CN114106169B - 一种针对抗REGγ全长蛋白的重组单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区。所述的重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示，所述的轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示。本发明将携带重组抗体基因的轻链和重链真核表达质粒共转染到HEK293T细胞，进行表达纯化。用抗REGγC末端区域的单克隆抗体作为对照抗体，利用WesternBlot、细胞免疫荧光、免疫组化技术、ELISA技术对本发明抗体进行性能评价。结果显示本发明重组单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、稳定性强、不依赖动物生产、适合量化生产等优点，为以过表达REGγ蛋白作为疾病的诊断与治疗靶标提供有效的工具。

Description

一种针对抗REGγ全长蛋白的重组单克隆抗体及其制备方法 和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种针对抗REGγ全长蛋白的重组单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界处，以40～50岁年龄组发病率最高，男女之比为2～3：1。发病率占胃肠道肿瘤的第3位。结肠癌主要为腺癌、黏液腺癌、未分化癌。大体形态呈息肉状、溃疡型等。结肠癌可沿肠壁环行发展，沿肠管纵径上下蔓延或向肠壁深层浸润，除经淋巴管、血流转移和局部侵犯外，还可向腹腔内种植或沿缝线、切口面扩散转移。慢性结肠炎患者、结肠息肉患者、男性肥胖者等为易感人群。根据临床诊断经验，结肠癌具有生长缓慢、疾病发展缓慢、潜伏期较长等特点。早期结肠癌患者具有5年以上的生存率高达98％，而仅有10％的末期结肠癌患者生存率超过5年，所以早期结直肠癌患者的成功诊断对于后续成功治疗有着十分重大的临床意义。

肿瘤标志物(Tumor marker)通常是指在恶性肿瘤的发生和增殖过程中由肿瘤本身所产生或是由机体对肿瘤细胞反应异常产生的，反映肿瘤存在和生长的一些物质，如蛋白质、激素、酶、RNA等。肿瘤标志物表达水平持续异常增高，再做影像学或胃肠镜检查，病理切片检查，有助于肿瘤病人的确诊。临床常见的有癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、糖类抗原(19-9)、前列腺特异抗原(PSA)、鳞状细胞癌抗原(SCC)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)等，最新研究发现外泌体、循环DNA也可以作为肿瘤标志物。

REGγ，又被称为11Sγ，PA28γ，PSME3，定位于细胞核内，最初在系统性红斑狼疮病人的血清中发现被鉴定为Ki抗原。11S蛋白酶体激活因子包括REG(PA28)α,β和γ。三种蛋白在序列相似性、细胞内分布、功能等方面有所差异。REGγ通过与20S蛋白酶体的α亚基结合，使底物进入20S的催化室，接触到20S的β基，底物蛋白被降解为肽段。

近来，REGγ-蛋白酶系统作为一个新的通路与人类癌症发生、发展的相关性已逐渐被关注。早前REGγ已被发现在直肠癌血清、甲状腺癌、皮肤癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌及淋巴结肿瘤中高表达，而且生物信息学研究显示REGγ表达水平与肝癌、肺癌、结肠癌分期呈正相关。最近又有研究者提出REGγ可以作为结肠癌早期诊断的血清标记物，用于筛查早期的结肠癌患者。有研究发现了REGγ基因敲除小鼠具有生长迟缓、体型偏小等生理特征，在一些细胞系中REGγ基因敲除后表现为细胞周期受阻，一些周期靶蛋白p53、p16、p21、p19也被证明是受REGγ调控的靶蛋白。此外，REGγ对免疫抑制、促进血管新生、刺激EMP代谢及EMT上皮间充质转化等代谢活动起到重要作用，这些研究证明了REGγ促进细胞增殖而抑制细胞凋亡，因而促进肿瘤细胞的恶性增殖。罗氏公司曾在2006年发表的《Identificationof PSME3 as a Novel Serum Tumor Marker for Colorectal Cancer by CombiningTwo-dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis with a Strictly MassSpectrometry-based Approach for Data Analysis》论文中通过ELISA方法检测肿瘤病人血清中REGγ的含量，指出将REGγ蛋白作为结肠癌的血清学早期检测标志物。随着REGγ新的靶蛋白的不断发现，对肿瘤的病理发生过程及具体的调控机制也不断深入探究，REGγ可能作为癌症新的治疗靶点，可以对REGγ作为癌症预防、诊断、治疗提供有力的工具。

基因工程抗体，又叫重组抗体，从杂交瘤细胞、免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNA，反转成cDNA，以编码抗体的基因为模板，利用重组DNA技术将该基因克隆到表达载体，并转到适当的宿主细胞(如酵母、细菌、哺乳动物细胞)在体外进行表达、折叠、翻译后修饰，形成有功能的抗体，超出了免疫系统的限制。这种方式生产的抗体是特定种类的抗体，包括IgG、IgA、IgM、IgE、IgD。不仅可以生产全长抗体，也可以生产各种片段抗体，如scFv、Fab。

与杂交瘤细胞单抗相比，重组单抗有以下优点：成本上经济高效，适合高通量生产；生产周期短；具有高度的批次间一致性与稳定性；可以避免鼠单抗引发的人体免疫反应；不仅可以生产全长抗体，也可以生产Fab、scFv、sdAb等片段抗体，可以在多种宿主细胞中表达；可以通过抗体工程技术进行人源化、提高亲和力改造；重组抗体不需要使用动物，避免了动物伦理问题；纯化需要的抗原更少等。

针对REGγ蛋白的肿瘤相关研究，甚至到临床水平需要大量的单抗，目前还没有能够用于这方面的重组抗体，而且，目前市面上出现的REGγ抗体为兔源的多克隆抗体。与单克隆抗体相比，其特异性较差，而且容易产生背景和杂带，还存在批次不专一、稳定性差等问题。

