NO341877B1

NO341877B1 - Nytt anti-plgf antistoff

Info

Publication number: NO341877B1
Application number: NO20074563A
Authority: NO
Inventors: Desire Jose Collen; Jean Marie Stassen; Peter Carmeliet
Original assignee: Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw; Life Science Res Partners Zvw; Thrombogenics Nv
Priority date: 2005-03-24
Filing date: 2007-09-10
Publication date: 2018-02-12
Also published as: CN101184776B; EP1869085B1; EP2447281A1; KR101314014B1; US20110123525A1; RS52372B; US20080193455A1; JP2012136522A; CY1113224T1; IL185754A; KR20080016794A; WO2006099698A2; SI1869085T1; AU2006227571B8; HK1116803A1; US8758748B2; BRPI0609151A2; UA94707C2; AU2006227571A1; AU2011201340A1

Abstract

Sammendrag Foreliggende oppfinnelse angår nye antistoffer og fragmenter og derivater derav, særlig egnet for inhiberingen av angiogenese ved patologiske tilstander.

Description

NYTT ANTI-PLGF ANTISTOFF

Foreliggende oppfinnelse angår nye antistoffer og fragmenter og derivater derav, særlig egnet for inhiberingen av angiogenese ved patologiske tilstander. Oppfinnelsen angår også cellelinjer som produserer de spesifikke antistoffer. Foreliggende oppfinnelse vedrører farmasøytiske preparater som omfatter antistoffene, fragmentene og/eller derivatene ifølge oppfinnelsen og tilveiebringer metoder for prevensjon og terapi av angiogenese og/eller vaskulær lekkasje der dette er uønsket, for eksempel som ved tumordannelse, øyesykdommer, pulmonær hypertensjon og inflammatoriske forstyrrelser samt metoder for prevensjon og terapi av beinforstyrrelser som osteoporose.

Abnormal blodkardannelse bidrar til patogenesen av tallrike sykdommer med høy morbiditet og mortalitet. Belysning av mekanismene som ligger bak vaskulær vekst, kan tillate utvikling av terapeutiske strategier for å stimulere vaskulær vekst i ischemisk vev eller å undertrykke deres dannelse i tumorer. Nyere genmålsøkingsstudier i embryoer har identifisert noen av mekanismene som er involvert i initialdannelsen av endoteliale kanaler (angiogenese) og deres etterfølgende maturering ved dekking med glatte muskelceller (arteriogenese). Bevis sier at distinkte, molekylære mekanismer kan mediere vekst av blodkar under patologiske betingelser, men de molekylære spillere forblir i stor grad ukjent.

Det er fastslått at vaskulær endotelial vekstfaktor (Vascular Endothelial Growth factor - VEGF) er implisert i utvikling og patologisk vekst av vaskulaturen (Ferrara N. et al., 1999, Curr Top Microbiol Immunol 237, 1-30). Videre er det også påvist at placental vekstfaktor (Placental Growth Factor -PlGF), en homolog av VEGF, er en spesifikk modulator av VEGF under et antall patologiske tilstander som ischemisk retinopati, tumorigenese, inflammatoriske forstyrrelser og ødem. Det er videre vist at PlGF<-/->-mus har en forringet angiogenese og arteriogenese i sykdom (Carmeliet P. et al., 2000, J. Pathol.190, 387-405), mens den fysiologiske angiogenese i vanlig helse forblir upåvirket. Således har inhibitorer av PlGF et stort potensiale for behandling av sykdommer der angiogenese eller arteriogenese bidrar ril sykdommens patologi.

Inhibitorer for PlGF er kjent i teknikken, for eksempel geitepolyklonalt antistoff mot human PlGF (R&D pharmaceuticals, Abingdon, UK) og et kyllingpolyklonalt antistoff (Gassmann et al., 1990, Faseb J.4, 2528). Disse antistoffer benyttes for Western blotting, histokjemi og immunoprecipiteringsstudier. WO01/85796 beskriver bruken av inhibitorer av PlGF inkludert monoklonale anti-PlGF antistoffer for terapi eller prevensjon av sykdommer som tumordannelse. Mer spesifikt beskrives det fremstilling av murine, monoklonale antistoffer som fullt ut inhiberer murin PlGF-2 binding til sin reseptor Flt-1, hvorved antistoffet Mab-PL5D11 velges til å ha den mest effektive, inhibitoriske aktivitet. Anvendelse av antistoffer i dyremodeller på patologisk angiogenese er beskrevet.

Antistoffer som genereres i dyr, har karakteristika som alvorlig begrenser deres anvendelse i human terapi. Som fremmedproteiner kan de utløse en anti-immunoglobulinrespons (som for museantistoffer angis som human anti-muse antistoff eller HAMA) som reduserer eller ødelegger deres terapeutiske effektivitet, og/eller fremkaller allergiske eller hypersensitivitetsreaksjoner hos pasienter, slik det beskrives av Jaffers et al., 1986 (Transplantation 198641:572). Mens bruken av humane monoklonale antistoffer vil bøte på denne begrensning, har det vist seg vanskelig å generere store mengder av humane, anti-humane antistoffer ved konvensjonell hybridomteknologi. Rekombinant teknologi har derfor vært benyttet i teknikken for å konstruere "humaniserte" antistoffer som beholder den høye bindingsaffinitet hos dyr som murine monoklonale antistoffer, men som viser redusert immunogenisitet i mennesker. Særlig har kimeriske antistoffer vært antydet der det variable området (V) for et ikke-humant antistoff er kombinert med det konstante (C) område av et humanantistoff. Metoder for å oppnå slike kimeriske immunoglobuliner er beskrevet i detalj i US 5770 198. I andre forsøk på å redusere immunogenisiteten for murine antistoffer blir kun det komplementaritetsbestemmende område (CDR), det vil si områder av hypervariabilitet i V-områdene, heller enn hele V-området, transplantert til et humant antistoff. Slike humaniserte antistoffer er kjent som CDR-podede antistoffer. Konstruksjonen av CDR-podede antistoffer som gjenkjenner mer komplekse antigener, har resultert i antistoffer som har bindingsaktivitet signifikant lavere enn de native, ikke-humaniserte antistoffer. I tallrike tilfeller er det påvist at kun innføring av ikke-humane CDR'er i humanantistoffskjelettet er utilstrekkelig til å opprettholde full bindingsaktivitet. Mens en raffinert datamaskinmodell av det murine antistoff av interesse kreves for å identifisere kritiske aminosyrer som må tas med i betraktning ved konstruksjon av et humanisert antistoff, og generelle, teoretiske retningslinjer ble foreslått for slik konstruksjon, må i alle tilfeller prosedyren skreddersys og optimaliseres for det spesielle, ikke-humane antistoff av interesse.

Deretter forblir det et behov for (monoklonale) antistoffer som optimalt inhiberer human PlGF binding til sin reseptor. Videre må slike antistoffer også være ikke-immunogeniske, dit hen at de ikke kan utløse HAMA (eller ha noen lav tendens til å gjøre dette).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et nytt, monoklonalt antistoff rettet mot PlGF og i stand til å inhibere binding av PlGF til sin reseptor som definert i kravene. De foreliggende ligander er de første som viser inhibering av human PlGF i en patologisk tilstand in vivo. Mer spesielt er antistoffene og derivatene derav ifølge oppfinnelsen i stand til å redusere tumorstørrelse og vaskularisering av human tumorvev in vivo. Antistoffene ifølge oppfinnelsen gir et alternativ til anti-angiogeniske terapier innrettet mot VEGF som benyttes i dag, med den vesentlige fordel at bivirkningene som forårsakes ved inhibering av fysiologisk angiogenese assosiert med disse terapier, signifikant reduseres.

Foreliggende fremleggelse angår antigenbindingsmolekyler og særlig monoklonale antistoffer, fragmenter og derivater derav, inkludert humaniserte antistoffer og antistoffragmenter, som binder til den samme epitop av PlGF som antistoffet som her angis som 16D3.

Det er beskrevet nye, monoklonale antistoffer i stand til binding til PlGF og med evnen til å inhibere funksjoneringen av PlGF og mer spesielt antistoffer som karakteriseres ved at deres tungkjedevariable områder omfatter sekvensen SEQ ID NR.: 2 eller en sekvens med minst 80 %, fortrinnsvis minst 90 % og aller helst minst 95 % sekvensidentitet med CDR-områdene, og/eller at deres lettkjedevariable område omfatter sekvensen SEQ ID NR.: 4 eller en sekvens med minst 80 %, særlig minst 85 % og spesielt minst 90 %, helt spesielt minst 95 % sekvensidentitet med CDR-områdene, som antistoffet 16D3 eller derivater derav. I tillegg eller alternativt har, i en ytterligere utførelsesform, de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen en sekvensidentitet innen de tung- og/eller lettkjedevariable områder utenfor CDR-områdene som er minst 80 %, fortrinnsvis minst 90 %, spesielt minst 90 % og helt spesielt minst 95 % identiske med sekvensene SEQ ID NR.: 2, henholdsvis SEQ ID NR.: 4.

I henhold til en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen er antistoffet et humanisert antistoff og mer spesielt et hybridantistoff, mest spesielt et muse-/humanhybridantistoff, og mer spesielt et hybrid muse-16D3/human-IgG1κ eller IgG4κ. Alternativt er det humaniserte antistoffet et som omfatter CDR-områdene av muse-16D3-antistoffet ifølge oppfinnelsen i stand til å binde PlGF, podet på skjelettet av et humant antistoff.

En ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen angår antigenbindingsfragmenter av muse-16D3-antistoffet eller et derivat derav, som et humanisert antistoff derav, som, men ikke begrenset til, et Fab, Fab' eller F(ab')2, en kombinasjon av minst to komplementaritetsbestemmende områder (CDR'er), et oppløselig eller membranforankret enkeltkjedevariabelt område, eller et enkelt variabelt domene. Antigenbindingsfragmenter inkluderer fragmenter som omfatter minst to CDR'er av 16D3 eller derivater derav, eller mer spesielt minst to CDR'er valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NR.: 17 (GYTFTDYY), SEQ ID NR.: 18 (IYPGSGNT); SEQ ID NR.: 19 (VRDSPFFDY), SEQ ID NR.: 20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID NR.: 21 (WAS) og SEQ ID NR.: 22 (KQSYHLFT) eller som omfatter minst to sekvenser med minst 80 %, særlig minst 85 %, spesielt minst 90 % og helt spesielt minst 95 % sekvensidentitet dermed. En spesiell utførelsesform av oppfinnelsen angår tilveiebringelsen av enkeltkjedevariable fragmenter (scFv'er) av muse-16D3 antistoffet og humaniserte scFv'er som er i stand til å inhibere PlGF-aktivitet. Helt spesielt tilveiebringer oppfinnelsen scFv'er omfattende aminosyresekvensen SEQ ID NR.: 24 eller SEQ ID NR.: 26.

Nok en gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe cellelinjer som produserer de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen og mer spesielt cellelinjen 16D3 som produserer 16D3-antistoffet, men også andre cellelinjer som er i stand til å produsere antigenbindingsmolekylene avledet fra 16D3 eller fragmenter derav, for eksempel som et resultat av rekombinant teknologi.

