MX2011003428A - Inhibicion del factor de crecimiento placentario (plgf) para tratar la leucemia con cromosoma filadelfia positivo. - Google Patents

Abstract

La presente solicitud se refiere al campo de las leucemias y más en particular a como la inhibición del P1GF puede ayudar a tratar leucemias con cromosoma Filadelfia positivo (Ph+) Se proporcionan métodos para tratar leucemias con Ph+ al administrar inhibidores del P1GF.También se dan a conocer los usos de inhibidores del P1GF en el tratamiento de leucemias con Ph+ o para la preparación de un medicamento contra leucemias con Ph+.

Description

INHIBICION DEL FACTOR DE CRECIMIENTO PLACENTARIO (PLGF) PARA TRATAR LA LEUCEMIA CON CROMOSOMA FILADELFIA POSITIVO Campo de la Invención La presente invención se refiere al campo del cáncer, en particular la leucemia. Más particularmente, se refiere al tratamiento de la leucemia con cromosoma Filadelfia positivo (Ph+) . Esto se logra por vía de la inhibición del factor de crecimiento plancentario (P1GF, por sus siglas en inglés) . De esta manera, se proporcionan métodos para el tratamiento de la leucemia con Ph+ utilizando inhibidores del PlGF, en particular utilizando un anticuerpo anti-PlGF. Un tipo particular de leucemia que está contemplado para ser tratado de esta manera es la leucemia mielógena crónica (CML, por sus siglas en inglés) , en especial también en pacientes donde los inhibidores convencionales de BCR/ABL, tal como imatinib, no tienen un efecto terapéutico suficiente.

Antecedentes de la Invención El cromosoma Filadelfia, también conocido como la translocación Filadelfia, es una anormalidad cromosómica específica que está asociada con la leucemia mielógena crónica (CML) . Es el resultado de una translocación recíproca entre los cromosomas 9 y 22 y se designa específicamente como t(9;22) (q34;qll) . La presencia de esta translocación es una REF: 218770 prueba sumamente sensible para la CML, puesto que 95% de los pacientes con CML tienen esta anormalidad. El 5% restante de pacientes con CML tienen típicamente ya sea una translocación críptica que es invisible en las preparaciones cromosómicas con bandas G o una translocación variante que involucra otro cromosoma o cromosomas así como también el brazo largo de los cromosomas 9 y 22. Sin embargo, la simple presencia del cromosoma Filadelfia (Ph) no es suficientemente específica para diagnosticar la CML, puesto que también se encuentra en 25-30% de casos de leucemia linfoblástica aguda (ALL, por sus siglas en inglés) en adultos (y en 2-10% en casos de ALL en edad pediátrica) .

No obstante, estas enfermedades son claramente distintas. La leucemia linfoblástica aguda (ALL) es una forma de leucemia en la cual los glóbulos blancos inmaduros, malignos se multiplican continuamente y son sobreproducidos en la médula ósea. La ALL causa daño y muerte al dejar fuera las células normales en la médula ósea y al propagarse (metástasis) a otros órganos. La ALL es más común en la niñez y la adolescencia con una incidencia máxima a los 4-5 años de edad y otro punto máximo en la vejez. La tasa de curación total en los niños es 85% y aproximadamente 50% de los adultos tienen una supervivencia libre de la enfermedad a largo plazo. "Agudo" se refiere al estado inmaduro, no diferenciado de los linfocitos circulantes ("células blásticas") y al progreso rápido de la enfermedad, la cual puede ser fatal de semanas a meses si se deja sin tratamiento. El tratamiento para la leucemia aguda puede incluir quimioterapia, esteroides, terapia de radiación, tratamientos combinados intensivos (que incluyen trasplantes de médula ósea o células madre) y factores de crecimiento.

Por otra parte, la leucemia mielógena (o mieloide) crónica (CML) es una forma de leucemia caracterizada por el crecimiento incrementado y desregulado de células predominantemente mieloides en la médula ósea y la acumulación de estas células en la sangre; de esta manera, es una enfermedad mieloproliferativa . La CML es un trastorno de células madre de la médula ósea de origen clonal en el cual la proliferación de granulocitos maduros (neutrófilos , eosinófilos y basófilos) y sus precursores es el descubrimiento principal. Históricamente, ha sido tratada con quimioterapia, interferón y trasplante de médula ósea, aunque las terapias dirigidas ahora también están disponibles y se utilizan como un estándar de atención médica.

El intercambio de partes de los cromosomas 9 y 22 observado en el cromosoma Filadelfia da origen a un gen de fusión de BCR-ABL (Meló, 1996) . Es decir, parte del gen de BCR ("región de la agrupación del punto de interrupción") del cromosoma 22 (región qll) se fusiona con parte del gen de ABL en el cromosoma 9 (región q34) . Abl significa "Abe1son" , el nombre de un virus de leucemia el cual lleva una proteína similar. Dos clases de transcripciones de BCR-ABL (las cuales producen las isoformas pl85 y p210, nombradas después de su peso molecular aparente en kDa) son generadas debido al punto de interrupción de la región BCR. El gen de "BCR-ABL" fusionado se localiza en el cromosoma más corto, resultante 22. ABL lleva un dominio que puede agregar grupos fosfato a los residuos de tirosina (una tirosina cinasa) y el producto del gen de fusión de BCR-ABL también es una tirosina cinasa. (Faderl y colaboradores, 1999) .

La proteína fusionada de BCR-ABL interactúa con la subunidad receptora común de interleucina-3 ß. La transcripción de BCR-ABL es continuamente activa y no requiere la activación por parte de otras proteínas mensajeras celulares. A su vez, la BCR-ABL activa una cascada de proteínas las cuales controlan el ciclo celular, acelerando la división celular. Por otra parte, la proteína de BCR-ABL inhibe la reparación del ADN, causando la inestabilidad genómica y haciendo que la célula sea más susceptible al desarrollo de anormalidades genéticas adicionales y promoviendo potencialmente el progreso de la CML de la fase crónica hacia una crisis de células blásticas intratable. Se cree que la acción de la tirosina cinasa de la proteína de BCR-ABL es la causa patofisiológica de la leucemia mielógena crónica. Se han desarrollado terapias dirigidas que inhiben específicamente la actividad de la proteína de BCR-ABL. La primera de éstas fue imatinib (comercializado como su sal de mesilato bajo el nombre comercial GlivecMR o GleevecMR) . Estos y otros inhibidores de tirosina cinasa pueden inducir remisiones completas en la CML, confirmando la importancia central de la BCR-ABL en la CML (Hehlmann y colaboradores, 2007) . También se reportó el éxito limitado cuando se trató la ALL con cromosoma Filadelfia positivo (Ph+) con inhibidores de BCR-ABL (Yanada y Naoe, 2006; Piccaluga y colaboradores, 2006) .

A pesar del hecho de que la introducción de imatinib y los inhibidores de BCR/ABL de segunda generación (por ejemplo dasatinib) ha revolucionado el tratamiento de pacientes con leucemia con cromosoma Filadelfia positivo (Ph+) , es un problema conocido que las células leucémicas persisten incluso en pacientes tratados exitosamente y algunos pacientes desarrollan resistencia y finalmente recaen (Swords y colaboradores, 2007; Buchert, 2007; Li y Li , 2007; Kujawski y Talpaz, 2007) . Las razones de estas desventajas no están resueltas completamente.

De esta manera, sería ventajoso tener opciones adicionales para tratar a pacientes con leucemia con cromosoma Filadelfia positivo, particularmente aquellos pacientes que no son sensibles al tratamiento con inhibidores de BCR-ABL.

Breve Descripción de la Invención Un objetivo de la solicitud es proporcionar planteamientos terapéuticos novedosos para tratar las leucemias con cromosoma Filadelfia positivo (Ph+) . Particularmente, se prevé también ser capaz de proporcionar planteamientos que sean útiles para aquellos pacientes donde los inhibidores de BCR-ABL, como imatinib, no son (o ya no son) adecuados como terapia. Sorprendentemente, se descubrió que la inhibición del factor de crecimiento placentario (P1GF) , incluso aunque este factor no es expresado en las líneas de células leucémicas, da por resultado una supervivencia significativamente prolongada de ratones leucémicos. Por otra parte, esta supervivencia prolongada es independiente del estado mutacional de BCR-ABL, contrario a lo que se observa para los inhibidores de BCR-ABL.

De esta manera, de acuerdo con un primer aspecto, se contempla el uso de un inhibidor del factor de crecimiento placentario para el tratamiento de la leucemia con cromosoma Filadelfia positivo. También se contempla el uso de un inhibidor del factor de crecimiento placentario para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la leucemia con cromosoma Filadelfia positivo. Del mismo modo, se proporcionan métodos para tratar la leucemia con cromosoma Filadelfia positivo en un sujeto necesitado de los mismos, que comprenden administrar un inhibidor de PlGF al sujeto.

Naturalmente, el objetivo es en consecuencia mejorar los síntomas o finalmente tratar la leucemia con Ph+ en el sujeto necesitado del mismo.

De acuerdo con modalidades particulares, el inhibidor del factor de crecimiento placentario proporcionado en los usos y métodos descritos en este documento es un inhibidor selectivo del factor de crecimiento placentario. Particularmente, el inhibidor selectivo es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se enlaza específicamente al factor de crecimiento placentario. Este anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal. De acuerdo con modalidades particulares, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se enlaza específicamente al factor de crecimiento placentario es un anticuerpo monoclonal. De acuerdo con modalidades particulares adicionales, es un anticuerpo monoclonal de murino. De acuerdo con modalidades particulares aún adicionales, los anticuerpos monoclonales de murino pueden ser humanizados, es decir versiones humanizadas de los anticuerpos monoclonales de ratón hechos por medio de la tecnología de ADN recombinante , iniciando a partir de las secuencias de ADN genómico de ratón y/o de humano que codifican las cadenas H y L y de clones de ADNc que codifican las cadenas H y L. De acuerdo con modalidades alternativas, el anticuerpo o un fragmento del mismo es un anticuerpo humano (o un fragmento del mismo) , en particular un anticuerpo monoclonal de humano.

De acuerdo con modalidades particulares, el fragmento del anticuerpo que se enlaza específicamente al PlGF es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento variable de cadena individual (scFv) . De acuerdo con modalidades particulares alternativas, el inhibidor selectivo es un nanocuerpo contra el PlGF. De acuerdo con todavía otras modalidades particulares, el inhibidor de PlGF no es un inhibidor selectivo. Un ejemplo particular del mismo es un inhibidor de VEGFR-1, tal como un anticuerpo contra el VEGFR-1 o un fragmento del mismo.

Se proporcionan métodos y usos de inhibidores del PlGF para el tratamiento de leucemias con cromosoma Filadelfia positivo (Ph+) . De acuerdo con modalidades particulares, la leucemia con cromosoma Filadelfia positivo es la leucemia mielógena crónica (CML) . De acuerdo con modalidades alternativas, la leucemia con Ph+ es la leucemia linfoblástica aguda (ALL) , tal como por ejemplo B-ALL (en la cual las células B son células leucémicas) o T-ALL (en la cual las células leucémicas son células T) .

Se contempla que los métodos y usos descritos en este documento tienen una aplicabilidad amplia. En particular, se contempla que los inhibidores de PlGF se pueden utilizar para el tratamiento (o en métodos de tratamiento) de todas las leucemias con cromosoma Filadelfia positivo, en particular también aquellas que no pueden ser tratadas con un inhibidor de BCR-ABL y/o aquellas que no pueden ser tratadas con un inhibidor de BCR-ABL solo. Una leucemia con Ph+ no puede ser tratable con un inhibidor de BCR-ABL - o un inhibidor de BCR-ABL solo - por una variedad de razones. Las razones más comunes son que la leucemia puede ser (por lo menos parcialmente) insensible al tratamiento (o puede haber desarrollado una resistencia/insensibilidad por lo menos parcial al tratamiento) o que el inhibidor de BCR-ABL no puede ser tolerado por el paciente (por ejemplo debido a una alergia o efectos colaterales adversos) . Mientras que la inhibición del PlGF ofrece un planteamiento general en el tratamiento de leucemias con Ph+, puede ser especialmente benéfico para aquellos casos donde la inhibición de BCR-ABL, un planteamiento terapéutico estándar para por ejemplo la CML, no logra conducir al efecto terapéutico deseado. El uso de inhibidores de PlGF entonces puede ofrecer un planteamiento alternativo o adicional. De acuerdo con modalidades específicas, el inhibidor de PlGF se puede utilizar en combinación con un inhibidor de BCR-ABL.

Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A-1B muestran la expresión de PlGF en células leucémicas, células hematopoyéticas y células estromales primarias de la médula ósea in vitro. La Figura 1A muestra la cantidad de proteína de PlGF secretada por diferentes líneas de células y células aisladas (véase el Ejemplo 1 para más detalles) ; La Figura IB muestra la expresión de PlGF por parte de la fracción hematopoyética (CD45+) y la fracción no hematopoyética (CD45") de BMDSCs de murino. * indica p<0.001. BM: médula ósea (cuyos títulos son Figura 1A: "Proteína de PlGF secretada" y Figura IB: "Secreción de PlGF por subpoblaciones de BMSC") .

En las Figuras 2A-2I, se muestra la expresión del PlGF y otras moléculas se muestra in vivo (para los detalles, véase el Ejemplo 2) . Las Figuras 2A, 2B muestran los niveles de proteína de PlGF en la sangre periférica o médula ósea en diferentes puntos de tiempo del progreso de la enfermedad leucémica en ratones; Las Figuras 2C, 2D: muestran la relación de los niveles de proteína de PlGF contra sVEGFR-1 en sangre periférica o médula ósea en diferentes puntos de tiempo del progreso de la enfermedad leucémica en ratones; La Figura 2E muestra la expresión de AR m del PlGF de médula ósea en ratones saludables y leucémicos, * indica p<0.002; La Figura 2F muestra la caracterización de la expresión de PlGF en subpoblaciones de médula ósea, * indica p<0.05; La Figura 2G: muestra la expresión de ARNm del VEGF de médula ósea en ratones saludables y leucémicos; Las Figuras 2H, 21 muestran la los niveles de proteínas del PlGF en sangre periférica o médula ósea se correlacionan con la carga leucémica en ratones enfermos en etapa terminal (cuyos títulos son Figura 2A: "PlGF en sangre periférica", Figura 2B: "PlGF en médula ósea", Figura 2C: "PlGF/sVEGFRl (PB) " , Figura 2D: "PlGF/sVEGFRl (BM) " , Figura 2E : "Expresión de ARNm de PlGF en médula ósea", Figura 2F: "Expresión de PlGF en subpoblaciones" , Figura 2G: "Expresión de ARNm de VEGA en médula ósea", Figura 2H: "Los niveles de PlGF en el plasma sanguíneo se correlacionan con la carga leucémica" y Figura 21 : "Los niveles de PlGF en el plasma de BM se correlacionan con la carga leucémica") .

Las Figuras 3A-3F demuestran la proliferación de células leucémicas por medio del PlGF (para los detalles véase el Ejemplo 3) . Las Figuras 3A, 3B muestran la expresión de Npn-1 y Npn-2 en diferentes líneas de células leucémicas; La Figura 3C muestra la inducción de la proliferación en la línea de células BV-173 por medio de diferentes concentraciones de PlGF; La Figura 2D muestra la inducción de la proliferación por medio de 50 ng/ml de PlGF en una línea de células K562 (panel superior izquierdo) , BV-173 (panel superior derecho) , KCL-22 (panel inferior izquierdo) y BaF3 (panel inferior derecho), respectivamente; La Figura 3E muestra la inhibición de la proliferación inducida por PlGF en la línea de células BV-173 por medio de un anticuerpo anti-VEGFR-1 ; La Figura 3F muestra la inhibición de la proliferación inducida por PlGF en la línea de células BV-173 por medio de un anticuerpo anti-PlGF. BM: médula ósea; PlGF: factor de crecimiento placentario; aVEGFR-1: anticuerpo antireceptor del factor de crecimiento endotelial vascular 1; aPIGF: anticuerpo anti-PlGF (cuyos títulos son Figura 3A: "Expresión de Npn-1", Figura 3B : "Expresión de Npn-2", Figura 3C: "El PlGF induce la proliferación (BV-173)", Figura 3D: "Proliferación inducida por PlGF (K562)", "Proliferación inducida por PlGF (BV-173)", "Proliferación inducida por PlGF (KCL-22)" y "Proliferación inducida por PlGF (BaF-3)", Figura 3E: "El anticuerpo aVEGFR-1 inhibe la proliferación inducida por PlGF (BV-173)" y Figura 3F: "El anticuerpo aPIGF inhibe la proliferación inducida por PlGF (BV-173)").

