KR20110074991A - 필라델피아 염색체 양성 백혈병의 치료를 위한 피엘지에프의 억제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백혈병들의 분야에 관한 것으로서, 특히 어떻게 PIGF 억제가 필라델피아 염색체 양성(Ph+) 백혈병을 치료하는 데 도움을 줄 수 있는 지에 관한 것이다. PIGF 억제제들을 투여하는 것에 의하여 Ph+ 백혈병들을 치료하는 방법들이 제공된다. Ph+ 백혈병들의 치료 또는 Ph+ 백혈병들에 대한 약물의 제조를 위한 PIGF 억제젝들의 용도들이 또한 개시된다.

Description

필라델피아 염색체 양성 백혈병의 치료를 위한 피엘지에프의 억제 {INHIBITION OF PLGF TO TREAT PHILADELPHIA CHROMOSOME POSITIVE LEUKEMIA}

본 출원은 암, 특히 백혈병의 분야에 관련된 것이다. 특히, 필라델피아 염색체 양성 (Ph+) 백혈병의 치료에 관한 것이다. 이는 경태반 성장인자의 억제(inhibition of placental growth factor ; PIGF)를 통하여 달성된다. 따라서, PIGF 억제제들(PIGF inhibitors)을 사용하는, 특히 항-PIGF 항체를 사용하는 Ph+ 백혈병의 치료를 위한 방법들이 제공된다. 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia ; CML), 특히 또한 이마티니브(imatinib) 등과 같은 통상의 BCR/ABL 억제제들이 충분한 치료적인 효과를 갖지 못한 환자들의 경우가 이러한 방법으로 치료될 것으로 예상되는 특정한 형태의 백혈병이다.

필라델피아 전좌(Philadelphia translocation)로도 알려진 필라델피아 염색체는 만성 골수성 백혈병(CML)과 연관되는 특이적인 염색체 이상(chromosomal abnormality)이다. 이는 염색체 9 와 22 사이의 상호간의 전좌의 결과이며, 특별히 t(9;22)(q34;qll)로 지정되었다. 95%의 CML 환자들이 이러한 이상을 갖기 때문에, 이러한 전좌의 존재는 CML에 대한 고도로 민감한 시험이다. CML 환자들의 나머지 5%는 전형적으로는 지-밴드화된 염색체 제제들(G-banded chromosome preparations) 상에서는 비가시적인 잠재적 전좌(cryptic translocation)나 또는 염색체들 9 및 22들의 긴 팔(long arm)과 마찬가지로 다른 염색체 또는 염색체들을 포함하는 변종 전좌(variant translocation)를 갖는다. 그러나, 25 내지 30%의 성인들에서 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia ; ALL) 케이스들이 (그리고 2 내지 10%의 소아과적 ALL(pediatric ALL) 케이스들이) 발견되기 때문에, 상기 필라델피아(Ph) 염색체의 단순한 존재가 CML을 진단하는데 충분히 특이적이지는 않다.

그럼에도 불구하고, 이들 질병들은 뚜렷하게 구별된다. 급성림프구성 백혈병(ALL)은 백혈병의 하나의 형태이고, 여기에서는 악성의, 미숙의 백혈구들이 골수(bone marrow) 내에서 연속적으로 증식되고 그리고 과생산된다. ALL은 골수 내에서 정상 세포들을 몰아내는 것에 의하여 그리고 다른 기관들에로 확산(전이)되는 것에 의하여 손상 및 죽음을 야기한다. ALL은 4 내지 5세들의 나이에서 피크 발생이 그리고 노령에서 다른 피크를 가지면서 어린이(childhood) 및 청장년(young adulthood)에서 가장 흔한 것이다. 어린이들에서의 전체 치료비율은 85%이고, 그리고 성인들의 약 50%는 장기간의 무질병 생존(long-term disease-free survival)을 갖는다. '급성'은 순환하는 림프구들의 미분화된(undifferentiated), 미성숙된 상태("싹(blasts)") 및 치료되지 않고 방치되는 경우 수 주 내지 수 개월 내에 죽음에 이르게 되는 질병의 빠른 진전을 의미한다. 급성 백혈병에 대한 치료에는 화학요법(chemotherapy), 스테로이드들(steroids), 방사선요법(radiation therapy), 집중복합치료법들(intensive combined treatments ; 골수 또는 줄기세포 이식들을 포함) 및 성장인자들이 포함된다.

한편 만성골수성 백혈병(CML)은 대개 골수 내에서의 골수세포들의 증가된 그리고 조절되지 않은 성장 및 혈액 내에서의 이들 세포들의 축적으로 특징지워지는 백혈병의 한 형태이며; 따라서 이는 골수증식질환(myeloproliferative disease)이다. CML은 클론성 골수 줄기세포 장애(clonal bone marrow stem cell disorder)이며 여기에서 성숙한 과립구들(granulocytes ; 호중구들(neutrophils), 산호성백혈구들(eosinophils) 및 호염기성백혈구들(basophils)) 및 그들의 전구체들의 증식이 주요 관찰점(finding)이다. 역사상, 표적화된 치료법들이 현재도 또한 획득가능하고 그리고 치료의 표준으로 사용되고 있기는 하나, 이는 화학요법, 인터페론 및 골수이식들로 치료되어 왔다.

필라델피아 염색체 내에서의 염색체 9와 22들의 부분들의 교환이 BCR-ABL 융합유전자(BCR-ABL fusion gene)를 생성시킨다(문헌 Melo, 1996 참조). 즉, 염색체 22로부터의 BCR("절단점군영역(breakpoint cluster region)") 유전자의 일부(q11 영역(region q11))가 염색체 9 상의 ABL 유전자의 일부(q34 영역)과 융합된다. AbI는 유사한 단백질을 전달하는 백혈병 바이러스의 이름인 "아벨손(Abelson)"을 의미한다. 상기 BCR 영역의 절단으로 인하여 두 종류들의 BCR-ABL 전사들(이들은 킬로달톤(kDa)로의 그들의 명백한 분자량에 따라 명명되는 p185 및 p210 아형(isoform)들을 생성함)을 생성한다. 상기 융합된 "BCR-ABL" 유전자는 그 결과의 보다 짧은 염색체 22 상에 위치된다. ABL은 포스페이트기들(phosphate groups)을 티로신 잔기들에 첨가할 수 있는 도메인(domain)(티로신 키나아제(tyrosine kinase))을 전달하며, 상기 BCR-ABL 융합 유전자 생성물을 또한 티로신 키나아제이다(문헌 Faderl et al., 1999 참조).

융합된 BCR-ABL 단백질은 인터류킨-3β 공통 수용기 서브유닛(interleukin-3 β common receptor subunit)과 상호작용한다. BCR-ABL 전사는 연속적으로 활성이며 다른 세포상 메시징 단백질들(cellular messaging proteins)에 의한 활성화를 필요로 하지 않는다. 결국, BCR-ABL은 세포 주기(cell cycle)를 조절하는 단백질들의 폭포(cascade)를 활성화시켜 세포 분화(cell division)를 촉진한다. 더욱이, BCR-ABL 단백질은 DNA 복구(DNA repair)를 저해하여, 유전자 상의 불안정성을 야기하고 그리고 세포가 보다 감수적이 되도록 하여 그 이상의 유전자 상의 불안정성을 발달시키고 그리고 잠재적으로 만성의 상태(chronic phase)에서 치료불가능한 아구성 발증(blast crisis)으로의 CML의 진전을 촉진한다. 상기 BCR-ABL 단백질의 상기 티로신 키나아제 작용은 만성골수성 백혈병의 병리생리학적 원인이 되는 것으로 여겨진다. 표적화된 치료법들 특히 상기 BCR-ABL 단백질의 활성을 억제하는 것이 개발되었다. 이들 중의 첫 번째는 이마티니브(상품명 Glivec® 또는 Gleevec®이라는 이름으로 그의 메실산염(mesylate salt)으로 판매됨)이었다. 이들 및 다른 티로신 키나아제 억제제들은 CML에서의 완전한 차도(remission)를 유도할 수 있으며, CML에서의 BCR-ABL의 중추적인 중요성을 확인할 수 있다(문헌 Hehlmann et al., 2007 참조). 필라델피아 염색체 양성 (Ph+) ALL를 BCR-ABL 억제제들로 치료하는 경우에 제한된 성공이 또한 보고되었다(문헌 Yanada and Naoe, 2006; Piccaluga et al., 2006 참조).

이마티니브 및 2세대 BCR/ABL 억제제들(예를 들면 다사티니브(dasatinib))의 도입이 필라델피아 염색체 양성 (Ph+) 백혈병을 앓는 환자들의 치료에 혁명적이었다는 사실에도 불구하고, 백혈병 세포들이 심지어 완전히 치료된 환자들에서도 존속하고 있으며, 또한 일부 환자들은 내성을 발전시키고 극단적으로는 재발한다는 알려진 문제점들이 있다(문헌 Swords et al., 2007; Buchert, 2007; Li and Li, 2007; Kujawski and Talpaz, 2007 참조). 이들 단점들에 대한 이유들은 완전히 풀리지 않았다.

따라서, 필라델피아 염색체 양성 백혈병을 앓는 환자들, 특히 BCR-ABL 억제제들로의 치료에 반응하지 않는 환자들을 치료하는 다른 선택들을 갖는 것이 유리할 수 있다.

본 발명은 암, 특히 백혈병을 치료하는 방법, 특히, 필라델피아 염색체 양성 (Ph+) 백혈병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 하나의 목적은 필라델피아 염색체 양성 (Ph+) 백혈병을 치료하기 위한 신규한 치료적인 접근법들을 제공하는 것이다. 특히, 이마티니브와 같은 BCR-ABL 억제제들이 (또는 더 이상) 치료법으로 적절하지 않은 환자들에 도움을 줄 수 있는 접근법들을 제공하는 것이 가능할 수 있다는 것이 예상된다. 놀랍게도, 비록 이 인자가 벡혈병 세포 내에서 발현되지는 않았음에도 불구하고, 경태반 성장인자의 억제(PIGF)가 백혈병 생쥐(leukemic mice)의 명백하게 연장된 생존의 결과를 가져왔다. 더욱이, 이 연장된 생존은 BCR-ABL 억제제들에 대해서 보여지는 것과는 반대로 BCR-ABL 돌연변이적 상태(mutational status)와는 독립적이다.

따라서, 첫 번째의 관점에 따르면, 필라델피아 염색체 양성 백혈병의 치료를 위한 경태반 성장인자의 억제제의 용도가 고려된다. 또한, 필라델피아 염색체 양성 백혈병의 치료를 위한 약물(medicament)의 제조를 위한 경태반 성장인자의 억제제의 용도가 고려된다.

유사하게, 대상체에 PIGF의 억제제를 투여하는 것을 포함하는 치료를 필요로 하는 대상체에서의 필라델피아 염색체 양성 백혈병을 치료하는 방법들이 제공된다. 물론, 그에 의하여 치료를 필요로 하는 대상체에서의 증후군들을 경감시키거나 또는 궁극적으로 Ph+ 백혈병을 치료하는 것이 목표이다.

특정의 구체예들에 따르면, 본 명세서에서 기술된 상기 용도들 및 방법들에서 제공된 경태반 성장인자의 억제제는 경태반 성장인자의 선택적 억제제이다. 특히, 상기 선택적 억제제는 경태반 성장인자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편이다. 이러한 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체가 될 수 있다. 특정의 구체예들에 따르면, 경태반 성장인자에 특이적으로 결합하는 상기 항체 또는 그의 단편은 모노클로날 항체이다. 다른 특정의 구체예들에 따르면, 쥣과의 모노클로날 항체(murine monoclonal antibody)이다. 또 다른 특정의 구체예들에 따르면, 쥣과의 모노클로날 항체들은 인간화된 것, 즉, H 및 L쇄(H and L chains)들을 코딩하는 생쥐 및/또는 인간 게놈 DNA 시퀀스들 또는 H 및 L쇄들을 코딩하는 cDNA 클론들로부터 시작하는 재조합 DNA 기술의 수단으로 만들어진 생쥐 모노클로날 항체들의 인간화된 버전들(humanized versions)이 될 수 있다. 대안의 구체예들에 따르면, 상기 항체 또는 그의 단편은 인간 항체(또는 그의 단편), 특히 인간 모노클로날 항체이다. 특정의 구체예들에 따르면, PIGF에 특이적으로 결합하는 상기 항체의 상기 단편은 Fab 단편(Fab fragment), F(ab')2 단편 또는 단일쇄 가변 단편(single chain variable fragment ; scFv)이다. 다른 특정의 구체예들에 따르면, 상기 선택적 억제제는 PIGF에 대한 나노바디(nanobody)이다. 또 다른 특정의 구체예들에 따르면, 상기 PIGF 억제제는 선택적 억제제가 아니다. 그의 특정의 구체예는 VEGFR-1 항체 또는 그의 단편 등과 같은 VEGFR-1 억제제이다.

필라델피아 염색체 양성 (Ph+) 백혈병의 치료를 위한 방법들 및 용도들이 제공된다. 특정의 구체예들에 따르면, 상기 필라델피아 염색체 양성 백혈병은 만성 골수성 백혈병(CML)이다. 대안의 구체예들에 따르면, 상기 Ph+ 백혈병은 예를 들면 B-ALL (여기에서 B 세포들은 백혈병 세포들임) 또는 T-ALL (여기에서 상기 백혈병 세포들은 T 세포들임) 등과 같은 급성의 림프구성 백혈병(ALL)이다.

본 명세서에서 기술되는 상기 방법들 및 용도들이 넓은 적용성(applicability)을 갖는다는 것이 고려된다. 특히, PIGF 억제제들이 모든 필라델피아 염색체 양성 백혈병들 특히 BCR-ABL 억제제로 치료될 수 없는 것 및/또는 BCR-ABL 억제제 단독으로 치료될 수 없는 것들의 치료(또는 치료의 방법들)에 사용될 수 있다는 것이 고려된다. Ph+ 백혈병은 여러 가지 이유들로 BCR-ABL 억제제, 또는 BCR-ABL 억제제 단독으로 치료되지 않을 수 있다. 가장 공통의 이유들은 상기 백혈병이 (적어도 부분적으로는) 치료에 대해 비감작적(insensitive)이라는 점(또는 치료에 대해 적어도 부분적인 내성/비감작성을 갖는다는 점) 또는 상기 BCR-ABL 억제제가 환자가 견딜 수 없는 것(예를 들면 알러지 또는 부작용들로 인한)이 될 수 있다는 점들이다. 비록 PIGF 억제가 Ph+ 백혈병들의 치료에서 일반적인 접근법을 제공한다고는 하나, 이는 예를 들면 CML에 대한 표준의 치료적인 접근법인 BCR-ABL 억제가 원하는 치료적인 효과를 야기하는 데 실패하는 경우들에 대해 특히 유리할 수 있다. 계속해서 PIGF 억제제들의 용도는 대안의 또는 부가의 접근법을 제공할 수 있다. 특정의 구체예들에 따르면, 상기 PIGF 억제제는 BCR-ABL 억제제와의 조합으로 사용될 수 있다.

본 출원은 암, 특히 백혈병의 분야에 관련된 것이다. 특히, 필라델피아 염색체 양성 (Ph+) 백혈병의 치료를 제공하는 효과가 있다.

도 1은 시험관 내에서의 백혈병 세포들, 조혈모세포들(hematopoietic cells) 및 원발성 골수 기질 세포들(primary bone marrow stromal cells)에서의 PIGF 발현을 나타내고 있다. A: 서로 다른 세포주들 및 단리된 세포들에 의해 분비된 PIGF 단백질의 양(보다 상세한 사항들은 실시예 1을 참조); B: 쥣과의 BMDSCs의 조혈모세포 분획(CD45⁺) 및 비-조혈모세포 분획(CD45^-)에 의한 PIGF 발현. *는 p<0,001을 표시. BM: 골수.
도 2에 있어서, 생체 내에서의 PIGF 및 다른 분자들의 발현을 나타내었다(상세한 사항들은 실시예 2를 참조). A, B: 생쥐에서의 백혈병 진전의 서로 다른 시점들(timepoints)에서의 말초혈액(peripheral blood) 또는 골수 내에서의 PIGF 단백질 수준들; C, D: 생쥐에서의 백혈병 진전의 서로 다른 시점들에서의 말초혈액 또는 골수 내에서의 PIGF 대 sVEGFR-1 단백질 수준들의 비율; E: 건강한 그리고 백혈병의 생쥐들에서의 골수 PIGF mRNA 발현, *는 p<0.002를 표시; F: 골수의 부분모집단들(subpopulation)에서의 PIGF 발현의 특정화(characterization), *는 p<0.05를 표시; G: 건강한 그리고 백혈병의 생쥐들에서의 골수 VEGF mRNA 발현; H, I: 말기의 질병을 앓는 생쥐에서의 백혈병의 부담(leukemic burden)과 연관된 말초혈액 또는 골수에서의 PIGF 단백질 수준들.
도 3은 PIGF에 의한 백혈병 세포들의 증식을 입증하고 있다(상세한 사항들은 실시예 3을 참조). A, B: 서로 다른 백혈병 세포주들 내에서의 Npn-1 및 Npn-2의 발현; C: PIGF의 서로 다른 농도들에 의한 BV-173 세포주들 내에서의 증식의 유도; D: K562(상부 좌측 패널), BV-173(상부 우측 패널), KCL-22(하부 좌측 패널) 및 BaF3(하부 우측 패널) 세포주 각각의 내에서의 50ng/㎖ PIGF에 의한 증식의 유도; E: 항-VEGFR-1 항체에 의한 BV-173 세포주 내에서의 PIGF 유도된 증식의 억제; F: 항-PIGF 항체에 의한 BV-173 세포주 내에서의 PIGF 유도된 증식의 억제. BM: 골수; PIGF: 경태반 성장인자; αVEGFR-1: 항-혈관내피 성장인자 수용기-1 항체; αPIGF: 항-PIGF 항체.
도 4에 있어서, 시험관 내에서의 백혈병 세포들과 BMDSCs 사에서의 파라크린 간섭(paracrine interaction)에 의한 유도(A-D)를 백혈병-세포 제어된 배지(medium)(E)와 함께 나타내었다. A: BDMSCs 내, BV-173 세포주 내 그리고 공-배양(BMDSCs + BV) 내에서의 PIGF 발현; B: S17 세포 내, BV-173 세포주 내 그리고 공-배양 내에서의 PIGF 발현; C: BV-173 백혈병 세포들 단독의 그리고 BMDSCs와의 공-배양에서의 증식 및 항-PIGF 항체에 의한 억제; D: BMDSCs 단독의 그리고 BV-173 백혈병 세포들과의 공-배양에서의 증식 및 항-PIGF 항체에 의한 억제; E: 백혈병 세포(BV-173)) 조절 배지로의 배양에 의한 S17 세포들 내에서의 PIGF 상향조절(upregulation). BV: BV-173 세포주; αPIGF: 항-PIGF 항체.
도 5A: 백혈병성 PIGF^{- l -} 및 야생형 생쥐들(WT mice)의 생존; B: 크로스오버 백혈병 생쥐의 생존(상세한 사항들은 실시예 5를 참조); C: 항-PIGF 항체로 또는 대조 항체로 처리한, 림프성(lymphatic) BCR-ABL+ BaF3 세포들에 의해 유도된 백혈병을 앓는 생쥐들의 생존; D, E: 초기 단계(d15) 및 말기 단계(d28)에서의 BCR-ABL+ 세포들의 FACS 분석 및 항-PIGF 항체로의 억제의 효과; F: 대조 및 항-PIGF 처리된 말기 백혈병 생쥐들의 골수 조직학; G: 항-PIGF 항체 또는 대조 항체로 처리된, 이마티니브-감작 CML의 생쥐 모델에서의 생존율; H: 항-PIGF 항체 또는 대조 항체로 처리된, 이마티니브-저항 CML의 생쥐 모델에서의 생존율. αPIGF: 항-PIGF 항체; d: 일수; T315I: BCR-ABL 융합 단백질의 T315I 돌연변이. 상세한 사항들은 실시예 6을 참조.
도 6은 항-PIGF 처리에 의한 골수 혈관과다(hypervascularization) 및 섬유증(fibrosis)의 억제를 나타낸다(실시예 7을 참조). A, C: 말기 백혈병에서 가성-이식된(mock-transplanted), 대조 항체-처리된 그리고 항-PIGF 처리된 생쥐들에서의 골수 혈관 밀도(MVD); B, D: 말기 백혈병에서 가성-이식된, 대조 항체-처리된 그리고 항-PIGF 처리된 생쥐들에서의 레티큘린 섬유들의 길이 및 골수 섬유증.
도 7에 있어서, 생쥐들(E) 및 인간들(F, 실시예 9)에서의 PIGF 발현 및 이마티니브 치료에 연관된 데이터와 마찬가지로 인간 CML에서의 PIGF 발현에 대한 데이터가 표시되었다(A-D, 실시예 8). A: CML(건강한 대조들, 만성 단계 및 아구성 발증)의 서로 다른 단계들에서의 혈장 PIGF 수준들, *는 p<0.0001을 표시; B: CML 환자들에서의 골수 혈장 PIGF 수준들; C: 인간 CML에서의 PIGF 수준들 및 BCR/ABL 전사의 수들 사이의 연관성; D: 건강한 대조들, CML 환자들의 백혈병 세포들 및 기질 세포들에서의 PIGF 발현의 QRT-PCR; E: 미치료된 백혈병 생쥐들 및 건강하고 그리고 이마티니브로 치료된 백혈병 생쥐들의 골수 PIGF 수준들; F: 건강한 인간 대상체들 및 이마티니브(IM)에 대해 서로 다른 반응 수준들을 갖는 환자들에서의 PIGF 수준들. 보다 상세한 사항들은 실시예 9를 참조.

