CN105132445A - 一种特异识别肿瘤细胞的受体蛋白、t淋巴细胞及nk细胞 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异识别肿瘤细胞的受体蛋白，编码所述受体蛋白的核苷酸序列为：SED？ID？NO:1。所述受体蛋白的氨基酸序列是SED？ID？NO:2。本发明还公开了一种特异识别肿瘤细胞的T淋巴细胞和NK细胞，两种表达氨基酸序列均为SED？ID？NO:2的受体蛋白基因。本发明经过大量的实验数据，筛选到一种特异性识别肿瘤细胞的受体蛋白，该受体蛋白构建在CAR-T或CAR-NK的表达载体上，得到T淋巴细胞和NK细胞。在CAR-T和CAR-NK的细胞免疫治疗中，可以显著提高T淋巴细胞杀伤肿瘤活性(～40％)以及NK细胞杀伤肿瘤活性(～50％)。

Description

一种特异识别肿瘤细胞的受体蛋白、T淋巴细胞及NK细胞

技术领域本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种特异识别肿瘤细胞的受体蛋白、T淋巴细胞及NK细胞。

背景技术肿瘤的免疫细胞治疗是肿瘤研究领域的前沿和热点，从利用抗体为导向的靶向治疗到以活化免疫细胞为效应细胞的过继免疫治疗，在肿瘤的免疫治疗上都取得了一定的理论和实践的积累。但从总体上看，迄今为止，免疫治疗效果仍不能达到彻底清除体内肿瘤细胞的目的。导致免疫治疗效果欠佳主要的原因之一就是免疫效应细胞缺乏特异识别肿瘤细胞的靶向性。因此，将抗体的导向作用与免疫细胞的杀伤作用相结合，是肿瘤过继免疫治疗的一个重要研究方向。

近年来，一种称为CAR-T(chimericantigenreceptorTcell,CAR-T)和CAR-NK(chimericantigenreceptorNKcell,CAR-NK)的免疫治疗正是这种研究所取得的重要成果。以CAR-T为例，其机理就是从患者自身血液收集T细胞，对T细胞进行基因工程处理，使T细胞表面表达出能够识别特异性肿瘤抗原的特殊受体，这种受体被称为嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor,CAR)，同时在受体的胞内段加上引起T细胞活化的信号传递区域。CAR是一种蛋白质受体，可使T细胞识别肿瘤细胞表面的特定蛋白质(抗原)，表达CAR的T细胞可识别并结合肿瘤抗原，进而攻击肿瘤细胞。这种表达CAR的T细胞被称为CAR-T。经过设计的CAR-T细胞可在实验室培养生长，达到数十亿之多将扩增后的CAR-T细胞注入到患者体内，注入之后的T细胞也会在患者体内增殖，并杀死具有相应特异性抗原的肿瘤细胞。

以识别CD19抗原受体为靶向的CAR-T治疗在B淋巴细胞瘤治疗中取得了显著疗效，并且正在尝试用于实体瘤。虽然CAR-T的这些初步结果令人鼓舞，但是CAR-T细胞的关键在于其识别肿瘤的特异性受体。在实体瘤的CAR-T治疗上能否取得突破性的进展将主要取决于受体的特异性。

本发明经过大量的前期验证和比较，筛选到了一种具有特异识别肿瘤细胞的受体蛋白，该受体蛋白的发现有望可以为进一步拓宽CAR-T以及CAR-NK在实体肿瘤中的应用打下坚实的基础。

发明内容为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种可提高CAR-T和CAR-NK在实体瘤中的杀瘤活性的受体蛋白、T淋巴细胞及NK细胞。

本发明的技术方案为：

一种特异识别肿瘤细胞的受体蛋白，编码所述受体蛋白的核苷酸序列为：SEDIDNO:1。

进一步，所述受体蛋白的氨基酸序列是：SEDIDNO:2。

进一步，本发明还公开了一种特异识别肿瘤细胞的T淋巴细胞，其表达氨基酸序列为SEDIDNO:2的受体蛋白基因。

进一步，本发明所述的一种特异识别肿瘤细胞的T淋巴细胞，其由氨基酸序列为SEDIDNO:2的受体蛋白基因构建在CAR-T的表达载体上，通过慢病毒包装系统，制备假病毒颗粒，进行转染即可。

