CN105968198A

CN105968198A - 一种念珠菌甘露聚糖的单克隆抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN105968198A
Application number: CN201610488056.5A
Authority: CN
Inventors: 彭洁; 李宁; 粟艳; 周泽奇
Original assignee: Hui Bin Bio Tech Ltd Tianjin
Current assignee: Danner (Tianjin) Biological Technology Co., Ltd.
Priority date: 2016-06-27
Filing date: 2016-06-27
Publication date: 2016-09-28

Abstract

本发明涉及抗体及其制备方法与应用。具体而言，本发明涉及用于针对念珠菌甘露聚糖(mannan,Mn)抗原的一种小鼠IgG型单克隆抗体和抗念珠菌甘露聚糖Mn抗原的单克隆抗体的制备方法及其在念珠菌抗原检测中的应用。本发明提供了一种将念珠菌进行破碎后免疫动物，制备杂交瘤细胞，再通过用甘露聚糖筛选的杂交瘤细胞接种动物，经分离纯化得到抗体的方法。用本发明方法制备得到的单克隆抗体具有特异性好、效价高、纯度高的特点。将其用于医疗卫生及科研领域的念珠菌检测中，具有灵敏度高、特异性好的优势，应用前景广阔。

Description

一种念珠菌甘露聚糖的单克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及抗体及其制备方法，特别涉及用于针对念珠菌甘露聚糖(Mannan，MN)抗原的一种单克隆抗体及其制备方法。

背景技术

白色念珠菌是一种条件致病念珠菌，人体在正常情况下不会受到白色念珠菌的感染，只有机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调时，可能感染白色念珠菌，引起深部感染，甚至全身散播性感染。

近年来由于人口老龄化，免疫抑制剂及广谱抗生素的大量应用，艾滋病、恶性肿瘤发病率的增加，器官、骨髓移植及介入治疗的广泛开展，临床上侵袭性念珠菌感染的发病率呈逐年上升趋势。由于缺乏有效的诊断方法，侵袭性念珠菌感染后易造成漏诊、误诊而延误治疗，因此，发展早期、快速且特异的侵袭性念珠菌感染诊断学方法成为临床上迫切需要解决的问题。

目前临床对于侵袭性念珠菌感染常规的诊断方法主要包括以下几种：

(1)组织病理学诊断方法

在组织切片中找到病原念珠菌是确诊的“金标准”，有念珠菌侵袭和相应的炎症反应与组织损害或组织标本念珠菌培养阳性即可确定念珠菌感染的诊断。但组织病理学检查取材需要侵入性操作，重症患者难以耐受，可行性差。其敏感性受到取材的影响，一次切片未必能够找到念珠菌成分，且侵袭性念珠菌感染可引起各种各样的组织反应，给诊断带来较大困难。

(2)直接镜检和培养

直接镜检是念珠菌学检查最经典的方法，具有简便、快速、实用的优点，可以在显微镜下直接观察念珠菌形态。但直接镜检阳性率较低，阴性结果不能排除诊断，且同一菌属内的多种念珠菌镜下形态相似，对于菌种鉴定没特别的帮助。而培养检查需要结合菌落特征、生化试验等进行详细观察，培养过程耗时长，有时需要数周时间重复多次接种才能得出正确结果，且敏感性和阳性率较低，同时对操作人员的技术经验要求高，不利于早期诊断。

(3)影像学检查

动态影像学检查对提示诊断具有重要作用，胸部CT扫描，特别是高分辨率CT的临床应用对早期诊断价值较高。但影像学检测特异性较差，接合菌、镰孢菌、放线菌、奴卡菌、金黄色葡萄球菌等血管侵袭性感染在影像学上可能与侵袭性真菌相似，所以影像学检查通常只能作为辅助诊断手段。

甘露聚糖(mannan)是白色念珠菌细胞壁的主要抗原成分。对于白色念珠菌感染的诊断，除了传统的培养方法，测定血清中白色念珠菌甘露聚糖抗原，逐渐成为白色念珠菌早期诊断的简单、快捷的方法。

免疫检测技术是利用抗原抗体间能特异性结合反应，通过检测标记在反应物上的标记物，对抗原或抗体实现定性或定量检测的方法。根据标记物质的不同，分为酶联免疫分析技术(Enzyme-LinkedImmunosorbant Assay,ELISA)、免疫荧光检测技术、化学发光免疫分析技术、免疫微球技术、免疫胶体金技术等。其中ELISA技术具有操作简单，灵敏度高，检测时间短的特点，在临床检测和科学研究中被广泛使用。

而测定抗原作为白色念珠菌感染诊断方法的关键，便是得到针对白色念珠菌甘露聚糖抗原的抗体。多糖类物质因为结构特殊、免疫原性差、结构类似，很多是半抗原，很难像蛋白免疫原一样容易得到单克隆抗体，经常需要对抗原表位进行化学修饰，使其成为完全抗原才能进行免疫，本发明使用菌体进行免疫，得到高亲和度的血清，并通过甘露聚糖对其进行筛选，得到高特异性的细胞株。

