JP2008532557A - 新規な抗plgf抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、特に病的状態における血管新生の阻害に適する新規な抗体およびそれらのフラグメントならびに誘導体に関する。本発明は、それら特定の抗体を産生する細胞株にも関する。本発明は、本発明の抗体、それらのフラグメントおよび/または誘導体を含む医薬組成物を提供し、腫瘍形成、目の病気、肺性高血圧および炎症性疾患等において望まれない血管新生および/または血液漏出の予防および治療方法、ならびに骨粗鬆症等の骨疾患の予防および治療方法を提供する。
異常な血管形成は高い罹患率と死亡率を有する多数の病気の発病に寄与する。血管増殖の根底にある機構の解明は、虚血組織における血管増殖を促進するか、または腫瘍におけるそれら形成を抑制する治療方法の開発を可能とするだろう。胚における最近の遺伝子標的法の研究によって、内皮チャンネルの初期形成(血管新生)および平滑筋細胞の被覆によるそれらのその後の成熟(動脈新生)に関わる機構の一部が同定された。異なる分子機構が病的状態における血管成長を仲介するという証拠が明らかになりつつあるが、その分子的プレーヤーは大部分未確定なままにある。
はこの制限に取り組むものであろうが、従来のハイブリドーマ技術による大量のヒト抗ヒト抗体の産生は困難であることが証明されている。したがって、マウスのモノクローナル抗体等、動物の高い結合親和性を維持するが、ヒトにおいて低減した免疫原性を示す「ヒト化」抗体を構築するために、組換え技術が当分野で用いられている。特に、非ヒト抗体の可変領域(V)をヒト抗体の定常(C)領域に組み合わせたキメラ抗体が提唱されている。そのようなキメラ免疫グロブリンを得る方法は米国特許第5,770,198号に詳細に説明されている。マウス抗体の免疫原性を低減させる他の試みでは、全V領域ではなく、相補性決定領域(CDR)のみ、すなわち、V領域の超可変性領域のみがヒト抗体に移植される。そのようなヒト化抗体はCDRグラフト化抗体として知られている。さらに複雑な抗原を認識するCDRグラフト化抗体の構築は、天然の非ヒト抗体よりも顕著に低い結合活性を有する抗体をもたらした。多くの場合に、非ヒトCDRのヒト抗体骨格への単なる導入は完全な結合活性の維持には不十分であることが示された。ヒト化抗体の設計で考慮すべき重要なアミノ酸を同定するために、関心の対象であるマウス抗体の緻密なコンピュータモデルが必要とされ、一般的な理論的指針がそのような設計のために提案されたが、すべての場合に、その手順は関心の対象である特定の非ヒト抗体に適合させて、最適化させる必要がある。
本発明は、PlGFがそのレセプターに結合することを阻害できる、PlGFに対する新規なモノクローナル抗体およびその誘導体に関する。本リガンドは、インビボの病的状態においてヒトPlGFの阻害を示す最初のものである。さらに具体的には、本発明による抗体およびその誘導体はインビボで腫瘍サイズおよびヒト腫瘍組織の血管新生を低減させることができる。本発明の抗体は、VEGFを標的とした現在使用されている抗血管新生療法に代わる手段を提供し、これら療法に関連した生理学的血管新生の阻害により引き起こされる副作用が顕著に低減するという重要な利点を有する。
ド抗体、最も特にはマウス/ヒトハイブリッド抗体、さらに特にはハイブリッドマウス16D3/ヒトIgG1κまたはIgG4κである。もしくは、ヒト化抗体は、PlGFに結合可能な本発明のマウス16D3抗体のCDR領域を、ヒト抗体の骨格にグラフト化させて含む抗体である。
は、医薬組成物は、配列番号26を含むヒト化scFv等の、しかし、これに限定されない16D3のヒト化scFvを含むか、またはPlGFに結合することのできるCDR内においてそれと少なくとも80%、特には少なくとも85%、さらに特には少なくとも90%、最も特には少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む。
の大きさを20%〜50%低減することのできるリガンドを明らかにする。
本明細書において用いられる「16D3」との用語は、LMBP6399CBの番号でBCCM/LMBPに寄託された細胞株により産生されるPlGFに対するモノクローナル抗体をいう。
抗原に対する結合は類似の特異性を有する。
以下、本発明を一定の実施形態と一定の図面を参照して説明するが、本発明はそれらに限定されず、請求の範囲のみにより限定される。
Biologie,University of Ghent K.L.Ledega
