MX2012003084A - Inhibidores de met para incrementar la eficacia de radioterapia. - Google Patents
Inhibidores de met para incrementar la eficacia de radioterapia.Info
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Abstract
Un inhibidor de Met y/o secuencia de nucleótido que codifica un inhibidor de Met para uso en el tratamiento de pacientes que sufren de un cáncer para reducir y/o abrogar la resistencia del paciente a la radioterapia, en donde el inhibidor de Met es seleccionado de entre: i) anticuerpo monoclonal anti-Met, ii) un anticuerpo modificado genéticamente que contiene las regiones determinantes de complementaridad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-Met, y iii) un fragmento de (i) o (ii) que contiene las regiones determinantes de complementaridad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-Met o combinaciones de los mismos.
Description
INHIBIDORES DE MET PARA INCREMENTAR LA EFICACIA DE
RADIOTERAPIA
Campo de la Invención
La presente invención describe el uso de inhibidores de MET para incrementar la eficacia de radioterapia en pacientes que sufren de cáncer.
Antecedentes de la Invención
Aunque exitosamente empleada para tratar pacientes con cáncer, la radioterapia puede fallar para erradicar el tumor, el cual recae con un fenotipo más agresivo. Consistentemente, un efecto pro-metastásico paradójico de radiación ionizante (IR, por sus siglas en inglés) ha sido develado por estudios clásicos en modelos animales. Puede resultar progresión tumoral después de la radioterapia a partir de selección positiva de la subpoblación de "célula germinal cancerosa" , la cual es intrínsecamente radioresistente . Sin embargo, evidencia sorprendente indica que, además de la selección, la IR promueve un fenotipo adaptativo con propósito en regeneración de tejido, el cual a su vez cambia en comportamiento metastásico. Este fenotipo es definido como la respuesta "tensión y recuperación" a daño de ADN, que ocurre tanto a nivel de la célula simple y de tejido. En células simples, la detección de daño de ADN produce mecanismos moleculares específicos, en su mayoría
Ref.:227855 orquestados por el eje ATM-p53, el cual bloquea la replicación y activa la reparación del ADN. Si el daño es irreversible, una célula normal es programada para ejecutar apoptosis, o para hibernar su capacidad proliferativa a través de la senescencia. Sin embargo, después de la muerte de células mutantes, los tejidos deben restablecer un número y patrón celular adecuado, para así recuperar la estructura y función originales. De esta forma, la regeneración (o "curación de herida") es iniciada por células sobrevivientes, ya sea normales o neoplásticas. Como se observa in vitro, este proceso incluye etapas como desunión a partir del borde de la herida, adquisición de un fenotipo de fibroblasto, migración en el área herida y posiblemente proliferación. El programa total ha sido referido como "transición epitelial mesenquimal" (EMT, por sus siglas en inglés) , una terminología que subclasifica las características morfológicas. Más recientemente, este programa ha sido también definido como "crecimiento invasivo" (IG por sus siglas en inglés) , una palabra que enfatiza los aspectos funcionales relevantes para el cáncer. Es ahora ampliamente aceptado, que EMT/IG es un programa fisiológico para desarrollo y regeneración de tejido, el cual es usurpado por células cancerosas para realizar invasión y metástasis. EMT/IG es activado en células cancerosas (a) algunas veces, como resultado de lesiones genéticas que soportan selección clonal; (b) más frecuentemente, como resultado de una respuesta adaptativa para condiciones ambientales adversas .
De esta forma, EMT/IG es un programa genético controlado por último por unos cuantos factores de transcripción específicos, y orquestados por un puñado de señales extracelulares . Lo último incluye factores de cicatrización, como factor de crecimiento de hepatocitos (HGF, por sus siglas en inglés) y proteína de estimulación de macrófagos (MSP por sus siglas en inglés) , la cual enlaza receptores de tirosina cinasa que pertenecen a la familia Met .
Sumario de la Invención
Existe la necesidad por lo tanto, de soluciones mejoradas para incrementar la eficacia de la radioterapia en pacientes que sufren de tumores.
El objeto de esta descripción es proporcionar tales soluciones mejoradas.
De acuerdo a la invención, el objeto anterior es logrado gracias a la materia objeto descrita específicamente en las reivindicaciones siguientes, las cuales son entendidas como que forman una parte integral de esta descripción.
Una modalidad de la invención proporciona el uso de un inhibidor de Met en el tratamiento de un paciente que sufre de un tumor, preferentemente un tumor que presenta una trayectoria de Met desregulada, en donde el inhibidor de Met es seleccionado de:
i) un anticuerpo monoclonal anti-Met,
ii) un anticuerpo modificado genéticamente que contiene las regiones determinantes de complementaridad (CDR, por sus siglas en inglés) del anticuerpo monoclonal anti-Met, y iii) un fragmento de (i) ó (ii) que contiene las regiones determinantes complementarias (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-Met, o combinaciones de los mismos, en donde el inhibidor de Met es capaz de inducir regulación descendente del receptor codificado por el gen MET y reduce y/o abroga la resistencia del paciente a radioterapia.
En una modalidad preferida el anticuerpo monoclonal anti-Met es el anticuerpo monoclonal anti-Met DN30 producido por la línea celular de hibridoma ICLC PD 05006.
En una modalidad preferida adicional, las regiones determinantes de complementaridad (CDR) contenidas en a) el anticuerpo modificado genéticamente o b) los fragmentos del anticuerpo monoclonal anti-Met o del anticuerpo modificado genéticamente son las CDR de anticuerpo monoclonal anti-Met DN30 cuyas secuencias de aminoácidos son indicadas en SEQ ID NO: 12 a 14 y 20 a 22.
Otra modalidad de la presente descripción se relaciona a una secuencia de nucleótidos que codifica un inhibidor de Met para uso en el tratamiento (por ejemplo, por terapia de genes) de un paciente que sufre de un tumor, preferentemente un tumor que presenta una trayectoria Met desregulada, el inhibidor de Met que es seleccionado de:
i) un anticuerpo monoclonal anti-Met,
ii) un anticuerpo modificado genéticamente que contiene las regiones determinantes de complementaridad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-Met, y
iii) un fragmento de (i) o (ii) que contiene las regiones determinantes de complementaridad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-Met, o combinaciones de los mismos,
en donde el inhibidor de Met es capaz de inducir regulación descendente del receptor codificado por el gen de MET y reduce y/o abroga la resistencia del paciente a radioterapia .
En una modalidad preferida el anticuerpo monoclonal anti-Met es anticuerpo monoclonal anti-Met DN30 producido por la línea celular de hibridoma ICLC PD 05006.
En una modalidad preferida las regiones determinantes de complementaridad (CDR) contenidas en las secuencias de nucleótidos que codifican a) el anticuerpo modificado genéticamente o b) los fragmentos del anticuerpo monoclonal anti-Met o del anticuerpo modificado genéticamente son las CDR de anticuerpo monoclonal anti-Met cuyas secuencias de aminoácidos son indicadas en SEQ ID NO: 12 a 14 y 20 a 22.
De acuerdo a una modalidad preferida, el inhibidor de Met es para administración i) en la forma de proteína soluble por inyección o infusión o ii) por medio de un vector para administración sistémica o intra-tumoral .
