la sonda un polinucleótido de la invención opcionalmente unido a un marcador detectable.
Los aspectos de la invención que se refieren a kits son aquellos para: analizar muestras para detectar la presencia de polinucleótidos derivados de HMSV que comprende una sonda polinucleotídica que contiene una secuencia polinucleotídica de acuerdo con la invención, en un recipiente adecuado; analizar muestras para detectar la presencia de un antígeno de HMSV que comprende un anticuerpo dirigido contra el antígeno de HMSV a detectar, en un recipiente adecuado; analizar muestras para detectar la presencia de anticuerpos dirigidos contra un antígeno de HMSV comprendiendo un polipéptido que contiene un epítopo de HMSV presente en el antígeno de HMSV, en un recipiente adecuado.
Otros aspectos a los que se refiere la invención son: un polipéptido que comprende un epítopo de HMSV, unido a un sustrato sólido; y un anticuerpo para un epítopo del HMSV, unido a un sustrato sólido.
Otros aspectos a los que también se refiere la invención son: un método para producir un polipéptido que contiene un epítopo del HMSV que comprende incubar las células hospedadoras transformadas con un vector de expresión que contiene una secuencia que codifica un polipéptido que contiene un epítopo del HMSV en condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido; y un polipéptido que contiene un epítopo de HMSV producido por este método.
La invención también se refiere a un método para detectar ácidos nucleicos de HMSV en una muestra que comprende hacer reaccionar ácidos nucleicos de la muestra con una sonda de un polinucleótido de HMSV en condiciones que permitan la formación de un polinucleótido doble entre la sonda y el ácido nucleico del HMSV de la muestra; y detectar un polinucleótido doble que contiene la sonda. El método puede comprender el uso de una reacción polimerasa en cadena (PCR).
También se incluyen ensayos inmunológicos e inmunoensayos en la invención. Estos incluyen un inmunoensayo para detectar un antígeno de HMSV que comprende (a) proporcionar una composición anticuerpo de acuerdo con la invención; (b) incubar una muestra con la composición anticuerpo en condiciones que permitan la formación de un complejo anticuerpo-antígeno; y (c) detectar complejos anticuerpo-antígeno que comprenden los anticuerpos anti-HMSV. La invención también proporciona un inmunoensayo para detectar anticuerpos dirigidos contra un antígeno del HMSV que comprende (a) incubar un polipéptido que comprende un determinante antigénico que se puede unir con dicho anticuerpo anti-HMSV, donde dicho determinante antigénico se codifica con el genoma del HMSV; (b) incubar una muestra biológica con dicho polipéptido en condiciones que permitan la formación de un complejo anticuerpo-antígeno; y (c) detectar complejos anticuerpo-antígeno que comprenden dicho polipéptido.
La invención también proporciona composiciones de vacuna para el tratamiento de la infección por HMSV que comprende un péptido inmunógeno que contiene un epítopo de HMSV, o una preparación inactivada de HMSV o una preparación atenuada de HMSV.
Una aplicación de la invención es una célula cultivada en cultivo de tejido infectada con HMSV. Pueden usarse métodos para cultivar células primarias o inmortalizadas tales como células nerviosas, células gliales o células mononucleares sanguíneas periféricas para preparar células hospedadoras adecuadas para HMSV y tales células pueden transformarse con partículas de HMSV o ácido nucleico.
Otra aplicación más de la invención es su uso en un método para producir anticuerpos, preferiblemente anticuerpos neutralizantes, de HMSV que comprende administrar a un individuo un polipéptido inmunógeno aislado que contiene un epítopo de HMSV en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune humoral y/o celular.
Las SEC ID 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 ilustran las secuencias de ADNc importantes en la invención. Estas secuencias pueden producirse por medios sintéticos conocidos per se.
Definiciones
El término "HMSV", como se usa en este documento, denota una especie vírica que causa o que está asociada con la EM y cepas atenuadas o partículas defectuosas interferentes derivadas de la misma. El genoma del HMSV está compuesto por ARN. Se sabe que los virus que contienen ARN tienen unas tasas relativamente altas de mutaciones espontáneas, es decir, del orden de 10^{-3} a 10^{-4} por nucleótido. Por lo tanto, hay múltiples cepas dentro de la especie HMSV descrita anteriormente. Las composiciones y métodos descritos en este documento permiten la identificación, detección y aislamiento de las distintas cepas relacionadas. Además, también permitirán la preparación de diagnósticos y vacunas para las distintas cepas y tienen utilidad en procedimientos de selección de agentes antivirales de uso farmacológico ya que inhiben la replicación del HMSV.