정의들

본 발명은 특정의 구체예들 및 특정의 도면들을 참조하여 기술될 것이기는 하나, 그러나 본 발명은 이들에 제한되는 것은 아니며, 오직 특허청구범위들로만 제한되는 것이다. 특허청구범위들에서의 어떠한 참조 기호들도 본 관점을 제한하는 것으로 이해되어져서는 안될 것이다. 기술된 도면들은 단지 개략적이며 비-제한적인 것들이다. 도면들에 있어서, 구성요소들의 일부의 크기는 과장될 수 있으며, 설명적인 목적을 위하여 축적대로 도시되지 않을 수 있다. 용어 "포함하는"이 본 상세한 설명 및 특허청구범위들에서 사용되는 경우, 이는 다른 구성요소들 또는 단계들을 배제하는 것은 아니다. 예를 들면 "하나의, 어떤(a, an)", "그(the)"와 같이 부정관사 또는 정관사가 단수 명사를 언급하는 경우에서 사용되는 경우, 이는 어떤 다른 것이 특별히 언급되지 않는 한 명사의 복수를 포함한다.

더욱이, 본 상세한 설명 및 특허청구범위들에 있어서 제1, 제2, 제3 등과 같은 용어들은 유사한 요소들 사이를 구별하기 위하여 사용되며, 근본적으로 순차적 또는 경시적인 순서를 기술하는 것은 아니다. 사용된 상기 용어들은 적절한 환경들 하에서 상호교체가 가능하고, 그리고 여기에서 기술된 본 발명의 구체예들은 여기에서 기술되거나 또는 도시된 것과는 다른 순서들로의 작동이 가능하다는 것은 이해되어져야 한다.

하기의 용어들 또는 정의들이 단지 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제공된다. 여기에서 특별히 한정하지 않는 한, 여기에서 사용된 모든 용어들은 본 발명이 속하는 당해 기술분야에서 숙련된 자들이 갖는 것과 동일한 의미를 갖는다. 당해 기술분야의 정의들 및 용어들에 대해서는 실무자들(Practitioners)은 문헌 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (1989); 및 문헌 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999)들을 참조한다. 여기에서 제공되는 정의들은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 이해되는 것 보다 더 적은 관점을 갖는 것으로 이해되어져서는 안될 것이다.

여기에서 사용된 바와 같은 "경태반 성장인자" 또는 "PIGF"는 VEGF(혈관 경피 성장인자) 아족(sub-family), 특히 인간 PIGF(GenelD 5228; RefSeqs (독립적으로 유전자 빌드(genome builds)의) NM_002632.4 (mRNA) 및 NP_002623.2 (단백질))의 구성원을 의미한다. 달리 특정되지 않는 한, 용어 "PIGF"는 유전자와 마찬가지로 PIGF RNA(특히, PIGF mRNA) 및 PIGF 단백질 등과 같은 그의 생성물들을 의미할 수 있다. PIGF의 모든 아형들은 PIGF의 정의 내에 포함되는 것으로 의도된다.

여기에서 사용된 바와 같은 용어 "필라델피아 염색체 양성" 또는 "Ph+" 백혈병은 상기 필라델피아 전좌가 존재하는 것으로 확인되는 질병들을 의미한다. 상기 필라델피아 염색체는 t(9;22)(q34;qll) 전좌(필라델피아 전좌)의 결과이다. 상기 필라델피아 전좌의 적어도 2개의 동형들(alternative forms)이 기록되었으나, 두개의 동형의 절단들이 염색체 9 상에 위치되는 ABL 유전자 (OMIM *189980)의 엑손들(exons)의 공통의 서브셋트(common subset)에의 염색체 22 상의 BCR (OMIM *151410)의 엑손 셋트의 결합을 야기한다. 따라서, 상기 융합은 p210(BCR-ABL) 및 pl85(BCR-ABL)들로 불리우는 2개의 다른 키메라성의 암유전자(chimeric oncogene) 생성물들을 야기하며, 여기에서는 집합적으로 "BCR-ABL" (OMIM *151410 및 *189980에 포함된)로 언급된다. 상기 키메라성 암유전자의 발암잠재성(oncogenic potential)에 대해서는 암유전 잠재ABL 티로신 키나아제 활성의 활성화가 요구된다. 상기 키메라성 BCR-ABL 유전자(및 그의 유전자 생성물들)의 존재가 Ph+ 백혈병들의 특징이기 때문에, "Ph+"는 또한 "BCR-ABL 양성" 또는 "BCR-ABL+" 백혈병들로서 언급되어 상기 융합 유전자의 존재를 나타내도록 할 수 있다. 따라서 여기에서 관능적인 BCR-ABL 키메라성 유전자의 발생을 야기하는(즉, BCR-ABL+) 전좌들 또는 돌연변이들은 또한 전좌의 메카니즘과는 무관하게 "Ph+"로 분류될 수 있다. 이는 예를 들면 보다 복잡한 전좌들에 대해서도 적용될 것이다.

본 출원에서 사용되는 바와 같은 "경태반 성장인자의 선택적 억제제"는 다른 분자들의 생리학적 기능에 간섭함이 없이 PIGF의 기능 또는 신호 경로(signaling pathway)를 억제하는 분자 또는 화합물이다. 특히, 선택적 PIGF 억제제는 VEGF의 기능에 간섭하지 않을 것이다. 따라서, 비록 표적 VEGF(VEGFRl-기반의 화합물 등과 같은) 또는 표적 VEGF/PIGF-공유된 수용기들(예를 들면 VEGFRl 또는 sVEGFR-1에 대한 항체)가 전형적으로 비-선택적 억제제인 반면에, 비-제한적인 예들로서, PIGF에 대하여 특별히 지향되는 화합물(예를 들면, 항-PIGF 항체)은 선택적 억제제이다.

여기에서 사용되는 바와 같은 "만성 골수성 백혈병", "만성 골수 백혈병" 또는 "CML"은 골수 섬유아세포들(marrow fibroblasts ; OMIM #608232; Silver, 2003) 들을 제외하고 골수(myeloid), 적혈구(erythroid), 거핵세포(megakaryocytic), B 림프구(B lymphoid) 및 때때로 T 림프구 세포들을 포함하는 특정의 세포유전학적 이상(cytogenetic abnormality ; 필라델피아 염색체)을 갖는 만능 줄기세포의 클론성 골수증식성 질환(clonal myeloproliferative disorder)이다.

본 출원에서 사용되는 바와 같은 "급성 림프성 백혈병", "급성 림프구성 백혈병" 또는 "ALL"은 미성숙 백혈구들이 연속적으로 증폭하고 그리고 골수 내에서 과생산되는 백혈병의 급성 형태를 의미한다. ALL의 예들에는 T-ALL 및 B-ALL들이 포함된다. ALL 케이스들의 이형 그룹(heterogeneeous group)의 특정의 서브셋트는 또한 필라델피아 염색체에 대해 양성, 즉 Ph+ 또는 BCR-ABL+이다(문헌 Radich, 2001; Alvarado et al., 2007).

본 출원에서 사용되는 바와 같이, "BCR-ABL 억제제"는 키메라성 BCR-ABL 유전자 또는 그의 유전자 생성물의 발현 또는 기능을 억제하는 분자 또는 화합물이다. 흥미롭게도, 상기 BCR-ABL 억제제는 BCR-ABL에 대하여 특이적이어야 할 필요는 없다. 예를 들면, 단지 BCR-ABL 티로신 키나아제 이상을 표적으로 하는 티로신 키나아제 억제제가 될 수 있다. BCR-ABL 억제제는 Ph+ 백혈병에서 표적화된 치료법으로서 공지되어 있으며, 비-제한적인 그러나 전형적인 예는 이마티니브이다. 다른 구체예들이 본 출원에 포함된다.

본 출원에서 사용된 바와 같은 "치료"는 Ph+ 백혈병과 연관되는 하나 또는 그 이상의 임상적 증후군들의 명백한 호전(amelioration)을 달성하는 것을 의미한다. 상황에 따라서는, 상기 명백한 호전은 정량적으로 또는 정성적으로 기록될 수 있다. 정성적인 기준은 예를 들면 환자의 웰빙(심신의 안녕과 행복)이 될 수 있다. 정량적인 평가의 경우에 있어서는, 상기 명백한 호전은 전형적으로는 상기 PIGF 억제제의 투여 이전의 상황에 대하여 10% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 또는 그 이상의 개선이다. 물론, 개선이 감소(예를 들면, 환자 샘플 내에 존재하는 악성 세포들의 갯수)로 표현되는 경우, 개선은 100% 이상이 될 수 없다. 상기 개선이 평가되는 가용시간(time-frame)은 관측되는 기준의 형태에 의존적일 수 있으며, 당해 기술분야에서 숙련된 자들에 의하여 결정될 수 있다.

필라델피아 염색체 양성 백혈병의 치료를 위한 경태반 성장인자의 억제제들의 방법들 및 용도들을 제공하는 것이 본 발명의 하나의 중요한 관점이다. 또한, 필라델피아 염색체 양성 백혈병의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 경태반 성장인자의 억제제들의 용도가 고려된다.

경태반 성장인자(PIGF)의 억제제들은 특히 PIGF의 선택적 억제제들이며, 따라서 다른 분자들과 간섭하지 않는다. 특히, 상기 선택적 PIGF 억제제들은 VEGF의 기능과 간섭하지 않는다. 특정의 구체예들에 따르면, 상기 PIGF 억제제들은 VEFG 억제제들이 아니다.

다른 특정의 구체예들에 따르면, 상기 PIGF 억제제는 VEGFRl 억제제가 아니다. 특정의 구체예들에 따르면, 상기 PIGF 억제제는 VEGFRl에 기초하지 않는다.

억제제들은 PIGF의 합성, 번역(translation), 이량체화(이합체화 ; dimerisation), 수용기-결합 및/또는 수용기-결합-매개 신호 형질도입(receptor-binding-mediated signal transduction)과 간섭하는 것에 의하여 PIGF의 활성을 중화할 수 있다. PIGF의 활성의 중화는 상기 PIGF 활성을 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%.로 억제하는 것으로 이해되어야 한다.

PIGF의 억제제들, 특히 선택적 억제제들은 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 특정의 구체예들에 따르면, 상기 선택적 억제제들은 항체들이다. 용어 "항체" 또는 "항체들"은 PIGF에 특이적으로 지향되는 것들 또는 그들의 임의의 관능적인 유도체 또는 그들의 항원-결합 단편, 특히 F(ab')2, F(ab) 또는 단쇄Fv(scFv) 형태 또는 이들의 유도된 임의의 형태의 재조합 항체로 특정되는 항체에 연관된다. PIGF에 대하여 준비된 특정의 폴리클로날 항혈청(polyclonal antisera) 또는 그들의 임의의 관능적 유도체들을 포함하여 여기에서 기술되는 상기 항-PIGF 항체들은 다른 단백질들에 대하여 교차반응성을 갖지 않는다. 특정의 구체예들에 따르면, 상기 항-PIGF 항체들은 모노클로날 항체들이다. 상기 모노클로날 항체들은 예를 들면 동물, 특히 PIGF에 대하여 면역화된 생쥐 또는 집쥐(rat)의 비장세포들 또는 이들의 관능성 유도체 및 골수 세포주의 세포들부터 통상적인 방법에 따라 형성될 수 있으며, 또한 PIGF를 인식하는 상기 모노클로날 항체들 또는 상기 동물들의 면역화를 위하여 초기에 사용되었던 그들의 임의의 관능적 유도체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)의 능력에 의해 선택될 것으로 여겨지는 임의의 하이브리도마에 의하여 생산될 수 있다.

특정의 구체예들에 따르면, 인간 PIGF에 대한 모노클로날 항체들을 생산하는 것은 예를 들면 다음가 같이 수행될 수 있다 : PIGF 또는 그의 단편에 의하여 인코딩된 아미노산들로 이루어지는 재조합 인간 PIGF 융합 단백질을 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(Glutathione S-transferase ; GST)에 결합시키고 그리고 대장균 내에서 발현시키고 그리고 고정화 글루타치온(immobilised glutathione) 상에서 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography ; 아메르샴 바이오사이언시즈사(Amersham Biosciences))에 의하여 정제된다. 재조합 인간 PIGF는 또한 알앤디 시스템즈 인코포레이티드(R&D Systems Inc. 614 McKinley Place N. E. Minneapolis, MN 55413, USA. ; 264-PG-010, 264-PG-OlO/CF, 264-PG-050 or 264-PG-050/CF)로부터, 리서치 다이애그노스틱스 인코포레이티드(Research Diagnostics Inc, Pleasant Hill Road, Flanders NJ 07836, USA ; 재조합 인간 PIGF-I : Cat#RDI-300-015 & Cat#RDI-300-016 및 재조합 인간 PIGF-2: Cat#RDI-300-019) 또는 알렉시스 코포레이션(ALEXIS Corporation, CH-4415 Lausanne, Switzerland ; 경태반 성장인자-2 (인간) (재조합) cat#RLT-300-020)으로부터 획득가능하다..

재조합 인간 PLGF는 등량의 부형제(adjuvant)와 혼합되고 그리고 계속해서 수득된 혼합물은 후속하여 Balb/c 수컷 생쥐들(면역화의 개시 후 8주령)에 생쥐 1마리당 100㎍의 PIGF의 양에 대응하는 양으로 투여되었다(초기 면역화 ; priming immunisation).

약 21일 이후, 앞서 기술한 바와 동일한 방법으로 피하 투여(subcutaneous administration)에 의하여 면역화가 수행될 수 있다(촉진 면역화 ; booster immunisation). 상기한 촉진으로부터 19일 또는 30일 이후, 상기 생쥐들을 그들의 꼬리 정맥을 통하여 250㎍/㎖의 농도를 갖도록 PBS(포스페이트-완충된 생리 염수)로 인간 PIGF를 희석하는 것에 의하여 수득된 제제 200㎕를 투여할 수 있다(최종 면역화 ; final immunisation). 계속해서 상기 최종 면역화로부터 약 3일 이후 상기 생쥐들로부터 비장들이 절제되도록 하고 그리고 이들이 단일 세포들로 분리되도록 하였다. 후속하여, 상기 비장세포들을 적절한 배지, 예를 들면, DMEM 배지로 세척하였다. 한편, 적절한 생쥐 골수세포들(예를 들면, Sp2/0-Agl4)을 대수성장기(logarithmic growth phase) 내에서 수집되도록 하고 그리고 적절한 배지, 예를 들면, DMEM 배지로 세척되도록 하였다. 상기 비장세포들 및 상기 생쥐 골수세포들이 플라스틱 튜브 내에서 10 : 1의 세포들의 수들의 비율로 충분히 혼합되도록 하고, 계속해서 50중량/용적%의 폴리에틸렌글리콜(PEG, 예를 들면, 베링거 만하임사(Boehringer Mannheim)의, 평균분자량 : 4000)을 첨가하는 것에 의하여 37℃에서 7분간 세포 융합이 수행되도록 하였다. 상층액(supernatant solution)(원심분리의 수단에 의하여)을 제거한 이후, 잔사(residue)에 HAT 배지(하이포크산틴(hypoxanthine), 아미놉테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine)들이 첨가된 10% 우태혈청을 포함하는 DMEM 배지)를 첨가하였다. 상기 잔사가 현탁되도록 하여 약 5*10⁶ 세포들/㎖의 비장세포들의 농도가 수득되도록 하였다. 이 세포 현탁액은 계속해서 96-웰(well)의 플라스틱 플레이트들 내로 부어 넣어 하나의 웰이 약 100㎕의 현탁액을 포함하도록 하고 계속해서 5% 이산화탄소 내에서 37℃에서 배양되도록 하였다. HAT 배지가 예를 들면 2일차 및 5일차들에서 50㎕/웰의 양으로 보충되도록 하였다. 그 후, 하이브리도마들의 증식에 따라 상기 배지의 절반 용적이 매 3일 또는 4일 마다 교환되도록 하였다.

본 발명의 상기 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마들이 스크리닝되도록 하였다. 이는 지수(index)로서 PIGF에 의하여 보유된 생리학적 활성에 대한 상기 모노클로날 항체의 억제 활성을 사용하는 것에 의하여 수행되었다.

계속해서 PIGF에 대하여 반응성을 나타내는 모노클로날 항체들을 생산하는 하이브리도마들을 상기 선택된 클론들로부터 선택되도록 하였다. 계속해서 수득된 하이브리도마들이 적절한 배지, 예를 들면, HAT 배지와 동일하나 아미놉테린이 없는 HT 배지로 옮겨지도록 하고 계속해서 배양되도록 하였다. 그에 의하여 안정한 하이브리도마들이 수득될 수 있는 한계희석법(limiting dilution method)에 따라 클로닝이 2회 수행될 수 있다.