De acuerdo a una modalidad preferida adicional, el inhibidor de Met está en la forma de un fragmento Fab opcionalmente conjugado con por lo menos una molécula estabilizante, en donde la molécula estabilizante es seleccionada de polietilenglicol , dominio de enlace de albúmina, albúmina.
La presente descripción describe que la irradiación sobreregula la expresión de MET (oncogen conocido para accionar el "crecimiento invasivo" del cáncer) , lo cual a su vez promueve la invasión celular y protege las células de apoptosis inducida por radiación. De esta forma, la abrogación de expresión de MET o inhibición de su actividad cinasa por compuestos específicos, es decir inhibidores de Met específicos, promueve la apoptosis y contrarresta la invasividad inducida por radiación, de esta forma incrementando la eficacia de la radioterapia.
Breve Descripción de las Figuras
La invención será ahora descrita, en forma de ejemplo solamente, con referencia a las figuras anexas, en donde :
En las Figura la-Id, se muestra que IR induce transcripción de MET.
la, la proteína Met en MDA-MB-435S en los puntos de tiempo indicados después de la radiación (10 Gy) , ctrl . , Met en tiempo cero. Figura Ib, proteína Met en MDA-MB-435S 12 horas después de la radiación (1-10 Gy) , Figura le, transcripción de MET en MDA-MB-435S en los puntos de tiempo indicados después de la radiación (10 Gy) . Figura Id, actividad de Luciferasa accionada por el promovedor de MET (construcción básica, sin promotor) en MDA-MB- 231 en los puntos de tiempo indicados después de la radiación (10 Gy; ctrl., células no irradiadas). Columnas: media de análisis triplicado de dos experimentos independientes + s.e.m (* p<0.05, n= 6, prueba te emparejada). a.u.( unidades arbitrarias .
Las Figuras 2a-2d muestran que la transcripción de Met inducida por IR requiere NF-KB.
Figura 2a, acumulación nuclear de proteína en MDA-MB-435S analizada en los puntos de tiempo indicados después de la radiación (10 Gy) , o después de 24 horas de cultivos en hipoxia (1% de 02) . Ctrl., células no irradiadas en tiempo cero. Figura 2b, inmunoprecipitación de cromatina en MDA-MB-231 radiadas (10 Gy; ctrl, células no irradiadas) . Las columnas representan la proporción entre inmunoprecipitación IgG anti-p65/RelA y no específica de cada secuencia de enlace de NF-?? ( BI O B2) en el promotor de MET (media + s.e.m. de análisis triplicado) . El promotor a NFKBIA (??a) es usado como control positivo. Figura 2c, actividad de promotor de MET en MDA-MB-231, silenciada para expresión de p65/RelA (siRELA; siCTRL, control) , e irradiadas (10 Gy; ctrl, células no-radiadas) . Las columnas representan la proporción entre el promotor de Met accionado y expresión de luciferasa (básico) sin promotor (media de análisis triplicado en tres experimentos independientes _+ s.e.m.). Grupo interno: proteína p65/RelA después de la transfección de ARNsi. Figura 2d, acumulación de proteína de Met en MDA-MB-435S silenciada por expresión de p65/RelA (siRELA; siCTRL, control) , en los puntos tiempo indicados después de la radiación (ctrl, células no irradiadas en tiempo cero) .
La Figura 3 muestra que la expresión de MET inducida por IR requiere activación de ATM cinasa
La expresión de proteína Met, fosforilación Chk2
(p-Chk2) y translocación nuclear p65/RelA en MDA-MB-435S tratado con el inhibidor de ATM cinasa CGK733, y extraída en los puntos tiempo indicados después de irradiación. Ctrl., células no irradiadas en tiempo cero.
Las Figuras 4a-4b, muestran que el crecimiento invasivo inducido por IR requiere Met.
Figura 4a, invasión de membrana basal por MDA-MB-231 irradiada o U-251 (10 Gy; ctrl., control). Micrografías de filtros transpozo (10X) . Figura 4b, morfogénesis de ramificación inducida por Met aberrante en MDA-MB-435S irradiada (10 Gy; ctrl., control), cultivada con o sin (-) las concentraciones de HGF indicadas. Barra de escala: 100 µp? .
La Figura 5 muestra que la inhibición de Met sensibiliza las células a apoptosis inducida por IR y detención proliferativa .
Viabilidad de U-251 irradiada con 10 Gy y/o cultivada en la presencia del fragmento de Fab del anticuerpo anti-Met de DN30, por 48 horas (vehículo: células no irradiadas). Columnas: media de análisis triplicados de tres experimentos independientes + s.e.m. (* p< 0.05, viabilidad significativamente reducida con respecto a ya sea Fab-DN30 ó 10 Gy slo, n=9 prueba t emparejada) .
Columnas: porcentaje de células que generan clones (media de análisis triplicados de dos experimentos independientes + s.e.m., *p< 0.05, n=6, prueba t emparejada).
La Figura 6 muestra que IR induce fosforilación de
Met.
Fosforilación de Met en MDA-MB-231 tratada con HGF (50 nM) y/o IR. Las células son inmunoprecipitadas con anticuerpos anti-Meb en los puntos de tiempo indicadas y se analiza por western blot con anticuerpos anti-fosfo-Tyr (p-Tyr) . Se muestra Met como control de inmunoprecipitación de proteína, ctrl, células tratadas con control negativo de HGF (ver métodos) .
La Figura 7 muestra la alineación de promotor de MET de ratón y humano.
Se analiza el promotor de MET humano (no. de acceso a GenBank: AF046925) con el software TRANSFAC 7.0 (Biobase Biological Datábase GMBH, Wolfenbuttel , Alemania) para identificación de sitios de enlace del factor de transcripción. Se encuentran dos sitios de enlace de NF-KB putativos (KBI y ??2) . La alineación del promotor de Met humano y de ratón (Gene ID: 17295) muestra que el sitio ??2 (-1149/1136 en la secuencia humana, rectángulo) es altamente conservado entre las dos especies.
Las Figuras 8a- 8b muestra la secuencia de ácidos nucleicos (8a) y de aminoácidos (8b) de la cadena pesada de anticuerpo monoclonal de DN30. Las regiones CDR son subrayadas tanto en las secuencias de nucleót do y aminoácido.
La Figura 9a- 9b muestra las secuencias de ácido nucleico (9a) y de aminoácido (9b) de la cadena ligera de anticuerpo monoclonal de DN30. Las regiones CDR son subrayadas tanto en las secuencias de nucleótido y aminoácidos .
Descripción Detallada de la Invención
La presente invención será ahora descrita en detalle con relación a algunas modalidades preferidas en la forma de ejemplos no limitantes.
En la siguiente descripción, se dan numerosos detalles específicos para proporcionar un entendimiento total de las modalidades. Las modalidades pueden ser practicadas sin uno o más de los detalles específicos, o con otros métodos, componentes, materiales, etc. En otros casos, las estructuras bien conocidas, materiales u operaciones no se muestran o describen en detalle para evitar confundir aspectos de las modalidades.
Los títulos proporcionados en la presente son para conveniencia solamente y no interpretan el alcance o significado de las modalidades.
Además de dañar los objetivos intracelulares , la radiación ionizante (en su mayoría a través de la generación de especies reactivas de oxígeno) sintoniza la actividad de moléculas regulatorias, las cuales controlan la respuesta biológica de tensión y recuperación.