发明内容

为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种针对抗REGγ全长蛋白的重组单克隆抗体及其制备方法和应用，本发明所述生产方法特异性强，灵敏度高，可以实现单抗的量产。

本发明的关键在于所使用的真核表达质粒为分泌型，抗体能够在宿主细胞HEK293T细胞中正确折叠，形成有功能的抗体分子，与REGγC末端多肽免疫得到的单抗相比，其灵敏度高，特异性强。

本发明提供了一种抗人REGγ蛋白序列的重组单克隆抗体(抗人REGγ全长蛋白的重组单克隆抗体)，该重组单克隆抗体也可以识别小鼠的REGγ。所述重组单克隆抗体命名为Mc-IgG-REGγ-R2单克隆抗体，所述重组单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区。

其中，所述重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:3所示，或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以上的序列一致性；

其中，所述轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ NO:2和SEQ ID NO:4所示，或与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以上的序列一致性。

在一个优选的实施方式中，所述的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，序列长度为1368bp。

在一个优选的实施方式中，所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在一个优选的实施方式中，所述的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，序列长度为654bp。

在一个优选的实施方式中，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

其中，所述重组单克隆抗体的V区结构分析结果见表1-4。

表1为Mc-IgG-REGγ-R2单克隆抗体重链可变区核酸序列生物信息学分析表；

表2为Mc-IgG-REGγ-R2单克隆抗体轻链可变区核酸序列生物信息学分析表；

表3为Mc-IgG-REGγ-R2单克隆抗体重链可变区氨基酸序列生物信息学分析表；

表4为Mc-IgG-REGγ-R2单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列生物信息学分析表。

其中，所述重组单克隆抗体可以与REGγ高亲和力结合，对REGα无亲和力。

所述重组单克隆抗体识别的抗原决定簇位于的IgG的重链和轻链可变区，所述重组单克隆抗体的全序列均和REGγ的结合有关。

其中，所述重组单克隆抗体为全长抗体，即小鼠免疫球蛋白IgG，由两条完全相同的重链和两条完全相同的轻链通过二硫键连接的呈“Y”形的单体。分子量为150kDa，重链50kDa，轻链25kDa，亚型为κ型。所述重组单克隆抗体识别的抗原决定簇位于IgG的重链和轻链的可变区。

本发明还提供了一种细胞系，高表达、稳定分泌如上所述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体Mc-IgG-REGγ-R2。

其中，所述细胞系为哺乳动物细胞系。

所述哺乳动物细胞系是指由原核表达的GST-REGγ蛋白免疫小鼠后的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合而成的杂交瘤细胞。

其中，所述细胞系为融合杂交瘤细胞，命名为Mc-IgG-REGγ-R2杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No.23040，保藏时间为2021年10月14日，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所述重组单克隆抗体序列来自融合杂交瘤细胞Mc-IgG-REGγ-R2杂交瘤细胞，细胞株外观饱满、分裂旺盛、分泌能力强。

其中，所述融合杂交瘤细胞是由原核表达的GST-REGγ蛋白免疫小鼠后的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合得到。

其中，所述骨髓瘤细胞为SP2/0。

本发明所述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体是根据上述Mc-IgG-REGγ-R2杂交瘤细胞系测序得到的。

上述重组单克隆抗体在实验室是可以用贴壁细胞HEK 293T少量生产，1个10cm的dish转染重链和轻链质粒(各6μg)产值10-20μg。

本发明还提供了一种质粒载体，所述质粒载体含有如上所述的轻链核苷酸序列或重链核苷酸序列；所述质粒载体为分泌型。

本发明提供的重组单克隆抗体表达质粒为pLexm，载体图谱见图10。在商业化载体的基础上在阅读框区进行了改造，N端有信号肽序列为ATGGATATGAGAGTTCCTGCTCAATTGCTGGGGTTGCTCTTGCTCTGGTTCAGTGGGGTGTTGGGG(SEQ ID NO:5)，C端带有6XHis标签，CACCACCACCACCACCAC(SEQ ID NO:6)。轻链和重链序列插入位点在信号肽与6X His标签之间。

本发明还提供了一种抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

(a)通过LIC-PCR技术将如上所述的轻链核苷酸序列和重链核苷酸序列分别构建到真核表达载体pLEXM；

(b)将所述步骤(a)中真核表达载体共转染到HEK 293T细胞表达，经纯化得到抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体。

本发明还提供了由上述方法构建得到的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体。

其中，所述重组单克隆抗体具有高亲和力的优点，能够有效识别REGγ。该抗体特异性强、灵敏度高、稳定性强、不依赖动物生产、适合大规模生产等优点，可以达到能够有效、快速检测REGγ作为靶蛋白的抗体药物研发的目的。

本发明还提供了一种抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体的纯化方法，在宿主细胞HEK293T细胞中稳定地分泌在上清中，用Protein G beads进行亲和层析纯化。

单抗的作用机理与其结构密切相关。抗体又名免疫球蛋白，150000道尔顿的异四聚糖蛋白，由Y型的单体组成，即两条相同重链(H)和轻链(L)通过二硫键连接而成，每条肽链由不同结构域组成。分析序列发现，轻链及重链的N端序列(110个氨基酸)变化较大，形成的结构域为可变区(V区)，重链可变区为VH，轻链可变区为VL。靠近C端的氨基酸序列比较稳定，成为恒定区(C区)，重链恒定区为CH，轻链恒定区为CL。抗体分子的V区和C区的氨基酸组成及顺序不同，其功能也不同。V区各有3个区域的序列高度变化，称为高变区(HVR)，也被称为互补决定区(CDR)，包括CDR1、CDR2、CDR3，轻链VH和重链VL一共6个CDR，V区之外的序列氨基酸组成及排列顺序变化不大，称为骨架区(FR)，VH和VL各含有4个FR区，分别为FR1、FR2、FR3、FR4。每条链的CDR通过FR区紧密靠在一起，与另一条链的CDR相互作用，组成了抗体的抗原结合部位，即表1-4中的V(D)J序列，决定了抗体的特异性，负责识别、结合特异性抗原，发挥免疫功能。而结构是由碱基序列决定。经过杂交瘤测序，可以获得相应的序列，以重组蛋白的方式来稳定获得抗体；本发明的重组抗体可变区序列成功得到了保存，避免了依赖杂交瘤细胞进行生产有抗体分泌能力丢失的风险，或者杂交瘤细胞状态不好乃至死亡的风险。