계속해서 모노클로날 항체들의 생산 및 정제가 다음과 같이 수행될 수 있다 : 2.6, 10, 14-테트라메틸펜타데칸(Tetramethylpentadecane ; 예를 들면, 시그마사의 프리스탄(Pristane), 0.5㎖)이 Balb/c 암컷 생쥐들(6 내지 8주령) 내로 복강내(intraperitoneally)로 주사될 수 있다. 10 내지 20일 이후, 클론들의 세포들(1*10⁶ 내지 10⁷ 세포들)이 PBS 내에 현탁될 수 있으며 상기 생쥐들 내로 복강내로 접종될 수 있다. 7 내지 10일 이후, 상기 생쥐들이 희생되고 그리고 복부 수술(abdominal operation)에 적용될 수 있으며, 그로부터 생산된 복수액(ascitic fluid)이 수집될 수 있다. 상기 복수액을 원심분리시켜 불용성 물질들을 제거하고 그리고 상층액이 회수되고 그리고 -20℃에서 정제될 때까지 저장될 수 있다. 따라서 하이-트랩 프로테인-에이 항체 정제 키트(Hi-Trap Protein-A a ntibody purification kit ; 파마시아사(Pharmacia, Roosendaal, Netherlands)로부터 획득가능)를 사용하는 것에 의하여 앞서 기술된 상기 복수액 상층액으로부터 면역글로블린 G(IgG)가 정제될 수 있다. 즉, 상기 복수액(2㎖)이 용액 A(1.5M 글리신, 3M NaCl, pH 8.9, 8㎖)에 첨가되고 그리고 45lm(밀리포어사(Millipore)의 기공 크기를 갖는 여과를 위한 필터로 여과될 수 있다. 그 후, 용액 A로 충분히 평형화된 프로테인 세파로스 HP(Protein Sepharose HP ; 파마시아사에 의해 생산된)로 충진된 컬럼(컬럼 용적 : 1㎖)에 수득된 여과물(filtrate)이 적용될 수 있으며, 상기 컬럼은 컬럼용적의 10배의 양의 용액 A로 세척되었다. 후속하여, 면역글로블린 G가 컬럼용적의 10배의 양의 용액 B(0.1M 글리신, pH 2.8)로 용리될 수 있다. 용리된 면역글로블린 G는 PBS에 대하여 투석될 수 있다. 앞서에서 수득된 정제된 항체들을 사용하여 상용적으로 획득가능한 서브클래스-결정 키트(subclass-determining kit ; 상표명 : Mono Ab-ID EIA Kit A, 자이메드(Zymed)에 의해 생산됨)에 의하여 그들의 면역글로블린 G 서브클래스들에 대한 상기 모노클로날 항체들이 결정될 수 있다. 이 방법은 효소결합면역흡착검사법(ELISA method)에 기초하고 있다.

모노클로날 항체들의 억제 활성들은 rPIGF의 그의 VEGFRl 수용기에의 결합의 완전한 저해에 대하여 시험될 수 있다. 예를 들면, 이는 면역관능적인 효소결합면역흡착검사(immunofunctional ELISA)에서 측정될 수 있으며 여기에서는 96-웰 플레이트들이 실온에서 PBS 내에서 밤새 동안 1㎍/㎖의 rmFlt-l/Fc 키메라 100㎕로 코팅된다. 1시간 동안 PBS 내의 1% 우혈청알부민(BSA)로의 블로킹(blocking) 이후, 계속해서 10ng/㎖에서 2시간 동안 실온에서 70㎕의 재조합 mPIGF-2로 전배양된(pre-incubated) 70㎕의 하이브리도마 배지의 혼합물 100㎕를 상기 플레이트에 적용시켰다. 20ng/㎖ 내지 156pg/㎖의 범위의 표준의 rmPIGF-2가 포함될 수 있다(PBS-트윈, BSA-EDTA로 희석된). 계속해서 플레이트들은 1시간 동안 37℃에서 그리고 1시간 동안 실온에서 배양되고, PBs-트윈으로 5회 세척될 수 있으며 200ng/㎖에서 비오티닐화된 염소 항-쥣과의 PIGF-2(biotinylated goat anti-murine PIGF-2) 100㎕가 2시간 동안 실온에서 적용될 수 있다. PBS-트윈으로 5회 세착한 후, 100㎕의 아비딘-에이취알피 콘쥬게이트(avidin-HRP conjugate ; 벡타스토리안 에이이비시 킷트(Vectastorin ABC kit))가 1시간 동안 실온에서 적용될 수 있다. PBS-트윈으로 5회 세척한 후, 상기 플레이트는 시트르산염 인산염 완충제(citrate phosphate buffercitrate phosphate buffer) pH 5.0 내의 오르토-페닐렌디아민(o-phenylene diamine) 90㎕로 전개되고 그리고 490㎚에서 측정될 수 있다.

본 명세서에서는 또한 억제 항체 리간드들(antibody ligands)이 제공되며 이는 PIGF에 결합할 수 있다. 특히, 이러한 리간드는 PIGF 상에 위치되는 특정의 에피토프(epitope)를 인식할 수 있을 것이다. 예를 들면, 본 발명은 동물들에서의 고의적인 면역화에 의하여 생산된 모노클로날 항체로부터 유도되는 앞서 언급한 형태의 리간드들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항원-결합 Fab 단편 또는 이러한 단편의 상동 유도체(homologue derivative)를 제공하며, 이들은 당해 기술분야에서 잘 알려진 방법들을 사용하는 파파인(papain)에 의한 상기 모노클로날 항체의 단백질가수분해적 소화(proteolytic digestion)에 의해 수득될 수 있다. 쥣과의 항-PIGF 모노클로날 항체의 면역원성(immunogenicity)을 감소시키기 위하여, 본 발명은 또한 우선적으로는 단일쇄 가변 도메인(single-chain variable domain)으로서 키메라성 항체의 구축을 포함하며, 이는 생쥐 항체의 가변 영역(variable region)을 소위 인간화된 모노클로날 항체인 인간 항체 고정 영역(human antibody constant region)과 결합시킨다.

예를 들면 비-인간 모노클로날 항체로부터의 결합 상보적 결정 영역(complementarily determining region ; "CDR")을 문헌 Jones et al. (Jones et al., 1986) 또는 문헌 Riechmann (Riechmann et al., 1988)들에서 기술된 바와 같이 또는 달리 인간화된 인간 골격 영역들(human framework regions) - 특히 인간 유전자의 고정 C 영역(constant C region)과 결합시키는 것에 의하여 동물들에서 생산된 상기 모노클로날 항체들이 인간화될 수 있다.

이들 구체예들에 따른 상기 모노클로날 항체들은 H쇄 및 L쇄들을 코딩하는 생쥐 및/또는 인간 게놈 DNA 시퀀스들 또는 H쇄 및 L쇄들을 코딩하는 cDNA 클론들과는 별개로, 재조합 DNA 기술에 의하여 만들어지는 생쥐 모노클로날 항체들의 인간화된 버전들이 될 수 있다.

달리 이들 구체예들에 따른 상기 모노클로날 항체들은 인간 모노클로날 항체들이 될 수 있다. 예를 들면, 이러한 인간 모노클로날 항체들은 PCT/EP99/03605에서 기술된 바와 같은 중증 복합 면역결핍증(severe combined immune deficiency) 생쥐의 인간 말초혈액림프구들(peripheral blood lymphocytes ; PBL) 재분포(repopulation)에 의하여 또는 미합중국 특허 5,545,806호에서 기술된 바와 같은 인간 항체들을 생산할 수 있는 유전자이식된 비-인간의 동물들을 사용하는 것에 의하여 제조된다. 본래의 결합 특성들(binding properties)을 보유한다고 가정하면 Fab, F(ab')2 및 scFv("단일쇄 가변 단편 ; single chain variable fragment") 등과 같이 이들 모노클론라 항체들로부터 유도된 단편들 또한 본 명세서에서 기술되는 것들의 일부를 구성한다. 이러한 단편들은 공통적으로, 예를 들면, 상기 항체들의 파파인, 펩신 또는 다른 프로테아제들로의 효소적 소화(enzymatic digestion)에 의하여 생산된다. 특정의 구체예들에 따르면, PIGF의 선택적 억제제는 항체의 단편이고, 이 단편은 경태반 성장인자에 특이적으로 결합한다. 특정의 구체예들에 따르면, 상기 항체 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 단일쇄 가변 단편(scFv)이다.

특정의 구체예들에 따르면, F(ab')2 또는 1가의 Fab 단편의 제조는 예를 들면 다음과 같다 : F(ab')2 단편들을 제조하기 위하여, 상기 모노클로날 항체는 0.1몰/ℓ 시트르산염 완충제(pH 3.5)에 대하여 밤새도록 투석될 수 있다. 계속해서 상기 항체(200부)는 시그마사(Sigma ; 미주리주 세인트루이스)로부터 획득가능한 펩신(1부)과 함께 1시간 동안 37℃에서 배양시키는 것에 의하여 소화된다. 후속하여 1몰 트리스 HCl 완충제(pH 9) 1용적을 10용적의 항체에 첨가하는 것에 의하여 소화가 중단된다. 1가의 Fab 단편들은 다음과 같이 파파인 소화에 의하여 제조될 수 있다 : 1용적의 1몰 인산염 완충제(pH 7.3)를 10용적의 상기 모노클로날 항체에 첨가하고 계속해서 1용적의 파파인(시그마사)을 모노클로날 항체, 10밀리몰/ℓ 엘-시스테인 염산염(L-cysteine HCl)(시그마사) 및 15밀리몰/ℓ 에틸렌디아민테트라아세트산(이하에서는 EDTA로 언급함)을 포함하는 25용적의 인산염 완충액에 첨가하였다. 3시간 동안 37℃에서 배양시킨 후, 30밀리몰/ℓ의 최종 농도의 신생의 요오드아세트아미드(iodoacetamide) 용액을 첨가하고 그 혼합물을 암중(in the dark)의 실온에서 30분 동안 유지시키는 것에 의하여 소화를 중단시켰다. F(ab')2 및 Fab 단편들 둘 다는 프로테인-에이-세파로스(protein-A-Sepharose)를 사용하여 오염시키는 온전한 면역글로블린 G(IgG) 및 Fc 단편들로부터 더욱 정제될 수 있다. 정제된 단편들은 최종적으로 인산염-완충된 염수(phosphate-buffered saline ; 이하에서는 PBS라 언급함)에 대하여 투석될 수 있다. 상기 단편들의 순도는 소듐도데실설페이트폴리아크릴아미드 겔 전기영동(sodiumdodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis)에 의하여 결정될 수 있으며 또한 단백질 농도는 비친초니신산 단백질 분석 시약 에이(bicinchonicic acid Protein Assay Reagent A ; 피어스사(Pierce) 일리노이주 록포드)를 사용하여 측정될 수 있다.

당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 (모노클로날) 항체들 또는 그의 단편들이 여러 용도들을 위하여 변형될 수 있음은 이해될 수 있는 것이다. 본 발명에 포함되는 상기 항체들은 효소(enzymatic), 형광(fluorescent) 또는 방사성(radioactive) 형태의 적절한 표지(label)로 표지될 수 있다.

항-PIGF 항체들의 예들은 당해 기술분야에서는 잘 기록되어 있다. 이들에는 문헌 Fischer (Fischer et al., 2007)에 의해 기술된 것 또는 쥣과의 모노클로날 항체 Mab-PL5D11 (WO01/85796; 이 모노클로날 항체는 브이아이비 베살리우스 리서치 센터(VIB Vesalius Research Center ; UZ Gasthuisberg, Herestraat 49, B-3000 Leuven)에서 획득가능한 것임)들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 16D3 항체 등과 같은 다른 항체들이 예를 들면 유럽특허 EP1869085호에 기술되어 있다. 또한 국제특허 WO2004/002524호는 어떻게 항-PIGF 항체들을 생산하는 지를 기술하고 있다. 유럽특허 EP1869085호 및 국제특허 WO2004/002524호들 둘 다를 여기에 참고로 인용되었다. 더욱이, 항-PIGF 항체들은 또한 예를 들면 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Santa Cruz Biotechnology Inc), 어빔사(Abeam), 노부스 바이오로지컬스사(Novus biologicals), 알앤디 시스템즈사(R&D systems), 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich) 및 많은 다른 회사들로부터 상용적으로 획득가능하다.

상기 방법들이 또한 다른 항체들의 제조를 위하여, 예를 들면, 항-VEGFR-1 항체들의 제조를 위하여 적용될 수 있으며, 이는 PIGF의 비-선택적 억제제들이다.

PIGF의 다른 억제제들, 특히 PIGF의 선택적 억제제들에는 앞서 언급한 바와 같은 중화 효과를 갖는 펩티드들(peptides), 사량체성 펩티드들(tetrameric peptides), 단백질들, 유기 분자들(organic molecules) 또는 그들의 단편들 또는 상동체들(homologues)이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 이 비-한정적인 목록 내의 다른 억제제들에는 PIGF의 전사를 억제하도록 기능하는 항-감작 RNA 및 DNA 분자들 및 리보자임들(ribozymes), 펩티드 압타머들(peptide aptamers ; 예르를 들면 siRNAs(예를 들면, 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이티드), 헤어핀(hairpin) RNA들 및 shRNA들(예를 들면 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이티드), 몰포리노스(morfolinos), 나노바디들(nanobodies) 및 작은 분자들(small molecules) 들이 포함된다. 이러한(비-선택적인 것과 마찬가지로 선택적인) 억제제들의 대부분은 상용적으로 획득가능하다. 가능한 억제제들의 일부가 이하에서 논의될 것이다.

작은 분자들, 예를 들면, 작은 유기 분자들 및 다른 약물 후보들이 예를 들면 조합 및 천연의 생성물 라이브러리들(product libraries)로부터 수득될 수 있다. 상기 후보/시험 분자들을 스크리닝하기 위하여, 예를 들면 VEGFR-1을 발현하는 세포주들이 사용될 수 있으며, 본 명세서에 참조로 인용되는 국제특허 공개공보 WO 01/85796호에서 상세하게 기술된 바와 같이 신호 전달(signal transduction)이 모니터링된다. 상기 모니터링(monitoring)은 표준의 생화학 기술들을 사용하여 측정될 수 있다. 촉매적 활성(catalytic activity)의 활성화(activation) 또는 억제(suppression), 다른 단백질들의 포스포릴화(phosphorylation ; 예를 들면 상기 수용기의 세포내 도메인(intracellular domain)의 티로신 포스포릴화(tyrosine phosphorylation)) 또는 탈포스포릴화(dephosphorylation), 2차 메신저 생성(second messenger production)의 활성화 또는 조절(modulation), 세포 이온 수준들에서의 변화들, 신호화 분자들의 결합(association), 해리(dissociation) 또는 전위(translocation) 또는 특정의 유전자들의 전사 또는 번역 등과 같은 다른 응답들(responses)이 또한 모니터링될 수 있다. 이들 분석들은 스크리닝의 과정에서 이들 목적들을 위하여 개발된 통상의 기술들을 사용하여 수행될 수 있다. 리간드의 세포상 수용기에의 결합의 억제는 신호 전달 경로들을 통하여 세포상 과정들(cellular processes)의 다양성에 영향을 줄 수 있다. 상기 VEGFR-1/PIGF 신호화 경로(signalling pathway)의 제어 하의 세포상 과정들에는 정상적인 세포 기능들, 증식, 분화, 세포 형태의 유지, 미조절된 세포 증식 등과 같은 비정상적이거나 또는 잠재적으로 유해한 과정들에 더한 부착(adhesion), 접촉 억제(contact inhibition)의 손실, 분화의 블로킹 또는 세포 사멸들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 당해 기술분야에서 공지된 기술들에 의한 상기 기술된 임의의 세포상 과정들의 정량적 또는 정성적인 관측 및 측정은 스크리닝의 과정에서 신호 전달에 대한 기록의 수단으로서 유리하게 사용될 수 있다.

작은 분자들에 대한 스크리닝의 대안의 방법은 실리코 디자인(silico design)을 통한 것이다. 인간 경태반 성장인자의 결정 구조는 획득가능(단백질 데이터베이스 코드(PDB Code) : IFZV)하며, 따라서 이 방법 또한 그 이상의 작은 분자 길항제 스크린(small molecule antagonist screens)을 위한 플랫폼(platform)으로서 기능할 수 있다. PIGF의 구조에 기초하여 하나의 억제분자 또는 일련의 분자들이 설계될 수 있으며, 그 이후 이들은 앞서 기술한 바와 같은 스크리닝을 사용하여 평가될 수 있다.

고체상 지지체(solid phase support)에 부착된 아미노산들의 모든 가능한 조합들로 이루어지는 본 명세서에서 그 이상 기술되는 사량체성 펩티드 라이브러리들(tetrameric peptide libraries) 등과 같은 랜덤 펩티드 라이브러리들(random peptide libraries)이 주어진 수용기 또는 키나아제 도메인들 등과 같은 수용기의 다른 관능성 도메인들의 리간드 결합 사이트(ligand binding site)에 결합할 수 있는 펩티드들을 동정하는 데 사용될 수 있다(문헌 Lam et al., 1991을 참조). 펩티드 라이브러리들의 스크리닝은 주어진 수용기에 대한 그들의 간섭들을 통한 수용기들의 생물학적 활성을 억제하는 작용을 하는 약품들(pharamceutical agents)의 발견에서 치료학적 값(therapeutic value)을 가질 수 있다. PIGF(또는 선택적으로 VEGFR-1)에 결합할 수 있는 분자들의 동정은 재조합 PIGF 단백질(또는 가용성 VEGFR-1 단백질)에 대하여 펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 키나아제 또는 VEGFR-1의 세포외 리간드 결합 도메인들이 별도로 발현되고 그리고 펩티드 라이브러리들을 스크리닝 하는 데 사용될 수 있다. 가용성 VEGFR-1 분자들의 사용에 더해, 다른 구체예에 있어서, 온전한 세포들을 사용하여 세포 표면 수용기들을 결합하는 펩티드들을 검출하는 것이 가능하다. 이 기술에 사용된 상기 세포들은 살아있거나 또는 고정된 세포들 둘 다가 될 수 있다. 상기 세포들은 랜덤 펩티드 라이브러리와 함께 배양될 수 있으며 상기 라이브러리에서 특정의 펩티드들을 결합하여 상기 표적 세포들(target cells)과 연관된 고체상 지지체/펩티드 사이에 "로제트(rosette)"를 형성할 수 있다. 그 후 상기 로제트는 분별 원심분리법(differential centrifugation)에 의하여 단리되거나 또는 해부 현미경(dissecting microscope) 하에서 물리적으로 제거될 수 있다.

특정의 구체예에 있어서 VEGF-수용기들의 초우성-음성의 돌연변이 형태들(transdominant-negative mutant forms)(예를 들면, VEGF-R1의 초우성-음성의 수용기)이 PIGF의 신호 전달을 억제하는 데 사용될 수 있다. VEGF-수용기들의 상기 초우성-음성의 돌연변이 형태들의 용도는 미합중국 특허 5,851,999호에서 충분히 기술되어 있다. 더욱이, 막관통 및 세포질 도메인들을 결여하는 상기 VEGF 수용기 Fit1의 접착 변종(splice variant)인 태반 가용성 fms-형 티로신 키나아제 1(sFIt1)는 잠재적 PIGF 길항제로서 작용한다는 것이 알려져 있으며(문헌 Kendall et al., 1996; Shibuya, 2001 참조) 또한 가용성 VEGFR1 융합 단백질들(문헌 Aiello et al., 1995 참조)이 생체 내에서 PIGF 활성을 억제하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 비록 그 자체로서 성공적임에도 불구하고, 초우성-음성의 수용기들의 사용은 PIGF 단독의 선택적 억제제들이 될 수 없다는 단점을 가질 수 있다. 따라서, 특정의 구체예들에 따르면, PIGF의 상기 억제제는 초우성-음성의 수용기는 아니다.