La sobreregulación transcripcional del oncogen de Met emerge como un evento crucial en esta respuesta, lo cual resulta en la ejecución de un programa de pro-supervivencia y regenerativo que contrarresta el daño inducido por radiación. Esta descripción muestra que la regulación ascendente de Met inducida por IR es controlada por una trayectoria de transducción de señal producida por la proteína cinasa ATM que sigue a la detección de lesiones de ADN. Esta trayectoria implica exportación nuclear de la ATM cinasa y liberación del factor de transcripción NF-?? a partir de la inhibición. Notablemente, es conocido que la activación de NF- ? por daño de ADN juega un papel clave en la respuesta defensiva contra radiación, ya que NF- ? es un regulador prominente de genes anti-apoptóticos . Se ha propuesto que la supervivencia celular promovida por NF-?? es por lo tanto efectiva como para inducir "resistencia adaptativa" de células cancerosas a radioterapia. La presente invención muestra ahora que la respuesta adaptativa a radiación sostenida por NF-KB implica crucialmente el proto-oncogen de MET.
La inducción de Met por IR es un evento transcripcional bifásico, mediado por enlace de NF- ? a los dos elementos de respuesta específicos de ?? ubicados en el promotor de MET. La respuesta transcripcional temprana que ocurre dentro de 1-2 horas después de la radiación alivia similarmente la activación de NF- ? por la trayectoria intrínseca accionada por el daño de ADN por sensor-ATM. Concebiblemente, la sobreexpresión de Met inducida por IR es per se suficiente para producir transducción de señal en la presencia de concentraciones fisiológicas del HGF ligando ubicuo, como se muestra en el caso de sobreexpresión de MET inducido por hipoxia. La sobreregulación de MET tardía y sostenida - prolongada sobre 24 horas- es también probable para ser soportada por trayectorias de señalización extrínsecas múltiples que inciden en NF-??. De hecho, la radiación promueve la expresión de citosinas que incluyen TNF-a, IL-l y IL-10 que, por una parte, son objetivos de NF-KB, y por otra parte, estimulan la actividad transcripcional de NF- ?. En la presente invención se considera que, en tejidos vivos, la radiación induce circuitos autocrinos/paracrinos que reverberan en NF- ? que propaga ondas de señales de supervivencia en todo el tejido dañado.
Notablemente, es conocido que la respuesta transcripcional a NF- ? incluye, además de los genes de pro supervivencia, moléculas responsables para EMT/IG. La ejecución combinada de pro supervivencia y programas genéticos EMT/IG actúan como una espada de doble filo; en tejidos normales, estos programas resultan en supervivencia y regeneración después del daño; en células cancerosas, estos adoptan progresión hacia malignancia.
El proto-oncogen de MET cumple los criterios para ser un objetivo de NF-?? crítico, requerido para orquestar tanto el lado luminoso y oscuro de las respuestas de tensión y recuperación. Como es mostrado en la presente descripción, por una parte, sobreexpresión de Met inducida por IR permite a las células curar las monocapas heridas. Por otra parte, la IR estimula a células para cruzar las membranas básales, una marca típica de tumores malignos . Incluso más sorprendentemente, es reportado que IR cambia el proceso fisiológico de morfogénesis de ramificación inducido por Met en diseminación celular desorganizada a través de la matriz tridimensional. En todos los casos, aunque varios genes objetivos de NF-?? son expresados en células irradiadas, a través de la inhibición de silenciamiento o funcional de MET, la presente invención muestra que Met es requerido para tanto crecimiento invasivo fisiológico (curación de heridas) y crecimiento invasivo maligno (invasividad) . La agresividad reportada de tumores que recaen después de la irradiación pueden, de esta forma, implicar activación del programa EMT/IG bajo un control justo del oncogen de MET.
La observación de que Met está implicada en la respuesta anti-apoptótica, regenerativa e invasiva a IR tiene importantes consecuencias terapéuticas: combinación de radioterapia con inhibición de Met radiosensibiliza las células cancerosas, mientras que evita los efectos colaterales pro- invasivos . En efecto, la presente descripción muestra que la inhibición de Met daña significativamente la supervivencia de células y la capacidad clonogénica después de la exposición a dosis terapéuticas de IR. Más importante, siendo expresada en el compartimiento germinal/progenitor de varios tejidos normales, MET es expresada concebiblemente también en células germinales cancerosas, lo cual con frecuencia deriva de transformación directa de células germinales normales o progenitores de proliferación. La expresión de Met inducida por IR y activación de radioresistencia celular (germinal) de cáncer de soporte y capacidad invasiva, de esta forma incrementando la oportunidad de su selección positiva y diseminación.
Por lo tanto, la inhibición de Met (por medio de administración del inhibidor de Met en la forma de proteína soluble o por terapia de genes, es decir administración de un vector que codifica el inhibidor de Met como se define en lo siguiente) en combinación con terapias convencionales, es decir radioterapia, es una estrategia adicional para erradicar el cáncer.
En la presente invención con la expresión "inhibidor de Met" se entiende un anticuerpo monoclonal anti-Met, derivados y/o fragmentos de los mismos capaces de inducir regulación descendente del receptor codificado por el gen de MET. En una modalidad preferida el "inhibidor de Met" es anticuerpo monoclonal anti-Met DN30, derivados y/o fragmentos de los mismos, los cuales son capaces de inducir regulación descendente del receptor codificado por el gen de MET.
Con la expresión "derivado de anticuerpo" se entiende una molécula que contiene las regiones determinantes complementarias (CDR) del anticuerpo, como un anticuerpo modificado genéticamente o humanizado que contiene las CDR del anticuerpo o un péptido que contiene las CDR del anticuerpo.
Con la expresión "fragmento de anticuerpo" se entiende un fragmento seleccionado de fragmentos Fv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 de i) el anticuerpo monoclonal anti-Met, y ii) anticuerpo modificado genéticamente o humanizado que contiene las regiones determinantes complementarias (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-Met.
A partir de un punto de vista farmacológico, el empleo de un fragmento Fab tiene tanto ventajas y desventajas. Las moléculas Fab pueden ser fácilmente producidas usando sistemas de expresión sencillas incluyendo eucariotes y procariotes inferiores (Chambers RS . Curr Opin Chem Biol . 2005 (9:46-50). Las moléculas de Fab son también menos inmunogénicas comparadas con anticuerpos enteros y su peso molecular inferior mejora la penetración de tejido.
Un problema en el uso de fragmentos de Fab en medicina se relaciona a la vida media corta en plasma de fragmentos de Fab que es debido a limpieza superior del riñon. Esto puede ser solucionado por administración local de la molécula de Fab al sitio tumoral . Para aplicaciones terapéuticas que requieren suministro sistémico y tratamiento prolongado, son necesarias acciones que tienen el propósito de incrementar la vida media del Fab. Con el fin de obtener una vida media de Fab incrementada, se ha realizado una forma estabilizada de Fab obtenida por conjugación con una molécula estabilizante (que no modifica las propiedades de enlace del antígeno del fragmento de Fab) .
Aunque la pegilación es la técnica más consolidada (Chapman AP. Adv Drug Deliv re 2002 54:531-545.), la pegilación no es la única posibilidad para implementar la estabilidad de las proteínas terapéuticas.
