EA028590B1

EA028590B1 - Ингибиторы мет для повышения эффективности лучевой терапии

Info

Publication number: EA028590B1
Application number: EA201200329A
Authority: EA
Inventors: Карла Боккаччо; Паоло Мария Комольо; Фиорелла Петронцелли; Рита Де Сантис; Сантис Рита Де
Original assignee: Метерезис Транслейшнл Ресерч Са
Priority date: 2011-03-18
Filing date: 2012-03-16
Publication date: 2017-12-29
Also published as: IL218293A0; PT2500036E; PL2500036T3; BR102012006063A2; EP2500036A1; HK1174539A1; IL218293A; JP5671487B2; CN102688491A; ZA201201992B; EA201200329A3; BR102012006063B1; MX2012003084A; CY1115374T1; JP2012196206A; EA201200329A2; HRP20140729T1; SMT201400106B; CA2769991C; KR20120106582A

Abstract

Ингибитор Met и/или нуклеотидная последовательность, кодирующая ингибитор Met для применения при лечении пациентов, страдающих злокачественной опухолью, для снижения и/или отмены устойчивости пациента к лучевой терапии, где ингибитор Met выбран из: i) моноклонального анти-Met антитела, ii) генетически сконструированного антитела, содержащего определяющие комплементарность области (CDR) моноклонального анти-Met антитела, и iii) фрагмента (i) или (ii), содержащего определяющие комплементарность области (CDR) моноклонального анти-Met антитела, или их сочетания.

Description

Настоящее изобретение относится к применению ингибиторов МЕТ для повышения эффективности лучевой терапии у пациентов, страдающих злокачественными опухолями.

Предшествующий уровень техники

Хотя лучевая терапия успешно используется для лечения пациентов со злокачественной опухолью, она может не справиться с искоренением опухоли, которая рецидивирует с более агрессивным фенотипом. Раз за разом выявляют парадоксальный прометастатический эффект ионизирующей радиации (ΙΡ) в классических исследованиях на животных моделях.

Прогрессирование опухоли после лучевой терапии может быть следствием позитивной селекции субпопуляции стволовых опухолевых клеток, которая, по существу, является устойчивой к облучению. Однако убедительные доказательства указывают, что помимо селекции ΙΡ способствует адаптивному фенотипу, направленному на регенерацию ткани, что может обернуться метастатическим поведением. Этот фенотип определяют как ответ стресс-и-восстановление на повреждение ДНК, происходящий как на уровне единичной клетки, так и на тканевом уровне. В отдельных клетках выявление повреждения ДНК вызывает определенные молекулярные механизмы, которые, в основном, управляются осью АТМр53, которая блокирует репликацию и активирует репарацию ДНК. Если повреждение необратимо, нормальная клетка запрограммирована на выполнение апоптоза, или на гибернацию своей пролиферативной активности вследствие старения. Однако, после гибели мутантных клеток, ткани должны восполнить соответствующее количество и паттерн клеток для восстановления исходной структуры и функции. Таким образом, регенерация (или заживление ран), инициированная выжившими клетками, является либо нормальной, либо опухолевой. По наблюдениям ίη νίίτο, этот процесс включает такие шаги, как отслойка от края раны, приобретение фенотипа фибробласта, миграция внутрь поврежденной области и, возможно, пролиферация.

Программу целиком называют эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМТ), терминология, подчеркивающая морфологические особенности. В последнее время эту программу также определяют как инвазивный рост (ΙΟ), словосочетание, которое отражает функциональные аспекты, относящиеся к злокачественной опухоли. В настоящее время является общепризнанным, что ЕМТ/Ю представляет собой физиологическую программу для роста и регенерации ткани, которую узурпируют злокачественные клетки для осуществления инвазии и метастазирования. ЕМТ/Ю активируется в злокачественных клетках (а) время от времени, как результат генетических изменений, поддерживающих клональную селекцию; (Ь) более часто, как результат адаптивного ответа на неблагоприятные условия окружающей среды.

