BRPI0609151A2 - anticorpo anti-plgf - Google Patents

Abstract

ANTICORPO ANTI-PLGF. A presente invenção refere-se a novos anticorpos monoclonais direcionados para PIGF e fragmentos e derivados dos mesmos, mais particularmente a anticorpos humanizados e fragmentos desses para uso no tratamento e/ou prevenção de angiogênese patológica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPO ANTI-PLGF".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a novos anticorpos e fragmentos e derivados desses particularmente adequados para a inibição de angiogê-nese em condições patológicas. A invenção também se refere a linhagens celulares que produzem anticorpos específicos. A presente invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem anticorpos, fragmentos e/ou derivados da invenção e fornece métodos de prevenir e tratar angiogênese e/ou extravasamento vascular onde esses são indesejados tais como em formação de tumor, doenças do olho, hipertensão pulmonar e distúrbios in-flamatórios e métodos para prevenir e tratar distúrbios ósseos tal como oste-oporose.

Antecedentes da Invenção

A formação anormal de vasos sangüíneos contribui para a pato-

gênese de várias doenças com alta morbidade e mortalidade. A elucidação dos mecanismos que dão suporte ao crescimento vascular pode permitir o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para estimular o crescimento vascular em tecidos isquêmicos ou para suprimir sua formação em tumores.

Estudos recentes direcionados a genes em embriões identificaram alguns dos mecanismos envolvidos na formação inicial de canais endoteliais (angiogênese) e sua maturação subseqüente pelo revestimento com células musculares lisas (arteriogênese). Surgiu a evidência de que mecanismos moleculares distintos podem mediar o crescimento de vasos sangüíneos durante condições patológicas, mas os fatores moleculares permanecem amplamente indeterminados.

Foi estabelecido que o Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) está implicado no desenvolvimento e crescimento patológico da vasculatura (Ferrara N. et al., 1999, Curr. Top. Micróbio!. Immunol. 237, 1-30). Além disso, também foi mostrado que o fator de crescimento Placen-tário (PIGF), um homólogo de VEGF, é um modulador específico de VEGF durante uma variedade de condições patológicas, tais como retinopatiaisquêmica, tumorigênese, distúrbios inflamatórios e edema. Foi mostrado que camundongos PIGF"7" têm angiogênese e arteriogênese prejudicada na doença (Carmeliet P. et al., 2000, J. Pathol. 190, 387-405), enquanto a angiogênese fisiológica em saudáveis normais permanece não afetada. Assim, 5 inibidores de PIGF têm um imenso potencial pára o tratamento de doenças nas quais a angiogênese ou arteriogênese contribuem para a patogenicida-de da doença.

Inibidores de PIGF são conhecidos na técnica, tal como um anticorpo policlonal de cabra contra PIGF humano (R&D Pharmaceuticals, A-

bingdon, UK) e um anticorpo policlonal de galinha (Gassmann et al., 1990, Faseb J. 4, 2528). Esses anticorpos são usados para estudos de Western blotting, histoquímica e de imunoprecipitação. WO01/85796 descreve o uso de inibidores de PIGF, incluindo os anticorpos monoclonais anti-PIGF, para o tratamento ou prevenção de doenças, tais como formação tumoral. Mais es-

pecificamente, a preparação de anticorpos monoclonais de murino que ini-bem-completamente a ligação de PIGF-2 de murino ao seu receptor FIM, está descrita, através da qual o anticorpo Mab-PL5D11, é selecionado como tendo a atividade inibitória mais eficiente. O uso de anticorpo em modelos animais de angiogênese patológica está descrito.

Anticorpos gerados em animais têm características que podem

limitar severamente seu uso na terapia humana. Como proteínas estranhas, eles podem fazer surgir uma resposta antiimunoglobulina (que para anticorpos de camundongo é referida como anticorpo humano anticamundongo ou HAMA) que reduz ou destrói sua eficácia terapêutica e/ou provoca reações

alérgicas ou de hipersensibilidade em pacientes, como mostrado por Jaffers et al., 1986 (Transplantation 1986 41:572). Embora o uso de anticorpos monoclonais humanos possa lidar com essa limitação, foi provado ser difícil gerar grandes quantidades de anticorpos humanos anti-humano pela tecnologia de hibridoma convencional. A tecnologia recombinante tem, portanto,

sido usada na técnica para construir anticorpos "humanizados" que mantém a alta afinidade de ligação do animal, tal como anticorpos monoclonais de murino mas que exibem imunogenicidade reduzida em seres humanos. Emparticular, foram sugeridos anticorpos quiméricos nos quais a região variável (V) de um anticorpo não humano é combinada com a região constante (C) de um anticorpo humano. Métodos de obter tais imunoglobulinas quiméricas estão descritos em detalhes na Patente U.S. 5.770.198. Em outras tentativas de reduzir a imunogenicidade de anticorpos de murino, apenas a região de determinação de complementaridade (CDR), isto é regiões de hipervariabili-dade nas regiões V, ao invés do domínio V completo, são transplantadas para um anticorpo humano. Tais anticorpos humanizados são conhecidos como anticorpos de CDR enxertada. A construção de anticorpos de CDR enxertada que reconhecem mais antígenos complexos tem resultado em anticorpos que tem atividade de ligação significativamente menor do que os anticorpos não humanizados nativos. Em vários casos foi demonstrado que a mera introdução de CDRs não humanas em uma cadeia principal de anticorpo humano é suficiente para manter a atividade de ligação total. Apesar de um modelo computadorizado refinado do anticorpo de murino de interesse ser necessário a fim de identificar os aminoácidos críticos a serem considerados no esboço de um anticorpo humanizado, e regras teóricas gerais terem sido propostas para tal esboço, em todos os casos o procedimento deve ser detalhado e otimizado para o anticorpo não humano em particular de interesse.

Subseqüentemente, permanece uma necessidade por anticorpos (monoclonais) que inibam otimamente a ligação de PIGF humana ao seu receptor. Além disso, tais anticorpos também precisam ser não imunogêni-cos, já que eles não podem fazer surgir HAMA (ou ter uma baixa tendência de fazê-lo).

Sumário da Invenção

A presente invenção se refere a novos anticorpos monoclonais e derivados desses direcionados para PIGF e capazes de inibir a ligação de PIGF ao seu receptor. Os presentes ligantes são os primeiros a demonstrara inibição de PIGF humano em uma condição patológica in vivo. Mais especificamente, os anticorpos e derivados desses de acordo com a presente invenção são capazes de reduzir o tamanho do tumor e a vascularização detecido tumoral humano in vivo. Os anticorpos da presente invenção fornecem uma alternativa para terapias antiangiogênicas que atingem VEGF atualmente usadas, com a importante vantagem de que os efeitos colaterais causados pela inibição da angiogênese patológica associada com essas te-5 rapias são significativamente reduzidos.

A presente invenção se refere a moléculas de ligação a antíge-no, particularmente anticorpos monoclonais, fragmentos ou derivados desses, incluindo anticorpos humanizados e fragmentos de anticorpo, que se ligam ao mesmo epitopo de PIGF como o anticorpo referido aqui como 16D3.

Um primeiro objetivo da presente invenção é o fornecimento de novos anticorpos monoclonais capazes de se ligar a PIGF e que tem a capacidade de inibir o funcionamento de PIGF, mais especificamente anticorpos caracterizados em que sua região variável de cadeia pesada compreende a seqüência de SEQ ID Ne: 2 ou uma seqüência que tem pelo menos 80%, mais particularmente pelo menos 90%, o mais particularmente 95% de identidade de seqüência com essa dentro das regiões de CDR e/ou em que sua região variável de cadeia leve compreende a seqüência de SEQ ID Ne: 4 ou uma seqüência que tem pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%,mais particularmente pelo menos 90%, o mais particularmente pelo menos 95% de identidade de seqüência com essa dentro das regiões de CDR, tal como o anticorpo 16D3 ou derivados desse. Adicional ou alternativamente, em uma modalidade adicional, as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção têm uma identidade de seqüência dentro das regiões variá- veis da cadeia pesada e/ou leve fora das regiões de CDR que é de pelo menos 70%, particularmente pelo menos 80%, mais particularmente pelo menos 90%, o mais particularmente pelo menos 95% idêntica às seqüências de SEQ ID N9: 2 e SEQ ID Ne: 4 respectivamente.

De acordo com uma modalidade particular da invenção, o anti- corpo é um anticorpo humanizado, mais particularmente um anticorpo híbrido, o mais particularmente um anticorpo híbrido de camundongo/humano, mais particularmente um híbrido de 16D3 de camundongo/lgG1K ou lgG4Khumano. Alternativamente, o anticorpo humanizado é um que compreende as regiões de CDR do anticorpo 16D3 de camundongo da presente invenção capazes de se ligar a PIGF, enxertada na cadeia principal de um anticorpo humano.

Uma modalidade adicional da presente invenção se refere a

fragmentos de ligação a antígeno do anticorpo 16D3 de camundongo ou um derivado dos mesmos, tal como um anticorpo humanizado desse, tal como mas não limitado a um Fab, Fab' ou F(ab')2, uma combinação de pelo menos duas regiões de determinação de complementaridade (CDRs), uma região variável de cadeia única ancorada na membrana ou solúvel ou um domínio variável único. Modalidades particulares de tais fragmentos de ligação ao antígeno incluem fragmentos que compreendem pelo menos duas CDRs de 16D3 ou derivados desse ou mais particularmente pelo menos duas CDRs selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ne: 17(GYTFTDYY), SEQ ID N9: 18 (IYPGSGNT), SEQ ID N9: 19 (VRDSPFFDY), SEQ ID N9: 20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID N9: 21 (WAS) e SEQ ID N9: 22 (KQSYHLFT) ou que compreendem pelo menos duas seqüências que tem pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, mais particularmente pelo menos 90%, o mais particularmente pelo menos 95% de identidade de seqüência com elas. Uma modalidade particular da invenção se refere ao fornecimento de fragmentos variáveis de cadeia única (scFvs) do anticorpo 16D3 de camundongo e scFvs humanizadas que são capazes de inibir a atividade de PIGF. O mais particularmente, a presente invenção fornece scFvs que compreendem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N9: 24 ou SEQ ID N9: 26 ou uma seqüência que tem pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, mais particularmente pelo menos 90%, o mais particularmente pelo menos 95% de identidade de seqüência com essas dentro das CDRs capazes de se ligar a PIGF.

Ainda um objetivo adicional da presente invenção é o forneci- mento de linhagens celulares que produzem os anticorpos monoclonais da presente invenção, mais particularmente a linhagem celular 16D3 que produz o anticorpo 16D3, mas também outras linhagens celulares que são ca-pazes de produzir as moléculas de ligação ao antígeno derivado de 16D3 ou fragmentos desse, por exemplo como um resultado de tecnologia recombi-nante.

Ainda um objetivo adicional da presente invenção é o forneci- mento de uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de angiogênese (indesejada) em condições patológicas ou distúrbios em mamíferos ou para prevenção ou tratamento de reabsorção óssea, que compreende um anticorpo contra PIGF que é 16D3 ou um fragmento ou um derivado, mais particularmente uma versão humanizada de 16D3 ou um fragmento

de ligação ao antígeno desse em mistura com um veículo farmaceuticamen-te aceitável. Uma modalidade específica da invenção é uma composição farmacêutica que compreende um fragmento de ligação ao antígeno de 16D3 ou um derivado desse, que é selecionado a partir do grupo que consiste em um Fab, Fab' ou F(ab')2, uma parte variável de cadeia única ancorada

à membrana ou solúvel ou um domínio variável único. As modalidades mais particulares da presente invenção se referem a composições farmacêuticas que compreendem um fragmento de ligação ao antígeno que compreende pelo menos duas CDRs selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID N9: 17 (GYTFTDYY), SEQ ID N9: 18 (IYPGSGNT), SEQ ID N9: 19

(VRDSPFFDY), SEQ ID N9: 20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID N9: 21 (WAS) e SEQ ID N9: 22 (KQSYHLFT) ou menos duas que tem pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, mais particularmente pelo menos 90%, o mais particularmente pelo menos 95% de identidade de seqüência com duas seqüências diferentes selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID

N9: 17 a 22. Uma modalidade particular da mesma se refere a composições farmacêuticas que compreendem um scFv do anticorpo 16D3 da invenção, mais particularmente que compreendem um scFv que compreende pelo menos duas CDRs selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID N9: 17 (GYTFTDYY), SEQ ID N9: 18 (IYPGSGNT), SEQ ID Ne: 19

(VRDSPFFDY), SEQ ID N9: 20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID N9: 21 (WAS) e SEQ ID N9: 22 (KQSYHLFT) ou pelo menos duas seqüências que têm pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, mais particularmente pelomenos 90%, o mais particularmente pelo menos 95% de identidade de seqüência com duas seqüências diferentes selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID N9: 17 a 22, tal como um scFv que compreende a SEQ ID Nõ: 24. Mais particularmente, a composição farmacêutica compreende um 5 scFv humanizado de 16D3, tal como mas não limitado a scFv humanizado que compreende SEQ ID NQ: 26 ou uma seqüência que tem pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, mais particularmente pelo menos 90%, o mais particularmente pelo menos 95% de identidade de seqüência com essa dentro das CDRs capazes de se ligar a PIGF. Em ainda outra modalidade particular da composição farmacêu-

tica de acordo com a invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz de outro agente antiangiogênico está incluída além da molécula de ligação ao antígeno capaz de se ligar a PIGF da invenção. O mais particularmente em relação a isso, agentes antiangiogênicos tais como inibidores de VEGF- e bFGF-, são considerados, o mais particularmente anticorpos anti-VEGF.

Outro objetivo da presente invenção é fornecer seqüências de nucleotídeos que codificam os fragmentos de ligação ao antígeno dos anticorpos que se ligam a PIGF descritos aqui, mais particularmente seqüências de nucleotídeos que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e leve de 16D3 produzido pela linhagem celular 16D3. O mais especificamente a seqüência de nucleotídeo que codifica as regiões variáveis de SEQ ID N9: 2 e SEQ ID N9: 4 é considerada. Adicionalmente, seqüências de polinucleotí-deo que codificam fragmentos de ligação ao antígeno que compreendem pelo menos duas CDRs de 16D3, mais especificamente, polinucleotídeos que codificam pelo menos duas das CDRs selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID N9: 17 (GYTFTDYY), SEQ ID N9: 18 (IYPGSGNT), SEQ ID N9: 19 (VRDSPFFDY), SEQ ID N9: 20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID N9: 21 (WAS) e SEQ ID N9: 22 (KQSYHLFT) ou que codificam seqüências que compreendem pelo menos duas CDRs que tem pelo menos 80%, parti-cularmente pelo menos 85%, mais particularmente pelo menos 90%, o mais particularmente pelo menos 95% de identidade de seqüência com SEQ ID N9: 17 a 22. Modalidades específicas das seqüências de nucleotídeos dapresente invenção são fornecidas nas SEQ ID N9s: 1, 3, 5 e 6. Modalidades específicas adicionais incluem as seqüências de nucleotídeos que codificam o scFv de 16D3 e versões humanizadas desse, mais particularmente a seqüência de SEQ ID N9: 23 e SEQ ID Ne: 25 e as seqüências que tem pelo 5 menos 80%, particularmente pelo menos 85%, mais particularmente pelo menos 90%, o mais particularmente pelo menos 95% de identidade de seqüência com essas, o mais particularmente dentro de regiões que codificam as regiões de CDR do scFv. Entretanto, será observado que existe uma variedade de seqüências de nucleotídeos que caem dentro do escopo da pre-

sente invenção como um resultado da redundância no código genético.