Alternativamente a la modificación química, las moléculas de Fab recombinantes pueden ser modificadas en el nivel de secuencia de nucleótidos primaria para incorporar secuencias que codifican péptidos o dominios capaces de enlazar con alta afinidad la albúmina sérica (Dennis MS, et al., J. Biol. Chem 2002 277:35035-35043; Stork R et al. Protein Eng Des Sel 2007 20:569-576) o puede ser generado como una molécula quimérica en la cual una de la cadena que codifica el Fab es fusionada en cuadro con una secuencia que codifica una proteína inactiva biológicamente (por ejemplo albúmina sérica (Subramanian GM, et al. Nat Biotechnol . 2007 25:1411-1419)). Polietilenglicol , dominio de enlace de albúina, albúmina o cualquier otra secuencia que no modifica las propiedades de enlace de antígeno del fragmento Fab pueden ser usados como moléculas estabilizantes capaces de incrementar la vida media de plasma in vivo del fragmento de Fab.
El anticuerpo monoclonal anti-cMet DN30 es producido por la línea celular de hibridoma depositada por Advanced Biotechnology Center (ABC) , Interlab Cell Line Collection (ICLC) , S.S. Banca Cellule e Colture en GMP, Largo Rosanna Benzi 10 Genova, Italia con número de acceso ICLC PD 05006.
Los tumores adecuados para administración de un inhibidor de Met con el fin de reducir y/o abrogar la resistencia a radioterapia de acuerdo a la descripción instantánea incluyen i) carcinomas, preferentemente seleccionados entre vejiga, mama, colangiocarcinoma, colorrectal, endometrial, esofageal, gástrico, cabeza y cuello, riñon, hígado, pulmón, nasofaríngeo, ovario, páncreas/bilis, próstata, tiroides, ii) sarcoma de tejido suave, preferentemente seleccionado entre sarcoma de Kaposi, Liomiosarcoma, MFH/fibrosarcoma, iii) sarcoma musculoesquelético , preferentemente seleccionado entre osteosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma sinovial, iv) malignancia hematopoyética, preferentemente seleccionada entre leucemia mielógena aguda, leucemia de células T adulta, leucemia mieloide crónica, linfomas, mieloma múltiple, v) otros neoplasmas seleccionados preferentemente entre tumores cerebrales, melanoma, mesotelioma, tumor de Wilms.
Todos estos tumores presentes, de hecho, una "trayectoria de Met desregulada" , en donde esta expresión significa que estos tumores están caracterizados por una señalización de Met aberrante debido a por lo menos una de i) mutaciones de Met, ii) sobreexpresión de proteína Met, iii) amplificación de gen de Met, iv) niveles elevados de HGF circulante.
Administración de Inhibidores de Met a Pacientes Humanos
Los anticuerpos anti-Met serán administrados a través de los regímenes similares a aquellos adoptados para anticuerpos que objetivan otras tirosina cinasas del receptor implicadas en malignidades humanas (por ejemplo, Trastuzumab, un anticuerpo contra HER-2). Típicamente, el anticuerpo o un derivado o fragmento del mismo es administrado por infusión intravenosa con semanalmente dosis en el intervalo entre 5-10 mg/kg, preferentemente 4-8 mg/kg. Para combinación con la radioterapia, la administración de los anticuerpos anti-Met iniciarán una semana, más preferentemente un día, antes de la irradiación y continuarán hasta una semana, preferentemente hasta 6 a 48 horas, después del final de la radioterapia.
Las secuencias de ADNc que codifican el anticuerpo anti-Met, o derivados o fragmentos de los mismos pueden ser también administrados a pacientes humanos a través de los procedimientos de "terapia de genes" . La secuencia de ADNc es clonada en un vector de transducción de origen viral (lentiviral, retroviral, adenoviral, etc.) y ensamblados en una partícula viral, capaces de objetivar específicamente células asociadas a tumores o tumores, por medio de proteínas de enlace superficial específicas. La preparación de partícula viral es entonces producida en una instalación grado GMP. Esta preparación puede ser ya sea suministrada sistémica o intratumoralmente a través de una o múltiples inyecciones. Los tejidos tumorales transducidos por el vector viral expresaran las proteínas codificadas por las secuencias del anticuerpo anti-Met o derivados o fragmentos de los mismos de esta forma proporcionando un circuito auto- inhibitorio.
En lo siguiente se proporcionan datos experimentales; los experimentos han sido realizados usando anticuerpo monoclonal DN30 y/o derivados y/o fragmentos de los mismos con el fin de proporcionar una descripción detallada de algunas modalidades preferidas sin ningún propósito limitante de la presente invención. Materiales y Métodos
Líneas celulares y ARNsi. Las líneas celulares (A549, MDA-MB-231, LoVo, MDAMB-435S, U-87MG, U-251, PC3 , SF295, DLB1, SK-N-SH) son de ATCC . Para inhibición de ATM cinasa, las células son pre-tratadas por 4 horas antes a la radiación entonces mantenidas en la presencia de CGK733 (10 KM en DMSO) . ARNsi que objetiva RELA (ON- TARGET plus SMART pool L-003533-00 RELA humana, NM_021975, Dharmacon, 100 nM) o ARNsi de control (ON-TARGET más SMART pool, ARNsi no objetivante siCONTROL, Dharmacon) son transfectados temporalmente.
Las secuencias ARNsi son como a continuación.
"SMART pool L-003533-00 RELA Humana NM_021975" es una mezcla 1:1:1:1 de las siguientes secuencias dúplex:
(1) sentido:
GGAUUGAGGAGAAACGUAAUU (SEQ ID No.:l),
antisentido :
5 ' -NUUUCCUACAAGCUCGUGGGUU (SEQ ID No.: 2),
(2) sentido:
CCCACGAGCUUGUAGGAAAUU (SEQ ID No.: 3),
antisentido :
5 ' -NUUUCCUACAAGCUCGUGGGUU (SEQ ID No.: 4),
(3) sentido:
GGCUAUAACUCGCCUAGUGUU (SEQ ID No.: 5),
antisen ido :
5' -NCACUAGGCGAGUUAUAGCCUU (SEQ ID No.: 6),
(4) sentido:
CCACACAACUGAGCCCAUGUU (SEQ ID No.: 7),
antisentido :
5 ' -NCAUGGGCUCAGUUGUGUGGUU (SEQ ID No.: 8).
SMART pool, ARNsi no objetivante siCONTROL (una secuencia dúplex sencilla) :
AUGUAUUGGCCUGUAUUAG (SEQ ID No.: 9).
Producción de anticuerpo DN30 y fragmento Fab de DN30
El anticuerpo monoclonal DN30 es producido como se describe en Prat M. et al., 1998, J. Cell Sci 111:237-247, y depositado por Advanced Biotechnology Center con número de acceso ICLC PD 05006. El fragmento Fab de DN30 es obtenido a través de la digestión con papaína de DN30 y purificación de afinidad (Immunopure Fab Preparation Kit, Pierce) .
La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de DN30 es ilustrada en la Figura 8b e indicada en la SEQ ID NO: 10, la secuencia de nucleótido de cadena pesada de DN30 es ilustrada en la Figura 8a e indicada en la SEQ ID NO; 11.