进一步，本发明还公开一种特异识别肿瘤细胞的NK细胞，其表达氨基酸序列为SEDIDNO:2的受体蛋白基因。

进一步，本发明所述的一种特异识别肿瘤细胞的NK细胞，其由氨基酸序列为SEDIDNO:2的受体蛋白基因构建在CAR-NK的表达载体上，通过慢病毒包装系统，制备假病毒颗粒，进行转染即可。

本发明还公开了一种特异识别肿瘤细胞的受体蛋白的制备方法，所述制备方法包括：

先提取抗肝癌的单克隆杂交瘤细胞的RNA，然后用单克隆抗体的特异性引物进行RT-PCR，将抗体重链和轻链的可变区DNA片段克隆到T载体上，测序，获得特异性识别肿瘤细胞的受体蛋白。

更进一步，本发明还公开一种抗肝癌的单克隆杂交瘤细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

采用肝癌组织作为免疫原对小鼠进行免疫，然后取免疫处理后的小鼠脾脏，获得B淋巴细胞，再选取骨髓瘤细胞，B淋巴细胞与骨髓瘤细胞通过促溶剂实现融合，通过HAT培养基进行初步筛选完成融合的异核体杂交瘤，并通过ELISA抗体分析筛选获得单克隆杂交瘤细胞。

本发明的有益效果为：本发明经过大量的实验数据，筛选到一种特异性识别肿瘤细胞的受体蛋白，该受体蛋白构建在CAR-T或CAR-NK的表达载体上，得到T淋巴细胞和NK细胞。在CAR-T和CAR-NK的细胞免疫治疗中，可以显著提高T淋巴细胞杀伤肿瘤活性(～40％)以及NK细胞杀伤肿瘤活性(～50％)。

具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

本发明提供一种特异识别肿瘤细胞的受体蛋白，编码所述受体蛋白的核苷酸序列为：SEDIDNO:1。

进一步，所述受体蛋白的氨基酸序列是：SEDIDNO:2。

进一步，本发明还公开了一种特异识别肿瘤细胞的T淋巴细胞，其表达氨基酸序列为SEDIDNO:2的受体蛋白基因。

实施例1

本发明所述的一种特异识别肿瘤细胞的T淋巴细胞，其由氨基酸序列为SEDIDNO:2的受体蛋白基因构建在CAR-T的表达载体上，通过慢病毒包装系统，制备假病毒颗粒，进行转染即可。

本实施例构建在CAR-T的表达载体上的T淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤活性的体外实验如下：

利用常规的慢病毒包装系统，包装出含CAR-MH(氨基酸序列为SEDIDNO:2的受体蛋白基因)-T的假病毒颗粒。

通过流式细胞分选，获得健康人CD8⁺T细胞。

将包装好的CAR-MH-T假病毒颗粒对CD8⁺T细胞进行转染，获得表达CAR-MH-T的T淋巴细胞(识别肿瘤的靶向T细胞)。

取96孔培养板，设置2组，分别为CAR-MH-T细胞孔和CD8⁺T细胞孔，每组12孔。每孔分别加入20万个表达CAR-MH-T的T淋巴细胞(效应细胞)或CD8⁺T细胞(效应细胞)后，再分别加入2万个肝癌细胞HEPG2(靶细胞)，并控制每孔终体积为200μL。同时设置三个对照孔，分别为只含有20万个效应细胞和2万个靶细胞的对照孔，每孔体积同样为200μL。37℃CO₂培养箱4h，每孔加入20μLMTT细胞活性检测试剂，37℃CO₂培养箱2h，550nm波长测定吸光值，计算杀伤率。杀伤率(％)＝〔1－(OD_e+t－OD_e)/OD_t〕×100％；其中，OD_e为：单纯效应细胞孔的OD值；OD_t：单纯靶细胞孔孔的OD值；OD_e+t：效应细胞加靶细胞孔的OD值；OD值为opticaldensity(光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，又称吸光度。

采用类似上述的方法分别检测对结肠癌细胞Caco-2、胃癌细胞MGC-803的杀伤率。检测数据见表1。

表1表达CAR-MH-T的T淋巴细胞对肿瘤细胞的体外杀伤活性

根据表1的检测数据，通过显著性分析可以看出，表达CAR-MH-T的T淋巴细胞对三种肿瘤细胞的杀伤活性均明显高于对照组CD8⁺T的杀伤活性，且均提高30％以上。

本实施例构建在CAR-T的表达载体上的T淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤活性的小鼠实验如下：

