CN102952200A - 一种白色念珠菌细胞壁甘露聚糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及真菌的多糖制备领域。具体而言，本发明涉及制备白色念珠菌细胞壁的甘露聚糖。本发明提供了一种利用十六烷基三甲基溴化铵来制备白色念珠菌细胞壁甘露聚糖的方法。白色念珠菌细胞经过在柠檬酸盐溶液中高温高压处理后，上清液在甲醇中沉淀得甘露聚糖粗品，接下来使用十六烷基三甲基溴化铵先沉淀杂蛋白及核酸，然后与甘露聚糖络合形成沉淀，络合物沉淀用乙酸溶解后，用乙醇沉淀多糖，得到纯化甘露聚糖。本发明中制备白色念珠菌细胞壁甘露聚糖的方法，不需要凝胶层析过程，制备工艺简单，利于甘露聚糖的工艺化生产。

Description

一种白色念珠菌细胞壁甘露聚糖的制备方法

技术领域

本发明涉及真菌的多糖制备领域。具体而言，本发明涉及制备白色念珠菌细胞壁的甘露聚糖。

背景技术

白色念珠菌是一种条件致病真菌，人体在正常情况下不会受到白色念珠菌的感染，只有机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调时，可能感染白色念珠菌，引起深部感染，甚至全身散播性感染。甘露聚糖是白色念珠菌细胞壁的主要抗原成分。对于白色念珠菌感染的诊断，除了传统的培养方法，测定血清中白色念珠菌甘露聚糖抗原，逐渐成为白色念珠菌早期诊断的简单、快捷的方法。

而测定抗原作为白色念珠菌感染诊断方法的关键，便是得到制备单克隆抗体的免疫原甘露聚糖。国内对于白色念珠菌细胞壁甘露聚糖制备的研究，主要是林飞卿等人所采用的热酚法和热甲酰胺法(林飞卿等，中国免疫学杂志，1987年，第3卷，第5期，288-292页)。

热酚法简述如下：1)除蛋白：向白念菌菌粉中加入含45％苯酚的1/15M pH7.2的磷酸盐缓冲液，匀浆透析过夜除去苯酚，离心得到沉淀物，沉淀用无水乙醇洗尽苯酚，加少量水，100℃水浴抽提1小时；离心得到沉淀物，加10倍体积的3％NaOH，在饱和氮气流下，100℃水浴抽提6小时；再进行离心，分离上清液，用HCl中和，对蒸馏水透析去盐，减压浓缩至少量体积；2)沉淀多糖：于上述上清液中加无水乙醇至最终浓度为80％，-20℃过夜，以沉淀多糖；离心得沉淀物，用丙酮干燥，即得到粗制甘露聚糖；3)多糖纯化：使用DEAE-SephadexA-50(DEAE葡聚糖凝胶A-50)纯化，先用常规法处理DEAE葡聚糖凝胶A-50，再用0.1N醋酸使之转化为酸型，装柱(1.8×30cm)；将粗制甘露聚糖抗原溶于少量去离子重蒸水中，对同一液体透析后上柱；用去离子重蒸水洗脱，收集洗脱液。用核酸检测蛋白仪监测，并做Molish测糖反应，合并阳性各管，减压浓缩至少量体积，对去离子重蒸水透析，分装，冷冻干燥得纯化甘露聚糖。该方法能得到纯度较高的甘露聚糖，但是制备过程较复杂，需要两次100℃水浴抽提，同时凝胶层析法进行费时费力，每次分离量少，并且在相对分子质量估计不清楚时，凝胶的选择有一定困难。

热甲酰胺法简述如下：1)除蛋白：丙酮干燥白念菌粉于圆底烧瓶中，加入甲酰胺(20mL/1g菌粉)，油浴150℃加热30min，使菌体破裂，冷却至室温，20℃下2000g离心30min，弃沉淀；2)沉淀多糖：上清液加入2.5倍体积酸酒精(2N HCl 1份，无水乙醇19份)，室温搅拌30min，20℃下6000g离心30min，弃上清液，得白色沉淀多糖；沉淀用蒸馏水抽提可溶性物质，然后在50％的乙醇(cold ethanol)中沉淀，4℃下6000g离心30min，弃上清液；沉淀物溶于蒸馏水，加冷乙醇(最终体积浓度为70％)和1M醋酸钠(5mL沉淀水溶液加0.2mL醋酸钠)，4℃下6000g离心30min，弃上清液；沉淀用无水乙醇洗涤，减压条件下用丙酮干燥，得粗制Mannan抗原；3)多糖纯化：粗制抗原溶于蒸馏水，过Sephadex G-75柱(1.5x26-cm)，蒸馏水洗脱，流速1mL/6min；收集各管，用Molish试剂作糖定性检测，并用核酸蛋白仪检测蛋白(280nm)，合并高峰曲线重叠管，冻干得到纯化甘露聚糖。该方法过程相对简单，但是得到的多糖纯度不高，含较多的杂蛋白，并且该方法同样存在凝胶层析的缺点。