Nok en gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe et farmasøytisk preparat for prevensjon eller terapi av (uønsket) angiogenese ved patologiske tilstander eller forstyrrelser i pattedyr eller for prevensjon eller terapi av beinresorpsjon, som omfatter et antistoff mot PlGF som er 16D3 eller et fragment eller derivat, mer spesielt en humanisert versjon av 16D3 eller et antigenbindende fragment derav, i blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer. En spesifikk utførelsesform av oppfinnelsen er et farmasøytisk preparat som omfatter et antigenbindende fragment av 16D3 eller et derivat derav som er valgt fra gruppen bestående av en Fab, Fab' eller F(ab')2, en oppløselig eller membranforankret enkeltkjedevariabel del eller et enkeltvariabelt domene. De mest spesielle utførelsesformer av fremleggelsen angår farmasøytiske preparater omfattende et antigenbindende fragment som omfatter minst to CDR'er valgt blant gruppen bestående av SEQ ID NR.: 17 (GYT-FTDYY), SEQ ID NR.: 18 (IYPGSGNT); SEQ ID NR.: 19 (VRDSPFFDY), SEQ ID NR.: 20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID NR.: 21 (WAS) og SEQ ID NR.: 22 (KQSYHLFT) eller minst to med minst 80 %, særlig minst 85 %, spesielt minst 90 % og helt spesielt minst 95 % sekvensidentitet med to forskjellige sekvenser valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NR.: 17 til 22. En spesiell utførelsesform angår farmasøytiske preparater omfattende en scFv av 16D3-antistoffet ifølge oppfinnelsen, mer spesielt omfattende en scFv omfattende minst to CDR'er valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NR.: 17 (GYTFTDYY), SEQ ID NR.: 18 (IYPGSGNT); SEQ ID NR.: 19 (VRDSPFF-DY), SEQ ID NR.: 20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID NR.: 21 (WAS) og SEQ ID NR.: 22 (KQSYHLFT) eller minst to sekvenser med minst 80 %, særlig minst 85 %, spesielt minst 90 % og helt spesielt minst 95 % sekvensidentitet med to forskjellige sekvenser valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NR.: 17 til 22, som en scFv omfattende SEQ ID NR.: 24. Mest spesielt omfatter det farmasøytiske preparat en humanisert scFv av 16D3 som, men ikke begrenset til, den humaniserte scFv omfattende SEQ ID NR.: 26 eller en sekvens med minst 80 %, særlig minst 85 %, spesielt minst 90 % og helt spesielt minst 95 % sekvensidentitet dermed innen CDR'ene som er i stand til å binde PlGF.

I nok en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen er en terapeutisk effektiv mengde av et annet antiangiogenisk middel inkludert i tillegg til det antigenbindende molekyl som er i stand til å binde til PlGF ifølge oppfinnelsen. Mest spesielt i denne forbindelse tas det sikte på antiangiogeniske midler som VEGF- og bfGF-inhibitorer og særlig anti-VEGF-antistoffer.

Nok en gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe nukleotidsekvenser som koder antigenbindingsfragmenter av antistoffene som binder til PlGF som beskrevet her, mer spesielt nukleotidsekvenser som koder de tung- og lettkjedevariable områder av 16D3 som produseres av cellelinje 16D3. Mest spesielt tas det sikte på nukleotidsekvensen som koder de variable områder av SEQ ID NR.: 2 og SEQ ID NR.: 4. Ytterligere fremlagte polynukleotidsekvenser som koder antigenbindingsfragmenter, omfatter minst to CDR'er av 16D3, mer spesielt polynukleotider som koder minst to av CDR'ene som er valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NR.: 17 (GYTFTDYY), SEQ ID NR.: 18 (IYPGSGNT); SEQ ID NR.: 19 (VRDSPFFDY), SEQ ID NR.: 20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID NR.: 21 (WAS) og SEQ ID NR.: 22 (KQSYHLFT), eller kodende sekvenser bestående av minst to CDR'er med minst 80 %, særlig minst 85 %, mer spesielt minst 90 % og helt spesielt minst 95 % sekvensidentitet med SEQ ID NR.: 17 til 22. Spesifikke utførelsesformer av nukleotidsekvensene er tilveiebrakt i SEQ ID NR.: 1, 3, 5 og 6. Ytterligere spesifikke utførelsesformer inkluderer nukleotidsekvensene som koder scFv av 16D3 og humaniserte versjoner derav, mest spesielt sekvensen SEQ ID NR.: 23 og SEQ ID NR.: 25.

Et ytterligere formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for terapi og/eller prevensjon av uønsket (eller patologisk) angiogenese i patologisk tilstand hos et pattedyr der metoden omfatter administrering til et pattedyr som trenger slik behandling eller prevensjon av en terapeutisk effektiv mengde av en aktiv bestanddel som et antistoff 16D3 ifølge oppfinnelsen eller et antigenbindende fragment eller derivat derav, mest spesielt en scFv som beskrevet her. Spesielt egnet for metodene ifølge oppfinnelsen er de humaniserte antistoffer og antistoffragmenter som scFv'er av 16D3 eller derivater derav. En spesiell utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er terapi og/eller prevensjon av patologiske tilstander som, men ikke begrenset til, cancer, inflammasjon, sykdommer i øyet, pulmonær hypertensjon og vaskulær lekkasje. Et spesielt formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en effektiv og sikker terapi (det vil si uten bivirkninger) for patologisk angiogenese, mer spesielt for tumorvekst, inflammasjon, sykdommer i øyet eller vaskulær lekkasje, hos pattedyr og mer spesielt mennesker. Mest spesielt er fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen egnet for terapi og/eller prevensjon av faste tumorer og mer spesielt for terapi og/eller prevensjon av koloncancer, brystcancer, pankreatisk cancer og melanomer.

Ytterligere anvendelser av antistoffene og antigenbindende fragmenter ifølge oppfinnelsen gjelder den immunologiske detektering av PlGF i humanprøver, som merkede, målsøkende deler i diagnostiske metoder og for screening av forbindelser med en additiv effekt for PlGF-inhibering i behandling av cancer.

Foreliggende fremleggelse er basert på den overraskende bestemmelse av nye ligander, nemlig nye murine og humaniserte, monoklonale antistoffer og fragmenter, derivater og homologer derav som inhiberer PlGF meget effektivt. Mest spesielt presenterer oppfinnelsen ligander som er i stand il å redusere tumorvekst, og mest spesielt i stand til å redusere størrelsen av en tumor mellom 20 og 50 %.

Den følgende beskrivelse som ikke er ment å begrense oppfinnelsen til spesifikke utførelsesformer som beskrevet her, kan forstås i forbindelse med de vedlagte figurer som viser:

Figur 1: Binding av antistoffet 16D3 (A) eller humanisert antistoff 16D3 (hu16D3)(B) til human PlGF-2 (produsert i Pichia) med en ELISA-test i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen.

Figur 2: Inhibering av PlGF-2-binding til human Flt-1-reseptoren ved antistoffet 16D3 (kvadrater) eller det humaniserte antistoff 16D3 (triangler) med en ELISA-test i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen.

Figur 3: Resultater av Biacore-forsøkene der rhuPlGF-2 mobiliseres på en CM5-brikke for å undersøke inhiberingspotensialet for antistoffet 16D3 og dens Fab-fragmenttest i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen.

Figur 4: Monoklonalt antistoff 16D3 inhiberer tumorvekst i en subkutan human pankreatisk DanG xenografttumormodell. Behandling av nu/nu-mus med tumorer på rundt 60 mm<3>med anti-tPa ('kontroll IgG') (1C8; 50 mg/kg kroppsvekt; n=10), anti-hPlGF 16D3 ('anti-hPlGF')(50 mg/kg kroppsvekt; n=10), anti-mPlGF (PL5D11D4) (oppnådd som beskrevet i WO01/85796; 50 mg/kg kroppsvekt; n=10), en kombinasjon av antihPlGF 16D3 og en anti-mPlGF PL5D11D4 ('anti-hPlGF/anti-mPlGF') (hver 25 mg/kg kroppsvekt; n=10) og 'vehikkel' (n=10) i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen.

(A) tumorstørrelse ,(B) tumorvekt 18 dager etter tumorinokulering.

Figur 5: Monoklonalt antistoff 16D3 inhiberer tumorvekst i en subkutan human pankreatisk DanG xenografttumormodell på doseavhengig måte. Behandling av nu/nu-mus med tumorer på rundt 60 mm<3>med anti-hPlGF 16D3 (50 mg/kg = '1000 µg'/'C', 37,5 mg/kg = '750 µg'/'D', 25 mg/kg = '500 µg'/'E', 12,5 mg/kg = '250 µg'/'F'; n=10 for hver konsentrasjon), kontroll IgG ('1C8'/'B'; 50 mg/kg) og 'vehikkel'/'A' (n=10) i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen.

A: evaluering av midlere tumorstørrelse etter tumorcelleinokulering;

B: gjennomsnittlig midlere tumorstørrelse på dag 20.

Figur 6: Monoklonalt antistoff 16D3 inhiberer tumorvekst i en subkutan humanbryst-MDA-MB-xenografttumormodell. Behandling av nu/nu-mus med tumorer på rundt 60 mm<3>med anti-hPlGF 16D3 (50 mg/kg kroppsvekt, n=10) eller vehikkel tre ganger en uke i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen.

A: tumorvekt og B: tumorvolum som bestemt 32 dager etter inokulering.

Figur 7: Monoklonalt antistoff 16D3 inhiberer tumorvekst i en subkutan humankolon LOVO xenografttumormodell. Behandling av nu/nu mus med tumorer på rundt 60 mm<3>med anti-hPlGF 16D3 (50 mg/kg kroppsvekt, n=10) eller vehikkel tre ganger en uke i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen.

A: tumorvekt og B: tumorvolum som bestemt 30 dager etter inokulering.

Figur 8: Monoklonalt antistoff 16D3 inhiberer tumorvekst i en subkutan humanmelanoma-Mel2a-xenografttumormodell. Behandling av nu/nu-mus med tumorer på rundt 60 mm<3>med anti-hPlGF 16D3 (50 mg/kg kroppsvekt, n=10) eller vehikkel tre ganger en uke i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen. Tumorvekt som bestemt 53 dager etter inokulering.

Figur 9: Monoklonalt antistoff 16D3 forhindrer kroppsvekttap i en subkutan humanpankreatisk DanG-xenografttumormodell. Behandling av nu/nu-mus med tumorer på rundt 60 mm<3>med anti-hPlGF 16D3 (50 mg/kg kroppsvekt; n=10), kontroll IgG, en kombinasjon av anti-hPlGF og anti-mPlGF (hver 25 mg/kg kroppsvekt; n=10) og vehikkel (n=10) i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen. Tumorvekten ble trukket fra kroppsvekten før beregning av prosentandel kroppsvekttap.

Åpne stolper: kroppsvekt på første behandlingsdag; fylte stolper: kroppsvekt siste behandlingsdag.

Figur 10: Monoklonalt antistoff 16D3 og Avastin utøver en ytterligere effekt på inhibering av tumorvekst i en subkutan humanpankreatisk DanG. Behandling av nu/nu-mus med tumorer på rundt 60 mm<3>med anti-hPlGF 16D3 (37,5 mg/kg, 25 mg/kg, 12,5 mg/kg kroppsvekt; n=10 for hver konsentrasjon), kontroll IgG (1C8; 50 mg/kg), Avastin (15 mg/kg og 5 mg/kg kroppsvekt, i.p. to ganger ukentlig, n= 10 hver) og en kombinasjon av anti-hPlGF (12,5 mg/kg kroppsvekt) og Avastin (5 mg/kg kroppsvekt; n=10) i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen. Mus ble avlivet 20 dager etter tumorinokulering og tumorvolumet bestemt.

Figur 11: Nukleotid- og aminosyresekvenser av variable deler av murinantistoff 16D3 i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen.

A: nukleotidsekvens som koder variabel del av tung kjede;

B: nukleotidsekvens som koder variabel del av lett kjede;

C: aminosyresekvens av variabel del av tung kjede;

D: aminosyresekvens av variabel del av lett kjede. Nukleotider eller aminosyrer som kan modifiseres for humaniseringsformål ifølge en utførelsesform av oppfinnelsen er understreket.

Figur 12: Nukleotid- og aminosyresekvenser for humaniserte variable deler av 16D3 i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen.