Таким образом, ЕМТ/Ю представляет собой генетическую программу, в конечном счете, регулируемую несколькими особыми факторами транскрипции, и срежиссированную несколькими внеклеточными сигналами. Последние включают в себя рассеивающие факторы, такие как фактор роста гепатоцитов (НОР) и белок, стимулирующий макрофаги (М8Р), которые связываются с рецепторами тирозинкиназы, принадлежащими к семейству Мер

Задача и сущность изобретения

Следовательно, ощущается необходимость в улучшенных решениях для повышения эффективности лучевой терапии у пациентов, страдающих от опухолей.

Задачей настоящего изобретения является создание таких улучшенных решений.

Согласно изобретению, вышеизложенная задача решена благодаря объекту изобретения, конкретно названному в последующей формуле изобретения, которая, как подразумевается, является неотъемлемой частью этого раскрытия.

Вариант осуществления изобретения относится к применению ингибитора Меί для лечения пациента, страдающего опухолью, предпочтительно, опухолью с нарушением регуляции каскада Мер где ингибитор Меί выбран из:

ί) моноклонального анти-Меί антитела, ίί) генетически сконструированного антитела, содержащего определяющие комплементарность области (СЭР.) моноклонального анти-Меί антитела, и ίίί) фрагмента (ί) или (ίί), содержащего определяющие комплементарность области (СЭР) моноклонального анти-Меί антитела, или их сочетания, где ингибитор Меί способен индуцировать понижающую регуляцию рецептора, кодируемого геном МЕТ, и уменьшать и/или отменять устойчивость пациента к лучевой терапии.

В предпочтительном варианте осуществления моноклональное анти-Меί антитело представляет собой моноклональное анти-Меί антитело ΌΝ30, которое вырабатывается гибридомной клеточной линией ЮЬС ΡΌ 05006.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления определяющие комплементарность области (СЭР), содержащиеся в: а) генетически сконструированном антителе или Ь) фрагментах моноклонального анти-Меί антитела или генетически сконструированного антитела, представляют собой СЭР моноклонального анти-Меί антитела ΌΝ30, чьи аминокислотные последовательности представлены в ЗЕО ΙΌ ΝΟ: с 12 до 14 и с 20 до 22.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к нуклеотидной последователь- 1 028590 ности, кодирующей ингибитор Ме!, для применения в лечении (например, посредством генной терапии) пациента, страдающего опухолью, предпочтительно опухолью с нарушением регуляции каскада Ме!, где указанный ингибитор Ме! выбран из:

ί) моноклонального анти-Ме! антитела, ίί) генетически сконструированного антитела, содержащего определяющие комплементарность области (СГОК) моноклонального анти-Ме! антитела, и ίίί) фрагмента (ί) или (ίί), содержащего определяющие комплементарность области (СОК) моноклонального анти-Ме! антитела, или их сочетания, где ингибитор Ме! способен индуцировать понижающую регуляцию рецептора, кодируемого геном МЕТ, и уменьшать и/или отменять устойчивость пациента к лучевой терапии.

В предпочтительном варианте осуществления моноклональное анти-Ме! антитело представляет собой моноклональное анти-Ме! антитело ΌΝ30, которое вырабатывается гибридомной клеточной линией 1СЬС ΡΌ 05006.

В предпочтительном варианте осуществления определяющие комплементарность области (СОК), содержащиеся в нуклеотидных последовательностях, кодирующих: а) генетически сконструированное антитело или Ь) фрагменты моноклонального анти-Ме! антитела или генетически сконструированного антитела, представляют собой СОК моноклонального анти-Ме! антитела ΌΝ30, чьи аминокислотные последовательности представлены в 5>Еф ГО ΝΟ: с 12 до 14 и с 20 до 22.

Согласно предпочтительному варианту осуществления ингибитор Ме! предназначен для введения ί) в форме растворимого белка путем инъекции или инфузии или ίί) при помощи вектора для системного или внутриопухолевого введения.

Согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления ингибитор Ме! существует в форме РаЬ-фрагмента, необязательно конъюгированного, по меньшей мере, с одной стабилизирующей молекулой, где стабилизирующая молекула выбрана из полиэтиленгликоля, альбуминсвязывающего домена, альбумина.