La información que se proporciona en este documento, aunque se deriva de una cepa de HMSV, en lo sucesivo denominada HMSV-1, es suficiente para permitir a un taxonomista vírico identificar otras cepas que forman parte de la especie. Como se describe en este documento, se ha descubierto que el HMSV es un retrovirus o un virus de tipo retroviral. La morfología y composición de los retrovirus son conocidas.
El HMSV codifica un epítopo que es identificable inmunológicamente con un epítopo en el genoma del HMSV del cual se derivan las secuencias descritas en este documento; preferiblemente, el epítopo se codifica en un ADNc descrito en este documento. Los métodos para determinar la reactividad inmunológica se conocen en la técnica, por ejemplo, ensayo radioinmunológico, ensayo ELISA o hemoaglutinación.
Además de los anteriores, los siguientes parámetros son aplicables, solos o en combinación, para identificar una cepa como HMSV. Como las cepas de HMSV están relacionadas evolutivamente, se espera que la homología total de los genomas a nivel de nucleótidos sea del 60% o mayor, preferiblemente del 65, 70 ó 75% o mayor e incluso más preferiblemente 80, 85, 90 ó 95% o mayor; y además existirán secuencias contiguas de al menos aproximadamente 13 nucleótidos. La correspondencia entre una secuencia genómica de una cepa de HMSV putativa y la secuencia de ADNc de HMSV-1 puede determinarse por métodos conocidos en la técnica.
Debido a la relación evolutiva de las cepas de HMSV, las cepas putativas de HMSV son identificables por su homología a nivel de polipéptido. Generalmente, las cepas de HMSV son homólogas en más del 40%, preferiblemente homólogas en más del 60, 65, 70 ó 75% e incluso más preferiblemente más del 80, 85 ó 90% a nivel de polipéptido. Los procedimientos para determinar la homología de la secuencia de aminoácidos se conocen en la técnica. Por ejemplo, puede determinarse directamente la secuencia de aminoácidos y compararse con las secuencias proporcionadas en este documento. También, por ejemplo, puede determinarse la secuencia de nucleótidos del material genómico del HMSV putativo (normalmente mediante un intermedio de ADNc); puede determinarse la secuencia de aminoácidos codificada en la misma y compararse las regiones correspondientes.
Como se usa en este documento, un polinucleótido "derivado de" una secuencia designada, por ejemplo, el ADNc del HMSV, particularmente una de las ejemplificadas en las secuencias de SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 o de un genoma de HMSV, se refiere a una secuencia polinucleotídica que está compuesta por una secuencia de al menos 6 nucleótidos, preferiblemente al menos 8 nucleótidos, más preferiblemente al menos 10-12 nucleótidos y aún más preferiblemente al menos 15-25 nucleótidos que corresponden, es decir, son homólogos, con una región de la secuencia de nucleótidos designada. Preferiblemente, la secuencia de la región de la que se deriva el polinucleótido es homóloga a una secuencia que es única de un genoma HMSV. Las secuencias complementarias de tales homólogos también forman parte de la presente invención. Puede determinarse si una secuencia es única del genoma por técnicas que conocen los especialistas en la técnica. Por ejemplo, la secuencia puede compararse con secuencias en bases de datos, por ejemplo, Genebank, para determinar si está presente en un huésped no infectado o en otros organismos. La secuencia también puede compararse con las secuencias conocidas de otros agentes víricos, incluyendo aquellos que son agentes retrovirales, por ejemplo, VIH-1 o VIH-2. La correspondencia o no correspondencia de la secuencia derivada con otras secuencias también puede determinarse por hibridación en condiciones rigurosas apropiadas. Las técnicas de hibridación para determinar la complementariedad de secuencias de ácido nucleico se conocen en la técnica.