nckstraat 35,B−9000 Ghent、ベルギー)に寄託された「細胞株16D3」とも称されるハイブリドーマ細胞株である。さらに、本発明はモノクローナル抗体16D3に由来するモノクローナル抗体を産生する細胞株を提供する。そのような細胞株は、モノクローナル抗体16D3をコードする配列、最も特には16D3の非抗原結合領域をコードするコード配列を修飾することにより得ることができる。行なうべき修飾の性質を決定する方法および適切な修飾の例を本書に記載する。
A配列の増幅およびクローニングと、その後の15アミノ酸リンカー配列の挿入、例えば2工程ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による(Gly4Ser)3のVHとVLとの間への挿入を含み得る(例えば、Dieffenbach and Dveksler,“PCR Primer,a laboratory manual”(1995),Cold Spring Harbour Press,Plainview,NY,USAを参照)。得られたフラグメントは、次に、単鎖可変フラグメントを可溶性またはファージ提示ポリペプチドとして発現するために適切なベクターに挿入することができる。これは、当業者に周知の方法、例えばGilliland等(Tissue Antigens(1996)47:1−20)に記載された方法により達成することができる。
biosystem合成機、例えばMilligen(USA)から入手可能なモデル9050や関連技術からのモデル等のポリペプチド合成機を用いた合成により得ることができる。
の抗原への結合に関わらないアミノ酸を置換することにより達成される。さまざまなタイプまたはレベルのヒト化が想定される。本発明の特定の実施形態は、非ヒト抗体またはフラグメントの全領域、特には定常領域が、キメラ(例えばヒト/マウス)抗体またはフラグメントをもたらすようにヒト抗体の定常領域により置換された抗体またはフラグメントに関する。さらに特定の実施形態は、PlGFに対する非ヒト抗体の抗原結合アミノ酸(例えば、2つ以上のCDR)がヒト抗体の骨格に導入された抗体(例えば、CDRグラフト化抗体)である。非ヒトモノクローナル抗体の結合相補性決定領域(「CDR」)をヒトフレームワーク領域(特に、ヒト遺伝子の定常C領域)に結合させる方法は、例えば、Jones等(Nature(1986)321:522)またはRiechmann(Nature(1988)332:323)により開示されているように当業者に公知である。もしくは、本発明の非ヒト抗PlGF抗体のさらに限られた数のアミノ酸の置換も想定される。本発明の特定の実施形態は、図9のヒト化可変重鎖および/または軽鎖領域またはそれらの一部を含む抗体および配列番号17〜配列番号22の少なくとも2つ、さらに特には3〜5つ、最も特には6つすべてのCDRを含む抗体に関する。本発明のさらなる実施形態は、配列番号6および配列番号8のそれぞれに少なくとも80%、特には少なくとも85%、さらに特には少なくとも90%、最も特には少なくとも95%の配列同一性を有する可変の重鎖および/または軽鎖領域を含むヒト化抗体に関する。もしくは、本発明は配列番号17〜22のそれぞれに対して少なくとも80%、特には少なくとも85%、さらに特には少なくとも90%、最も特には少なくとも95%の配列同一性を有する少なくとも2つ、さらに特には3〜5つ、最も特には6つすべてのCDRを含むヒト化抗体を提供する。
より、例えば、PlGFをマウスに注射し、次に脾臓リンパ球をマウスミエローマ細胞系に融合した後に、(例えば、PlGFへの結合に関するスクリーニングにより)抗PlGF抗体を産生する細胞培養物を同定し、それらをクローニングすることにより産生される。抗体の任意のさらなる選択は16D3エピトープに対する反応性、または抗体16D3またはそのフラグメントとの競合に基づいて実施される。