Настоящее описание раскрывает, что облучение активирует экспрессию МЕТ (онкогена, как известно, управляющего инвазивным ростом злокачественной опухоли), который, в свою очередь, способствует инвазии клеток и защищает клетки от апоптоза, индуцированного радиацией. Таким образом, отмена экспрессии МЕТ или ингибирование его киназной активности при помощи определенных соединений, т. е. специфических ингибиторов Ме!, способствует апоптозу и противодействует инвазивности, индуцированной радиацией, таким образом, улучшая эффективность лучевой терапии.

Краткое описание чертежей

Далее будет описано изобретение, только в качестве примера, со ссылкой на прилагаемые чертежи, где

Фиг. 1: ΙΚ индуцирует транскрипцию МЕТ.

1а - белок Ме! в МЭА-МВ-435§ в указанных временных точках после облучения (10 Гр). С1г1, Ме! в нулевой момент времени;

1Ь - белок Ме! в МЭА-МВ-435§ через 12 ч после облучения (1-10 Гр);

1с - транскрипт МЕТ в МЭА-МВ-435§ в указанных временных точках после облучения (10 Гр);

- активность люциферазы под управлением промотора МЕТ (базовая конструкция без промотора) в МОА-МВ-231 в указанных временных точках после облучения (10 Гр; С1г1, необлученные клетки). Столбики: среднее трехкратного анализа в двух независимых экспериментах ± в.е.ш. (*р<0,05, п=6, парный !-тест). а.и., относительные единицы.

Фиг. 2: Для транскрипции МЕТ, индуцированной ΙΚ, необходим ΝΕ-кВ.

2а - накопление белка в ядре в МОА-МВ-435§, исследованное в указанных временных точках после облучения (10 Гр) или после 24 ч культивирования при гипоксии (1% О₂). С!г1, необлученные клетки в нулевой момент времени;

2Ь - иммунопреципитация хроматина в облученных МОА-МВ-231 (10 Гр; С!г1, необлученные клетки). Столбики показывают соотношение между анти-р65/Ке1А и неспецифической иммунопреципитации 1§С каждой последовательности, связывающей ΝΕ-кВ (кВ1 или кВ2) в промоторе МЕТ (среднее ± в.е.ш. трехкратного анализа). Промотор ΝΕΚΕΙΛ (1кВ а) применяли в качестве положительного контроля;

2с - активность промотора МЕГ в МЭА-МВ-231 с подавленной экспрессией р65/Ке1А (вЖЕЬА; 51СТКЬ, контроль) и облученных (10 Гр; С!г1, необлученные клетки). Столбики показывают соотношение между экспрессией люциферазы под контролем промотора МЕТ и без промотора (базовая) (среднее трехкратного анализа в трех независимых экспериментах ± в.е.ш). Врезка: белок р65/Ке1А после трансфекции миРНК;

- накопление белка Ме! в МОА-МВ-4358 с подавленной экспрессией р65/Ке1А (вьКЕЬА; вЮТКЬ, контроль), в указанных временных точках после облучения (е!г1, необлученные клетки в нулевой момент времени).

Фиг. 3: Для экспрессии МЕТ, индуцированной ΙΚ, необходима активация киназы АТМ.

Экспрессия белка Ме!, фосфорилирование СЬк2 (р-СЬк2) и ядерная транслокация р65/Ке1А в МОА- 2 028590

МВ-4353, обработанных ингибитором киназы АТМ СОК733 и выделенных в указанных временных точках после облучения, с!г1. необлученные клетки в нулевой момент времени.

Фиг. 4: Для инвазивного роста. индуцированного ΙΚ. необходим Ме!.

4а - инвазия в базальную мембрану облученных МОА-МВ-231 или И-251 (10 Гр; с!г1. контроль). Микрофотографии фильтров Тгап5\уе11 (10Х);

4Ь - нарушение разветвленного морфогенеза. индуцированного Ме!. в облученных МОА-МВ-4 353 (10 Гр; с!г1. контроль). культивированных в присутствии указанных концентраций НОР или без НОР (-). Деление шкалы: 100 мкм.

Фиг. 5: Ингибирование Ме! повышает чувствительность клеток к апоптозу. индуцированному ΙΚ. и к аресту пролиферации.