Las secuencias de aminoácido que corresponden a las regiones CDR de cadena pesada de DN30 son las siguientes: CDR-H1: GYTFTSYW (SEQ ID NO:12), CDR-H2 : INPSSGRT (SEQ ID NO:13); CDR-H3 ; ASRGY (SEQ ID NO: 14). Las secuencias de nucleótidos que corresponden a las regiones CDR de cadena pesada de DN30 son las siguientes:
CDR-H1: GGCTACACCTTCACCAGTTACTGGA
(SEQ ID NO.: 15); CDR-H2 : ATTAATCCTAGCAGCGGTCGTACT (SEQ
ID NO.: 16); CDR-H3 : GCAAGTAGG (SEQ ID NO.: 17).
La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de DN30 es ilustrada en la Figura 9b e indicada en la SEQ ID NO: 18, la secuencia de nucleótido de cadena ligera de DN30 es ilustrada en la Figura 9a e indicada en SEQ ID NO: 19.
Las secuencias de aminoácidos que corresponden a las regiones de CDR de cadena ligera de DN30 son las siguientes: CDR-L1: QSVDYDGGSY (SEQ ID NO:20); CDR-L2 : AAS (SEQ ID NO: 21); CDR-L3; QQSYEDPLT (SEQ ID NO: 22). Las secuencias de nucleótido que corresponden a las regiones de CDR de cadena ligera de DN30 son las siguientes: CDR-L1:
AAAGTGTTGATTATGATGGTGGTAGTTATAT (SEQ ID NO. :23) ; CDR- L2: GCTGCATCC (SEQ ID NO.: 24); CDR-L3 :
CAGCAAAGTTATGAGGATCCGCTCACG (SEQ ID NO. :25) .
Radiación in vitro: Los rayos X son emitidos por un acelerador de partículas lineal (Clínica 600C/D, Varían) que opera en 6 MW.
Western blot . La expresión de proteína es investigada en células cosechadas con suero, confluentes y radiadas . Para fraccionamiento en porciones citoplásmicas y nucleares, las células son lavadas e incubadas en hielo por 10 minutos en "amortiguador A" (HEPES 10 mM, pH 7.9, 10 mM de KC1, 0.1 mM de EDTA, 0.5% de NP-40, 1 mM de ditiotreitol , 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo y un cóctel de inhibidores de proteasa) . Los sobrenadantes, que contienen los extractos citoplásmicos, son separados por centrifugación. Los granulos son resuspendidos en "amortiguador B" (20 mM de HEPES pH 7.0, 400 mM de KC1, 1 mM de EDTA, 1 mM de ditiotreitol, 10% de glicerol, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo y un cóctel de inhibidores de proteasa) y se incuban en 4°C por 1 hora con mezclado vigoroso. Los lisados nucleares resultantes son clarificados por centrifugación de alta velocidad. La cantidad igual de proteínas son resueltas por SDS-PAGE y analizadas por western blot con los siguientes anticuerpos primarios: Met antihumano de ratón (DL21 descrito en Prat et al., Int. J. Cáncer 49, 323-328 (1991)), anti-p65/RelA de ratón y anti-HIF-lcc de ratón (BD Biosciences) , anti-fosfo-Ser276 de conejo y. anticaspasa-3 de conejo (Cell Signaling) , anti-fosfo-Chk2 de conejo (T68, R&D Systems). Anti-actina de cabra (C-ll; Santa Cruz Biotechnology) y anti-lamina B de ratón (Calbiochem) son usados para control de carga de proteína nuclear o citoplásmica igual, respectivamente. Imágenes de blot son capturadas usando un visualizador molecular (GelDoc XR; Bio-Rad Laboratories) . Se realiza el análisis densitométrico con Quantity One 1-D (Bio-Rad Laboratories) . Los Western blots mostrados son representativos de resultados obtenidos en por lo menos tres experimentos independientes .
Northern blot. Las células confluentes son cosechadas en suero por 48 horas y radiadas. Se resuelve el ARN total en 0.8% de gel de agarosa-formaldehído, y se transfiere a membranas de nylon (Amersham) de acuerdo a procedimientos estándar. La sonda MET que contiene la secuencia de codificación entera (No. de acceso de GenBank A J02958) se obtiene del plásmido pCEV- T (ver Michieli et al., Oncogene 18, 5221-5231 (1999)), y etiquetado con [oc-32P]dCTP (Megaprime, Amershara) . Se realiza la hibridización en 42°C por 16 horas en la presencia de 50% de fortnamida. Se lavan las membranas de Nylon dos veces con 2X SSC-0.1% de SDS, y dos veces con 0. IX SSC-0.1% de SDS en 42°C, y se lleva a autoradiografía.
Detección ROS: se evalúa la generación ROS intracelular usando diacetato de 5- (y 6) -carboxi-2'-7'-diclorofluoresceina (carboxi-H2DCFDA, sondas moleculares) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Brevemente, se siembran las células en placas de 96 -pozos negras (3 x 104 células/pozo) 24 horas antes del tratamiento (IR: 10 Gy; H202: 100 µ? como control) . Las células son incubadas en la presencia de carboxi-H2DCFDA (10 µ ) en DMEM libre de rojo fenol por una hora en 37°C. Las células son lavadas, incubadas por 30 minutos adicionales en DMEM libre de rojo fenol sin carboxi-H2DCFDA, y entonces se llevan a radiación. Se mide la generación ROS 15 minutos después de la radiación usando un lector de placa de fluorescencia (?e?= 485 nm, \em-535 nm) (Detector Multimodal DTX 880) .
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP, por sus siglas en inglés) . 4 x 107 células son usadas para 10 ChIP ya sea para células radiadas o de control. Después de la radiación (10 Gy) , se fijan las células en 1% de formaldehído por 15 minutos en temperatura ambiente, y se detiene la reacción con glicina (0.125 M) . Se lavan las células fijas, se recolectan en PBS enfriado en hielo complementado con un cóctel de inhibidores de proteasa y se centrífuga. Se extrae la fracción citoplásmica como anteriormente y se desecha, se granulan los núcleos y se vuelven a suspender en 1 mi de amortiguador SDS-Lysis (1% de SOS, 1 mM de EDTA, 50 mM de Tris-HCl pH 8, y un cóctel de inhibidores de proteasa). Los núcleos son entonces alterados por sonicación, produciendo fragmentos de ADN con un tamaño a granel de 400-1000 pb. Se enjuagan los residuos celulares por centrifugación en 14,000 rpm por 10 minutos en 4°C. Los sobrenadantes que contienen la preparación de cromatina son diluidos con amortiguador de dilución 10X (0.01% de SDS, 1.1% de Tritón X-100, 1.2 mM de EDTA, 16.7 mM de Tris-HCl pH 8, 167 mM de NaCl) . La cromatina es entonces preenjuagada por 1 hora en 4°C por agregar proteína G-sepharose (Amersham, 50% de suspensión en gel complementada con 0.2 mg/ml de ADN de esperma de salmón, 0.1% de BSA y 0.05% de NaN3) . Las perlas son granuladas por una breve centrifugación en 4000 rpm en 4°C y se recolectan los sobrenadantes. 3% de preparación de cromatina es usada como entrada para la normalización ChIP. Se realiza ChIP durante la noche en 4°C con 4 g de anticuerpos (anti-p65/RelA, Santa Cruz; IgG de ratón total, Chemicon) , seguido por incubación con 50 µ? de perlas de proteína G-sepharose por 3 horas. Las perlas son lavadas secuencialmente en una plataforma de rotación en 4°C con las siguientes soluciones (10 min/cada una) : dos veces con amortiguador bajo en sal (0.1% de SDS, 1% de Tritón X-100, 2 mM de EDTA, 20 mM de Tris-HCl pH 8, 150 mM de NaCl) , dos veces con amortiguador alto en sal (0.1% de SDS, 1% de Tritón X-100, 2 mM de EDTA, 20 mM de Tris-HCl pH 8, 500 mM de NaCl), una vez con amortiguador LiCl (0.25 M de LiCl, 1% de ácido deoxicólico, 0.5% de NP-40, 1 mM de EDTA, 10 mM de Tris-HCl, pH 8) , y dos veces con TE (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM de EDTA) . Se eluyen los ChIP dos veces en EB (1% de SDS, 0.1 M de NaHC03) y se mantienen durante la noche en 65 °C para reticulación inversa con formaldehído . Se realiza el tratamiento con RNasa (50 µg/ml, 37°C por 30 minutos) y
proteinasa-K (500 µg/ml, 45°C por 2 horas) . Cada muestra es purificada por extracción de fenol/cloroformo y finalmente se vuelve a suspender en 40 µ? de agua estéril. 2 µ? de cada muestra se usa como plantilla para PCR de tiempo real con mezcla maestra SYBR GREEN PCR (Applied Biosystems) en sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems) .