Outro objetivo da presente invenção é fornecer um método de tratamento e/ou prevenção de angiogênese indesejada (ou patológica) em uma condição patológica em um mamífero, cujo método compreende administrar a um mamífero que necessite de tal tratamento ou prevenção de uma

quantidade terapeuticamente eficaz de um princípio ativo que é o anticorpo 16D3 da presente invenção ou um fragmento de ligação de antígeno ou derivado desse, o mais particularmente um scFv como aqui descrito. Particularmente adequados para os métodos da presente invenção são os anticorpos humanizados e fragmentos de anticorpo, tal como scFv de 16D3 ou de-

rivados do mesmo. Uma modalidade particular do método da invenção se refere ao tratamento e/ou prevenção de condições patológicas tais como, mas não limitadas a câncer, inflamação, doenças do olho, hipertensão pulmonar e extravasamento vascular. Um objetivo particular da presente invenção é fornecer uma terapia eficaz e segura (isto é, sem efeitos colaterais)

para a angiogênese patológica, mais em particular para crescimento tumoral, inflamação, doenças do olho ou extravasamento vascular, em mamíferos, mais particularmente em seres humanos. O mais particularmente, o método da presente invenção é adequado para o tratamento e/ou prevenção de tumores sólidos, mais particularmente, para o tratamento e/ou prevenção de

câncer de cólon, câncer de mama, câncer pancreático e melanomas.

Usos adicionais dos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção se referem a detecção imunológica de PIGF emamostras humanas, como porções marcadas em métodos de diagnóstico e para o rastreamento de compostos com um efeito aditivo para inibição de PIGF no tratamento de câncer.

A presente invenção se baseia na determinação surpreendente de novos ligantes, denominados novos anticorpos monoclonais de murino e humanizados e fragmentos, derivados e homólogos desses que inibem PIGF muito eficientemente. O mais particularmente, a presente invenção demonstra ligantes capazes de reduzir o crescimento tumoral, o mais particularmente capazes de reduzir o tamanho de um tumor entre 20% e 50%.

Breve Descrição das Figuras

A seguinte descrição, não pretendida para limitar a invenção às modalidades específicas aqui descritas, pode ser entendida em conjunto com as figuras que a acompanham, incorporadas aqui como referência, nas quais:

Figurai: Ligação de anticorpo 16D3 (A) ou anticorpo 16D3

humanizado (hu 16D3) (B) a PIGF-2 humano (produzido em Pichia) com um teste ELISA de acordo com uma modalidade da presente invenção.

Figura 2: Inibição da ligação de PIGF-2 ao receptor Flt-1 humano pelo anticorpo 16D3 (quadrados) ou pelo anticorpo 16D3 humani-zado (triângulos) com um teste ELISA de acordo com uma modalidade da presente invenção.

Figura 3: Resultados dos experimentos Biacore em que rhuPIGF-2 está imobilizado sobre um chip CM5 a fim de investigar o potencial de inibição do anticorpo 16D3 e seu fragmento Fab teste de acordo com uma modalidade da presente invenção.

Figura 4: O anticorpo monoclonal 16D3 inibe o crescimento do tumor em um modelo de xenoenxerto de tumor pancreático humano DanG subcutâneo. Tratamento de camundongos nu/nu com tumores de a-proximadamente 60 mm3 com anti-tPA ('IgG de controle') (1C8; 50 mg/kg depeso corporal; n=10), 16D3 anti-hPIGF ('anti-hPIGF') (50 mg/kg de peso corporal; n=10), anti-mPIGF (PL5D11D4 (obtido como descrito em WO 01/85796); 50 mg/kg de peso corporal; n=10), uma combinação de 16D3anti-hPIGF e PL5D11D4 anti-mPIGF ('anti-hPIGF/anti-mPIGF) (25 mg/kg de peso corporal de cada; n=10) e 'veículo' (n=10) de acordo com uma modalidade da presente invenção. (A) Tamanho do tumor (B) Peso do tumor 18 dias após a inoculação do tumor. Figura 5: O anticorpo monoclonal 16D3 inibe o crescimento do tumor em um modelo de xenoenxerto de tumor pancreático humano sub-cutâneo DanG de uma maneira dependente da dose. Tratamento de camun-dongos nu/nu com tumores de aproximadamente 60 mm3 com 16D3 anti-hPIGF (50 mg/kg = '1000ug7'C\ 37,5 mg/kg = 750 ug'/'D', 25 mg/kg = '500 ugVE', 12,5 mg/kg = '250 ug'/'F'; n=10 para cada concentração), IgG de controle ('1C87 'B'; 50 mg/kg) e 'veículo'/'A' (n=10) de acordo com uma modalidade da presente invenção. A: evolução do tamanho médio do tumor após a inoculação de célula tumoral; B: média do tamanho médio do tumor no dia 20.

Figura 6: O anticorpo monoclonal 16D3 inibe o crescimento do tumor em um modelo de xenoenxerto de tumor de mama humano subcu-tâneo MDA-MB. Tratamento de camundongos nu/nu com tumores de aproximadamente 60 mm3 com 16D3 anti-hPIGF (50 mg/kg de peso corporal; n=10) ou veículo três vezes por semana de acordo com uma modalidade da presente invenção. A: peso do tumor e B: volume do tumor como determinado 32 dias após a inoculação.

Figura 7: O anticorpo monoclonal 16D3 inibe o crescimento do tumor em um modelo de xenoenxerto de tumor de cólon humano subcu-tâneo LOVO. Tratamento de camundongos nu/nu com tumores de aproxi- madamente 60 mm3 com 16D3 anti-hPIGF (50 mg/kg de peso corporal; n=10) ou veículo três vezes por semana de acordo com uma modalidade da presente invenção. A: peso do tumor e B: volume do tumor como determinado 30 dias após a inoculação.

Figura 8: O anticorpo monoclonal 16D3 inibe o crescimento do tumor em um modelo de xenoenxerto de tumor de melanoma humano subcutâneo Mel2a. Tratamento de camundongos nu/nu com tumores de a-proximadamente 60 mm3 com 16D3 anti-hPIGF (50 mg/kg de peso corporal;n=10) ou veículo três vezes por semana de acordo com uma modalidade da presente invenção. Peso do tumor como determinado 53 dias após a inocu-lação.

Figura 9: Anticorpo monoclonal 16D3 evita perda de peso corporal em um modelo de xenoenxerto de tumor pancreático humano sub-cutâneo DanG. Tratamento de camundongos nu/nu com tumores de aproximadamente 60 mm3 com 16D3 anti-hPIGF (50 mg/kg de peso corporal; n=10), IgG de controle, uma combinação de anti-hPIGF e anti-PIGF (25 mg/kg de peso corporal de cada; n=10) e veículo (n=10) de acordo com uma

modalidade da presente invenção. O peso do tumor foi subtraído do peso corporal antes do cálculo da porcentagem de perda de peso corporal. Barras abertas: peso corporal no primeiro dia de tratamento; barras preenchidas: peso corporal no último dia de tratamento.

Figura 10: Anticorpo monoclonal 16D3 e Avastin exercem

efeito adicional sobre a inibição do crescimento do tumor em um DanG pancreático humano subcutâneo. Tratamento de camundongos nu/nu com tumores de aproximadamente 60mm3 com 16D3 anti-hPIGF (37,5 mg/kg, 25 mg/kg, 12,5 mg/kg de peso corporal; n=10 para cada concentração), IgG de controle (1C8; 50 mg/kg), Avastin (15 mg/kg e 5 mg/kg de peso corporal, i.p.

duas vezes por semana, n=10 cada) e uma combinação de anti-hPIGF (12,5 mg/kg de peso corporal) e Avastin (5 mg/kg de peso corporal; n=10) de a-cordo com uma modalidade da presente invenção. Os camundongos foram sacrificados após 20 dias da inoculação do tumor e o volume do tumor foi determinado.

Figura 11: Seqüências de nucleotídeo e aminoácidos de par-

tes variáveis de anticorpo murino 16D3 de acordo com a uma modalidade da presente invenção. A. Seqüência de nucleotídeo que codifica uma parte variável da cadeia pesada; B. Seqüência de nucleotídeo que codifica parte variável da cadeia leve; C. Seqüência de aminoácido da parte variável da ca-

deia pesada; D. Seqüência de aminoácido da parte variável da cadeia leve. Nucleotídeos ou aminoácidos que podem ser modificados para fins de hu-manização de acordo com uma modalidade da invenção estão sublinhados.Figura 12: Seqüências de nucleotídeos e aminoácidos de partes variáveis humanizadas de 16D3 de acordo com uma modalidade da presente invenção. A. Seqüência de nucleotídeo que codifica a parte variável humanizada da cadeia pesada. B. Seqüência de nucleotídeo que codifica a 5 parte variável humanizada da cadeia leve; C. Seqüência de aminoácido da parte variável humanizada da cadeia pesada; D. Seqüência de aminoácido da parte variável humanizada da cadeia leve. Nucleotídeos ou aminoácidos modificados para fins de humanização estão sublinhados.

Figura 13: Ilustração do vetor para expressão de scFv de 10 16D3 humanizado em células 293.

Figura 14: A. Ligação de scFv16D33 e scFv16D3 humanizado a PIGF; B. Inibição da ligação de huPIGF-2 ao seu recepto9r huFlt-1 por scFv16D3 e scFv16D3 humanizado (B).

Figura 15: A. Seqüência de aminoácido de scFv de anticorpo 15 murino 16D3; B. Seqüência de aminoácido de scFv humanizado de anticorpo 16D3. Regiões fora das regiões variáveis de cadeia pesada e leve estão sublinhadas.

Figura 16: Ilustração do vetor para expressão de Fab de 16D3 humanizado em células 293 de acordo com uma modalidade da inven-20 ção.

Figura 17: Ligação de Fab de 16D3 humanizado a huPIHG com um teste de ELISA de acordo com uma modalidade da presente invenção; B. Inibição da ligação de huPIGF-2 ao seu receptor huFlt-1 por Fab16D3. 25 Definições

O termo "16D3" como usado aqui se refere ao anticorpo mono-clonal contra PIGF produzido pela linhagem celular depositada com o BCCM/LMBP sob o número LMBP 6399CB.

O termo "fragmento de anticorpo" se refere a uma subparte de 30 uma molécula de anticorpo que sozinha, ou em combinação com outros fragmentos é capaz de se ligar ao antígeno contra o qual o anticorpo correspondente foi criado. Fragmentos de anticorpo típicos são Fab, Fab', F(ab')2,Fv ou scFv, que freqüentemente retém uma afinidade pelo antígeno que é comparável ao anticorpo completo. Fragmentos menores incluem regiões de determinação de complementaridade ou CDRs tais como CRD1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada ou leve e/ou combinações de duas ou mais das mesmas.

O termo "derivado" é usado aqui para se referir a uma molécula de ligação ao antígeno que corresponde a uma modificação do anticorpo original (por exemplo como produzido por uma linhagem celular de hibrido-ma) ou fragmento dessa, sem afetar de forma significante a ligação ao antí- geno. Modificações típicas incluem modificações da seqüência de aminoacidos do anticorpo original ou modificações dos grupos funcionais presentes na seqüência de aminoácido, por exemplo no contexto de humanização, para a ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo desse a outras moléculas tais como marcadores ou contas, ou para a modificação de glicosilação.

Dessa forma, derivados incluem mas não são limitados a anticorpos humanizados, anticorpos híbridos, anticorpos ou outras moléculas de ligação ao antígeno que tenham sido obtidas por enxerto ou introdução de uma ou mais das regiões variáveis e/ou CDRs do anticorpo original na cadeia principal de outro anticorpo ou fragmento da mesma espécie ou de uma diferente. Deri- vados de um anticorpo incluem estruturas alternativas de uma ou mais C-DRs do anticorpo que resultam em uma molécula de ligação ao antígeno tal como um polipeptídeo sintético.

Um "anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo" como usado aqui, se refere a uma molécula de anticorpo, ou fragmento dessa na qual, em comparação ao anticorpo original, aminoacidos foram substituídos a fim de assemelhar-se mais intimamente a um anticorpo humano. A maioria dessas substituições serão na cadeia principal do anticorpo ou fragmento de anticorpo, isto é em regiões onde o antígeno não se liga. Entretanto, é contemplado que dentro das CDRs, aminoacidos que não participam na ligação ao antígeno também podem ser substituídos.

Um anticorpo ou fragmento de anticorpo "remodelado" ou um "anticorpo híbrido" como usado aqui, se refere a um anticorpo que compre-ende partes de pelo menos dois anticorpos diferentes, que podem opcionalmente ser da mesma espécie ou de espécies diferentes. Tipicamente, um anticorpo híbrido humano pode ser uma região constante humana de um anticorpo ligado a uma região variável humanizada de outro anticorpo (que é direcionado contra o antígeno de interesse) ou uma cadeia principal de anticorpo humano de um anticorpo no qual seqüências de aminoácidos nas regiões de ligação ao antígeno foram substituídas por seqüências de outro anticorpo por exemplo um anticorpo não humano direcionado contra um antígeno humano de interesse. Mais particularmente as regiões de ligação ao antígeno de um anticorpo (geralmente não humano) que têm afinidade por um antígeno de interesse, tal como uma ou mais CDRs ou regiões variáveis \ ou partes dessas, são introduzidas na cadeia principal de outro anticorpo

(geralmente humano) (por exemplo anticorpos de CDR enxertada). \ O termo "homologia" ou "homólogo" como usado aqui com refe- rência a duas ou mais moléculas de ligação ao antígeno da presente inven-

1 ção se refere a habilidade das moléculas de ligação ao antígeno se ligarem

ao mesmo antígeno, mais particularmente ao mesmo epitopo. A habilidade de duas moléculas de ligação ao antígeno se ligarem ao mesmo epitopo pode ser avaliada determinando se as moléculas de ligação ao antígeno po- dem competir uma com a outra pela ligação ao mesmo antígeno, por exemplo em um ensaio de ligação competitiva. A ligação ao antígeno de moléculas de ligação ao antígeno homólogas deve ser de especificidade similar.