Жизнеспособность И-251. облученных 10 Гр и/или культивированных в присутствии РаЬ-фрагмента антитела ΌΝ30 к Ме! в течение 48 ч (носитель: необлученные клетки). Столбики: среднее трехкратного анализа в трех независимых экспериментах ± 8.е.ш. (*р<0.05. жизнеспособность достоверно снижена по сравнению с РаЬ-Э№0 или 10 Гр по отдельности. п=9. парный !-тест). Столбики: процент клеток. генерирующих клоны (среднее трехкратного анализа в двух независимых экспериментах ± 8.е.т.. *р<0.05. п=6. парный !-тест).

Фиг. 6: ΙΚ индуцирует фосфорилирование Ме!.

Фосфорилирование Ме! в МОА-МВ-231. обработанных НОР (50 нМ) и/или ΙΚ·(10 Гр). Клетки подвергали иммунопреципитации с антителами к Ме! в указанных временных точках и анализировали при помощи вестерн-блоттинга с антителами к фосфо-Туг (р-Туг). Ме! показан в качестве контроля белковой иммунопреципитации. с!г1. клетки. обработанные отрицательным контролем НОР (см. Способы)

Фиг. 7: Выравнивание промоторов МЕТ человека и мыши.

Промотор МЕТ человека (ОепВапк. номер доступа: АР046925) анализировали при помощи программного обеспечения ТВАЖРАС 7.0 (ВюЬаке Вю1ощса1 Иа!аЬа8е ОтЬк. АоИспЬиНек Оегтапу) для выявления участков связывания факторов транскрипции. Были обнаружены два предполагаемых участка связывания ΝΕ-кВ (кВ1 и кВ2). Выравнивание промоторов МЕТ человека и мыши (Ген ГО: 17295) показало. что сайт кВ2 (-1149/-1136 в последовательности человека. прямоугольник) является высококонсервативным у двух видов.

Фиг. 8: Последовательность нуклеиновой кислоты (а) и аминокислотная (Ь) последовательность тяжелой цепи моноклонального антитела ΌΝ30. Области СИК подчеркнуты как в нуклеотидной. так и в аминокислотной последовательности.

Фиг. 9: Последовательность нуклеиновой кислоты (а) и аминокислотная (Ь) последовательность легкой цепи моноклонального антитела ΌΝ30. Области СОК подчеркнуты как в нуклеотидной. так и в аминокислотной последовательности.

Подробное описание вариантов осуществления изобретения

Настоящее изобретение далее будет описано подробно в соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами осуществления посредством неограничивающих примеров.

В последующем описании многочисленные конкретные детали приведены для того. чтобы обеспечить глубокое понимание вариантов осуществления. Варианты осуществления можно осуществлять практически без одной или нескольких специфических деталей. или при помощи других способов. компонентов. материалов и т.д. В других случаях. хорошо известные устройства. материалы. или процессы не показаны. или описаны подробно для того чтобы избежать неясности в аспектах вариантов осуществления.

Заголовки в настоящем документе приведены только для удобства и не разъясняют сущность или смысл вариантов осуществления.

Помимо повреждения внутриклеточных мишеней (главным образом. за счет генерации активных форм кислорода) ионизирующая радиация регулирует активность регуляторных молекул. которые контролируют биологический ответ стресс и восстановление.

Положительная регуляция транскрипции онкогена МЕТ выступает важным событием в этом ответе. приводя к выполнению программы. направленной на выживание и регенерацию. которая противодействует повреждению. индуцированному радиацией. Это описание демонстрирует. что положительная регуляция МЕТ. индуцированная ΙΚ. управляется посредством сигнального пути. который запускает протеинкиназа АТМ вслед за выявлением повреждений ДНК. Этот каскад включает в себя перенос АТМ киназы АТМ в ядро и высвобождение фактора транскрипции ΝΕ-кВ из ингибирования. Примечательно. известно. что активация NР-кВ при повреждении ДНК играет ключевую роль в защитном ответе против радиации. поскольку ΝΕ-кВ является известным регулятором противоапоптотических генов. Предполагают. что выживание клетки. которому способствует ΝΕ-кВ. является настолько эффективным. что индуцирует адаптивную устойчивость злокачественных клеток к лучевой терапии. Авторы настоящего изобретения теперь демонстрируют. что адаптивный ответ на радиацию. поддерживаемый ИР-КВ. обязательно включает проонкоген МЕТ.