생체 내에서 단백질 기능을 비활성화시키는 그의 용도를 고려할 때 RNA는 작은 유기 분자들에 비해 뚜렷한 잇점들을 갖는다. RNA 인코딩 시퀀스는 프로모터(promoter)에 연결될 수 있으며, 이러한 인공적인 유전자는 세포들 또는 유기체들 내로 도입될 수 있다. 포함된 조절 시퀀스(regulatory sequence)에 따라, 이는 시간- 및/또는 조직-특이성 억제 유전자(suppressor gene)를 구축하는 독특한 방법을 제공한다. 이러한 RNA 억제 유전자들은 대개 단백질-코딩 유전자들 보다 더 작으며, 쉽게 유전자요법 벡터들(gene therapy vectors) 내로 삽입될 수 있다. 외래 또는 변형된 단백질과는 달리, RNA는 면역 응답(immune response)을 덜 유발시키는 것 같다. 항감작 분자들 및 리보자임들이 합리적인 약물 설계 및 정교한 특이성으로 유전자 기능을 비활성화시키기 위한 "코드 차단제들(code blockers)"로서 개발되었었다(문헌 Altman, 1995; 문헌 Matteucci and Wagner, 1996 참조). 기계론적으로, 항감작 올리고디옥시뉴클레오티드들(antisense oligodeoxynucleotides ; "ODNs") 및 생물공학적인 리보자임들 둘 다는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 후그스틴 쌍짓기(Hoogsteen base pairing)에 기초하는 표적 뉴클레오티드 시퀀스에 대한 안정한 듀플렉스(duplex)(상기 ODNs의 일부 경우들에 있어서는 트리플렉스(triplex))를 형성하는 것에 의하여 그들의 작용의 제1단계에서 특이적인 결합을 달성할 것으로 기대된다.

특정의 구체예들에 있어서, PIGF 억제제는 압타머(aptamer)가 될 수 있다. 압타머들의 결합 특성들을 구축하고 그리고 결정하는 방법들은 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 이러한 기술들은 미합중국 특허 5,582,981호, 동 5,595,877호 및 동 5,637,459호들에 기술되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참조로 인용되었다.

압타머들은 합성, 재조합 및 정제 방법들을 포함하여 임의의 공지된 방법들에 의해 제조될 수 있으며, 단독으로 또는 동일한 표적에 대해 특이적인 다른 리간드들과 함께 사용될 수 있다. 대체로, 대략 3개의 최소 뉴클레오티드들, 바람직하게는 적어도 5개의 뉴클레오티드들이 특이적인 결합을 발휘하는 데 요구된다. 비록 10, 20, 30 또는 40개의 뉴클레오티드들의 압타머들이 선호될 수 있기는 하나, 10개의 염기들 보다 짧은 시퀀스들의 압타머들이 실현가능할 수 있다.

압타머들은 결합 특이성을 부여하는 시퀀스를 포함할 것이 필요하나, 그러나 플랭킹 영역들(flanking region)로 연장되고 그리고 달리 유도체화될 수 있다. 특정의 구체예들에 있어서, 압타머들의 PIGF-결합 시퀀스들은 프라이머-결합 시퀀스들로 덧붙여져서(flanked) PCR 또는 다른 증폭 기술들에 의하여 압타머들의 증폭을 용이하게 할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 플랭킹 시퀀스는 기질(substrate)에의 상기 압타머의 고정화를 증가시키기 위한 성분(moiety)을 우선적으로 인식하거나 또는 결합하는 특정의 시퀀스를 포함할 수 있다.

통상의 DNA 또는 RNA 분자들과 마찬가지로 압타머들은 단리되거나, 시퀀스되거나 및/또는 합성될 수 있다. 달리, 대상의 압타머들은 변형된 올리고머들을 포함할 수 있다. 압타머들 내에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실기들이 포스포네이트기들(phosphonate groups)로 치환되거나, 표준 보호기(protecting group)에 의해 보호되거나 또는 활성화되어 다른 뉴클레오티드들에 부가의 연결들을 제조할 수 있거나 또는 고체 지지체들에 콘쥬게이트될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 포스포디에스테르 연결들(phosphodiester linkages)이 P(O)S, P(O)NR2 , P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CNR2로 대체된 P(O)O 등과 같은 다른 연결기들로 대체될 수 있으며, 여기에서 R은 H 또는 탄소수 1 내지 20의 알킬이고, R'는 탄소수 1 내지 20의 알킬이고; 더욱이, 이 기는 산소(O) 또는 황(S)을 통하여 인접하는 뉴클레오티드들에 부착될 수 있다. 올리고머 내의 모든 연결들이 동일하여야 할 필요는 없다.

특정의 결합 시퀀스들을 결정하기 위한 출발물질들로서 사용된 압타머들은 단일-가닥(single-stranded) 또는 이중-가닥(double-stranded) DNA 또는 RNA가 될 수 있다. 특정의 구체예에 있어서, 상기 시퀀스들은 단일-가닥 DNA이며, 이는 RNA 보다 핵산가수분해효소(nuclease) 분해에 덜 감작적이다. 특정의 구체예들에 따르면, 출발 압타머는 대체로 10 내지 400개의 뉴클레오티드들, 특히 20 내지 100개의 뉴클레오티드들을 포함하는 랜덤화된 시퀀스 부분을 포함할 수 있다. 상기 랜덤화된 시퀀스는 상기 표적에 결합하는 것으로 밝혀진 압타머들의 증폭을 허용하는 프라이머 시퀀스들로 덧붙여진다. 랜덤화된 영역들의 합성을 위하여, 합성 동안에 랜덤화가 소망되는 위치들에서 뉴클레오티드들의 혼합물들이 첨가될 수 있다.

특정의 흥미의 표적들에 결합하는 압타머들의 제조 및 스크리닝을 위한 방법들은 예를 들면 미합중국 특허 5,475,096호 및 동 5,270,163호로 잘 알려져 있으며, 이들 각각은 여기에 참조로 인용되었다. 상기 기술은 대체로 후보 압타머들의 혼합물로부터의 선택과 결합의 단계적인 반복들, 결합되지 않은 압타머들로부터의 결합된 압타머들의 분리 및 증폭이 포함된다. 단지 가장 높은 친화성(affinity) 압타머들에 대응하는 작은 수의 시퀀스들(가능하게는 단지 압타머의 하나의 분자)이 상기 혼합물 내에 존재하기 때문에, 대체로 기준을 분할하여 설정하여 상기 혼합물 내의 뚜렷한 양(대략 5 내지 50%)의 압타머들이 분리 동안에 잔류되도록 하는 것이 바람직하다. 각 사이클은 상기 표적에 대한 높은 친화성을 갖는 압타머들의 풍부화의 결과를 야기한다. 3 내지 6회 사이의 선택의 반복 및 증폭 사이클들이 사용되어 PIGF 등과 같이 상기 표적에 대하여 높은 친화성 및 특이성으로 결합하는 압타머들을 생성할 수 있다.

특정의 구체예들에 따르면, 상기 압타머들은 특히 PLGF와 또는 선택적으로 VEGF-Rl 또는 VEGFR-1/PIGF 신호화 경로(signalling pathway)의 다른 비핵산물질들과 간섭하는 RNA 압타머들이다. 이들은 치료학적 시약들(therapeutic reagents)로서 사용될 수 있다. RNA 압타머들은 직접적으로 단백질 기능을 방해하는 그들의 능력으로 사용된다. 시험관 내 압타머들의 선택은 특정의 단백질들에 대한 높은 특이성 및 친화성을 갖는 극히 희귀한 RNA들의 신속한 단리를 허용한다. 예시적인 RNA 압타머들은 골드(Gold)와 그의 동료들에의 미합중국 특허 5,270,163호 및 문헌 Ellington and Szostak, 1990, and Tuerk and Gold, 1990들에서 기술되었다. 표적들이 1차원적인 격자들(one dimensional lattices)인 항감작 화합물들과는 달리, RNA 압타머들은 단백질의 3차원적인 표면들에 결합할 수 있다. 더욱이, RNA 압타머들은 종종 단백질의 이산된 관능성 사이트들 중에서도 섬세하게 차별될 수 있다(문헌 Gold et al., 1995 참조). 치료적인 시약들로서, 압타머들은 항체들 및 작은 분자 덩어리 약물들의 결합된 잇점들을 가질 뿐만 아니라 RNA 압타머들의 생체 내 생산 또한 유전적으로 제어될 수 있다. 높은 친화성 RNA 압타머들의 제어된 발현은 단백질들의 특정의 도메인들을 신속하게 비활성화시키고, 그에 의하여 그들의 기능 및 작용의 메카니즘을 평가하는 수단을 제공한다.

미합중국 특허 5,840,867호에서의 툴레(Toole)와 그의 동료들 및 미합중국 특허 6,207,388호에서의 그로스만(Grossman)과 그의 동료들은 압타머들을 제조하는 방법들과 생체분자들에 결합하는 압타머들을 기술하고 있다. 이들 압타머들은 분리 도구(separation tool), 진단 또는 치료학적 도구로서 생체분자들의 정상적인 생물학적 기능에 간섭하도록 하는 데 사용될 수 있다. 툴레와 그의 동료들에 의해 기술된 상기 압타머들은 단일쇄 또는 듀플렉스 RNA 또는 DNA가 될 수 있다.

코쓰(Korth)와 그의 동료들(문헌 Korth et al., 1997)은 시리안 골든 햄스터(Syrian golden hamster) 프리온 단백질에 대하여 지향되는 단일-가닥 RNA 압타머들을 적용하였으며, 상기 압타머들은 수 백개의 서로 다른 단백질들의 혼합물 내에서 그들의 특정의 표적을 인식할 수 있었다. 데이비스(Davis)(문헌 Davis (1994))는 트롬빈의 활성 사이트(active site)를 결합하고 그리고 생체 내에서 항-응집 효과들을 나타내는 단일-나선 DNA 압타머를 기술하였다.

라잔드란(Rajendran), 만줄라(Manjula) 등(US20020127581)은 DNA가 특정의 편향된 몰비의 뉴클레오티드들의 무작위 삽입(random insert)을 갖는 DNA 풀(DNA pool)을 합성하는 단계; 상기 DNA풀을 증폭시키는 단계; 형광적으로 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 상기 증폭된 DNA로부터 RNA풀을 전사시키는 단계; 상기 형광적으로 표지된 RNA풀을 친화성 컬럼(affinity column)에 적용시켜 상기 형광적으로 표지된 RNA풀로부터 높은-친화성의 형광 RNA 분자들을 제거하는 단계; 높은 친화성 형광 RNA 분자들로부터 cDNA풀을 수득하는 단계; 상기 형광 RNA 분자들에 대하여 상기 증폭 및 선택 단계들을 반복하는 단계; 및 상기 형광 RNA 분자들을 복제하여 신호화 압타머들을 수득하는 단계;들을 포함하는, 신호화 압타머들의 시험관 내 선택을 위한 방법들을 제공하고 있다. DNA 분자들을 포함하는 신호화 압타머들이 또한 선택된다.

본 명세서에서는 또한 상기 신호화 압타머의 형광 세기 내에서의 변화에 리간드를 결합시키는 것에 의한 형태 변화(conformational change)를 유도하는 신호화 압타머가 제공된다.

따라서 압타머들은 PIGF 또는 VEGFR1 등과 같은 비핵산 물질들(non-nucleic acid substances)에 특이적으로 상호작용하도록 설계될 수 있다. PIGF에 대하여 높은 친화성 수용기들로서 기능할 수 있거나 또는 PIGF(또는 선택적으로 VEGFR1)와 긴밀하게 상호작용할 수 있다. PLGF 또는 VEGFR1 주위의 초기적으로 구조화되지 않은 분자의 폴딩(folding) 및 PLGF 또는 VEGFR1과의 수소결합 네트워크의 형성은 이러한 중화 결합을 용이하게 한다.

그러나 압타머들은 또한 촉매적이 될 수 있다. 촉매적인 압타머들은 거의 리보자임들 또는 압타자임들(aptazymes)로 고려된다. 압타머들은 대향되는 방향의 핵산 시퀀스들 내의 염기들 사이에서의 왓슨-크릭 염기 쌍짓기에 기초하는 그들에 단순히 결합하는 것 외에 마찬가지로 핵산 물질들과 특이적으로 상호작용하도록 설계될 수 있다.

만일 촉매적인 경우, 이러한 압타머들은 정말로 압타자임들로 불리워질 수 있다. 이러한 특이적인 작용은 치료적인 목적들로 고려될 수 있다.

PIGF에 대하여 53% 시퀀스 상동성(sequence homology)을 갖는 단백질인, 혈관 내피 성장인자의 165-아미노산 형태(VEGF165)에 대한 2'-플루오로피리미딘 RNA-기반 압타머들(2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers)의 생산이 문헌 Ruckman et al., 1998 및 Bridonneau et al., 1999들에서 상세하게 기술되었다. 셀렉스 공정(SELEX process ; 상기 골드와 그의 동료들의 미합중국 특허에서 기술됨)을 사용하여, 인간 VEGF165에 대한 2'-플루오로피리미딘 RNA 올리고뉴클레오티드 리간드들(2'-F-pyrimidine RNA oligonucleotide ligands)(압타머들)이 단리되었다. 이들 압타머들은 또한 VEGF165 및 PIGF123의 헤테로다이머들(heterodimers)에 그리고 유사하게 또한 아형 PIGF152 등과 같은 보다 큰 아형들에 결합된다. 3개의 서로 구별되는 시퀀스 패밀리들로부터의 대표적인 압타머들이 VEGF(23 내지 29 뉴클레오티드들)에 높은 친화성으로 결합할 수 있는 최소 시퀀스들로 절단되어 길이가 줄어들었으며, 치환이 인용되는 경우에는 모든 리보퓨린 위치들(ribopurine positions)에서 2'-OH에 대한 2'-O-메틸(2'-O-methyl)의 치환으로 더욱 변형되었다. 이 프로토콜(protocol)은 당해 기술분야에서 숙련된 자에 의하여 중화 항-PIGF 압타머들을 생산하는 데 사용될 수 있다. VEGF 압타머(맥쿠젠(Macugen)®, 페갑타니브 소듐(pegaptanib sodium))이 또한 인간들에게 투여될 수 있는 첫 번째의 치료학적 압타머이며, 노인황반변성(age-related macular degeneration)을 앓는 환자들에 대하여 현재 시판되고 있다.

또한 VEGFR-1 mRNA 또는 PIGF mRNA의 전사를 억제하도록 기능하는 리보자임들과 같은 촉매화 RNA 분자들을 포함하는 올리고리보뉴클레오티드 시퀀스들이 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 억제제들의 관점 이내이다.

다수의 RNA 분자들이 촉매들로서 활성인 것으로 알려져 있으며, 단순히 정보가 핵으로부터 벗어나는 수단으로서 작용하는 것은 아니다.

리보자임들은 RNA의 특이적인 개열(specific cleavage)을 촉매할 수 있는 효소적 RNA 분자들(enzymatic RNA molecules)이다. 리보자임 작용의 메카니즘은 내부핵산가수분해 개열(endonucleolytic cleavage)이 후속하는 상보성 표적 RNA(complementary target RNA)에 대한 상기 리보자임 분자의 시퀀스 특이적 잡종화(hybridisation)를 포함한다. 자가-개열(self-cleaving) 또는 리보자임들의 다른 RNA 개열의 활성은 RNA의 2차구조에 의존적인 것으로 이해되고 있으며, 이는 염기 시퀀스 및 금속 위치들의 포함 등과 같은 인자들에 의존적일 수 있다. 리보자임들은 인공적으로 제어되는 유전자 발현에서 큰 유용성을 갖는다. 염기 시퀀스 및 예상가능한 왓슨-크릭 염기 쌍짓기에 기초하여 핵산들의 매우 특이적인 하전 패턴들(charge patterns), 그들의 염기들 및 백본들(backbones) 및 예상가능한 2차구조를 형성하는 DNA의 능력의 잇점들이 취해질 수 있다. 핵산의 작은 크기들 및 유연한 속성은 단백질들 등과 같은 다른 물질들에 대하여 인식하고 그리고 특이적으로 결합할 수 있는 복합체들(complexes)을 구축하는 데 매우 적절하도록 한다. 바이오칩들(biochips) 상에 탑재된 단일-가닥의 핵산들에의 결합에 의존적인 셀렉스-구동 스크리닝(SELEX-driven screening ; 골드와 그의 동료들의 미합중국 특허 5,567, 588호)를 통하여, 연구자들은 리보자임들을 발견하였으며, 이들은 100배 또는 심지어 1000배로 보다 촉매적으로 활성이다. 페르난데즈(Fernandez)와 그의 동료들(문헌 Fernandez et al. (2001))은 리보자임 내에서의 단일 분자 형태 변화로부터 수집된 데이터를 보고하고 있다. 페르난데즈와 그의 동료들은 또한 이러한 필수적으로 듀플렉스 핵산 구조들이 기대될 수 있는 쌍 결합(pair binding)에 의한 전진 쌍(progressive pair)이 아닌, 형태에서의 "전부 또는 전혀의" 별개의 전이들을 수행한다는 것을 보고하고 있다.

개열 사이트(cleavage site)에서의 별개의 RNA 분자를 개열시키는 효소적 활성을 갖는 원형의 RNA 및 내인성 리보자임 결합 단백질을 통한 생체 내에서 RNA에 안정성을 부여할 수 있는 RNA 분자들이 빈(Been)과 그의 동료들의 미합중국 특허 5,712,128호 및 시오우드(Sioud)의 미합중국 특허 5,985,620호에서 기술되었다.

임의의 잠재적 RNA 표적 내의 특정의 리보자임 개열 사이트들은 리보자임 개열 사이트들에 대하여 표적 분자들을 스크리닝하는 것에 의해 초기적으로 동정되었으며, 이는 다음의 시퀀스들, 즉, GUA, GUU 및 GUC들을 포함한다. 일단 동정되면, 상기 개열 사이트를 포함하는 상기 표적 유전자의 영역에 대응하는 15 내지 20개의 리보뉴클레오티드들의 짧은 RNA 시퀀스들이 올리고뉴클레오티드 시퀀스를 적절하지 않도록 만들 수 있는 2차구조 등과 같은 예상되는 구조적 특징들에 대해 평가될 수 있다. 리보뉴클레아제 보호 분석법들(ribonuclease protection assays)을 사용하여 상보성 올리고뉴클레오티드들과 잡종화하는 그들의 접근성(accessibility)을 시험하는 것에 의하여 후보 표적들의 적합성(suitability)이 또한 평가될 수 있다.

억제를 제공하는 또 다른 방법은 대상체, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간에서의 필라델피아 염색체 양성 백혈병의 치료를 위한 PIGF(또는 선택적으로 VEGFR-1) RNA 시퀀스들의 내부핵산가수분해 개열을 특이적으로 그리고 효과적으로 촉매하는 가공된 해머헤드 모티브(engineered hammerhead motif) 리보자임 분자들을 사용하는 것이다. 리보자임 파마슈티컬스 인코포레이티드(Ribozyme Pharmaceuticals Inc ; Boulder, Colorado 80301, USA)에 의해 VEGFR-1 mRNA에 대해 개발된 안지오자임(Angiozyme) 등과 같은 항-VEGFR-1-리보자임이 이미 암요법(cancer therapy)에서 사용되었다(문헌 Weng and Usman, 2001; Pavco et al., 2000 참조). 다른 항-VEGFR-1 촉매적 RNA 분자들 중에서 이 안지오자임은 상기 PIGF 수용기 활성의 억제를 위해 사용될 수 있으며, 이는 1차 PIGF 수용기들, VEGFR-1에 대해 상기 mRNA들을 특이적으로 개열시키는 것에 의해 PIGF 수용기 기능을 하향조절(downregulate)한다. 유방암(breast cancer)에 대하여 항-VEGFR-1 리보자임의 임상적인 시도들이 현재 진행중에 있다.