A: nukleotidsekvens som koder humanisert variabel del av tung kjede;

B: nukleotidsekvens som koder humanisert variabel del av lett kjede;

C: aminosyresekvens for humanisert variabel del av tung kjede;

D: aminosyresekvens av humanisert variabel del av lett kjede.

Nukleotider eller aminosyrer som er modifisert for humaniseringsformål, er understreket.

Figur 13: Illustrering av vektor for ekspresjon av humanisert 16D3 scFv i 293 celler.

Figur 14: A: binding av scFv16D3 og humanisert scFv16D3 til PlGF;

B: inhibering av huPlGF-2 binding til sin reseptor huFlt-1 ved scFv16D3 og humanisert scFv16D3 (B).

Figur 15: A: aminosyresekvensen for scFv av murint antistoff 16D3;

B: aminosyresekvens for humanisert scFv av antistoff 16D3.

Regioner utenfor tung- og lettkjedevariable områder er understreket.

Figur 16: Illustrering av vektoren for ekspresjon av humanisert 16D3 Fab i 293 celler i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen.

Figur 17: A: binding av humanisert Fab 16D3 til huPlGF med en ELISA-test i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen;

B: inhibering av huPlGF-2 binding til sin reseptor huFlt-1 ved humanisert Fab16D3.

Definisjoner

Uttrykket "16D3" som benyttet her henviser til det monoklonale antistoff mot PlGF som produseres av cellelinjen som er deponert hos BCCM/LMBP under nummeret LMBP 6399CB.

Uttrykket "antistoffragment" henviser til en subdel av et antistoffmolekyl som alene, eller i kombinasjon med andre fragmenter, er i stand til binding til antigenet mot hvilket det tilsvarende antistoff ble dyrket. Typiske antistoffragmenter er Fab, Fab', F(ab')2, Fv eller scFv som ofte bibeholder en affinitet for antigenet som er sammenliknbar med det fullstendige antistoff. Mindre fragmenter inkluderer komplementaritetsbestemmende områder eller CDR'er som CDR1, CDR2 og CDR3 av den tunge eller lette kjede og/eller kombinasjoner av to eller flere derav.

Uttrykket "derivat" benyttes her for å henvise til et antigenbindende molekyl som tilsvarer en modifikasjon av det opprinnelige antistoff (for eksempel som produsert av en hybridomcellelinje) eller fragment derav, uten signifikant å påvirke bindingen til antigenet. Typiske modifiseringer inkluderer modifiseringer av aminosyresekvensen av det opprinnelige antistoff eller modifiseringer av de funksjonelle grupper som er til stede på aminosyresekvensen, for eksempel innen konteksten humanisering, for bindingen av antistoffet eller fragmentet derav til andre molekyler som merkelapper eller kuler, eller for modifiseringen av glykosylering. Således inkluderer derivatene, men er ikke begrenset til, humaniserte antistoffer, hybridantistoffer, antistoffer eller andre antigenbindende molekyler som er oppnådd ved poding eller innføring av en eller flere av de variable områder og/eller CDR'er av det opprinnelige antistoff på skjelettet av et annet antistoff eller fragment av den samme eller en annen spesie. Derivater av et antistoff inkluderer alternative strukturer av en eller flere CDR'er av antistoffet som resulterer i et antigenbindende molekyl som et syntetisk polypeptid.

Et "humanisert antistoff eller antistoffragment" som benyttet heri henviser til et antistoffmolekyl eller fragment derav hvori, sammenliknet med det opprinnelige antistoff, aminosyrer er erstattet for å likne mer på et humant antistoff. Majoriteten av disse substitueringer vil være i skjelettet av antistoffet eller antistoffragmentet, det vil si i ikke-antigenbindende områder. Imidlertid er det tatt sikte på at innen CDR'ene kan aminosyrer som ikke eller nesten ikke deltar i bindingen til antigenet, også substitueres.

Et "omformet" antistoff eller antistoffragment eller et "hybrid antistoff" som benyttet her, henviser til et antistoff som omfatter deler av minst to forskjellige antistoffer som eventuelt kan være fra de samme eller forskjellige spesier. Typisk kan et humanhybridantistoff være et humant konstant område av et antistoff forbundet med et humanisert variabelt område av et annet antistoff (som er rettet mot antigenet av interesse) eller et humanantistoffskjelett av et antistoff hvori aminosyresekvensen i antigenbindingsområdene er erstattet med sekvenser fra et annet antistoff, for eksempel et ikke-humant antistoff rettet mot et humant antigen av interesse. Mer spesielt blir de antigenbindende områder av ett (vanligvis ikke-humant) antistoff med en affinitet for et antigen av interesse, for eksempel en eller flere CDR'er eller variable områder eller deler derav, innført i skjelettet av et annet (vanligvis humant) antistoff (for eksempel CDR-podede antistoffer).

Uttrykkene "homologi" eller "homolog" som benyttet her under henvisning til to eller flere antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen, henviser til evnen hos de antigenbindende molekyler til å binde til det samme antigen og mer spesielt den samme epitop. Evnen hos to antigenbindende molekyler til å binde til den samme epitop kan bedømmes ved å bestemme hvorvidt de antigenbindende molekyler kan konkurrere med hverandre for binding til det samme antigen, for eksempel i en kompetitiv bindingsanalyse. Bindingen til antigenet av homologe, antigenbindende molekyler bør være av tilsvarende spesifisitet.

"Sekvensidentitet" for to sekvenser som benyttet her angår antallet posisjoner med identiske nukleotider eller aminosyrer dividert med antallet nukleotider eller aminosyrer i den kortere av sekvensene, når to sekvenser innrettes ovenfor hverandre. Fortrinnsvis er nevnte sekvensidentitet høyere enn 70-80 %, særlig 81-85 %, spesielt 86-90 %, særlig 91-95 %, helst 96-100 % og er spesielt 100 %. I lys av det generelt begrensede bidrag for skjelettet av de variable områder til bindingen med antigenet er sekvensidentiteten vanligvis spesifisert her med henblikk på sekvensen innen de komplementære testbestemmende områder eller CDR'er, det vil si i forbindelse med nukleotidsekvensene som kodet og aminosyresekvensen som utgjør CDR'ene. Når således en sekvens spesifiseres til å ha en 80 % sekvensidentitet over en spesifikk sekvens "innen CDR'ene" er det tilsiktet å tilveiebringe sekvensidentiteten mellom de to sekvenser kun med henblikk på sekvensene som utgjør CDR'ene.

Uttrykket "PlGF" benyttes her for å henvise til den placentale vekstfaktor. PlGF er funnet å inntre hovedsakelig i to spleisevarianter eller isoformer, PlGF-1 på 149 aminosyrer og PlGF-2 på 170 aminosyrer omfattende 21 aminosyreinnskudd i karboksyterminalområdet, men også andre isoformer er funnet.

Uttrykket "inhibitorisk" benyttes når det henvises til et antistoff mot PlGF eller et fragment eller derivat derav, for å indikere at antistoffet, fragmentet eller derivatet er i stand til å inhibere bindingen av PlGF til sin reseptor Flt-1.

Foreliggende oppfinnelse skal beskrives under henvisning til visse utførelsesformer og til visse figurer, men oppfinnelsen er begrenset kun av de vedlagte krav.

Foreliggende oppfinnelse angår antigenbindende molekyler og særlig monoklonale antistoffer, fragmenter eller derivater derav, og som binder til den samme epitop av PlGF som antistoffet som her angis som antistoffet 16D3. "Antistoff 16D3", produsert av cellelinjen LMBP 6399CB, ble konstruert mot PlGF av human opprinnelse, og binder human PlGF (begge isoformer PlGF-1 og PlGF-2). Antistoff 16D3 inhiberer bindingen av human PlGF til sin reseptor-flt-1 og inhiberer PlGF-aktiviteten.16D3-antistoffet per se og fragmenter eller derivater derav så vel som nukleotidsekvenser som koder antistoffet, fragmentene eller derivatene derav, kan således benyttes for inhiberingen av PlGF både i en terapeutisk kontekst og i en dyremodell for testings- eller screeningsformål. Alternativt kan antistoffet benyttes for detektering og/eller kvantifisering av PlGF enten in vivo, ex vivo eller in vitro. Således tilveiebringer foreliggende oppfinnelse forskjellige anvendelser for de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen og nukleotidsekvensene som koder dem. Oppfinnelsen angår videre metoder for fremstilling av de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen og cellelinjer i stand til å produsere disse antigenbindende molekyler.

Et første aspekt ved oppfinnelsen angår cellelinjer som produserer de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen, mer spesielt cellelinjer som produserer monoklonale antistoffer som er i stand til å binde til det samme antigen som 16D3 eller fragmenter eller derivater derav. En spesiell utførelsesform av dette aspekt ved oppfinnelsen er hybridomcellelinjen også angitt som "cellelinje 16D3" som produserer det monoklonale antistoff 16D3 og som ble deponert ved BCCM/LMBP (Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms/Plasmid Collection Laboratorium voor Moleculaire Biologie), University of Ghent K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent, BE av Thromb-X 29. mars 2005 under deponeringsnummeret LMBP 6399CB. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre cellelinjer som produserer monoklonale antistoffer avledet fra monoklonalt antistoff 16D3. Slike cellelinjer kan oppnås ved modifisering av den kodende sekvens for monoklonalt antistoff 16D3 og mest spesielt den kodende sekvens som koder de ikke-antigenbindende områder av 16D3. Metoder for å bestemme arten av modifikasjonene som skal foretas samt eksempler på egnede modifikasjoner, er beskrevet her.

Det er beskrevet antigenbindende molekyler i stand til å binde til det samme antigen som antistoff 16D3. Mer spesielt angår oppfinnelsen antistoffet kalt 16D3 som er produsert av cellelinjen 16D3 som beskrevet ovenfor, og homologer, fragmenter og derivater derav som er i stand til å binde PlGF og inhibere PlGF-aktivitet.

Således tilveiebringer en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen det anti-humane PlGF antistoffmonoklonale antistoff 16D3 som produsert av cellelinje LMBP 6399BC, og fragmenter av dette antistoff. Monoklonalt antistoff 16D3 karakteriseres ved aminosyresekvensen til de variable områder av sine tunge og lette kjeder som beskrevet i SEQ ID NR.: 2, henholdsvis SEQ ID NR.: 4.

I henhold til en spesifikk utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse antigenbindende fragmenter av antistoff 16D3. Slike fragmenter inkluderer, men er ikke begrenset til, Fab, Fab', F(ab')2, CDR'er, peptider med en sekvens av en del av antistoffet eller dens CDR'er, enkle variable domener og kombinasjoner av disse. Fab-, Fab'- og F(ab')2-fragmenter kan genereres ved proteolytisk digestering av monoklonale antistoffer ved bruk av metoder som er velkjent i teknikken og som er beskrevet av Stanworth et al., Handbook of Experimental Immunology (1978), bind 1, kapittel 8 (Blackwell Scientific Publications). Slike fragmenter som bibeholder evnen til å binde antigenet, har mistet et antall av egenskaper fra opphavsantistoffet, for eksempel som komplementaktivering eller evnen til å binde til Fcγ-reseptorer. Mer spesielt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fragmenter som omfatter de variable områder av de tunge og lette kjeder av 16D3 tilsvarende SEQ ID NR.: 2, henholdsvis SEQ ID NR.: 4. En fremlagt ytterligere spesiell utførelsesform angår fragmenter omfattende de komplementaritetsbestemmende områder (CDR'er) av 16D3 og derivater derav. De to som oftest fulgte metoder for å identifisere CDR'er er IMGT og KABAT, og fragmenter omfattende mer enn en av hver type CDR av 16D3 er omfattet innenfor oppfinnelsens kontekst så vel som derivater av 16D3 som omfatter disse fragmenter eller CDR'er. I henhold til IMGT-identifisering av CDR'er tilsvarer CDR-områdene innen de variable regioner av 16D3 SEQ ID NR.: 17 (GYTFT-DYY), SEQ ID NR.: 18 (IYPGSGNT); SEQ ID NR.: 19 (VRDSPFFDY), SEQ ID NR.: 20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID NR.: 21 (WAS) og SEQ ID NR.: 22 (KQSYHLFT). Det er tilveiebrakt fragmenter av antistoff 16D3 omfattende en eller flere av CDR'ene av 16D3 som tilveiebrakt i SEQ ID NR.: 17 til SEQ ID NR.: 22.