Индукция МЕТ посредством ΙΚ представляет собой двухфазное транскрипционное событие. опо- 3 028590 средованное связыванием ΝΕ-кВ с двумя специфическими элементами ответа кВ, расположенными в промоторе МЕТ. Ранний транскрипционный ответ, происходящий в пределах 1-2 часов после облучения, вероятно, зависит от активации ΝΕ-кВ посредством внутреннего каскада, который управляется АТМ, чувствительной к повреждению ДНК. Предположительно, сверхэкспрессии Ме1, индуцированной ΙΡ, самой по себе достаточно, чтобы вызвать трансдукцию сигнала в присутствии физиологических концентраций вездесущего лиганда НОТ, как было показано в случае сверхэкспрессии Ме1, индуцированной гипоксией. Поздняя и продолжительная положительная регуляция МЕТ - продолжающаяся более 24 ч вероятно, также поддерживается несколькими сигнальными путями, сходящимися к ΝΕ-кВ. Действительно, облучение способствует экспрессии цитокинов, в том числе, ΤΝΕ- а, ГБ-1 и 1Ь-10, которые, с одной стороны, являются мишенями ΝΕ-кВ, и, с другой стороны, стимулируют транскрипционную активность ΝΕ-кВ. Авторы настоящего изобретения считают, что в живых тканях излучение индуцирует аутокринные/паракринные петли, отражающиеся на ΝΕ-кВ, что приводит к распространению волн сигналов выживания на всем протяжении поврежденной ткани.

Примечательно, известно, что транскрипционный ответ на ΝΕ-кВ включает в себя, в дополнение к генам выживания, молекулы, ответственные за ЕМТ/ΙΟ. Совместное выполнение генетических программ выживания и ЕМТ/ΙΟ действует как обоюдоострый меч: в нормальных тканях эти программы приводят к выживанию и регенерации; в злокачественных клетках, они способствуют переходу к злокачественному новообразованию.

Проонкоген МЕТ соответствует критериям для ключевой мишени ΝΕ-кВ, необходимым для управления как светлой, так и темной стороной ответов «стресс и восстановление». Как показано в данном раскрытии, с одной стороны, сверхэкспрессия Ме1, индуцированная ΙΡ, позволяет клеткам залечить поврежденные монослои. С другой стороны, ΙΡ стимулирует клетки к пересечению базальных мембран, типичный признак злокачественных опухолей. Еще более поразительно, сообщают, что ΙΡ обращает физиологический процесс разветвленного морфогенеза, индуцированного Ме1, в неорганизованное распространение клеток на всем протяжении трехмерного матрикса. Во всех случаях, хотя несколько геновмишеней для ΝΕ-кВ экспрессируются в облученных клетках, авторы настоящего изобретения демонстрируют путем нокдауна МЕТ или функционального ингибирования, что Ме! необходим как для физиологического инвазивного роста (заживление ран), так. и для злокачественного инвазивного роста (инвазивность). Подтвержденная агрессивность опухолей, рецидивирующих после облучения, таким образом, может включать в себя активацию программы ЕМТ/ΙΟ под жестким контролем онкогена МЕТ.

Наблюдение, которое дает основание полагать, что Ме! вовлечен в противоапоптотический, регенеративный и инвазивный ответ на ΙΡ, имеет важные терапевтические выводы: комбинация лучевой терапии с ингибированием Ме! делает злокачественные клетки чувствительными к облучению, в то же время, предотвращая параллельные проинвазивные эффекты. Фактически настоящее раскрытие показывает, что ингибирование Ме! значительно ухудшает выживание клеток и клоногенную активность после воздействия терапевтических доз ΙΡ. Более важно то, что экспрессируясь в стволовых клетках и предшественниках некоторых нормальных тканей, МЕТ предположительно экспрессируется также в стволовых клетках злокачественной опухоли, которые часто образуются путем прямой трансформации нормальных стволовых клеток или пролиферирующих предшественников. Экспрессия и активация Ме!, индуцированная ΙΡ, поддерживает устойчивость к облучению и инвазивные свойства у (стволовой) клетки злокачественной опухоли, таким образом, повышая шансы ее позитивной селекции и распространения.