En las Figuras 4A-4E, se muestra la inducción por medio de la interacción paracrina entre células leucémicas y BMDSCs in vitro (A-D) , así como también con el medio acondicionado de células leucémicas (E) . La Figura 4A muestra la expresión de PlGF en BDMSCs, en la línea de células BV-173 y en el co-cultivo (BMDSCs + BV) ; La Figura 4B muestra la expresión de PlGF en células S17, en la línea de células BV-173 y en co-cultivo; La Figura 4C muestra la proliferación de las células leucémicas BV-173 solas y en co-cultivo con BMDSCs e inhibición por medio de un anticuerpo anti-PlGF; La Figura 4D muestra la proliferación de BMDSCs solos y en co-cultivo de células leucémicas BV-173 e inhibición por medio de un anticuerpo anti-PlGF; La Figura 4E muestra la regulación por incremento de PlGF en células S17 por medio de la incubación con un medio acondicionado de células leucémicas (BV-173). BV: línea de células BV-173; PIGF: anticuerpo anti-PlGF (cuyos títulos son Figura 4A: "Expresión de P1GF en co-cultivo", Figura 4B: "Expresión de PlGF del co-cultivo de S17/BV-173", Figura 4C: "Proliferación de células leucémicas en co-cultivo (BV-173)", Figura 4D: "Proliferación de BMDSCs en co-cultivo con células leucémicas" y Figura 4E: "S17" ) .

La Figura 5A muestra la supervivencia de ratones PlGF"7" y WT leucémicos; La Figura 5B muestra la supervivencia de ratones leucémicos entrecruzados (para los detalles, véase el Ejemplo 5) ; La Figura 5C muestra la supervivencia de ratones que padecen leucemia inducida por células BaF3 con BCR-ABL+ linfáticas, ya sea tratados con un anticuerpo anti-PlGF o un anticuerpo de control; las Figuras 5D, 5E muestran la análisis de FACS de células con BCR-ABL+ en la leucemia en etapa inicial (dl5) y en etapa terminal (d28) y efecto de la inhibición con un anticuerpo anti-PlGF; La Figura 5F muestra la histología de la médula ósea de ratones leucémicos en etapa terminal tratados con un control y con un anticuerpo anti-PlGF; La Figura 5G muestra la supervivencia en un modelo de ratón de CML sensible a imatinib, ya sea tratados con un anticuerpo anti-PlGF o un anticuerpo de control; La Figura 5H muestra la supervivencia en un modelo de ratón de CML resistente a imatinib, ya sea tratados con un anticuerpo anti- PlGF o un anticuerpo de control. aPlGF: anticuerpo anti-PlGF; d: días; T315I: la mutación T315I de la proteína de fusión de BCR-ABL. Para mayores detalles véase el Ejemplo 6 (cuyos títulos son Figura 5?: "Supervivencia de KO-KO vs . WT-WT" , Figura 5B: "Supervivencia de ratones leucémicos con BCR-ABL'1'" , Figura 5C: "Supervivencia de BaF3 con BCR-ABL+" , Figura 5D : "Sangre periférica en dl5" y Figura 5E: "Sangre periférica en d28"), Figura 5F: "BM con control" y "BM con anticuerpo anti-PIGF", Figura 5G: "Supervivencia en CIVIL sensible a imatinib" , Figura 5H: "Supervivencia en CML [T315I] resistente a imatinib").

Las Figuras 6A-6D muestran la inhibición de la hipervascularización y fibrosis de la médula ósea con el tratamiento anti-PlGF (véase el Ejemplo 7) . Las Figuras 6A, 6C muestran la densidad vascular de la médula ósea (MVD, por sus siglas en inglés) en ratones tratados con anticuerpo de control y anticuerpo anti-PlGF, trasplantados de modo simulado con leucemia en etapa terminal; Las Figuras 6B, 6D muestran la longitud de las fibras de reticulina+ y fibrosis de la médula ósea en ratones tratados con anticuerpo de control y tratados con anticuerpo anti-PlGF, trasplantados de modo simulado con leucemia en etapa terminal (cuyos títulos son Figura 6A: "MVD", Figura 6B: "Fibras").

En las Figuras 7A-7F, se muestran los datos sobre la expresión del PlGF en la CML humana (A-D, Ejemplo 8) así como también los datos que correlacionan la expresión de PlGF y el tratamiento con imatinib en ratones (E) y humanos (F, Ejemplo 9) . La Figura 7A se muestran los niveles de PlGF en el plasma en diferentes etapas de CML (controles saludables, fase crónica y crisis de células blásticas) , * indica p<0.0001; La Figura 7B se muestran los niveles de PlGF en el plasma de médula ósea en pacientes con CML; La Figura 7C se muestran la correlación entre los niveles de PlGF y los números de transcripciones de BCR/ABL en la CML humana; La Figura 7D se muestran el QRT-PCR de expresión de PlGF en controles saludables, células leucémicas y células estromales de pacientes con CML; La Figura 7E se muestran los niveles de PlGF en la médula ósea de ratones leucémicos no tratados y ratones saludables y leucémicos tratados con imatinib; La Figura 7F se muestran los niveles de PlGF en sujetos humanos saludables y pacientes con diferentes niveles de respuesta al imatinib (IM) . Para los detalles véase el Ejemplo 9 (cuyos títulos son Figura 7A: "PlGF en CML humana", Figura 7B : "Plasma de la médula ósea con CML", Figura 7c : "CML humana", Figura 7D: "Expresión de PlGF en células CD34+ humanas", Figura 7E: "PlGF en plasma de la médula ósea", Figura 7F: "PlGF en pacientes con respuesta a IM" ) .

Descripción Detallada de la Invención Definiciones La presente invención se describirá con respecto a modalidades particulares y con referencia a ciertos dibujos pero la invención no está limitada a los mismos sino únicamente por las reivindicaciones. Cualquier signo de referencia en las reivindicaciones no debe interpretarse como limitante del alcance. Las figuras descritos son solo esquemáticos y no son limitantes. En los dibujos, el tamaño de algunos elementos puede ser exagerado y puede no estar dibujado a escala para propósitos ilustrativos. Donde se utiliza el término "que comprende" en la presente descripción y reivindicaciones, no excluye otros elementos o pasos. Donde se utiliza un artículo indefinido o definido cuando se refiere a un sustantivo singular por ejemplo "un" o "una", "el", "la", éste incluye una forma plural de ese sustantivo a menos que se establezca específicamente alguna otra cosa.

Adicionalmente, los términos primero, segundo, tercero y similares en la descripción y en las reivindicaciones se utilizan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Se debe entender que los términos utilizados de esta manera son intercambiables conforme a las circunstancias apropiadas y que las modalidades de la invención descritas en este documento tienen capacidad de operación en otras secuencias de aquellas descritas o ilustradas en este documento.

Los siguientes términos o definiciones se proporcionan solamente para ayudar en el entendimiento de la invención. A menos que se defina específicamente en este documento, todos los términos utilizados en este documento tienen el mismo significado que tendrían para una persona experta en el campo de la presente invención. Los practicantes son dirigidos particularmente a Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning-. A Laboratory Manual, 2a ed. , Cold Spring Harbor Press, Plainsview, Nueva York (1989); y Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology (Suplemento 47) , John Wiley & Sons, Nueva York (1999) , para definiciones y términos del campo. No se debe interpretar que las definiciones proporcionadas en este documento tengan un alcance menor que aquel entendido por una persona de experiencia ordinaria en el campo.

"Factor de crecimiento placentario" o "PlGF" como se utiliza en este documento se refiere a un miembro de la subfamilia de VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) , en particular el P1GF humano (Identificación del Gen 5228; Secuencias de Referencia (independientemente de las construcciones del genoma) NM_002632.4 (ARN ) y NP_002623.2 (proteína) ) . A menos que se especifique de otra manera, el término "P1GF" puede referirse al gen así como también a sus productos, tal como el ARN de PlGF (más particularmente, el ARNm de PlGF) y la proteína de PlGF. Todas las isoformas de PlGF tienen por objeto ser incluidas en la definición de P1GF.

El término leucemia con "cromosoma Filadelfia positivo" o "Ph+" como se utiliza en este documento se refiere a enfermedades en donde se confirma que la translocación Filadelfia está presente. El cromosoma Filadelfia es un resultado de la translocación t(9;22) (q34;qll) (translocación Filadelfia). Por lo menos dos formas alternativas de la translocación del cromosoma Filadelfia están documentadas, pero ambos puntos de interrupción alternativos dan por resultado la unión de diferentes conjuntos de exones de BCR (OMIM *151410) en el cromosoma 22 a un subconjunto común de exones del gen de ABL (OMIM *189980) localizado en el cromosoma 9. De esta manera, la fusión puede dar por resultado 2 productos de oncogenes quiméricos alternativos llamados p210 (BCR-ABL) y pl85 (BCR-ABL) , referidos colectivamente en este documento como "BCR-ABL" (incluidos en OMIM *151410 y *189980) . La activación de la actividad de tirosina cinasa de ABL es necesaria para el potencial oncogénico del oncogen quimérico. Ya que la presencia del gen de BCR-ABL quimérico (y sus productos génicos) es una característica distintiva de las leucemias con Ph+, "Ph+" también puede ser referido como leucemias "BCR-ABL positivo" o "BCR-ABL+" , para indicar la presencia del gen de fusión. Se debe tener en cuenta que las translocaciones o mutaciones que dan por resultado la generación de un gen quimérico de BCR- ABL funcional (es decir BCR-ABL+) en este documento también serán clasificadas de esta manera como "Ph+", sin importar el mecanismo de translocación. Este puede ser el caso por ejemplo con las translocaciones más complejas.

Un "inhibidor selectivo del factor de crecimiento placentario" como se utiliza en la solicitud es una molécula o compuesto que inhibe la función o vía de señalización del PlGF sin interferir con la función fisiológica de otras moléculas. En particular, un inhibidor selectivo del PlGF no interferirá con la función del VEGF. De esta manera, como un ejemplo no limitante, un compuesto dirigido específicamente contra el PlGF (por ejemplo un anticuerpo anti-PlGF) es un inhibidor selectivo, mientras que los compuestos que también fijan como objetivo el VEGF (tales como los compuestos a base de VEGFR1) o fijan como objetivo los receptores compartidos por VEGF/PlGF (por ejemplo un anticuerpo contra VEGFR1 o sVEGFR-1) son típicamente inhibidores no selectivos.

"Leucemia mielógena crónica" , "leucemia mieloide crónica" o "CML" como se utiliza en este documento se refiere a un trastorno mieloproliferativo clonal de una célula madre pluripotente con una anormalidad citogenética específica (el cromosoma Filadelfia) , que involucra células mieloides, eritroides, megacariocíticas , linfoides B y algunas veces linfoides T, pero no fibroblastos de la médula (OMIM #608232; Silver, 2003) .

"Leucemia linfocítica aguda" , "leucemia linfoblástica aguda" o "ALL" como se utiliza en la solicitud se refiere a una forma aguda de leucemia en la cual los glóbulos blancos inmaduros se multiplican continuamente y son sobreproducidos en la médula ósea. Los ejemplos de ALL incluyen T-ALL y B-ALL. Un subconjunto particular del grupo heterogéneo de casos de ALL también es positivo para el cromosoma Filadelfia, es decir Ph+ o BCR-ABL+ (Radich, 2001; Al arado y colaboradores, 2007) .

Como se utiliza en la solicitud, un "inhibidor de BCR-ABL" es una molécula o compuesto que inhibe la expresión o función del gen de BCR-ABL quimérico o su producto génico. Es notable que el inhibidor de BCR-ABL no necesita ser obligatoriamente específico para BCR-ABL. Por ejemplo, puede ser un inhibidor de tirosina cinasa el cual fija como objetivo más que solo la tirosina cinasa de BCR-ABL. Un inhibidor de BCR-ABL es bien conocido como una terapia dirigida en la leucemia con Ph+, un ejemplo típico pero no limitante es imatinib. Otros ejemplos están incluidos en la solicitud.

"Tratar" como se utiliza en la solicitud significa lograr un mejoramiento significativo de uno o más síntomas clínicos que están asociados con la leucemia con Ph+ . Dependiendo de la situación, el mejoramiento significativo puede ser registrado cuantitativa o cualitativamente. Los criterios cualitativos pueden ser por ejemplo el bienestar del paciente. En el caso de la evaluación cuantitativa, el mejoramiento significativo es típicamente un mejoramiento mayor que 10%, mayor que 20%, mayor que 25%, mayor que 30%, mayor que 40%, mayor que 50%, mayor que 60%, mayor que 70%, mayor que 75%, mayor que 80%, mayor que 90%, mayor que 95% o de 100% o más sobre la situación antes de la administración del inhibidor de P1GF. Naturalmente, si el mejoramiento es expresado como una disminución (por ejemplo el número de células malignas que están presentes en una muestra del paciente), el mejoramiento no puede ser mayor que 100%. El marco de tiempo sobre el cual se evalúa el mejoramiento dependerá del tipo de criterios observados y puede ser determinado por la persona experta en el campo.

Un aspecto importante de la invención es proporcionar métodos y usos de inhibidores del factor de crecimiento placentario para el tratamiento de la leucemia con cromosoma Filadelfia positivo. También se enseña el uso de inhibidores del factor de crecimiento placentario para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de la leucemia con cromosoma Filadelfia positivo.

Los inhibidores del factor de crecimiento placentario (PlGF) son particularmente inhibidores selectivos del PlGF, de modo que no interfieren con otras moléculas. En particular, los inhibidores selectivos del PlGF no deben interferir con la función del VEGF . De acuerdo con modalidades particulares, el inhibidor de PlGF no es un inhibidor del VEGF. De acuerdo con modalidades particulares alternativas, el inhibidor de PlGF no es un inhibidor del VEGFR1. De acuerdo con modalidades específicas, el inhibidor de PlGF no está basado en el VEGFR1.

Los inhibidores pueden neutralizar la actividad del PlGF al interferir con su síntesis, traducción, dimerización, enlace a receptores y/o transducción de señales mediada por el enlace a receptores. La neutralización de la actividad del PlGF se debe entender como la supresión de la actividad del PlGF por al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o incluso 100%.

Los inhibidores, en particular los inhibidores selectivos, del PlGF son conocidos en el campo. De acuerdo con modalidades particulares, los inhibidores selectivos son anticuerpos. El término "anticuerpo" o "anticuerpos" se refieren a un anticuerpo caracterizado como que se dirige específicamente contra el PlGF o cualquier derivado funcional del mismo o un fragmento de enlace a antígenos del mismo, particularmente del tipo F(ab')2, F(ab) o Fv de cadena individual (scFv) o cualquier tipo de anticuerpo recombinante derivado del mismo. Los anticuerpos anti-PlGF descritos en este documento, inclusive los antisueros policlonales específicos que se preparan contra el PlGF o cualquier derivado funcional de los mismos, no tienen una reactividad cruzada con otras proteínas. De acuerdo con modalidades particulares, los anticuerpos anti-PlGF son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir por ejemplo por medio de cualquier hibridoma susceptible a ser formado de acuerdo con métodos clásicos a partir de células esplénicas de un animal, particularmente de un ratón o rata inmunizado contra el PlGF o cualquier derivado funcional del mismo, y de células de una línea de células de mieloma, y se pueden seleccionar por la capacidad del hibridoma para producir los anticuerpos monoclonales que reconocen el PlGF o cualquier derivado funcional de los mismos los cuales han sido utilizados inicialmente para la inmunización de los animales.

De acuerdo con modalidades particulares, la preparación de anticuerpos monoclonales contra el PlGF humano se puede realizar por ejemplo de la siguiente manera: una proteína de fusión de PlGF humano recombinante , que consiste de los aminoácidos codificados por el PlGF o un fragmento del mismo se acopla a la Glutationa S-transíerasa (GST) y se expresa en Escherichia coli y se purifica por medio de la cromatografía de afinidad en glutationa inmovilizada (Amersham Biosciences) . El PlGF humano recombinante también se puede obtener de R&D Systems Inc. 614 McKinley Place N. E.