본 명세서에서 예상되는 다른 억제제들은 상기 PIGF 유전자의 mRNA 시퀀스 또는 그의 수용기 VEGFR-I mRNA의 일부에 상동인 항-감작 RNA 및 DNA 분자들 및 siRNA 구조물들이 포함되는 올리고리보뉴클레오티드 시퀀스들이다. RNA 간섭 또는 "RNAi"는 이중-가닥의 RNA(dsRNA)가 유전자 발현을 차단한다는 발견을 기술하기 위하여 파이어(Fire)와 그의 동료연구자들이 처음으로 만들어낸 용어이다(문헌 Fire et al., 1998 참조). dsRNA는 척추동물들을 포함하여 많은 유기체들 내에서 유전자 특이적, 전사후 유전자 침묵(post-transcriptional silencing)을 지향하며, 유전자 기능을 연구하는 새로운 도구를 제공하였다. RNAi는 mRNA 분해(mRNA degradation)를 포함한다. PIGF는 상기 PIGF 유전자의 상기 mRNA 시퀀스의 일부와 상동인 siRNA 구조물의 세포 내로의 도입을 포함하는 대상체의 세포 내의 PIGF의 발현의 선택적 전사후 침묵의 방법에 의하여 침묵될 수 있다. 본 발명은 세포들 내에서의 RNA 간섭(RNAi) PIGF 발현 및/또는 세포들 내에서의 RNA 간섭(RNAi) VEGFR-1 발현에 의한 전사후 유전자 침묵에 의한 대상체에서의 Ph+ 백혈병을 치료하는 방법을 제공한다. 이는 인간 환자에서의 생체 내에서 특히 중요한 방법이다. 유사하게, PIGF RNAi의 용도는 Ph+ 백혈병의 치료가 예상된다.

RNAi를 개시시키는 데 사용된 dsRNA는 천연의 공급원(native source)으로부터 단리되거나 또는 공지된 수단들, 예를 들면 DNA로부터의 전사에 의해 생산될 수 있다. 예를 들면, 프로모터(DNA 의존적 RNA 폴리머라아제에 의해 인식된 결합 사이트를 포함하는 DNA의 임의의 이중-가닥의 시퀀스를 의미)에의 RNA 폴리머라아제(RNA polymerase)의 결합은 전사의 개시를 허용한다. 많은 공지된 프로모터 시퀀스들이 상기 dsRNA, 예를 들면 파지(phages) T7, T3 또는 SP6들의 RNA 폴리머라아제들에 의해 인식되는 시퀀스들을 생산하는 데 사용될 수 있으나 이들에 제한되는 것은 아니다. 그러나, 상기한 바와 같이 동정되고, 그리고 그에 대한 대응하는 RNA 폴리머라아제가 획득될 수 있는 임의의 프로모터 시퀀스가 사용될 수 있다는 것이 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 명백한 것일 수 있기 때문에 이는 제한을 나타내는 것은 아니다. 달리, 상기 dsRNA를 형성하는 데 사용되는 ENA의 2개의 가닥들이 각각이 적어도 부분적으로는 상보적인 시퀀스의 DNA 가닥에 대하여 형성될 수 있는 동일하거나 또는 2개의 다른 듀플렉스들에 속할 수 있다. 상기 dsRNA가 그에 따라 생산되는 경우, 전사되어야 할 상기 DNA 시퀀스는 하나가 상기 가닥들 중의 하나의 전사를 제어하고, 다른 하나가 상보성 가닥의 전사를 제어하는 2개의 프로모터들에 의해 덧붙여진다. 이들 2개의 프로모터들은 동일하거나 또는 다른 것일 수 있다. 실제로, 미합중국 특허 5,795,715호에 따르면, 각각의 단부에 프로모터 시퀀스가 제공된 DNA 듀플렉스는 한정된 길이의 RNA들을 직접적으로 생산할 수 있으며, 또한 이는 쌍들로 결합되어 dsRNA를 형성할 수 있다.

합성 또는 천연의 유래의 상기 dsRNA는 여러 동물 종들,특히 영장류들의 혈청 내에 존재하는 뉴클레아제들에 의한 빠른 분해에 영향을 받기 쉽다. 따라서 dsRNA를 포함하는 절차들은 대체로 전체를 통해 구워진 유리그릇(baked glassware)을 활용하며, 모든 완충제들은 멸균을 위하여, 예를 들면, 날젠(Nalgene) 45미크론 필터를 통하여 여과된다. 내독소(endotoxin) 오염의 임의의 가능성을 최소화하기 위하여 모든 용액들에 대하여 무-발열물질(pyrogen-free)의, 이중 증류된 물이 반드 사용되어야 한다.

상기 dsRNA 용액의 농도는 그의 자외선 스펙트럼(UV spectrum)으로부터 결정될 수 있다. 예를 들면, 천연 또는 합성의 dsRNA의 몰농도는 문헌으로부터 또는 표준 절차들 : 44.7배의 OD260 = dsRNA/㎖ 마이크로그램(㎍)으로 획득가능한 소광계수(extinction coefficient)를 사용하여 260㎚에서의 광학적 밀도(OD)로부터 결정된다.

만일 적절한경우, 취급의 편의성을 위하여 상기 dsRNA 용액은 무-발열물질의 완충제로 희석될 수 있다. 그 결과의 dsRNA는 선택적으로 지지체에 또는 비오틴 등과 같은 리간드에 연결될 수 있으며, 이는 아비딘(avidin)으로 코팅된 지지체에 부착될 수 있다. 분석적인 도구로서 사용되는 경우, 이는 직접적인 정량화를 허용한다.

특정의 구체예에 따르면, 본 발명의 상기 dsRNA 조성물들은 대상체들의 치료를 위한, 특히 인간 환자들의 치료를 위한 약제학적 조성물로서 제조된다. 특히, 상기 약제학적 조성물들은 인간 환자들에서의 필라델피아 염색체 양성 백혈병을 치료하는 데 투여된다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 조성물들은 기능적인 '녹아웃(knockout)' 모델 유기체들을 생성하는 데 사용되며, 여기에서 표적 유전자는 결함이 있거나 또는 이 경우에서는 발현이 억제된다. 상기 dsRNA 약제학적 조성물은 상기 환자에 국소영역적으로(locoregionally) 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 dsRNA 약제학적 조성물은 바람직하게는 화합물 또는 혼합물이 예를 들면 비경구적으로(parenterally), 정맥내로(intravenously), 피부내로(intradermally), 근육내로(intramuscularly) 또는 경피적으로(transdermally) 투여가능하게 하기에 적절한 약제학적으로 수용가능한 담체(carrier) 또는 부형제(excipient)를 포함한다. 상기 활성의 성분들은 임의의 통상적인 약제학적으로 수용가능한 담체 또는 부형제와 혼합되거나 또는 배합될 수 있다.

기능성(functionality)의 높은 개연성(probability)을 갖는 VEGFR1 유전자를 침묵시키고 그리고 상기 mRNA의 90% 이상을 타도(knocking down)시키기 위한 선택된 siRNA들은 다르마콘 인코포레이티드(Dharmacon Inc. ; Lafayette, CO 80026, USA)로부터 획득가능하다. SMART풀화/SMART선택(SMARTpooling/SMARTselection)이라 불리우는 모두 하나의 표적 유전자에 대하여 지향되는 다수의 서로 다른 siRNA 듀플렉스들의 풀화(pooling)가 상기 VEGFR1 유전자 및/또는 상기 PIGF 유전자를 침묵시키기 위한 효과적인 기술로서 사용된다. PIGF에 대한 siRNA들은 또한 상용적으로 획득가능하다(예를 들면, 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이티드).

항-감작 RNA 및 DNA 분자들은 표적화된 mRNA에 결합하고 그리고 단백질 번역을 방지하는 것에 의하여 mRNA의 번역을 직접적으로 차단하도록 작용한다. 항감작 DNA에 관해서는, 번역 개시 사이트, 예를 들면, 상기 VEGFR-1 또는 PIGF 뉴클레오티드 시퀀스의 -10 내지 +10 영역들 사이로부터 유도된 올리고디옥시리보뉴클레오티드들이 바람직하게 예상된다. 예를 들면 VEGFR2 항감작 올리고뉴클레오티드 형질전환에 의해 달성된 다른 티로신 키나아제 수용기, VEGFR2 수용기의 하향조절이 이미 표준 항감작 기술에 의해 달성되었다(문헌 Berard et al., 1997 참조). 더욱이, PIGF 수용기 VEGFR1에 직접적으로 지향되는 항감작(AS) 올리고뉴클레오티드들이 생체 내에서 혈관생성(에 직접적으로 지향되는)을 차단하는 것이 입증되었다(문헌 Marchand et al., 2002 참조). 더욱이 PIGF 단백질 생산의 항감작 억제가 이미 요네쿠라(Yonekura)와 그의 동료들에 의해 입증되었다(문헌 Yonekura et al. (1999) 참조).

리보자임들과 마찬가지로 항-감작 RNA 및 DNA 분자들 둘 다는 RNA(또는 DNA) 분자들의 합성을 위한 당해 기술분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들에는 예를 들면 고체상 포스포르아미다이트 화학 합성(solid phase phosphoramidite chemical synthesis) 등과 같이 당해 기술분야에서 잘 알려진 올리고디옥시뉴클레오티드들을 화학적으로 합성하기 위한 기술들이 포함된다. 달리, RNA 분자들은 상기 항감작 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 시퀀스들의 시험관 내 및 생체 내 전사에 의하여 생산될 수 있다. 이러한 DNA 시퀀스들은 다양한 벡터들 내로 도입될 수 있으며, 이는 상기 T7 또는 SP6 폴리머라아제 프로모터들 등과 같은 적절한 RNA 폴리머라아제 프로모터들을 도입한다. 달리, 사용된 상기 프로모터에 따라, 항-감작 RNA을 본질적으로 또는 유도적으로 합성하는 항감작 cDNA 구조물들이 세포주들 내로 안정하게 도입될 수 있다.

특정의 구체예에 있어서, 필라델피아 염색체 양성 백혈병을 치료하기 위한 본 발명의 치료학적 방법이 또한 당해 기술분야에서 공지된 Ph+ 백혈병의 치료를 위한 임의의 다른 요법과 함께 사용될 수 있음은 자명한 것이다. 단백질 티로신 키나아제 억제제들, 특히 BCR/ABL 억제제들, 예를 들면, 이마티니브 등을 포함하는 요법들이 특히 예상된다.

본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 '약물'은 앞서 기술된 바와 같은 분자들(억제제들) 및 약제학적으로 수용가능한 담체 또는 부형제(두 용어들은 상호교환적으로 사용될 수 있음)를 포함하여 앞서 표시한 질병들을 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다. 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 공지된 적절한 담체들 또는 부형제들은 염수, 링거액(Ringer's solution), 포도당 용액(dextrose solution), 행크용액(Hank's solution), 고정유들(fixed oils), 에틸올레이트(ethyl oleate), 염수 내 5% 포도당(5% dextrose in saline), 등장성 및 화학적 안정성을 강화시키는 물질들, 완충제들 및 보존제들이다. 다른 적절한 담체들에는 그 자체로 단백질들, 다당류들, 폴리락트산들(polylactic acids), 폴리글리콜산들(polyglycolic acids), 중합체성 아미노산들(polymeric amino acid) 및 아미노산 공중합체들 등과 같이 상기 조성물을 수요하는 개체들에 해로운 항체들의 생산을 유도하지 않는 임의의 담체가 포함된다. 상기 '약물'은 당해 기술분야에서 숙련된 자의 지식의 범위 내에서 임의의 적절한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 선호되는 투여의 경로는 비경구적이다.

비경구적 투여에 있어서, 본 발명의 상기 약물은 앞서 정의한 바와 같은 약제학적으로 수용가능한 부형제들과 함께 용액, 현탁액 또는 에멀젼 등과 같은 단위 투여량(unit dosage)의 주사가능한 형태로 제형화될 수 있다. 그런, 상기 투여량 및 투여의 모드들은 개체에 의존적일 수 있다. 대체로, 상기 약물은 상기 PIGF 억제제(예를 들면, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 화합물 또는 분자)가 1㎍/㎏ 내지 10㎎/㎏, 보다 바람직하게는 10㎍/㎏ 내지 5㎎/㎏, 가장 바람직하게는 0.1 내지 2㎎/㎏ 사이의 투여량으로 주어지도록 투여된다. 바람직하게는, 1회분 투여량(bolus dose)으로서 주어진다. 연속적 주입이 또한 사용될 수 있으며, 삼투성 미니펌프(osmotic minipump)를 통한 연속적 피하 전달(subcutaneous delivery)을 포함한다. 만일 그렇다면, 상기 약물은 5 내지 20㎍/㎏/분, 보다 바람직하게는 7 내지 15㎍/㎏/분의 투여량으로 주입될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 수용가능한 담체"에는 임의의 그리고 모든 용제들, 분산매들, 코팅제들, 항균제들(antibacterial agents) 및 항진균제들(antifungal agents), 등장제들(isotonic agents), 흡수지연제들(absorption delaying agents) 등이 포함된다. 약제학적 활성의 물질들에 대한 이러한 배지 및 물질들의 사용은 당해 기술분야에서는 잘 알려진 것이다. 임의의 통상의 배지 또는 물질이 본 발명의 상기 조성물들과 부조화인 경우를 제외하고는, 상기 치료학적 제형에서의 그의 사용이 고려된다. 보충적 활성의 성분들(supplementary active ingredients)이 또한 상기 약제학적 제형들 내로 도입될 수 있다.

당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 임의의 투여의 모드, 통상적으로 사용되는 비히클(vehicle) 또는 담체 및 상기 활성의 물질에 대해 비활성인 것들이 본 발명의 상기 약제학적 조성물들을 제조하고 그리고 투여하는 데 활용될 수 있다는 것은 이해될 수 있을 것이다. 이러한 방법들, 비히클들 및 담체들의 예시들은 예를 들면 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences, 4th ed. (1970)에서 기술된 것들이며, 그의 상세들이 여기에 참조로 인용된다. 본 발명의 원리들에 노출된 당해 기술분야에서 숙련된 자들은 적당한 그리고 적절한 비히클들, 부형제들 및 담체들의 결정 또는 이들과 상기 활성 성분들을 배합하여 본 발명의 상기 약제학적 조서울들을 형성함에 있어서 곤란함을 경험하지 않을 것이다.

본 발명의 상기 약제학적 조성물 내에 포함되어야 할 활성제(active agent)의 치료학적으로 유효한 양은 각각의 경우에 있어서 여러 인자들, 예를 들면, 치료되어야 할 환자의 형태, 크기 및 상태, 의도된 투여의 모드, 의도된 투여량 형태를 포함하는 환자의 용량 등에 의존적이다. 대체로, 활성제의 양은 각 투여량 형태에서 약 0.1 내지 약 250㎎/㎏, 그리고 바람직하게는 약 0.1 내지 약 100㎎/㎏이 제공되도록 포함된다. 여기에서 사용되는 바와 같은 '치료학적 양' 또는 치료학적으로 유효한 양은 질병의 하나 또는 그 이상의 증후군들을 완화시키는 양이다. 이러한 양은 전형적으로는 억제제 및 상기 질병의 중증도(severity)에 의존적일 수 있으나, 숙련된 자들에 의해서 아마도 일정한 실험(routine experimentation)을 통하여 결정될 수 있다.

치료를 위한 투여의 다른 관점은 상기 PIGF mRNA 또는 그의 관능부(functional part)에 직접적으로 대향하는 앞서 언급한 항-감작 유전자 또는 상기 PIGF 유전자의 관능부들 또는 리보자임을 전달하는 유전자요법의 용도이다. 유전자요법(gene therapy)은 환자의 세포들에의 치료학적 핵산들의 전달에 의한 치료를 의미한다. 이는 문헌들 Lever and Goodfellow 1995; Br. Med Bull., 51, 1-242; Culver et al., 1995; Ledley, 1995에서 집중적으로 검토되었다. 유전자요법을 달성하기 위하여 유전자들을 환자들의 세포들에 전달하는 방법 및 임의의 치료학적 유전자들의 생산을 유효하게 하는 것을 확실하게 하는 부가의 방법들이 존재하여야 한다.

시험관 내에서 또한 특히 생체 내에서 표적 세포들 내에서의 치료학적 유전자 생성물 발현을 달성하도록 의도된 유전자요법 프로토콜들은 당해 기술분야에서 집중적으로 기술되었다. 이들에는 플라스미드 DNA(본래 그대로 또는 리포좀들 내에서)의 근육내 주사, 간질 주사(interstitial injection ; (체내 기관, 세포, 조직) 사이의 주사), 공로들 내에서의 점적 주사(instillation in airways), 내피에의 적용(application to endothelium), 간-내 유조직(intra-hepatic parenchyme), 및 정맥내 또는 동맥내 투여(에를 들면, 간-내 동맥, 간-내 정맥)들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. DNA의 상기 표적 세포에의 적응성(availability)를 강화시키기 위한 다양한 기구들이 개발되었다. 단순한 접근법은 상기 표적 세포를 물리적으로 DNA를 포함하는 카테터들 또는 이식가능한 물질들과 접촉시키는 것이다. 다른 접근법은 고압 하에서 액체의 기둥(column)을 직접적으로 표적 조직 내로 주입하는 무-주사바늘의, 젯트주입 기구들을 활용하는 것이다. 이들 전달 파라다임들(delivery paradigms)은 또한 바이러스성의 벡터들을 전달하는 데 사용될 수 있다. 표적화된 유전자 전달의 또 다른 접근법은 분자성 콘쥬게이트들을 사용하는 것이며, 이는 세포들에의 특정의 핵산을 표적화하기 위한 핵산 - 또는 DNA - 을 결합하는 물질이 결합되는 단백질 또는 합성 리간드들로 이루어진다(문헌 Cristiano et al., 1993 참조). 표적 세포들은 전형적으로 치료되어야 할 증후군들에 의존적일 수 있으며, 당해 기술분야에서 숙련된 자에 의하여 선택될 수 있을 것이다(예를 들면, 백혈병을 치료하기 위한 골수 세포들 또는 기질 세포들).

상기 유전자요법 벡터들은 치료학적 양의 상기 PIGF 억제제를 발현하여야 한다. 특정의 구체예들에 따르면, 본 출원에서 기술되는 상기 유전자요법 벡터들은 연장된 기간 동안의 상기 유전자 생성물의 치료학적 양의 발현을 향한다. 결국, 치료적인 수준들이 달성되는 한, 새로운 치료가 필요치는 않다. 전형적으로, 기껏해야 적어도 20일, 적어도 50일, 적어도 100일, 적어도 200일 그리고 일부 경우들에 있어서는 300일 또는 그 이상에서 치료학적 발현(therapeutic expression)이 예상된다. 코딩 시퀀스(coding sequence)에 의해 인코딩된 상기 유전자 생성물(예를 들면, 폴리펩티드, RNAi 등)의 발현은 항체-기반의 분석법(antibody-based assays), 예를 들면, 웨스턴 블럿(Western Blot) 또는 효소결합면역흡착검사법(ELISA assay) 등과 같이 예를 들어 상기 유전자 생성물의 치료학적 발현이 달성되었는 지의 여부를 평가하는 것과 같이 임의의 당해 기술분야에서 인식된 방법들에 의하여 측정될 수 있다. 상기 유전자 생성물의 발현은 또한 상기 유전자 생성물의 효소적 또는 생물학적 활성을 검출하는 생물검정(bioassay)에서 측정될 수 있다.

유전자요법 벡터들은 에피솜 벡터(즉, 숙주세포의 유전체 내로 통합되지 않는)가 되거나 또는 상기 숙주세포 유전체 내로 통합되는 벡터들이 될 수 있다. 에피솜 벡터들의 예들에는 (염색체외의) 플라스미드들 및 소위 미니서클들(mini-circles)이 포함되며, 이는 단지 발현 카셋트(expression cassette)로 이루어지고, 그리고 박테리아성 시퀀스들(bacterial sequences)이 전혀 없는 것이며, 상기 숙주세포 유전체 내로 통합되는 벡터들의 예들에는 바이러스성 벡터들(viral vectors)이 포함된다.