A "identidade de seqüência" de duas seqüências como usado aqui se refere ao número de posições com nucleotídeos ou aminoácidos idênticos dividido pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos na menor das seqüências, quando as duas seqüências são alinhadas. Preferivelmente a dita identidade de seqüência é maior do que 70%-80%, preferivelmente 81-85%, mais preferivelmente 86-90%, especialmente preferivelmente 91-95%, o mais preferivelmente 96-100%, mais especificamente é 100%. Em vista da contribuição geralmente limitada da cadeia principal das regiões variáveis para a ligação com o antígeno, identidade de seqüência é o mais co-mumente especificada aqui com relação a seqüência dentro das regiões dedeterminação de complementaridade ou CDRs, isto é com relação às seqüências de nucleotídeps que codificam e as seqüências de aminoácidos que constituem as CDRs. Dessa forma, quando uma seqüência é especificada ter por exemplo uma identidade de seqüência de 80% por uma se- qüência específica "dentro das CDRs" ela é pretendida para fornecer a identidade de seqüência entre as duas seqüências apenas com relação às seqüências que formam as CDRs.

O termo "PIGF" é usado aqui para se referir ao fator de crescimento placentário. Foi descoberto que PIGF ocorre principalmente em duas variantes de splice ou isoformas, PIGF-1 de 149 aminoácidos e PIGF-2 de 170 aminoácidos, que compreende um inserção de 21 aminoácidos na região carboxi-terminal, mas também outras isoformas foram descobertas.

O termo "inibitório" quando se referindo a um anticorpo para PIGF ou fragmento ou derivado desse é usado para indicar que o anticorpo,fragmento ou derivado é capaz de inibir a ligação de PIGF ao seu receptor FIM.

Descrição Detalhada

A presente invenção será descrita com referência a certas modalidades e a certas figuras mas a presente invenção não está limitada a elas mas apenas pelas reivindicações.

A presente invenção se refere a moléculas de ligação ao antíge-no, particularmente anticorpos monoclonais, fragmentos ou derivados desses, que se ligam ao mesmo epitopo de PIGF que o anticorpo referido aqui como anticorpo 16D3. "Anticorpo 16D3", produzido pela linhagem celular LMBP 6399CB, foi criado contra PIGF de origem humana, e se liga a PIGF humano (ambas as isoformas PIGF-1 e PIGF-2). O anticorpo 16D3 inibe a ligação de PIGF humano ao seu receptor Flt-1, inibindo a atividade de PIGF. O anticorpo 16D3 em si e fragmentos ou derivados desses, assim como seqüências de nucleotídeos que codificam o anticorpo, fragmentos ou deriva-dos, podem assim ser usados para a inibição de PIGF tanto em um contexto terapêutico como em um modelo animal para fins de teste ou rastreamento. Alternativamente, o anticorpo pode ser usado para detecção e/ou quantifica-ção de PIGF in vivo, ex vivo, ou in vitro. Dessa forma, a presente invenção fornece diferentes aplicações das moléculas de ligação ao antígeno da invenção e as seqüências de nucleotídeos que as codificam. A invenção ainda se refere a métodos de produzir as moléculas de ligação ao antígeno da in- venção, e a linhagens celulares capazes de produzir essas moléculas de ligação ao antígeno.

Um primeiro aspecto da presente invenção se refere a linhagens celulares que produzem as moléculas de ligação ao antígeno da invenção, mais particularmente linhagens celulares que produzem anticorpos mono-

clonais capazes de se ligar ao mesmo antígeno que 16D3 ou fragmentos ou derivados desses. Uma modalidade particular desse aspecto da invenção é a linhagem celular de hibridoma também referida como "linhagem celular 16D3" que produz o anticorpo monoclonal 16D3 e que foi depositada com o BCCM/LMBP (Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms/Plasmid

Collection Laboratorium voor Moleculaire Biologie, Universidade de Ghent K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent, BE por Thromb-X em 29 de março de 2005 como o número de depósito LMBP 6399CB. A presente invenção ainda fornece linhagens celulares que produzem anticorpos monoclonais derivados do anticorpo monoclonal 16D3. Tais linhagens celulares podem

ser obtidas pela modificação da seqüência codificante para o anticorpo monoclonal 16D3, o mais particularmente a seqüência codificante que codifica as regiões que não se ligam ao antígeno de 16D3. Métodos de determinar a natureza das modificações a serem feitas, e exemplos de modificações adequadas estão descritos aqui.

Um segundo aspecto da invenção se refere a moléculas de liga-

ção ao antígeno capazes de se ligar ao mesmo antígeno que o anticorpo 16D3. Mais particularmente, a invenção se refere ao anticorpo chamado 16D3 produzido pela linhagem celular 16D3 descrita acima e homólogos, fragmentos de derivados desse capazes de se ligar a PIGF e inibir a ativida-

de de PIGF.

Dessa forma uma modalidade particular da presente invenção fornece o anticorpo monoclonal anti-PIGF humano 16D3 produzido pela li-nhagem celular LMBP 6399CB, e fragmentos desse anticorpo. O anticorpo monoclonal 16D3 é caracterizado pela seqüência de aminoácido das regiões variáveis de suas cadeias pesada e leve como descrito em SEQ ID N9: 2 e SEQ ID N9: 4, respectivamente. De acordo com uma modalidade específica, a presente invenção

se refere a fragmentos, mais particularmente fragmentos de ligação ao antí-geno do anticorpo 16D3. Tais fragmentos incluem, mas não estão limitados a Fab, Fab', F(ab')2, CDR's, peptídeos com uma seqüência de um parte do anticorpo ou suas CDRs, domínios variáveis únicos e combinações desses.

Fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2, podem ser gerados por digestão proteolítica de anticorpos monoclonais usando métodos bem-conhecidos na técnica, tal como descrito por Stanworth et al, Handbook of Experimental Immunology (1978), vol. I capítulo 8 (Blackwell Scientific Publications). Tais fragmentos, que retém a habilidade de se ligar ao antígeno, perderam várias proprieda-

des do anticorpo de origem, tais como ativação do complemento ou capacidade de se ligar a receptores Fc gama. Mais especificamente a presente invenção fornece fragmentos que compreendem as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de 16D3 que correspondem a SEQ ID N-: 2 e SEQ ID NQ: 4, respectivamente. Uma modalidade particular adicional da invenção se refere a fragmentos que compreendem as regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de 16D3 e derivados desses. Os dois métodos mais comumente seguidos para identificar CDRs são IMGT e KABAT, e fragmentos que compreendem mais de um tipo de CDR de 16D3 são considerados dentro do contexto da invenção, assim como derivados de 16D3 que com-

preendem esses fragmentos ou CDRs. De acordo com a identificação por IMGT de CDRs, as regiões CDR dentro das regiões variáveis de 16D3 correspondem a SEQ ID N9: 17 (GYTFTDYY), SEQ ID N9: 18 (IYPGSGNT); SEQ ID N9: 19 (VRDSPFFDY), SEQ ID N9: 20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID N9: 21 (WAS) e SEQ ID N9: 22 (KQSYHLFT). Dessa forma, a presente in-

venção fornece fragmentos do anticorpo 16D3 que compreendem uma ou mais das CRDs de 16D3 como fornecido em SEQ ID N9: 17 a SEQ ID Ne: 22.Uma modalidade específica adicional da invenção fornece fragmentos de 16D3 que são partes variáveis de cadeia única ancoradas à membrana ou solúveis de 16D3. Um fragmento variável de cadeia única (scFv) é um fragmento de anticorpo geneticamente projetado que geralmen- te consiste na cadeia variável pesada (VH) e cadeia leve (VL) de uma imu-noglobulina, ou partes dessas, unidas juntas por um ligante de peptídeo flexível. Opcionalmente, scFvs compreendem as regiões CDR do anticorpo de interesse e regiões de arcabouço de outro anticorpo. A seqüência de amino-ácido das regiões de arcabouço e/ou CDR de scFv é opcionalmente huma-nizada para reduzir antigenicidade para uso como um farmacêutico em seres humanos. A invenção fornece um scFv de 16D3 e uma versão humanizada desse que compreende SEQ ID N9: 24 e SEQ ID Ne: 26, respectivamente. Métodos para obter partes variáveis de cadeia única de anticorpos são conhecidas do versado na técnica e estão descritas no exemplo 6 aqui contido. Por exemplo o método pode incluir amplificação das seqüências de DNA das partes variáveis das cadeias pesada e leve humanas em reações separadas e clonagem, seguida por inserção de uma seqüência ligante de quinze ami-noácidos, por exemplo (Gly4Ser)3 entre VH e VL por uma reação em cadeia da polimerase (PCR) de duas etapas (veja por exemplo Dieffeiibach &

Dveksler, "PCR Primer, a laboratory manual" (1995), Cold Spring Harbour Press, Plainview, NY, USA). O fragmento resultante pode então ser inserido em um vetor adequado para expressão de um fragmento variável de cadeia única como um polipeptídeo solúvel ou apresentado em fago. Isso pode ser alcançado por métodos bem-conhecidos daqueles versados na técnica, tal como descrito por Gilliland et al., Tissue Antigens (1996) 47: 1 -20.

A presente invenção também fornece fragmentos de 16D3 que são peptídeos de ligação ao antígeno representativos das regiões hipervari-ávies do anticorpo 16D3 ou combinações desses. Tais peptídeos podem ser obtidos por síntese usando um sintetizador de biossistema aplicado por e- xemplo um sintetizador de polipeptídeos tal como o modelo 9050 disponível por Milligen (USA) ou um modelo de uma tecnologia relacionada.

Uma modalidade adicional da invenção se refere a derivados doanticorpo 16D3 ou fragmentos desses. Mais particularmente, a invenção se refere a anticorpos que compreendem uma região de cadeia pesada variável e ou uma região de cadeia leve variável como descrito em SEQ ID Ng: 2 e SEQ ID N9: 4, respectivamente, mas das quais as regiões constantes são diferentes daquelas em 16D3. Adicional ou alternativamente, os derivados do anticorpo 16D3 da presente invenção compreendem pelo menos duas das CDRs de 16D3 como fornecido em SEQ ID N9: 17 (GYTFTDYY), SEQ ID N9: 18 (IYPGSGNT); SEQ ID N9: 19 (VRDSPFFDY), SEQ ID N9: 20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID N9: 21 (WAS) e SEQ ID N9: 22 (KQSYHLFT), enquanto as regiões de arcabouço entre as CDRs e/ou regiões constantes são diferentes.

De acordo com uma modalidade da invenção, derivados do anticorpo 16D3 ou fragmentos desses são fornecidos tendo pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, mais particularmente pelo menos 90%, o

mais particularmente pelo menos 95% de identidade de seqüência com a região variável de cadeia pesada e leve de 16D3 fornecida em SEQ ID N9: 2 e SEQ ID N9: 4, respectivamente. O mais particularmente, a presente invenção fornece derivados do anticorpo 16D3 ou fragmentos desses que compreendem uma região variável de cadeia pesada e/ou uma região variável

de cadeia leve que tem pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, mais particularmente pelo menos 90%, o mais particularmente pelo menos 95% de identidade de seqüência com SEQ ID N9: 2 e SEQ ID N9: 4, respectivamente dentro das regiões CDR. Identidade de seqüência dentro das regiões de arcabouço pode ser, mas não é limitada a, menos do que 80%.

Também considerados são derivados que compreendem pelo menos duas CDRs que tem pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, mais particularmente pelo menos 90%, o mais particularmente pelo menos 95% de identidade de seqüência com as seqüências de SEQ ID N9: 17 a 22, respectivamente.

De acordo com uma modalidade adicional, a invenção fornece

derivado de uma scFV de 16D3 que compreende uma seqüência que tem pelo menos 80%, mais particularmente pelo menos 90%, o mais particular-mente pelo menos 95% de identidade de seqüência com SEQ ID N9: 24 e uma seqüência que tem pelo menos 80%, particularmente pelo menos 90%, o mais particularmente pelo menos 95% de identidade de seqüência com SEQ ID N-: 26, o mais particularmente dentro das regiões CDR. 5 De acordo com outra modalidade, a invenção fornece derivados

de 16D3 ou fragmentos desses que são humanizados. Tais derivados humanizados de 16D3 são homólogos em que eles retêm sua afinidade de ligação por PIGF. De acordo com uma modalidade particular, os derivados humanizados de 16D3 também retêm a habilidade de inibir a atividade de

PIGF. Humanização de anticorpos não humanos é alcançada pela substituição de um ou mais aminoácidos na cadeia principal do anticorpo, isto é a-queles aminoácidos que não estão envolvidos na ligação do anticorpo ao antígeno, a fim de assemelhar-se mais intimamente à cadeia principal de um anticorpo humano. Diferentes tipos ou níveis de humanização são conside-

rados. Modalidades particulares da invenção se referem a anticorpos ou fragmentos nos quais regiões inteiras, mais particularmente a(s) regiões(s) constante(s) do anticorpo não humano ou fragmento é (são) substituídas pela(s) região(ões) constante(s) de um anticorpo humano, a fim de resultar em anticorpos ou fragmentos quiméricos (por exemplo humano/murino). Mo-

dalidades particulares adicionais são anticorpos onde os aminoácidos de ligação ao antígeno (por exemplo duas ou mais CDRs) do anticorpo não humano contra PIGF é introduzido dentro da cadeia principal de um anticorpo humano (por exemplo anticorpos de CDR enxertada). Métodos para associar a ligação da região de determinação de complementaridade ("CDR")

do anticorpo monoclonal não humano com as regiões de arcabouço humanas - em particular a região constante C do gene humano - são conhecidos do versado na técnica, tal como descrito por Jones et al. em Nature (1986) 321 :522 ou Riechmann em Nature (1988) 332:323. Alternativamente a substituição de um número mais limitado de aminoácidos dos anticorpos anti-

PIGF não humanos da invenção também é considerada. Modalidades particulares da invenção se referem a anticorpos que compreendem regiões de cadeia pesada e/ou leve variáveis humanizadas da Figura 9 ou partes des-sas e anticorpos que compreendem pelo menos duas, mais particularmente três a cinco, o mais particularmente todas as seis CDRs de SEQ ID N9: 17 a SEQ ID N9: 22. Modalidades adicionais da invenção se referem a anticorpos humanizados que compreendem regiões de cadeia pesada e/ou leve variá- veis que tem pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, mais particularmente pelo menos 90%, o mais particularmente pelo menos 95% de identidade de seqüência com SEQ ID N9: 6 e SEQ D NO: 8, respectivamente. Alternativamente a presente invenção fornece anticorpos humanizados que compreendem pelo menos duas, mais particularmente três a cinco, o mais particularmente seis CDRs que tem pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, mais particularmente pelo menos 90%, o mais particularmente pelo menos 95% de identidade de seqüência com SEQ ID N9: 17 a 22, respectivamente.