Minneapolis, MN 55413, EUA. (264-PG-010, 264-PG-010/CF, 264-PG-050 o 264-PG-050/CF) , de Research Diagnostics Inc, Pleasant Hill Road, Flanders NJ 07836, EUA (PlGF Humano Recombinante-1 : # de Catálogo RDI-300-015 y # de Catálogo RDI-300-016 y PlGF Humano Recombinante-2 : # de Catálogo RDI -300-019) o de ALEXIS Corporation, CH-4415 Lausanne, Suiza (Factor de Crecimiento Placentario-2 (humano) (recombinante) # de Catálogo RLT-300-020) .

El PLGF humano recombinante se mezcla con una cantidad igual de un adyuvante y la mezcla obtenida luego se administra por la ruta subcutánea a ratones macho Balb/c (8 semanas de edad desde el inicio de la inmunización) en una cantidad correspondiente a una cantidad de PlGF de 100 g por 1 ratón (inmunización de cebadura) . Después de aproximadamente 21 días, la inmunización se puede realizar por medio de la administración subcutánea de la misma manera como se describiera anteriormente (inmunización de refuerzo). Después de 19 días o 30 días desde el refuerzo, los ratones pueden ser administrados a través de sus venas de la cola con 200 µ? de una preparación obtenida al diluir el PlGF humano con PBS (solución salina fisiológica amortiguada con fosfato) para tener una concentración de 250 µg/ml (inmunización final) . Los bazos luego tienen que ser extirpados de los ratones después de aproximadamente 3 días desde la inmunización final y luego tienen que ser separados en células individuales. Subsecuentemente, las células del bazo deben ser lavadas con un medio apropiado, por ejemplo el medio DMEM. Por otra parte, las células de mieloma de ratón adecuadas (por ejemplo Sp2/0-Agl4) tienen que ser recolectadas en la fase de crecimiento logarítmica y tienen que ser lavadas con un medio apropiado, por ejemplo un medio DMEM. Las células del bazo y las células de mieloma de ratón tienen que ser mezcladas suficientemente en un tubo de plástico en una relación de números de las células de 10:1, seguido por la adición de polietilenglicol al 50% (p/v) (PEG por ejemplo de Boehringer Mannheim, peso molecular promedio: 4000) para realizar la fusión de células a 37°C durante 7 minutos. Después de la remoción de la solución de sobrenadante (por medio de la centrifugación) , el residuo se agrega con el medio de HAT (medio DMEM que contenía 10% de suero bovino fetal agregado con hipoxantina, aminopterina y timidina) . El residuo tiene que ser suspendido de modo que se obtenga una concentración de células del bazo de aproximadamente 5xl06 células/ml . Esta suspensión de células entonces puede ser distribuida y vertida dentro de placas de plástico de 96 pocilios de modo que un pocilio contenga aproximadamente 100 µ? de la suspensión, seguido por el cultivo a 37°C en dióxido de carbono al 5%. El medio de HAT tiene que ser complementado; por ejemplo en una cantidad de 50 µ?/pocillo en el 2o y 5o días. Después de eso, la mitad del volumen del medio puede ser cambiada cada 3 o 4 días de conformidad con la proliferación de los hibridomas .

Los hibridomas, los cuales producen el anticuerpo monoclonal de la presente invención, tienen que ser seleccionados. Esto tiene que realizarse por medio del uso de, como un índice, la actividad inhibitoria del anticuerpo monoclonal sobre la actividad fisiológica poseída por el P1GF.

Los hibridomas los cuales produjeron anticuerpos monoclonales que exhiben una reactividad con el P1GF entonces tienen que ser seleccionados de los clones seleccionados. Los hibridomas obtenidos entonces tienen que ser transferidos a un medio adecuado por ejemplo el medio de HT el cual es el mismo que el medio de HAT, pero sin aminopterina, y se cultivan adicionalmente . La clonación se puede realizar dos veces de acuerdo con el método de dilución limitante por medio del cual se pueden obtener hibridomas estables.

La producción y purificación de anticuerpos monoclonales entonces se pueden realizar de la siguiente manera: 2.6, 10, 14 -Tetrametilpentadecano (por ejemplo Pristano de Sigma, 0.5 mi) se puede inyectar por la ruta intraperitoneal en ratones hembra Balb/c (6 a 8 semanas de edad desde el nacimiento) . Después de 10 a 20 días, las células de clones (lxlO6 a 107 células) se pueden suspender en PBS y se pueden inocular intraperitonealmente en los ratones.

Después de 7 a 10 días, los ratones se pueden sacrificar y se pueden sujetar a una operación abdominal, de la cual se puede recolectar el fluido ascítico producido. El fluido ascítico se puede centrifugar para eliminar los materiales insolubles y un sobrenadante se recupera y se almacena a -20 °C hasta la purificación. Consecuentemente, la IgG se puede purificar del sobrenadante de fluido ascítico descrito anteriormente por medio del uso del kit de purificación de anticuerpos de Proteína-A Hi-TrapMR (disponible de Pharmacia, Roosendaal , Países Bajos) . Específicamente, el fluido ascítico (2 mi) se puede agregar con la Solución A (glicina 1.5 M, NaCl 3 M, pH 8.9, 8 mi) y se puede colar con un filtro que tiene un tamaño de poro de 45 lm (Millipore) . Después de eso, un producto filtrado obtenido se puede aplicar a una columna (volumen de columna: 1 mi) cargada con Protein Sepharose HPMR (producido por Pharmacia) equilibrada suficientemente con la Solución A y la columna tiene que ser lavada con la Solución A en una cantidad de un volumen de columna de 10 veces. Subsecuentemente, una fracción de IgG se puede eluir con la Solución B (glicina 0.1 M, pH 2.8) en una cantidad de un volumen de columna de 10 veces. La fracción de IgG eluida se puede dializar contra el PBS. Los anticuerpos monoclonales se pueden determinar por sus subclases de IgG por medio del uso de anticuerpos purificados que se obtuvieron anteriormente, por medio de un kit determinante de subclases comercialmente disponible (nombre comercial: Mono Ab-ID EIA Kit AMR, producido por Zymed) . Este método se basa en el método de ELISA.

Las actividades inhibitorias de los anticuerpos monoclonales se pueden someter a prueba por la inhibición completa del enlace del rPlGF a su receptor de VEGFR1. Esto se puede medir por ejemplo en un ensayo ELISA inmunofuncional en el cual las placas de 96 pocilios son revestidas con 100 µ? de 1 µ9/??1 de quimera rmFlt-I/Fc durante toda la noche a temperatura ambiente en PBS . Después del bloqueo durante 1 hora con BSA al 1% en PBS, 100 µ? de una mezcla de 70 µ? de medio de hibridoma incubado previamente con 70 µ? de mPlGF-2 recombinante a 10 ng/ml durante 2 horas a temperatura ambiente entonces se aplican a la placa. Un estándar de rmPlGF-2 que varía de 20 ng/ml a 156 pg/ml se puede incluir (diluido en PBS-Tween. BSA-EDTA) . Las placas luego se pueden incubar durante 1 hora a 37 °C y durante 1 hora a temperatura ambiente, se pueden lavar 5 veces con PBS-Tween y 100 µ? de PlGF-2 anti-murino de cabra biotinilado a 200 ng/ml se pueden aplicar durante 2 horas a temperatura ambiente. Después del lavado 5 veces con PBS-Tween, 100 µ? de conjugando de avidina-HRP (kit Vectastorin ABCMR) se pueden aplicar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado 5 veces con PBS-Tween, la placa se puede desarrollar con 90 µ? de o- fenilen-diamina en amortiguador de citrato-fosfato a pH 5.0 durante 30 minutos y se puede medir a 490 nm.

También se proporcionan en este documento ligandos de anticuerpos inhibitorios, los cuales son capaces de enlazarse al P1GF. Más preferiblemente, este ligando debe ser capaz de reconocer un epítopo específico localizado en el PlGF. Por ejemplo, la presente invención se refiere a ligandos del tipo mencionado anteriormente, que se derivan de un anticuerpo monoclonal producido por medio de la inmunización deliberada en animales. La presente invención también proporciona un fragmento Fab de enlace a antígenos, o un derivado homólogo de este fragmento, el cual se puede obtener por medio de la digestión proteolítica del anticuerpo monoclonal por papaína, utilizando métodos bien conocidos en el campo. Con el propósito de reducir la inmunogenicidad del anticuerpo monoclonal anti-PlGF de murino, la presente invención también induce la construcción de un anticuerpo quimérico, preferiblemente como un dominio variable de cadena individual, el cual combina la región variable del anticuerpo de ratón con una región constante de anticuerpo humano - un comúnmente llamado anticuerpo monoclonal humanizado.

Los anticuerpos monoclonales que son producidos en animales pueden ser humanizados, por ejemplo por medio de la asociación de la región determinante de la complementariedad de enlace ("CDR", por sus siglas en inglés) del anticuerpo monoclonal no humano con regiones de estructura humanas - en particular la región C constante del gen humano - tal como es dado a conocer por Jones y colaboradores (Jones y colaboradores, 1986) o Riechmann (Riechmann y colaboradores, 1988) o pueden ser hibridizados de otra manera.

Los anticuerpos monoclonales de acuerdo con estas modalidades pueden ser versiones humanizadas de los anticuerpos monoclonales de ratón hechos por medio de la tecnología de ADN recombinante, a partir de las secuencias de ADN genómico de ratón y/o humano que codifican las cadenas H y L o de clones de ADNc que codifican las cadenas H y L.

Alternativamente, los anticuerpos monoclonales de acuerdo con estas modalidades pueden ser anticuerpos monoclonales humanos. Estos anticuerpos monoclonales humanos se preparan, por ejemplo, por medio de una repoblación de linfocitos de sangre periférica humana (PBL, por sus siglas en inglés) de ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID, por sus siglas en inglés) como se describe en el documento PCT/EP99/03605 o por medio del uso de animales transgénicos no humanos que son capaces de producir anticuerpos humanos como se describe en la patente de los Estoados Unidos 5,545,806. También los fragmentos derivados de estos anticuerpos monoclonales tales como Fab, F(ab')2 y scFv ("fragmento variable de cadena individual"), condición de que hayan retenido las propiedades originales de enlace, forman parte de lo que se da conocer en este documento. Estos fragmentos, se generan comúnmente por medio de, por ejemplo, la digestión enzimática de los anticuerpos con papaína, pepsina u otras proteasas . De acuerdo con modalidades particulares, el inhibidor selectivo de PlGF es un fragmento de un anticuerpo, fragmento el cual se enlaza específicamente al factor de crecimiento placentario. De acuerdo con modalidades particulares, el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento variable de cadena individual (scFv) .

De acuerdo con modalidades específicas, la preparación de los fragmentos F(ab')2 o los fragmentos Fab monovalentes es por ejemplo de la siguiente manera: con el propósito de preparar los fragmentos F(ab')2, el anticuerpo monoclonal puede ser dializado durante toda la noche contra un amortiguador de citrato 0.1 mol/L (pH 3.5). El anticuerpo (200 partes) luego se digiere por medio de la incubación con pepsina (1 parte) disponible de Sigma (Saint-Louis , Missouri) durante 1 hora a 37°C. La digestión se detiene consecuentemente al agregar 1 volumen de amortiguador de Tris HC1 1 M (pH 9) a 10 volúmenes de anticuerpo. Los fragmentos Fab monovalentes se pueden preparar por medio de la digestión con papaína de la siguiente manera: 1 volumen de un amortiguador de fosfato 1 M (pH 7.3) se agrega a 10 volúmenes del anticuerpo monoclonal, luego 1 volumen de papaína (Sigma) se agrega a 25 volúmenes del amortiguador de fosfato que contiene un anticuerpo monoclonal, HCl de L-Cisteína 10 mmol/1 (Sigma) y ácido etilen-diaminotetra-acético 15 mmol/1 (referido en lo sucesivo como EDTA) . Después de la incubación durante 3 horas a 37 °C, la digestión se detiene al agregar una concentración final de 30 mmol/1 de solución de yodoacetamida preparada recientemente (Sigma) , manteniendo la mezcla en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los fragmentos tanto F(ab')2 como Fab se pueden purificar adicionalmente de los fragmentos intactos, contaminantes de IgG y Fe utilizando proteína A SepharoseMR. Los fragmentos purificados se pueden dializar finalmente contra solución salina amortiguada con fosfato (en este documento referida posteriormente como PBS) . La pureza de los fragmentos se puede determinar por medio de la electroforesis de gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida y la concentración de proteínas se puede medir utilizando el Reactivo A del Ensayo de Proteína de ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, Illinois) .

Es bien sabido para la persona experta en el campo que los anticuerpos (monoclonales) , o fragmentos de los mismos, se pueden modificar para varios usos. A los anticuerpos implicados en la invención se les puede colocar una etiqueta apropiada de tipo enzimático, fluorescente o radioactivo.

Los ejemplos de anticuerpos anti-PlGF están bien documentados en el campo. Incluyen, pero no están limitados a, aquel descrito por Fischer (Fischer y colaboradores, 2007) o el anticuerpo monoclonal de murino Mab-PL5D11 (documento WO01/85796; este anticuerpo monoclonal está disponible en the VIB Vesalius Research Center, UZ Gasthuisberg, Herestraat 49, B-3000 Leuven) . Otros anticuerpos, tal como el anticuerpo 16D3, se describen por ejemplo en el documento EP1869085. También el documento WO2004/002524 describe como generar anticuerpos anti-PlGF. Tanto el documento EP1869085 como el documento WO2004/002524 se incorporan por este acto a manera de referencia. Por otra parte, los anticuerpos anti-PlGF también están disponibles comercialmente, por ejemplo de Santa Cruz Biotechnology Inc, Abcam, Novus biologicals, R&D systems, Sigma-Aldrich y muchas más compañías.

Se debe entender que los métodos anteriores también tienen aplicación para la generación de otros anticuerpos, por ejemplo para la generación de anticuerpos anti -VEGFR- 1 , los cuales son inhibidores no selectivos del P1GF.

Otros inhibidores del PlGF, particularmente inhibidores selectivos del PlGF, incluyen, pero no están limitados a, péptidos, péptidos tetraméricos , proteínas, moléculas orgánicas o fragmentos u homólogos de los mismos que tienen un efecto neutralizante como se estableciera anteriormente. Los inhibidores adicionales en esta lista no exhaustiva son moléculas de ARN y ADN antisentido y ribozimas que funcionan para inhibir la traducción del PlGF, aptámeros de péptidos (por ejemplo, ARNpis (ARN pequeños de interferencia) (por ejemplo Santa Cruz Biotechnology Inc) , AR s de horquilla o AR shs (por ejemplo Santa Cruz Biotechnology Inc), morfolinos, nanocuerpos y moléculas pequeñas. Muchos de estos inhibidores (selectivos así como también no selectivos) están disponibles comercialmente . Algunos de los posibles inhibidores serán planteados adicionalmente en este documento.

Las moléculas pequeñas, por ejemplo moléculas orgánicas pequeñas, y otros candidatos farmacológicos se pueden obtener, por ejemplo, de colecciones de productos combinatorios y naturales. Para seleccionar las moléculas candidatas/de prueba, se pueden utilizar por ejemplo líneas de células que expresan el VEGFR-1 y la transducción de señales es supervisada como se describe detalladamente en el documento WO 01/85796 el cual se incorpora en este documento a manera de referencia.