대표적인 플라스미드 벡터들에는 pUC 벡터들, 청스크립트 벡터들(bluescript vectors ; pBS) 및 pBR322 또는 박테리아성 시퀀스들(미니서클들)이 전혀 없는 이들의 유도체들이 포함된다. 플라스미드 벡터들의 일부는 형질감염된 세포들(transfected cells) 내에서의 에피솜 플라스미드 지속성(persistence)을 강화시키는 요소들(elements)을 내포하도록 적용될 수 있다. 이러한 시퀀스들에는 전사유닛(transcription unit)에 연결된 스캐폴드/매트릭스 부착 영역 모듈들(scaffold/matrix attached region modules)에 대응하는 S/MARs들이 포함된다(문헌 Jenke et al., 2004; Manzini et al., 2006 참조).

대표적인 바이러스성 벡터들에는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 아데노바이러스(adenovirus), 레트로바이러스들(retroviruses) 및 렌티바이러스들(lentiviruses)로부터 유도되는 벡터들이 포함된다. 달리, 유전자 전달 시스템들은 나노입자들(nanoparticles) 또는 비로좀들(virosome) 등과 같은 바이러스성 및 비-바이러스성의 구성요소들을 결합시키는 데 사용될 수 있다(문헌 Yamada et al., 2003 참조).

레트로바이러스들 및 렌티바이러스들은 감염 후 그들의 유전자들을 숙주세포 염색체들 내로 삽입할 수 있는 능력을 갖는 RNA 바이러스들이다. 레트로바이러스성 및 렌티바이러스성 벡터들은 바이러스성 단백질들을 인코딩하는 유전자들을 결여하나, 그러나 세포들을 감염시키고 그리고 그들의 유전자들을 표적 세포의 상기 염색체들 내로 삽입할 수 있는 능력을 보유하면서 발달되었다(문헌 Miller, 1990; Naldini et al., 1996 참조). 렌티바이러스성 벡터와 전통적인 몰로니-쥣과의 백혈병-바이러스(Moloney-murine leukemia-virus ; MLV) 기반의 레트로바이러스성 벡터 사이의 차이점은 렌티바이러스성 벡터들이 분열중인 세포들(dividing cells)과 비-분열중인 세포들(non-dividing cells) 둘 다에서 형질도입(transduce)을 할 수 있는 반면에 MLV-기반의 레트로바이러스성 벡터들은 단지 분열중인 세포들만 형질도입할 수 있다는 것이다.

아데노바이러스성 벡터들(adenoviral vectors)은 살아있는 대상체에 직접적으로 투여되도록 설계되었다. 레트로바이러스성 벡터들과는 달리, 대부분의 아데노바이러스성 벡터 유전체들은 상기 숙주세포의 상기 염색체 내로 통합되지 않는다. 대신, 아데노바이러스성 벡터들을 사용하여 세포들 내로 도입된 유전자들은 핵(nucleus) 내에서 연장된 시간의 기간 동안 존속하는 염색체외의 요소(에피솜)로서 유지된다. 아데노바이러스성 벡터들은 공로 상피 세포들(airway epithelial cells), 내피 세포들(endothelial cells), 간세포들(hepatocytes) 및 여러 종양들을 포함하여 생체 내 많은 서로 다른 조직들 내의 분열중인 그리고 비-분열중인 세포들을 형질도입할 수 있다(문헌 Trapnell, 1993 참조).

아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus ; AAV)는 질병을 야기하는 것으로 알려지지는 않았으며, 따라서 단지 매우 약한 면역 반응만을 야기하는, 인간들 및 일부 다른 영장류를 감염시키는 작은 ssDNA 바이러스이다. AAV는 분열중인 그리고 비-분열중인 세포들 둘 다를 감염시킬 수 있고 그리고 그의 유전체를 상기 숙주세포의 그것들 내로 도입시킬 수 있다. 이들 특징들은 비록 상기 벡터의 복제능(cloning capacity)이 상대적으로 제한됨에도 불구하고, AAV를 유전자요법을 위한 바이러스성 벡터들을 생성하기 위한 매우 매력적인 후보로 만든다.

다른 바이러스성 벡터는 크기가 큰, 이중-가닥의 DNA 바이러스인 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus)로부터 유도된다. 다른 dsDNA 바이러스인 백신 바이러스(vaccinia virus)의 재조합 형태들은 크기가 큰 삽입물들(inserts)을 수용할 수 있으며, 상동성 재조합에 의해 생성된다.

여기에 기재된 상기 억제제들은 필라델피아 염색체 양성 (Ph+ 또는 BCR-ABL+) 백혈병의 치료를 위하여 사용될 수 있거나, 또는 Ph+ (BCR-ABL+) 백혈병의 치료를 위한 약물의 제조를 위하여 사용될 수 있다. Ph+/BCR-ABL+ 백혈병의 치료를 위한 방법들은 전형적으로 이러한 PIGF 억제제의 치료를 필요로 하는 대상체, 가장 바람직하게는 인간 대상체에의 투여를 포함할 수 있다. Ph+ 백혈병들의 특정의 서브셋트는 만성 골수성 백혈병들(CMLs)이다. 따라서, 특정의 구체예들에 따르면, 본 출원에서 기술되는 용도들 및 방법들은 CML의 치료를 위한 것이다. Ph+ 백혈병들의 다른 중요한 카테고리는 또한 필라델피아 염색체의 존재에 의해 특징지워지는 급성 림프구성 백혈병들(ALLs)이다. 이 카테고리는 많은 표준의 치료들이 Ph+ ALL 케이스들에서 실패하는 것과 같이 전형적으로 좋지 않은 예후(bad prognosis)를 갖는다. 특정의 구체예에 따르면, 상기 필라델피아 염색체(또는 상기 BCR-ABL 융합 단백질)가 존재하는 다른 백혈병들이 또한 본 출원에서 기술되는 용도들 및 방법들에 적절할 수 있다. 그러나, 이들 케이스들은 CML 또는 ALL 보다는 덜 일반적이다. 그럼에도 불구하고, Ph+ AML(급성 골수성 백혈병)의 일부 케이스들이 보고되었으며, Ph+ 백혈병의 이러한 케이스들은 또한 본 출원에서 제공되는 용도들 및 방법들로부터 혜택을 받을 수 있을 것으로 예상된다.

백혈병들이 종종 환자들에 대하여 좋지 않은 예후들을 갖는 파괴적인 질병들(devastating diseases)임을 인식하는 것이 중요하다. 따라서, 만일 하나의 치료의 접근법이 실패하는 경우, 대안의 치료법 전략들 또는 전략들의 조합을 제공할 수 있다는 것이 중요하다. 본 출원의 목표는 특히 다른 치료 요법(treatment regimen)으로부터 잇점을 갖지 못한 환자들에 치료적인 잇점을 제공하는 것이다.

필라델피아 염색체 양성 백혈병들에 대한, 특히 CML에 대한 표준의 치료법은 BCR-ABL 억제제 또는 티로신 키나아제 억제제의 사용이다. 이러한 형태의 약물들의 가장 잘 알려진 예는 이마티니브이나, 그러나 닐로티니브(nilotinib ; AMN107), 다사티니브(dasatinib ; BMS354825), 에이티9283(AT9283 ; 아스텍스 테라퓨틱스(Astex therapeutics)), 에스지엑스393(SGX393 ; 엘리 릴리(Eli Lilly)), 인노-406(INNo-406 ; 인노바이브 파마슈티칼스(Innovive Pharmaceuticals)), 보수티니브(bosutinib ; SKI606) 및 엠케이0457(MK0457 ; 메르크(Merck)) 등과 같은 여러 다른 예들이 존재한다.

그러나, 여러 보고들은 이들 약물들에 대한 저항성이 공통의 문제이다라는 점을 나타내고 있다. 결국, 백혈병 세포들은 심지어 성공적으로 치료된 환자들에서도 존재하고, 그리고 일부 환자들은 저항성을 발달시키고 그리고 극단적으로는 재발된다(문헌 Swords et al., 2007; Buchert, 2007; Li and Li, 2007; Kujawski and Talpaz, 2007 참조). 특정의 구체예들에 따르면, 상기 PIGF 억제제들이 BCR-ABL 억제제로 치료될 수 없거나 및/또는 보다 특정한 케이스들에 있어서는 BCR-ABL 억제제 단독으로는 치료될 수 없는 Ph+ 백혈병들의 치료를 위하여 사용된다. 필라델피아 염색체 양성 백혈병들은 다양한 이유들로, 두 가지 가장 일반적인 것은 상기 BCR-ABL 억제제에 대한 악성 세포들의 둔감성(insensitivity) 및 환자들에 의해 인용될 수 없는 약물이라는 이유들로 BCR-ABL 억제제(또는 BCR-ABL 억제제 단독)로 치료되지 못할 수 있다.

상기 BCR-ABL 억제제에 대한 상기 백혈병 세포들의 둔감성은 여러 메카니즘들 때문일 수 있으며(문헌 Shah and Sawyers, 2003 참조), 또한 온셋(onset ; 즉, 최초의 치료에서의 둔감성)으로부터 야기될 수 있거나, 또는 상기 저항성은 획득될 수 있다(즉, 재발을 나타내는 환자들에서, 또는 더 발달된 백혈병을 앓는 환자들에서, 또는 아구성 발증 단계(blast crisis stage)의 경우에서).

또한, BCR-ABL 억제제들은 환자들에서 부작용들(adverse side-effects)을 야기하는 것으로 알려져 있으며, 이는 상기 약물이 특정의 환자들에 대하여 더 이상 적절하지 않음을 야기할 수 있다. 환자에서의 알러지 반응(allergic reaction)이 도한 상기 약물에 대한 불관용(intolerance)을 야기할 수 있다.

특정의 구체예들에 따르면, 상기 PIGF 억제제들은 BCR-ABL 억제제로의 치료에 (적어도 부분적으로) 저항성인 Ph+ 백혈병들의 치료를 위하여 사용된다. BCR-ABL 억제제에 (부분적으로) 저항성인 백혈병들은 상기 BCR-ABL 억제제에 대하여 감소된 응답을 갖는 백혈병 세포들이 존재하는 백혈병들로 정의될 수 있다. 감소된 응답을 갖는 세포들의 양은 상기 BCR-ABL 억제제에 대한 저항성의 정도를 나타낸다. 전형적으로, 비록 필수적이지는 않지만, BCR-ABL 억제제에 대한 (부분적인) 저항성은 획득된 현상이다. 다른 특정의 구체예들에 따르면, 상기 PIGF 억제제들은 이마티니브-저항성 Ph+ 백혈병들의 치료를 위하여 사용된다. 이러한 백혈병들의 비제한적인 예들에는 이마티니브-저항성 Ph+ CML, 예를 들면 이마티니브-저항성 Ph+ T-ALL, 이마티니브-저항성 Ph+ B-ALL 등과 같은 이마티니브-저항성 Ph+ ALL들이 포함된다.

비록 확실히 모든 케이스들에서는 아니지만, 때로, BCR-ABL 억제제들에 대한 저항성, 특히 이마티니브에 대한 저항성은 상기 BCR-ABL 유전자에서의, 특히 티로신 키나아제 도메인에서의 돌연변이들과 연관되어 있다. T315I 돌연변이가 그의 가장 잘 알려진 예이다. 다른 예들에는 E255K, E255V, Y253H, H396P, F317L, M351T, G250E, F311L, M244V, F359V, L387M, H396R, Q252H, Y253F, Q252R 및 E355G 돌연변이들이 포함된다(문헌 Shah and Sawyers, 2003 참조). 코르빈(Corbin)과 그의 동료들은 특히 G250E, H396P, H396R, E255V 및 T315I들이 이마티니브에 대한 저항성을 부여한다고 보고하였다(문헌 Corbin et al., 2003 참조). 특정의 구체예들에 따르면, 상기 PIGF 억제제들은 상기 BCR-ABL 유전자가 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 Ph+ 백혈병들의 치료를 위하여 사용된다. 다른 특정의 구체예들에 따르면, 상기 PIGF 억제제들은 BCR-ABL 억제제들로 치료될 수 없는 및/또는 BCR-ABL 억제제 단독으로 치료될 수 없는 Ph+ 백혈병들의 치료를 위하여 사용되며, 여기에서 상기 BCR-ABL 유전자는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 또 다른 특정의 구체예들에 따르면, 상기 Ph+ 백혈병들은 이마티니브로 치료될 수 없거나 또는 이마티니브 단독으로 치료될 수 없는 것이다. 또 다른 특정의 구체예들에 따르면, 상기 BCR-ABL 유전자 내의 상기 적어도 하나의 돌연변이는 T315I, E255K, E255V, Y253H, H396P, F317L, M351T, G250E, F311L, M244V, F359V, L387M, H396R, Q252H, Y253F, Q252R 및 E355G 돌연변이들로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 것이다.

필라델피아 염색체 양성 백혈병의 치료를 위한 경태반 성장인자의 억제제의 사용은 독립형의 치료법 또는 치료의 방법이 될 수 있다는 것이 예상된다. 그러나, 특정의 구체예들에 따르면, Ph+ 백혈병들의 치료에서의 PIGF 억제제들의 사용은 복합요법(combination therapy)의 일부로서 예상된다. 따라서, PIGF 억제는 방사선요법, 화학요법, 생물학적요법(biological therapy ; 예를 들면 인터페론 치료), 줄기세포 이식(stem cell transplantation), 골수 이식(bone marrow transplantation), 외과적 수술(surgery ; 예를 들면 비장의 제거) 또는 BCR-ABL 억제, Lyn 억제, Hsp90 억제, Src 억제 등과 같은 표적화된 요법들(targeted therapies) 등가 같은 Ph+ 백혈병들을 치료하는 데 사용된 다른 요법들과 함께 사용될 수 있다. 물론, PIGF 억제제들은 하나 또는 그 이상의 이들 요법들(예를 들면, BCR-ABL 및 Lyn 억제를 함께)과 함께 사용될 수 있다.

PIGF 억제는 다른 요법들과 부수하여 수행될 수 있거나 또는 다른 요법들의 이전 또는 이후 둘 중의 어느 하나에서 수행될 수 있거나, 또는 이들은 예를 들면 간헐적으로 교환될 수 있다. 당해 기술분야에서 숙련된 자는 선택적으로 일정한 실험 후에 최적의 치료 요법에 대하여 결정할 수 있을 것이다.

비록 본 발명에 따른 세포들 및 방법들에 대하여 물질들 및/또는 분자들과 마찬가지로 특정의 구체예들, 특정의 배열들이 본 명세서에서 논의되기는 하였으나, 본 발명의 범주 및 정신을 벗어남이 없이 형태에서의 여러 변화들 및 변형들 및 상세들이 이루어질 수 있을 것이다. 하기의 실시예들은 특정의 구체예들의 보다 나은 설명을 제공하기 위한 것이며, 이들은 본 출원을 한정하는 것으로 고려되어서는 안될 것이다. 본 출원은 단지 특허청구범위들에 의해서만 한정된다.

실시예들

물질들 및 방법들

동물들

암컷 Balb/c 생쥐(8주령)들을 잔비어사(Janvier)로부터 수득하였다. 거처의 제공(housing) 및 모든 실험적인 동물 절차들은 뢰벤의 카톨릭 대학(K.U. Leuven)의 동물보호 및 연구 자문 위원회(Institutional Animal Care and Research Advisory Committee)의 승인을 받았다.

세포들 및 배양 조건들

KCL-22 및 CRL-1929 세포들은 미국균주보존협회(ATCC)로부터 수득하였다. Bv-173, K562, BaF3, 32D 및 Nalm6 세포들은 친절하게도 제이. 쿨스(J. Cools ; VIB, Leuven)가 제공하였다. Bv-173 세포들 및 K562 세포들은 20% FCS(하이클론 라보레토리즈(Hyclone Laboratories))를 갖는 RPMI 배지(기브코(Gibco), 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation))에서 배양되었고; BaF3, 32D 및 KCL-22 세포들은 10% FCS를 갖는 RPMI 배지 내에서 배양되었고; 나이린 6(Nairn 6) 세포들은 10% FCS를 갖는 DMEM 배지(기브코, 인비트로겐 코포레이션) 내에서 배양되었고 그리고 CRL-1929 세포들은 20% FCS 및 0.05mM 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol ; 기브코, 인비트로겐 코포레이션)을 갖는 IMDM 배지(기브코, 인비트로겐 코포레이션) 내에서 배양되었다.

기본 쥣과의 골수-유도 기질 세포들(bone marrow-derived stromal cells ; BMDSCs)의 단리

BMDSCs의 단리를 위하여, 대퇴골(femurs) 및 경골(tibias)로부터 골수를 씻어내고, 적혈구들을 용해완충제(lysis buffer ; 150mM NH4CI, 0.1mM EDTA, 10mM KHCO3, pH 7.4)로 제거하고 그리고 후속하여 상기 세포들을 15% FCS로 보충된 DMEM 배지 내에서 배양시켰다. 24시간 후, 부착되지 않은 세포 분획을 제거하고 그리고 부착된 세포들을 더 배양하고 그리고 3주간 확대시켰다.

증식분석 및 공-배양

백혈병 세포들 및 BMDSCs의 증식을 MTT 분석(MTT assays)을 사용하는 것에 의하거나 또는 혈구계수기(hemocytometer)로 수작업으로 계수하는 것에 의하여 분석하였다. 알앤디 시스템즈로부터 쥣과의 재조합 PIGF 및 항-VEGFR-1를 수득하였다. 항-PIGF 및 대조 IgG1들이 트롬보게닉스 앤드 바이올른벤트(Thrombogenics and Biolnvent)에 의해 생산되었으며 기술된 바와 같이 특정되었다(문헌 Fischer et al., 2007 참조). 달리 언급하지 않는 한, PIGF는 50ng/㎖의 농도에서 그리고 항체들은 100배의 몰의 과량으로 사용되었다. 공-배양 실험들을 위하여는, 10⁵ BMDSCs를 4*10⁵ 백혈병 세포들 단독으로 또는 무-혈청 배지(serum-free medium) 내에서 개개 항체들의 존재 중에서 48시간 동안 공-배양시켰다. 후속하여, 부착된 BMDSCs 및 부착되지 않은 백혈병 세포들의 수들을 결정하였으며, 상청액(supernatants)을 수확하여 PIGF 및 VEGF 단백질의 분석에 사용하였다.

말초혈액 분석

혈액을 후안 출혈(retro-orbital bleeding)에 의한 모세관피펫(capillary pipettes)으로 수집하였으며, 자동화된 세포계수기(cell counter ; 베크만 쿨터(Beckman Coulter))를 사용하여 백혈구계수(white blood cell count ; WBC)를 결정하였다.

효소결합면역흡착검사법

"퀀티카인" 생쥐 PIGF 및 생쥐 VEGF 면역분석("Quantikine" mouse PIGF and mouse VEGF immunoassays ; 알앤디 시스템즈)를 사용하여 세포 배양 상청액, 말초혈액 혈장 및 골수 혈장 내의 PIGF 또는 VEGF의 농도들을 정량화하였다. 농도들은 pg/㎖/10⁵ 세포들로 또는 pg/㎖로 표현하였다.

정량적 실시간 PCR

앞서 기술된 바와 같이 프라이머들(primers) 및 프로브들(probes)에 대하여 근본적으로 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행하였다(문헌 Fischer et al., 2007 참조).

BCR-ABL+ Pre-B 세포 백혈병의 동계 모델(syngeneic model)

BCR-ABL+ BaF3 세포들을 앞서 기술한 바와 같이 배양하였으며 1*10⁶ 세포들을 꼬리정맥을 통하여 동계의 8주령의 Balb/C 생쥐들 내로 주입시켰다.