本发明还提供了一种体外诊断试剂或药物组合物，包括所述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体，或编码所述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体的基因序列，以及药学上可接受的载体或赋形剂。如体外诊断ELISA试剂盒包括96孔酶标板、HRP标记的二抗、REGγ标准蛋白、PBST、1％BSA、TMB显色液、1M硫酸等试剂，为研究高表达REGγ蛋白为检测靶标的疾病提供有效的手段。不依赖动物生产的重组单克隆抗体，能够满足大量生物科学及医学检测的要求，同时为开发ELISA试剂盒提供了原材料。

本发明还提供了一种体外诊断试剂或药物组合物，包括结合剂，其识别上述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体识别的抗原表位；所述抗原表位的物种交叉反应性包括人、小鼠等，其中，所述重组单克隆抗体的片段保留所述完整抗体的抗原结合活性。

本发明还提供了所述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体在制备诊断与治疗以REGγ高表达为靶标的相关疾病的药物和/或产品中的应用。

本发明还提供了一种REGγ重组单克隆抗体在结肠癌患者病理切片检查中的应用，与用REGγC末端多肽免疫得到的小鼠单克隆抗体作为对照，灵敏度得到了较大程度的提高。所述的REGγ蛋白过表达为治疗靶点的相关疾病包括结肠癌、肺癌、甲状腺癌、皮肤癌、乳腺癌、肝癌等。

本发明的有益效果包括：本发明利用LIC克隆的方法构建了抗REGγ全长序列重组单克隆抗体的轻链和重链真核表达质粒，并在HEK 293T细胞中进行表达及纯化。将该重组单克隆抗体与抗REGγC末端多肽单抗进行了特异性和灵敏度比较，结果该重组单克隆抗体特异性强、灵敏度高。期望应用于结肠癌的早期诊断。同时还可以为日后开发特异性强、灵敏度高、效价高的REGγ酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒提供了可能。

附图说明

图1为本发明实施例1中GST-REGγ蛋白原核表达及纯化考马斯亮蓝染色分析结果。M:双色预染蛋白Marker 1:GST-REGγ。

图2为本发明实施例3中免疫小鼠后得到的单克隆抗体经Western Blot检测的效价结果。M:双色预染蛋白Marker 1:HCT 116REGγWT细胞裂解液2:HCT 116REGγKO细胞裂解液3:REGγ蛋白4:REGα蛋白。

图3为本发明实施例4中杂交瘤细胞Mc-IgG-REGγ-R2培养后收集细胞培养基，作为抗体稀释液经Western Blot检测的抗体分泌能力结果。M:双色预染蛋白Marker 1:HEK293T REGγWT细胞裂解液2:HEK 293T REGγKO细胞裂解液3:REGγ蛋白4:REGα蛋白。

图4为重组单克隆抗体Mc-IgG-REGγ-R2质粒在真核细胞HEK 293T细胞中表达后的纯化结果。M:双色预染蛋白Marker 1:纯化后的抗体。

图5为重组单克隆抗体Mc-IgG-REGγ-R2质粒在真核细胞HEK 293T细胞中表达、纯化后经Western Blot检测的效价及特异性结果。M:双色预染蛋白Marker 1:HCT 116REGγWT细胞裂解液2:HCT 116REGγKO细胞裂解液3:REGγ蛋白4:REGα蛋白。

图6为Mc-IgG-REGγ-R2重组单克隆抗体在细胞免疫荧光实验中灵敏度检测结果，即将抗REGγC末端区域的单克隆抗体作为对照，研究REGγ蛋白在结肠癌细胞HCT 116、HT29中定位检测分析。在HCT 116WT、HT29细胞免疫荧光实验结果显示，REGγ表达在细胞核中，DAPI对细胞核染色后可以Merge上，本发明抗体呈现强阳性信号，而抗REGγC端区域单抗则阳性信号弱很多。在HCT 116KO细胞中，均没有REGγ蛋白的定位表达结果。因此证明本发明抗体能够更灵敏识别细胞核中表达的REGγ蛋白。

图7为Mc-IgG-REGγ-R2重组单克隆抗体在免疫组化实验中灵敏度检测结果。即将抗REGγC末端区域的重组单克隆抗体作为对照，研究REGγ在人源结肠癌肿瘤病人组织中定位检测分析。选择的样本是结肠癌四个时期的肿瘤病人石蜡切片，以抗REGγC末端的重组单克隆抗体为对照，本发明抗体与结肠癌肿瘤病人组织中的REGγ蛋白结合的信号明显增强，表现为染色更强，背景清晰，可以明显区分REGγ蛋白在肿瘤组织不同时期的表达情况(图中箭头指示)。之前研究报道过REGγ在癌症早期细胞核染色较浅，细胞核数目少，晚期则染色更深，细胞核较多，本发明抗体的结果与此报道一致。

图8为Mc-IgG-REGγ-R2重组单克隆抗体在酶联免疫吸附法鉴定灵敏度结果。即将抗REGγC末端区域的重组单克隆抗体作为对照，研究相同蛋白浓度包被条件下抗体结合后的显色分析。