El polinucleótido derivado no se deriva necesariamente físicamente de la secuencia de nucleótidos mostrada, sino que puede generarse de cualquier forma, incluyendo por ejemplo, síntesis química o replicación de ADN o trascripción inversa o trascripción, que se basan en la información proporcionada por la secuencia de bases en las regiones de las que se deriva el polinucleótido. Además, las combinaciones de las regiones correspondientes a las de la secuencia designada pueden modificarse con técnicas conocidas consistentes con el uso pretendido.
Los polinucleótidos homólogos incluyen aquellos en los que se ha alterado el código genético de un marco abierto de lectura para proporcionar sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos pero con otro uso del codón. La alteración del uso del codón puede introducirse por ejemplo para aumentar la eficacia de la expresión en sistemas de células hospedadoras recombinantes.
De forma similar, un polipéptido o secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de ácido nucleico designada, por ejemplo, una de las secuencias de SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 o de un genoma de HMSV, se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la de un polipéptido codificado en la secuencia o una porción del mismo en el que la porción consiste en al menos 3-5 aminoácidos y más preferiblemente al menos 8-10 aminoácidos y aún más preferiblemente al menos 11-15 aminoácidos que es identificable inmunológicamente con un polipéptido codificado en la secuencia.
Los polipéptidos que son identificables inmunológicamente con polipéptidos de HMSV también pueden ser mimeótopos, es decir, polipéptidos de secuencia no relacionada pero con una estructura tridimensional correspondiente a un epítopo de HMSV, es decir, el mimeótopo puede unirse con un anticuerpo a HMSV.
Un polipéptido recombinante o derivado no se traduce necesariamente de una secuencia de ácido nucleico designada, por ejemplo, una de las secuencias de SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 o de un genoma HMSV; puede generarse de cualquier forma, incluyendo por ejemplo, síntesis química o expresión de un sistema de expresión recombinante o aislamiento de HMSV mutado.
El término "polinucleótido recombinante", como se usa en este documento, significa un polinucleótido de ADNc genómico, de origen semisintético o sintético que, por medio de su origen o manipulación: (1) no está asociado con todo o parte del polinucleótido con el que se asocia en la naturaleza o en forma de biblioteca; y/o (2) está unido a un polinucleótido distinto de al que se une en la naturaleza.
El término "polinucleótido", como se usa en este documento, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ribonucleótidos o desoxiribonucleótidos. Este término se refiere solo a la estructura primaria de la molécula. De esta forma, este término incluye ADN mono- y bicatenario, así como ARN mono- y bicatenario. También incluye formas modificadas, por ejemplo, por metilación y/o capping (coronación), y no modificadas del polinucleótido.
Como se usa en este documento, el término "HMSV que contiene una secuencia correspondiente a un ADNc" significa que el HMSV contiene una secuencia polinucleotídica que es homóloga o complementaria a una secuencia del ADN designado; el grado de homología o complementariedad con el ADNc será el descrito anteriormen-
te.
Los términos "células hospedadoras recombinantes", "células hospedadoras", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares" y otros términos similares denotan microorganismos o líneas celulares eucariotas superiores cultivadas como entidades unicelulares se refieren a células que pueden usarse, o se han usado, como receptoras para vectores recombinantes u otros ADN de transferencia, e incluyen la progenie de la célula original que se ha transfectado. Debe apreciarse que la progencia de una única célula parenteral puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en ARN total o genómico al padre original, debido a mutaciones accidentales o deliberadas. La progenie de la célula madre que es suficientemente similar al precursor para caracterizarse por una propiedad relavante, tal como por la presencia de una secuencia nucleotídica que codifica un péptido deseado, se incluye en la progenie que pretende esta definición y está englobada por los términos anteriores.
Un "replicón" es cualquier elemento genético, por ejemplo, un plásmido, un cromosoma, un virus, que se comporta como unidad autónoma de la replicación del polinucleótido dentro de una célula; es decir, puede replicarse bajo su propio control.
Un "vector" es un replicón al que se acopla otro segmento polinucleótido, de forma que se consigue la replicación y/o expresión del segmento acoplado.
"Secuencia de control" se refiere a secuencias polinucleotídicas que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias de codificación a las que están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador; en procariotas, tales secuencias de control incluyen generalmente promotores, sitios de unión ribosómicos y terminadores; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores, terminadores y, en algunos casos, potenciadores. El término "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder.