En ytterligere spesifikk utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringer fragmenter av 16D3 som er oppløselige eller membranforankrede enkelkjedevariable deler av 16D3. Et enkeltkjedevariabelt fragment (scFv) er et genetisk konstruert antistoffragment som vanligvis består av den variable tunge kjede (VH) og lette kjede (VL) av et immunoglobulin eller deler derav, forent ved en fleksibel peptidlinker. Eventuelt omfatter scFv'er CDR-områdene av antistoffet av interesse og rammeverksområdene for et annet antistoff. Aminosyresekvensen for scFv-rammeverket og/eller CDR-områdene er eventuelt humanisert for å redusere antigenisiteten for bruk som farmasøytikum i mennesker. Oppfinnelsen tilveiebringer en scFv av 16D3 og en humanisert versjon derav omfattende SEQ ID NR.: 24, henholdsvis SEQ ID NR.: 26. Metoder for å oppnå enkeltkjedevariable deler av antistoffer er velkjente for fagfolk og er beskrevet i eksempel 6. For eksempel kan metoden inkludere forsterkning av DNA-sekvensene av de variable områder av humane tunge og lette kjeder i separerte reaksjoner og kloning fulgt av innskyting av en femten-aminosyrelinkersekvens, for eksempel (Gly4Ser)3, mellom VH og VL ved hjelp av en totrinns polymerasekjedereaksjon (PCR) (se for eksempel Dieffenbach and Dreksler, "PCR Primer, a laboratory manual" (1995), Cold Spring Harbour Press, Plainview, NY, USA). Det resulterende fragment kan så skytes inn i en egnet vektor for ekspresjon av enkeltkjedevariabelt fragment som oppløselig eller fagvist polypeptid. Dette kan oppnås på i og for seg kjent måte som beskrevet av Gilliland et al., Tissue Antigens (1996) 47:1-20.

I henhold til en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen derivater av 16D3 eller fragmenter derav som er humanisert. Slike humaniserte derivater av 16D3 er homologe på den måten at de bibeholder sin bindingsaffinitet for PlGF. I henhold til en spesiell utførelsesform bibeholder de humaniserte derivater av 16D3 også evnen til å inhibere PlGF-aktivitet. Humaniseringen av ikkehumane antistoffer oppnås ved erstatning av en eller flere aminosyrer i antistoffets skjelett, det vil si de aminosyrer som ikke er involvert i bindingen av antistoffet til antigenet, for derved å likne mer på skjelettet for et humanantistoff. Forskjellige typer eller nivåer av humanisering er vurdert. Spesielle utførelsesformer av oppfinnelsen angår antistoffer eller fragmenter hvor hele områder, mer spesielt ett eller flere konstante områder av det ikke-humane antistoff eller fragment er erstattet med det eller de konstante områder av et humanantistoff for å gi kimeriske (for eksempel humane/murine) antistoffer eller fragmenter. Ytterligere spesielle utførelsesformer er antistoffer der antigenbindingsaminosyrene (for eksempel to eller flere CDR'er) av det ikke-humane antistoff mot PlGF innføres i skjelettet av et humanantistoff (for eksempel CDR-podede antistoffer). Metoder for assosiering av det bindingskomplementaritetsbestemmende området ("CDR") fra det ikke-humane, monoklonale antistoff med humanrammeverksområder, særlig det konstante C-område av det humane gen, er velkjent for fagmannen som beskrevet for eksempel av Jones et al. i Nature (1986) 321:522 eller Riechmann i Nature (1988) 332:323. Alternativ erstatning av et mer begrenset antall aminosyrer av de ikke-humane anti-PlGF-antistoffer ifølge oppfinnelsen er også omfattet. Spesielle utførelsesformer av oppfinnelsen angår antistoffer omfattende humaniserte, variable tung- og/eller lettkjedeområder av figur 9 eller deler derav og antistoffer omfattende minst to og spesielt tre til fem, mest spesielt alle seks CDR'er i SEQ ID NR.: 17 til SEQ ID NR.: 22. Ytterligere utførelsesformer ifølge oppfinnelsen angår humaniserte antistoffer omfattende variable tung- og/eller lettkjedeområder med minst 80 %, spesielt minst 85 %, mer spesielt minst 90 %, mest spesielt minst 95 % sekvensidentitet med SEQ ID NR.: 6, henholdsvis SEQ ID NR.: 8. Alternativt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse humaniserte antistoffer omfattende minst to, mer spesielt tre til fem og spesielt seks CDR'er med minst 80 %, spesielt minst 85 %, mer spesielt minst 90 %, mest spesielt minst 95 % sekvensidentitet med SEQ ID NR.: 17 til 22.

Foreliggende oppfinnelse angår således humaniserte og/eller kimere eller hybride antistoffer avledet fra det murine antistoff 16D3. I en spesiell utførelsesform er spesifikke aminosyrer fra det murine antistoff 16D3 mutert for å eliminere immunogeniske aminosyrer. I en spesiell utførelsesform angår derfor foreliggende oppfinnelse antigenbindende molekyler omfattende en tungkjedevariabel del aminosyresekvens i henhold til SEQ ID NR.: 2 der en eller flere av de følgende aminosyrer er forandret: 12V, P9A, K40A og/eller T111L. I tillegg eller alternativt er de humaniserte antistoffer som avledes fra antistoff 16D3 antigenbindende molekyler omfattende en lettkjedevariabel del aminosyresekvens i henhold til SEQ ID NR.: 4 der en eller flere av de følgende aminosyrer er forandret: S5T, S9D, A15L, K18R, R22N og/eller L89V. I henhold til en spesiell utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen derfor antigenbindende molekyler omfattende både en tungkjedevariabel aminosyresekvens i henhold til SEQ ID NR.: 2 der en eller flere av de følgende aminosyrer er forandret: 12V, P9A, K40A og/eller T111L og en lettkjedevariabel aminosyresekvens ifølge SEQ ID NR.: 4 der en eller flere av de følgende aminosyrer er forandret: S5T, S9D, A15L, K18R, R22N og/eller L89V.

I nok en utførelsesform er antistoffet ytterligere humanisert dit hen at de (humaniserte) variable lettog/eller tungkjeder av det murine antistoff 16D3 er podet i en human immuno-globulinramme eller er koblet til det konstante området av et humanantistoff, mer spesielt til et human-IgG-konstantområde. Særlig egnet i denne forbindelse er IgG1κ som er i stand til aktivering av naturlige dreperceller, NKC, i kroppen. I en spesiell utførelsesform angår oppfinnelsen således en hybrid Hu16D3-IgG1κ. En alternativ utførelsesform av oppfinnelsen er et hybrid Hu16D3-IgG4κ. Human-IgG-antistoffer (og således også hybridantistoffer som oppnås ved bruk av human-IgG-ryggradog/eller konstantområder) viser en forlenget halveringstid og gir således meget stabile plasmanivåer og tillater en drastisk reduksjon av administreringsfrekvensen. Videre medfører bruken av humaniserte antistoffer eller derivater en minimal risiko for å indusere immunresponser.

Nok et aspekt ved oppfinnelsen angår å tilveiebringe nukleotidsekvenser som koder de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen, og mest spesielt de antigenbindende områder derav. Spesielle utførelsesformer av oppfinnelsen angår nukleotidsekvensene som koder det variable tungkjedeområde og det lettkjedevariable område som definert ved SEQ ID NR.: 2, henholdsvis SEQ ID NR.: 4 som, men ikke begrenset til, nukleotidsekvensene ifølge SEQ ID NR.: 1 og SEQ ID NR.: 3, tilsvarende sekvensene av cellelinje 16D3 som koder tung- og lettkjedeområdet av antistoff 16D3. Videre tilveiebringes det nukleotidsekvenser som koder ett eller flere av CDR-områdene av monoklonalt antistoff 16D3 som identifisert i SEQ ID NR.: 17 til 22. Spesielle utførelsesformer av oppfinnelsen inkluderer sekvensen som koder scFv'er og humaniserte scFv'er av 16D3 slik som SEQ ID NR.: 23 og SEQ ID NR.: 25.

Foreliggende fremleggelse inkluderer også nukleotidsekvenser som er komplementære til sekvensene som koder de monoklonale antistoffer, fragmenter eller derivater derav som beskrevet her.

Ytterligere et aspekt ved oppfinnelsen angår den terapeutiske anvendelse av de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen. Oppfinnelsen tilveiebringer således anvendelsen av de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen som et medikament. I denne forbindelse tilveiebringer oppfinnelsen farmasøytiske preparater omfattende ett eller flere av de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen for prevensjon eller terapi av sykdommer eller forstyrrelser der angiogenese bidrar til sykdommens eller forstyrrelsens patologi. I henhold til dette omfatter metoder for terapi og/eller prevensjon av sykdommer der angiogenese bidrar til sykdommens eller forstyrrelsens patologi administrering til et pattedyr som trenger slik terapi eller prevensjon, av en terapeutisk effektiv mengde av et preparat omfattende ett eller flere antigenbindende molekyler som beskrevet her.

I slike sykdommer blir angiogenese også angitt som "patologisk angiogenese". Eksempler på slik patologisk angiogenese inkluderer angiogenesen som observeres ved patologi i blodkar (aterosklerose, hemangiom, hemangioendoteliom), i bein og ledd (reumatoid artritt, synovitt, bein- og bruskdestruering, osteomyelitt, pannusvekst, osteofyttdannelse, neoplasmer og metastase), i huden (vorter, pyogeniske granulomaer, hårvekst, Kaposis sarkom, arrkeloider, allergisk ødem, neoplasmer), i lever, nyre, lunge, øre og andre epiteler (inflammatoriske og infeksiøse prosesser inkludert hepatitt, glomerulonefritt, pneumonia, astma, nasalpolypper, otititt og transplantasjon, regenerering, neoplasmer og metastase i disse organer), i visse patologier i uterus, ovarie og placenta (dysfunksjonell uterinblødning for eksempel på grunn av intra-uterinkontraseptive innretninger, follikulær cystedannelse, ovariehyperstimuleringssyndrom, endometriose, neoplasmer), patologier i hjerne eller nerver (neoplasmer og metastaser), visse hjerte- og skjelettmuskelfenomener (for eksempel på grunn av arbeidsoverbelastning, patologiske tilstander av adiposevev (obesitet) og endokrine organer (tyroiditt, tyroidforstyrrelse, pankreastransplantering). Patologisk angiogenese kan også bidra til sykdommer av hematopoiese (AIDS, Kaposi), hematologiske malignanser (leukemier,etc.).