El monitoreo se puede medir utilizando técnicas bioquímicas estándar. Otras respuestas tales como la activación o supresión de la actividad catalítica, fosforilación (por ejemplo la fosforilación de tirosina del dominio intracelular del receptor) o desfosforilación de otras proteínas, activación o modulación de la producción del segundo mensajero, cambios en los niveles celulares de iones, asociación, disociación o translocación de moléculas de señalización o transcripción o traducción de genes específicos también se pueden supervisar. Estos ensayos se pueden realizar utilizando técnicas convencionales desarrolladas para estos propósitos en el curso de la selección. La inhibición del enlace de ligandos a su receptor celular puede afectar, por vía de las rutas de transducción de señales, una variedad de procesos celulares. Los procesos celulares bajo control de la ruta de señalización de VEGFR-1/P1GF pueden incluir, pero no están limitados a, funciones celulares normales, proliferación, diferenciación, mantenimiento de la forma de las células y adherencia, además de procesos anormales o potencialmente perjudiciales tales como la proliferación desregulada de células, pérdida de inhibición de contacto, bloqueo de diferenciación o muerte celular. La observación cualitativa o cuantitativa y la medición de cualquiera de los procesos celulares descritos por medio de técnicas conocidas en el campo se pueden utilizar ventajosamente como un medio para registrar la transducción de señales en el curso de la selección.

Una manera alternativa de seleccionar las moléculas pequeñas es por vía de un diseño in silico. La estructura de cristal del factor de crecimiento placentario humano está disponible (PDB Código: 1FZV) , de modo que ésta también puede servir como una plataforma para las selecciones adicionales de antagonistas de moléculas pequeñas. Una molécula inhibidora o una serie de moléculas se puede diseñar con base en la estructura del P1GF, después de lo cual se pueden validar utilizando selecciones como se describe anteriormente .

Las colecciones de péptidos aleatorios, tales como las colecciones de péptidos tetraméricos descritas adicionalmente en este documento, que consisten de todas las combinaciones posibles de aminoácidos unidos al soporte en fase sólida se pueden utilizar para identificar péptidos que son capaces de enlazarse al sitio de enlace a ligandos de un receptor determinado u otros dominios funcionales de un receptor tal como los dominios de cinasa (Lam y colaboradores, 1991). La selección de colecciones de péptidos puede tener valor terapéutico en el descubrimiento de agentes farmacéuticos que actúan para inhibir la actividad biológica de receptores a través de sus interacciones con el receptor determinado. La identificación de moléculas que son capaces de enlazarse al P1GF (u opcionalmente al VEGFR-1) se puede realizar por medio de la selección de una colección de péptidos con la proteína de PlGF recombinante (o proteína de VEGFR-1 soluble) . Por ejemplo, los dominios de enlace a cinasa y ligandos extracelulares del VEGFR-1 pueden ser expresados por separado y se pueden utilizar para seleccionar colecciones de péptidos. Además del uso de moléculas solubles de VEGFR-1, en otra modalidad, es posible detectar péptidos que se enlacen a receptores de la superficie celular utilizando células intactas. Las células utilizadas en esta técnica pueden ser células ya sea vivas o fijas. Las células serán incubadas con la colección de péptidos aleatorios y se enlazarán a ciertos péptidos en la colección para formar una "roseta" entre las células objetivo y el soporte en fase sólida/péptido relevante. Después, la roseta se puede aislar por medio de la centrifugación diferencial o se puede eliminar físicamente bajo un microscopio de disección.

En una modalidad específica, las formas mutantes transdominantes negativas de los receptores de VEGF (por ejemplo, un receptor transdominante negativo del VEGF-R1) se pueden utilizar para inhibir la transducción de señales del PlGF. El uso de las formas mutantes transdominantes negativas de los receptores de VEGF se describe completamente en la Patente de los Estados Unidos 5,851,999. Por otra parte, la tirosina cinasa 1 similar a fms soluble de la placenta (sFltl) , una variante de empalme de la Fitl del receptor de VEGF que carece de los dominios transmembrana y citoplásmico, se sabe que actúa como un antagonista potente del PlGF (Kendall y colaboradores, 1996; Shibuya, 2001) y las proteínas de fusión de VEGFR1 solubles (Aiello y colaboradores, 1995) se pueden utilizar in vivo para inhibir la actividad del PlGF. Sin embargo, aunque es exitoso por derecho propio, el uso de los receptores dominantes negativos puede tener la desventaja de no ser inhibidores selectivos del PlGF por sí solos. De esta manera, de acuerdo con modalidades específicas, el inhibidor de PlGF no es un receptor transdominante negativo.

El ARN tiene distintas ventajas sobre las moléculas orgánicas pequeñas cuando se considera su uso para inactivar la función de proteínas in vivo. Una secuencia de codificación de ARN se puede unir a un promotor y este gen artificial se puede introducir en células u organismos. Dependiendo de la secuencia regulatoria incluida, esto proporciona una manera única de construir un gen supresor específico del tiempo y/o tejido. Estos genes que expresan ARN son usualmente más pequeños que los genes que codifican proteínas y se pueden insertar fácilmente en vectores de terapia génica. A diferencia de una proteína extraña o alterada, es menos probable que el ARN evoque una respuesta inmune. Se han desarrollado moléculas antisentido y ribozimas como "bloqueadores de códigos" para inactivar la función de genes, con la promesa de un diseño racional de fármacos y una especificidad superlativa (Altman, 1995; Matteucci y agner, 1996) . Mecánicamente, se espera que tanto los oligodesoxinucleótidos antisentido ("ODNs") como las ribozimas biodiseñadas logren un enlace específico en el primer paso de su acción al formar una estructura dúplex estable (o estructura triplex en algunos casos de los ODNs) con una secuencia de nucleótidos objetivo con base en el apareamiento de bases de Watson-Crick o Hoogsteen.

En ciertas modalidades, un inhibidor de PlGF puede ser un aptámero. Los métodos para construir y determinar las características de enlace de los aptámeros son bien conocidos en el campo. Por ejemplo, estas técnicas se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,582,981, 5,595,877 y 5,637,459, cada una incorporada en este documento a manera de referencia .

Los aptámeros se pueden preparar por medio de cualquier método conocido, incluyendo métodos sintéticos, recombinantes y de purificación, y se pueden utilizar solos o en combinación con otros ligandos específicos para el mismo objetivo. En general, un mínimo de aproximadamente 3 nucleótidos, preferiblemente por lo menos 5 nucleótidos, es necesario para efectuar un enlace específico. Los aptámeros de secuencias más cortas que 10 bases pueden ser factibles, aunque se pueden preferir los aptámeros de 10, 20, 30 o 40 nucleótidos .

Es necesario que los aptámeros contengan la secuencia que confiere la especificidad de enlace, pero pueden ser extendidos con regiones flanqueadoras y derivatizados de otra manera. En modalidades particulares, las secuencias de aptámeros de enlace al P1GF pueden ser flanqueadas por secuencias de enlace a cebadores, facilitando la amplificación de los aptámeros por medio de PCR u otras técnicas de amplificación. En una modalidad adicional, la secuencia flanqueadora puede comprender una secuencia específica que reconoce o se enlaza preferiblemente a una porción para mejorar la inmovilización del aptámero a un substrato .

Los aptámeros pueden ser aislados, secuenciados y/o amplificados o sintetizados como moléculas de ADN o ARN convencionales. Alternativamente, los aptámeros de interés pueden comprender oligómeros modificados. Cualquiera de los grupos hidroxilo que están presentes ordinariamente en los aptámeros pueden ser reemplazados por grupos fosfonato, grupos fosfato, pueden ser protegidos por un grupo protector estándar o pueden ser activados para preparar uniones adicionales a otros nucleótidos o pueden ser conjugados a soportes sólidos. Una o más uniones de fosfodiéster pueden ser reemplazadas por grupos de unión alternativos, tales como P(0)0 reemplazado por P(0)S, P(0)NR 2, P(0)R, P(0)0R', CO o CNR 2, en donde R es H o alquilo (de 1 a 20 átomos de carbono) y R' es alquilo (de 1 a 20 átomos de carbono) ; además, este grupo se puede unir a nucleótidos adyacentes a través de 0 o S . No es necesario que todas las uniones en un oligómero sean idénticas.

Los aptámeros utilizados como materiales de partida para determinar las secuencias de enlace específico pueden ser ADN o A N de cadena individual o de doble cadena. En una modalidad particular, las secuencias son ADN de cadena individual, el cual es menos susceptible a la degradación por nucleasa que el ARN. De acuerdo con modalidades particulares, el aptámero de partida contendrá una porción de secuencia aleatorizada, que incluye generalmente de aproximadamente 10 a 400 nucleótidos, particularmente de 20 a 100 nucleótidos. La secuencia aleatorizada es flanqueada por secuencias de cebadores que permiten la amplificación de aptámeros encontrados para unirse al objetivo. Para la síntesis de las regiones aleatorizadas , las mezclas de nucleótidos en las posiciones donde se desea la aleatorizacion se pueden agregar durante la síntesis.

Los métodos para la preparación y selección de aptámeros que se enlazan a objetivos particulares de interés son bien conocidos, por ejemplo la Patente de los Estados Unidos No. 5,475,096 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,270,163, cada una incorporada a manera de referencia. La técnica implica generalmente la selección de una mezcla de aptámeros candidatos e iteraciones escalonadas de enlace, separación de aptámeros enlazados de aquellos no enlazados y amplificación. Debido a que solo un número muy pequeño de secuencias (posiblemente solo una molécula de aptámero) que corresponde a los aptámeros de afinidad más alta existe en la mezcla, es deseable generalmente establecer los criterios de división de modo que una cantidad significativa de aptámeros en la mezcla (aproximadamente 5-50%) sea retenida durante la separación. Cada ciclo da por resultado un enriquecimiento de aptámeros con alta afinidad por el objetivo. La repetición por entre tres a seis ciclos de selección y amplificación se puede utilizar para generar aptámeros que se enlazan con afinidad y especificidad altas al objetivo, tal como el PlGF.

De acuerdo con modalidades particulares, los aptámeros son aptámeros de ARN los cuales interactúan específicamente con el PLGF u opcionalmente con el VEGF-R1 u otras sustancias diferentes de ácido nucleico de la ruta de señalización de VEGFR-l/PlGF. Estos se pueden utilizar como reactivos terapéuticos. Los aptámeros de ARN se utilizan por su capacidad para alterar directamente la función de una proteína. La selección de aptámeros in vitro permite el aislamiento rápido de ARNs extremadamente raros que tienen una alta especificidad y afinidad por proteínas específicas. Los aptámeros de ARN ejemplares se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 5,270,163 de Gold y colaboradores y documentos de Ellington y Szostak, 1990, y Tuerk y Gold, 1990. A diferencia de los compuestos antisentido, cuyos objetivos son entramados unidimensionales, los aptámeros de ARN se pueden enlazar a superficies tridimensionales de una proteína. Por otra parte, los aptámeros de ARN pueden diferenciar frecuentemente con precisión entre sitios funcionales discretos de una proteína (Gold y colaboradores, 1995) . Como los reactivos terapéuticos, los aptámeros no solo tienen las ventajas combinadas de los anticuerpos y los fármacos de masa molecular pequeña, sino que la producción in vivo de los aptámeros de ARN también puede ser controlada genéticamente. La expresión controlada de aptámeros de ARN de alta afinidad ofrece un medio para inactivar rápidamente dominios específicos de proteínas y valorar en consecuencia su función y mecanismo de acción.

Toóle y colaboradores en la Patente de los Estados Unidos No. 5,840,867 y Grossman y colaboradores en la Patente de los Estados Unidos No. 6,207,388 dan a conocer métodos para hacer aptámeros y aptámeros que se enlazan a biomoléculas . Estos aptámeros se pueden utilizar para interferir con la función biológica normal de las biomoléculas, como una herramienta de separación, una herramienta de diagnóstico o una herramienta terapéutica. Los aptámeros descritos por Toóle y colaboradores pueden ser ARN o ADN de cadena individual o dúplex.

Korth y colaboradores (Korth y colaboradores, 1997) han aplicado aptámeros de ARN de cadena individual dirigidos contra la proteína priónica de hámster dorado de Siria y los aptámeros fueron capaces de reconocer su objetivo específico dentro de una mezcla de cientos de diferentes proteínas. Davis (1994) describió un aptámero de ADN de cadena individual que se enlaza al sitio activo de trombina y exhibe efectos anti-coagulación in vivo.

Rajendran, Manjula y colaboradores (US20020127581) proporcionan métodos para la selección in vitro de aptámeros de señalización que comprenden los pasos que consisten en sintetizar una reserva de ADN, el ADN tiene un inserto aleatorio de nucleótidos de una relación en mol desequilibrada, específica; amplificar la reserva de ADN; transcribir una reserva de ARN del ADN amplificado utilizando un nucleótido etiquetado de manera fluorescente; aplicar la reserva de ARN etiquetada de manera fluorescente a una columna de afinidad para retirar las moléculas de ARN fluorescentes de alta afinidad de la reserva de ARN etiquetada de manera fluorescente; obtener una reserva de ADNc de las moléculas de ARN fluorescentes de alta afinidad; repetir los pasos de ampliación y selección sobre las moléculas de ARN fluorescentes y clonar las moléculas de ARN fluorescentes para producir aptámeros de señalización. Los aptámeros de señalización que comprenden moléculas de ADN también se seleccionan.

También se proporciona en este documento un aptámero de señalización que transduce el cambio conformacional con el enlace a un ligando a un cambio en la intensidad de fluorescencia del aptámero de señalización.

De esta manera, los aptámeros se pueden diseñar para interactuar específicamente con sustancias diferentes de ácidos nucleicos, tales como PlGF o VEGFR1. Los aptámeros pueden funcionar como receptores de alta afinidad para el PlGF o pueden interactuar estrechamente con el PlGF (u opcionalmente el VEGFR1) . El plegamiento de una molécula inicialrnente no estructurada alrededor del PLGF o el VEGFR1 y la formación de una red enlazada por hidrógeno con el PLGF o VEGFR1 facilitan este enlace neutralizante.

Sin embargo, los aptámeros también pueden ser catalíticos. Los aptámeros que son catalíticos se consideran ribozimas aproximadas o aptazimas. Los aptámeros también se pueden diseñar para interactuar específicamente con sustancias de ácido nucleico, fuera de enlazarlas simplemente con base en el apareamiento de bases de atson-Crick entre bases en secuencias de ácido nucleico de orientación opuesta.

Estos aptámeros, si son catalíticos, pueden ser denominados justamente aptazimas. Esta acción específica puede ser buscada para propósitos terapéuticos.

La producción de aptámeros a base de AR de 2'-Fluoropirimidina para la forma de 165 aminoácidos del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF165) , una proteína con 53% de homología de secuencias con el PlGF, ha sido descrita detalladamente por Ruckman y colaboradores, 1998 y Bridonneau y colaboradores, 1999. Utilizando el proceso SELEX (descrito anteriormente, patente de los Estados Unidos de Gold y colaboradores) se aislaron los ligandos de oligonucleótidos de ARN de 2 ' -F-pirimidina (aptámeros) para el VEGF165 humano. Estos aptámeros también se enlazaron a los heterodímeros del VEGF165 y P1GF123 y probablemente también a las isoformas más largas tal como la isoforma P1GF152. Los aptámeros representativos de tres familias de secuencias distintas fueron truncados a la secuencia mínima con capacidad de enlace de alta afinidad al VEGF (23-29 nucleótidos) y fueron modificados adicionalmente por medio del reemplazo de 2'-0-metilo por 2' -OH en todas las posiciones de ribopurina donde se toleró la sustitución. Este protocolo puede ser utilizado por una persona experta en el campo para la manufactura de aptámeros anti-PlGF neutralizantes. Un aptámero de VEGF (MacugenMR, PEG-aptanib sódico) también es el primer aptámero terapéutico que es administrado a humanos y actualmente está siendo comercializado para pacientes con una degeneración macular relacionada con la edad.

También dentro del alcance de los inhibidores como se describe en este documento se encuentran las secuencias de oligorribonucleótidos , que incluyen moléculas de ARN catalizadoras tales como ribozimas que funcionan para inhibir la traducción de ARNm de VEGFR-1 o ARNm de PlGF.

Se sabe que una variedad de moléculas de ARN son activas como catalizadores y no sirven solamente como el medio por el cual la información se traslada del núcleo.

Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la escisión específica del ARN. El mecanismo de acción de las ribozimas implica la hibridación específica de secuencias de la molécula de ribozima al ARN objetivo complementario, seguida por una escisión endonucleolítica . Se entiende que la actividad de autoescisión o escisión diferente del ARN de las ribozimas es dependiente de la estructura secundaria del ARN, la cual puede ser dependiente de factores tales como la secuencia de bases y la inclusión de ubicaciones de metal. Las ribozimas tienen gran utilidad en el control de manera artificial de la expresión de genes. Se puede tomar ventaja de los patrones de cargas muy específicos de los ácidos nucleicos, sus bases y estructuras principales y capacidad del ADN para formar una estructura secundaria predecible con base en la secuencia de bases y el apareamiento de bases predecible de atson-Crick . Las dimensiones pequeñas y el carácter flexible del ácido nucleico lo hacen muy adecuado para construir complejos capaces de reconocer y enlazarse específicamente a las características en otras sustancias, tales como proteínas. A través de la selección promovida por SELEX (Patente de los Estados Unidos No. 5,567,588 de Gold y colaboradores), la cual depende del enlace a ácidos nucleicos de cadena individual montados sobre biochips, los investigadores han descubierto ribozimas las cuales son 100 o incluso 1000 veces más activas catalíticamente. Fernandez y colaboradores (2001) reportan datos recolectados de un cambio conformacional de molécula individual en una ribozima. Fernandez y colaboradores también reportan que estas estructuras de ácido nucleico esencialmente dúplex se someten a "todas o ninguna de" las transiciones discretas en la conformación, no el enlace por pares progresivo que uno esperaría.

Un ARN circular que tiene actividad enzimática para escindir una molécula de ARN separada en un sitio de escisión y moléculas de ARN capaces de conferir estabilidad al ARN in vivo a través de una proteína de enlace de ribozima endógena se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 5,712,128 de Been y colaboradores y la Patente de los Estados Unidos No. 5,985,620 de Sioud.

Los sitios de escisión de ribozima específicos dentro de cualquier objetivo de ARN potencial son identificados inicialmente por medio de la exploración de la molécula objetivo para los sitios de escisión de ribozima, los cuales incluyen las siguientes secuencias, GUA, GUU y GUC. Una vez identificadas, las secuencias cortas de ARN de entre 15 y 20 ribonucleótidos que corresponden a la región del gen objetivo que contiene el sitio de escisión pueden ser evaluadas por características estructurales previstas tal como una estructura secundaria que puede volver inadecuada la secuencia de oligonucleótidos . La idoneidad de los objetivos candidatos también puede ser evaluada al someter a prueba su accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios, utilizando ensayos de protección de ribonucleasa .

Otra manera de proporcionar la inhibición es el uso de moléculas de ribozima con configuración de cabeza de martillo que catalizan específica y eficientemente la escisión endonucleolítica de secuencias de ARN de PlGF (u opcionalmente VEGFR-1) para el tratamiento de la leucemia con cromosoma Filadelfia positivo en un sujeto, preferiblemente un mamífero y todavía más preferiblemente un humano. La ribozima anti -VEGFR-1 , tal como una Angiozima, la cual ha sido desarrollada contra el ARNm del VEGFR-1 por Ribozyme Pharmaceuticals Inc, Boulder, Colorado 80301, EUA ya ha sido utilizada en la terapia contra el cáncer (Weng y Usman, 2001; Paveo y colaboradores, 2000). Esta Angiozima, entre otras moléculas de ARN catalíticas anti-VEGFR-1 se puede utilizar para la inhibición de la actividad del receptor de PlGF, la cual regula por decremento la función del receptor de PlGF al escindir específicamente los ARNms para los receptores primarios de PlGF, VEGFR-1. Las pruebas clínicas de una ribozima anti-VEGFR-1 están actualmente en progreso para el cáncer de mama .

Otros inhibidores contemplados en este documento son las secuencias de oligorribonucleótidos , que incluyen moléculas de ARN y ADN antisentido y construcciones de ARNpi las cuales son homologas a una parte de la secuencia de ARNm del gen de PlGF o su receptor el ARNm del VEGFR-1. La interferencia de ARN o "iARN" es un término acuñado inicialmente por Fire y colaboradores para describir la observación que el ARN de doble cadena (ARNdc) puede bloquear la expresión de genes (Fire y colaboradores, 1998) . El ARNdc dirige el silencionamiento pos-traducción específico de genes en muchos organismos, inclusive vertebrados, y ha probado ser una nueva herramienta para estudiar la función de genes. La iARN implica la degradación del ARNm. El PlGF puede ser silenciado por medio de un método de silenciamiento pos-transcripcional selectivo de la expresión del PlGF en una célula de interés que comprende introducir en la célula una construcción de ARNpi la cual es homologa a una parte de la secuencia de ARNm del gen de PlGF. La presente invención proporciona un método para tratar la leucemia con Ph+ en un sujeto mediante el silenciamiento génico pos-trancripcional por medio de la interferencia de ARN (iARN) de la expresión de PlGF en células y/o por medio de la interferencia de ARN (iARN) de la expresión del VEGFR-1 en células. Este es un método de importancia particular in vivo en un paciente humano. Del mismo modo, el uso de la iARN del PlGF esta contemplado para el tratamiento de la leucemia con Ph+ .

El ARNdc utilizado para iniciar la iARN se puede aislar de una fuente nativa o se puede producir mediante medios conocidos, por ejemplo se puede transcribir del ADN. Por ejemplo, el enlace de una ARN polimerasa a un promotor (que significa cualquier secuencia de doble cadena de ADN que comprende un sitio de enlace reconocido por una ARN polimerasa dependiente de ADN) permite el inicio de la transcripción. Muchas secuencias promotoras conocidas se pueden utilizar para producir el ARNdc, por ejemplo, pero no limitado a, las secuencias reconocidas por las ARN polimerasas de los fagos T7, T3 o SP6. Sin embargo, esto no representa una limitación debido a que parece claramente para una persona experta en el campo que se puede utilizar cualquier secuencia promotora identificada como tal y para la cual está disponible la ARN polimerasa correspondiente. Alternativamente, las dos cadenas de ADN utilizadas para formar el ARNdc pueden pertenecer a la misma o dos estructuras dúplex diferentes en las cuales cada una se forma con una cadena de ADN de secuencia por lo menos parcialmente complementaria. Cuando el ARNdc es producido de esta manera, la secuencia de ADN que es transcrita está flanqueada por dos promotores, uno que controla la transcripción de una de las cadenas y el otro que controla aquella de la cadena complementaria. Estos dos promotores pueden ser idénticos o diferentes. De hecho, de acuerdo con la Patente de los Estados Unidos No. 5,795,715, una estructura dúplex de ADN proporcionada en cada extremo con una secuencia promotora puede generar directamente ARNs de longitud definida y los cuales pueden unirse en pares para formar un ARNdc.

El ARNdc, ya sea de origen sintético o natural, se sujeta a una degradación rápida por medio de nucleasas que están presentes en los sueros de varias especies de animales, particularmente los primates. Consecuentemente, los procedimientos que involucran el ARNdc utilizan generalmente cristalería para horno en todo momento, y todos los amortiguadores se filtran, por ejemplo a través de un filtro de 45 micrómetros NalgeneMR, por esterilidad. Se debe utilizar agua doblemente destilada libre de pirógenos para todas las soluciones para minimizar cualquier posibilidad de contaminación de endotoxinas .

La concentración de la solución de ARNdc se puede determinar a partir de su espectro de luz UV. Por ejemplo, la concentración molar del ARNdc natural o sintético se determina a partir de la densidad óptica (OD, por sus siglas en inglés) a 260 nm utilizando un coeficiente de extinción, que se puede obtener de la bibliografía o se puede determinar utilizando procedimientos estándar: 44.7 veces OD260=microgramos de ARNdc/mi .

Si es apropiado, la solución de AR dc se puede diluir con un amortiguador libre de pirógenos para facilidad en la manipulación. El ARNdc resultante se puede unir opcionalmente a un soporte; o a un ligando, tal como biotina, el cual se puede vincular a un soporte revestido con avidina. Esto permite la cuantif cación directa, cuando se utiliza como una herramienta analítica.

De acuerdo con una modalidad particular, las composiciones de ARNdc de la presente invención se preparan como una composición farmacéutica para el tratamiento de sujetos, particularmente para el tratamiento de pacientes humanos. Más particularmente, las composiciones farmacéuticas se administran para tratar la leucemia con cromosoma Filadelfia positivo en pacientes humanos. En modalidades alternativas, las composiciones se utilizan para crear organismos modelo "genéticamente deficientes" funcionales, aquellos en los cuales está defectuoso un gen objetivo, o en este caso, se inhibe la expresión. La composición farmacéutica de ARNdc se puede administrar de manera locorregional al paciente. Las composiciones farmacéuticas de ARNdc de la presente invención contienen preferiblemente un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable que es adecuado para hacer que el compuesto o la mezcla sea administrable por ejemplo por la ruta parenteral, intravenosa, intradérmica, intramuscular, subcutánea o transdérmica . Los ingredientes activos se pueden mezclar o combinar con cualquier portador o excipiente convencional, farmacéuticamente aceptable.

Los ARNpis seleccionados para silenciar el gen de VEGFRl con alta probabilidad de funcionalidad y para destruir más de 90% del ARNm están disponibles de Dharmacon Inc. Lafayette, CO 80026, EUA. Una reserva de varias estructuras dúplex diferentes de ARNpi todas las cuales están dirigidas contra un gen objetivo, llamada reserva SMART/selección SMART se utiliza como una tecnología eficiente para silenciar el gen de VEGFRl y/o el gen de PlGF. Los ARNpis contra el PlGF también están disponiles comercialmente (por ejemplo Santa Cruz Biotechnology Inc.).

Las moléculas de ARN y ADN antisentido actúan para bloquear directamente la traducción del ARNm por medio del enlace al ARNm dirigido y al prevenir la traducción de proteínas. Con respecto al ADN antisentido, los oligodesoxirribonucleótidos derivados del sitio de iniciación de la traducción, por ejemplo entre las regiones -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos del VEGFR-1 o PlGF, están contemplados particularmente. Por ejemplo, la regulación por decremento de otro receptor de tirosina cinasa, receptor del VEGFR2 , lograda por medio de la transfección de oligonucleótidos antisentido del VEGFR2 , ya ha sido lograda por medio de la tecnología antisentido estándar (Berard y colaboradores, 1997) . Por otra parte, se ha demostrado in vivo que los oligonucleótidos antisentido (AS) dirigidos contra el receptor del PlGF VEGFRl bloquean la angiogénesis (Marchand y colaboradores, 2002) . Por otra parte, la inhibición antisentido de la producción de proteínas del PlGF ya ha sido demostrada por Yonekura y colaboradores (1999) .

Las moléculas tanto de ARN como de ADN antisentido así como también las ribozimas se pueden preparar por medio de cualquier método conocido en el campo para la síntesis de moléculas de ARN (o ADN) . Estos incluyen técnicas para sintetizar químicamente oligodesoxirribonucleótidos bien conocidas en el campo tal como por ejemplo la síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Alternativamente, las moléculas de ARN se pueden generar por medio de la transcripción in vitro e in vivo de secuencias de ADN que codifican la molécula de ARN antisentido. Estas secuencias de ADN se pueden incorporan en una amplia variedad de vectores, los cuales incorporan promotores de ARN polimerasa adecuados tales como los promotores de polimerasa T7 o SP6. Alternativamente, las construcciones de ANDc antisentido que sintetizan constitutiva o induciblemente el ARN antisentido, dependiendo del promotor utilizado, se pueden introducir de manera estable en líneas de células.

En una modalidad específica, debe ser claro que el método terapéutico de la presente invención para el tratamiento de la leucemia con cromosoma Filadelfia positivo también se puede utilizar en combinación con cualquier otra terapia conocida en el campo para el tratamiento de la leucemia con Ph+ . Las terapias contempladas particularmente incluyen inhibidores de proteína tirosina cinasa, particularmente inhibidores de BCR/ABL, por ejemplo imatinib y similares.

El término "medicamento" como se utiliza en la solicitud se refiere a una composición que comprende moléculas (inhibidores) como se describiera anteriormente y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable (ambos términos se pueden utilizar de manera intercambiable) para tratar enfermedades como se indica anteriormente. Los portadores o excipientes adecuados que son conocidos para la persona experta son solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, solución de Hank, aceites fijos, oleato de etilo, dextrosa al 5% en solución salina, sustancias que mejoran la isotonicidad y estabilidad química, amortiguadores y conservadores. Otros portadores adecuados incluyen cualquier portador que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos nocivos para el individuo que recibe la composición tales como proteínas, polisacáridos , ácidos polilácticos , ácidos poliglicólicos , aminoácidos poliméricos y copolímeros de aminoácidos. El "medicamento" se puede administrar por medio de cualquier método adecuado dentro del conocimiento de la persona experta. La ruta de administración preferida es la ruta parenteral .

En la administración parenteral, el medicamento de esta invención será formulado en una forma inyectable de dosificación unitaria tal como una solución, suspensión o emulsión, en relación con los excipientes farmacéuticamente aceptables que se definieran anteriormente. Sin embargo, la dosificación y el modo de administración dependerán del individuo. Generalmente, el medicamento se administra de modo que el inhibidor de P1GF (por ejemplo proteína, polipéptido, péptido, ácido nucleico, compuesto o molécula) se administra en una dosis entre 1 µg/kg y 10 mg/kg, más particularmente entre 10 µg/kg y 5 mg/kg, mucho más particularmente entre 0.1 y 2 mg/kg. Preferiblemente, se administra como una dosis de bolo. La infusión continua también se puede utilizar e incluye el suministro subcutáneo continuo por vía de una minibomba osmótica. Si es así, el medicamento se puede infusionar en una dosis entre 5 y 20 µg/kg/minuto, más particularmente entre 7 y 15 .

Como se utiliza en este documento, el término "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y la totalidad de solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungales , agentes isotónicos, agentes retardadores de la absorción y similares. El uso de estos medios y agentes para las sustancias activas, farmacéuticas es bien conocido en el campo. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con las composiciones de esta invención, su uso en la formulación terapéutica está contemplado. Los ingredientes activos, complementarios también se pueden incorporar en las formulaciones farmacéuticas .

Será entendido por aquellas personas expertas en el campo que cualquier modo de administración, vehículo o portador empleado convencionalmente y el cual es inerte con respecto al agente activo se puede utilizar para preparar y administrar las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Los métodos, vehículos y portadores ilustrativos son aquellos descritos, por ejemplo, en emington's Pharmaceutical Sciences, 4a ed. (1970), la descripción del cual se incorpora en este documento a manera de referencia. Aquellas personas expertas en el campo, que han sido expuestas a los principios de la invención, no experimentarán dificultad en la determinación de los vehículos, excipientes y portadores adecuados y apropiados o en la combinación de los ingredientes activos con los mismos para formar las composiciones farmacéuticas de la invención.

La cantidad terapéuticamente efectiva de agente activo que se incluye en la composición farmacéutica de la invención depende, en cada caso, de varios factores, por ejemplo el tipo, tamaño y condición del paciente que es tratado, el modo propuesto de administración, la capacidad del paciente para incorporar la forma de dosificación propuesta, etcétera. Generalmente, una cantidad de agente activo se incluye en cada forma de dosificación para proporcionar de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 250 mg/kg y particularmente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 mg/kg. Una "cantidad terapéutica" o una cantidad terapéuticamente efectiva utilizada en este documento es una cantidad que mejora uno o más síntomas de una enfermedad. Esta cantidad dependerá típicamente del inhibidor y la gravedad de la enfermedad, pero puede ser decidida por la persona experta, posiblemente a través de la experimentación de rutina.

Otro aspecto de la administración para el tratamiento es el uso de una terapia génica para suministrar el gen antisentido mencionado anteriormente o partes funcionales del gen de P1GF o una ribozima dirigida contra el ARNm de P1GF o una parte funcional de la misma. Terapia génica significa el tratamiento por medio del suministro de ácidos nucleicos terapéuticos a las células del paciente. Esto se revisa extensivamente en Lever y Goodfellow 1995; Br. Med Bull., 51, 1-242; Culver y colaboradores, 1995; Ledley, 1995. Para lograr la terapia génica debe existir un método de suministro de genes a las células del paciente y métodos adicionales para asegurar la producción efectiva de cualquier gen terapéutico.