よる血液と酸素の供給が減少し、網膜の末梢部がそれらの栄養源を失い、適切に機能することを止める。網膜症の一般的原因は、網膜中心静脈閉塞症、頸動脈の狭窄、糖尿病(糖尿病性網膜症)および貧血(鎌状赤血球網膜症)である。網膜症は早産児にも観察される(未熟児網膜症)。糖尿病性網膜症は糖尿病患者の視力喪失の主要な原因である。虚血性網膜では、新しい血管の増殖が起こる(新血管形成)。これらの血管は、網膜の表面、視神経、または虹彩上の目の前面でしばしば成長する。これらの新しい血管は必要な栄養の流れを交換することができず、その代わりに、硝子体出血、網膜剥離および調節されない緑内障等の多くの問題を引き起こしうる。これらの問題は、新しい血管は壊れやすく、出血する傾向があるために生じる。その初期段階で発見されれば、増殖性糖尿病性網膜症の進行は汎網膜光凝固により時には止めることができる。しかし、硝子体切除術が唯一の選択肢である場合もある。血管新生が重要な役割を果たしていると思われる他の目の病気は、脈絡叢および他の眼球内疾患、白質軟化症および新生物と転移である。脈絡膜血管新生は、脈絡膜から始まる新しい血管のブルッフ膜の破壊を経た網膜下色素上皮(sub−RPE)または網膜下腔への増殖である。CNVの位置、成長パターンおよびタイプ(1または2)は患者の年齢や基礎疾患に依存する。出血と浸出はさらなる増殖とともに起こり、視覚症状の主な原因となる。脈絡膜血管新生(CNV)は、視力喪失の主要な原因である。CNVは近視者の5〜10%に起こると推定され、治癒期中に事実上すべての脈絡膜破裂において起こる。ほとんどが自発的に退行するが、患者の15〜30%で、CNVは再発し、視力喪失を伴う出血性または漿液黄斑性剥離に至る。
イドも癒着の一形態である。胎盤成長因子(PlGF)の阻害は術後癒着形成の著しい抑制を導くことが示された(WO03063904)。
al.,1999)Toxicologic pathology 27(l):78−86)。最近の研究は、VEGF阻害剤が、健康な気管と甲状腺の血管の退縮を引き起こすし、それによって臓器障害がもたらされることもあることを記載している(Baffert et al,2004,Circ Res 94:984−992;Inai et al.,2004 Am J Pathol 165:35−52)。それにもかかわらず、抗ヒトVEGF抗体であるベバシズマブは、創傷治癒、血圧および血栓症の危険性に対するその観察される効果にもかかわらず、腫瘍縮退に対するこの抗血管新生アプローチの全体的有効性のために、血管新生の抑制因子として現在販売されている。本発明の抗PlGF抗体および誘導体は、血圧、創傷治癒、血栓症の危険性、および健康な器官での血管退縮に対するこれらの観察された副作用なしに、望まれない血管新生の阻害を可能とする。
スおよび一価抗体の乏しい保持等、抗体の投与に関連した多くの潜在的な制限を克服することが可能となる。インビボ生産は抗体の免疫原性を低下させ、抗体の耐容性を良好とし、抗原結合性分子またはそれらのフラグメントの効果的で持続的なレベルをもたらす。さらに、遺伝学的アプローチは抗原結合性分子に対する新しい機能の提供を可能とする。さまざまな細胞/組織によるモノクローナル抗体のインビボ生産と全身送達の実現可能性がウイルスベクターによるインビボ遺伝子移入を用いて示された(Pelegrin et
al.,2004,Gene Ther 4:347−356)。抗血管形成活性を有する抗ラミニン抗体による線維肉腫細胞の遺伝子組み換えにより、インビトロおよびインビボでの腫瘍増殖の減少も示されている(Sanz et al.2001,Cancer Immunol Immunother 50:557−565)。
動物モデルにおける本発明の抗原結合性分子の使用に関する。そのようなモデルとして、nu/nuマウスでのヒト腫瘍の増殖と発達が研究される腫瘍モデルが挙げられるが、これに限定されない。試験化合物と本発明の抗体またはフラグメントとの併用投与は、その化合物が本発明の抗体もしくはフラグメントのみを投与した際に観察された効果に対して相加効果を有するかどうかを同定することを可能とする。抗PlGF抗体と組み合わされた化合物の対抗有効性または毒素等の他の側面もまたこのようにして決定できる。
実施例
1.マウスの免疫付与と融合
ヒトPlGFに対するモノクローナル抗体は基本的にはGalfreおよびMilstein(Galfre F,Milstein C. Preparation of monoclonal antibodies:strategies and procedures. Method Enzymol 1981;73:3−46)に記載されたように作った。手短に説明すれば、PlGFノックアウトマウス(Luttun et al.,2002,Biochem Biophys Res Comm 295(2):428−34,Carmeliet et al.(2001),Nat Med 7:575−593またはWO01/85796)を、フロイント完全アジュバント中の50μgの組換えヒトPlGF−2(Pichiaにおいて産生)の皮下注射と、それから2週間後のフロイント非完全アジュバント中の50μgの組換えヒトPlGFの皮下注射により免疫付与した。血液試料(約100μl)を10日後にマウスの尾から集めた。血清は、ヒトPlGFをキャプチャとして被覆したマイクロタイタープレート、希釈血清の適用(1/500〜1/8000)および標識用に西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)複合化ヤギ抗マウスIgGを用いるELISAにより抗huPlGF抗体について調べた。