Los cebadores usados son como a continuación:
- NFKBIA (fw: GAACCCCAGCTCAGGGTTTAG - SEQ ID No.: 26; rev: GGGAATTTCCAAGCCAGTCA - SEQ ID No.: 27);
- KB1 (fw: AGGCCCAGTGCCTTATTACCA - SEQ ID No.: 28; rev:
GCGGCCTGACTGGAGATTT - SEQ ID No.: 29);
- tB2 (fw: GGGACTCAGTTTCTTTACCTGCAA - SEQ ID No.:30;
rev: GGGACTCAGTTTCTTTACCTGCAA - SEQ ID No.: 31).
(Fw) hacia delante
rev : inverso
Ensayo de curación de heridas. Se hacen crecer las células para confluir en placas de 24 pozos, se cosechan por 24 horas, y se rasgan con una punta de plástico. Se reemplaza el medio de cultivo con medio fresco, que contiene 1% de FBS y el vehículo solo (DMSO) , y se aplica radiación inmediatamente. Después de 24 horas, se fijan las células con 11% de glutaraldehído (Sigma) , y se tiñen con cristal violeta. Las imágenes son adquiridas con una fotocámara Leica (Leica DFC320, Leica) conectada con un microscopio de luz invertida (DM IRB, Leica) . Las imágenes son representativas de resultados obtenidos en por lo menos tres experimentos independientes.
Ensayo transpozo. Se mide la invasión celular en cámaras Transwell™ (BD Falcon) . Se siembran células MDA-MB-231 y MDA-MB435S ( 5xl05/transwell ) en los lados superiores del filtro recubiertos con 20 µg/cm2 de membrana basamental Matrigel reconstituida (Collaborative Research) . U-251 (104/transwell) se siembra en filtros recubiertos con 50 µg/cm2. El medio de cultivo complementado con 1% de FBS se agrega a ambas cámaras. 1 hora después de la siembra, se aplica radiación a las células (10 Gy) y se incuban en 37 °C por 24 horas. Las células en el lado superior del filtro son removidas mecánicamente y aquellas que migran en el lado inferior son fijadas, teñidas y fotografiadas como anteriormente. Para cuantificación de invasión celular, diez campos por condición experimental son seleccionados aleatoriamente y micrografiados como anteriormente con un objetivo 10X. Se realiza el análisis morfométrico usando software MetaMorph 7.1. Las imágenes son representativas de por lo menos tres experimentos independientes.
Ensayo de Morfogénesis de Ramificación Se preforman los esferoides MDA-MB-435S por resuspensión de célula simple en 240 mg/ml de metilcelulosa (Sigma) y cultivo en placas de 96 pozos no adherentes (Greiner) por 24 horas. Se transfieren los esferoides en una matriz que contiene 1.3 mg/ml de colágeno tipo I a partir de cola de rata (BD Biosciences) , 10% de FBS y 240 mg/ml de metilcelulosa. Después de 24 horas, se llevan a radiación las células y/o cultivan en la presencia de HGF por 7 días. Se obtiene HGF comó una proteína recombinante de baculovirus en células SF9. El medio acondicionado a partir de células no infectadas es usado como control negativo. Las imágenes son representativas de resultados obtenidos en tres experimentos independientes .
Ensayo de Viabilidad Celular con Fab de DN30.
103 células son sembradas en placas de 96 pozos y se hacen crecer por 24 horas. Se reemplaza el medio de cultivo con medio que contiene 1% de FBS y Fab de DN30 (28 µ9/p?1) o el vehículo solo (PBS) . Después de 24 horas, se llevan a radiación las células (10 Gy) . Se evalúa la viabilidad celular como anteriormente.
Resultados
IR Induce Transcripción de MET
En la presente invención se ha mostrado previamente que el proto-oncogen de MET es regulado transcripcionalmente por señales específicas extra e intracelulares , incluyendo factores de crecimiento y el detector de oxígeno. Aquí es investigada la modulación de expresión de Met por exposición a dosis terapéuticas de IR (hasta 10 Gy) .
En diez líneas celulares derivadas de tejidos neoplásticos de diferentes tipos histológicos (carcinomas de mama, pulmón, próstata y colon; melanoma; glioblastoma; neuroblastoma) , se ha encontrado que el nivel de proteína de Met es incrementado significativamente 24 horas después de la radiación. En las líneas celulares representativas (como MDA-MB-435S y MDA-MB-231) , experimentos de curso de tiempo detallado revelan un perfil bifásico de acumulación de proteína Met. Esto es caracterizado por un pico temprano de inducción de Met (~cinco veces) alrededor de 1-2 horas, seguido por un pico tardío similar o una meseta, que aparece en 6 horas, y que disminuye 24 horas después de la radiación (Figura la) . Experimentos de respuesta a dosis muestran que la inducción por Met inicia después de 1 Gy y alcanza una meseta en 5 Gy (Figura Ib) . En células sometidas a radiación, la acumulación de mRNA de MET, y activación del promotor de MET de longitud completa son también observadas (Figura lc-ld) , lo que indica que la sobreexpresion de MET inducida por IR implica un mecanismo transcripcional . En forma interesante, en MDA-MB-231, una autofosforilación de Met independiente a ligando y temporal es también detectada, que ocurre dentro de 10 minutos después de la exposición a IR, (Figura 6) . La intensidad de fosforilación de Met inducida por IR es comparable a aquella producida por una concentración no saturada de HGF (50 ng/ml) . Sin embargo, las cinéticas de fosforilación son diferentes, como el pico inducido por IR es alcanzado después de 10 minutos, mientras que el pico inducido por HGF es alcanzado después de 30 minutos . La estimulación concomitante por IR y HGF no es sinergística (Figura 6) .