综上所述，在念珠菌临床检测领域，迫切需要制备出新的高敏感度、高特异性的抗念珠菌甘露聚糖的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种念珠菌甘露聚糖的单克隆抗体，通过抗原免疫动物、细胞融合制备杂交瘤细胞、杂交瘤细胞分泌单克隆抗体三个步骤制得。

本发明的目的在于使用灭活的念珠菌对小鼠进行免疫得到高亲和度的血清。

本发明的目的在于提供一种制备杂交瘤细胞株的方法，该细胞株为经过乙酰化的甘露聚糖筛选后能分泌抗念珠菌甘露聚糖抗原的单克隆抗体。

本发明技术方案如下：

步骤：

1.用反复冻融法和超声破碎法将灭活后念珠菌进行破碎。

2.用破碎后的念珠菌菌体免疫BALB/C小鼠。

3.测定免疫后小鼠的血清效价，将免疫后的小鼠的脾细胞取出，与骨髓瘤细胞进行细胞融合并筛选，得到杂交瘤细胞。

4.将杂交瘤细胞上清在包被甘露聚糖酶标板上进行筛选。

5.将筛选后的单克隆杂交瘤细胞注射到BALB/C小鼠体内。

6.将从BALB/C小鼠体内获得的血清或腹水进行抗体纯化，得到针对甘露聚糖的单克隆抗体。

上述步骤1中用于破碎的方法是多种多样的，除步骤1中用到的反复冻融法和超声破碎法外，还包括：高速离心法，高速组织捣碎法，渗透压差法等。

上述步骤2中免疫的方法是多种多样的，如：皮下注射，脾内注射，静脉注射，腹腔注射等。免疫剂量可视具体动物种类而定，为10-1000μg/只。用于制备单克隆抗体的动物可以是鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴等可用于免疫的动物。

上述步骤3中未获得较好的免疫效果，应每隔7天左右对免疫动物的血清进行效价测定。当免疫4次左右后，将动物处死，分离脾细胞，与肿瘤细胞进行细胞融合。用于细胞融合的肿瘤细胞种类有很多，如SP2/0，F0，X63，X63-Ag8.653，NS-1，P3U1，S194/5.XXO.BU.1，MPC11-45.6TG1.7，210.RCY3.Ag1.2.3，GM15006TG-A12，U-266AR等。

上述步骤3中细胞融合后用进行克隆化，克隆化的方法很多，可以是有限稀释法、软琼脂培养法等。

上述步骤5中注射细胞株的方法可以是腹腔注射，皮下多点注射等。

上述步骤6中用于抗体纯化的方法可以是饱和硫酸铵盐析沉淀法和亲和层析法等。

用上述方法制备得到的小鼠IgG型单克隆及其他种属来源和类型的单克隆抗体是需要本发明保护的。

本发明提供了一种抗念珠菌甘露聚糖抗原的小鼠IgG型单克隆抗体DNK-C6及念珠菌甘露聚糖抗原的单克隆抗体的制备方法。

实验证明，用本发明所属方法制得的小鼠IgG型单克隆抗体DNK-C6具有效价高，特异性好的特点，将其用于科研和临床检测领域中，具有灵敏度高，特异性好多的优势，有很强的应用前景。

附图描述

图1显示了小鼠IgG型单克隆抗体的SDS-PAGE检测的结果。

图2显示了小鼠IgG型单克隆抗体的效价测定的结果。

实施例1，抗念珠菌甘露聚糖抗原的小鼠IgG型单克隆抗体DNK-C6的制备及其效价测定

一、用反复冻融法和超声破碎法将灭活后念珠菌进行破碎。

具体方法为：

1)液体培养基中加入甲醛溶液，使甲醛终浓度为3.7％，于4℃放置24小时灭活孢子。

2)灭活后的烟曲霉菌体4℃4000rpm离心10min，去上清。

3)用预冷的生理盐水重悬孢子后反复洗涤6-10次，充分去除福尔马林。

4)加入液氮用灭菌的研钵研磨破碎3-5次，加水，冰浴下使用探头式超声破碎30min。

5)进行BCA蛋白定量和苯酚硫酸法糖定量。

二、杂交瘤细胞株的制备

1.免疫动物

将破碎后的菌体与弗氏完全佐剂按体积比1:1混合，终体积0.2ml。充分乳化后对3只雄性BALB/C小鼠进行腹腔注射免疫，每只小鼠免疫剂量为50μg。免疫前3天取尾血，分离血清做阴性对照。初次免疫后第2、4、6周分别进行免疫，方法与第一次相同。