Los protocolos de la terapia génica, proyectados para lograr la expresión del producto génico terapéutico en células objetivo, in vitro, pero también particularmente in vivo, han sido descritos extensivamente en el campo. Estos incluyen, pero no están limitados a, la inyección intramuscular de ADN del plásmido (desnudo o en liposomas) , inyección intersticial, instilación en las vías respiratorias, aplicación al endotelio, parénquima intra-hepática y administración intravenosa o intra-arterial (por ejemplo arteria intra-hepática, vena intra-hepática) . Se han desarrollado varios dispositivos para mejorar la disponibilidad del ADN para la célula objetivo. Un planteamiento simple es poner en contacto físicamente la célula objetivo con catéteres o materiales implantables que contienen ADN. Otro planteamiento es utilizar dispositivos de inyección a chorro, sin agujas los cuales proyectan una columna de líquido directamente dentro del tejido objetivo bajo alta presión. Estos paradigmas de suministro también se pueden utilizar para suministrar vectores virales. Otro planteamiento para el suministro dirigido de genes es el uso de conjugados moleculares, los cuales consisten de ligandos de proteínas o sintéticos a los cuales un agente de enlace de ácido nucleico o ADN ha sido vinculado para la fijación como objetivo específica de ácidos nucleicos a las células (Cristiano y colaboradores, 1993) . Las células objetivo dependerán típicamente de que síntomas necesitan ser tratados y pueden ser seleccionadas por la persona experta (por ejemplo células de médula ósea o células estromales para tratar la leucemia.

Los vectores de terapias génicas deben expresar una cantidad terapéutica del inhibidor de P1GF. De acuerdo con modalidades particulares, los vectores de terapias génicas descritos en esta solicitud dirigen la expresión de una cantidad terapéutica del producto génico durante un período prolongado. En realidad, siempre y cuando se alcancen niveles terapéuticos, no es necesario un tratamiento nuevo. Típicamente, se contempla que la expresión terapéutica dure por lo menos 20 días, por lo menos 50 días, por lo menos 100 días, por lo menos 200 días y en algunos casos 300 días o más. La expresión del producto génico (por ejemplo polipéptido, iARN, etcétera) codificado por la secuencia de codificación se puede medir por cualquier medio reconocido en el campo, tal como por medio de ensayos a base de anticuerpos, por ejemplo una Inmunotransferencia Western o un ensayo ELISA, por ejemplo para evaluar si se logra la expresión terapéutica del producto génico. La expresión del producto génico también se puede medir en un bioensayo que detecta una actividad enzimática o biológica del producto génico .

Los vectores de terapias génicas pueden ser vectores episomales (es decir, que no se integran en el genoma de una célula hospedante) o pueden ser vectores que se integran en el genoma de la célula hospedante. Los ejemplos de vectores episomales incluyen plásmidos (extracromosómicos) y los comúnmente llamados mini -círculos , los cuales están compuestos del cásete de expresión únicamente y están carentes de secuencias bacterianas y los ejemplos de vectores que se integran en el genoma de la célula hospedante incluyen vectores virales .

Los vectores plasmídicos representativos incluyen vectores pUC, vectores bluescript (pBS) y pBR322 o derivados de los mismos que están carentes de secuencias bacterias (minicírculos) . Algunos de los vectores plasmídicos se pueden adaptar para incorporar elementos que mejoran la persistencia de plásmidos episomales en las células transfectadas . Estas secuencias incluyen S/MARs que corresponden a los módulos de región vinculados con el andamiaje/matriz unidos a una unidad de transcripción (Jenke y colaboradores, 2004; Manzini y colaboradores, 2006) .

Los vectores virales representativos incluyen vectores derivados de virus adeno-asociados , adenovirus, retrovirus y lentivirus. Alternativamente, los sistemas de suministro de genes se pueden utilizar para combinar componentes virales y no virales, tales como nanopartículas o virosomas (Yamada y colaboradores, 2003) .

Los retrovirus y lentivirus son virus de ARN que tienen la capacidad de insertar sus genes en los cromosomas de las células hospedantes después de la transfección. Se han desarrollado vectores retrovirales y lentivirales que carecen de los genes que codifican proteínas virales, pero retienen la capacidad para infectar células e insertar sus genes en los cromosomas de la célula objetivo (Miller, 1990; Naldini y colaboradores, 1996) . La diferencia entre un vector lentiviral y un vector retroviral a base de virus de leucemia de murino Moloney (MLV, por sus siglas en inglés) clásico es que los vectores lentivirales pueden transducir las células tanto divisorias como no divisorias mientras que los vectores retrovirales a base de MLV solo pueden transducir las células divisorias .

Los vectores adenovirales se diseñan para ser administrados directamente a un sujeto vivo. A diferencia de los vectores retrovirales, la mayoría de genomas de vectores adenovirales no se integran en el cromosoma de la célula hospedante. En cambio, los genes introducidos en células utilizando vectores adenovirales se mantienen en el núcleo como un elemento extracromosómico (episoma) que persiste durante un periodo de tiempo prolongado. Los vectores adenovirales transducirán las células tanto divisorias como no divisorias en muchos tejidos diferentes in vivo que incluyen las células epiteliales de las vías respiratorias, células endoteliales, hepatocitos y varios tumores (Trapnell, 1993) .

El virus adeno-asociado (AAV) es un virus de ADNss pequeño el cual infecta a los humanos y algunas otras especies de primates, que no se sabe que causa una enfermedad y consecuentemente que causa solo una respuesta inmune muy ligera. El AAV puede infectar las células tanto divisorias como no divisorias y puede incorporar su genoma en aquel de la célula hospedante. Estas características hacen que el AAV sea un candidato muy atractivo para crear vectores virales para la terapia génica, aunque la capacidad de clonación del vector es relativamente limitada.

Otro vector viral se deriva del virus de herpes simple, un virus grande de ADN de doble cadena. Las formas recombinantes del virus vaccinia, otro virus de ADNdc, pueden dar cabida a insertos grandes y se generan por medio de la recombinación homologa.

Los inhibidores listados en este documento se pueden utilizar para el tratamiento de la leucemia con cromosoma Filadelfia positivo (Ph+ o BCR-ABL+) o se pueden utilizar para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de la leucemia con Ph+ (BCR-ABL+) . Los métodos para el tratamiento de la leucemia con Ph+/BCR-ABL+ implicarán típicamente la administración de este inhibidor de PlGF a un sujeto necesitado del mismo, más particularmente a un sujeto humano. Un subconjunto particular de leucemias con Ph+ son las leucemias mielógenas crónicas (CMLs) . De esta manera, de acuerdo con modalidades particulares, los usos y métodos descritos en la solicitud son para el tratamiento de CML. Otra categoría importante de leucemias con Ph+ es un grupo de leucemias linfocíticas agudas (ALLs) también caracterizadas por la presencia del cromosoma Filadelfia. Esta categoría tiene típicamente una mala prognosis, ya que muchos tratamientos estándar fallan en los casos de ALL con Ph+ . De acuerdo con una modalidad particular, las otras leucemias en donde el cromosoma Filadelfia (o la proteína de fusión de BCR-ABL) está presente también pueden ser adecuadas para los usos y métodos descritos en este documento. Sin embargo, estos casos son menos comunes que la CML o la ALL. No obstante, algunos casos de AML con Ph+ (leucemia mieloide aguda) han sido reportados y estos casos de leucemia con Ph+ también están contemplados para beneficiarse de los usos y métodos proporcionados en la solicitud.

Es importante comprender que las leucemias son enfermedades devastadoras, frecuentemente con una mala prognosis para el paciente. Por lo tanto, es importante tener la capacidad de ofrecer estrategias de tratamiento alternativas, o estrategias de combinación, si falla un planteamiento de tratamiento. Un objetivo de la presente solicitud es proporcionar un beneficio terapéutico, en particular también a pacientes que no se benefician de otro régimen de tratamiento.

El tratamiento estándar para las leucemias con cromosoma Filadelfia positivo, en particular para la CML, es el uso de un inhibidor de BCR-ABL o un inhibidor de tirosina cinasa. El mejor ejemplo conocido de este tipo de fármacos es imatinib, pero existen otros diversos ejemplos, tales como nilotinib (AN107) , dasatinib (BMS354825) , AT9283 (Astex therapeutics) , SGX393 (Eli Lilly) , INNo-406 (Innovive Pharmaceuticals) , bosutinib (SKI606) y MK0457 (Merck) .

Sin embargo, varios reportes indican que la resistencia contra estas medicinas es un problema común. En realidad, las células leucémicas persisten incluso en pacientes tratados exitosamente y algunos pacientes desarrollan resistencia y finalmente recaen (Swords y colaboradores, 2007; Buchert, 2007; Li y Li, 2007; Kujawski y Talpaz, 2007). De acuerdo con modalidades particulares, los inhibidores del P1GF se utilizan para el tratamiento de leucemias con Ph+ las cuales no pueden ser tratadas con un inhibidor de BCR-ABL y/o en casos más particulares no pueden ser tratados con un inhibidor de BCR-ABL solo. Las leucemias con cromosoma Filadelfia positivo no pueden ser tratables con un inhibidor de BCR-ABL (o un inhibidor de BCR-ABL solo) por una variedad de razones, las dos más comunes son la insensibilidad de las células malignas al inhibidor de BCR-ABL y la medicina que no es tolerada por el paciente.

La insensibilidad de las células leucémicas al inhibidor de BCR-ABL puede ser debido a varios mecanismos (Shah y Sawyers, 2003) y puede surgir desde el inicio (es decir la insensibilidad en el primer tratamiento) o se puede adquirir resistencia (por ejemplo en pacientes que muestran una recaída o en pacientes que tienen una leucemia desarrollada adicional, por ejemplo en una etapa de crisis de células blásticas) .

También, se ha sabido que los inhibidores de BCR-ABL invocan efectos colaterales adversos en pacientes, los cuales pueden conducir a que el medicamento ya no sea adecuado para pacientes particulares. Una reacción alérgica en un paciente también puede conducir a la intolerancia a la medicina .

De acuerdo con modalidades específicas, los inhibidores de PlGF se utilizan para el tratamiento de leucemias con Ph+ las cuales son resistentes (por lo menos parcialmente) al tratamiento con un inhibidor de BCR-ABL. Las leucemias que son resistentes (parcialmente) a un inhibidor de BCR-ABL se pueden definir como leucemias en las cuales están presentes células leucémicas que tienen una respuesta disminuida al inhibidor de BCR-ABL. La cantidad de células que tienen una respuesta disminuida es indicativa del grado de resistencia al inhibidor de BCR-ABL. Típicamente, aunque no necesariamente, la resistencia (parcial) a un inhibidor de BCR-ABL es un fenómeno adquirido. De acuerdo con modalidades específicas adicionales, los inhibidores de PlGF se utilizan para el tratamiento de leucemias con Ph+ resistentes a imatinib. Los ejemplos no limitantes de estas leucemias incluyen CML con Ph+ resistente a imatinib, ALL con Ph+ resistente a imatinib, por ejemplo T-ALL con Ph+ resistente a imatinib, B-ALL con Ph+ resistente a imatinib.

Algunas veces, aunque desde luego no en todos los casos, la resistencia a inhibidores de BCR-ABL, en particular la resistencia a imatinib, está asociada con mutaciones en el gen de BCR-ABL, en particular en el dominio de tirosina cinasa. La mutación T315I es el mejor ejemplo conocido de la misma. Otros ejemplos incluyen las mutaciones E255K, E255V, Y253H, H396P, F317L, M351T, G250E, F311L, M244V, F359V, L387M, H396R, Q252H, Y253F, Q252R y E355G (Shah y Sawyers, 2003) . Corbin y colaboradores reportaron que especialmente las mutaciones G250E, H396P, H396R, E255V y T315I parecieron conferir resistencia al imatinib (Corbin y colaboradores, 2003). De acuerdo con modalidades particulares, los inhibidores de PlGF se utilizan para el tratamiento de leucemias con Ph+ en las cuales el gen de BCR-ABL tiene por lo menos una mutación. De acuerdo con modalidades particulares adicionales, los inhibidores de PlGF se utilizan para el tratamiento de leucemias con Ph+ las cuales no pueden ser tratadas con un inhibidor de BCR-ABL y/o no son tratadas con un inhibidor de BCR-ABL solo y en las cuales el gen de BCR-ABL tiene por lo menos una mutación. De acuerdo con modalidades particulares aún adicionales, las leucemias con Ph+ no pueden ser tratadas con imatinib o no son tratadas con imatinib solo. De acuerdo con modalidades aún más específicas, por lo menos la mutación en el gen de BCR-ABL se selecciona del grupo que consiste de las mutaciones T315I, E255K, E255V, Y253H, H396P, F317L, M351T, G250E, F311L, 244V, F359V, L387M, H396R, Q252H, Y253F, Q252R y E355G.

Se contempla que el uso de un inhibidor del factor de crecimiento placentario para el tratamiento de una leucemia con cromosoma Filadelfia positivo puede ser una terapia o método de tratamiento independiente. Sin embargo, de acuerdo con modalidades particulares, el uso de inhibidores de PlGF en el tratamiento de leucemias con Ph+ se contempla como parte de una terapia de combinación. De esta manera, la inhibición del PlGF se puede utilizar junto con otras terapias utilizadas para tratar las leucemias con Ph+, tales como la radioterapia, quimioterapia, terapia biológica (por ejemplo tratamiento con interferón) , trasplante de células madre, trasplante de médula ósea, cirugía (por ejemplo remoción del bazo) o terapias dirigidas tales como la inhibición de BCR-ABL, inhibición de Lyn, inhibición de Hsp90, inhibición de Src . Naturalmente, la inhibición de PlGF se puede utilizar en combinación con más de una de estas terapias (por ejemplo junto con la inhibición de BCR-ABL y Lyn) .

La inhibición de PlGF se puede realizar de manera concomitante con otras terapias o ya sea antes o después de otras terapias o puede ser por ejemplo cambiada intermitentemente. La persona experta es capaz de decidir sobre el régimen de tratamiento óptimo, opcionalmente después de la experimentación de rutina.

Se debe entender que aunque las modalidades particulares, configuraciones específicas así como también materiales y/o moléculas, se han planteado en este documento para células y métodos de acuerdo con la presente invención, se pueden hacer varios cambios o modificaciones en forma y detalle sin apartarse del espíritu y alcance de esta invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar mejor las modalidades particulares y no deben considerarse como limitantes de la solicitud. La solicitud es limitada únicamente por las reivindicaciones.

Ej emplos Materiales y métodos Animales Los ratones hembra Balb/c (8 semanas de edad) se obtuvieron de Janvier. El alojamiento y todos los procedimientos de los animales experimentales fueron aprobados por the Institutional Animal Care and Research Advisory Committee of the K.U. Leuven.

Células y condiciones de cultivo Las células KCL-22 y CRL-1929 se obtuvieron de ATCC. Las células Bv-173, K562, BaF3 , 32D y Nalm6 fueron proporcionadas amablemente por J. Cools (VIB, Leuven) . Las células Bv-173 y las células K562 se cultivaron en un medio RPMI (Gibco, Invitrogen Corporation) con 20% de FCS (Hyclone Laboratories); las células BaF3 , 32D y KCL-22 se cultivaron en un medio RPMI con 10% de FCS; las células Nalm 6 se cultivaron en un medio DMEM (Gibco, Invitrogen Corporation) con 10% de FCS y las células CRL-1929 se cultivaron en un medio IMDM (Gibco, Invitrogen Corporation) con 20% de FCS y beta-mercaptoetanol 0.05 mM (Gibco, Invitrogen Corporation). Aislamiento de células estro ales primarias derivadas de médula ósea de murino (BMDSCs) Para el aislamiento de las BMDSCs, la médula ósea de fémures y tibias se vació, los eritrocitos se eliminaron con amortiguador de lisis (NH4C1 150 mM, EDTA 0.1 mM, KHC03 10 mM, pH 7.4) y subsecuentemente las células se cultivaron en un medio DMEM complementado con 15% de FCS. Después de 24 horas, la fracción de células no adherentes se eliminó y las células adherentes se cultivaron adicionalmente y se expandieron durante 3 semanas .