图9为REG家族蛋白的氨基酸序列生物信息学分析结果。

图10为pLexm载体图谱。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：GST-REGγ蛋白原核表达及纯化结果

将构建好的pMCSG10-GST-REGγ质粒转化到大肠杆菌BL 21(DE 3)，挑选单克隆后接入5ml LB(含氨苄青霉素)摇菌2h，再接到1L的2YT培养基，待OD值为0.8左右进行低温诱导，条件是0.2mM的异丙基硫代-半乳糖苷(IPTG)，16℃培养12h，180rpm。收集细胞后用预冷的PBS重悬菌液沉淀，低温高压破碎后加入适量GST-Beads，低温孵育2h后用PBS洗涤Beads，再加入含10mM的还原型谷胱甘肽的Tris-HCl(pH8.0)洗脱液进行洗脱。使用截留分子量为30kDa的蛋白浓缩管将收集后的洗脱液进行浓缩，将样品进行SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色。

结果见图1：得到纯度约为80％的GST-REGγ，条带位置大概是55kDa(GST约为27kDa，REGγ约为28kDa)，可以进行免疫小鼠实验，从而制备单克隆抗体。

实施例2：抗REGγ蛋白的单克隆抗体的制备

抗REGγ蛋白的单克隆抗体的制备需要产生杂交瘤细胞，杂交瘤细胞是由经过抗原刺激的B细胞活化后能够产生特异性的抗体，再将B细胞与骨髓瘤细胞融合形成。制备过程如下：

1免疫动物

将原核表达纯化后的GST-REGγ与弗氏佐剂等体积混合，经过乳化后进行免疫8周左右的BALB/C小鼠。第一次免疫是适量GST-REGγ蛋白与弗氏完全佐剂混合，第二次与第三次免疫中适量GST-REGγ蛋白与弗氏不完全佐剂混合，注射方式包括背部皮下多点注射和腹腔注射，最后加强免疫是腹腔注射。

2细胞融合

2.1脾细胞的制备

引颈处死小鼠，在超净台里面剪开腹膜，取出脾脏，放入10mL的RPMI 1640培养基，用镊子挤压纱布上的脾脏直到透明状态，收集培养液于15mL离心管，1000rpm离心4min，再用PBS洗一遍离心，最后用RPMI 1640培养基重悬细胞，计数。

2.2骨髓瘤细胞SP 2/0的制备

选取对数期的骨髓瘤细胞，离心收集后用RPMI 1640培养基重悬，计数。

2.3细胞融合

需要用50％PEG、无血清培养基、10％FBS-RPMI 1640-HAT培养基。骨髓瘤细胞:脾细胞＝1:4-10的比例进行混合，加入融合管，再加无血清培养基，800rpm离心5min，收集细胞。将其放入37℃水浴锅，1min内加入50％PEG，边加边摇晃，加完后混匀1min。逐滴加入无血清培养基，约20ml后1200rpm离心5min。将融合管再放入水浴锅，加入10％FBS-RPMI-1640-HAT培养基，混合细胞后的密度为3x10⁶左右，进行铺板，置于培养箱。5d后用HAT培养基换一半的培养基，7d后用HT培养基取代HAT培养基，待杂交瘤细胞长到孔底面积的1/10，筛选阳性孔。

2.4杂交瘤细胞的克隆

先制备饲养层细胞：颈椎脱臼处死小鼠，在超净台剪开腹部皮肤，用PBS润洗腹部，用5mL PBS注入腹腔，按摩腹部，注射器吸出液体后放入离心管，800rpm离心8min，加入培养基稀释到1x10⁵个/mL，100μL/孔铺板于96孔培养板，放在培养箱培养。

杂交瘤细胞的克隆化：克隆前一天准备好饲养层，选择阳性孔的细胞吹打下来装到1.5Ml EP管，计数。进行有限稀释，浓度为5个/mL、10个/mL和50个/mL，100μL/孔铺板于96孔培养板，即每个孔0.5个、1个和5个放在培养箱培养。待细胞长到孔底1/10时检测。第2次和第3次的克隆是在前一次检测为阳性的前提下进行，直到3次克隆化后检测细胞上清100％为阳性，即此时为阳性的单克隆细胞。

2.5杂交瘤细胞的冻存与扩大培养

为了避免阳性克隆丢失，及时将筛选得到的处于对数期，状态饱满的杂交瘤细胞进行扩大培养和冻存，冻存。

实施例3：Western Blot检测抗REGγ蛋白的单克隆抗体特异性、效价(抗体孵育效果的蛋白免疫印迹实验)

(1)准备好HCT116或者HEK 293T细胞样品，纯化的REGγ和REGα的蛋白样品，加入适量的1×蛋白loading buffer，进行煮沸，使蛋白充分变性。

(2)电泳:向电泳槽中加入配好的1×Running buffer，夹好蛋白胶进行上样。加入双色预染蛋白Marker进行指示。

(3)转膜:配好1×Transfer buffer，加至转膜槽，从下往上按照海绵两层-滤纸三层-蛋白胶-NC膜-滤纸三层-海绵两层顺序放好，加入冰块和适量水，以恒流200mA进行转膜。

(4)封闭:用5％脱脂奶粉37℃摇床上封闭至少1h。

(5)孵育一抗:在NC膜上裁出所需检测的蛋白条带。孵育所要检测的蛋白的抗体，以合适的比例1:1000、1:2000、1:4000用3％BSA稀释好抗体，4℃摇床上孵育过夜。