A presente invenção dessa forma se refere a anticorpos humani-zados e/ou quiméricos ou híbridos derivados do anticorpo murino 16D3. Em uma modalidade particular, aminoácidos específicos do anticorpo murino 16D3 estão mutados a fim de eliminar aminoácidos imunogênicos. Portanto, em uma modalidade particular, a presente invenção se refere a moléculas de ligação ao antígeno que compreendem uma seqüência de aminoácido daparte variável de cadeia pesada de acordo com SEQ ID N9: 2 em que um ou mais dos seguintes aminoácidos foram alterados: I2V, P9A, K40A e/ou TI 1 IL. Adicional ou alternativamente, os anticorpos humanizados derivados do anticorpo 16D3 são moléculas de ligação ao antígeno que compreendem uma seqüência de aminoácido da parte variável de cadeia leve de acordo com SEQ ID N9: 4, em que um ou mais dos seguintes aminoácidos foi alterado: S5T, S9D, A15L, Kl 8R, R22N e/ou L89V. Dessa forma, de acordo com uma modalidade particular, a invenção fornece moléculas de ligação ao antígeno que compreendem tanto uma seqüência de aminoácido de parte variável da cadeia pesada de acordo com SEQ ID N9: 2, em que um ou mais dos seguintes aminoácidos foi alterado: I2V, P9A, K40A e/ou T111L e uma seqüência de aminoácido de parte variável de cadeia leve de SEQ ID N9: 4 em que um ou mais dos seguintes aminoácidos foi alterado: S5T, S9D, Al5L, Kl 8R, R22N e/ou L89V.

Em outra modalidade, o anticorpo é adicionalmente humanizado em que as cadeias leve variável e/ou pesada variável (humanizadas) do anticorpo murino 16D3 são enxertadas em uma estrutura de uma imunoglobu- lina humana ou são acopladas à região constante de um anticorpo humano, mais em particular a uma região constante de IgG humana. Particularmente adequados nesse respeito são IgGlK (lgG1-kappa), que são capazes de ativar células destruidoras naturais no corpo. Em uma modalidade particular, a presente invenção assim se refere a um híbrido Hu16D3 - IgGlK. Uma

modalidade alternativa da presente invenção é um híbrido Hu16D3 - lgG4k. Anticorpos IgG humanos (e assim também anticorpos híbridos obtidos usan-da cadeia principal e/ou regiões constantes de IgG humana) exibem um tempo de meia-vida prolongado, assim fornecendo níveis plasmáticos muito estáveis e permitindo uma drástica redução na freqüência de administração.

Além disso, o uso de anticorpos ou derivados humanizados carrega um risco mínimo de induzir respostas imunes.

Modalidades adicionais da presente invenção se referem a moléculas de ligação ao antígeno que são homólogas ao anticorpo 16D3 ou fragmentos desses, isto é moléculas de ligação ao antígeno que se ligam ao

mesmo epitopo que o anticorpo 16D3. Em uma modalidade as moléculas de ligação ao antígeno homólogas são produzidas pela imunização intencional em animais, mais particularmente em camundongo, por exemplo pela injeção de PIGF nos camundongos e então fusão do linfocitos do baço com uma linhagem celular de mieloma de camundongo, seguida pela identificação das

culturas celulares que produzem anticorpos anti-PIGF (por exemplo pelo ras-treamento da ligação a PIGF) e clonagem deles. Opcionalmente a seleção adicional dos anticorpos é realizada com base na reatividade com o epitopo de 16D3, ou competição com o anticorpo 16D3 ou um fragmento desse.

Ainda outro aspecto da invenção se refere a métodos para pro-

duzir as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção. Esses métodos incluem mas não são limitados, aos métodos de humanização do anticorpo 16D3 como fornecido na seção de Exemplos aqui contida.Ainda outro aspecto da presente invenção se refere ao fornecimento de seqüências de nucleotídeos que codificam moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção, o mais particularmente as regiões de ligação ao antígeno desse. Modalidades particulares da invenção se referem às seqüências de nucleotídeos que codificam região de cadeia pesada variável e a região de cadeia leve variável definidas por SEQ ID N9: 2 e SEQ ID Ne: 4, respectivamente, tais como, mas não limitadas, às seqüências de nucleotídeos de SEQ ID Ne: 1 e SEQ ID N9: 3, que correspondem às seqüências da linhagem celular 16D3 que codificam a região de cadeia pesada e leve do anticorpo 16D3. Também dentro do contexto da presente invenção seqüências de nucleotídeos são fornecidas que codificam uma ou mais das regiões de CDR do anticorpo monoclonal 16D3 como identificado nas SEQ ID N9s: 17 a 22. Modalidades particulares da invenção incluem a seqüência que codifica scFvs e scFvs humanizadas de 16D3 tais como mas não limita- do a SEQ ID Ne: 23 e SEQ ID Ne: 25, respectivamente. A invenção também fornece seqüências de nucleotídeos que codificam os derivados de 16D3 e fragmentos desses, descritos aqui. A presente invenção também fornece sondas e iniciadores capazes de hibridizar especificamente com as seqüências de nucleotídeos descritas acima, tal como, mas não limitados aos inici- adores descritos na seção de Exemplos.

A presente invenção também inclui seqüências de nucleotídeos que são complementares às seqüências que codificam anticorpos monoclo-nais, fragmentos ou derivados desses, descritos aqui.

Outro aspecto ainda da presente invenção, se refere à aplicação terapêutica das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção. A presente invenção assim fornece o uso de moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção como um medicamento. Em relação a isso, a invenção fornece composições farmacêuticas, que compreendem uma ou mais das moléculas de ligação ao antígeno da invenção, para a prevenção ou trata- 0 mento de doenças ou distúrbios nas quais a angiogênese contribui para a patologia da doença ou distúrbio. Conseqüentemente métodos de tratamento e/ou prevenção de doenças nas quais a angiogênese contribui para a pa-tologia da doença ou distúrbio que compreendem administrar a um mamífero que necessite de tal tratamento ou prevenção, uma quantidade terapeutica-mente eficaz de uma composição que compreende uma ou mais das moléculas de ligação ao antígeno descritas aqui.Em tais doenças a angiogênese também é referida como "angi-

ogênese patológica". Exemplos de tal angiogênese patológica incluem a angiogênese observada em patologias de vasos sangüíneos (aterosclerose, hemangioma, hemangioendotelioma), de ossos e articulações (artrite reuma-tóide, sinovite, destruição de ossos de cartilagens, osteomielite, crescimento de pannus, formação de osteofito, neoplasmas e metástases), de pele (ver-rugas, granulomas piogênicos, crescimento de cabelo, sarcoma de Kaposi, quelóides de cicatrizes, edema alérgico, neoplasmas), de fígado, rim, pulmão, ouvido e outros epitélios (processos inflamatórios e infecciosos incluindo hepatite, glomerulonefrite, pneumonia, asma, pólipos nasais, otite, e transplante, regeneração, neoplasmas e metástase nesses órgãos), em certas patologias do útero, ovário e placenta (sangramento uterino disfuncional por exemplo devido a dispositivos contraceptivos intra-uterinos, formação de cisto folicular, síndrome de hiperestimulação ovaríana, endometriose, neoplasmas), patologias no cérebro ou nervos (neoplasmas e metástase), certas afecções cardíacas e musculares esqueléticas (por exemplo devido a sobrecarga de trabalho), condições patológicas de tecido adiposo (obesidade) e órgãos endócrinos (tireoidite, dilatação de tireóide, transplante de pâncreas). Angiogênese patológica também pode contribui para doenças de hemato-poiese (AIDS, Kaposi), malignidades hematológicas (leucemias, etc). Em várias doenças do olho acredita-se que a angiogênese pato-

lógica seja um fator importante, e dessa forma o tratamento com moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção é considerado. Nas "doenças isquêmicas da retina" o suprimento de sangue e oxigênio da retina é diminuído, as porções periféricas da retina perdem sua fonte de nutrição e param de funcionar apropriadamente. Causas comuns de retinopatia são oclusão da veia central da retina, estenose da artéria carótida, diabete (retinopatia diabética) e anemia (retinopatia de célula caliciforme). Retinopatia também éobservada em crianças prematuras (retinopatia da prematuridade). Retino-patia diabética é uma importante causa de perda visual em pacientes com diabete. Na retina isquêmica ocorre o crescimento de novos vasos sangüíneos (neovascularização). Esses vasos freqüentemente crescem sobre a 5 superfície da retina, no nervo ótico, ou na frente do olho, na íris. Os novos vasos não conseguem substituir o fluxo de nutrientes necessários, e ao contrário, pode causar vários problemas tais como hemorragia vítrea, descolamento de retina, e glaucoma incontrolado. Esses problemas ocorrem porque os novos vasos são frágeis e tendem a sangrar. Se descoberto nos seus

estágios iniciais, a retinopatia diabética proliferativa pode algumas vezes ser interrompida com fotocoagulação panretinal. Entretanto, em alguns casos, cirurgia de vitrectomia é a única opção. Outras doenças dos olhos nas quais acredita-se que a angiogênese desempenhe um papel crítico são distúrbios intraoculares, leucomalácia, e neoplasmas e metástase. Neovascularização

coroidal, é o crescimento de novos vasos sangüíneos que se originam do coróide através de uma quebra na membrana de Bruch dentro do epitélio do pigmento sub-retinal (sub-RPE) ou espaço subretinal. A localização, padrão de crescimento, e tipo (1 ou 2) de CNV dependem da idade do paciente e da doença subjacente. Sangramento e exsudação ocorrem com crescimento

adicional, sendo responsáveis pelos sintomas visuais. A neovascularização coroidal (CNV) é uma causa importante de perda visual. É estimado que a CNV ocorre em 5-10% de míopes e ocorre em virtualmente todas as rupturas coroidais durante a fase de cura; a maioria regride espontaneamente mas em 15-30% dos pacientes, a CNV pode recorrer e levar a um desloca-

mento hemorrágico ou macular seroso com perda visual concomitante.

O termo "hipertensão pulmonar" se refere a um distúrbio no qual a pressão sangüínea nas artérias pulmonares é anormalmente alta. Na ausência de outras doenças do coração ou pulmões ela é chamada hipertensão pulmonar primária. O estreitamento difuso das arteríolas pulmonares

ocorre como um resultado de arteriogênese patológica seguida por hipertensão pulmonar como uma resposta à resistência aumentada ao fluxo sangüíneo. A incidência é 8 em cada 100.000 pessoas. Entretanto, hipertensãopulmonar também pode ocorrer como uma complicação de Doenças Pulmonares Obstrutivas Crônicas (COPD) tais como enfisema, bronquite crônica ou fibrose intersticial difusa e em paciente com COPD asmatiforme. A incidência de COPD é de aproximadamente 5 em cada 10.000 pessoas. 5 Ainda um exemplo adicional de uma doença na qual a angiogê-

nese contribui para a patologia da doença, e na qual é considerado para tratamento com as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção, é o grupo de distúrbios inflamatórios. "Inflamação" como usado aqui significa a reação local descontrolada à lesão (isto é física, química ou como um resul-

tado de infecção) de tecidos vivos, especialmente a reação local dos vasos sangüíneos pequenos, seus conteúdos, e suas estruturas associadas. A passagem dos constituintes do sangue através das paredes dos vasos para dentro dos tecidos é a característica distintiva da inflamação, e o conjunto de tecido assim formado é chamado o exsudato ou edema. Qualquer processo

nocivo que danifica o tecido vivo tal como mas não limitado a infecção com bactérias, calor excessivo, frio, lesão mecânica tal como compressão, ácidos, álcalis, irradiação, ou infecção com vírus pode causar inflamação independentemente do órgão ou tecido envolvido. Tais "doenças inflamatórias" incluem reações que variam de queimaduras até pneumonia, leprosia, tuber-

culose, e artrite reumatóide.

Formação de adesão pós-operatória (POA) é uma complicação cirúrgica freqüente em cirurgias ginecológicas, pélvicas e cardiológicas. O trauma cirúrgico aos tecidos freqüentemente causa formação de cicatriz permanente que conecta o tecido traumatizado a outro órgão. Dessa forma,

no sítio de tal dano, os tecidos internos que normalmente permanecem separados, freqüentemente se tornam unidos. Complicações que surgem da formação de adesão são obstruções intestinais, obstruções do intestino delgado, dor pélvica crônica, e infertilidade em mulheres. O termo "formação de adesão" no seu sentido médico se refere a conglutinação, o processo de

adesão ou união de duas superfícies ou partes. Por exemplo a união das superfícies opostas de uma ferida, ou superfícies opostas do peritônio. Ainda, adesões, no plural, podem se referir a faixas inflamatórias que conectamsuperfícies serosas opostas. O termo adesão, como usado aqui, também inclui adesões fibrinosas, que são adesões que consistem em finos filamentos de fibrina que resultam de um exsudato de plasma ou linfa, ou um extra-vasamento de sangue. Quelóide, um leve crescimento excessivo de tecido fibroelástico que surge em uma área de lesão ou, ocasionalmente, espontaneamente também é uma forma de adesão. Foi mostrado que a inibição de fator de crescimento placentário (PIGF) leva a uma supressão notável de formação de adesão pós-operatória (WO03063904).

Foi ainda demonstrado que doenças caracterizadas por reabsor- ção óssea, tais como, mas não limitadas a osteoporose, podem se beneficiar da inibição de PIGF (WO2004002524).

Dessa forma, de acordo com uma modalidade específica as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção são particularmente adequadas para o tratamento e/ou prevenção de crescimento tumoral e me-15 tástase, doenças do olho, inflamação, formação de adesão, e hipertensão pulmonar.

Uma modalidade particular adicional da invenção se refere ao uso das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção para a prevenção e/ou tratamento de câncer, tal como, mas não limitado a câncer de

mama, pulmão, próstata, cérebro, fígado, pâncreas, cólon, rim, útero ou medula óssea. Mais particularmente, a invenção se refere ao uso das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção para a prevenção e/ou tratamento de tumores sólidos tais como mas não limitados a câncer de cólon, câncer de mama, câncer pancreático, e melanomas. Mais particularmente os

dados são fornecidos aqui demonstrando que os anticorpos da presente invenção são particularmente adequados para obter regressão de tumores humanos pancreáticos. Os anticorpos da presente invenção são demonstrados reduzir significativamente o tamanho do tumor in vivo, pelo qual, reduções no tamanho de até cerca de 50% são demonstradas. Dessa forma, a

presente invenção fornece métodos e composições farmacêuticas para reduzir o tamanho do tumor em pelo menos 20%, mais particularmente pelo menos 30%, o mais particularmente pelo menos 50%.Uma modalidade particular adicional da invenção se refere ao uso das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção no tratamento ou prevenção de distúrbios ósseos e mais especificamente para o tratamento de condições onde há uma reabsorção óssea aumentada tal co- mo por exemplo osteoporose e osteomalácia.