I et antall sykdommer i øyet er patologisk angiogenese antatt å være en viktig faktor, og følgelig er behandling med de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen omfattet. I de "retinale ischemiske sykdommer" blir retinas blod- og oksygentilførsel redusert, de perifere deler av retina mister sin næringskilde og opphører å virke riktig. Vanlige årsaker for retinopati er sentral retinal veneokklusjon, stenose i karotidarterien, diabetes (diabetisk retinopati) og anemi (sigdcelleretinopati). Retinopati observeres også hos premature spedbarn (prematuritetsretinopati). Diabetisk retinopati er en hovedårsak for visuelt tap hos diabetiske pasienter. I den ischemiske retina inntrer vekst av nye blodkar (neovaskularisering). Disse kar vokser ofte på overflaten av retina, på den optiske nerve, eller i fronten av øyet på iris. De nye kar kan ikke erstatte en strøm av nødvendig næring, men kan i stedet forårsake mange problemer som vitrøs hemoragi, retinal løsning og ikkekontrollert glaukom. Disse problemer inntrer fordi nye kar er skjøre og har en tendens til å blø. Hvis de fanges opp i de tidlige trinn kan proliferativ diabetisk retinopati noen ganger stanses med panretinal fotokoagulering. I enkelte tilfeller er imidlertid vitrektomikirurgi den eneste mulighet. Andre sykdommer i øyet der angiogenese antas å spille en kritisk rolle, er koroidale og andre intraokkulære forstyrrelser, leukomalaci og neoplasmer og metastase. Koroidal neovaskularisering er veksten av nye blodkar som stammer fra koroiden via et brudd i Bruch-membranen inn i den subretinale pigmentepitel (sub-RPE) eller det subretinale rom. Lokasjonen, vekstmønsteret og type (1 eller 2) av CNV avhenger av pasientens alder og den underliggende sykdom. Blødning og eksudering inntrer med ytterligere vekst og står for de visuelle symptomer. Koroidal neovaskularisering (CNV) er en hovedårsak for visuelt tap. CNV er estimert å inntre i 5-10 % av myoper og inntrer i så å si alle koroidale brudd under helingsfasen; ofte ikke for alvorlig spontant, men i 15-30 % av pasientene kan CNV komme tilbake og føre til hemorragi eller alvorlig makulær løsgjøring med samtidig visuelt tap.

Uttrykket "pulmonær hypertensjon" henviser til en forstyrrelse der blodtrykket i de pulmonære arterier er unormalt høyt. I fravær av andre sykdommer i hjertet eller lunger kalles dette primær pulmonær hypertensjon. Diffus innsnevring av pulmonærarteriolene inntrer som et resultat av patologisk arteriogenese fulgt av pulmonær hypertensjon som en respons på den økede resistens mot blodstrøm. Forekomsten er 8 av 100000 personer. Imidlertid kan pulmonær hypertensjon også inntre som en komplikasjon i forbindelse med kronisk obstruktiv pulmonær sykdom, (COPD) som emfysem, kronisk bronkitt eller diffus interstitial fibrose og hos pasienter med astmaiform COPD. Forekomsten av COPD er rundt 5 av 10000 personer.

Et ytterligere eksempel på en sykdom der angiogenese bidrar til sykdommens patologi og er omfattet for behandling med de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen, er gruppen inflammatoriske forstyrrelser. "Inflammasjon" som benyttet her betyr den lokale, ikke-kontrollerte reaksjon mot skade (det vil si fysisk, kjemisk eller som et resultat av infeksjon) i levende vev, særlig den lokale reaksjon av de små blodkar, deres innhold og deres assosierte strukturer. Passasjen av blodbestanddeler gjennom karveggene inn i vevet er "varemerket" på inflammasjon, og vevsamlingen som dannes på denne måte, er angitt som eksudat eller ødem. Enhver noksiøs prosess som skader levende vev slik som, men ikke begrenset til, infeksjon med bakterier, for høy varme, kulde, mekanisk skade som knusing, syrer, alkali, stråling eller infeksjon med viruser, kan forårsake inflammasjon uansett det organ eller det vev som er involvert. Slike "inflammatoriske sykdommer" inkluderer reaksjoner som ligger fra brannsår til lungebetennelse, leprosi, tuberkulose og reumatoid artritt.

Postoperativ adhesjonsdannelse (POA), er en hyppig kirurgisk komplikasjon ved gynekologisk, pelvisk og kardiologisk kirurgi. Kirurgisk trauma hos vev forårsaker ofte permanent arrdannelse som forbinder det traumatiske vev med et annet organ. Ved skadesetet for slik skade blir indre vev som normalt er separat, ofte forent. Komplikasjoner som skyldes adhesjonsdannelse er intestinalobstruksjon, tynntarmobstruksjon, kronisk pelvisk smerte og infertilitet hos kvinner. Uttrykket "adhesjonsdannelse" henviser i medisinsk henseende til konglutinering, prosessen for adhering eller forening av to overflater eller deler, for eksempel foreningen av de motsatte overflater av et sår eller motsatte overflater av peritoneum. Videre kan adhesjoner i flertall henvise til inflammatoriske bånd som forbinder mot hverandre stående serøse overflater. Uttrykket adhesjon, slik det her benyttes, inkluderer også fibrinøse adhesjoner som er adhesjoner som består av fine tråder av fibrin som stammer fra et eksudat av plasma eller lymfe, eller en ekstravasjon av blod. Keloid, en glatt overvekt av fibroblastisk vev, som oppstår i et område med skade eller leilighetsvis også spontant, er også en form for adhesjon. Det er påvist at inhibering av placentavekstfaktor (PlGF) føret til en bemerkelsesverdig undertrykkelse av postoperativ adhesjonsdannelse (WO03/063904).

Det er videre påvist at sykdommer som karakteriseres ved beinresorpsjon som, men ikke begrenset til, osteoporose, kan trekke fordel av inhibering av PlGF (WO04/002524).

Således er i henhold til en spesifikk utførelse de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen spesielt egnet for behandling og/eller prevensjon av tumorvekst og metastase, sykdommer i øyet, inflammasjon, adhesjonsdannelse og pulmonær hypertensjon.

En ytterligere spesiell utførelsesform av oppfinnelsen angår bruken av de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen for prevensjon og/eller terapi av cancer, som, men ikke begrenset til, cancer i bryst, lunge, prostata, hjerne, lever, pankreas, kolon, nyre, uterus eller beinmarg. Mer spesielt angår oppfinnelsen anvendelsen av de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen for prevensjon og/eller terapi av faste tumorer som, men ikke begrenset til, koloncancer, brystcancer, pankreatisk cancer og melanomer. Mer spesielt tilveiebringes det her data som viser at antistoffene ifølge oppfinnelsen er spesielt egnet for å oppnå regresjon av humanpankreatiske tumorer. Antistoffene ifølge oppfinnelsen er påvist signifikant å redusere tumorstørrelse in vivo hvorved reduksjoner i størrelsesorden opptil 50 % påvises. Således tilveiebringer foreliggende fremleggelse metoder og farmasøytiske preparater for å redusere tumorstørrelse med minst 20 %, mer spesielt minst 30 % og helst minst 50 %.

En ytterligere spesiell utførelsesform av oppfinnelsen angår anvendelsen av de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen ved terapi eller prevensjon av beinforstyrrelser og mer spesifikt for terapi av tilstander der det er en økt beinresorpsjon som for eksempel osteoporose eller osteomalaki.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse anvendelsen av de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for terapi av de ovenfor nevnte sykdommer.

Et viktig aspekt ved fremleggelsen er at antistoffene, fragmentene og derivatene derav tillater terapi og/eller prevensjon av de ovenfor nevnte sykdommer uten bivirkninger som skyldes eller forventes med andre antiangiogeniske behandlinger, og mer spesielt alternative behandlinger som tar sikte på angiogeniske faktorer som VEGF. Prekliniske sikkerhetsprøver med rekombinant humane anti-VEGF-antistoffer viste så tidlig som i 1999 at inhibering av VEGF resulterte i inhibering av fysiologisk angiogenese og mer spesielt neovaskularisering i longitudinal beinvekst og corpora luteadannelse (Ryan et al., 1999) Toxicologic pathology 27(1):78-86). Nylige studier beskriver at VEGF-inhibitorer forårsaker regresjon av kar i friske trakea- og tyroidkjertler, noe som kan føre til organdysfunksjon (Baffert et al, 2004, Circ Res 94:984-992; Inai et al., 2004 Am J Pathol 165:35-52). Uansett er bevacizumab, et antihuman VEGF-antistoff, i dag på markedet som suppressor av angiogenese på tross av de observerte effekter ved sårheling, blodtrykk og tromboserisiko, på grunn av den totale effektivitet på denne antiangiogeniske tilnærmelse for tumorregresjon. Anti-PlGF-antistoffene og derivatene ifølge oppfinnelsen tillater inhibering av uønsket angiogenese uten disse observerte bivirkninger på blodtrykk, sårheling, tromboserisiko og karregresjon i friske organer.

En spesiell utførelsesform av oppfinnelsen angår farmasøytiske preparater som, som aktiv bestanddel, omfatter det monoklonale antistoff 16D3 eller et fragment eller derivat derav, i blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer. Det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen omfatter en terapeutisk effektiv mengde av ett eller flere av de antigenbindende molekyler. Tilsvarende tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for terapi og/eller prevensjon omfattende administrering av en terapeutisk effektiv mengde av ett eller flere av de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen.

En terapeutisk effektiv mengde slik uttrykket her benyttes betyr en mengde innen området rundt 0,5 til rundt 50 mg/kg kroppsvekt, mer spesielt fra 1 til rundt 10 mg/kg kroppsvekt av pattedyret som behandles. Det vil erkjennes at, i lys av den lange halveringstid for de fleste IgG-humanantistoffer, vil de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen som er monoklonale antistoffer i denne klasse, nyte godt av denne behandlingsperiodisitet som gir behag for pasienten.

I henhold til nok et aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes det farmasøytiske preparater som omfatter de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen, og et annet antiangiogenisk middel, så vel som metoder for behandling som gir en samtidig eller sekvensiell administrering av de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen, og et annet antiangiogenisk middel. Således viser foreliggende oppfinnelse en additiv effekt for antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen og andre antiangiogeniske midler, for eksempel som anti-VEGF-antistoffer ved inhibering av tumorvekst. Mer spesielt påvises det at den kombinerte bruk av 16D3-antistoffet ifølge oppfinnelsen og Avastin® er i stand til å redusere tumorstørrelsen med opptil 70 % mens økte doser av enten Avastin® alene eller anti-PlGF-antistoffet ikke når noen tumorstørrelsesreduksjon på mer enn 55 % under de samme betingelser. Egnede andre anti-angiogeniske produkter så vel som deres vanlige dosering avhengig av den klasse de hører til, er velkjent for fagfolk. Eksempler på antiangiogeniske midler inkluderer inhibitorer av VEGF som virker direkte på VEGF, for eksempel som antistoffet rettet mot VEGF, kommersialisert under navnet Avastin<TM>, eller som virker på VEGF-reseptorene. Antistoffene ifølge oppfinnelsen gjør det mulig å redusere doseringen av for eksempel VEGF-inhiberende, antiangiogeniske midler, kjent for å indusere et antall bivirkninger som beskrevet ovenfor.

De farmasøytiske preparater kan videre omfatte en terapeutisk effektiv mengde av andre forbindelser/medikamenter som er aktive mot sykdommen som behandles og mer spesielt andre forbindelser/medikamenter som er nyttige ved behandling av tumorvekst, inflammasjon, sykdommer i øyet og pulmonær hypertensjon.