2.ProSep vA Ultraによる抗体の精製
ProSep vA Ultra(Millipore)を用いるアフィニティクロマトグラフィによって、製造者の手順書にしたがって抗体を細胞培養物から精製した。手短に説明すれば、150mMのNaClを上清に加え、PBSで前もって平衡化しておいたProSep vA Ultraカラムに上清を加えた。カラムはPBSで洗浄し、結合タンパク質を0.1Mグリシン(pH2.8)で溶出した。溶出タンパク質はPBSに対
して透析した。溶出タンパク質の純度は還元および非還元状態下でSDS−PAGEにより確認した。
3.(実施例2に記載したように得た)16D3/hu16D3のPlGFに対する結合(図1を参照)
ELISAプレートを、PBS中の1μg/mlのhuPlGF−2(Pichia)により100μL/ウエルにて4℃で被覆した。1%BSAによる1時間、室温でのブロッキング後、16D3/hu16D3の希釈系列を100μL/ウエルで加え、抗体を1時間室温で結合させた。結合した16D3をヤギ抗ヒトまたはヤギ抗マウスIgG−HRP(Sigma)により100μL/ウエルにて、1時間、室温で検出した。アッセイはOPDにより開発された。
4.huFlt−1レセプターに対するPlGF結合の阻害(図2を参照)
ELISAプレートを、1μg/mlのhuFlt−1(R&D Systems)により200μL/ウエルにて4℃で被覆した。1%BSAによる1時間、室温でのブロッキング後、16D3/hu16D3の希釈系列を100μL/ウエルで加え、さらに100μL/ウエルのhuPlGF−2を加えた。室温での2時間のインキュベーション後、結合したPlGFをヤギ抗huPlGF(R&D Systems)により180μL/ウエルにて、1時間、室温で検出した後に、RAG−HRP(DAKO)とともに1時間、室温でインキュベートした。アッセイはOPDにより展開された。
5.Biacore実験による16D3およびFab 16D3のさらなる特徴づけ
・阻害:rhuPlGF−2(Pichia,TX)を、EDC/NHS化学(アミンカップリングキット、Biacore)を用いてCM5チップに固定化して、412RUを得た。16D3を注射した後、rhuFlt−1/Fcキメラ(R&D Systems)を注射した。この操作を、マウス抗体の代わりに緩衝液を用いても実施した。これらはネガティブコントロール流路にわたっても注入し、これらの値は既に差し引いた。このアッセイはリン酸緩衝液(pH9.6)で実施した。
6.16D3のマウス可変領域のクローニングと配列決定
・mRNAの単離:16D3のハイブリドーマ細胞のmRNAをQuickPrep(登録商標)マイクロmRNA精製キット(Amersham Biosciences)を用いて単離した。このmRNAは、First−Strand cDNA合成キット(Amersham Biosciences)を用い、キットで利用できるpd(N)6プライマーによりcDNAを作るために使用された。
・PCR:重鎖および軽鎖の可変部分の配列は、一群のプライマー(リーダー配列で始まる8プライマーと重鎖の定常領域で始まる2プライマー、リーダー配列で始まる11プライマーと軽鎖の定常領域で始まる1プライマー)を用いるPCRを実施することにより見出した。プライマーの異なる組合せによる8回および11回のPCR反応を実施した。
抗体16D3の重鎖のために用いられるプライマー:
MHVR3 5’−ATG GRA TGG AGC TGK ATC WTT HTC−3’(配列番号9)
MHCR1 5’−CAS AYM CAG GGG CCA GTG GAT AGA
C−3’(配列番号10)
抗体16D3の軽鎖のために用いられるプライマー:
MKVR3 5’−ATG RAG TCA CAK ACY CAG GTC TTY
RTA−3’(配列番号11)
MKCR1 5’−GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TGG−3’(配列番号12)
PCRセットアップ:変性、10分間、94℃;変性、30秒間、94℃;アニーリング