(6)洗膜:取出抗体，用PBST洗三到四次，每次6min。

(7)孵育二抗:加入抗小鼠荧光二抗，配好后4℃摇床孵育1h。

(8)洗膜:取出抗体，用PBST洗三到四次，每次6min。

(9)扫膜:用Image Studio进行扫膜，检测条带。

结果显示见图2，本发明实施例2制备的抗REGγ蛋白的单克隆抗体经过1：1000到1：4000的梯度稀释，仍可以清晰看到在28kDa处有REGγ的条带，而且不识别REGα，条带单一无杂带。对照组抗体抗REGγC末端单抗在同等抗体稀释度下，条带较浅。说明本发明抗体特异性强、效价高。

实施例4：Western Blot检测杂交瘤细胞抗体分泌能力

培养杂交瘤细胞后收集上清，作为一抗进行孵育，之后扫膜检测。

结果显示见图3，本发明抗REGγ蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞能够持续稳定分泌抗REGγ蛋白的单克隆抗体，条带单一无杂带，杂交瘤细胞分泌的抗体只识别抗原REGγ，不识别REGα。

实施例5：单克隆抗体的序列分析结果

首先培养杂交瘤细胞，Trizol法提取RNA，经反转录成cDNA，扩增并获得重链和轻链可变区，克隆到Pmd18-T载体并测序，最后使用IMGT数据库进行测序结果比对做进一步分析。包括抗体重链及轻链全长序列、V区结构分析、全长序列分析。

结果：重链可变区核苷酸序列结果见SEQ ID NO:1所示；轻链可变区苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。V区结构分析结果见表格1-4。表1为Mc-IgG-REGγ-R2单克隆抗体重链可变区核酸序列生物信息学分析表；表2为Mc-IgG-REGγ-R2单克隆抗体轻链可变区核酸序列生物信息学分析表；表3为Mc-IgG-REGγ-R2单克隆抗体重链可变区氨基酸序列生物信息学分析表；表4为Mc-IgG-REGγ-R2单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列生物信息学分析表。

表1Mc-IgG-REGγ-R2单克隆抗体重链可变区核酸序列生物信息学分析表

表2Mc-IgG-REGγ-R2单克隆抗体轻链可变区核酸序列生物信息学分析表

表3Mc-IgG-REGγ-R2单克隆抗体重链可变区氨基酸序列生物信息学分析表

表4Mc-IgG-REGγ-R2单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列生物信息学分析表

实施例6:单克隆抗体的真核系统表达纯化

(1)根据序列结果分别设计轻链和重链引物，进行LIC-PCR反应。

引物序列为：

VH-F:AGTGGGGTGTTGGGGGAGGTCCAGCTGCAG(SEQ ID NO:39)

VH-R:GTGATGGTGATGGTGATG TTTACCCAGAGACCG(SEQ ID NO:40)

VL-F:AGTGGGGTGTTGGGGGACATTGTGCTGACACAG(SEQ ID NO:41)

VL-R:GTGATGGTGATGGTGATGACACTCATTCCTGTT(SEQ ID NO:42)

PCR程序：

VH(16℃保存)

VL(16℃保存)

(2)内切酶Esp3l处理载体pLexm线性化，37℃5h。

反应体系为

(3)将上述产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，然后进行胶回收，测定DNA浓度。

(4)分别对载体和PCR产物加上粘性末端，程序为

PCR产物体系：

线性化载体体系：

(5)进行连接转化，挑单克隆送测序。

(6)进行无内毒素质粒抽提。

将上述测序获得的杂交瘤可变区序列构建到真核表达载体pLEXM上，然后进行真核表达及纯化。纯化过程为：

(1)培养HEK 293T细胞汇合度为80％时进行转染。

(2)准备转染试剂和质粒，按照DNA:转染试剂＝1μg:3μl比例分别加样，然后把转染试剂加到质粒，静置15min后，逐滴加入细胞培养皿。

(3)48h后收集转染后的293T细胞培养液进行纯化。

(4)处理Protein G beads：取350μl beads置于1.5ml EP管中，加入650μl Q水，1000g，离心10s，3次，将保存Protein G beads的buffer换掉。再加入650μl Na₃PO₄于350μlbeads中，1000g，离心10s，3次，主要用来平衡beads。细胞培养上清加入350μl Protein Gbeads，4℃，摇床孵育4h.

(5)静置30min，待Protein G beads自然下沉，去上清(上清收集待测)，加入Na₃PO₄洗涤beads，3次，1000g，3s。取250μl 0.1M甘氨酸洗脱(洗脱液1ml甘氨酸与50μl HCL)beads，1000g，离心30s，3次，每次10min(洗脱液均收集后待测)。

(6)SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测蛋白纯度

(7)Western Blot检测纯化的重组单克隆抗体活性及效价。

纯化结果见图4，SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测蛋白纯度为80％，效价结果见图5，可以达到1：2000。而且保留了特异性。

实施例7:单克隆抗体的细胞免疫荧光法鉴定灵敏度

为了验证本发明实施例2制备的抗REGγ蛋白的单克隆抗体是否可以用于免疫荧光实验，以抗REGγC端区域单抗为对照，用HT29、HCT 116细胞进行REGγ的定位分析。