"Unida operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos tienen una relación que les permite funcionar de la forma pretendida. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia de codificación se liga de tal forma que se consigue una expresión de la secuencia de codificación en condiciones compatibles con la secuencia de control.
Un "marco abierto de lectura" (ORF) es una región de una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido; esta región puede representar una porción de una secuencia de codificación o una secuencia de codificación total.
Una "secuencia de codificación" es una secuencia polinucleotídica que se transcribe a ARNm y/o se traduce en un polipéptido cuando se pone bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación se determinan con un codón de inicio de la translación en el extremo 5' y un codón de parada de translación en el extremo 3'. Una secuencia de codificación puede incluir, pero sin limitación, ARNm, ADNc y secuencias polinucleótido recombinantes.
El término "identificables inmunológicamente con" se refiere a la presencia de epítopos y polipéptidos que también están presentes y son únicos en el polipéptido designado, normalmente proteínas del HMSV. La identidad inmunológica puede determinarse con unión de anticuerpos y/o competición en la unión; estas técnicas son conocidas por los especialistas en la técnica.
La unicidad de un epítopo también puede determinarse por búsquedas computerizadas de bases de datos conocidas, por ejemplo Genebank, para encontrar las secuencias polinucleótido que codifican el epítopo y por comparaciones entre secuencias de aminoácidos con otras proteínas conocidas.
Como se usa en este documento, "epítopo" se refiere a un determinante antigénico de un polipéptido; un epítopo podría comprender 3 aminoácidos contiguos o juntados por la estructura secundaria o terciaria del polipéptido en una conformación espacial exclusiva del epítopo, generalmente un epítopo consisten en al menos 5 de tales aminoácidos y más normalmente consiste en al menos 8-10 aminoácidos. Los métodos para determinar la conformación espacial de los aminoácidos se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, cristalografía por rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional.
Un polipéptido es "inmunológicamente reactivo" con un anticuerpo cuando se une a un anticuerpo debido al reconocimiento por parte del anticuerpo de un epítopo específico contenido en el polipéptido. La reactividad inmunológica puede determinarse mediante la unión al anticuerpo, más particularmente por la cinética de la unión al anticuerpo y/o por la competición en la unión usando como competidores polipéptidos conocidos que contienen un epítopo contra el cual se dirige el anticuerpo. Las técnicas para determinar si un polipéptido es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo se conocen en la técnica.
Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Para los propósitos de esta invención, el término "anticuerpo", a menos que se especifique lo contrario, incluye fragmentos de anticuerpos enteros que retienen su actividad de unión para un antígeno tumoral diana. Tales fragmentos incluyen fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')_{2}, así como anticuerpos de cadena sencilla. Además, los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos humanizados, por ejemplo, como se describen en el documento EP-A-239400.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden producirse por técnicas de hibridoma convencionales o, en el caso de anticuerpos o fragmentos modificados, por tecnología de ADN recombinante, por ejemplo, por expresión en un vector huésped adecuado de una construcción de ADN que codifica el anticuerpo o fragmento modificado unido operativamente a un promotor. Las células hospedadoras adecuadas incluyen células de bacterias (por ejemplo, E. coli), levaduras, insectos y mamíferos.
Como se usa en este documento, el término "polipéptido inmunógeno que contiene un epítopo de HMSV" incluye polipéptidos de HMSV de origen natural o fragmentos de los mismos, así como polipéptidos preparados por otros medios, por ejemplo, síntesis química o expresión del polipéptido en un organismo recombinante.
El término "polipéptido" se refiere a una cadena molecular de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto; de esta forma, los péptidos, oligopéptidos y proteínas están incluidas en la definición de polipéptido. Este término tampoco se refiere a las modificaciones post-expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. El término no se refiere a la fuente del polipéptido que puede obtenerse por cualquier medio adecuado, por ejemplo, de forma recombinante o sintética.
El término "transformación", como se usa en este documento, se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula hospedadora, independientemente del método usado para la inserción, por ejemplo, absorción directa, transducción o apareamiento-f. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido o alternativamente, puede integrarse en el genoma del huésped.
El término "tratamiento", como se usa en este documento, se refiere a profilaxis y/o terapia.