Ensayos de proliferación y co-cultivos La proliferación de células leucémicas y BMDSCs se analizó mediante el uso de ensayos de MTT o mediante el conteo manual con un hemocitómetro . El P1GF recombinante de murino y anti-VEGFR-1 se obtuvieron de R&D Systems. La IgGl anti-PlGF y de control fueron producidas por Thrombogenics and Biolnvent y se caracterizaron como se describe (Fischer y colaboradores, 2007) . El PlGF se utilizó en una concentración de 50 ng/ml y los anticuerpos en un exceso molar de 100 veces, a menos que se establezca de otra manera. Para los experimentos de co-cultivo, 105 BMDSCs se co-cultivaron durante 48 horas con 4xl05 células leucémicas solas o en presencia de los anticuerpos respectivos en un medio sin suero. Subsecuentemente, los números de BMDSCs adherentes y células leucémicas no adherentes se determinaron y los sobrenadantes se recolectaron para los análisis de la proteína de PlGF y VEGF.

Análisis de sangre periférica La sangre se recolectó con pipetas capilares mediante el sangrado retro-orbital y el conteo de glóbulos blancos (WBC, por sus siglas en inglés) se determinó utilizando un contador automático de células (Beckman Coulter) .

ELISA Las concentraciones de PlGF o VEGF se cuantif icaron en sobrenadantes de cultivo de células, plasma sanguíneo periférico y plasma de la médula ósea utilizando inmunoensayos de P1GF de ratón y VEGF de ratón "Quant ikineMR" ( R&D Systems) . Las concentraciones se expresaron como pg/ml/105 células o como pg/ml .

PCR cuantitativa en tiempo real La RT-PCR se llevó a cabo esencialmente con cebadores y sondas como se describiera previamente (Fischer y colaboradores, 2007) .

Modelo singénico de leucemia de células Pre-B con BCR-ABL+ Las células BaF3 con BCR-ABL+ se cultivaron como se describiera anteriormente y lxlO6 células se inyectaron por vía de la vena de la cola en ratones Balb/C singénicos de 8 semanas de edad.

Modelos de trasplante de CML sensible a imatinib y resistente a imatinib Para la inducción de la CML, las células de médula ósea se recolectaron al vaciar los fémures y tibias de donadores Balb/c (8 semanas) 4 días después del tratamiento con 200 mg/kg de 5-fluorouracilo (5-FU; Sigma Aldrich) y se estimularon previamente in vitro en un medio que contenía 10 ng/ml de IL-3, 10 ng/ml de IL-6 y 50 ng/ml de SCF. Subsecuentemente, las células se sujetaron a un ciclo de co-sedimentación con soluciones madre retrovirales (construcciones retrovirales : MCSV-GFP, MSCV-BCR-ABL p210 IRES-EGFP, MSCV-BCR-ABL-T315I -IRES-EGFP ; proporcionadas amablemente por Jan Cools) . Los ratones hembra receptores se prepararon mediante la irradiación letal y la médula transducida se trasplantó por medio de una inyección intravenosa de 0.5x106 células por animal.

Ejemplo 1. Análisis de expresión del PlGF en células leucémicas y células estromales primarias de médula ósea in vitro Con el propósito de determinar el perfil de expresión del PlGF por parte de células leucémicas y por parte de diferentes poblaciones de células estromales asociadas con la leucemia in vitro, la expresión del PlGF se analizó en un conjunto de líneas de células mieloides y linfoides con BCR-ABL+ (murino: BaF3 , 32D; humano: K562, Bv-173, KCL-22) . Además, la línea de células linfoide con BCR-ABL- humana Nalm-6 se investigó. Adicionalmente , la expresión del PlGF se cuantificó en diferentes poblaciones de células estromales de médula ósea. No se encontró la expresión de la proteína de PlGF en todas las líneas estudiadas de células leucémicas determinada por medio de un ensayo ELISA y se encontraron cantidades muy bajas (41 + 2.3 pg/ml) en células hematopoyéticas CD45+ saludables aisladas de la médula ósea de murino (Figura 1A) . En contraste, las células estromales primarias derivadas de médula ósea de murino (BMDSCs) y las líneas de células estromales (S17, 0P9) expresaron cantidades abundantes de la proteína de PlGF (Figura 1A) .

El análisis de FACS de células estromales derivadas de médula ósea reveló que 49.7% + 20% de BMDSCs de murino fueron de linaje hematopoyético después de un periodo de cultivo promedio de 3 semanas (lo cual no se muestra) . Para aclarar si la fracción hematopoyética (CD45+) o la fracción no hematopoyética (CD45") de BMDSCs de murino expresó el PlGF, se separaron ambas poblaciones por vía de un planteamiento inmunomagnético (pureza>93%, el cual no se muestra) y se determinó subsecuentemente el PlGF en los sobrenadantes de BMDSCs CD45+ y CD45". Estos experimentos revelaron una expresión casi exclusiva del PlGF por parte de las BMDSCs CD45" (Figura IB) (N=3 ; p<0.001). Adicionalmente , se determinó la expresión del PlGF en células endoteliales de humano (HUVEC) y de murino (fEND5) y se descubrió una expresión abundante de la proteína de PlGF (HUVEC: 279.7 ± 29.9 pg/ral; fEND5 : 125.7 ± 18.8 pg/ml ; N=3) . En conjunto, estos resultados apuntan en la dirección que el PlGF es expresado principalmente por las células estromales de la médula ósea y no por las células leucémicas in vitro.

Ejemplo 2. El PlGF es expresado por el estroma leucémico y representa un biomarcador del progreso de la leucemia in vivo Para esclarecer un impacto potencial del PlGF sobre el progreso de la enfermedad leucemia y por lo tanto un potencial terapéutico del anticuerpo aPlGF in vivo, un modelo de crisis de células blásticas descrito adecuadamente de la CML se utilizó para trasplantar médula ósea transducida con BCR/ABL-GFP en ratones singénicos irradiados a un nivel subletal . Se analizaron primero los niveles de proteína de PlGF en el plasma de ratones enfermos en diferentes puntos de tiempo (dl4, d21 y d28) en comparación con ratones de control y se detectaron cantidades muy bajas de proteína de PlGF en la sangre periférica de ratones saludables o ratones trasplantados con médula ósea transducida de modo simulado y bajas cantidades de proteína de PlGF en su médula ósea. En contraste, los ratones leucémicos mostraron una proteína de PlGF creciente con el progreso de la enfermedad en su circulación que alcanzaban niveles comparables a ratones que padecían de tumores sólidos (Fischer y colaboradores, 2007) en etapa terminal (Figuras 2A, 2B) . Una cinética similar de incremento del PlGF se observó en el plasma de médula ósea (Figura 2B) . También se cuantificó el inhibidor natural de PlGF, sVEGFR-1, y se descubrió que aunque el sVEGFR-1 está presente en exceso en comparación con el PlGF, la relación de PlGF/sVEGFR-1 incrementa en la sangre y la médula ósea con el progreso de la enfermedad, indicando que la regulación por incremento del PlGF es más pronunciada que el sVEGFR-1 durante el curso de la leucemia (Figuras 2C, 2D) .

Para diseccionar la fuente del PlGF in vivo, se realizaron análisis de PC en Tiempo Real del hueso y la médula ósea, que revelaron una regulación por incremento de 12.6 veces del AR m de PlGF en la médula ósea (N=8; P<0.002) (Figura 2E) . Los niveles de ARNm de PlGF en los huesos fueron similares en ratones enfermos y saludables (los datos no se muestran) , indicando que la fuente principal del PlGF elevado detectado en el plasma de la médula ósea de ratones leucémicos es la médula ósea. Para especificar adicionalmente las células productoras de PlGF dentro de la médula ósea, se clasificaron por medio de FACS las células leucémicas (GFP+) , las células hematopoyéticas no leucémicas (GFP"CD45+) y las células estromales no hematopoyéticas, no leucémicas (GFP~CD45~) y se determinó subsecuentemente la expresión del ARNm de PlGF por medio de la RT-PCR en estas subfracciones . Estos experimentos esclarecieron, de manera similar a los descubrimientos in vitro mencionados anteriormente, que el PlGF es expresado predominantemente por las células estromales CD45" y solo de manera insignificante por las células leucémicas o células hematopoyéticas en ratones leucémicos in vivo. En realidad, las células estromales GFP" CD45" expresaron 95.6 veces más ARNm de PlGF que las células leucémicas y 32 veces más ARNm de PlGF que las células hematopoyéticas (N=4; P<0.05); (Figura 2F) . Cuando se compararon los niveles de ARNm de PlGF en células de médula ósea CD45" de ratones leucémicos con los niveles de ARNm de PlGF en células CD45" de la médula ósea de ratones saludables, se descubrió una fuerte regulación por incremento (25.4 veces) de la expresión de PlGF dentro del compartimiento de células estromales no hematopoyéticas de ratones que padecen leucemia (N=4 ; P<0.05) (Figura 2F) . Interesantemente, el ARNm de VEGF solo fue regulado por incremento ligeramente en la médula ósea de ratones que padecían leucemia en comparación con los ratones saludables (N=8; P=0.23) (Figura 2G) indicando que el PlGF representa un factor patogénico derivado del estroma, específico en la leucemia con BCR/ABL+ también in vivo. Esta hipótesis es corroborada adicionalmente por la observación que la cantidad de proteína de PlGF que está presente en el plasma sanguíneo o el plasma de médula ósea de ratones leucémicos se correlaciona con el número de células blásticas leucémicas que infiltran la médula ósea, determinado por medio de un análisis de FACS de las células con GFP+ en la médula ósea de ratones enfermos en etapa terminal (r=0.81 y r=0.85; p<0.05; Figuras 2H, 21). Por lo tanto, el PlGF representa un biomarcador del progreso de la enfermedad de CML con crisis de células blásticas en ratones. Ejemplo 3. El anti-PlGF inhibe la proliferación inducida por PlGF de células leucémicas Para determinar un efecto biológico potencial del PlGF sobre las células leucémicas, se investigó la expresión del receptor principal de PlGF, VEGFR-1 y sus co-receptores Npnl y Npn2 en líneas de células leucémicas. El VEGFR-1 fue expresado por las líneas de células más estudiadas de acuerdo con la bibliografía publicada (Fragoso y colaboradores, 2006) (los datos no se muestran) . El Npnl y Npn2 fueron expresados en las líneas de células K562, Nalm-6, BV-173 y KCL-22, aunque a niveles diferentes, pero no en las células 32D (Figuras 3A, 3B) . Con base en estos descubrimientos, las células leucémicas se incubaron con PlGF in vi tro, las cuales indujeron de manera dependiente de la dosis la proliferación de 4 de 5 líneas de células con BCR/ABL+, de acuerdo con la bibliografía publicada (Figuras 3C, 3D) . Además de su receptor principal VEGFR-1, el PlGF también se enlaza a los co-receptores Npn-1 y Npn-2. Para aclarar si la proliferación inducida por PlGF de células leucémicas requiere el VEGFR-1, se evaluó el efecto inhibidor de un anticuerpo de bloqueo de VEGFR-1 extracelular (OtVEGFR- 1 ) . Se descubrió la inhibición de la proliferación mediada por el PlGF en presencia del anticuerpo ccVEGFR- 1 (Figura 3E) . En contraste, la proliferación inducida por el PlGF de células leucémicas no fue inhibida con la adición de anticuerpos de bloqueo funcionales, extracelulares contra Npn-1 y Npn-2, lo que indica que el efecto pro-proliferativo del PlGF es mediado principalmente por vía del VEGFR-1 (Figura 1G) . En un siguiente paso, se investigó si el anticuerpo anti-PlGF (aPIGF) inhibe la proliferación inducida por el PlGF de células leucémicas y se descubrió la abrogación casi completa del efecto pro-proliferativo del PlGF con la adición del anticuerpo ocPlGF, indicando un potencial terapéutico en la leucemia (Figura 3F) .

Con el propósito de esclarecer si el PlGF induce cambios en la fosforilación de ABL de las células leucémicas con BCR/ABL+, se realizaron inmunotransferencias Western de células Bv-173 y KCL-22 que se incubaron con y sin PlGF. Estos experimentos indicaron que el PlGF no modificó la fosforilación de ABL (los datos no se muestran) .

Ejemplo 4. Las interacciones paracrinas entre células leucémicas y BMDSCs inducen la secreción del PlGF por BMDSCs Los experimentos de co-cultivo se realizaron para estudiar las interacciones potenciales entre las células leucémicas humanas y las BMDSCs de murino o una línea de células estromales de médula ósea de murino (S17) que conduce a una secreción incrementada de PlGF por ya sea las BMDSCs o las células S17 y se descubrió una regulación por incremento significativa del PlGF de murino con el co-cultivo (Figuras 4A, 4B) . Este descubrimiento motivó el análisis de la proliferación de los co-cultivos, el cual reveló una inducción significativa de la proliferación de células leucémicas y BMDSCs (Figuras 4C, 4D) . Este efecto pro-proliferativo fue abrogado casi completamente con la adición del anticuerpo aPlGF a los cultivos, indicando que el PlGF puede inducir la proliferación de células leucémicas de una manera paracrina, pero al mismo tiempo media la expansión de células estromales de la médula ósea por vía de un circuito autocrino, promoviendo simultáneamente de esta manera el clon leucémico y su estroma de apoyo (Figuras 4C, 4D) . Interesantemente, esta interacción conduce específicamente a la regulación por incremento del PlGF, debido a que el VEGF no fue regulado por incremento con el co-cultivo (los datos no se muestran) . Para someter a prueba el papel potencial del PlGF en la leucemia con BCR-ABL+ in vivo, se establecieron 3 diferentes modelos de murino de leucemia mieloide y linfoide con BCR/ABL+ .

En un esfuerzo para aclarar las señales moleculares que podrían inducir la regulación por incremento del PlGF, se analizó primero si la incubación con un medio acondicionado de células leucémicas (CM) sería suficiente para inducir una regulación por incremento similar del PlGF en células estromales (S17) que el co-cultivo directo con células leucémicas y se descubrió que en realidad el CM es suficiente para la inducción de la secreción del PlGF por S17 (N=3 ; P=0.008; Figura 4E) .

Ejemplo 5. La deficiencia genética del estroma del hospedante, pero no de las células leucémicas prolonga la supervivencia de ratones leucémicos Para determinar el papel del PlGF en la leucemia con BCR/ABL+ in vivo, se indujo la leucemia en ratones genéticamente deficientes para el PlGF (PlGF_/~) y en ratones wt (WT) y se comparó la supervivencia entre ambos grupos. Se descubrió que los ratones que carecían del PlGF vivieron significativamente más tiempo que los ratones WT, lo que indica que el PlGF juega un papel importante en la patogénesis de la leucemia in vivo. (N=14/15; P=0.003; Figura 5A) .

En un intento por probar la hipótesis que el PlGF representa un factor derivado del estroma en la leucemia con BCR/ABL+, se realizaron estudios de entrecruzamiento al trasplantar células transducidas de médula ósea de ratones WT y ratones PlGF KO en hospedantes WT y se comparó la supervivencia entre los diferentes grupos (WT?WT, KO?WT y WT?K0) . Se descubrió que la ausencia del PlGF en las células leucémicas no prolongó la supervivencia de los ratones, sino que la deficiencia de PlGF del estroma del hospedante indujo una ventaja de supervivencia significativa en los ratones leucémicos, que está en un rango comparable como en el sistema completamente deficiente de PlGF (véase anteriormente) . De esta manera, el PlGF derivado del estroma promueve críticamente el progreso de la leucemia con BCR/ABL+ in vivo (Figura 5B) .