Egnede farmasøytiske bærere for bruk i de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen er for eksempel beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utgave (1980), og deres formulering er velkjent for fagfolk. De inkluderer ethvert og alle oppløsningsmidler, dispergeringsmedier, belegg, antibakterielle og antifungale midler (for eksempel fenol, sorbinsyre, klorbutanol), isotoniske midler (som sukkere eller natriumklorid) og liknende. Ytterligere bestanddel kan inkluderes for å kontrollere varigheten for virkningen av det monoklonale antistoff som aktiv bestanddel i preparatet. Kontrollfrigivningspreparater kan så oppnås ved å velge egnede polymerbærere som for eksempel polyetere, polyaminosyrer, polyvinylpyrrolidon, etylenvinylacetatkopolymerer, metylcellulose, karboksymetylcellulose, protaminsulfat og liknende. Frigivningshastigheten og virkningsvarigheten kan også kontrolleres ved å innarbeide den aktive monoklonale antistoffbestanddel i partikler som mikrokapsler av et polymermateriale som hydrogeler, polymelkesyre, hydroksymetylcellulose, polymetylmetakrylat og de ovenfor beskrevne polymerer. Slike metoder inkluderer kolloidmedikamentavleveringssystemer som liposomer, mikrosfærer, mikroemulsjoner, nanopartikler, nanokapsler og så videre. Avhengig av administreringsvei kan det farmasøytiske preparat omfattende den aktive bestanddel kreve beskyttende belegg. Den farmasøytiske form som er egnet for injeksjonsanvendelse, inkluderer sterile vandige oppløsninger eller dispersjoner og sterile pulvere for ekstemporan fremstilling derav. Typiske bærere inkluderer derfor biokompatible, vandige buffere, etanol, glyserol, propylenglykol, polyetylenglykol og blandinger derav.

De antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen kan gis til en pasient på en hvilken som helst i og for seg kjent måte, det vil si oralt, intranasalt, subkutant, intramuskulært, intradermalt, intravenøst, intraarterielt, parenteralt eller ved kateterisering.

I henhold til et spesielt aspekt blir de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen administrert ved genterapi. Antistoffbasert genterapi gjør det mulig å overvinne et antall potensielle begrensinger forbundet med administrering av antistoffer som storskalaproduksjon, biofordeling, hurtig blodklaring og dårlig retensjon av monovalente antistoffer. In vivo produksjon gjør antistoffene mindre immunogeniske og bedre tolerert og resulterer i effektive og vedvarende nivåer av antigenbindende molekyler eller fragmenter derav. Videre gjør genetiske veier det mulig å tilveiebringe antigenbindende molekyler med nye funksjoner. Brukbarheten av in vivo produksjon og systemisk avlevering av monoklonale antistoffer via forskjellige celler/vev er påvist ved bruk av in vivo genoverføring ved hjelp av virale vektorer (Pelegrin et al., 2004, Gene Ther 4:347-356). Reduksjonen av tumorvekst in vitro og in vivo på grunn av genmodifisering av fibrosarkomceller med et antilamininantistoff med antiangiogenisk aktivitet er også påvist (Sanz et al.2001, Cancer Immunol Immunother 50:557-565).

Det er således tilveiebrakt nukleotider som koder de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen for bruk i genterapi ved terapi av sykdommer som karakteriseres ved den her beskrevne, patologiske angiogenese. Særlig tilveiebringer oppfinnelsen preparater omfattende nukleotidsekvensene som koder det variable tungkjedeområde definert ved SEQ ID NR.: 2, og/eller nukleotidsekvenser som koder det lettkjedevariable område definert ved SEQ ID NR.: 4, for bruk i genterapi. Mer spesielt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse preparater omfattende nukleotidsekvensen SEQ ID NR.: 1 og/eller SEQ ID NR.: 3, tilsvarende sekvensene av cellelinje 16D3 som koder tung- og lettkjedeområdet av antistoff 16D3.

Fremgangsmåten for terapi og/eller prevensjon ifølge oppfinnelsen kan inkludere ytterligere terapi eller prevensjon av den samme, patologiske angiogenesetilstand ved administrering, fortrinnsvis sekvensiell administrering, til pasienten av en terapeutisk effektiv mengde av et antiangiogenisk eller et antitumormiddel som beskrevet ovenfor under headingen av farmasøytiske preparater. Sekvensielt, som benyttet her, betyr at liganden ifølge oppfinnelsen og det kjente, antiangiogeniske middel administreres til pasienten sekvensielt, men ikke samtidig.

Nok et aspekt ved oppfinnelsen angår bruken av de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen for immunologisk detektering av PlGF i humanprøver og som komponenter for sett som er egnet for slik detektering. Metoder for immunologisk detektering av et antigen er velkjent i teknikken og inkluderer, men er ikke begrenset til, EIA, ELISA og RIA samt immunohistokjemiske metoder. Bindingen av de murine antistoffer ifølge oppfinnelsen til PlGF-antigenet kan detekteres indirekte eller ved hjelp av et merket antimuse-antistoff. Alternativt kan antistoffene eller fragmentene derav merkes direkte. En spesifikk utførelsesform av dette aspekt ved oppfinnelsen angår bruken av antistoffer mot PlGF og antigenbindende fragmenter derav ved identifisering av pasienter som er mottakelige for behandling med anti-PlGF. Dette er av spesiell interesse ved behandling av cancer.

Nok et aspekt ved oppfinnelsen angår bruken av de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen som et diagnostisk verktøy. Det er påvist i teknikken at i et antall patologiske tilstander er PlGF-ekspresjonen oppregulert. Mer spesielt er et antall tumorer påvist å overuttrykke PlGF. De humaniserte antistoffer eller antistoffragmenter ifølge oppfinnelsen kan benyttes i diagnose av disse patologiske tilstander, for eksempel ved billedteknikker der antistoffene eller de antigenbindende fragmenter ifølge oppfinnelsen merkes og visualiseres in vivo. Et antall merkelapper for avbildning av bindingen av antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen in vivo er velkjente på områder og inkluderer, men er ikke begrenset til, optiske (for eksempel fluorescente), metall- og magnetiske merkelapper, der hver krever spesifikke (strålings- og) detekteringsinnretninger. En spesiell utførelsesform av dette aspekt ved oppfinnelsen angår bruken av antistoffer ifølge oppfinnelsen for å prediktere prognose av sykdommen og å bestemme behandlingsregimer.

Nok et aspekt ved oppfinnelsen angår bruken av de antigenbindende molekyler ifølge oppfinnelsen i ikke-humane dyremodeller ved avsøking av forbindelser for bruk i kombinasjon med anti-PlGF-terapi. Slike modeller inkluderer, men er ikke begrenset til, tumormodeller hvorved vekst og utvikling av humantumorceller i nu/nu-mus undersøkes. Kombinert administrering av forbindelsen for testing og antistoffet eller fragmentet ifølge oppfinnelsen gjør det mulig å identifisere hvorvidt forbindelsen har en additiv effektiv til den effekt som observeres ved administrering av antistoffene eller fragmentene av oppfinnelsen alene. Andre aspekter som motvirkende effektivitet eller toksisitet for en forbindelse i kombinasjon med et anti-PlGF-antistoff, kan også bestemmes på denne måte.

Ved siden av den terapeutiske applikasjon som beskrevet ovenfor, er nukleotidsekvensene ifølge oppfinnelsen som beskrevet ovenfor, nyttige ved produksjon av antistoffer og andre antigenbin dende fragmenter, for eksempel ved rekombinante metoder. Det er videre tilveiebrakt metoder for å produsere rekombinante antistoffer og antistoffragmenter inkludert kloning og manipulering av antistoffgener, produksjon av scFv og andre antigenbindende fragmenter ved bruk av de her beskrevne nukleotidsekvenser. Protokollen for disse metoder er tilgjengelige på området. I tillegg kan probene som spesifikt hybriderer til nukleotidsekvensene ifølge oppfinnelsen, benyttes for avsøking for ekspresjon av antistoffene og antistoffragmenter ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse skal beskrives nærmere ved hjelp av de følgende eksempler som kun er gitt for illustrasjonsformål.

Eksempler

Eksempel 1 – Fremstilling og karakterisering av murine anti-humane PlGF antistoffer (16D3) 1. Immunisering av mus og fusjon

Monoklonale antistoffer mot human PlGF ble produsert i det vesentlige som beskrevet av Galfrè og Milstein (Galfrè F, Milstein C. Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. Method Enzymol 1981; 73:3-46). Kort sagt blir PlGF-knockout-mus (Luttun et al., 2002, Biochem Biophys Res Comm 295(2):428-34, Carmeliet et al. (2001), Nat Med 7:575-593 eller WO01/85796) immunisert ved subkutan injeksjon av 50 µg rekombinant human PlGF-2 (fremstilt i Pichia) i Freunds komplette adjuvant, fulgt to uker senere av subkutan injeksjon med 50 µg rekombinant human PlGF i ufullstendig Freunds adjuvant. Blodprøver på rundt 100 µl ble samlet fra musenes haler etter 10 dager. Seraene ble testet for anti-huPlGF-antistoffer ved ELISA ved bruk av mikrotiterplater belagt med human-PlGF som fanger, applikering av fortynnet sera (fra 1:500 til 1:8000) og pepperrotperoksidase-(HRP-)konjugert geiteantimuse-IgG for merking.

Etter et intervall på minst 6 uker ble musene (med høy positiv respons) boosted intraperitonealt med 50 µg rekombinant human-PlGF i saltoppløsning på dagene 4 og 2 før cellefusjon.

Miltceller ble isolert og fusert med Sp2/0-Ag14 myelomaceller. Etter seleksjon i hypoksantin, aminopterin, tymidinmedium ble positive kloner valgt ved applikering av kultursupernatanter i ELI-SA som beskrevet ovenfor.

2. Rensing av antistoffer på ProSep vA Ultra

Antistoffer ble renset fra cellekultursupernatant ved affinitetskromatografi på ProSep vA Ultra (Millipore) i henhold til produsentens protokoll. Kort sagt ble 150 mM NaCl satt til supernatanten og denne ble lastet på en ProSep vA Ultra kolonne som var pre-ekvilibrert med PBS. Kolonnen ble vasket med PBS og bundet protein eluert med 0,1 M glycin pH 2,8. Eluert protein ble dialysert ON til PBS. Renheten for eluert protein ble kontrollert under reduserende og ikke-reduserende betingelser ved SDS-PAGE.

3. Binding av 16D3/hu16D3 (oppnådd som beskrevet i eksempel 2) til PlGF (se figur 1)

ELISA-plater ble belagt ON med 1 µg/ml huPlGF-2 (Pichia) i PBS, 100 µl/brønn, 4 °C. Etter blokkering med 1 % BSA, 1 time, RT, ble en fortynningsserie av 16D3/hu16D3 tilsatt, 100 µl/brønn, og antistoffet ble tillatt å binde i 1 time, ved RT. Bundet 16D3 ble detektert med geiteantihuman- eller geiteantimurin-IgG-HRP (Sigma), 100 µl/brønn, 1 time, ved RT. Analysen ble fremkalt med OPD.

4. Inhibering av PlGF binding til huFlt-1-reseptor (se figur 2)

ELISA-plater ble belagt ON med 1 µg/ml huFlt-1 (R&D Systems), 200 µl/brønn, ON, 4 °C. Etter blokkering med 1 % BSA, 1 time, RT, ble det tilsatt en fortynningsserie av 16D3/hu16D3, 100 µl/brønn og ytterligere 100 µl/brønn huPlGF-2 ble tilsatt. Etter 2 timers inkubering ved RT ble bundet PlGF detektert med geiteanti-huPlGF (R&D Systems), 180 µl/brønn, 1 time, romtemperatur, fulgt av en inkubering med RAG-HRP (DAKO), 1 time, RT. Analysen ble utviklet med OPD.

5. Ytterligere karakterisering av 16D3 og Fab 16D3 med Biacoreforsøk

● Inhibering: rhuPlGF-2 (Pichia, TX) ble immobilisert på en CM5-brikke ved bruk av EDC/NHS-kjemi (aminkoblingssett, Biacore), noe som ga 412 RU.16D3 ble injisert fulgt av rhuFlt-1/Fc Chimera (R&D Systems). Dette ble også gjennomført med buffer i stedet for museantistoffet. Disse ble også injisert over en negativ kontrollstrømningskanal, og disse verdier er allerede trukket fra. Analysen ble gjennomført i en fosfatbuffer ved pH 9,6.