、30秒間、55℃;伸長、1分間、72℃;伸長、5分間、72℃;サイクル数、30回。
・クローニングおよび配列決定:PCR産物をアガロースゲルに負荷し、右側のバンドを選択し、精製し(QIAquick(登録商標)Gel Extractionキット、Qiagen GmbH社)、配列決定用Zero Blunt(登録商標)TOPO(登録商標)PCRクローニングキット(Invitrogen(登録商標) life technologies)に供給されたpCR(登録商標)4Blunt−TOPO(登録商標)ベクターにクローニングした。プラスミドDNAはHigh Pure Plasmid Isolation Kit(Roche Diagnostics社)を用いて調製し、T7およびM13リバースプライマーを用いてABI PRISM(登録商標)310(PE Applied Biosystems)により挿入物の配列を決定した。
・抗体16D3の重鎖と軽鎖の可変領域の塩基配列とアミノ酸配列を配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4に示す(図11を参照)。
1.ヒト化16D3の構築
可変領域のヒト化
・変異:マウス抗体16D3の可変部分をヒト化するために以下の変異を行なった:
重鎖: I2V
P9A
K40A
T111L
軽鎖: S5T
S9D
A15L
K18R
R22N
L89V
・変異はQuickChange(登録商標)Multi Site−Directed
Mutagenesis Kit(Stratagene社(登録商標))を用いて行なった。変異を含む1〜5プライマーを1回のPCRに使用することができた。形質転換後、コロニーを採集し、DNAの配列決定を行なって、ほとんどの点突然変異を有するクローンを決定した。このクローンを取って、すべての変異が配列に存在するまでこの操作を繰り返した。
可変領域のヒトIgG定常領域への連結:
PCRを実施することにより、適切な制限部位が付加された重鎖と軽鎖のヒト化可変部分を得た。
軽鎖の可変部分用プライマー:
プライマー1:5’−CCACCGGT GAC ATT GTG CTG ACC CAG TCT CC−3’(配列番号13)
プライマー2:5’−CACCGTACG TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC CGA G−3’(配列番号14)
重鎖の可変部分用プライマー:
プライマー3:5’−CAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT G−
3’(配列番号15)
プライマー4:5’−GATGGGCCCTTGGTCGACGC TGA GGA GAC TGT GAG CAG GG−3’(配列番号16)
PCRセットアップ:変性、5分間、94℃;変性、30秒間、94℃;アニーリング、30秒間、60℃;伸長、30秒間、72℃;伸長、5分間、72℃;サイクル数、25回。
2.hu16D3の一時的発現
FreeStyle 293 Expression System(Invitrogen)を製造者の使用説明書にしたがって使用して、Hu16D3 IgG4κをHEK293細胞に一時的に発現させた。Hu16D3は、proSep vA Ultraによるアフィニティクロマトグラフィを用いて上清から精製した。精製Hu16D3は、還元および非還元条件下でSDS−PAGEにより純度を確認した。Hu16D3は、huPlGFに対する結合に関して、およびHuPlGF/huFLT−1結合の阻害に関して、ELISAによりさらに調べた(図1および図2を参照)。
1.材料と方法の一般的説明
細胞培養
マウス膵臓細胞株Panc02およびヒト膵臓細胞株DanGはS.Rosewicz(Charite−Universitatsmedizin、ベルリン、ドイツ)の親切な寄贈品である。ヒト乳房MDA−MB、結腸LOVOおよび黒色腫Mel2a細胞株はAmerican Type Culture Collection(ATCC;マナッサス、VA、USA)から得た。すべての細胞は推奨されたように培養した。抗体に対する免疫反応を避けるために、マウス16D3抗PlGF抗体をすべてのインビボ実験に用いた。
実験動物