小鼠实验采用联合免疫缺陷的小鼠—“SCID小鼠”作为动物模型。SCID小鼠分为3个组(肝癌细胞+CAR-MH-T细胞组、肝癌细胞+CD8⁺T细胞组以及空白对照组)，每组4只。每只小鼠左大腿背侧皮下分别接种3×10⁶个HEPG2细胞。HEPG2细胞接种后第3天，每只小鼠尾静脉注射1×10⁷的MH-T细胞或CD8⁺T细胞，空白对照组注射等体积的生理盐水。每间隔4天，每只小鼠尾部静脉注射对应的免疫细胞1×10⁷。20天后测量瘤体体积，比较各组瘤体体积的差别。

在SCID小鼠模型中测定免疫细胞对结肠癌细胞Caco-2、胃癌细胞MGC-803的杀伤活性与上述方法相同。详细结果见表2。

表2表达CAR-MH-T的T淋巴细胞对肿瘤细胞的在小鼠体内杀伤活性(n＝4,x±s,mm³)

从表2可以看出，表达CAR-MH的T淋巴细胞抑制小鼠体内瘤体生长的活性明显高于普通的CD8⁺T淋巴细胞。

实施例2

本实施例公开一种特异识别肿瘤细胞的NK细胞，其表达氨基酸序列为SEDIDNO:2的受体蛋白基因。

具体的，所述一种特异识别肿瘤细胞的NK细胞，其由氨基酸序列为SEDIDNO:2的受体蛋白基因构建在CAR-NK的表达载体上，通过慢病毒包装系统，制备假病毒颗粒，进行转染即可。

其中，所述慢病毒转染包括以下步骤：

1)、取1.5mL灭菌EP管，加入混合质粒以及250μL的无血清培养基；轻柔混匀，室温孵育5min。

2)、取1.5mL灭菌EP管，取9μL脂质体溶于250μL无血清培养基中。轻柔混匀，室温孵育5min。

3)、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀，室温孵育20min。

4)、DNA-脂质体复合物加入293T细胞中，细胞数量为1×10⁶个，37℃CO₂孵箱中孵育过夜。

5)、移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以2mL慢病毒培养液，培养48h，观察细胞融合状况。

6)、48-72h收获含病毒的上清。3000rpm离心20min，去除沉淀，用0.45μm的微孔滤膜过滤。

7)、将待转染的NK细胞培养于不含抗生素的培养基中，细胞密度约为30％；

8)、转染细胞：在2×10⁵/mLNK细胞中加入终浓度为6μg/mL的聚凝胺和适量病毒，充分混匀。

9、继续培养3-4天。

本实施例构建在CAR-NK的表达载体上的NK细胞对肿瘤细胞杀伤活性的体外实验如下：

利用常规的慢病毒包装系统，包装出含CAR-MH(氨基酸序列为SEDIDNO:2的受体蛋白基因)-NK的假病毒颗粒。

通过流式细胞分选，获得健康人CD56⁺NK细胞。

将包装好的CAR-MH-NK假病毒颗粒对CD56⁺NK细胞进行转染，获得表达CAR-MH-NK的NK细胞(识别肿瘤的靶向NK细胞)。

取96孔培养板，设置2组，分别为CAR-MH-T细胞孔和CD8⁺T细胞孔，每组12孔。每孔分别加入20万个表达CAR-MH-NK的NK淋巴细胞(效应细胞)或CD56⁺T细胞(效应细胞)后，再分别加入2万个肝癌细胞HEPG2(靶细胞)，并控制每孔终体积为200μL。同时设置三个对照孔，分别为只含有20万个效应细胞和2万个靶细胞的对照孔，每孔体积同样为200μL。37℃CO₂培养箱4h，每孔加入20μLMTT细胞活性检测试剂，37℃CO₂培养箱2h，550nm波长测定吸光值，计算杀伤率。杀伤率(％)＝〔1－(OD_e+t－OD_e)/OD_t〕×100％；其中，OD_e：单纯效应细胞孔的OD值；OD_t：单纯靶细胞孔孔的OD值；OD_e+t：效应细胞加靶细胞孔的OD值；OD为吸光值。