Sammenliknet med maksimal binding av rhuFlt-1 til rhuPlGF-2 ble signalet av rhuFlt-1 redusert hvis først 16D3 eller 16D4Fab injiseres (figur 3).

6. Kloning og sekvensering av musevariable områder av 16D3

● mRNA isolering: mRNA av hybridomacellene av 16D3 ble isolert ved bruk av QuickPrep<TM>Micro mRNA Purification Kit (Amersham Biosciences). Denne mRNA ble benyttet for å fremstille cDNA ved bruk av First-Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences) med pd(N)6-primer tilgjengelig i dette sett.

● PCR: Sekvensene for de variable deler av den tunge og lette kjede ble funnet ved å foreta en PCR med en samling av primere: 8 primere som startet i ledersekvens og 2 i det konstante området av den tunge kjede, 11 primere som startet i ledersekvensen og 1 i det konstante området av den lette kjede.8 henholdsvis 11 PCR-reaksjoner med forskjellige kombinasjoner av primere ble gjennomført.

Primere benyttet for den tunge kjede av antistoffet 16D3:

MHVR35'-ATG GRA TGG AGC TGK ATC WTT HTC-3' (SEQ ID NR.: 9)

MHCR15'- CAS AYM CAG GGG CCA GTG GAT AGA C- 3' (SEQ ID NR.: 10)

Primere benyttet for den lette kjede for antistoff 16D3:

MKVR35'- ATG RAG TCA CAK ACY CAG GTC TTY RTA- 3' (SEQ ID NR.: 11)

MKCR15'- GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TGG- 3' (SEQ ID NR.: 12)

PCR oppsett: denaturering i 10 min. ved 94 °C, denaturering i 30 sekunder ved 94 °C, annelering i 30 sekunder ved 55 °C, forlengelse i 1 min. ved 72 °C, forlengelse i 5 min. ved 72 °C, antall cykler: 30.

Rikeligheten i sekvensen av SEQ ID NR.: 9 til 11 er antydet ved bruk av de konvensjonelle forkortelser R = A eller G, K = G eller T, W = A eller T, H = A eller C eller T, S = C eller G, Y = C eller T, M = A eller C.

● Kloning og sekvensering: PCR produktene ble lastet på en agarosegel, de riktige bånd valgt, renset (QIAquick<®>Gel Extraction kit, Qiagen GmbH) og klonet i pCR<®>4Blunt-TOPO<®>vektor supplert i Zero Blunt<®>TOPO<®>PCR Cloning Kit for sekvensering (Invitrogen<TM>life technologies). Plasmid DNA ble fremstilt ved bruk av High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche Diagnostics GmbH), og innskuddene ble sekvensert ved bruk av T7- og M13-reversprimere på ABI PRIS-M<TM>310 (PE Applied Biosystems).

● Nukleotid- og aminosyresekvensene for de variable områder av de tunge og lette kjeder i antistoff 16D3 er angitt i SEQ ID NR.: 1, 2, 3 og 4 (se figur 11).

Eksempel 2 – fremstilling og karakterisering av humaniserte anti-human PlGF antistoffer (16D3) 1. Konstruksjon av humanisert 16D3

Humanisering av de variable områder

● Mutasjoner: de følgende mutasjoner ble gjennomført for å humanisere de forskjellige deler av museantistoff 16D3:

Tung kjede: 12V

P9A

K40A

T111L

Lett kjede: S5T

S9D

A15L

K18R

R22N

L89V

● Mutasjonene ble foretatt ved å benytte QuickChange<®>Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene<®>).1 til 5 primere inneholdende mutasjonene kunne benyttes i 1 PCR. Etter at transformasjonskolonier var plukket, ble DNA sekvensert for å bestemme klonen med den mest poengterte mutasjon. Denne klon ble benyttet for å gjenta prosedyren inntil alle mutasjoner var til stede i sekvensen.

Forbindelse mellom variable områder til human-IgG-konstantområde

Ved å gjennomføre en PCR ble de humaniserte, variable deler av den tunge og lette kjede oppnådd hvortil de egnede restriksjonsseter ble tilsatt.

Primere for den variable del av den lette kjede:

Primer 1: 5'-CCACCGGT GAC ATT GTG CTG ACC CAG TCT CC-3' (SEQ ID NR.: 13) Primer 2: 5'-CACCGTACG TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC CGA G-3' (SEQ ID NR.: 14)

Primere for den variable del av den tunge kjede:

Primer 3: 5'-CAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT G-3' (SEQ ID NR.: 15)

Primer 4: 5'-GATGGGCCCTTGGTCGACGC TGA GGA GAC TGT GAG CAG GG-3' (SEQ ID NR.: 16)

PCR-oppsett: denaturering 5 min. og 94 °C, denaturering 30 sekunder ved 94 °C, annelering 30 sekunder ved 60 °C, forlengelse 30 sekunder ved 72 °C, forlengelse i 5 min. ved 72 °C, antall cykler 25.

PCR-produktene ble lastet på en agarosegel, båndene valgt og renset (QIAquick<®>Gel Extraction kit, Qiagen GmbH). PCR-produktet for den variable del av den tunge kjede av 16D3 ble digestert med SalI, vektoren pKANEO-MCS50-Hleu-var #24 inneholdende den fullstendige, konstante del av den tunge kjede av et humanantistoff (IgG4), med Eco47III og SalI, og ligert. PCR-produktet for den variable del av den lette kjede ble først klonet inn i pCR<®>4Blunt-TOPO<®>vektoren levert i Zero Blunt<®>TOPO<®>PCR Cloning Kit for sekvensering (Invitrogen<TM>life technologies). Den variable del av den lette kjede ble skåret ut ved AgeI og BsiWI og klonet inn i vektoren pKANEO-CM30-L-var #7 som allerede inneholdt den konstante del av en human κ lettkjede. Begge vektorer ble satt sammen til en vektor ved å ta ekspresjonskassetten for den lette kjede av vektoren ved bruk av PmeI og PacI og sette denne til vektoren inneholdende den tunge kjede.

Nukleotid- og aminosyresekvensene for de variable deler av de tunge og lette kjeder av det humaniserte antistoff 16D3 er vist i SEQ ID NR.: 5, 6, 7 og 8 (se figur 12).

2. Transient ekspresjon av hu16D3

Hu16D3 IgG4κ ble transient uttrykt i HEK 293-celler ved bruk av Freestyle 293 Expression System (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjon. Hu16D3 ble renset fra supernatanten ved bruk av affinitetskromatografi på ProSep vA Ultra. Renset hu16D3 ble undersøkt for renhet ved SDS PAGE under reduserende og ikke-reduserende betingelser. Hu16D3 ble videre testet for binding til huPlGF og for inhibering av HuPlGF/huFLT-1 binding via ELISA (se figur 1 og 2).

Eksempel 3: In vivo undersøkelse av inhiberingen av tumorvekst med anti-PLGF antistoffer 1. Generell beskrivelse av materialer og metoder

Cellekultur

De murine pankreatiske cellelinjer Panc02 og den humanpankreatiske cellelinje DanG er å anse som en gave fra S. Rosewicz (Charité-Universitätsmedizin Berlin, Tyskland). Humanbryst-MDA-MB, kolon-LOVO og melanoma Mel2a cellelinje ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA). Alle celler ble dyrket som anbefalt. Murine 16D3 anti-PlGF antistoffer ble benyttet for alle in vivo forsøk for å unngå en immun reaksjon mot antistoffet.

Dyreforsøk

Alle dyreprosedyrer var fullt godkjent av komiteen for institusjonell dyrepleie og –bruk. NMRI nu/nuhunmus ble holdt under semisterile betingelser og ble rutinemessig benyttet i en alder av 8-10 uker (omtrentlig vekt, 25 g). For fremstillingen av tumorkilde ble tumorceller tryptinisert for å gi enkeltcellesuspensjon, vasket med PBS. Den sentrifugerte pellet ble resuspendert i 200 µl PBS og injisert subkutant i musens høyre flanke. For den ortotopiske pankreatiske tumormodell ble 1 x 10<6>tumorceller i 30 µl PBS injisert i hodet av pankreas via ventral laparotomi i C57B16 hunmus i en alder på 9-10 uker. Før prosedyrene ble musene anestetisert med ketamin (90 mg/kg kroppsvekt) og xylazin (9 mg/kg kroppsvekt).

Administrering av medikamenter (det vil si antistoffer, vehikkel, etc.)

Behandling med antistoffer eller vehikkelkontroll ble initiert når tumorene nådde en størrelse på rundt 60 mm<3>. Antistoffene P15D11D4 (WO01/85796), 16D3, 1C8 eller vehikkel ble administrert i de antydede doser intraperitonealt annenhver dag. Avastin ble injisert ved de antydede doser intraperitonealt to ganger per uke.

Måling av tumorer

Subkutant voksende tumorer ble målt annenhver dag ved bruk av et skyvelær, og tumorvolumene ble beregnet ved bruk av formelen p/6 (w1 x w2 x w2) der "w1" og "w2" angir den største, henholdsvis minste, tumordiameter. Etter at musene var avlivet, ble ortotopisk voksende tumorer i pankreas målt etter ventral laparotomi ved bruk av den samme metode.

Statistisk analyse

Statistisk analyse ble gjennomført ved to-hale Student t-test for parede observasjoner ved bruk av GraphPad statistisk program (GraphPad Software Inc., San-Diego, CA). Alle data er uttrykt som middel ± SEM hvis ikke annet er sagt. *p<0,5, *p<0,01, hvis ikke annet er sagt.

2. Inhibering av tumorvekst i en subkutan human pankreatisk DanG xenografttumormodell med det murine anti-hPlGF antistoff 16D3.

1 x 10<6>tumorceller ble subkutant injisert i den høyre flanke av 11 uker gamle NMRI nu/nu-hunmus. Etter at tumorer nådde en størrelse på rundt 60 mm<3>, ble behandling med anti-hPlGF (16D3, 50 mg/kg kroppsvekt; n=10), anti-mPlGF (PL5D11D4 (oppnådd som beskrevet i WO01/85796; 50 mg/kg kroppsvekt; n = 10), kontroll IgG (1C8; 50 mg/kg kroppsvekt; n = 10), en kombinasjon av anti-hPlGF og anti-mPlGF (hver 25 mg/kg kroppsvekt; n=10) og vehikkel (n=10) påbegynt. Antistoffer ble injisert i.p. annenhver dag.

(A) Tumorer ble målt annenhver dag og tumorvolumet beregnet ved bruk av formelen W1xW2xW2xp/2 der W1 er den lengste og W2 den minste diameter.

(B) Mus ble avlivet på dag 18 etter tumorinokulering, tumorene skårene ut og veid. Forholdet midlere tumorvolum:vehikkel: 915±90 mm<3>, IgG: ± 89 mm<3>, PL5D11D4: 832 ± 118 mm<3>, 16D3: 521 ± 83 mm<3>, PL5D11D4 16D3: 497 ± 86 mm<3>.

Resultatene, som vist i figur 4, viser at administrering av anti-human PLGF antistoff 16D3 har en klar innvirkning på tumorvekt og størrelse.

3. Anti-hPlGF inhiberer tumorvekst i en subkutan humanpankreatisk DanG xenografttumormodell på doseavhengig måte.

1 x 10<6>tumorceller ble subkutant injisert i den høyre flanke av 11 uker gamle NMRI nu/nu-hunmus. Etter at tumorene nådde en størrelse på rundt 60 mm<3>, ble behandling med anti-hPlGF, IgG (1C8; 50 mg/kg), 16D3 (50 mg/kg, 37,5 mg/kg, 25 mg/kg, 12,5 mg/kg kroppsvekt; n = 10 for hver konsentrasjon) og vehikkel (n=10) påbegynt.

Musene ble avlivet på dag 18 etter tumorinokulering.