すべての動物手順は、動物実験委員会(the institutional animal care and use committee)により完全に承認された。メスNMRI nu/nuマウスを準滅菌条件下で収容し、8〜10週齢(およその体重、25g)で定期的に使用した。腫瘍源の調製のために、腫瘍細胞をトリプシン処理して単細胞懸濁物を調製し、PBSで洗浄した。その遠心ペレットを200μlのPBSに再懸濁し、マウスの右脇腹に皮下注射した。同所性膵臓腫瘍モデルのために、30μlのPB
S中の1×106腫瘍細胞を、9〜10週齢のメスC57B16マウスの腹部開腹術により膵臓頭部に注射した。これらの手順の前に、マウスはケタミン(90mg/体重kg)およびキシラジン(9mg/体重kg)で麻酔した。
医薬(すなわち、抗体、ビヒクル等)の投与
抗体またはビヒクルコントロールによる処置は、腫瘍が約60mm3の大きさに達したときに開始した。抗体P15D11D4(WO01/85796)、16D3、1C8またはビヒクルは、示された用量で腹腔内に1日おきに投与した。Avastinは、示された用量で腹腔内に週2回投与した。
腫瘍の測定
皮下増殖している腫瘍を、キャリバーを用いて1日おきに測定し、腫瘍容積を式:p/6(w1×w2×w2)(式中、w1とw2は最大腫瘍直径と最小腫瘍直径をそれぞれ表す)を用いて計算した。マウスを屠殺したときに、膵臓の同所性増殖腫瘍を同じ方法を用いた腹部開腹術後に測定した。
統計分析
統計分析は、GraphPad統計ソフトウエア(GraphPad Software社、サンジエゴ、CA)を用いるペア観察のために両側スチューデントt検定により実施した。すべてのデータは、別途の指定がない限り、平均±SEMとして示す。別途の指定がない限り、*p<0.5、**p<0.01である。
2.皮下ヒト膵臓DanG異種移植片腫瘍モデルにおける腫瘍増殖のマウス抗hPlGF抗体16D3による阻害
1×106腫瘍細胞を、11週齢のメスNMRI nu/nuマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍が約60mm3の大きさに達した後、抗hPlGF(16D3、50mg/体重kg;n=10)、抗mPlGF(PL5D11D4(WO01/85796に記載のように得たもの;50mg/体重kg;n=10)、コントロールIgG(1C8;50mg/体重kg;n=10)、抗hPlGFと抗mPlGFの組合せ(それぞれが25mg/体重kg;n=10)およびビヒクル(n=10)による処置を開始した。抗体を1日おきに腹腔内に注射した。(A)腫瘍を1日おきに測定し、腫瘍容積を式:W1×W2×W2×p/2(式中、W1は最大直径およびW2は最小直径を示す)を用いて計算した。(B)マウスを腫瘍接種の18日後に屠殺し、腫瘍を切除し、重量を測定した。平均腫瘍容積:ビヒクル:915±90mm3、IgG:±89mm3、PL5D11D4:832±118mm3、16D3:521±83mm3、PL5D11D4+16D3:497±86mm3。
3.抗hPlGFは皮下ヒト膵臓DanG異種移植片腫瘍モデルの腫瘍増殖を用量依存的に阻害する。
4.抗huPlGFは皮下ヒト乳房MDA−MB異種移植片腫瘍モデルの腫瘍増殖を阻害する。
材料と方法は実施例3に記載したとおりであった。
材料と方法は実施例3に記載したとおりであった。
重鎖と軽鎖の可変部分の配列(それぞれ配列番号2と配列番号4、実施例1に記載されたように得られたもの)を、適切な制限結合部位とリンカーを有するプライマーを用いたPCRにより増幅した。SOE PCR(オーバーラップ伸長による遺伝子スプライシング)後、scFvをpEE14.4(HindIII−EcoRIクローニング部位)に
クローニングした(図12)。このscFvhp16D3/pEE14.4は、Fugene 6(Boehringer Mannheim)を用いたBamHIによる直線化の後に、CHO−KI細胞に移入し、希釈により2回サブクローニングした。モノクローナルscFv hp16D3、6C5D4が得られ、作られた。このクローンもまたscFv hp16D3/pKANEO−MCS50−dhfr1(NheI−NotIクローニング部位)と平行してProducellにより293細胞に一時的に移入した(図13)。
scFvの可変領域のヒト化を実施例2に記載のように実施した。16D3のヒト化scFvの塩基配列とアミノ酸配列を配列番号25と配列番号26にそれぞれ示す。ヒト化scFvの重鎖と軽鎖の可変領域、リンカー配列とHA−tagおよびHis Tagを示すアミノ酸配列も図15に示す。
1.ヒト化scFv16D3からVHフラグメントとVLフラグメントを増幅する
ヒト化scFv16D3のVHフラグメント増幅用プライマー