이마티니브-감응성 이식 모델들 및 이마티니브-저항성 CML

CML의 유도를 위하여, 200㎎/㎏ 5-플루오로우라실(5-FU; 시그마 알드리치)로 처리한 4일 후 Balb/C 공여자들(donors)(8주령)으로부터의 대퇴골 및 경골을 씻어내는 것에 의하여 골수세포들을 수확하고 그리고 시험관 내에서 10ng/㎖ 인터류킨-6(IL-6) 및 50ng/㎖ SCF를 포함하는 배지 내에서 사전-자극(pre-stimulated) 시켰다. 후속하여, 상기 세포들을 레트로바이러스성 비축물들(retroviral stocks ; 레트로바이러스성 구조물들(retroviral constructs): MCSV-GFP, MSCV-BCR-ABL p210 IRES-EGFP, MSCV-BCR-ABL-T315I-IRES-EGFP; 친절하게도 잔 쿨스(Jan Cools)에 의해 제공됨)들로 1회전(1 round)의 공-침전(co-sedimentation)에 적용시켰다. 수납자(recipient) 암컷 생쥐들을 치사량의 조사(lethal irradiation)에 의해 준비하고, 그리고 형질감염된 골수를 동물 마리 당 0.5*10⁶ 세포들의 정맥 내 주사에 의하여 이식시켰다.

실시예 1. 시험관 내에서의 백혈병 세포들 및 원발성 골수 기질 세포들 내에서의 PIGF 발현의 분석

시험관 내에서의 백혈병 세포들에 의한 그리고 백혈병-연관 기질 세포들의 서로 다른 분포(population)들에 의한 PIGF의 발현 프로파일(expression profile)을 결정하기 위하여, 골수성 및 림프성 세포주들(쥣과 : BaF3, 32D; 인간: K562, Bv-173, KCL-22)의 세트 내에서 PIGF 발현이 분석되었다. 게다가, 인간 BCR-ABL- 림프성 세포주 Nalm-6를 조사하였다. 더욱이, 골수 기질 세포들의 서로 다른 분포들에서 PIGF 발현을 정량화시켰다. 효소결합면역흡착검사법에 의하여 결정된 바와 같이 모든 연구된 백혈병 세포주들에서 PIGF 단백질의 발현이 발견되지 않았으며, 건강한 CD45⁺ 조혈모세포들 내에서 매우 적은 양들(41±2.3pg/㎖)이 쥣과의 골수로부터 단리되었다(도 1a). 대조적으로, 쥣과의 원발성 골수-유도 기질 세포들(BMDSCs) 및 기질 세포주들(S17, OP9)이 풍부한 양으로 PIGF 단백질이 발현되었다(도 1a).

골수-유도 기질 세포들의 FACS 분석은 3주간의 평균 배양 기간 이후에 쥣과의 BMDSCs의 49.7%±20%가 조혈모세포 계열(hematopoietic lineage) 이었다라는 것이 밝혀졌다(도시하지 않음). 이해를 위하여, 쥣과의 BM DSCs 발현된 PIGF의 조혈모세포 분획(hematopoietic fraction ; CD45⁺)이든 또는 비-조혈모세포 분획((CD45^-)이든 간에, 본 발명자들은 면역자기접근법(immunomagnetic approach)(순도>93%, 도시하지 않음)을 통하여 두 분포들을 분리하였으며, 후속하여 CD45⁺ 및 CD45^- BMDSCs의 상층액 내에서 PIGF를 결정하였다. 이들 실험들은 거의 전적인 CD45^- BMDSCs의 발현을 나타내었다(도 1b ; N=3; p<0,001). 더욱이, 본 발명자들은 인간 (HUVEC) 및 쥣과의 (fEND5) 내피세포들에서의 PIGF 발현을 결정하였으며, PIGF 단백질의 풍분한 발현을 발견하였다(HUVEC: 279.7±29.9pg/㎖; fEND5: 125.7±18.8pg/㎖; N=3). 전체적으로 보아, 이들 결과들은 시험관 내에서 PIGF가 주로 골수 기질 세포들에 의하여 발현되고 백혈병 세포들에 의해서는 발현되지 않는다는 방향성을 지시하고 있다.

실시예 2. PIGF 는 백혈병성 기질( leukemic stroma )에 의하여 발현되고 그리고 생체 내에서의 백혈병 진전의 생체지표( biomarker )를 나타낸다.

백혈병 진전에 대한 PIGF의 잠재적 충격 및 그에 따른 생체 내에서의 αPIGF의 치료학적 잠재성을 자세히 설명하기 위하여, BCR/ABL-GFP 형질도입된 골수의 동계의, 거의 치사량에 가깝게 조사된 생쥐들 내로 이식시키는 것에 의하여 잘 기술된 CML의 아구성 발증을 사용하였다. 본 발명자들은 먼저 대조 생쥐들과 비교하여 서로 다른 시점들(14일(dl4), 21일(d21) 및 28일(d28))에서 질병에 걸린 생쥐의 혈장 내의 PIGF 단백질 수준들을 분석하였으며, 건강한 생쥐들 및 가성-이식된 골수로 이식된 생쥐들의 말초혈액 내에서 매우 낮은 양들의 PIGF 단백질 및 그들의 골수 내에서의 낮은 양들의 PIGF 단백질을 검출하였다. 대조적으로, 백혈병 생쥐들은 말기에서 고형암들을 앓는 생쥐들(문헌 Fischer et al., 2007 참조)에 비해 그들의 순환 도달 수준들(circulation reaching levels)에서 질병의 진전에 따라 PIGF 단백질의 증가를 나타내었다(도 2a, b). PIGF 증가의 유사한 동력학(kinetic)이 골수 혈장에서 관측되었다(도 2b). 본 발명자들은 또한 PIGF의 천연의 억제제, sVEGFR-1를 정량화하였으며, 비록 sVEGFR-1이 PIGF에 비해 과량으로 존재함에도 불구하고, 질병의 진전에 따른 혈액 및 골수 내에서 PIGF/sVEGFR-1 비율이 증가하였음을 발견하였으며, 이는 백혈병의 과정 동안에 PIGF의 상향조절(upregulation)이 sVEGFR-1의 상향조절에 비해 보다 확연하다는 것을 나타내고 있다(도 2c, d).

생체 내 PIGF의 공급원을 해부하기 위하여, 본 발명자들은 골 및 골수의 실시간 PCR 분석을 수행하였으며, 상기 골수 내에서의 PIGF mRNA의 12.6배의 상향조절을 드러내었다(N=8 ; P<0.002)(도 2e). 골들 내에서의 PIGF mRNA 수준들은 질병에 걸린 그리고 건강한 생쥐들에서 유사하였으며(데이터는 나타내지 않음), 이는 백혈병 생쥐의 골수 혈장 내에서 검출된 증가된 PIGF의 1차적 근원(primary source)가 상기 골수임을 나타내고 있다. 상기 골수 내에서의 상기 PIGF 생산 세포들을 더욱 특정하기 위하여, 본 발명자들은 백혈병 세포들(GFP⁺), 비-백혈병의 조혈모세포들(GFP^-CD45⁺) 및 비-백혈병의, 비-조혈모세포 기질 세포들(GFP^-CD45^-)을 형광이용세포분류기-분류(FACS-sorted)를 하였으며, 후속하여 이들 아분획들(subfractions)에서 역전사-중합효소연쇄반응의 수단에 의하여 PIGF mRNA 발현을 결정하였다. 이들 실험들은 앞서 언급한 시험관 내 발견들과 유사하게 PIGF가 대부분 CD45^- 기질 세포들에 의하여 발현되었으며, 생체 내 백혈병 세포들 또는 백혈병 생쥐들의 조혈모세포들에 의해서는 거의 무시할 정도로 발현되었다는 것을 설명하고 있다. 결국, GFP^-CD45^- 기질 세포들이 백혈병 세포들에 비해 95.6배 많은 PIGF mRNA를 그리고 조혈모세포들에 비해 32배 많은 PIGF mRNA를 발현하였다(N=4 ; P<0,05); 도 2f). 백혈병 생쥐들로부터의 CD45^- 골수 세포들 내에서의 PIGF mRNA 수준들을 건강한 생쥐들의 골수들로부터의 CD45^- 세포들 내의 PIGF mRNA 수준들과 비교하였을 때, 본 발명자들은 백혈병을 앓는 생쥐들의 비-조혈모세포 기질 세포 격실(compartment) 내에서의 PIGF 발현의 강한(25.4배) 상향조절을 발견하였다(N=4 ; P<0,05)(도 2f). 흥미롭게도, 건강한 생쥐들에 비교하는 경우 백혈병을 앓는 생쥐들의 골수 내에서 VEGF mRNA가 단지 약간 상향조절되었으며(N=8; P=O.23)(도 2g), 이는 PIGF가 또한 생체 내에서 BCR/ABL+ 백혈병에서 특이적인, 기질-유도의 병원성 인자(stroma-derived pathogenic factor)임을 나타내고 있다. 이러한 가설은 말기의 질병을 앓는 생쥐들의 골수 내에서의 GFP⁺ 세포들의 형광이용세포분류기(FACS) 분석에 의해 결정된 바와 같이 백혈병 생쥐들의 혈장 또는 골수 혈장 내에 존재하는 PIGF 단백질의 양이 골수를 침윤시키는 백혈병 싹(leukemic blasts)의 수에 상관된다는 관측에 의해 더욱 확증되었다(r=0.81 및 r=0.85; p<0.05 ; 도 2h, i). 따라서, PIGF는 생쥐들에서의 아구성 발증 CML 의 질병의 진전의 생체지표를 나타낸다.

실시예 3. 항- PIGF 는 백혈병 세포들의 PIGF -유도된 증식을 억제한다.

백혈병 세포들에 대한 PIGF의 잠재적 생물학적 효과를 결정하기 위하여, 백혈병 세포주들 내의 주 PIGF 수용기, VEGFR-1 및 그의 공-수용기들 Npn1 및 Npn2의 발현을 수확하였다. VEGFR-1은 간행된 문헌들에 따라 가장 연구된 세포주들로 발현되었다(문헌 Fragoso et al., 2006 참조)(데이터는 나타내지 않음). 비록 서로 다른 수준들에서 일지라도 Npnl 및 Npn2들이 K562, Nalm-6, BV-173 및 KCL-22 세포주들 내에서 발현되었으나, 32D 세포들 내에서는 발현되지 않았다(도 3a, b).이들 발견점들에 기초하여, 본 발명자들은 시험관 내에서 백혈병 세포들을 PIGF와 함께 배양시켰으며, 이는 간행된 문헌과 일치하게 5개 중의 4개의 BCR/ABL⁺ 세포주들의 증식을 용량 의존적으로 유도하였다(도 3c, d). 그의 주 수용기 VEGFR-1에 더해, PIGF 또한 공-수용기들 Npn-1 및 Npn-2에 결합한다. 백혈병 세포들의 PIGF-유도된 증식이 VEGFR-1을 요구하는 지의 여부를 이해하기 위하여, 세포외 VEGFR-1 블로킹 항체(αVEGFR-1)의 억제 효과(inhibitory effect)가 평가되었다. αVEGFR-1의 존재 중에서의 PIGF 매개된 증식의 억제가 발견되었다(도 3e). 대조적으로, 백혈병 세포들의 PIGF-유도된 증식은 Npn-1 및 Npn-2에 대한 세포외의, 기능 블로킹 항체들의 첨가에 의하여 억제되지 않았으며, 이는 PIGF의 친-증식 효과(pro-proliferation effect)가 VEGFR-1을 통하여 일차적으로 매개된다는 것을 나타내고 있다(도 1g). 다음 단계에서, 항-PIGF(αPIGF)가 백혈병 세포들의 PIGF 유도된 증식을 억제하는지 그리고 αPIGF의 첨가에 의하여 PIGF의 친-증식 효과의 거의 완전한 폐기가 발견되었는지가 조사되었으며, 이는 백혈병에서의 치료학적인 잠재성을 나타낸다(도 3f).

PIGF가 BCR/ABL⁺ 백혈병 세포들의 ABL 포스포릴화에서의 변화들을 유도하는 지의 여부를 보다 자세하게 설명하기 위하여, 본 발명자들은 PIGF와 함께 그리고 PIGF 없이 배양된 Bv-173 및 KCL-22 세포들의 웨스턴 블럿들을 수행하였다. 이들 실험들은 PIGF는 ABL의 포스포릴화를 변형시키지 않았다는 것을 나타내었다(데이터는 나타내지 않았음).

실시예 4. 백혈병 세포들과 BMDSCs 에 의한 BMDSCs 유도 PIGF 분비 간의 근거리분비 상호작용들( paracrine interactions )

인간 백혈병 세포들과 BMDSCs 또는 S17 둘 중의 어느 하나에 의한 증가된 PIGF 분비를 야기하는 쥣과의 BMDSCs 또는 쥣과의 골수 기질 세포주(S17) 사이의 잠재적 상호작용들을 연구하기 위하여 공-배양 실험들을 수행하였으며, 공-배양에 의한 쥣과의 PIGF의 명백한 상향조절이 발견되었다(도 4a, b). 이러한 발견은 본 발명자들이 상기 공-배양들의 증식을 분석하도록 자극하였으며, 이는 백혈병 세포들 및 BMDSCs의 증식의 명백한 유도를 나타내었다(도 4c, d). 이러한 친-증식 효과는 상기 배양물들에의 αPIGF의 첨가에 의하여 거의 완전하게 폐지되었으며, 이는 PIGF가 근거리 방법으로 백혈병 세포들의 증식을 유도할 수 있으나 그러나 동시에 자가분비 루프(autocrine loop)를 통한 골수 기질 세포들의 팽창을 매개하고 그에 따라 동시적으로 백혈병 복제(leukemic clone) 및 그의 지지 기질(supportive stroma)을 촉진한다는 것을 나타내었다(도 4c, d). 흥미롭게도, VEGF가 공-배양에 의하여 상향조절되지 않기 때문에, 이 상호작용은 특히 PIGF 상향조절을 야기한다(데이터는 나타내지 않음). 생체 내에서의 BCR-ABL+ 백혈병에서의 PIGF의 잠재적인 역할을 시험하기 위하여, BCR/ABL+ 골수성 및 림프성 백혈병의 3가지의 서로 다른 쥣과의 모델들을 구축하였다.

PIGF의 상향조절을 유도할 수 있는 분자상 신호들을 자세하게 설명하기 위한 노력으로, 본 발명자들은 먼저 백혈병 세포들로 조절된 배지(CM)로의 배양이 백혈병 세포들과의 직접적인 공-배양에 비하여 기질 세포들(S17) 내에서의 PIGF의 유사한 상향조절을 유도하기에 충분한 지의 여부를 분석하였으며, 결국 CM이 S17에 의한 PIGF 분비의 유도에 충분하다는 것을 발견하였다(N=3; P=0,008; 도 4e).

실시예 5. 백혈병 세포들이 아닌 숙주 기질의 유전적 결함이 백혈병 생쥐들의 생존을 연장시킨다 .

생체 내에서의 BCR/ABL⁺ 백혈병에서의 PIGF의 역할을 결정하기 위하여, 본 발명자들은 PIGF에 대해 유전적으로 결함이 있는 생쥐들(PIGF^{- l -}) 내에 그리고 야생형 생쥐들 내에 백혈병을 유발시켰으며, 두 그룹들 사이의 생존율을 비교하였다. 본 발명자들은 PIGF를 결여하는 생쥐들이 야생형 생쥐들 보다 명백하게 더 오래 생존하였다는 것을 발견하였으며, 이는 PIGF가 생체 내에서의 백혈병의 발병(pathogenesis)에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타내고 있다(N=14/15 ; P=0.003; 도 5a).

PIGF가 BCR/ABL+ 백혈병에서 기질-유도 인자를 나타낸다는 본 발명자들의 가설을 입증하기 위한 시도로서, 본 발명자들은 야생형 생쥐들 및 PIGF KO 생쥐들로부터의 형질전환된 골수들을 야생형 숙주들 내로 이식하는 것에 의하여 교차연구들(cross-over studies)을 수행하였으며, 서로 다른 그룹들(WT→WT, KO→WT 및 WT→KO) 사이의 생존율을 비교하였다. 본 발명자들은 상기 백혈병 세포들 내에서의 PIGF의 부재가 생쥐들의 생존을 연장시키지는 않으나, 그러나 숙주 기질의 PIGF 결함이 백혈병 생쥐들에서의 명백한 생존상의 잇점을 유도한다는 것을 발견하였으며, 이는 완전히 PIGF 결함이 있는 체계들에서와 마찬가지로 상당한 범위 이내이다(상기 참조). 따라서, 기질 유도 PIGF는 생체 내에서 BCR/ABL⁺+ 백혈병의 진전을 극단적으로 촉진한다(도 5b).

실시예 6. 백혈병 생쥐들의 항- PIGF 로의 처리가 명백하게 그들의 생존을 연장시킨다 .

쥣과의 Ph+ 백혈병에서의 PIGF 억제의 치료학적 잠재능을 조사하기 위하여, BCR-ABL+ BaF3 세포들의 정맥 주사에 의해 유도된 백혈병을 앓는 생쥐들을 αPIGF로 처리하였으며, 대조 항체들에 비하여 18일로의 중간값의 생존율의 명백한 연장이 발견되었다(N=9; P=0.015)(도 5c). 이들 결과들은 본 발명자들로 하여금 상승된 백혈구들이 말초혈액 내에서 처음으로 검출될 수 있는 1주일 후에 질병을 앓는 생쥐들의 사망을 유도하는 비장비대증(splenomegalia)과 골수성 백혈병 세포들의 과도 증식에 의해 특징지워지는 아구성 발증에서의 인간 질병 상태를 임상적으로 모방하는 BM 형질도입된 BCR-ABL의 이식에 의해 유도된, 이마티니브-감작성 및 이마티니브-저항성(T315I 돌연변이) CML의 쥣과의 모델들을 구축하도록 하였다. 그 후, 상기 백혈병의 부담(leukemic burden), 골수 조직학 및 생쥐들의 생존율에 대한 αPIGF의 효과가 검사되었다. 감소된 백혈병의 부담이 관측되었으며(데이터는 나타내지 않음), 초기단계(15일) 및 말기단계(28일) 백혈병에서 GFP⁺ 세포들의 FACS 분석이 골수(BM) 및 말초혈액(PB) 내에서의 BCR-ABL⁺ 세포들의 특이적인 감소를 나타내었다(N=7; P<0,05)(도 5d, e 및 나타내지 않음). 더욱이, 말기단계에서의 골수 조직학들은 αPIGF의 처리에 의해 유도된 질병의 진전의 상당한 억제를 나타내고 있다(도 5f). 그 후, 본 발명자들은 생쥐들의 생존율에 대한 αPIGF의 효과를 조사하였다. 이들 실험들은 이마티니브-감작성 및 이마티니브-저항성 백혈병 둘 다를 앓는 생쥐들에서의 대조 항체들과 비교할 때 αPIGF로의 치료(처리)에 의하여 생존의 명백한 연장을 나타내고 있다(도 5g, h). 따라서, αPIGF는 BCR/ABL 돌연변이성 상태와는 무관하게 쥣과의 아구성 발증의 진전을 억제한다.

실시예 7. 백혈병 생쥐들의 항- PIGF 로의 치료가 골수 혈관과다( hypervascularization ) 및 섬유증( fibrosis )을 억제한다.

골수의 신혈관생성(neoangiogenesis)은 백혈병에서의 중요한 병원인자(pathogenic factor)를 나타낸다. PIGF는 잠재적인 신생혈관유발 사이토카인(pro-angiogenic cytokine)이며 이미 종양 혈관신생(tumor angiogenesis)을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 말기 백혈병에 대하여 가성-이식된 항체로 처리된 그리고 αPIGF로 처리된 생쥐들에서의 CD31 염색(stainings)의 형태계측학적 분석(morphometric analysis)에 의하여 골수 혈관과다에 대한 PIGF 억제의 효과가 분석되었다. 이들 실험들은 가성-이식된 대조들에 비하여 백혈병 생쥐들에서의 골수의 극심한 혈관과다를 나타내었다(도 6a, c).