Transcripción de MET inducida por IR requiere NF- B. ES conocido que IR modula unos cuantos factores de transcripción incluyendo NF-??. Por consiguiente, el perfil de expresión amplia de genoma muestra que, en las líneas celulares examinadas, IR induce una respuesta de NF-KB temprana prominente. Por ejemplo, en MDA-MB-231, 9 de los 33 genes modulados 1 hora después de la radiación son objetivos de NF-??, exhibiendo una frecuencia de ~20 veces superior al esperado. Por otra parte, en experimentos de curso de tiempo con MDA-MB-231, MDA-MB-435S o células U-251, IR (10 Gy) induce acumulación nuclear rápida (dentro de 30 minutos) y persistente (hasta 24 horas) de la subunidad NF- ? p65/RelA, una marca de activación de NF-?? (Figura 2a) . Por otra parte, en puntos de tiempo tempranos después de la radiación, se fosforila temporalmente p65/RelA nuclear en Ser276 (Figura 2a) . Esta fosforilación es conocida para ser inducida por especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) por medio de la proteína cinasa A, y para promover la interacción p65/RelA con el activador transcripcional CBP/p300, lo cual es requerido para sobreregulación de un subgrupo de genes objetivos tempranos. Estos datos indican que IR promueve la activación funcional de NF- ?, a través de la acumulación nuclear y fosforilación temporal temprana de la subunidad p65/RelA.
En el promotor humano de MET, dos sitios de enlace NF- ? putativos, KBI, ubicado en -1349/ -1340 pb, y <B2, ubicado en -1149/-1136 pb, con respecto al sitio de inicio de transcripción de la secuencia (No. de acceso GenBank AF046925) son identificados a través del análisis in silico. En forma interesante, el sitio ??2 es altamente conservado en el promotor de Met de ratón (Figura 7; secuencia promotora de met de ratón (mus musculus) indicada en la SEQ ID NO: 32 y secuencia promotora de met humana (homo sapiens) indicada en la SEQ ID NO: 33). Los experimentos de inmunoprecipitación de cromatina muestran que la asociación de p65/RelA a cualquier sitio es incrementada significativamente en células expuestas a 10 Gy (Figura 2b) , lo que indica que MET es controlada transcripcionalmente por NF- ? en células sometidas a radiación. Estos descubrimientos son el motivo para investigar en la presente si NF-?? es un requerimiento absoluto para inducción de MET por IR. En cuanto p65/RelA es implicado en la formación de cada uno de los varios heterodímeros NF- ?, de esta forma es crítico para la actividad transcripción accionada por NF- ? total, la expresión de p65/RelA es abrogada a través de la interferencia de ARN. En MDA-MB-231 o MDA-MB435S tratada con ARNsi contra p65/RelA (SMART pool L-003533-00 Human RELA, SEQ ID NO:l a 8), IR no puede inducir más la actividad del promotor de MET de longitud completa (Figura 2c) , ni la acumulación de la proteína Met. Tomados en conjunto, estos datos proporcionan evidencia convincente que la sobreregulación de MET inducida por IR requiere activación del factor de transcripción NF-??.
La implicación del factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1) en transcripción de MET inducida por IR es también considerada, ya que (a) HIF-1 es mostrado para ser activado en células sometidas aradiación como un resultado de formación de ROS, y (b) HIF-1 es un regulador prominente de la expresión de MET . Sin embargo, la relevancia de HIF-1 es mínima, como se muestra por procedimientos complementarios. Primero, en MDA-MB-231 y MDA-MB-435S, IR no induce translocación nuclear de la subunidad HIF-?a, la cual es la marca de la activación de HIF-1, de otra forma observada cuando las células son cultivadas en baja concentración de oxígeno (Figura 2a) . La carencia de activación de HIF-1 no es debido a la débil producción de ROS en células sometidas a radiación, ya que ROS se incrementa por 25 + 3.5% en promedio, 15 minutos después de la exposición a 10 Gy. Esto es estimado para corresponder a un promedio de 80% de inducción de ROS 2-5 minutos después de la radiación, por consiguiente a las observaciones previas en líneas celulares expuestas a 1-10 Gy. Por otra parte, se ha encontrado que IR no puede activar el así llamado promotor de MET "mínimo" que incluye los dos elementos responsables de hipoxia funcionales (HRE, por sus siglas en inglés) y el sitio Ap-1, los cuales son responsables para sobreregulación de MET inducida por hipoxia. Tomados en conjunto, estos datos indican que HIF-1 no está implicado en sobreregulación de MET por IR. Sin embargo, se ha observado que la hipoxia induce translocación nuclear p65/RelA y fosforilación de serina (Figura 2a) .
Finalmente, la implicación del factor de transcripción p53, un objetivo de IR prominente, es regulado también. De hecho, MDA-MB-435S y MDA-MB-231 (dos líneas celulares que exhiben la inducción de MET más alta por IR) cosechan mutaciones inactivantes de p53 (G266E y R280K, respectivamente) . Por otra parte, a diferencia del promotor de ratón, el promotor de MET humano no es sobreregulado por formas activas constitutivamente de p53.
Expresión de Met inducida por IR es mediada por activación de ATM cinasa.
NF-?? es un cruce de varias trayectorias iniciadas tanto por señales extracelulares e intracelulares . Lo último incluye aquellas producidas por proteína cinasa ATM que sigue a la detección del daño de ADN. Para investiga si la inducción de Met por IR recae en la activación de la ATM cinasa, se tratan MDA-MB-435S o MDA-MB-231 con 10 µ? del inhibidor de molécula pequeña específica CGK733. En experimentos de curso de tiempo, CGK733 evita la fosforilación inducida por IR del substrato de ATM específico Chk2, así como también translocación nuclear p65/RelA y sobreexpresión de proteína de Met. Estos datos indican que ATM cinasa es requerida para sobreregulación de MET inducida por IR (Figura 3) .
Crecimiento Invasivo inducido por IR requiere MET
La sobreexpresión de Met no implica activación de 6
cinasa en la ausencia del ligando extracelular HGF. Sin embargo, implica un incremento significativo en actividad de señalización dependiente a ligando (es decir sensibilización) . Esto ha sido observado en células donde la hipoxia sobreregula la expresión de Met a un nivel comparable a, o menor a aquel inducido por radiación.
En la presente invención se investiga de esta forma si la sobreexpresion de Met inducida por IR puede producir o potenciar las respuestas biológicas dependientes a Met. Estos incluyen los lados fisiológicos y patológicos de crecimiento invasivo. En ensayo de curación de heridas, evaluar la capacidad de la célula para regenerar tejidos dañados (es decir, crecimiento invasivo fisiológico) , MDA-MB-231 irradiado, así como también MDA-MB-435S, realiza espontáneamente el programa de curación, por desunir del borde de la herida, y migrar a través del área desgarrada. Esta respuesta, monitoreada por 24 horas, es traslapada con aquella estimulada por HGF, lo cual es también conocido como "factor de rasguño" ya que promueve la disociación celular y motilidad. Sin embargo, la respuesta de curación producida por IR no es debido a la inducción de un circuito autocrino de HGF, ya que células sometidas a radiación no expresan HGF como se evalúa por PCR cuantitativo. En la presente invención se concluye que la sobreexpresion de Met inducida por IR sensibiliza células a una cantidad pequeña de HGF presente en el medio de cultivo, lo cual es suministrado con 1% de suero. Esta condición similarmente imita la presencia fisiológica de HGF in vivo, la cual es embebida en forma ubicua en matrices extracelulares .