采用类似上述的方法分别检测结肠癌细胞Caco-2、胃癌细胞MGC-803的杀伤率。具体数据见表3。

表3表达CAR-MH-NK的NK细胞对肿瘤细胞体外杀伤活性

根据表3数据，通过显著性分析可以得出，表达CAR-MH-NK的NK细胞对三种肿瘤细胞的杀伤活性均明显高于对照组CD56⁺NK的杀伤活性。

本实施例构建在CAR-NK的表达载体上的NK细胞对肿瘤细胞杀伤活性的小鼠实验如下：

小鼠实验采用联合免疫缺陷的小鼠—“SCID小鼠”作为动物模型。SCID小鼠分为3个组(肝癌细胞+CAR-MH-NK细胞组、肝癌细胞+CD56⁺NK细胞组以及空白对照组)，每组4只。每只小鼠左大腿背侧皮下分别接种3×10⁶个HEPG2细胞。HEPG2细胞接种后第3天，每只小鼠尾静脉注射1×10⁷的CAR-MH-NK细胞或CD56⁺NK细胞，空白对照组注射等体积的生理盐水。每间隔4天，每只小鼠尾部静脉注射对应的免疫细胞1×10⁷。20天后测量瘤体体积，比较各组瘤体体积的差别。

在SCID小鼠模型中测定四种免疫细胞对结肠癌细胞Caco-2、胃癌细胞MGC-803的杀伤活性与上述方法相同。检测结果见表4。

表4表达CAR-MH-NK的NK细胞对肿瘤细胞的在小鼠体内杀伤活性(n＝4,x±s,mm³)

从表4可以看出，表达CAR-MH-NK的NK细胞抑制小鼠体内瘤体生长的活性明显高于普通的CD56⁺NK淋巴细胞。

实施例3

本实施例公开一种特异识别肿瘤细胞的受体蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

步骤S1：先提取抗肝癌的单克隆杂交瘤细胞的RNA，然后用单克隆抗体的特异性引物进行RT-PCR；

其中，抗肝癌的单克隆杂交瘤细胞RNA的提取过程为：

1)收集1×10⁷处于对数生长期的杂交瘤细胞。

2)加入lmL裂解液，反复吹打后室温放置5min。

3)加入200μL氯仿颠倒混匀，放置5min。

4)4℃12000g离心l0min，收集上层水相转移至新的1.5mL离心管。

5)加500μL异丙醇，混匀，室温放置10min。

6)4℃12000g离心l0min后，弃上清。

7)加lmL75％乙醇洗涤沉淀，7500g离心5min，弃上清，室温干燥RNA。

8)用300μLDEPC(焦碳酸二乙酯)处理的去离子水溶解RNA，测定RNA浓度，其余样品于-70℃保存备用。

进一步，扩增抗体轻、重链可变区基因的引物设计过程为：

1)小鼠重链V区5’端引物(VH)：5’-GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT-3’；

2)小鼠重链V区3’端引物(MHC)：5’-GAC(ACT)CATGGGG(CG)TGT(TC)GTGCTAGCTG(AC)(AG)GAGAC(AGT)GTGA-3’；

3)小鼠轻链V区5’端引物(VL)：5’-GGGGATATCCACCATGGAG(AT)CACA(GT)(AT)CTCGGGTCTTT(GA)TA-3’；

4)小鼠轻链V区3’端引物(MLC)：5’-GGATACAGTTGGTGGTGCAGTCGACTTACGTTT(GT)GTTTCA(AG)CTT-3’；

RT-PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction)即逆转录PCR，是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应(PCR)相结合的技术。

本发明反转录合成cDNA的过程为：

1)取5μL总RNA，70℃水浴10min，12000g瞬时离心后置冰上待用。

2)参照试剂盒说明书，组成如下RT反应体系，并充分混匀：

所述MgCl₂为氯化镁，dNTP为脱氧核糖核苷三磷酸，Oligo(dT)15为只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链。