Como se usa en este documento, la "hebra más" de ácido nucleico contiene la secuencia que codifica el polipéptido. La "hebra menos" contiene una secuencia que es complementaria a la de la "hebra más".
Como se usa en este documento, un "genoma de cadena positiva" de un virus es uno en el que el genoma es monocatenario y codifica un polipéptido vírico. Algunos ejemplos de virus ARN de cadena positiva incluyen Togaviridiae, Coronaviridiae, Retroviridiae, Piconaviridiae y Caliciviridiae.
Como se usa en este documento, "componente del cuerpo que contiene anticuerpos" se refiere a un componente del cuerpo de un individuo que es una fuente de anticuerpos de interés. Los componentes del cuerpo que contienen anticuerpos se conocen en la técnica e incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, plasma, suero, líquido espinal, líquido linfático, secreciones externas de tractos respiratorios, intestinales y genitourinarios, lágrimas, saliva, leche, células blancas de la sangre y mielomas.
Como se usa en este documento, "HMSV purificado" se refiere a una preparación de HMSV que se ha aislado de los constituyentes celulares a los que el virus está asociado normalmente y de otros tipos de virus que pueden estar presentes en el tejido infectado. Las técnicas para aislar virus son conocidas por los especialistas en la técnica e incluyen, por ejemplo, centrifugación y cromatografía de afinidad.
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología que están dentro de los conocimientos del especialista en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Maniatis, Fitsch & Sambrook, MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, VOLUMES I AND II (D.N Glover ed. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait ed, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney ed. 1986); IM-MOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); las series, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively), Mayer and Walker, eds. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London), Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.), and HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLUMES I-IV (D.M. Weir and C. C. Blackwell eds 1986).
Los materiales y procesos útiles de la presente invención se posibilitan con las secuencias nucleotídicas derivadas de secuencias presentes en suero de pacientes con EM.
La disponibilidad de la información de secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 y 6 permite la construcción de sondas de ADN y polipéptidos útiles en el diagnóstico de HMSV por infección de HMSV. Por ejemplo, con estas secuencias es posible sintetizar oligómeros de ADN de aproximadamente 8-10 nucleótidos o mayores, por ejemplo de 15, 18, 20 ó 25 o más nucleótidos uno o más de los cuales son útiles como sondas de hibridación para detectar la presencia del genoma vírico. Estas secuencias también permiten el diseño y producción de polipéptidos específicos de HMSV que son útiles como reactivos de diagnóstico para la presencia de anticuerpos generados en un individuo expuesto a EM. Los anticuerpos de polipéptidos purificados derivados de la información de secuencia también pueden usarse para detectar antígenos víricos en individuos infectados y en otros líquidos y tejidos corporales tales como en la sangre.
El conocimiento de estas secuencias también permite el diseño y producción de polipéptidos que pueden usarse como vacunas contra HMSV y también para la producción de anticuerpos que a su vez pueden usarse para la protección frente a la enfermedad y/o para terapia de individuos infectados con HMSV.
Como se ha identificado un retrovirus como causante de la EM o al menos como asociado a la enfermedad EM, esto abre la posibilidad de tratamiento de pacientes de EM con agentes farmacéuticos que son eficaces en el tratamiento o profilaxis del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Por consiguiente, la invención proporciona:
(i) el uso de un agente farmacéutico que es eficaz en el tratamiento o profilaxis del VIH para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de EM; y
(ii) un método para tratar EM o mejorar los síntomas de la misma que comprende administrar a un individuo con EM una cantidad eficaz de un agente farmacéutico que es eficaz en el tratamiento o profilaxis del HIV.
Los ejemplos de agentes farmacéuticos adecuados incluyen AZT y ddI.