Las células irradiadas son entonces evaluadas en ensayos transwell, midiendo la capacidad para traspasar una membrana basal artificial in vitro, lo cual se correlaciona fuertemente con invasividad in vivo, es decir crecimiento invasivo maligno. En efecto, células sometidas a radiación (como MDA-MB-231, MDA-MB-435S o U-251) cruzan espontáneamente la membrana basal transpozo en la presencia de una baja concentración sérica (1%) (Figura 4a) , otra vez imitando el comportamiento evocado por HGF.
Ir Cambia la Morfogénesis Inducida por Met en un Proceso
Invasivo
La morfogénesis de ramificación es un proceso fisiológico complejo, inducido por HGF como para generar órganos tridimensionales durante el desarrollo. Este programa de multietapas implica migración celular, proliferación y reorganización espacial, terminando con generación de túbulos ramificados huecos alineados por células polarizadas . Algunas de las lineas celulares estudiadas, como MDA-MB-435S, pueden ejecutar totalmente el programa de morfogénesis de ramificación in vitro.
La exposición a IR sensibiliza estas células a una concentración subóptiraa de HGF exógeno (5 nM) que - solo- es incapaz de inducir morfogénesis de ramificación (Figura 4b) . En forma importante, las células sometidas a radiación estimuladas con HGF construyen túbulos con alteraciones estructurales remarcables, como células desacopladas a partir de la superficie abluminal y dispersión en matriz rodeante (Figura 5b) . Este comportamiento es reminiscente del "rasguño tridimensional" descrito como una forma de morfogénesis aberrante que ocurre en respuesta a TNFa. Se' concluye que las dosis terapéuticas de IR puede cambiar la morfogénesis de ramificación fisiológica en un proceso pro-invasivo aberrante .
Inhibición de Met sensibiliza las células a apoptosis
inducida por IR y detención proliferativa Como parte del programa EMT/IG, MET emana señales anti-apoptóticas poderosas a través de activación sostenida de trayectorias en dirección 3' incluyendo PI3-cinasa/AKT. En la presente invención de esta forma se razona que la sobreregulación de Met puede prevenir la muerte celular inducida por radiación, y que, inversamente, la inhibición de Met puede incrementar la eficacia de la radioterapia.
Una disminución de viabilidad celular (hasta 75%) es observada en células irradiadas que son mantenidas en la presencia del fragmento Fab del anticuerpo anti-Met DN30, lo cual es conocido para inducir la regulación descendente de MET, de esta forma inhibiendo la señalización de MET y actividades biológicas (Petrelli et al., PNAS 103: 5090-5, 2006) (Figura 5) .
Estos resultados indican que la actividad de inhibición de Met sensibiliza las células a radioterapia, por incrementar la muerte celular y reducir la capacidad para resumir la proliferación después del tratamiento.
Naturalmente, mientras el principio de la invención permanece similar, los detalles de construcción y las modalidades pueden variar ampliamente con respecto a aquella que ha sido descrita e ilustrada simplemente en la forma de ejemplo, sin alejarse del alcance de la presente invención.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (13)
1. Un inhibidor de Met para uso en el tratamiento de un paciente que sufre de un tumor, caracterizado porque es seleccionado de: i) un anticuerpo monoclonal anti-Met, ii) un anticuerpo modificado genéticamente que contiene las regiones determinantes de complementaridad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-Met, y iii) un fragmento de (i) o (ii) que contiene las regiones determinantes de complementaridad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-Met, o combinaciones de los mismos, en donde el inhibidor de Met es capaz de inducir regulación descendente del receptor codificado por el gen de MET y reduce y/o abroga la resistencia del paciente a radioterapia.
2. La secuencia de nucleótidos que codifica un inhibidor de Met para uso en el tratamiento de un paciente que sufre de un tumor, el inhibidor de Met caracterizado porque es seleccionado de: i) un anticuerpo monoclonal anti-Met, ii) un anticuerpo modificado genéticamente que contiene las regiones determinantes de complementaridad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-Met, y iii) un fragmento de (i) o (ii) que contiene las regiones determinantes de complementaridad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-Met, en donde el inhibidor de Met es capaz de inducir regulación descendente del receptor codificado por el gen de MET y reduce y/o abroga la resistencia del paciente a radioterapia.
3. El inhibidor de Met o secuencia de nucleótidos que codifica un inhibidor de Met de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, el inhibidor de Met caracterizado porque es seleccionado de: i) anticuerpo monoclonal anti-Met de DN30, ii) un anticuerpo modificado genéticamente que contiene las regiones determinantes de complementaridad (CDR) de anticuerpo monoclonal anti-Met DN30, las CDR que tienen las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 12 a 14 y 20 a 22, y iii) un fragmento de (i) o (ii) que contiene las regiones determinantes de complementaridad (CDR) de anticuerpo monoclonal anti-Met de DN30, las CDR que tienen las secuencias de aminoácido indicadas en SEQ ID NO: 12 a 14 y 20 a 22, o combinaciones de los mismos, en donde el anticuerpo monoclonal anti-Met de DN30 es producido por la línea celular de hibridoma ICLC PD 05006.
4. El inhibidor de Met de conformidad con la reivindicación 1 ó 3, caracterizado porque el inhibidor de Met es para administración en la forma de proteína soluble por inyección o infusión.
5. Una secuencia de nucleótido que codifica el inhibidor de Met de conformidad con la reivindicación 2 ó 3 , caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica el inhibidor de Met es para administración por medio de un vector, en donde el vector está en la forma de una partícula.
6. La secuencia de nucleótido que codifica el inhibidor de Met de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el vector es adecuado para objetivar un tumor o células asociadas a tumor.
7. La secuencia de nucleótidos que codifica el inhibidor de Met de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizada porque el vector es para administración sistémica o intra tumoral, preferentemente por inyección.
8. El inhibidor de Met o secuencia de nucleótido que codifica un inhibidor de Met de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el fragmento es un fragmento Fab, preferentemente un fragmento Fab que comprende por lo menos una molécula estabilizante.
9. El inhibidor de Met o secuencia de nucleótido que codifica un inhibidor de Met de conformidad con la reivindicación 8, caracterizados porque por lo menos una molécula estabilizante es seleccionada de polietilenglicol, dominio de enlace de albúmina, albúmina.
10. El inhibidor o secuencia de nucleótido que codifica un inhibidor de Met de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el inhibidor de Met y/o la secuencia de nucleótido que codifica el inhibidor de Met es para administración por lo menos una semana antes de someter al paciente a radioterapia.
11. El inhibidor de Met o secuencia de nucleótido que codifica un inhibidor de Met de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el inhibidor de Met y/o la secuencia de nucleótido que codifica el inhibidor de Met es para administración un día antes de someter el paciente a radioterapia.
12. El inhibidor de Met o secuencia de nucleótido que codifica un inhibidor de Met de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el inhibidor de Met y/o la secuencia de nucleótido que codifica el inhibidor de Met es para administración hasta por lo menos una semana, preferentemente 6 a 48 horas, después del final de la radioterapia .
13. El inhibidor de Met o secuencia de nucleótidos que codifica un inhibidor de Met de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizados porque el tumor es seleccionado entre un carcinoma, un sarcoma musculoesquelético, sarcoma de tejido suave, una malignidad nematopoyética, un tumor cerebral, melanoma, mesotelioma, tumor de Wilms .
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