Conseqüentemente, a presente invenção se refere ao uso das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção para a produção de um medicamento para o tratamento das doenças acima mencionadas. Um aspecto importante da presente invenção é que os anticorpos, fragmen-tos e derivados desses permitem o tratamento e/ou prevenção das doenças acima mencionadas sem os efeitos colaterais atribuídos ou esperados com outros tratamentos antiangiogênicos, mais particularmente tratamentos alternativos que atingem fatores angiogênicos, tais como VEGF. Testes de segurança pré-clínicos com anticorpos humanos anti-VEGF recombinantes demonstraram já em 1999 que a inibição de VEGF resulta ha inibição de angiogênese fisiológica, mais particularmente neovascularização no crescimento ósseo longitudinal e formação de corpora lutea (Ryan et al., 1999) Toxicologic pathology 27(l):78-86). Estudos recentes descrevem que inibidores de VEGF causam regressão de vasos em traquéia e glândulas tireóides saudáveis, o que pode levar a disfunção de órgãos (Baffert et al, 2004, Circ Res 94:984-992; Inai et al., 2004 Am J Pathol 165:35- 52). Apesar disso, be-vacizumab, um anticorpo anti-VEGF humano é usado atualmente no mercado como supressor de angiogênese apesar dos seus efeitos observados na cura de feridas, pressão sangüínea e risco de trombose, por causa da eficá-cia geral dessa abordagem antiangiogênica sobre a regressão do tumor. Os anticorpos anti-PIGF e derivados da presente invenção permitem a inibição de angiogênese indesejada sem esses efeitos colaterais observados sobre a pressão sangüínea, cura de feridas, risco de trombose, e regressão de vasos em órgãos saudáveis.

Uma modalidade particular da presente invenção se refere acomposições farmacêuticas, como um princípio ativo, o anticorpo monoclo-nal 16D3 ou um fragmento ou derivado desse, em mistura com um veículofarmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica da presente invenção compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais das moléculas de ligação ao antígeno. De forma semelhante, a presente invenção fornece métodos de tratamento e/ou prevenção que compreen- dem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz como usada aqui significa uma quantidade dentro da faixa de cerca de 0,5 mg por quilograma de peso (mg/kg) a cerca de 50 mg/kg, mais preferivelmente de cerca de 1 mg/kg e cerca de 10 mg/kg do mamífero a ser tratado. Será observado que, em vista do longo tempo de meia vida da maioria dos anticorpos IgG humanos, as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção que são anticorpos monoclonais dessa classe irão possuir uma periodicidade de tratamento que participa no conforto do paciente. De acordo com outro aspecto ainda da invenção, composições

farmacêuticas são fornecidas que compreendem as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção e outro agente antiangiogênico, assim como métodos de tratamento que fornecem uma administração seqüencial das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção e outro agente anti- angiogênico. De fato, a presente invenção demonstra um efeito aditivo das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção e outros agentes antiangiogênicos, tais como anticorpos anti-VEGF sobra a inibição do crescimento tumoral. Mais particularmente é demonstrado que o uso combinado do anticorpo 16D3 da presente invenção e Avastin® é capaz de reduzir o tamanho do tumor em até 70%, enquanto doses aumentadas tanto de Avastin® sozinho como do anticorpo anti-PIGF não alcançam uma redução do tamanho do tumor de mais do que 55% nas mesmas condições. Outros produtos antiangiogênicos adequados, assim como, sua dosagem usual dependendo da classe a qual eles pertencem, são bem-conhecidas daqueles ver- sados na técnica. Exemplos de agentes antiangiogênicos incluem inibidores de VEGF que agem diretamente sobre VEGF, tal como o anticorpo direcionado contra VEGF comercializado sob o nome Avastin® ou que age sobre osreceptores de VEGF. Os anticorpos da presente invenção tornam possível diminuir a dosagem de por exemplo agentes antiangiogênicos que inibem VEGF, conhecidos por induzir vários efeitos colaterais como descrito acima.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem a- inda compreender, uma quantidade terapeuticamente eficaz de outros com-postos/fármacos ativos contra a doença a ser tratada, mais particularmente outros compostos/fármacos úteis no tratamento de crescimento tumoral, inflamação, doenças do olho e hipertensão pulmonar.

Veículos farmacêuticos adequados para uso nas composições

farmacêuticas da invenção são descritos por exemplo em Remington's Pharmaceutical Sciences 16- ed. (1980) e sua formulação é bem-conhecida daqueles versados na técnica. Eles incluem quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos (por exemplo fenol, ácido sórbico e clorobutanol), agentes isotônicos, (tal

como açúcares ou cloreto de sódio) e similares. Ingredientes adicionais podem estar incluídos a fim de controlar a duração da ação do princípio ativo de anticorpo monoclonal na composição. Composições de liberação controlada podem assim ser obtidas pela seleção de veículos de polímeros apropriados tais como por exemplo poliésteres, ácidos de poliamino, polivinil pir-

rolidona, copolímeros de acetato de etileno-vinila, metilcelulose, carboxime-tilcelulose, sulfato de protamina e similares. A taxa da liberação e duração da ação do fármaco também pode ser controlada pela incorporação do princípio ativo de anticorpo monoclonal em partículas, por exemplo microcápsu-las, de uma substância polimérica tais como hidrogéis, ácido polilático, hi-

droximetilcelulose, metacrilato de polimetila e os outros polímeros descritos acima. Tais métodos incluem sistemas de liberação de fármacos colóides como lipossomos, microesferas, microemulsões, nanopartículas, e assim por diante. Dependendo da via de administração, a composição farmacêutica que compreende o princípio ativo pode requerer revestimentos protetores. A

forma farmacêutica adequada para uso injetável inclui soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea dessas. Veículos típicos incluem portanto tampões aquosos biocompatíveis, e-tanol, glicerol, propileno glicol, polietileno giicol e misturas desses.

As moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção podem ser fornecidas a um paciente por qualquer meio bem-conhecido na técnica, isto é oral, intranasal, intramuscular, intradérmica, intravenosa, intra-5 arterial ou parenteralmente, ou por cateterização.

De acordo com um aspecto particular da presente invenção, as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção são administradas por terapia gênica. Terapia gênica a base de anticorpos torna possível superar várias das potenciais limitações associadas com a administração de anti-

corpos tais como produção em larga escala, biodistribuição, rápida depuração do sangue e fraca retenção de anticorpos monovalentes. A produção in vivo faz os anticorpos menos imunogênicos e mais bem-tolerados e resulta em níveis eficazes e persistentes de moléculas de ligação ao antígeno ou fragmentos desses. Além disso, abordagens genéticas tornam possível for-

necer moléculas de ligação ao antígeno com novas funções. A viabilidade da produção in vivo e a liberação sistêmica de anticorpos monoclonais por diferentes células/tecidos tem sido demonstrada usando transferência de gene in vivo por vetores virais (Pelegrin et al., 2004, Gene Ther 4: 347-356). A redução do crescimento do tumor in vitro e in vivo por modificação gênica de

células de fibrosarcoma com um anticorpo antilaminina com atividade anti-angiogênica também tem sido demonstrada (Sanz et al. 2001, Câncer Im-munol Imniunother 50:557-565).

Dessa forma, de acordo com essa modalidade, a presente invenção fornece nucleotídeos que codificam as moléculas de ligação ao antí-

geno da presente invenção para uso em terapia gênica no tratamento das doenças caracterizadas por angiogênese patológica descrita aqui. Particularmente, a presente invenção fornece composições que compreendem seqüências de nucleotídeos que codificam a região de cadeia pesada variável definida por SEQ ID N9: 2 e/ou seqüências de nucleotídeos que codificam a

região variável de cadeia leve definida por SEQ ID Ne: 4, para uso em terapia gênica. Mais particularmente, a presente invenção fornece composições que compreendem a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N9: 1 e/ou SEQID NQ: 3, que corresponde às seqüências da linhagem celular 16D3 que codifica a região de cadeia leve e pesada do anticorpo 16D3. Também dentro do contexto da presente invenção composições que compreendem seqüências de nucleotídeos são fornecidas que codificam uma ou mais das regiões de CDR do anticorpo monoclonal 16D3 como identificado nas SEQ ID N9s 17 a 22. Modalidades particulares da invenção incluem a seqüência que codifica as scFvs e scFvs humanizadas de 16D3 tais como mas não limitadas a SEQ ID N9: 23 e SEQ ID Ne: 25, respectivamente.

O método de tratamento e/ou prevenção de acordo com a in- venção pode incluir tratamento ou prevenção adicional da mesma condição de angiogênese patológica pela administração, preferivelmente pela administração seqüencial, ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente antiangiogênico ou antitumoral tal como descrito aqui acima sob tópico de composições farmacêuticas. Seqüencialmente, como usado aqui, significa que o ligante da presente invenção e o agente antiangiogêne-se conhecidos são administrados ao paciente seqüencialmente mas não simultaneamente.

Ainda outro aspecto da presente invenção se refere ao uso das moléculas de ligação ao antígeno da invenção para a detecção imunológica de PIGF em amostras humanas e como componentes de kits adequados para tal detecção. Métodos de detecção imunológica de um antígeno são conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a, EIA, ELISA e RIA e métodos imunohistoquímicos. A ligação dos anticorpos murinos da presente invenção ao antígeno de PIGF pode ser detectada indiretamente por e-xemplo por meio de um anticorpo anticamundongo marcado. Alternativamente os anticorpos ou fragmentos desses podem ser marcados diretamente. Uma modalidade específica desse aspecto da invenção se refere ao uso dos anticorpos contra PIGF e fragmentos de ligação ao antígeno desses na identificação de pacientes susceptíveis a um tratamento com anti-PIGF. Isso é de interesse particular no tratamento de câncer.

Ainda outro aspecto da presente invenção se refere ao uso das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção como uma ferra-menta de diagnóstico. Foi demonstrado na técnica que em várias condições patológicas a expressão de PIGF está regulada positivamente. Mais particularmente, vários tumores foram demonstrados superexpressando PIGF. Os anticorpos humanizados ou fragmentos de anticorpo da presente invenção podem ser usados no diagnóstico dessas condições patológicas por exemplo por técnicas de imagem nas quais o anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno da invenção são marcados e visualizados in vivo. Uma variedade de marcadores para visualização por imagem da ligação das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção in vivo são conhecidos na téc-

nica e incluem, mas não são limitados a marcadores ópticos (por exemplo fluorescentes), de metal, e magnéticos, cada um requerendo aparatos de (radiação e) detecção específicos. Uma modalidade particular desse aspecto da invenção se refere ao uso dos anticorpos da invenção para prever o prognóstico da doença e decidir o regime de tratamento.

Ainda outro aspecto da presente invenção se refere ao uso das

moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção em modelos animais no rastreamento de compostos para uso em combinação com uma terapia anti-PIGF. Tais modelos incluem mas não estão limitados a modelos de tumor pelos quais o crescimento e desenvolvimento de células tumorais hu-

manas em camundongos nu/nu é investigada. A administração combinada do composto a ser testado e do anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente invenção torna possível identificar se o composto tem um efeito aditivo ao efeito observado por administração dos anticorpos ou fragmentos da invenção sozinhos. Outros aspectos tais como contra-eficácia ou toxicidade de

um composto em combinação com um anticorpo anti-PIGF também podem ser determinados dessa forma.

Apesar da aplicação terapêutica descrita acima, as seqüências de nucleotídeos da presente invenção descritas acima são úteis na produção de anticorpos e outros fragmentos de ligação ao antígeno, por exemplo por

métodos recombinantes. Dessa forma, a presente invenção ainda fornece métodos de produzir anticorpos recombinantes e fragmentos de anticorpos, incluindo clonagem e manipulação de genes de anticorpo, produção de scFve outros fragmentos de ligação ao antígeno usando as seqüências de nucle-otídeos descritas aqui. O protocolo desses métodos está disponível na técnica. Adicionalmente, as sondas que hibridizam especificamente à seqüência de nucleotídeo da presente invenção podem ser usadas para rastrear a ex-5 pressão dos anticorpos e fragmentos de anticorpo da presente invenção.

A presente invenção é ainda descrita pelos exemplos seguintes que são fornecidos apenas para fins ilustrativos. Exemplos

Exemplo 1 - Produção e caracterização de anticorpos de murino anti-PIGF

humano (16D3)

1. Imunização de camundonqos e fusão

Anticorpos monoclonais contra PIGF humano foram produzidos essencialmente como descrito por Galfré e Milstein (Galfré F, Milstein C. Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. Method

15 Enzymol 1981; 73:3-46). Resumidamente, camundongos knock-out para PIGF (Luttun et al., 2002, Biochem Biophys Res Comm 295(2): 428-34, Carmeliet et al. (2001), Nat Med 7:575-593 ou WO01/85796) foram imunizados por injeção subcutânea de 50 ug de PIGF-2 humano recombinante (produzido em Pichia) em adjuvante de Freund Completo, seguido duas sema-

nas mais tarde por injeção subcutânea com 50 ug de PIGF recombinante humano em adjuvante de Freund incompleto. Amostras de sangue (cerca de 100 ul) foram coletadas das caudas dos camundongos após 10 dias. Os soros foram testados quanto aos anticorpos anti-huPIGF por ELISA usando placas de microtitulação cobertas com PIGF humano como captura, aplica-

ção de soros diluídos (de 1/500 a 1/8000), e IgG de cabra anticamundongo conjugada a peroxidase de rábano silvestre (HRP) para sinalização.

Após um intervalo de pelo menos 6 semanas, os camundongos (com respostas positivas elevadas) foram estimulados intraperitonialmente com 50 ug de PIGF recombinante humano em solução salina nos dias 4 e 2

antes da fusão celular.

Células do baço foram isoladas e fundidas com células de mie-loma Sp2/0-Ag14. Após seleção em meio com hipoxantina, aminopterina etimidina, clones positivos foram selecionados pela aplicação dos sobrena-dantes de cultura em ELISA como descrito acima.

2. Purificação de anticorpos em ProSep vA Ultra

Anticorpos foram purificados a partir dos sobrenadantes da cul- tura celular por cromatografia de afinidade em ProSep vA Ultra (Millipore) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, NaCI 150 mM foi adicionado ao sobrenadante e o sobrenadante foi aplicado em uma coluna ProSep vA Ultra que foi pré-equilibrada com PBS. A coluna foi lavada com PBS e a proteína ligada foi eluída com glicina 0,1 M pH 2,8. A proteína eluída 10 foi dialisada ON contra PBS. A pureza da proteína eluída foi checada sob condições redutoras e não redutoras por SDS-PAGE.

3. Liaacão de 16D3/hu16D3 (obtido como descrito no Exemplo2) a PIGF (ve-\ • ia Figura 1)

\ Placas de ELISA foram revestidas ON com 1ug/ml de huPIGF-2

(Pichia) em PBS, 100 uL/cavidade, 4°C. Após bloqueio com BSA 1%, uma

hora, TA, uma série de diluições de 16D3/hu16D3 foi adicionada, 100 uL/cavidade, o anticorpo foi deixado se ligar por uma hora, TA. 16D3 ligado foi detectado com IgG-HRP de cabra anti-humano ou de cabra antimurino (Sigma), 100 uL/cavidade, uma hora, TA. O ensaio foi desenvolvido com OPD.

4.lnibicão da ligação de PIGF ao receptor huFlt-1 (veia Figura 2)

Placas de ELISA foram revestidas ON com 1ug/ml de huFlt-1 (R&D Systems), 200 uL/cavidade, ON, 4°C. Após bloqueio com BSA 1%, uma hora, TA, uma série de diluições de 16D3/hu16D3 foi adicionada, 100

uL/cavidade e um adicional de 100 uL/cavidade de huPIGF-2 foi adicionado. Após uma incubação de duas horas em TA, PIGF ligado foi detectado com anti-huPIGF de cabra (R&D Systems), 180 uL/cavidade, uma hora, TA, seguido por uma incubação com RAG-HRP (DAKO), uma hora, TA. O ensaio foi desenvolvido com OPD.