(1)细胞在玻片上爬好长满后取出，用预冷的PBS洗3min，洗3遍。

(2)用4％多聚甲醛固定爬片30min，用预冷的PBS洗3min，洗3遍。

(3)滴加0.3％Triton X-100溶液通透10min，用预冷的PBS洗3min，洗3遍。

(4)滴加山羊血清封闭30min，吸水纸吸掉封闭液。

(5)按照1：200比例稀释本发明实施例2制备的抗REGγ蛋白的单克隆抗体，同时以抗REGγ-C端区域单抗为对照，4℃孵育过夜，用PBS洗5min，洗3遍。

(6)避光孵育免疫荧光二抗1h，用PBST洗5min，洗3遍。

(7)滴加PAPI染色5min，PBST洗5min，洗3遍。

(8)滴加抗荧光淬灭剂，将爬片覆盖，用指甲油封片，用荧光显微镜拍照，观察染色结果。

结果见图6，在HCT 116WT、HT29细胞免疫荧光实验结果显示，REGγ表达在细胞核中，DAPI对细胞核染色后可以Merge上，与抗REGγC端区域的单抗相比，本发明实施例2制备的抗REGγ蛋白的单克隆抗体具有较高灵敏度。细胞样品经同种条件处理，两种抗体经过同种浓度的稀释比，在同一曝光强度下拍照对比发现，在HCT 116、HT29细胞样本处理中，均发现本发明抗体呈现强阳性信号，而抗REGγC端区域单抗则阳性信号弱很多，同时在HCT116KO细胞中，均没有REGγ蛋白的定位表达结果。说明了本发明实施例2制备的抗REGγ蛋白的单克隆抗体能够更灵敏识别细胞中的REGγ，并且通过DAPI对细胞核染色的Merge结果来看，REGγ表达在细胞核中，与文献报道的REGγ亚定位结果一致。因此，本发明实施例2制备的抗REGγ蛋白的单克隆抗体具有灵敏度高、特异性强、准确度高等优点。

实施例8:单克隆抗体的免疫组化法鉴定灵敏度

经过大量研究发现，REGγ在结肠癌、甲状腺癌、乳腺癌等人源肿瘤组织内高表达。为了鉴定本发明实施例2制备的抗REGγ蛋白的单克隆抗体是否可以用于检测肿瘤病人样本，以REGγC末端区域单抗为对照，对收集的结肠癌病人的组织进行了REGγ的表达水平分析。

(1)材料收集：人结肠癌肿瘤组织由许昌市中心医院提供，所有对人样本的研究都经过上海长征医院独立委员会批准。

(2)结肠癌肿瘤组织蜡块切片：将组织放在冰块中提前冷却，在石膜切片机上将组织切成厚度为5μm的切片，并在42℃的摊片机中充分展开，将没有褶皱、平滑完整的组织转移到载玻片上，放置于65℃烘片机上烘片至少4小时。

(3)脱蜡：切片依次浸泡于二甲苯II、二甲苯I各10min。再梯度复水：100％无水乙醇、95％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液、75％乙醇水溶液、50％乙醇、ddH₂O水中，各5min。

(4)抗原修复：修复液柠檬酸钠溶液中(1mM，pH 6.0)的烧杯提前在水浴锅中加热到95℃，用铝箔纸封口。将复水后的切片放在95℃的修复20min，然后将整个烧杯放在室温下自然冷却。最后将切片放入PBS中清洗3次，每次3min。

(5)淬灭：将切片放入3％的H₂O₂甲醇溶液(现用现配)中浸泡15min。然后用PBS溶液清洗切片3次，每次3min。

(6)封闭：将组化试剂盒提供的封闭液滴加到组织表面，室温孵育10min。

(7)孵育一抗：将本发明的REGγ单克隆抗体按照1：500的比例用PBS稀释，抗REGγ的C末端的单克隆抗体稀释到相同浓度，向组织表面滴加适量稀释后的抗体，放在湿盒中，4℃孵育过夜。然后将组织切片置于室温下，用PBS洗涤3次，每次2min。

(8)孵育二抗：将组化试剂盒中提供的第二抗体生物素化羊抗小鼠IgG滴加到组织表面，室温孵育10min，用PBS溶液清洗切片3次，每次2min。

(9)加链霉亲和素-HRP：室温孵育10min。用PBS溶液清洗切片3次，每次2min。

(10)DAB染色：避光条件下，将试剂盒中提供的DAB染液滴加到组织表面，5min后显微镜下观察染色情况，将切片放入自来中终止染色反应。

(11)苏木精染色：将上述处理好的切片浸泡于苏木精染液中，2min后取出，放入自来水中清洗干净，然后用75％乙醇水溶液配制的1％HCl分色液中浸泡1sec，立即取出切片并放入自来水中，返蓝15min。

(12)梯度脱水及透明：将蓝化后的切片依次浸泡于50％乙醇水溶液、75％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液、95％乙醇水溶液、100％无水乙醇，各3min，再依次浸泡于二甲苯I和二甲苯II中，各3min。

(13)封片：在切片上滴加适量中性树脂，盖上盖玻片，放置过夜。

(14)拍照：在白光视野下，用20、40倍物镜对成片进行拍照并分析。

组织苏木精－伊红染色

(1)将石蜡切片置于65℃烘箱1h，将玻片放入二甲苯中脱蜡15min，2遍；放入无水乙醇、95％、75％乙醇、50％乙醇各5min；蒸溜水洗2min。

(2)用苏木精染色5-10min，浸自来水3min，用1％盐酸分色10s，蒸馏水再洗涤一遍，返蓝1h以上。

(3)玻片在50％乙醇，75％乙醇，85％乙醇和95％乙醇中各脱水3min。

(4)用伊红染色30s，自来水冲洗2-3遍。

(5)置于无水乙醇和二甲苯(2遍)中各透明3min。

(6)中性树胶封片。

(7)拍照，保存结果并分析。

结果见图7：图7选择的样本是结肠癌四个时期的肿瘤病人石蜡切片，以抗REGγC末端的单克隆抗体为对照，本发明的单克隆抗体与结肠癌肿瘤病人组织中的REGγ蛋白结合的信号明显增强。具体是指在相同的抗体浓度孵育切片，本发明的单克隆抗体染色更强，背景清晰，可以明显区分REGγ蛋白在肿瘤组织不同时期的表达情况。也说明本发明实施例2制备的抗REGγ蛋白的单克隆抗体灵敏度明显高于抗REGγC末端的单克隆抗体，可以明显区分REGγ蛋白在肿瘤组织不同时期的表达情况。研究证明了癌症早期细胞核染色较浅，细胞核数目少，晚期则染色更深，细胞核较多，本发明抗体的结果与此报道一致。