Таким образом, ингибирование Ме! (путем введения ингибитора Ме! в форме растворимого белка или посредством генной терапии, т.е. введения вектора, кодирующего ингибитор Ме!, как будет определено далее) в комбинации с общепринятыми методами лечения, т.е. лучевой терапией, представляет собой дополнительную стратегию уничтожения злокачественной опухоли.

В настоящем описании под выражением ингибитор Ме! имеют в виду моноклональное анти-Ме! антитело, его производные и/или фрагменты, способные индуцировать понижающую регуляцию рецептора, который кодируется геном МЕТ. В предпочтительном варианте осуществления ингибитор Ме! представляет собой моноклональное анти-Ме! антитело ΌΝ30, его производные и/или фрагменты, которые способны индуцировать понижающую регуляцию рецептора, кодирующегося геном МЕТ.

Под выражением производное антитела имеют в виду молекулу, которая содержит определяющие комплементарность области (СЭР) антитела, такую как генетически сконструированное или гуманизированное антитело, которое содержит СЭР антитела или пептид, который содержит СЭР антитела.

Под выражением фрагмент антитела имеют в виду фрагмент выбранный из Εν, δοΕν, ΕαΡ ΕαΡ, Р(аЬ')₂ фрагментов ί) моноклонального анти-Ме! антитела и ίί) генетически сконструированного или гуманизированного антитела, которое содержит определяющие комплементарность области (ОЭР) моноклонального анти-Ме! антитела.

С фармакологической точки зрения использование ΕаЬ-фрагмента имеет как преимущества, так и недостатки. Молекулы ΕаЬ можно легко получать с использованием простых экспрессирующих систем, в том числе низших эукариот и прокариот (СйатЬегк Р§. Сигг Ορίη Сйет Вю1 2005 9:46-50). Молекулы РаЬ к тому же менее иммуногенны по сравнению с целыми антителами, и их низкая молекулярная масса улучшает их проникновение в ткани.

- 4 028590

Проблема применения РаЬ-фрагментов в клинике связана с их коротким периодом полувыведения из плазмы, что обусловлено повышенным почечным клиренсом. Этого можно избежать при помощи местного введения молекулы РаЬ в место локализации опухоли. Для терапевтических применений, которые требуют системного введения и длительного лечения, необходимы действия, направленные на увеличение периода полувыведения РаЬ. Для того чтобы добиться увеличенного полувыведения РаЬ, получили стабилизированную форму РаЬ путем конъюгации со стабилизирующей молекулой (которая не изменяет антиген-связывающие свойства РаЬ-фрагмента).

Хотя пегилирование является наиболее консолидированным способом (СЬартап АР. Α6ν Эгид Эс1ίν Κβν 2002 54:531-545), пегилирование представляет собой не единственную возможность для повышения стабильности терапевтических белков. В качестве альтернативы химической модификации можно модифицировать рекомбинантные молекулы РаЬ на уровне первичной нуклеотидной последовательности, для того чтобы вставить последовательности, кодирующие пептиды или домены, способные с высокой аффинностью связывать сывороточный альбумин (Όβηηίδ Μδ е! а1., 1 ΒίοΙ СЬет 2002 277:3503535043; δΐοτΡ К. е! а1. Рго!еш Епд Эек 8е1 2007 20:569-576) или можно получать их в виде химерной молекулы, в которой одна из цепей, кодирующая РаЬ, слита в рамке считывания с последовательностью, кодирующей биологически неактивный белок (например, сывороточный альбумин ^иЬгаташап СМ, е! а1. Ыа! Вю!есЬпо1 2007 25:1411-1419)). Полиэтиленгликоль, альбуминсвязывающий домен, альбумин или любую другую последовательность, которая не изменяет антиген-связывающие свойства РаЬ-фрагмента, можно использовать в качестве стабилизирующих молекул, способных увеличивать ίη νίνο период полувыведения из плазмы РаЬ-фрагмента.