_16D3Vhbackblunt 5’−CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTG−3’(配列番号27)
16D3VhforSalI 5’−GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACTGTGAGCAGGG−3’(配列番号28)
ヒト化scFv16D3のVLフラグメント増幅用プライマー
_16D3VLBackAgeI 5’−CCACCGGTGACATTGTGCTGACCCAGTCTCC−3’(配列番号29)
16D3VLForBsiWI 5’−CACCGTACGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCGAG−3’(配列番号30)
2.重鎖ベクターと軽鎖ベクターの構築
最初に、軽鎖のPCR産物をpCR4blunt−TOPOベクターにクローニングした。配列決定後、軽鎖をAgeIとBsiWI消化により取り出し、pKANEO−CM30−Lvar#7ベクターにクローニングした。重鎖のPCR産物は消化後にpKANEO−MCS50−Fabvar#3に直接クローニングした。
3.重鎖構築物と軽鎖構築物の連結
軽セグメントを含むカセットを取り出し、これを、酵素PmeIとPacIを用いて重セグメントを含むベクターに付加することにより、軽セグメントと重セグメントを含む(上記の)両ベクターを結合させて、最終構築物hpl6D3mutcmplFab/pKANEO−MCS50−Fabvar#3を得た(図16を参照)。
1.抗原結合ELISA
ELISAプレートを、PBS中の1μg/mlのhuPlGF−1により、200μL/ウエルにて、4℃で被覆した。1%BSAによる1時間室温でのブロッキング後、scFv16D3/ヒト化scFv16D3の希釈系列を200μL/ウエルで加え、抗体
フラグメントを1時間室温で結合させた。結合したscFv16D3を、マウス抗HA(180μL/ウエル、1時間、室温)により検出した後、ヤギ抗マウスIgG−HRP(Sigma)とともに170μL/ウエルにて1時間室温でインキュベートした。アッセイはOPDにより展開された。
2.ELISAによるPlGF/Flt−1相互作用の阻害
ELISAプレートを、1μg/mlのhuFlt−1(R&D Systems)により、200μL/ウエルにて、4℃で被覆した。1%BSAによる1時間室温でのブロッキング後、scFv16D3/ヒト化scFv16D3の希釈系列を100μL/ウエルで加え、さらに100μL/ウエルのhuPlGF−2を加えた。室温での2時間のインキュベーション後、結合したPlGFを、ヤギ抗huPLGF(R&D Systems)により180μL/ウエル、1時間、室温で検出した後、RAG−HRP(DAKO)とともに、1時間室温でインキュベートした。アッセイはOPDにより展開された。
1.抗原結合ELISA
ELISAプレートを、PBS中の1μg/mlのhuPlGF−1により、100μL/ウエル、4℃で被覆した。1%BSAによる1時間室温でのブロッキング後、ヒト化Fab16D3の希釈系列を100μL/ウエルで加え、抗体フラグメントを1時間室温で結合させた。結合したヒト化Fabl6D3は抗huIgG−HRP(Fab特異的)(100μL/ウエル、1時間、室温)で検出した。アッセイはOPDにより展開された。結果を図17Aに示す。
2.ELISAによるPlGF/Flt−1相互作用の阻害
ELISAプレートを、1μg/mlのhuFlt−1(R&D Systems)により、200μL/ウエルにて、4℃で被覆した。1%BSAによる1時間室温でのブロッキング後、ヒト化scFab16D3の希釈系列を100μL/ウエルで加え、さらに100μL/ウエルのhuPlGF−2を加えた。室温での2時間のインキュベーション後、結合したPlGFを、ヤギ抗huPlGF(R&D Systems)により180μL/ウエルにて1時間、室温で検出した後、RAG−HRP(DAKO)とともに、1時間室温でインキュベートした。アッセイはOPDにより展開された。それらの結果を図17Bに示す。
16D3、ヒト化16D3 IgG4、ヒト化scFv16D3およびヒト化Fab16D3のそれぞれのKD値を、Biacoreを用いて決定した。結果を以下の表4に示す。
6D3のKD値。
Claims (29)
- 配列番号17〜配列番号22からなる群から選択される少なくとも2つのCDRを含むか、またはそれらに対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも2つの配列を含むことを特徴とするPlGFに結合することのできる抗原結合性分子。