S.Caracterização adicional de 16D3 e Fab 16D3 com experimentos Biacore • Inibicão: rhuPIGF-2 (Pichia, TX) foi imobilizado sobre um chip CM5 usando química EDC/NHS (Amine Coupling Kit, Biacore), dando412 RU. O 16D3 foi injeto seguido de quimera rhuFlt-1/Fc (R&D Systems). Isso também foi realizado com tampão ao invés do anticorpo de camundon-go. Esses também foram injetados em um canal de Fluxo de controle negativo e esses valores também já são subtraídos. Esse ensaio foi realizado em um tampão de fosfato em pH 9,6.

Em comparação com a ligação máxima de rhuFlt-1 a rhuPIGF-2, o sinal de rhuFlt-1 é reduzido se 16D3 ou 16D3Fab é injetado primeiro (Figura 3).

6.Clonaaem e seqüenciamento das regiões variáveis de camundonqo de 16D3

• Isolamento de mRNA: O mRNA de células de hibridoma de 16D3 foi isolado usando o QuickPrep® Micro mRNA Purification Kit (A-mersham Biosciences). Esse mRNA foi usado para fazer cDNA usando o First-Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences) com o iniciador

pd(N)6 disponível no kit.

• PCR: As seqüências das partes variáveis das cadeias pesada e leve foram encontradas pela realização de um PCR com um conjunto de iniciadores: 8 iniciadores começando na seqüência líder e 2 na região constante da cadeia pesada, 11 iniciadores começando na seqüência líder e 1 na região constante da cadeia leve. 8 e 11 reações de PCR com combinações diferentes dos iniciadores foram realizadas.

Iniciadores usados para a cadeia pesada do anticorpo 16D3: MHVR3 5'-ATG GRA TGG AGC TGK ATC WTT HTC- 3' (SEQ ID N9:9) MHCRI 5'- CAS AYM CAG GGG CCA GTG GAT AGA C- 3' (SEQ ID N9: 10) Iniciadores usados para a cadeia leve do anticorpo 16D3:

MKVR3 5'- ATG RAG TCA CAK ACY CAG GTC TTY RTA- 3' (SEQ ID N9: 11) MKCRI 5'- GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TGG- 3' (SEQ ID Ng: 12)

Configuração do PCR: desnaturação 10 min. 94°C, desnatura-ção 30 seg. 94°C, anelamento 30 seg. 55°C, extensão 1 min 72°C, extensão 5 min. 72°C, número de ciclos 30.

A redundância na seqüência de SEQ ID N9: 9 a 11 é indicada usando as abreviações convencionais R = A ou G, K= G ou T, W= A ou T,H= A ou C ou T, S= C ou G, Y= C ou T, M= A ou C.

• Clonagem e seaüenciamento: Os produtos de PCR foram aplicados em um gel de agarose, as bandas corretas foram selecionadas, purificadas (QIAquich^ Gel Extraction Kit, Qiagen GmBH) e clonados no

vetor pCR@4Blunt-TOPO® fornecido no Zero Blunf TOPCf PCR Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen® life Technologies). O plasmídeo de DNA foi preparado usando o High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche Diagnostics GmbH) e os insertos foram seqüenciados usando os iniciadores de sentido reverso T7 e M13 no ABI PRISM®310 (PE Applied Biosystems). 10 «As seqüências de nucleotídeo e aminoácido das regiões

variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo 16D3 estão representadas nas SEQ ID N9s 1, 2, 3 e 4 (veja Figura 11).

Exemplo 2 - Produção e caracterização de anticorpos anti-PIGF humano (16D3) humanizados 15 1. Construção de 16D3 humanizado Humanização das regiões variáveis

• Mutações: As seguintes mutações foram feitas a fim de humanizar as partes variáveis do anticorpo de camundongo 16D3:

Cadeia pesada: I2V 20 P9A K40A T111L

Cadeia leve:S5T S9D 25 A15L

K18R R22N L89V

• As mutações foram feitas pelo uso do QuickChange® 30 Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene®). 1 a 5 iniciadores contendo

as mutações puderam ser usados em 1 PCR. Após a transformação colônias foram retiradas e o DNA seqüenciado para determinar o clone com a maioriadas mutações pontuais. Esse clone foi usado para repetir esse procedimento

até que todas as mutações estavam presentes na seqüência.

Ligando as regiões variáveis a uma região constante de IqG humana:

Pela realização de um PCR as partes variáveis humanizadas das cadeias pesada e leve foram obtidas, as quais os sítios de restrição a-

propriados foram adicionados.

Iniciadores para a parte variável da cadeia leve:

Iniciador 1: 5'-CCACCGGT GAC ATT GTG CTG ACC CAG TCT

CC-3' (SEQ ID N-: 13) Iniciador 2: 5'-CACCGTACG TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC

CGAG-3'(SEQIDNe:14)

Iniciadores para a região variável da cadeia pesada:

Iniciador 3: 5'-CAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT G-3' (SEQ

ID Ne: 15) Iniciador 4: 5'-GATGGGCCCTTGGTCGACGC TGA GGA GAC

TGT GAG CAG GG-3' (SEQ ID Ne: 16)

Configuração do PCR: desnaturação 5 min. 94°C, desnaturação 30 seg. 94°C, anelamento 30 seg. 60°C, extensão 30 seg. 72°C, extensão 5 min. 72°C, número de ciclos 25. Os produtos de PCR foram aplicados em gel de agarose, as

bandas foram selecionadas e purificadas {QIAquictf® Gel Extraction Kit, Qia-gen GmBH). O produto de PCR da parte variável da cadeia pesada de 16D3 foi digerido com Sall, o vetor pKANEO-MCS50-Hleu-var Ne 24 contendo a parte constante completa da cadeia pesada de um anticorpo humano (lgG4), com Eco47lll e Sall e ligados. O produto de PCR da parte variável da cadeia leve foi clonado primeiro no vetor pCR®4Blunt-TOPO® fornecido no Zero Blunf TOPCf PCR Cloning Kit for Sequencing (lnvitrogen®life Technologies). A parte variável da cadeia leve foi cortada por Agel e BsiWI e clonada no vetor pKANEO-CM30-L var Ne 7 que já continha a parte constante de uma cadeia leve kappa humana. Ambos os vetores foram reunidos para um vetor pela extração do cassete de expressão da cadeia leve do vetor usando Pmel e Pacl e adicionando-o ao vetor que continha a cadeia pesada.As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos das partes variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo 16D3 humanizado estão representadas nas SEQ ID Nes. 5, 6, 7 e 8 (veja Figura 12). 2. Expressão transitória de hu16D3 5 Hu16D3 lgG4k foi expresso transitoriamente em células HEK

usando o FreeStyle 293 Expression System (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Hu16D3 foi purificado a partir do sobrenadante usando cromatografia de afinidade em proSep vA Ultra. Hu16D3 purificado foi checado quanto à pureza por SDS-PAGE sob condições redutoras e não 10 redutoras. Hu16D3 foi ainda testado quanto a ligação a huPIGF e quanto a inibição da ligação de HuPIGF/huFLT-1 através de ELISA (veja Figura 1 e 2). Exemplo 3: Investigação in vivo da inibição de crescimento tumoral com anticorpos anti-PLGF

1. Descrição geral de materiais e métodos

Cultura celular

As linhagens de células pancreáticas Panc02 de murino e a linhagem de célula pancreática humana DanG são uma gentil doação de S. Rosewicz (Charité-Universitãtsmedizin Berlim, Alemanha). As linhagens celulares humanas MDA-MB de mama, LOVO de cólon e Mel2a de melanoma

foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA). Todas as células foram cultivadas como recomendado. Anticorpos 16D3 anti-PIGF de murino foram usados para todos os experimentos in vivo, para evitar reação imune ao anticorpo. Experimentos em animais

Todos os procedimentos em animais foram completamente a-

provados pelo comitê institucional para uso e cuidados de animais. Camundongos nu/nu NMRI fêmeas foram abrigadas sob condições semi-estéreis e foram usadas rotineiramente com 8-10 semanas de idade (peso aproximado, 25 g). Para a preparação da fonte de tumor, células de tumor foram tripsini-

zadas para preparar uma suspensão de células isoladas, lavadas com PBS. O precipitado centrifugado foi re-suspenso em 200 ul de PBS e injetado sub-cutaneamente no flanco direito dos camundongos. Para o modelo de tumorpancreático ortotópico, 1x10 células tumorais em 30 ul de PBS foram injetadas na cabeça do pâncreas através de laparotomia ventral de camundon-gos C57B16 fêmeas com idade de 9-10 semanas. Antes dos procedimentos, os camundongos foram anestesiados com quetamina (90 mg/kg de peso corporal) e xilazina (9 mg/kg de peso corporal).

Administração de fármacos (isto é anticorpos, veículo, etc.)

Tratamento com anticorpos ou controle com veículo foi iniciado quando os tumores atingiram um tamanho aproximado de 60 mm3. Anticorpos P15D11D4 (WO01/85796), 16D3, 1C8 ou veículo foram administrados nas doses indicadas intraperitonialmente em dias alternados. Avastin foi injetado nas doses indicadas intraperitonialmente duas vezes por semana. Medidas dos tumores

Tumores que cresciam subcutaneamente foram medidos em dias alternados usando um calibrador e os volumes dos tumores calculados usando a fórmula p/6 (w1 xw2x w2), onde 'w1' e 'w2' representam o maiore o menor diâmetro do tumor, respectivamente. Quando os camundongos foram sacrificados o tumores ortotópicos em crescimento do pâncreas foi medido após laparotomia ventral usando o mesmo método. Análise estatística

A análise estatística foi realizada pelo teste de t-Student bicau- dal para observações pareadas usando um programa estatístico GraphPad (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Todos os dados são expressos com média ± SEM, a menos que indicado de outra maneira. *p<0,5, **p<0,01, a menos que indicado de outra maneira.

2. Inibicão de crescimento tumoral em um modelo de xenoenxerto de tumor pancreático humano subcutâneo DanG com anticorpo anti-PIGF de murino 16D3. 1x106 células tumorais foram injetadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos fêmeas nu/nu NMRI de 11 semanas de ida-30 de. Após os tumores atingirem um tamanho de aproximadamente 60 mm3, o tratamento com anti-hPIGF (16D3, 50 mg/kg de peso corporal; n=10), anti-mPIGF (PL5D11D4 (obtido como descrito na WO01/85796; 50 mg/kg de pe-so corporal; n=10), IgG de controle (1C8; 50 mg/kg de peso corporal; n=10), uma combinação de anti-hPIGF e anti-mPIGF ( 25 mg/kg de peso corporal de cada; n=10) e veículo (n=10) foi iniciado. Os anticorpos foram injetados i.p. em dias alternados. (A) Os tumores foram medidos em dias alternados e 5 o volume do tumor foi calculado usando a fórmula W1xW2xW2xp/2, onde W1 representa o maior e W2 representa o menor diâmetro. (B) Os camun-dongos foram sacrificados no dia 18 após a inoculação do tumor, os tumores foram ressecados e pesados. Volume médio do tumor: veículo: 915 ± 90 mm3, IgG: ± 89 mm3, PL5D11D4: 832 ± 118 mm3, 16D3: 521 ± 83 mm3, 10 PL5D11D4+16D3:497±86mm3.

Os resultados, como mostrado na Figura 4, mostram que a administração de anticorpo 16D3 anti-PIGF humano tem uma clara influência sobre o tamanho e peso do tumor.

3. Anti-hPIGF inibe o crescimento tumoral em um modelo de xenoenxerto de 15 tumor pancreático humano subcutâneo DanG de uma maneira dependente

da dose.

1x106 células tumorais foram injetadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos fêmeas nu/nu NMRI de 11 semanas de idade. Após os tumores atingirem um tamanho de aproximadamente 60 mm3, o

tratamento com anti-hPIGF, IgG (1C8; 50 mg/kg), 16D3 (50 mg/kg, 37,5 mg/kg, 25 mg/kg, 12,5 mg/kg de peso corporal; n=10 para cada concentração) e veículo (n=10). (B) Os camundongos foram sacrificados no dia 18 a-pós a inoculação do tumor.

Os resultados são mostrados na Figura 5. Volume médio do tu-

mor ± SEM: 16D3, 50 mg/kg de peso corporal: 450 ± 37 mm3; 37,5 mg/kg de peso corporal: 469 ± 97 mm3 ; 25 mg/kg de peso corporal: 493 ± 107mm3; 12,5 mg/kg de peso corporal: 693 ± 107mm3 ; IC8: 865 ± 109mm3 ; veículo: 889 ±100 mm3.

4. Anti-huPIGF inibe o crescimento tumoral em um modelo de xenoenxerto 30 de tumor de mama humano subcutâneo MDA-MB

1x107 Células tumorais foram injetadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos fêmeas nu/nu NMRI de 11 semanas de ida-de. Após os tumores atingirem um tamanho de aproximadamente 60 mm3, tratamento com anti-hPIGF, 16D3 (50 mg/kg de peso corporal; n=10) e veículo (n=10).

Os resultados são mostrados na Figura 6 (e Tabela 1 abaixo).<table>table see original document page 43</column></row><table>5. Anti-huPIGF inibe o crescimento tumoral em um modelo de xenoenxerto de tumor cólon humano subcutâneo LOVQ.

1x107 células tumorais foram injetadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos fêmeas nu/nu NMRI de 11 semanas de idade. Após os tumores atingirem um tamanho de aproximadamente 60 mm3, tratamento com anti-hPIGF, 16D3 (50 mg/kg de peso corporal; n=10) e veículo (n=10).

Os resultados são mostrados na Figura 7 e Tabela 2 abaixo.

<table>table see original document page 43</column></row><table>6. Anti-huPIGF inibe o crescimento tumoral em um modelo de xenoenxerto de tumor de melanoma humano subcutâneo Mel2a.

4 x 106 células tumorais foram injetadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos fêmeas nu/nu NMRI de 11 semanas de idade. Após os tumores atingirem um tamanho de aproximadamente 60 mm3, tratamento com anti-hPIGF, 16D3 (50 mg/kg de peso corporal; n=10) e veículo (n=10).

Os resultados são mostrados na Figura 8 e Tabela 3 abaixo.<table>table see original document page 44</column></row><table>Exemplo 4: Investigação in vivo do efeito do tratamento com anticorpos 16D3 sobre a perda de peso.