골수 섬유증은 CML에서 잘 알려진 부정적인 인자(adverse factor)이고 그리고 이마티니브에 대한 저항성과 연관된다. PIGF가 BMDSCs의 증식을 자극한다는 우리들의 관측들에 기초하여(상기한 내용 참조), 본 발명자들은 αPIGF로의 백혈병 생쥐들의 치료가 골수 섬유증을 변형시킬 수 있는 지의 여부를 조사하였다. 상기 골수 내에서의 망상적혈구⁺ 섬유들(레티큘린⁺ 섬유들(reticulin⁺ fibers))의 평균 길이의 형태계측학적 분석에 의하여, 본 발명자들은 PIGF의 억제에 의해 유도된 골수 섬유증의 명백한 감소를 발견하였다(도 6b, d). 따라서, αPIGF는 백혈병 생쥐들에서의 골수의 혈관과다 및 섬유증 둘 다를 감소시킨다.

흥미롭게도, 초기의 실험들은 이마티니브 및 항-PIGF가 생체 내에서 BCR/ABL+ 백혈병에 대한 부가적인 억제 효과를 갖는다는 것을 나타내었다.

실시예 8. PIGF 는 인간 CML 에서 상향조절된다.

인간 CML에서의 신규한 표적 분자로서의 PIGF의 연관성을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 건강한 대조군들(n=10), 원발성의 진단(primary diagnosis)에 의한 만성의 단계(Chronic Phase ; CP)에서의 처치(치료)되지 않은 환자들(n=32) 및 서로 다른 티로신 키나아제 억제제들(tyrosine kinase inhibitors ; TKIs)로의 치료 하에 있는 아구성 발증(BC, 상기 질병의 말기 상태)을 앓는 환자들(n=9) 들에서의 PIGF 혈장 수준들을 결정하였다. 이들 분석들은 건강한 대조군들에 비해 CP 내에서 새로이 진단된 환자들에서 PIGF의 2.1배의 상향조절이(p<0.0001) 그리고 BC를 앓는 환자들에서의 PIGF 수준들의 3.7배의 증가(p<0.0001)를 나타내었다(도 7a). 후속하여 본 발명자들은 새로이 진단된 CML를 앓는 환자들의 골수 혈장(bone marrow plasma ; BMP) 내에서(n=7) 그리고 골수의 침투가 없는 림프종으로 진단된 대조 환자들 내에서(n=5)의 PIGF 수준들을 결정하였다(도 7b). 이들 분석들은 또한 대조들에 비하여 CML 환자들의 BMP 내에서의 PIGF의 상향조절을 나타내었다.

계속해서 본 발명자들은 단일 기관(single centre) 내에서의 QRT-PCR에 의해 결정된 바와 같은 PB PIGF 단백질과 BCR-ABL₁ 전사수들 사이의 잠재적인 관계를 조사하였다(n=43 CP, n=2 촉진된 상태; 서로 다른 TKIs, 이마티니브+인터페론, 또는 호모해링토닌(homoharringtonine) 들로 처리). 본 발명자들은 PIGF 수준들과 BCR-ABL₁ 전사수들 사이의 명백한 상관관계를 발견하였으며(r=0.45; p=0.0016), 이는 인간 CML에서 PIGF가 질병 특이적 표적을 나타낸다는 것을 표시한다(도 7c). 후속하여, 본 발명자들은 건강한 공여체들로부터 그리고 CP 및 BC들 내의 CML 환자들로부터 CD34⁺ 세포들을 단리하였으며 QRT-PCR에 의하여 PIGF 발현을 결정하였다. 이들 분석들은 PIGF 발현이 건강한 CD34⁺ 세포들에서 마찬가지로 백혈병 세포들 내에서 동등하게 낮다는 것을 나타내었다(도 7d). 따라서, 상승된 순환하는 PIGF는 백혈병 세포들에 의해 분비되지 않은 것 같았으며, 기질 세포들에 의한 것 같았다. 이 가설을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 새로이 진단된 CML을 앓는 환자들로부터 고착된 BM 기질 세포들(adherent BM stromal cells)을 단리하였으며, PIGF 발현 수준들을 CD34⁺ 백혈병 세포들에서의 발현 수준들과 비교하였다. 본 발명자들은 기질 세포들이 백혈병 세포들 보다 7배 이상의 PIGF를 발현한다는 것을 발견하였으며(도 7d; p=0.003), 이는 본 발명자들의 임상전 데이터(preclinical data)를 확증하고 있으며, PIGF가 일차적으로 CML 환자들에서의 기질 세포들에 의해 생성되었다는 개념을 연장하고 있다.

실시예 9. 이마티니브 치료 하의 CML 환자들 내에서의 PIGF 수준들이 상승된 채로 남아 있다.

왜 백혈병 세포들이 이마티니브로 치료된 환자들 내에 존속하는 지는 여전히 명료하지 않은 채로 남아 있으며, 이는 약물의 회수(중단) 이후 대부분의 환자들의 빠른 재발을 야기한다. 숙주 기질(host stroma)는 BCR/ABL⁺ 백혈병 세포들과는 별개로 잠재적으로 중요한 역할을 한다. 만일 이마티니브가 BMDSCs에 의한 PIGF 분비를 유도할 수 있는 지의 여부를 보다 상세하게 설명하기 위하여, 본 발명자들은 증가하는 농도들의 이마티니브와 함께 기질 세포들을 배양시켰다. 이들 실험들은 쥣과의 BMDSCs에서의 PIGF의 용량-의존적인 유도(dose-dependent induction)를 나타내었으며, 이는 이마티니브에 대한 저항성을 매개하는 기질-유도의 PIGF의 잠재적인 역할을 나타내고 있다. BMDSCs 내에서의 PIGF의 이러한 유도가 또한 생체 내에서 일어나는 지의 여부를 보다 상세하게 설명하기 위하여, 본 발명자들은 BCR/ABL 형질도입된 골수의 이식에 의해 유도된 CML을 앓는 생쥐들을 이마티니브로 처치하였으며, 그들의 골수 내의 PIGF 수준들을 처치되지 않은 백혈병 생쥐들 및 건강한 생쥐들과 비교하였다. 심지어 백혈병 세포들로의 이마티니브 처치된 생쥐들의 골수 침입이 명백하게 낮았음에도 불구하고, 이들 실험들은 처치되지 않은 생쥐들에 비하여 이마티니브로 처치된 백혈병 생쥐들의 골수 내에서의 PIGF의 상향조절을 나타내었다(도 7e). 이들 결과들은 이마티니브에 의하여 골수 내에서의 백혈병-유도된 PIGF 발현의 강화(potentiation)를 나타내고 있으며, 이는 아마도 이마티니브의 존재 중에서의 백혈병 세포들의 생존 및 증식을 촉진하는 것으로 여겨진다.

이들 발견들은 본 발명자들로 하여금 서로 다른 응답 수준들에 달하는 이마티니브로 치료된 환자들의 PB 내에서의 PIGF 수준들을 결정하도록 하고(완전분자성관해(complete molecular remission(CMR); BCR/ABL/ABL 비율 < 1; BCR/ABL/ABL 비율 < 10), 그리고 이들을 건강한 개체들 및 미처리된, 원발성으로 진단된 CML 환자들과 비교하도록 하였다. 흥미롭게도, PIGF 수준들은 건강한 대상체들에서 그리고 < 1의 낮은 BCR/ABL/ABL 비율을 갖는 환자들에서 보다 CMR을 앓는 환자들에서 명백하게 높았으며, PIGF는 치료되지 않은, 새로이 진단된 CML 환자들에서와 유사한 수준들로 상승되었다(도 7f). 이들 데이터들은 여러 차수들의 규모(several orders of magnitude)의 백혈병의 부담의 감소에도 불구하고 PIGF가 상승된 채로 남아 있음을 나타내고 있으며, 아마도 이마티니브로의 치료 하에서의 질병의 존속에 기여하고 있는 것 같다.

결론적으로, 본 발명자들의 데이터는 PIGF가 BCR/ABL 돌연변이성 상태와는 무관하게 Ph+ 백혈병의 진전을 촉진하는 기질 유도의 인자를 나타내고 그리고 BCR/ABL 키나아제 억제제들 또는 TKI 난치의 백혈병에서의 유용한 부가물(adjunct)인, 백혈병 기질에 의해 생성된 신규한 표적을 나타낸다는 것을 나타내고 있다.

결론

이마티니브와 2세대 BCR-ABL 억제제들의 도입은 필라델피아 염색체 양성(Ph+) 백혈병들을 앓는 환자들의 치료에 혁명적이었으나, 그러나 백혈병 세포들은 성공적으로 치료된 환자들에서조차도 존속하며, 일부 환자들은 저항성 및 극단적으로는 재발하고 있다. 이들 단점들의 이유들은 완전히 해결되지는 않았으나, 상기 숙주 기질이 BCR-ABL과는 별개로 잠재적으로 중요한 역할을 하는 것으로 본 발명자들에 의해 가정되었다. VEGF의 상동체인 경태반 성장인자(PIGF)가 고형암들 내의 기질 세포들에 의하여 풍부하게 분비되는 것으로 이미 증명되었다. 따라서, Ph+ 림프구성 및 골수성 백혈병들에서의 PIGF의 역할을 연구하고 그리고 PIGF에 대한 모노클로날 항체인 αPIGF의 치료학적 잠재성에 접근하는 것은 가치가 있는 것이며, 이는 본 발명자들에 의해 고형암들의 다양한 임상전 모델들에서 광범위한 항-종양 잠재성(anti-tumoral potential)을 갖는 것으로 보고되었다(문헌 Fischer et al., Cell, 2007 참조).

첫째, 5가지의 서로 다른 인간 및 쥣과의 Ph+ 백혈병 세포주들(Bv-173, BaF3, 32D, K562, KCL22)에 의한 PIGF의 발현이 시험관 내에서 연구되었으며, 비록 이들이 그의 표적 수용기 VEGFR-1을 발현하기는 하였으나, 이들 세포주들 중의 어느 것도 PIGF 단백질을 분비하는 것으로는 발견되지 않았다. 대조적으로, 원발성의 쥣과의 고착된 골수 기질 세포들(BMDSC)은 풍부한 양의 PIGF 단백질을 발현하였으며(10⁵ pg/㎖/10⁵ 세포들까지), 이는 PIGF의 잠재적인 기질-연관 기능을 나타내고 있다.

둘째, PIGF가 증식을 유발하는 지를 분석하였고 그리고 그에 의하여 재조합 PIGF에 의한 증식의 용량-의존적인 유도가 모든 분석된 백혈병 세포주들에서 밝혀졌다. 이러한 PIGF의 효과는 αPIGF 및 세포외 항-VEGFR-1 항체 둘 다에 의해 거의 완전하게 폐지되었으며, 따라서 PIGF의 친-증식효과가 일차적으로는 VEGFR-1에 의하여 매개된다는 것을 나타내고 있다.

셋째, 공-배양 실험들에 의하여 BMDSCs와 백혈병 세포들 사이의 잠재적 파라크린 간섭들이 연구되었다. 뚜렷하게, BMDSC의 백혈병 세포들과의 공-배양은 명백하게 백혈병 세포들의 증식을 유도하였다. 이러한 증식의 유도가 PIGF에 의해 매개될 수 있고 그리고 결국 상기 공-배양물들에의 αPIGF의 첨가에 의한 이러한 친-증식효과가 발견되었다는 것이라는 가설이 성립되었다. 더욱이, 백혈병 세포들의 존재 중에서 배양되는 경우 BDMSCs는 명백하게 PIGF 분비를 상향조절시켰으며(2.1배; N=3; P=O.005), 이는 두 세포 형태들 사이에서의 상당한 파라크린 상호작용들을 나타내고 있다. 이들 결과들은 본 발명자들이 기질 유도의 PIGF가 Ph+ 백혈병들에서의 신규한 표적을 나타낼 수 있다고 결론을 내리는 것을 허용하였다.

생체 내에서의 이러한 가설을 시험하기 위하여, 3가지의 서로 다른 Ph+ 골수성 및 림프종 백혈병의 쥣과의 모델들이 구축되었다. 후속적으로, 건강한 생쥐들에 비교하여 질병에 걸린 생쥐들의 혈액 및 골수 내에 존재하는 바와 같은 PIGF 단백질이 분석되었다. 건강한 생쥐들의 말초혈액 내에서는 PIGF 단백질이 발견되지 않았으며, 그들의 골수 내에서는 낮은 양들의 PIGF 단백질이 발견되었다. 대조적으로, 백혈병 생쥐들은 그들의 순환계에서 고형암들을 앓는 생쥐들에 상당하는 수준으로 PIGF 단백질을 나타내었으며(76.5±18.4pg/㎖ 혈장; N=7), 흥미롭게도, 건강한 생쥐들에 비해 다시 그들의 골수 내에 8.9배 이상의 상승된 PIGF 수준들 나타내었으며, 이는 Ph+ 백혈병에서 PIGF가 기질-유도의 신규한 병원성 인자를 나타낸다는 것을 나타내고 있다.

쥣과의 Ph+ 백혈병들 내에서의 αPIGF의 치료학적 잠재성을 조사하기 위하여, 후속적으로 BCR/ABL+ BaF3 세포들의 주사에 의해 유도된 백혈병을 앓는 생쥐들을 대조 항체들에 비하여 αPIGF로 치료하였으며, αPIGF에 의해 유도된 18일로의 중간값의 생존율의 명백한 연장이 발견되었다(N=9; P=0.015). 이들 긍정적인 결과들에 고무되어, 원발성의 골수세포들의 형질유도 및 하는 치명적으로 조사된 수용 생쥐들 내로의 이식에 의하여 이마티니브-감작성 및 이마티니브-저항성(T315I 돌연변이) CML의 모델들이 구축되었으며, 이들을 αPIGF 및 대조 항체들로 치료하였다. 흥미롭게도, 또한 이들 공격적인 모델들에 있어서, 본 발명자들은 PIGF의 차단에 의해 유도된 질병에 걸린 생쥐들의 뚜렷하게 연장된 생존율을 발견하였다(야생형 BCR-ABL 유도된 백혈병에서의 중간값 생존 연장 5일; N=11; P=0.002; T315I 돌연변이 내에서 4일; N=12; P=0.039). 골수 조직학 및 FACS에 의한 표현형 분석(phenotypic analysis)은 백혈병 세포들로의 비장 및 골수의 감소된 침입을 나타내었다(골수 내에서는 38% 그리고 비장 내에서는 24%의 감소).

본 발명자들은 여기에서 백혈병 세포들이 비-조혈모세포의 골수 유도 기질 세포들(BMDSCs)에게 경태반 성장인자(PIGF)를 상향조절하도록 명령하고 이는 극단적으로 임상전 생쥐 모델들에서 BCR-ABL1+ 백혈병의 진전을 구동시킨다는 것을 밝혀냈다. 중요하게도, 이들 발견들은 PIGF가 또한 CML 환자들의 혈액 및 골수들 내에서 상향조절되는 것과 마찬가지로 CML의 인간 샘플들에서도 확인되었다. PIGF에 대한 모노클로날 항체, αPIGF에 의한 이러한 신규한 표적 분자의 억제는 이마티니브-감작성 및 이마티니브-저항성(T351I-돌연변이된) 백혈병을 앓는 생쥐의 생존율을 강화시킨다. 항-PIGF는 백혈병 세포들의 증식을 차단하는 것에 의하여 그리고 혈관과다 및 섬유증을 감소시키는 것에 의하여 비정상적인 백혈병성 골수 미세환경(microenvironment)를 정규화(normalizing)하는 것에 의하여 치료학적 효과를 나타낸다. 흥미롭게도, 이마티니브는 BMDSCs 내에서 PIGF를 상향조절할 수 있고 그리고 PIGF 수준들은 이마티니브로 치료된 CML 환자들 내에 높은 상태로 남아 있으며, 이는 PIGF가 백혈병 세포들의 존속에 기여할 수 있다는 것을 나타내고 있다. 이는 PIGF 억제가 이러한 치료법들과 조합하여 사용되어 부가의 잇점을 제공할 수 있다는 사실을 더욱 지지한다. 요약하면, PIGF의 억제는 복합요법들에서 또는 TKI 난치의 CMLd에서 표적화될 수 있는 신규한 후보로서 기능할 수 있다.

결론적으로, 이들 데이터는 PIGF가 BCR/ABL 돌연변이성 상태와는 무관하게 Ph+ 백혈병의 진전을 촉진하는 기질 유도의 인자를 나타내고 그리고 BCR/ABL 키나아제 억제제들 또는 TKI 난치의 백혈병에서의 유용한 부가물인, 백혈병 기질에 의해 생성된 신규한 표적을 나타낸다는 것을 나타내고 있다.

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Claims (11)

1. 필라델피아 염색체 양성 백혈병의 치료에서 사용되기 위한 것임을 특징으로 하는 경태반 성장인자의 억제제.
2. 제 1 항에 있어서,
   경태반 성장인자의 선택적 억제제, 특히 경태반 성장인자에 특이적으로 결합하는 그의 항체 또는 단편임을 특징으로 하는 경태반 성장인자의 억제제.
3. 제 1 항에 있어서,
   경태반 성장인자의 비-선택적 억제제, 특히 VEGFR-1에 특이적으로 결합하는 그의 항체 또는 단편임을 특징으로 하는 경태반 성장인자의 억제제.
4. 제 1 항 내지 제 3 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
   상기 필라델피아 염색체 양성 백혈병이 만성 골수성 백혈병임을 특징으로 하는 경태반 성장인자의 억제제.
5. 제 1 항 내지 제 4 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
   상기 필라델피아 염색체 양성 백혈병이 BCR-ABL 억제제로 치료될 수 없거나 및/또는 BCR-ABL 억제제 단독으로 치료될 수 없는 것임을 특징으로 하는 경태반 성장인자의 억제제.
6. 필라델피아 염색체 양성 백혈병의 치료를 위한 약물의 제조를 이한 경태반 성장인자의 억제제, 특히 청구항 제 1 항 내지 제 5 항들 중의 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 억제제들의 용도.
7. PIGF의 억제제를 대상체에 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 치료를 필요로 하는 대상체에서의 필라델피아 염색체 양성 백혈병을 치료하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서,
   경태반 성장인자의 상기 억제제가 경태반 성장인자의 선택적 억제제, 특히 경태반 성장인자에 특이적으로 결합하는 그의 항체 또는 단편임을 특징으로 하는 치료를 필요로 하는 대상체에서의 필라델피아 염색체 양성 백혈병을 치료하는 방법.
9. 제 7 항에 있어서,
   경태반 성장인자의 상기 억제제가 경태반 성장인자의 비-선택적 억제제, 특히 VEGFR-1에 특이적으로 결합하는 그의 항체 또는 단편임을 특징으로 하는 치료를 필요로 하는 대상체에서의 필라델피아 염색체 양성 백혈병을 치료하는 방법.
10. 제 7 항 내지 제 9 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 필라델피아 염색체 양성 백혈병이 만성 골수성 백혈병임을 특징으로 하는 치료를 필요로 하는 대상체에서의 필라델피아 염색체 양성 백혈병을 치료하는 방법.
11. 제 7 항 내지 제 9 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 필라델피아 염색체 양성 백혈병이 BCR-ABL 억제제로 치료될 수 없거나 및/또는 BCR-ABL 억제제 단독으로 치료될 수 없는 것임을 특징으로 하는 치료를 필요로 하는 대상체에서의 필라델피아 염색체 양성 백혈병을 치료하는 방법.
    

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