国外已经公开的白色念珠菌细胞壁甘露聚糖制备方法，主要参考Peat等人的菲林试剂沉淀的方法(1961，J.Chem.Soc.1：29-34)。具体方法为：菌粉在19mM的柠檬酸盐缓冲液中，高压灭菌锅中140℃灭菌2小时，离心，胶状体加入水后，再次相同条件高压灭菌；混合液减压浓缩，加入醋酸，混合液离心，分离棕色胶状物，用醋酸溶液洗涤，收集洗液，上清液为含甘露聚糖溶液，用氢氧化钠中和；加入乙醇，沉淀用60％乙醇水溶液洗涤两次，溶解于水中，离心，除去棕色胶状物，浑浊上清液加入氢氧化钠调至碱性，使用菲林试剂沉淀，然后沉淀用乙醇洗涤，最终得到甘露聚糖沉淀。该法虽然不存在凝胶层析的缺点，但是菲林试剂沉淀多糖，产率、纯度都较低。要想提高多糖产量和纯度，需要反复使用菲林试剂沉淀，过程繁琐，其工艺并不适合工业生产。

上世纪50年代，Scott首先发现十六烷基三甲基溴化铵(Cetavlon)对酸性多糖有较强的沉淀作用，能与多糖形成季胺络合物而沉淀多糖。目前，十六烷基三甲基溴化铵已经广泛用于各种细菌荚膜多糖的纯化制备。本发明中，首次使用十六烷基三甲基溴化铵来制备白色念珠菌细胞壁多糖抗原甘露聚糖的方法。我们发现，该方法不仅工艺操作流程简单，并且能够制备纯度较高的白色念珠菌甘露聚糖。

本发明详细描述

本发明的目的在于提供一种利用十六烷基三甲基溴化铵来制备白色念珠菌细胞壁甘露聚糖的方法。

本发明所采用的白色念珠菌购买自中国医学微生物菌种保藏管理中心。

本发明技术方案如下：

步骤：

1)白色念珠菌培养采用通用的白色念珠菌培养条件，具体地说培养基采用YM肉汤培养基，成分为每升培养基含3g酵母提取物，5g蛋白胨，3g麦芽糖提取物，10g D-葡萄糖。培养温度为30℃，震荡速度为200rpm，培养时间大约28h。

2)上述培养液进行离心，沉淀即白色念珠菌细胞用0.9wt％氯化钠洗涤两次，56℃加热2h杀死细胞，用丙酮干燥得到白色念珠菌菌粉。

3)所得白色念珠菌菌粉在pH＝7.0，浓度为0.02M的柠檬酸盐缓冲液中高压灭菌90min，离心，保留上清液，沉淀胶状物相同条件下灭菌，离心，合并上清液。

4)上述上清液加入到甲醇中，出现沉淀；离心分离得到沉淀，沉淀溶于去离子水，用去离子水透析，冻干，得到粗制甘露聚糖。

5)粗制甘露聚糖溶于去离子水中，加入十六烷基三甲基溴化铵的水溶液，混合液静止一段时间出现沉淀。

6)离心分离沉淀，沉淀用去离子水洗涤，合并洗涤液和5)步上清液，合并液加入1wt％的硼酸溶液。

7)上述混合液边搅拌边加入2M氢氧化钠，调节pH至8.8，生成十六烷基三甲基溴化铵-甘露聚糖络合物沉淀，收集沉淀，用pH＝8.8的0.5％醋酸钠洗涤，然后用2％乙酸溶解，所得溶液在乙醇中沉淀。