Materiais e métodos são como descritos no Exemplo 3. 5 1x106 células tumorais foram injetadas subcutaneamente no

flanco direito de camundongos fêmeas nu/nu NMRI de 11 semanas de idade. Após os tumores atingirem um tamanho de aproximadamente 60 mm3, o tratamento com anti-hPIGF (16D3, 50mg/kg de peso corporal; n=10), anti-mPIGF (PL5D11D4 50 mg/kg de peso corporal; n=10), IgG de controle (1C8; 10 50 mg/kg de peso corporal; n=10), uma combinação de anti-hPIGF e anti-mPIGF (25 mg/kg de peso corporal de cada; n=10) e veículo (n=10) foi iniciado. Os anticorpos foram injetados i.p. em dias alternados. O peso corporal dos camundongos foi medido no primeiro e no último dia do tratamento com anticorpo. O peso do tumor foi subtraído do peso corporal antes do cálculo 15 do percentual de perda de peso corporal.

Os resultados são mostrados na Figura 9. É mostrado que anti-hPIGF evita a perda de peso corporal nesse modelo de xenoenxerto de tumor pancreático humano subcutâneo DanG.

Exemplo 5: Combinação de anti-hPIGF e um anticorpo anti-VEGF para o

tratamento de crescimento tumoral

Materiais e métodos são como descritos no Exemplo 3. 1x106 células tumorais foram injetadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos fêmeas nu/nu NMRI de 11 semanas de idade. Após os tumores atingirem um tamanho de aproximadamente 60 mm3,

tratamento com anti-hPIGF (16D3, 50mg/kg, 37,5 mg/kg, 12,5 mg/kg de peso corporal i.p. em dias alternados; n=10 para cada concentração), Avastin (15 mg/kg e 5 mg/kg de peso corporal, i.p. duas vezes por semana, n=10 cada) e uma combinação de anti-PIGF (12,5 mg/kg de peso corporal) e Avastin (5 mg/kg de peso corporal; n=10). Os camundongos foram sacrificados após 20dias da inoculação do tumor.

Os resultados são mostrados na Figura 10. Volume tumoral médio ± SEM: 1C8, 37; 37,5 mg/kg de peso corporal: 954 ± 164 mm3: 12,5 mg/kg de peso corporal: 1398 ± 236 mm3; IgG: 1789± 231 mm3; Avastin 15 5 mg/kg de peso corporal: 828 ± 186 mm3; 5 mg/kg de peso corporal: 926 ± 202 mm3; Avastin + 16D3: 569 ± 94 mm3. É observado que anti-hPIGF e A-vastin exercem um efeito adicional sobre a inibição do crescimento tumoral em um DanG pancreático subcutâneo humano. Exemplo 6: Produção de scFv de 16D3

As seqüências das partes variáveis das cadeias pesada e leve

(SEQ IDs NO: 2 e 4, respectivamente, obtidas como descrito no Exemplo 1) foram amplificadas por PCR usando iniciadores com os sítios de restrição de ligação e ligantes apropriados. Após um SOE PCR (estrançamento de genes por extensão de super posição) scFv foi clonado em pEE14.4 (sítios de clona-

gem Hindlll-EcoRI) (Figura 12). Esse scFvhp16D3/pEE14.4 foi transfectado para células CHO-KI após linearização com BamHI usando Fugene 6 (Boe-hringer Mannheim) e subclonado duas vezes por diluição. Um scFv hp16D3 monoclonal, 6C5D4, foi obtido e produzido. Esse clone também foi transfectado transitoriamente em células 293 por Producell em paralelo com scFv

hp16D3/pKANEO-MCS50-dhfr1 (sítios de clonagem Nhel-Notl) (Figura 13).

As seqüências de nucleotídeo e aminoácido do scFv de 16D3 são fornecidas como SEQ ID NQ: 23 e SEQ ID N9: 24, respectivamente. A seqüência de aminoácidos que demonstra as regiões variáveis das cadeias pesada e leve, a seqüência ligante e HA-tag e His Tag também é fornecida

na Figura 15.

Exemplo 7: Humanizacão de scFv 16D3

Humanização das regiões variáveis do scFv foi realizada como descrito no Exemplo 2. As seqüências de nucleotídeo e aminoácido de scFv de 16D3 são fornecidas nas SEQ ID N9: 25 e SEQ ID NQ: 26, respectivamen-

te. A seqüência de aminoácidos que demonstra as regiões variáveis das cadeias pesada e leve, a seqüência ligante e HA-Tag e His tag de scFv humanizado também é fornecida na Figura 15.Exemplo 8: Produção de Fab 16D3 humanizado

1. Amplificação dos fragmentos VH e VL de scFv16D3 humanizado

Iniciadores para amplificacão de fragmento VH de scFv16D3

humanizado

16D3Vhbackblunt 5'-CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTG-3' (SEQ ID N9: 27)

16D3VhforSall 5'-GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACTGTGAGCAGGG-3' (SEQ 1D Ns: 28)

Iniciadores para amplificação de fragmento VL de scFv16D3

humanizado

16D3VLBackAgel 5'-CCACCGGTGACATTGTGCTGACCCAGTCTCC-3' (SEQIDN9:29)

16D3VLForBsiWI 5'-CACCGTACGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCGAG-3' (SEQ ID N9: 30)

2. Construção de vetores de cadeia pesada e leve

.0 produto de PCR da cadeia leve foi clonado primeiro no vetor

pCP»4blunt-T0P0. Após o seqüenciamento a cadeia leve foi removida por digestão com Agel e BsiWI e clonada no vetor pKANEO-CM30-LvarNe 7. O produto de PCR da cadeia pesada foi clonado após digestão diretamente em pKANEO-MCS50-FabvarNe 3.

3. União de construtos de ligação de cadeia pesada e leve

Ambos os vetores (acima descritos), contendo o segmento leve e pesado, foram unidos juntos pela remoção do cassete contendo o segmento leve e adicionando-o ao vetor contendo o segmento pesado pelo uso das enzimas Pmel e Pacl, para obter o construto final,

hp16D3mutcmplFab/pKANEO-MCS50-FabvarNQ 3. (veja Figura 16).

Exemplo 9: Análise de ligação ao antígeno e inibição da interação de PIGF/flt-1 por scFv 16D3 e scFv16D3 humanizado (Figura 14) 1. ELISA de ligação ao antígeno

Placas de ELISA foram revestidas ON com 1 ug/ml de huPIGF-1

em PBS, 200 uL/cavidade, 4°C. Após bloqueio com BSA 1%, uma hora, TA, uma série de diluições de scFvl6D3/ scFvl6D3 humanizado foi adicionada, 200 uL/cavidade, o fragmento de anticorpo foi deixado se ligar por uma ho-ra., TA. scFvl6D3 ligado foi detectado com anti-HA de murino (180 uL/cavidade, uma hora. TA) seguida pela incubação com IgG- HRP de cabra antimurino (Sigma), 170 uL/cavidade, uma hora, TA. O ensaio foi desenvolvido com OPD. 5 2. Inibição de interação de PIGF/Flt-1 através de ELISA

Placas de ELISA foram revestidas ON com 1 ug/ml de huFlt-1 (R&D Systems), 200 uL/cavidade, ON, 4°C. Após bloqueio com BSA 1%, uma hora, TA, uma série de diluições de scFvl6D3/scFv16D3 humanizado foi adicionada, 100 uL/cavidade e um adicional de 100 uL/cavidade de huPIGF-10 2 foi adicionado. Após uma incubação de duas horas em TA, PIGF ligado foi detectado com anti-huPIGF de cabra (R&D Systems), 180 uL/cavidade, uma hora, TA, seguido por uma incubação com RAG-HRP (DAKO), uma hora, TA. O ensaio foi desenvolvido com OPD.

Exemplo 10: Análise de ligação ao antígeno e inibição da interação de 15 PIGF/flt-1 por Fab16D3 humanizado.

1. ELISA de ligação ao antígeno

Placas de ELISA foram revestidas ON com 1 ug/ml de huPIGF-1 em PBS, 100 uL/cavidade, 4°C. Após bloqueio com BSA 1%, uma hora, TA, uma série de diluições de Fab16D3 humanizado foi adicionada, 100 20 uL/cavidade, o fragmento de anticorpo foi deixado se ligar por uma hora, TA. Fab16D3 humanizado ligado foi detectado com anti-hulgG-HRP (Fab específico) (100 uL/cavidade, uma hora TA). O ensaio foi desenvolvido com OPD. Os resultados são fornecidos na Figura 17A.

2. Inibição de interação PIGF/Flt-1 através de ELISA

Placas de ELISA foram cobertas ON com 1 ug/ml de huFlt-1(R&D Systems), 200 uL/cavidade, ON, 4°C. Após bloquear com BSA 1%, uma hora, TA, uma série de diluições de Fab16D3 humanizado foi adicionada, 100 uL/cavidade e um adicional de 100 uL /cavidade de huPIGF-2 foi adicionado. Após uma incubação de duas horas em TA, PIGF ligado foi de- tectado com anti-huPIGF de cabra (R&D Systems), 180 uL/cavidade, uma hora, TA, seguido por uma incubação com RAG-HRP (DAKO), uma hora, TA. O ensaio foi desenvolvido com OPD, Os resultados são fornecidos naFigura 17B.

Exemplo 11: Determinação dos valores de Kn

Os valores de KD para 16D3, 16D3 lgG4 humanizado, scFv16D3 humanizado e Fab16D3 humanizado foram determinados por Biacore. Os resultados são fornecidos na Tabela 4 abaixo. Tabela 4: Tabela resumida de valores de KD

<table>table see original document page 48</column></row><table>

Valores de KD de 16D3, 16D3 lgG4 humanizado, Fab 16D3 humanizado e scFv!6D3 humanizado.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Thromb-X nv

Collen Research Foundation vzw

Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie (VIB)

<120> Novo anticorpo anti-PLGF <130> T3326-BR

<150> US 60/664,768 <151> 2005-03-24 <160> 30

<170> Versão da Patente 3.3

<2io> i

<211> 348

<212> DNA

<213> Mus músculo <220>

<221> CDS

<222> (1)..(348)

<223> parte variante da cadeia pesada de 16D3 de camundongo<400> 1

cag ate cag ctg cag cag tet gga cet gag ctg gtg aag cet ggg gct Gln lie Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

tca gtg aag ata tec tgc aag gcc tet ggc tac acc ttc act gac tac Ser Vai Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

tat ata aac tgg gtg aag ttg aag cet gga cag gga ctt gag tgg att Tyr lie Asn Trp Vai Lys Leu Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie

35 40 45

gga tgg att tat cet gga age ggt aat act aag tac aat gag aag ttc Gly Trp lie Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

aag ggc aag gcc aca ttg act ata gac aca tec tec age aca gcc tac Lys Gly Lys Ala Thr Leu. Thr lie Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

atg. cag etc age age ctg aca tet gag gac act gct gtc tat ttc tgt Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys

85 90 95

gta aga gac age cet ttc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act etc Vai Arg Asp Ser Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

aca gtc tec. tca Thr Vai Ser Ser 115

<210> 2

<211> 116

<212> PRT

<213> Mus músculo

<400> 2

Gln lie Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15Ser Vai Lys lie 20

Tyr lie Asn Trp 35

Gly Trp lie Tyr 50

Lys Gly Lys Ala 65

Met Gln Leu Ser

Vai Arg Asp Ser 100

Thr Vai Ser Ser 115

<210> 3 <211> 336 <212> DNA <213> Mus músculo <220>

<221> CDS

<222> (1)..(336)

<223> parte variante da cadeia leve de 16D3 de camundongo <400> 3

gac att gtg ctg tca cag tct cca tcc tcc ctg gct gtg tca gca gga Asp lie Vai Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Vai Ser Ala Gly 1 5 10 15

gag aag gtc act atg cgc tgc aaa tcc agt cag agt ctg etc aac agt Glu Lys Vai Thr Met Arg Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

25 30

gga atg cga aag agt ttc ttg gct tgg tac cag cag aaa cca ggg cag Gly Met Arg Lys Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45

Ser Cys Lys Ala

Vai Lys Leu Lys 40

Pro Gly Ser Gly 55

Thr Leu Thr lie 70

Ser Leu Thr Ser 85

Pro Phe Phe Asp

Ser Gly Tyr Thr 25

Pro Gly Gln Gly

Asn Thr Lys Tyr 60

Asp Thr Ser Ser 75

Glu Asp Thr Ala 90

Tyr Trp Gly Gln 105

Phe Thr Asp Tyr 30

Leu Glu Trp lie 45

Asn Glu Lys Phe

Ser Thr Ala Tyr 80

Vai Tyr Phe Cys 95

Gly Thr Thr Leu 110tct cct aag ctg ctg ate tac tgg gea tec act agg gaa tet ggg gtc 192 Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai

.50 55 60

cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act etc acc 240 5 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

ate age agt gtg cag gct gaa gac ctg gea gtt tat tac tgc aag caa 288 lie Ser Ser Vai Gln Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 tct tat cat cta ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 336 Ser Tyr His Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

<210> 4 <211> 112 15 <212> PRT

<213> Mus músculo <400> 4

Asp lie Vai Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Vai Ser Ala Gly 1 5 10 15

Glu Lys Vai Thr Met Arg Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asri Ser 20 25 30

Gly Met Arg Lys Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 . 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai 25 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

lie Ser Ser Vai Gln Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95

Ser Tyr His Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

<210> 5<211> 348<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

5 <223> Fragmento de anticorpo humanizado<220>

<221> CDS

<222> (1) . . (348)

<223> parte variante da cadeia pesada de 16D3 humanizada10 <400> 5

cag gtc cag ctg cag cag tct gga gcc gag ctg gtg aag cct ggg gct 48Gln Vai Gln Leu Gln Gln Ser.Gly Ala Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala1 5 ' 10 15

tca gtg aag ata tcc tgc aag gcc tct ggc tac acc ttc act gac tac 9615 Ser Vai Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

tat ata aac tgg gtg aag ttg gcc cct gga cag gga ctt gag tgg att 144Tyr lie Asn Trp Vai Lys Leu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie35 40 45

20 gga tgg att tat cct gga age ggt aat act aag tac aat gag aag ttc 192Gly Trp lie Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

aag ggc aag gcc aca ttg act ata gac aca tcc tcc age aca gcc tac 240Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr lie Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr25 65 70 75 80

atg cag etc age age ctg aca tct gag gac act gct gtc tat ttc tgt 288Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys

85 90 95

gta aga gac age cct ttc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc ctg etc 33630 Vai Arg Asp Ser Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu

100 105 110

aca gtc tcc tca 348Thr Vai Ser Ser115

<210> 6<211> 116<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Constructo sintético<400> 6

Gln Vai Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Vai Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr lie Asn Trp Vai Lys Leu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie

35 40 45

Gly Trp lie Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr lie Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys

85 90 95

Vai Arg Asp Ser Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu

. 100 105 110

Thr Vai Ser Ser115

<210> 7<211> 336<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Fragmento de anticorpo humanizado<220><221> CDS

<222> <1)..(336)

<223> parte variante da cadeia leve de 16D3 humanizada<400> 7

gac att gtg ctg acc cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tca ctg ggaAsp lie Vai Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly1 .5 10 15

gag cgg gtc act atg aac tgc aaa tcc agt cag agt ctg etc aac agtGlu Arg Vai Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

gga atg cga aag agt ttc ttg gct tgg tac cag cag aaa cca ggg cagGly Met Arg Lys Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 ' 40 45

tct cet aag ctg ctg ate tac tgg gea tcc act agg gaa tct ggg gtcSer Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai

50 55 60

cet gat cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act etc accPro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80

ate age agt gtg cag gct gaa gac gtc gea gtt tat tac tgc aag caalie Ser Ser Vai Gln Ala Glu Asp Vai Ala Vai Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

tct tat cat cta ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaaSer Tyr His Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys100 105 110

<210> 8<211> 112<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Constructo sintético<400> 8Asp lie Vai Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly1 5 10 15

Glu Arg Vai Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30

5 Gly Met Arg Lys Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr10 65 70 75 80

lie Ser Ser Vai Gln Ala Glu Asp Vai Ala Vai Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr His Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys100 105. 110

15 <210> 9<211> 24<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

20 <223> iniciador oligonucleotídeo<400> 9

atggratgga gctgkatcwt thtc 24<210> 10<211> 2525 <212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> iniciador oligonucleotídeo<400> 10

30 casaymcagg ggccagtgga tagac 25<210> 11<211> 27<212> DNA <213> Seqüência artificial<220> <223> iniciador oligonucleotídeo <400> 11 atgragtcac akacycaggt cttyrta <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Seqüência artificial<220> <223> iniciador oligonucleotídeo <400> 12 gctcactgga tggtgggaag atgg <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Seqüência artificial<220> <223> iniciador oligonucleotídeo <400> 13 ccaccggtga cattgtgctg acccagtctc c <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Seqüência artificial<220> <223> iniciador oligonucleotídeo <400> 14 caccgtacgt tttatttcca actttgtccc cgag <210> 15<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> iniciador oligonucleotideo

<400> 15

caggtccagc tgcagcagtc tg

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> iniciador oligonucleotideo

<400> 16

gatgggccct tggtcgacgc tgaggagact gtgagcaggg

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus músculo

<220>

<221> misc.