H&E为苏木精-伊红染色实验，Mc-IgG-REGγ-C是指用REGγC末端的13个氨基酸序列(IKRPRSSNAETLY)作为目的抗原肽段免疫得到的鼠单抗、Mc-IgG-REGγ-R2为REGγ全长蛋白免疫得到的鼠单抗。H&E的染色结果能够说明结肠癌肿瘤组织结构的形态，细胞核的位置，细胞大小等，而REGγ表达于细胞核，组织孵育REGγ抗体染色后的结果结合H&E的染色结果可以看出REGγ定位于细胞核中。

实施例9:单克隆抗体的酶联免疫吸附法鉴定灵敏度

以稀释的纯化的蛋白作为包被蛋白，HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-rabbit IgG(H+L)作为二抗。

(1)用pH9.6的碳酸盐包被液稀释标准蛋白，REGγ浓度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、0ng/ml。每孔100μl，将稀释液加入到96孔酶标板，37℃孵育2h。

(2)甩干孔内液体，加入PBST，每孔300μl，清洗3次，每次1min，拍干孔内的液体。

(3)加入BSA 3％浓度进行封闭，200μl/孔，37℃封闭2h，

(4)加入PBST，每孔300μl，洗板三次

(5)加入提前稀释好的单抗，Mc-IgG-REGγ-C、Mc-IgG-REGγ-R2按1：2000稀释，每孔100μl。

(6)加入PBST洗板三次，拍干，加入HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-mouse IgG(H+L)1：10000配置，每孔100μl，37℃孵育1h。

(7)洗板三次，加入底物TMB反应液，每孔100μl。37℃避光反应15min。

(8)每孔加入2M H₂SO₄，每孔50μl。用酶标板读取OD₄₅₀值。

(9)分析数据，做好记录。

设置三个重复求平均值，以蛋白浓度为横坐标，OD₄₅₀为纵坐标，建立折线图。

结果见图8：在相同的REGγ浓度下，以抗REGγC末端的Mc-IgG-REGγ-C单克隆抗体为对照，本发明的单克隆抗体与REGγ蛋白结合的信号明显增强。

实施例10:REG家族蛋白的氨基酸序列生物信息学分析

应用DNAMAN软件对REG家族成员(REGα、REGβ、REGγ)蛋白质氨基酸序列进行生物信息学分析，设计REGγ区别于REGα、REGβ蛋白序列并且最适宜作为抗原的短肽，即位于REGγC末端的13个氨基酸序列(IKRPRSSNAETLY)，以此作为目的抗原肽段，制备了Mc-IgG-REGγ-C单克隆抗体，如图9所示。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东师范大学

<120> 一种针对抗REGγ全长蛋白的重组单克隆抗体及其制备方法和应用

<160> 42

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1368

<212> DNA

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 1

gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggata cacattcact acctatgtta tacactgggt gaagcagaag 120

cctgggcagg gccttgagtg gattggatat gtttatcctt acaatgatgg tacttggtac 180

catgagaact tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcttccag cacagcctac 240

atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggtctg 300

ggctatgatt acccctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360

gccaaaacaa cacccccatc agtctatcca ctggcccctg ggtgtggaga tacaactggt 420

tcctccgtga ctctgggatg cctggtcaag ggctacttcc ctgagtcagt gactgtgact 480

tggaactctg gatccctgtc cagcagtgtg cacaccttcc cagctctcct gcagtctgga 540

ctctacacta tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggccaag tcagaccgtc 600

acctgcagcg ttgctcaccc agccagcagc accacggtgg acaaaaaact tgagcccagc 660

gggcccattt caacaatcaa cccctgtcct ccatgcaagg agtgtcacaa atgcccagct 720

cctaacctcg agggtggacc atccgtcttc atcttccctc caaatatcaa ggatgtactc 780

atgatctccc tgacacccaa ggtcacgtgt gtggtggtgg atgtgagcga ggatgaccca 840

gacgtccaga tcagctggtt tgtgaacaac gtggaagtac acacagctca gacacaaacc 900

catagagagg attacaacag tactatccgg gtggtcagca ccctccccat ccagcaccag 960

gactggatga gtggcaagga gttcaaatgc aaggtcaaca acaaagacct cccatcaccc 1020

atcgagagaa ccatctcaaa aattaaaggg ctagtcagag ctccacaagt atacatcttg 1080

ccgccaccag cagagcagtt gtccaggaaa gatgtcagtc tcacttgcct ggtcgtgggc 1140

ttcaaccctg gagacatcag tgtggagtgg accagcaatg ggcatacaga ggagaactac 1200

aaggacaccg caccagtcct ggactctgac ggttcttact tcatatatag caagctcaat 1260

atgaaaacaa gcaagtggga gaaaacagat tccttctcat gcaacgtgag acacgagggt 1320

ctgaaaaatt actacctgaa gaagaccatc tcccggtctc tgggtaaa 1368

<210> 2

<211> 654

<212> DNA

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 2

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcatgca gggccagcaa aagtgtcaat acatctggct atagttatat gcactggttt 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga gcttccgctc 300

acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 360

atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 420

aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 480

aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 540

agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 600

actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgt 654

<210> 3

<211> 456

<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 3

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Val Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Trp Tyr His Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Asp Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val

115 120 125

Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu

165 170 175

Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala

195 200 205

Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser

210 215 220

Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala

225 230 235 240

Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile

245 250 255

Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val

260 265 270

Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val

275 280 285

Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp

290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln

305 310 315 320

Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp

325 330 335

Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val

340 345 350

Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser

355 360 365

Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly

370 375 380

Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr

385 390 395 400

Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr

405 410 415

Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe

420 425 430

Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys

435 440 445

Thr Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys

450 455

<210> 4

<211> 218

<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 4

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asn Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105 110