3)反应条件：42℃水浴lh；再99℃水浴5min；然后放置冰上冷却，-20℃保存备用。

更进一步，重链和轻链基因的PCR扩增和纯化过程为：

1)以合成的cDNA为模板，用相应的特异引物扩增重链和轻链基因。PCR体系组成及反应条件如下：

重链扩增组成成分：

轻链扩增组成成分：

所述PremixExTaq为宝生物工程有限公司生产的一种聚合酶。

重链/轻链扩增条件：

循环参数：94℃，5min变性；94℃lmin、54℃lmin、72℃lmin，30循环；72℃延伸10min。

2)将PCR扩增样品进行琼脂糖凝胶电泳分析并分离纯化。

步骤S2：将抗体重链和轻链的可变区DNA片段克隆到T载体上。

其中，重链和轻链基因PCR产物的T载体克隆的具体操作为：

1)参照如下连接反应体系，并充分混匀：

pMD19-T载体0.5μL

重链/轻链片段4.5μL

连接SolutionI5μL

2)16℃连接过夜、转化大肠杆菌感受态细胞，涂平板，挑选阳性克隆，送测序。

所述pMD19-T是一种高效克隆PCR产物的专用载体，SolutionI为连接酶。

步骤S3：测序；然后对测序正确的重链和轻链的可变区DNA序列进行分析，并根据获得的序列，进行人工拼接合成，完成融合获得MH基因，即获得特异性识别肿瘤细胞的受体蛋白基因。

实施例4

本实施例公开了一种抗肝癌的单克隆杂交瘤细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

步骤S1：采用肝癌组织作为免疫原对小鼠进行免疫。

其中，对小鼠进行分段免疫，因可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂包括：福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。使用佐剂的操作要求为：将抗原和佐剂等体积混合，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

具体免疫过程为：

1)初次免疫：1～50μg抗原加福氏完全佐剂皮下多点注射(一般0.8～1mL，0.2mL/点)

2)3周后：第二次免疫，剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下多点注射；

3)再过3周后，第三次免疫，剂量同上，不加佐剂皮下多点注射；

4)接着2～3周后，加强免疫，加大注射剂量50～500μg为宜，不加佐剂皮下多点注射；

5)在经过第4)步操作的3天后，取脾融合。

步骤S2：然后取免疫处理后的小鼠脾脏，获得B淋巴细胞。

步骤S3：再选取骨髓瘤细胞，B淋巴细胞与骨髓瘤细胞通过促溶剂实现融合，所述促溶剂为浓度40％(W/V)的聚乙二醇。

步骤S4：通过HAT培养基进行初步筛选完成融合的异核体杂交瘤，并通过ELISA抗体分析筛选获得单克隆杂交瘤细胞。

本实施例获得的单克隆杂交瘤细胞可应用于实施例3中。

Claims (8)

1.一种特异识别肿瘤细胞的受体蛋白，其特征在于：编码所述受体蛋白的核苷酸序列为：SEDIDNO:1。

2.根据权利要求1所述的特异识别肿瘤细胞的受体蛋白，其特征在于：所述受体蛋白的氨基酸序列是：SEDIDNO:2。

3.一种特异识别肿瘤细胞的T淋巴细胞，其特征在于：其表达氨基酸序列为SEDIDNO:2的受体蛋白基因。

4.根据权利要求3所述的一种特异识别肿瘤细胞的T淋巴细胞，其特征在于：其由氨基酸序列为SEDIDNO:2的受体蛋白基因构建在CAR-T的表达载体上，通过慢病毒包装系统，制备假病毒颗粒，进行转染即可。

5.一种特异识别肿瘤细胞的NK细胞，其特征在于：其表达氨基酸序列为SEDIDNO:2的受体蛋白基因。

6.根据权利要求5所述的一种特异识别肿瘤细胞的NK细胞，其特征在于：其由氨基酸序列为SEDIDNO:2的受体蛋白基因构建在CAR-NK的表达载体上，通过慢病毒包装系统，制备假病毒颗粒，进行转染即可。

7.根据权利要求1所述的一种特异识别肿瘤细胞的受体蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括：

先提取抗肝癌的单克隆杂交瘤细胞的RNA，然后用单克隆抗体的特异性引物进行RT-PCR，将抗体重链和轻链的可变区DNA片段克隆到T载体上，测序，获得特异性识别肿瘤细胞的受体蛋白。

8.根据权利要求7所述的抗肝癌的单克隆杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

采用肝癌组织作为免疫原对小鼠进行免疫，然后取免疫处理后的小鼠脾脏，获得B淋巴细胞，再选取骨髓瘤细胞，B淋巴细胞与骨髓瘤细胞通过促溶剂实现融合，通过HAT培养基进行初步筛选完成融合的异核体杂交瘤，并通过ELISA抗体分析筛选获得单克隆杂交瘤细胞。