<222> (1) . . (8)

<223> cadeia pesada CDR1 de 16D3

<400> 17

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus músculo

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (1)..(8)<223> cadeia pesada CDR2 de 16D3<400> 18

lie Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr

<210> 19

<211> 9

"<212> PRT

<213> Mus músculo

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO<222> (1) . . (9)

<223> cadeia leve CDR3 de 16D3

<400> 19

Vai Arg Asp Ser Pro Phe Phe Asp Tyr

<210> 20

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus músculo

<220>

<221> misc

<222> (1). . (12)

<223> cadeia leve CDR1 de 16D3

<400> 20

Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Met Arg Lys Ser Phe

1 5 10

<210> 21

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus músculo

<220>

<221> misc<222> (1)..(3)

<223> cadeia leve CDR2 de 16D3

<400> 21Ti-p Ala Ser1

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus músculo

<220>

<221> REGIÃO DE INTERESSE BIOLÓGICO

<222> (1)..(8)

<223> cadeia leve CDR3 de 16D3

<400> 22

Lys Gln Ser Tyr His Leu Phe Thr1 5

<21.0> 23

<211> 786

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> 16D3 ScFv<220>

<221> CDS

<222> (1)..(786) <220>

<221> misc

<222> (1)..(348)

<223> cadeia pesada<220>

<221>misc

<222> (349)..(393)<223> Ligante<220>

<221> misc<222> (394). .(729)5 <223> Cadeia leve<220>

<221> misc<222> (736) . . (762)<223> HA-Tag10 <220>

<221> misc<222> (769) . . (786)<223> His-Tag<400> 23

15 cag ate cag ctg cag cag tet gga cet gag ctg gtg aag cet ggg gct 48Gln lie Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

tca gtg aag ata tec tgc aag gcc tet ggc tac acc ttc act gac tac 96Ser Vai Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 20 25 30

tat ata aac tgg gtg aag ttg aag cet gga cag gga ctt gag tgg att 144Tyr lie Asn Trp Vai Lys Leu Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu.Trp lie

35 40 45

gga tgg att tat cet gga age ggt aat act aag tac aat gag aag ttc 192

25 Gly Trp lie Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60

aag ggc aag gcc aca ttg act ata gac aca tec tec age aca gcc tac 240Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr lie Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

30 atg cag etc age age ctg aca tet gag gac act gct gtc tat ttc tgt 288Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys85 90 95gta aga gac ageVai Arg Asp Ser100

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ÇfÇft ggt tct gacGly Gly Ser Asp130

tca gea gga gagSer Ala Gly Glu145

etc aac agt ggaLeu Asn Ser Gly

cca ggg cag tctPro Gly Gln Ser18Ò

tct ggg gtc cetSer Gly Vai. Pro195

act etc acc ateThr Leu Thr. Ile210

tgc aag caa tctCys Lys Gln Ser225

gaa ata aaa ggtGlu Ile Lys Gly

cat cat cac catHis His His His

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ggt ggt ggt ggtGly Gly Gly Gly120

att gtg ctg tcaIle Vai Leu Ser135

aag gtc act atgLys Vai Thr Met150

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gat cgc ttc acaAsp Arg Phe Thr200

age agt gtg cagSer Ser Vai Gln215

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tct tac cca tacSer Tyr Pro Tyr245

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tac tgg ggc caaTyr Trp Gly Gln105

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cag tct cca tecGln Ser Pro Ser140

cgc tgc aaa tecArg Cys Lys Ser155

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ggc agt gga tctGly Ser Gly Ser

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gea gtt tat tacAla Vai Tyr Tyr

ggg aca aag ttgGly Thr Lys Leu240

tac gct ggt tctTyr Ala Gly Ser255260

<210> 24<211> 262<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Constructo sintético<400> 24

Gln lie Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Vai Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr lie Asn Trp Vál Lys Leu Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie

35 40 45

Gly Trp lie Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr lie Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys

85 . 90 95

Vai Arg Asp Ser Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Asp lie Vai Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Vai

130 135 140

Ser Ala Gly Glu Lys Vai Thr Met Arg Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu145 150 155 160

Leu Asn Ser Gly Met Arg Lys Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

165 170 175

Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu180 185 190Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Leu Thr lie Ser Ser Vai Gln. Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr

210 215 220

Cys Lys Gln Ser Tyr His Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu225 230 235 240

Glu lie Lys Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Vai Pro Asp Tyr Ala Gly Ser

245 250 255

His His His His His His260

<210> 25<211> 786<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> 16D3 ScFv humanizado<220>

<221> CDS

<222> (1)..(786)

<220>

<221> misc<222> (1)..(348)<223> Cadeia pesada<220>

<221> misc<222> (349) .. (393)<223> Ligante<220>

<221> misc<222> (394)..(729)<223> Cadeia leve<220><221> misc<222> (736) . . (762)<223> HA-tag<220> <221> misc

<222> (769)..(786)<223> HA-tag<400> 25

cag gtc cag ctg cag cag tct gga gcc gag ctg gtg aag cct ggg gct 48 Gln Vai Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala1.5 10 15

tca gtg aag ata tcc tgc aag gcc tct ggc tac acc ttc act gac tac 96Ser Vai Lys lie Sér Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30

tat ata aac tgg gtg aag ttg gcc cct gga cag gga ctt gag tgg att 144Tyr lie Asn Trp Vai Lys Leu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie

35 40 45

gga tgg att tat cct gga age ggt aat act aag tac aat gag aag ttc 192Gly Trp lie Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe20 50 .55 60

aag ggc aag gcc aca ttg act ata gac aca tcc tcc age aca gcc tac 240Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr lie Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

atg cag etc age age ctg aca tct gag gac act gct gtc tat ttc tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys

85 90 95

gta aga gac age cct ttc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc ctg etc 336Vai Arg Asp Ser Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu100 105 110 aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt gga, 384Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly.Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly115 120 125ggt ggt tct gac att gtg ctg acc cag tct cca gac tcc ctg gct gtgGly Gly Ser Asp lie Vai Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Vai

130 135 140

tca ctg gga gag cgg gtc act atg aac tgc aaa tcc agt cag agt ctgSer Leu Gly Glu Arg Vai Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu145 150 155 160

etc aac agt gga atg cga aag agt ttc ttg gct tgg tac cag cag aaaLeu Asn Ser Gly Met Arg Lys Ser Phe Leú Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

165 170 175

cca ggg cag tct cet aag ctg ctg ate tac tgg gea tcc act agg gaaPro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu

180 185 190

tct ggg gtc cet gat cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttcSer Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

195 200 205

act etc acc ate age agt gtg cag gct gaa gac gtc gea gtt tat tacThr. Leu Thr lie Ser. Ser Vai Gln Ala Glu Asp Vai Ala Vai Tyr Tyr

210 215 220

tgc aag caa tct tat cat cta ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttgCys Lys Gln.Ser Tyr His Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu225 230 235 240

gaa áta aaa ggt tct tac cca tac gac gtc cca gac tac gct ggt tctGlu lie Lys. Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Vai Pro Asp Tyr Ala Gly Ser

245 250 .255

cat cat cac cat cac catHis His His His His His260

<210> 26<211> 262<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220><223> Constructo sintético<400> 26

Gln Vai Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Vai Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

"Tyr lie Asn Trp Vai Lys Leu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie

35 40 45

Gly Trp lie Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr lie Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Sér Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys

85 90 95

Vai Arg Asp Ser Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu

100 105 110

Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Asp lie Vai Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Vai

130 135 140

Ser Leu Gly Glu Arg Vai Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu145 150 155 160

Leu Asn Ser Gly Met Arg Lys Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

165 170 175

Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu

180 185 190

Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Leu Thr lie Ser Ser Vai Gln Ala Glu Asp Vai Ala Vai Tyr Tyr

210 215 220

Cys Lys Gln Ser Tyr His Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu225 230 235 240Glu lie Lys Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Vai Pro Asp Tyr Ala Gly Ser

245 250 255

His His His His His His260

<210> 27<211> 22<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> iniciador oligonucleotídeo<400> 27

caggtccagc tgcaíjcagtc tg<210> 28<211> 40<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> iniciador oligonucleotídeo<400> 28

gatgggccct tggtcgacgc tgaggagact gtgagcaggg<210> 29<211> 31<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> iniciador oligonucleotídeo<400> 29

ccaccggtga cattgtgctg acccagtctc c<210> 30<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> iniciador oligonucleotídeo<400> 30

caccgtacgt tttatttcca actttgtccc cgag 34

Claims (29)

1. Molécula de ligação ao antígeno capaz de se ligar a PIGF, ca-racterizada em que ela compreende pelo menos duas CDRs selecionadas apartir do grupo que consiste em SEQ ID Ne:17 a 22 ou pelo menos duas se- qüências que tem pelo menos 90% de identidade de seqüência com elas.

2. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica-ção 1, caracterizada em que ela compreende as regiões de CDR que cor-respondem às seqüências de SEQ ID N9:17 a SEQ ID NQ:22 ou seqüênciasque tem pelo menos 90% de identidade de seqüência com elas.

3. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica-ção 1 ou 2, que é uma molécula selecionada a partir do grupo de Fab, Fab'ou F(ab')2, uma combinação de pelo menos duas regiões de determinaçãode complementaridade (CDRs), uma parte variável de cadeia simples anco-rada à membrana ou solúvel ou um domínio variável único.

4. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica-ção 1 ou 2, caracterizada em que ela compreende uma região variável decadeia pesada que compreende a seqüência de SEQ ID NQ:2 ou uma se-qüência que tem pelo menos 90% de identidade de seqüência com ela den-tro das regiões de CDR e em que ela compreende uma região variável de cadeia leve que compreende a seqüência de SEQ ID NQ:4 ou uma seqüênciaque tem pelo menos 80% de identidade de seqüência com ela dentro dasregiões de CDR.

5. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 4, que é o anticorpo 16D3 como produzido pela linha- gem celular depositada como LMBP 6399CB ou um fragmento do mesmo.

6. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 4, que é um anticorpo ou fragmento de anticorpo hu-manizado.

7. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, que é um anticorpo ou fragmento de anticorpo hí-brido humano/camundongo.

8. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 4, em que as ditas regiões de CDR estão enxertadasna cadeia principal de um anticorpo humano.

9. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica-ção 8, em que o dito anticorpo humano é IgG 1k ou lgG4K.

10. Molécula de ligação ao antígeno da reivindicação 1 ou 2,que é um fragmento variável de cadeia única que se liga a PIGF que com-preende pelo menos duas CDRs selecionadas a partir do grupo de SEQ IDNQ:17 a 22 ou pelo menos duas seqüências que tem pelo menos 80% deidentidade de seqüência com elas.

11. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica-ção 10, que compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NQ: 24.

12. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica-ção 11, que é uma molécula de ligação ao antígeno humanizada.

13. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica- ção 12, que compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID Ns: 26.

14. Linhagem celular que produz uma molécula de ligação aoantígeno como definida na reivindicação 1 ou 2.

15. Linhagem celular de acordo com a reivindicação 14, que é alinhagem celular depositada como LMPB 6399CB.

16. Composição farmacêutica para prevenção ou tratamento deangiogênese indesejada em condições patológicas em mamíferos, que com-preende como um princípio ativo uma molécula de ligação a PIGF como de-finida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em mistura com um veí-culo farmaceuticamente aceitável.

17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16,que compreende ainda uma quantidade terapeuticamente eficaz de outroagente antiangiogenico.

18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 17,em que o dito outro agente antiangiogenico é selecionado a partir do grupo que consiste em inibidores de VEGF e bFGF.

19. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 18,em que o dito inibidor de VEGF é um anticorpo anti-VEGF.

20. Polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação ao an-tígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

21. Método de tratamento e/ou prevenção de angiogênese inde-sejada em condição patológica em um mamífero, que compreende adminis-trar a um mamífero que necessite de tal tratamento ou prevenção, umaquantidade terapeuticamente eficaz de um princípio ativo que é uma ou maisdas moléculas de ligação ao antígeno como definida em qualquer uma dasreivindicações 1 a 13.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a condi- ção patológica é selecionada a partir do grupo que consiste em câncer, in-flamação, formação de adesão, doenças do olho, hipertensão pulmonar eextravasamento vascular.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o ditocâncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de cólon, câncer de mama, câncer pancreático e melanomas.

24. Uso da molécula de ligação ao antígeno como definida emqualquer uma das reivindicações 1 a 13, para a detecção imunológica dePIGF em amostras humanas.

25. Uso da molécula de ligação ao antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, para o rastreamento de compostoscom um efeito aditivo à inibição de PIGF no tratamento de câncer.

26. Uso da molécula de ligação ao antígeno como definida emqualquer uma das reivindicações 1 a 13, como uma ferramenta de diagnósti-co iri vitro.

27. Uso da molécula de ligação ao antígeno como definida emqualquer uma das reivindicações 1 a 13, para a produção de um medica-mento para o tratamento e/ou prevenção de angiogênese indesejada emcondição patológica em um mamífero.

28. Uso de acordo com a reivindicação 27, em que a condição patológica é selecionada a partir do grupo que consiste em câncer, inflama-ção, formação de adesão, doenças do olho, hipertensão pulmonar e extra-vasamento vascular.

29. Uso de acordo com a reivindicação 28, em que o dito cânceré selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de cólon, câncer demama, câncer pancreático e melanomas.