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

115 120 125

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

145 150 155 160

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

180 185 190

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

195 200 205

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 5

<211> 66

<212> DNA

<213> pLexm

<400> 5

atggatatga gagttcctgc tcaattgctg gggttgctct tgctctggtt cagtggggtg 60

ttgggg 66

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> pLexm

<400> 6

caccaccacc accaccac 18

<210> 7

<211> 75

<212> DNA

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 7

gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttct 75

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 8

ggatacacat tcactaccta tgtt 24

<210> 9

<211> 51

<212> DNA

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 9

atacactggg tgaagcagaa gcctgggcag ggccttgagt ggattggata t 51

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 10

gtttatcctt acaatgatgg tact 24

<210> 11

<211> 114

<212> DNA

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 11

tggtaccatg agaacttcaa aggcaaggcc acactgactt cagacaaatc ttccagcaca 60

gcctacatgg agctcagcag cctgacctct gaggactctg cggtctatta ctgt 114

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 12

gcaagaggtc tgggctatga ttacccctgg tttgcttac 39

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 13

tggggccaag ggactctggt cactgtctct gca 33

<210> 14

<211> 360

<212> DNA

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 14

gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggata cacattcact acctatgtta tacactgggt gaagcagaag 120

cctgggcagg gccttgagtg gattggatat gtttatcctt acaatgatgg tacttggtac 180

catgagaact tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcttccag cacagcctac 240

atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggtctg 300

ggctatgatt acccctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360

<210> 15

<211> 78

<212> DNA

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<400> 15

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcatgca gggccagc 78

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 16

aaaagtgtca atacatctgg ctatagttat 30

<210> 17

<211> 51

<212> DNA

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 17

atgcactggt ttcaacagaa accaggacag ccacccaaac tcctcatctat 51

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<211> 9

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cttgcatcc 9

<210> 19

<211> 108

<212> DNA

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 19

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<210> 20

<211> 27

<212> DNA

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<400> 20

cagcacagta gggagcttcc gctcacg 27

<210> 21

<211> 30

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<211> 333

<212> DNA

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 22

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caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga gcttccgctc 300

acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 333

<210> 23

<211> 25

<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 23

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 24

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<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 24

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Val

1 5

<210> 25

<211> 17

<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 25

Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10 15

Tyr

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 26

Val Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr

1 5

<210> 27

<211> 38

<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 27

Trp Tyr His Glu Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys

1 5 10 15

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp

20 25 30

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 28

<211> 13

<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 28

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Asp Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 29

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210> 30

<211> 120

<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 30

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Val Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Trp Tyr His Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Asp Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 31

<211> 26

<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 31

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

20 25

<210> 32

<211> 10

<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 32

Lys Ser Val Asn Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 33

<211> 17

<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 33

Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 34

<211> 3

<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 34

Leu Ala Ser

1

<210> 35

<211> 36

<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 35

Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 36

Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 37

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

1 5 10

<210> 38

<211> 111

<212> PRT

<213> Mc-IgG-REGγ-R2

<400> 38

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asn Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 39

agtggggtgt tgggggaggt ccagctgcag 30

<210> 40

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 40

gtgatggtga tggtgatgtt tacccagaga ccg 33

<210> 41

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 41

agtggggtgt tgggggacat tgtgctgaca cag 33

<210> 42

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 42

gtgatggtga tggtgatgac actcattcct gtt 33

Claims (14)

1.一种抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区；

所述的重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示；

所述的轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示。

2.如权利要求1所述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体，其特征在于，所述重组单克隆抗体识别的抗原决定簇位于IgG的重链和轻链可变区。

3.如权利要求1所述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体，其特征在于，所述重组单克隆抗体与REGγ抗原特异性结合，不结合其同源蛋白REGα。

4.如权利要求1所述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体，其特征在于，所述重组单克隆抗体为全长抗体。

5.一种细胞系，其特征在于，高表达、稳定分泌如权利要求1所述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体。

6.如权利要求5所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系为哺乳动物细胞系。

7.如权利要求5所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系为融合杂交瘤细胞，命名为Mc-IgG-REGγ-R2杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No.23040，保藏时间为2021年10月14日。

8.如权利要求7所述的细胞系，其特征在于，所述融合杂交瘤细胞是由原核表达的GST-REGγ蛋白免疫小鼠后的脾脏细胞和骨髓瘤细胞融合得到。

9.如权利要求8所述的细胞系，其特征在于，所述骨髓瘤细胞为SP2/0。

10.一种质粒载体，其特征在于，所述质粒载体含有如权利要求1中所述的轻链可变区的核苷酸序列或重链可变区的核苷酸序列；所述质粒载体为分泌型。

11.一种抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（a）通过LIC-PCR技术将如权利要求1中所述的轻链可变区的核苷酸序列和重链可变区的核苷酸序列分别构建到真核表达载体pLEXM；

（b）将所述步骤（a）中真核表达载体共转染到HEK 293T细胞表达，经纯化得到抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体。

12.一种体外诊断试剂或药物组合物，其特征在于，所述体外诊断试剂或者药物组合物包含如权利要求1所述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体，或编码所述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体的基因序列，以及药学上可接受的载体或赋形剂；

所述重组单克隆抗体的片段保留所述抗体的抗原结合活性。

13.如权利要求1所述的抗REGγ蛋白的重组单克隆抗体在制备诊断与治疗以REGγ高表达为靶标的相关疾病的药物和/或产品中的应用。

14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述疾病包括结肠癌、肺癌、甲状腺癌、皮肤癌、乳腺癌、肝癌。

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