Resultatene er vist i figur 5. Midlere tumorvolum ± SEM: 16D3, 50 mg/kg kroppsvekt: 450 ± 37 mm<3>; 37,5 mg/kg kroppsvekt: 469 ± 97 mm<3>; 25 mg/kg kroppsvekt: 493 ± 107 mm<3>; 12,5 mg/kg kroppsvekt: 693 ± 107 mm<3>; IC8: 865 ± 109 mm<3>; vehikkel: 889 ± 100 mm<3>.

4. Anti-huPlGF inhiberer tumorvekst i en subkutan humanbryst-MDA-MB xenografttumormodell.

1 x 10<7>tumorceller ble subkutant injisert i den høyre flanke av 11 uker gamle NMRI nu/nu-hunmus. Etter at tumorene nådde en størrelse på rundt 60 mm<3>, ble behandling med anti-hPlGF, 16D3 (50 mg/kg kroppsvekt; n=10) og vehikkel (n=10) påbegynt.

Resultatene er vist i figur 6 (og tabell 1 nedenfor).

Tabell 1.

5. Anti-huPlGF inhiberer tumorvekst i en subkutan humankolon LOVO xenografttumormodell.

1 x 10<7>tumorceller ble subkutant injisert i den høyre flanke av 11 uker gamle NMRI nu/nu hunmus. Etter at tumorene nådde en størrelse rundt 60 mm<3>ble behandling med anti-hPlGF, 16D3 (50 mg/kg kroppsvekt; n =10) og vehikkel (n=10) påbegynt.

Resultatene er vist i figur 7 og tabell 2 nedenfor.

Tabell 2

6. Anti-huPlGF inhiberer tumorvekst i en subkutan humanmelanoma Mel2a xenografttumormodell.

4 x 10<6>tumorceller ble subkutant injisert i den høyre flanke av 11 uker gamle NMRI nu/nu hunmus. Etter at tumorene nådde en størrelse rundt 60 mm<3>ble behandling med anti-hPlGF, 16D3 (50 mg/kg kroppsvekt; n =10) og vehikkel (n=10) påbegynt.

Resultatene er vist i figur 8 og tabell 3 nedenfor.

Tabell 3.

Eksempel 4: In vivo undersøkelse av effekten av behandlingen med 16D3 antistoffer på vekttap. Materialer og metoder er som beskrevet i eksempel 3.

1 x 10<6>tumorceller ble subkutant injisert i den høyre flanke av 11 uker gamle NMRI nu/nu hunmus. Etter at tumorene nådde en størrelse rundt 60 mm<3>ble behandlingen med anti-HPlGF (16D3, 50 mg/kg kroppsvekt; n = 10), anti-mPlGF (PL5D11D4; 50 mg/kg kroppsvekt; n = 10), kontroll IgG (1C8; 50 mg/kg kroppsvekt; n = 10), en kombinasjon av anti-hPlGF og anti-mPlGF (hver 25 mg/kg kroppsvekt; n =10) og vehikkel (n = 10) startet. Antistoffer ble injisert i.p. annenhver dag. Kroppsvekten for musene ble målt den første og siste dag av antistoffbehandling. Tumorvekten ble trukket fra kroppsvekten før beregning av prosentandel vekttap.

Resultatene er vist i figur 8. Det vises at anti-hPlGF forhindrer kroppsvekttap i denne subkutane, humane, pankreatiske DanG xenografttumormodell.

Eksempel 5: Kombinering av anti-hPlGF og et anti-VEGF antistoff for behandlingen av tumorvekst Materialer og metoder er som beskrevet i eksempel 3.

1 x 10<6>tumorceller ble subkutant injisert i den høyre flanke av 11 uker gamle nu/nu NMRI hunmus. Etter at tumorene nådde en størrelse rundt 60 mm<3>ble behandling med anti-hPlGF (16D3, 50 mg/kg, 37,5 mg/kg, 12,5 mg/kg kroppsvekt i.p. annenhver dag; n = 10 for hver konsentrasjon), Avastin (15 mg/kg og 5 mg/kg kroppsvekt, i.p. to ganger ukentlig, n = 10 hver) og en kombinasjon av anti-hPlGF (12,5 mg/kg kroppsvekt) og Avastin (5 mg/kg kroppsvekt; n = 10) startet. Mus ble avlivet 20 dager etter tumorinokulering.

Resultatene er vist i figur 10. Midlere tumorvolum ± SEM: 1C8, 37; 37,5 mg/kg kroppsvekt: 954 ± 164 mm<3>, 12,5 mg/kg kroppsvekt: 1398 ± 236 mm<3>; IgG: 1789 ± 231 mm<3>; Avastin: 15 mg/kg kroppsvekt: 828 ± 186 mm<3>; 5 mg/kg kropps-vekt: 926 ± 202 mm<3>; Avastin 16D3: 569 ± 94 mm<3>. Det observeres at anti-hPlGF og Avastin utøver ytterligere effekt på inhibering av tumorvekst i en subkutan, humanpankreatisk DanG.

Eksempel 6: Fremstilling av scFv av 16D3

Sekvensene for de variable deler av den tunge og lette kjede (SEQ ID NR.: 2 henholdsvis 4, oppnås dom beskrevet i eksempel 1) ble forsterket ved PCR ved bruk av primere med de egnede restriksjonsbindingsseter og linker. Etter en SOE PCR (genspleising ved overlappingsekstensjon) ble scFv klonet i pEE14.4 (HindIII-EcoRI kloningsseter) (figur 12).

Denne scFvhp16D3/pEE14.4 ble transfektert til CHO-K1 celler etter linearisering med BamHI ved bruk av Fugene 6 (Boehringer Mannheim) og subklonet to ganger ved fortynning. Det ble oppnådd et monoklonalt scFv hp16D3, 6C5D4 og dette ble produsert. Denne klon ble også transient transfektert i 293 celler ved hjelp av Producell parallelt med scFv hp16D3/pKANEO-MCS50-dhfr1 (NheI-NotI kloningsseter) (figur 13).

Nukleotid- og aminosyresekvensen av 16D3 scFv er gitt som SEQ ID NR.: 23 henholdsvis SEQ ID NR.: 24. Aminosyresekvensen som viser tung- og lettkjedevariable områder, linkersekvensen og HA-tag og His Tag er også gitt i figur 15.

Eksempel 7: Humanisering av scFv 16D3

Humanisering av de variable områder av scFv ble gjennomført som beskrevet i eksempel 2.

Nukleotid- og aminosyresekvensene for det humaniserte scFv av 16D3 er gitt i SEQ ID NR.: 25, henholdsvis SEQ ID NR.: 26. Aminosyresekvensen som viser de tung- og lettkjedevariable områder, linkersekvensen og HA-tag og His Tag av den humaniserte scFv er også gitt i figur 15.

Eksempel 8: Produksjon av humanisert Fab 16D3

1. Forsterkning av VH- og VL fragmenter fra humanisert scFv16D3

Primere for forsterkning av VH fragment av humanisert scFv16D3

16D3Vhbackblunt 5'-CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTG-3' (SEQ ID NR.: 27) 16D3VhforSalI 5'-GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACTGTGAGCAGGG-3' (SEQ ID NR.: 28)

Primere for forsterkning av VL fragment av humanisert scFv16D3

16D3VLBackAgel 5'-CCACCGGTGACATTGTGCTGACCCAGTCTCC-3' (SEQ ID NR.: 29) 16D3VLForBsiWI 5'-CACCGTACGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCGAG-3' (SEQ ID NR.: 30)

2. Konstruksjon av tung- og lettkjedevektorer

PCR produktet fra den lette kjede ble først klonet inn i pCR4stump-TOPO vektor. Etter sekvensering ble den lette kjede fjernet ved AgeI- og BsiWI digestering og klonet inn i pKANEO-CM30-Lvar#7 vektoren. PCR produktet for den tunge kjede ble etter digestering klonet direkte i pKANEO-MCS50-Fabvar#3.

3. Forening av tung- og lettkjedekonstrukter

Begge vektorer (beskrevet ovenfor), inneholdende det lette og tunge segment, ble forent ved å fjerne kassetten inneholdende det lette segment og å føye dette til vektoren inneholdende det tunge segment ved å bruke enzymene PmeI og PacI for å oppnå det endelige konstrukt, hp16D3mutcmplFab/pKANEO-MCS50-Fabvar#3. (se figur 16).

Eksempel 9. Analyse av antigenbinding og inhibering av PlGF/flt-1 interaksjon med scFv 16D3 og humanisert scFv16D3. (figur 14)

1. Antigenbindings ELISA

ELISA plater ble belagt ON med 1 µg/ml huPlGF-1 i PBS, 200 µl/brønn, 4 °C. Etter blokkering med 1 % BSA i 1 time ved romtemperatur ble det tilsatt en fortynningsserie av scFv16D3/humanisert scFv 16D3, 200 µl/brønn og antistoffragmentet ble tillatt å binde i 1 time ved RT. Bundet scFv16D3 ble detektert med murin anti-HA (180 µl/brønn, 1 time RT) fulgt av inkubering med geite-anti-murin IgG-HRP (Sigma), 170 µl/brønn, 1 time, RT. Analysen ble utviklet med OPD.

2. Inhibering av PlGF/Flt-1 interaksjon med ELISA

ELISA plater ble belagt ON med 1 µg/ml huFlt-1 (R&D Systems), 200 µl/brønn, ON, 4 °C. Etter blokkering med 1 % BSA, 1 time, RT, ble en fortynningsserie av scFv16D3/humanisert scFv16D3 tilsatt, 100 µl/brønn, og ytterligere 100 µl/brønn huPlGF-2 ble tilsatt. Etter 2 timers inkubering ved RT ble PlGF detektert med geite-anti-huPlGF (R&D Systems), 180 µl/brønn, 1 time, RT, fulgt av en inkubering med RAG-HRP (DAKO), 1 time, RT. Analysen ble utviklet med OPD.

Eksempel 10. Analyse av antigenbinding og inhibering av PlGF/Flt-1 interaksjon med humanisert Fab16D3.

1. Antigenbindings ELISA

ELISA plater ble belagt ON med 1 µg/ml huPlGF-1 i PBS, 100 µl/brønn, 4 °C. Etter blokkering med 1 % BSA, 1 time, RT ble en fortynningsserie av humanisert Fab16D3 tilsatt, 100 µl/brønn, der antistoffragmentet ble tillatt binding i 1 time ved RT. Bundet, humanisert Fab16D3 ble detektert med anti-huIgG-HRP (Fab spesifikk) (100 µl/brønn, 1 time RT). Analysen ble utviklet med OPD. Resultatene er gitt i figur 17A.

2. Inhibering av PlGF/Flt-1 interaksjon via ELISA

ELISA plater ble belagt ON med 1 µg/ml huFlt-1 (R&D Systems), 200 µl/brønn, ON, 4 °C. Etter blokkering med 1 % BSA, 1 time, RT, ble det tilsatt en fortynningsserie av humanisert Fab16D3, 100 µl/brønn, og ytterligere 100 µl/brønn huPlGF-2. Etter 2 timers inkubering ved RT ble bundet PlGF detektert med geiteanti-huPlGF (R&D Systems), 180 µl/brønn, 1 time, RT, fulgt av en inkubering med RAG-HRP (DAKO), 1 time, RT. Analysen ble utviklet med OPD. Resultatene er gitt i tabell 17B.

Eksempel 11. Bestemmelse av KDverdier

KDverdiene for 16D3, humanisert 16D3 IgG4, humanisert scFv16D3 og humanisert Fab16D3 ble bestemt ved Biacore. Resultatene er gitt i tabell 4 nedenfor.

Tabell 4: Oppsummeringstabell av KDverdier

KDverdiene for 16D3, humanisert 16D4 IgG4, humanisert Fab 16D3 og humanisert scFv16D3.