8)离心，弃上清液，沉淀用2％的醋酸乙醇溶液洗涤，溶于水后用2M氢氧化钠中和，蒸馏水中透析，冻干，得到白色念珠菌甘露聚糖产物。

本发明中，白色念珠菌细胞经过柠檬酸盐处理后，上清液在甲醇中沉淀即可得到甘露聚糖粗品，之后加入十六烷基三甲基溴化铵，其目的如下：1)中性条件下，出去蛋白质和核酸；2)碱性条件下，和甘露聚糖结合形成络合物沉淀，纯化多糖。因此，本发明中，使用十六烷基三甲基溴化铵来制备甘露聚糖，省略了凝胶层析的过程，不但使得制备工艺简单化，同时能制备出高纯度的甘露聚糖。

实施例1，用本发明的制备方法提取白色念珠菌细胞壁抗原甘露聚糖，其步骤如下：

配制YM肉汤培养基2.4L，其成分为7.2g酵母提取物，12g蛋白胨，7.2g麦芽糖提取物，24g D-葡萄糖。培养温度为30℃，震荡速度为200rpm，培养时间为28h。离心收集菌体细胞，离心条件为6000rpm离心15min，使用0.9wt％氯化钠洗涤细胞，56℃加热2h杀死细胞，用丙酮干燥得到白色念珠菌菌粉。白色念珠菌菌粉在pH＝7.0，浓度为0.02M的柠檬酸盐缓冲液中高压灭菌90min，离心，保留上清液，沉淀胶状物相同条件下灭菌，离心，合并上清液。将上清液加入到3倍体积的甲醇当中，出现沉淀，10000rpm离心10min，分离得到沉淀，沉淀溶于去离子水，用去离子水透析，冻干，得到粗制甘露聚糖。

实施例2，用本发明的制备方法，利用十六烷基三甲基溴化铵对粗制甘露聚糖进行纯化，具体步骤如下：

1)粗制甘露聚糖溶液中，加入浓度为0.04g/ml的十六烷基三甲基溴化铵水溶液20ml，混合液静止4小时出现沉淀，10000rpm离心10min，沉淀用去离子水洗涤，合并洗涤液和上清液，共得合并液60ml，合并液加入1wt％的硼酸溶液30ml；2)上述混合液边搅拌边加入2M氢氧化钠，调节pH至8.8，生成十六烷基三甲基溴化铵-甘露聚糖络合物沉淀，10000rpm离心10min，收集沉淀；3)用pH＝8.8的0.5％醋酸钠洗涤沉淀两次，每次30ml，然后用10ml2％乙酸溶解，所得溶液在3倍体积的乙醇中沉淀；4)10000rpm离心10min，收集沉淀，沉淀用10ml去离子水溶解，用2M氢氧化钠调节pH至中性，蒸馏水中透析，冻干，得到白色念珠菌甘露聚糖产物。

Claims (9)

1.一种白色念珠菌细胞壁甘露聚糖的制备方法，包括以下步骤：

(a)白色念珠菌细胞经过柠檬酸盐的处理后，上清液加入到甲醇中，静置产生沉淀，离心分离沉淀即为粗制甘露聚糖；

(b)将(a)步骤得到粗制甘露聚糖溶于去离子水，加入十六烷基三甲基溴化铵，产生沉淀，离心，上清液加入硼酸溶液；

(c)步骤(b)所得混液用氢氧化钠调节pH值至碱性，生成十六烷基三甲基溴化铵-甘露聚糖络合物沉淀，收集沉淀；

(d)用乙酸钠洗涤步骤(c)所得沉淀，沉淀在乙酸中溶解后，所得溶液中加入乙醇，从而形成甘露聚糖沉淀；

(e)步骤(d)所得沉淀用乙酸乙醇溶液洗涤后，溶于水，用氢氧化钠调节pH值至中性，蒸馏水中透析，冻干，即为纯化甘露聚糖。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，上清液在甲醇中产生沉淀，生成沉淀的静置时间为3-5h，对沉淀进行分离的方法为离心，离心条件为10000rpm，10-15min，20-25℃。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，加入的十六烷基三甲基溴化铵应过量，质量为甘露聚糖粗品的2-4倍。

4.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(b)中，所用硼酸溶液的浓度为1wt％。

5.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(c)中，所用氢氧化钠溶液浓度是2mol/L，溶液pH值最终调节至8.8。

6.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(d)所使用乙酸钠溶液浓度为0.5wt％，pH＝8.8。

7.如权利要求1所述方法，其特征在于，所使用乙酸溶液中乙酸的体积分数为2％。

8.如权利要求1所述方法，其特征在于，所使用乙酸乙醇溶液中，乙酸的体积分数为2％。

9.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(b)和(e)中，沉淀溶于水后都使用0.45um滤膜进行了过滤。