- 配列番号17〜配列番号22の配列に対応するCDR領域またはそれらに対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする請求項1記載の抗原結合性分子。
- Fab、Fab’またはF(ab’)2、少なくとも2つの相補性決定領域(CDR)の組合せ、可溶性または膜固定の単鎖可変部分または単一の可変ドメインからなる群から選択される分子である請求項1または2記載の抗原結合性分子。
- 配列番号2の配列を含む重鎖可変領域を含むか、またはCDR領域内でそれと少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含み、かつ配列番号4の配列を含む軽鎖可変領域を含むか、またはCDR領域内でそれと少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする請求項1または2記載の抗原結合性分子。
- LMBP 6399CBとして寄託された細胞株により産生される抗体16D3またはそのフラグメントである請求項1〜4のいずれかに記載の抗原結合性分子。
- ヒト化抗体または抗体フラグメントである請求項1〜4のいずれかに記載の抗原結合性分子。
- ヒト/マウスハイブリッド抗体または抗体フラグメントである請求項1〜4のいずれかに記載の抗原結合性分子。
- 前記CDR領域がヒト抗体の骨格にグラフトされた請求項1〜4のいずれかに記載の抗原結合性分子。
- 前記ヒト抗体がIgG1κまたはIgG4κである請求項8記載の抗原結合性分子。
- 配列番号17〜配列番号22からなる群から選択される少なくとも2つのCDRか、またはそれらに対して少なくとも80%の配列同一性を有する少なくとも2つの配列を含むPlGFに結合する単鎖可変フラグメントである請求項1または2記載の抗原結合性分子。
- 配列番号24のアミノ酸配列を含む請求項10記載の抗原結合性分子。
- ヒト化抗原結合分子である請求項11記載の抗原結合性分子。
- 配列番号26のアミノ酸配列を含む請求項12記載の抗原結合性分子。
- 請求項1または2記載の抗原結合性分子を産生する細胞株。
- LMBP 6399CBとして寄託された細胞株である請求項14記載の細胞株。
- 有効成分として、請求項1〜13のいずれかに記載のPlGF結合分子を医薬的に許容される担体と混合して含む、哺乳動物の病的状態における望まれない血管新生の予防また
は治療のための医薬組成物。 - さらに、治療有効量の別の血管新生阻害剤を含む請求項16記載の医薬組成物。
- 前記別の血管新生阻害剤が、VEGF阻害剤とbFGF阻害剤からなる群から選択される請求項17記載の医薬組成物。
- 前記VEGF阻害剤が抗VEGF抗体である請求項18記載の医薬組成物。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の抗原結合性分子をコードするポリヌクレオチド。
- 哺乳動物の病的状態において望まれない血管新生を治療および/または予防する方法において、そのような治療または予防を必要とする哺乳動物に請求項1〜13のいずれかに記載の1つ以上の抗原結合性分子である治療有効量の有効成分を投与することからなる方法。
- 病的状態が、癌、炎症、癒着形成、目の病気、肺性高血圧および血液漏出からなる群から選択される請求項21記載の方法。
- 前記癌が、結腸癌、乳癌、膵臓癌および黒色腫からなる群から選択される請求項22記載の方法。
- ヒト試料中のPlGFの免疫学的検出のための請求項1〜13のいずれかに記載の抗原結合性分子の使用。
- 癌の治療でPlGF阻害に対して相加作用を有する化合物のスクリーニングのための請求項1〜13のいずれかに記載の抗原結合性分子の使用。
- インビトロ診断ツールとしての請求項1〜13のいずれかに記載の抗原結合性分子の使用。
- 哺乳動物の病的状態において望まれない血管新生を治療および/または予防するための医薬の製造のための請求項1〜13のいずれかに記載の抗原結合性分子の使用。
- 病的状態が、癌、炎症、癒着形成、目の病気、肺性高血圧および血液漏出からなる群から選択される請求項27記載の使用。
- 前記癌が、結腸癌、乳癌、膵臓癌および黒色腫からなる群から選択される請求項28記載の使用。
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