Ejemplos Ejemplo 1
Usando sondas derivadas de las secuencias de SEC ID Nº 1-6 derivadas del Ejemplo 1, se sondean otras muestras de ácido nucleico de individuos con EM, para confirmar la presencia de ácido nucleico de HMSV. Se construyen bibliotecas de tales individuos, partiendo de ácido nucleico total o ARN total. Se usan sondas derivadas de las SEC ID Nº 1-6 para identificar miembros de la biblioteca que contienen las secuencias de HMSV. Los clones positivos se secuencian y las regiones 3' o 5' de los clones se usan como sondas para identificar otros clones HMSV positivos. Usando esta técnica de recorrido de genoma, se deriva la secuencia genómica total de HMSV.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: UNIVERSITY COLLEGE, LONDRES
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 5 GOWER STREET
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: LONDRES
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: REINO UNIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: WC1E 6HA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: GARSON, JEREMY
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: WIDEYER BUILDING, 46 CLEVELAND STREET
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: LONDRES
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: REINO UNIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: W1P 6DB
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: TUKE, PHILIP
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: WIDEYER BUILDING, 46 CLEVELAND STREET
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: LONDRES
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: REINO UNIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: W1P 6DB
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VIRUS DE LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 80 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCCAACAAT TTGCCAGACG TATGTGGGGC AAGCAATTGA ACCTAGACGT AAAAAATTTT 
\hfill
60 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACAGTGTTA CATTGATCAC 
\hfill
80 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGAGATAGCC TCCACCTCTT TGGACAGGCT CTAGCTAGGG ACTTGTGCAC CCTGCAG 
\hfill
57 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 86 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAGGACAAAA TATGTCATGC AAGTTCTTTT CCATAAGTCA CGCTCTGTAC TTACTTATTC 
\hfill
60 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCATATACT ACTGTCCCTT CACATT 
\hfill
86 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCTGAAGCC TATCGCGTGC AGTTGCCGGA TGCCGCCTAT AGCCTC 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 61 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCCCAGGCA TCAGCCCAA GACTTGAGCC AGTCCTCATA CCTGGACACT CTTGTCTTCA 
\hfill
60 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
G 
\hfill
61 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 68 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGCTGAAG GTGCGCTGAA AAATGCCATG GCTTCAGCCA CTTTTAATGA CTTTCCGGCT 
\hfill
60 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTCGATA 
\hfill
68

Claims (14)

1. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre cualquiera de
(i) SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 ó 6;
(ii) una secuencia de polinucleótidos complementaria a cualquiera de dichas SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
(iii) una secuencia polinucleotídica que es homóloga al menos en un 60% a cualquiera de las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 o a cualquiera de las secuencias complementarias a cualquiera de las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
2. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende una secuencia polinucleotídica que es homóloga al menos en un 80% a cualquiera de las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
3. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende adicionalmente un marcador detectable.
4. Un vector recombinante que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.
5. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 unido operativamente a una secuencia de control compatible con una célula hospedadora deseada.
6. Una célula hospedadora transformada con un vector de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5.
7. Un método para detectar la presencia o ausencia en una muestra de ácido nucleico de un agente vírico asociado con la esclerosis múltiple que comprende poner la muestra en contacto con un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para formar un polinucleótido doble entre el polinucleótido y cualquier ácido nucleico en la muestra; y detectar el polinucleótido doble que contiene el polinucleótido.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7 que comprenden una reacción de polimerasa en cadena (PCR).
9. Un polipéptido que comprende una secuencia contigua de al menos 10 aminoácidos codificada con el genoma del virus de la esclerosis múltiple humana (HMSV), siendo el polipéptido un determinante antigénico de HMSV y cuya secuencia contigua está codificada con una secuencia polinucleotídica de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2.
10. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9 codificado con un ORF de cualquiera de las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
11. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10 unido a un sustrato sólido.
12. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 unido a un marcador detectable.
13. Un método de inmunoensayo para detectar la presencia o ausencia de un anticuerpo del virus de la esclerosis múltiple humana que comprende (a) incubar un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende un determinante antigénico que se puede unir con dicho anticuerpo anti-HMSV, codificándose dicho determinante antigénico con el genoma del HMSV; (b) incubar una muestra biológica con dicho polipéptido en condiciones que permitan la formación de un complejo anticuerpo-antígeno; y (c) detectar complejos anticuerpo-antígeno que comprenden dicho polipéptido.
14. Un método de inmunoensayo para detectar la presencia o ausencia del virus de la esclerosis múltiple humana que comprende (a) proporcionar una composición de anticuerpo que se une a un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12; (b) incubar una muestra con la composición anticuerpo en condiciones que permitan la formación de complejo anticuerpo- antígeno; y (c) detectar complejos anticuerpo-antígeno que comprenden los anticuerpos anti-HMSV.
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