Ejemplo 6. El tratamiento de ratones leucémicos con un anticuerpo anti-PlGF prolonga significativamente su supervivencia Con el propósito de investigar el potencial terapéutico de la inhibición del PlGF en la leucemia con Ph+ de murino, los ratones que padecían leucemia inducida por una inyección intravenosa de células BaF3 con BCR-ABL+ se trataron con anticuerpo OlPlGF y se descubrió una prolongación significativa de la supervivencia media por 18 días (N=9; P=0.015), en comparación con los anticuerpos de control (Figura 5C) . Estos resultados motivaron al establecimiento de modelos de murino de la CML sensible a imatinib y resistente a imatinib (mutante T315I) , inducida por medio del trasplante de BM transducida con BCR-ABL, imitando clínicamente la condición de enfermedad humana en la crisis de células blásticas caracterizada por la esplenomegalia y una proliferación excesiva de células leucémicas mieloide lo que conduce a la muerte de los ratones enfermos una semana después de que los leucocitos elevados puedan ser detectados primero en la sangre periférica. Posteriormente, se investigó el efecto de un anticuerpo aPlGF sobre la carga leucémica, la histología de la médula ósea y la supervivencia de los ratones. La carga leucémica reducida se observó (los datos no se muestran) y el análisis de FACS de las células con GFP+ en la leucemia en etapa inicial (dl5) y en etapa terminal (d28) reveló una reducción específica de las células con BCR-ABL+ en BM y PB (N=7; P<0.05) (Figuras 5D, 5E y no se muestran). Adicionalmente , las histólogas de la médula ósea en la etapa terminal indican una inhibición sustancial del progreso de la enfermedad inducida por el tratamiento con un anticuerpo OCPlGF (Figura 5F) . Después, se investigó el efecto de un anticuerpo aPlGF sobre la supervivencia de ratones. Estos experimentos indican una prolongación significativa de la supervivencia con el tratamiento con un anticuerpo OCPlGF en comparación con los anticuerpos de control en ratones que padecen de leucemia tanto sensible a Imatinib como resistente a Imatinib (Figuras 5G, 5H) . De esta manera, el anticuerpo OCPlGF inhibe el progreso de la leucemia con crisis de células blásticas de murino independiente del estado mutacional de BCR/ABL.

Ejemplo 7. El tratamiento de ratones leucémicos con anticuerpo anti-PlGF inhibe la hipervascularización y fibrosis de la médula ósea La neoangiogénesis de la médula ósea representa un factor patógeno importante en la leucemia. El P1GF es una citocina pro-angiogénica potente y ya se mostró que promueve la angiogénesis de tumores. Por lo tanto, el efecto de la inhibición del PlGF sobre la vascularización de la médula ósea se analizó por medio de un análisis morfométrico de tinciones con CD31 en ratones tratados con anticuerpo de control, trasplantados de modo simulado y tratados con aPlGF con leucemia en etapa terminal . Estos experimentos indicaron una profunda hipervascularización de la médula ósea en ratones leucémicos en comparación con controles trasplantados de modo simulado (Figuras 6A, 6C) . Esta hipervascularización se reduce significativamente después del tratamiento con el anticuerpo aPlGF (Figuras 6A, 6C) .

La fibrosis de la médula ósea es un factor adverso bien conocido en la CML y está asociada con la resistencia a Imatinib. Con base en las observaciones que el P1GF estimula la proliferación de BMDSCs (véase anteriormente) se investigó si el tratamiento de ratones leucémicos con el anticuerpo aPlGF podría modificar la fibrosis de la médula ósea. Con el análisis morfométrico de la longitud promedio de las fibras de reticulina+ en la médula ósea se descubrió una reducción significativa de la fibrosis de la médula ósea inducida por la inhibición del P1GF (Figuras 6B, 6D) . Por lo tanto, el anticuerpo ocPlGF reduce la hipervascularización y la fibrosis de la médula ósea en ratones leucémicos.

Interesantemente, los experimentos iniciales han mostrado que el imatinib y el anticuerpo anti-PlGF tienen un efecto inhibitorio adicional sobre la leucemia con BCR/ABL+ in vivo.

Ejemplo 8. El PlGF es regulado por incremento en la CML humana Para investigar la relevancia del PlGF como una molécula objetivo novedosa en la CML humana, se determinaron los niveles en el plasma del PlGF en controles saludables (n=10) , pacientes no tratados en Fase Crónica (CP, por sus siglas en inglés) con la diagnosis primaria (n=32) y pacientes con crisis de células blásticas (BC, fase terminal de la enfermedad) bajo tratamiento con diferentes inhibidores de tirosina cinasa (TKIs) (n=9) . Estos análisis revelaron una regulación por incremento de 2.1 veces del PlGF en pacientes recientemente diagnosticados en CP . (p<0.0001) y un incremento de 3.7 veces de los niveles de PlGF en pacientes con BC (p<0.0001) en comparación con controles saludables (Figura 7A) . Subsecuentemente, se determinaron los niveles de PlGF en el plasma de la médula ósea (BMP) de pacientes con CML recientemente diagnosticada (n=7) y en pacientes de control diagnosticados con linfoma sin invasión de la médula ósea (n=5; Figura 7B) . Estos análisis revelaron una regulación por incremento del PlGF también en el BMP de pacientes con CML en comparación con los controles.

Luego se investigó una relación potencial entre la proteína de PlGF de PB y números de transcripciones de BCR-ABLx determinados por medio de QRT-PCR en un centro individual (n=43 CP, n=2 Fase Acelerada; tratamiento con diferentes TKIs, imatinib+interferón u homoharringtonina) . Se descubrió una correlación significativa entre los niveles de PlGF y los números de transcripciones de BCR-ABLi (r=0.45; p=0.0016), indicando que el PlGF representa un objetivo específico de la enfermedad en la CML humana (Figura 7C) . Subsecuentemente, se aislaron células CD34+ de donadores saludables y de pacientes con CML en CP y BC y se determinó la expresión del PlGF por medio de QRT-PCR. Estos análisis revelaron que la expresión del PlGF es igualmente baja en las células leucémicas que en las células CD34+ saludables (Figura 7D) . De esta manera, es más probable que el PlGF circulante elevado no sea secretado por células leucémicas, sino por células estromales. Para investigar esta hipótesis, se aislaron células estromales de BM adherentes de pacientes con CML recientemente diagnosticada y se compararon los niveles de expresión de PlGF con aquellos de las células leucémicas CD34+. Se descubrió que las células estromales expresan >7 veces más PlGF que las células leucémicas (Figura 7D; p=0.003), lo cual corrobora los datos preclínicos y extiende el concepto que el PlGF es producido principalmente por células estromales en pacientes con CML.

Ejemplo 9. Los niveles de PlGF en pacientes con CML bajo imatinib permanecen elevados Aún permanece incierto porque las células leucémicas persisten en pacientes tratados con imatinib, lo cual causa una recaída rápida de la mayoría de pacientes después del retiro del fármaco. El estroma del hospedante juega potencialmente un papel importante, independiente de las células leucémicas con BCR/ABL+ . Para esclarecer si el imatinib puede inducir la secreción del PlGF por las BMDSCs, se incubaron células estromales con concentraciones crecientes de imatinib. Estos experimentos revelaron una inducción dependiente de la dosis del PlGF en BMDSCs de murino que indica un papel potencial del PlGF derivado del estroma en la mediación de la resistencia al imatinib. Con el propósito de esclarecer si esta inducción del PlGF en BMDSCs también ocurre in vivo, se trataron ratones que padecían de CML inducida por el trasplante de médula ósea transducida con BCR/ABL con imatinib y se compararon los niveles de PlGF en su médula ósea con ratones leucémicos no tratados y ratones saludables. Estos experimentos revelaron la regulación por incremento del PlGF en la médula ósea de ratones leucémicos tratados con imatinib en comparación con ratones no tratados, aunque la infiltración de la médula ósea de ratones tratados con imatinib con células leucémicas fue significativamente más baja (Figura 7E) . Estos resultados indican una potenciación de la expresión de PlGF inducida por la leucemia en la médula ósea por parte del imatinib, lo cual podría promover la supervivencia y proliferación de células leucémicas en presencia de imatinib.

Estos descubrimientos motivaron la determinación de los niveles de PlGF en la PB de pacientes tratados con Imatinib que alcanzaban niveles de respuesta diferentes (remisión molecular completa CMR; relación de BCR/ABL/ABL <1; relación de BCR/ABL/ABL <10) y la comparación de los mismos con individuos saludables y pacientes con CML diagnosticados en primera instancia, no tratados. Interesantemente, los niveles de P1GF fueron significativamente más altos en pacientes con CMR que en sujetos saludables y en pacientes con una relación baja de BCR/ABL/ABL <1, el P1GF se elevó a niveles similares que los pacientes con CML recientemente diagnosticada, no tratados (Figura 7F) . Estos datos indican que el P1GF permanece elevado a pesar de la reducción de la carga leucémica por varios órdenes de magnitud y podría contribuir a la persistencia de la" enfermedad bajo tratamiento con Imatinib.

En conclusión, los datos indican que el P1GF representa un factor derivado del estroma que promueve el progreso de la leucemia con Ph+, independientemente del estado mutacional de BCR/ABL, y representa un objetivo novedoso producido por el estroma leucémico, un complemento útil para los inhibidores de cinasa BCR/ABL o en la leucemia refractaria con TKI .

Discusión La introducción de Imatinib e inhibidores de BCR-ABL de segunda generación ha revolucionado el tratamiento de pacientes con leucemias con cromosoma Filadelfia positivo (Ph+) , pero las células leucémicas persisten incluso en pacientes tratados exitosamente y algunos pacientes desarrollan resistencia y finalmente recaen. Las razones de estas desventajas no están resueltas completamente, pero se postuló que el estroma del hospedante juega potencialmente un papel importante independiente de BCR-ABL. El Factor de Crecimiento Placentario (PlGF) , un homólogo del VEGF, ya ha probado ser secretado abundantemente por las células estromales en tumores sólidos. Por lo tanto, se decidió que vale la pena estudiar el papel del PlGF en leucemias linfoides y mieloides con Ph+ y abordar el potencial terapéutico de un anticuerpo aPIGF, un anticuerpo monoclonal contra el PlGF, el cual se reportó recientemente que tiene un potencial antitumoral amplio en una variedad de modelos pre-clínicos de tumores sólidos (Fischer y colaboradores, Cell, 2007) .

Primero, la expresión del PlGF por 5 diferentes líneas de células leucémicas con Ph+ de humano y murino (Bv-173, BaF3, 32D, K562, KCL22) se estudiaron in vitro y se descubrió que ninguna de estas líneas de células secreta la proteína de PlGF, aunque expresaron su receptor objetivo VEGFR-1. En contraste, las células estromales, ahderentes, primarias de médula ósea de murino (BMDSC) expresaron cantidades abundantes de proteína de PlGF (hasta 105 pg/ml/105 células) , indicando una potencial función relacionada con el estroma del PlGF.

En segundo lugar, se analizó si el PlGF podría inducir la proliferación y en consecuencia una inducción dependiente de la dosis de la proliferación mediante el PlGF recombinante se reveló en todas las líneas de células leucémicas analizadas. Este efecto del PlGF fue abrogado casi completamente por tanto el anticuerpo PlGF como un anticuerpo anti-VEGFR-1 extracelular, indicando de esta manera que el efecto pro-proliferativo del PlGF es mediado principalmente por el VEGFR-1.

En tercer lugar, las potenciales interacciones paracrinas entre las BMDSCs y células leucémicas se estudiaron al realizar experimentos de co-cultivo. Notablemente, el co-cultivo de BMDSC con células leucémicas indujo significativamente la proliferación de células leucémicas. Se creó la hipótesis que esta inducción de la proliferación podría ser mediada por el PlGF y en realidad, se descubrió una abrogación casi completa de este efecto pro-proliferativo con la adición de un anticuerpo 0CP1GF a los co-cultivos. Adicionalmente , las BDMSCs regularon por incremento significativamente la secreción del PlGF (2.1 veces; N=3 ; P=0.005) cuando se cultivaron en presencia de células leucémicas, lo que indica interacciones paracrinas sustanciales entre ambos tipos de células. Estos resultados permitieron concluir que el PlGF derivado del estroma podría representar un objetivo novedoso en las leucemias con Ph+ .

Para someter a prueba esta hipótesis in vivo, se establecieron 3 diferentes modelos de murino de leucemia mieloide y linfoide con Ph+ . Subsecuentemente, se analizó la proteína de PlGF cuando estaba presente en la sangre y médula ósea de ratones enfermos en comparación con ratones saludables. No se encontró la proteína de PlGF en la sangre periférica de ratones saludables y se encontraron bajas cantidades de proteína de PlGF en su médula ósea. En contraste, los ratones leucémicos mostraron la proteína de PlGF (76.5 ± 18.4 pg / mi de plasma; N=7) en su circulación a niveles comparables con ratones que padecían de tumores sólidos e interesantemente niveles de PlGF elevados más de 8.9 veces (N=7; P<0.0001) en su médula ósea, en comparación con ratones saludables, lo que indica nuevamente que el PlGF representa un factor patógeno, novedoso, derivado del estroma en la leucemia con Ph+ .

Con el propósito de investigar el potencial terapéutico del anticuerpo ocPlGF en leucemias con Ph+ de murino, subsecuentemente los ratones que padecían leucemia inducida por una inyección de células BaF3 con BCR/ABL+ se trataron con el anticuerpo ocPlGF en comparación con anticuerpos de control y se descubrió una prolongación significativa de la supervivencia media por 18 días (N=9; P=0.015) inducida por el anticuerpo ocPlGF . Alentados por estos resultados positivos, los modelos de C L sensible a Imatinib y resistente a Imatinib (mutante T315I) se establecieron mediante la transducción de células primarias de médula ósea y el trasplante subsecuente en ratones receptores irradiados a niveles letales, los cuales se trataron con el anticuerpo aPlGF y anticuerpos de control. Interesantemente, también es estos modelos agresivos, se descubrió una prolongación significativa de la supervivencia de ratones enfermos inducida por el bloqueo del PlGF (prolongación de supervivencia media en leucemia inducida por BCR-ABL wt 5 días; N=ll; P=0.002; en el mutante T315I 4 días; N=12; P=0.039) . La histología de la médula ósea y los análisis fenotípicos mediante FACS revelaron una infiltración disminuida del bazo y la médula ósea con células leucémicas (reducción en la médula ósea por 38% y en el bazo por 24%) .

En este punto se aclara que las células leucémicas instruyen a las células estromales derivadas de la médula ósea no hematopoyéticas (BMDSCs) a regular por incremento el factor de crecimiento placentario (PlGF) , lo cual impulsa críticamente el progreso de la leucemia con BCR-ABL1+ en modelos de ratón preclínicos. Importantemente, estos descubrimientos se confirmaron en muestras humanas de CML, ya que el PlGF también es regulado por incremento en la sangre y médula ósea de pacientes con CML. La inhibición de esta molécula objetivo novedosa por un anticuerpo monoclonal contra el PlGF, aPlGF, mejora la supervivencia de ratones que padecen leucemia sensible a Imatinib y resistente a Imatinib (mutación T315I) . El anticuerpo anti-PlGF exhibe eficacia terapéutica al bloquear la proliferación de células leucémicas y al normalizar el microambiente leucémico anormal de la médula ósea al reducir la hipervascularización y la fibrosis. Interesantemente, el Imatinib puede regular por incremento el PlGF en BMDSCs y los niveles de PlGF permanecen altos en pacientes con CML tratados con Imatinib, los que indica que el PlGF podría contribuir a la persistencia de células leucémicas. Esto apoya adicionalmente el hecho que la inhibición del PlGF puede ser utilizada en combinación con estas terapias, proporcionando un beneficio adicional. En resumen, la inhibición del PlGF puede servir como un nuevo candidato para ser dirigido en terapias de combinación o en la CML refractaria con TKI .

En conclusión, estos datos indican que el PlGF representa un factor derivado del estroma que promueve el progreso de la leucemia con Ph+, independientemente del estado mutacional de BCR-ABL, y podría representar un objetivo novedoso producido por el estroma leucémico, un complemento potencialmente útil para los inhibidores de cinasa de BCR-ABL.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (7)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. El uso de un inhibidor del factor de crecimiento placentario para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de la leucemia con cromosoma Filadelfia positivo .

2. El uso de un inhibidor de conformidad con la reivindicación 1, en donde el inhibidor es un inhibidor selectivo de factor de crecimiento placentario.

3. El uso de un inhibidor de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde el inhibidor es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se enlaza específicamente al factor de crecimiento placentario.

4. El uso de un inhibidor de conformidad con la reivindicación 1, en donde el inhibidor es un inhibidor no selectivo del factor de crecimiento placentario.

5. El uso de un inhibidor de conformidad con la reivindicación 4, en donde el inhibidor es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se enlaza específicamente al VEGFR-1.

6. El uso de un inhibidor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la leucemia con cromosoma Filadelfia positivo es leucemia mielógena crónica.

7. El uso de un inhibidor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la leucemia con cromosoma Filadelfia positivo no puede ser tratada con un inhibidor de BCR-ABL y/o no puede ser tratada con un inhibidor de BCR-ABL solo.