2.细胞融合

1)饲养层细胞的制备

选取6-10周龄的BALB/C小鼠，拉颈处死后在无菌条件用无菌注射器向腹腔内注入5-6ml 4℃预冷的RPMI1640细胞培养液(下文简称“细胞培养液”)。再将培养液吸出，于1000rpm，4℃下离心5分钟。用含20％胎牛血清的细胞培养液重悬细胞，将细胞转移至96孔板中，放入细胞培养箱中培养。要求培养温度37℃，CO₂含量5.0％。

2)制备免疫脾细胞

将第四次免疫后3天的小鼠拉颈处死，无菌条件下取脾脏。用细胞培养液洗1次后研碎，过不锈钢筛网，将得到的细胞离心后用细胞培养液洗2次。

3)细胞融合

取对数期的SP2/0骨髓瘤细胞，与脾细胞混合。用不含胎牛血清的细胞培养液洗一次后离心、弃上清。加入聚乙二醇溶液后37℃恒温90秒左右。再用不含胎牛血清的细胞培养液终止反应后离心，用含20％胎牛血清的HAT选择培养液重悬，将细胞加到96孔板内，放入细胞培养箱内培养。要求培养温度37℃，CO₂含量5.0％。

4)细胞单克隆化与筛选

将96孔板内生长状态良好的细胞用细胞培养液稀释至1-3个细胞/ml，加入到96孔板内，放入细胞培养箱内培养。要求培养温度37℃，CO₂含量5.0％。每个细胞株分别编号，使用甘露聚糖做为筛选抗原，选取培养液上清呈阳性的细胞株扩大培养。最终得到一株的杂交瘤细胞株。

三、单克隆抗体的制备

1.将杂交瘤细胞株扩大培养，细胞数目达到10⁶/ml浓度时，将细胞离心后用PBS重悬，再用PBS洗2遍，注射到6周龄的BALB/C小鼠腹腔内。注射细胞株之前2周先向小鼠腹腔内注射降植烷或液体石蜡0.5ml。注射细胞株2周后将小鼠拉颈处死，抽取腹水。

2.将腹水离心后取上清，用饱和硫酸铵盐析沉淀法进行初步纯化。

3.用Protein A层析填料填装层析柱，用亲和层析的方法进行纯化。

实施例2，抗念珠菌甘露聚糖抗原的单克隆抗体的检测

1.SDS-PAGE电泳检测

对步骤三制得的抗体进行SDS-PAGE电泳，对得到的凝胶进行考马斯亮蓝染色。实验结果见图1(GXM泳道为抗甘露聚糖单克隆抗体，M泳道为蛋白Marker)。由图中可看出，在25KD和50KD分子量区有清晰明显的条带，说明抗体纯度很高。

2.效价测定

用间接ELISA法对抗体效价进行测定。所用酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，阴性对照为PBS溶液。检测结果见图2。从结果可看出，该抗体效价很高，不低于1:1×10⁶。

应当知道只是用实施示例对本发明进行了描述，在本发明基础上做出的改进仍属本发明范畴。

Claims

1.一种念珠菌甘露聚糖的单克隆抗体，通过抗原免疫动物、细胞融合制备杂交瘤细胞、杂交瘤细胞分泌单克隆抗体三个步骤制得，其特征在于，所述免疫原为念珠菌灭活菌体。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述免疫原为念珠菌灭活后破碎菌体。

3.一种如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，用甘露聚糖包被，间接法ELISA检测显示其效价不低于1:1×10⁶。

4.一种如权利要求1所述的念珠菌甘露聚糖的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)用反复冻融法和超声破碎法将灭活后念珠菌进行破碎；

(b)用(a)步骤得到的破碎后的菌体作为免疫原免疫动物；

(c)步骤(b)所得动物的脾细胞与肿瘤细胞进行细胞融合，得到杂交瘤细胞；

(d)将步骤(c)所得的杂交瘤细胞接种到动物体内；

(e)从步骤(d)所得的动物体内分离纯化出单克隆抗体。

5.如权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(c)中，得到的杂交瘤细胞通过乙酰化的甘露聚糖进行筛选。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，免疫的方法为皮下注射、脾内注射、静脉注射、腹腔注射；免疫剂量为10-1000μg/只；免疫的动物为大鼠、小鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴。

7.如权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(c)中，用于细胞融合的肿瘤细胞种类为：SP2/0，F0，X63，X63-Ag8.653，NS-1，P3U1，S194/5.XXO.BU.1，MPC11-45.6TG1.7，210.RCY3.Ag1.2.3，GM15006TG-A12，U-266AR；细胞融合后克隆化的方法为有限稀释法、软琼脂培养法。

8.如权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(c)中，接种细胞株的方法为腹腔注射，皮下多点注射；接种的动物为大鼠、小鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴。

9.如权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(d)所使用的抗体纯化的方法为饱和硫酸铵盐析沉淀法和亲和层析法。