Моноклональное анти-Ме! антитело ΌΝ30 вырабатывается гибридомной клеточной линией, которая хранится в Абуапсеб Вю!есЬпо1оду Сеп!ег (АВС), 1п!ег1аЬ Се11 Ыпе Со11есЬоп (1СЬС), δ.δ. Вапса Се11и1е е СоЬиге ш СМР, Ьагдо Кокаппа Веп/ί 10, Сеηονа, Иа1у с инвентарным номером 1СЬС ΡΌ 05006.

Опухоли, подходящие для введения ингибитора Ме! для снижения и/или уничтожения устойчивости к лучевой терапии по данному изобретению, включают: ί) карциномы, предпочтительно выбранные из карциномы мочевого пузыря, молочной железы, холангиокарциномы, колоректальной, эндометриальной, карциномы пищевода, желудка, головы и шеи, почки, печени, легкого, носоглоточной, карциномы яичника, поджелудочной железы/желчного пузыря, предстательной железы, щитовидной железы, ίί) саркому мягких тканей, предпочтительно выбранную из саркомы Капоши, лейомиосаркомы, недифференцированной плейоморфной саркомы/фибросаркомы, ίίί) скелетно-мышечную саркому, предпочтительно выбранную из остеосаркомы, рабдомиосаркомы, синовиальной саркомы, ίν) гематопоэтические опухоли, предпочтительно выбранные из острого миелогенного лейкоза, Т-клеточного лейкоза взрослых, хронического миелолейкоза, лимфом, множественной миеломы, ν) другие неоплазии, предпочтительно выбранные из опухолей головного мозга, меланомы, мезотелиомы, опухоли Вильмса.

Все эти опухоли, фактически, демонстрируют нарушение регуляции каскада Ме!, где данное выражение означает, что эти опухоли характеризуются нарушенной передачей сигнала Ме! по меньшей мере из-за одной причины из: ί) мутаций Ме!, ίί) сверхэкспрессии белка Ме!, ίίί) амплификации гена Ме!, ίν) повышенных уровней циркулирующего НСР.

Введение ингибитора Ме! пациентам-людям

Антитела к Ме! вводят посредством схемы лечения, сходной со схемами, которые одобрены для антител, нацеленных на другие рецепторные тирозинкиназы, вовлеченные в злокачественные новообразования у человека (например, Трастузумаб, антитело против НЕК-2). Как правило, антитело или производное или его фрагмент вводят путем внутривенного вливания еженедельных доз в диапазоне 5-10 мг/кг, предпочтительно 4-8 мг/кг. Для комбинации с лучевой терапией, введение антител к Ме! следует начинать за неделю, более предпочтительно, за сутки, перед облучением и продолжать в течение недели, предпочтительно от 6 до 48 ч после окончания лучевой терапии.

Последовательности кДНК, кодирующие антитело к Ме! или его производные или фрагменты можно также вводить пациентам-людям посредством процедур генотерапии. Последовательность кДНК клонируют в трансдуцирующий вектор вирусного происхождения (лентивирусный, ретровирусный, аденовирусный и т.д.) и собирают в вирусную частицу, способную обеспечить специфически направленную доставку в опухоль или клетки, связанные с опухолью, за счет специфических поверхностно связывающих белков. Препарат вирусных частиц затем производят на устройстве уровня СМР. Этот препарат можно вводить или системно или внутрь опухоли посредством одной или нескольких инъекций. Опухолевые ткани, трансдуцированные вирусным вектором, будут экспрессировать белки, которые кодируются последовательностями антитела к Ме! или его производных или фрагментов, таким образом, обеспечивая противоингибиторный цикл.

Далее представлены экспериментальные данные; эксперименты проведены с использованием моноклонального антитела ΌΝ30 и/или его производных и/или его фрагментов для того чтобы предоставить подробное описание некоторых предпочтительных вариантов осуществления без ограничения по настоящему изобретению.

- 5 028590

Материалы и способы

Клеточные линии и миРНК.

Клеточные линии (А549, ΜΌΑ-ΜΒ-231, ЬоУо, ΜΌΑΜΒ-435δ, И-87МО, И-251, РСЗ, δΡ295, ΌΕΌ1, δΚ-Ν-δΗ) были получены из АТСС. Для ингибирования киназы ΑΤΜ клетки были предварительно обработаны в течение 4 ч перед облучением, а затем поддерживались в присутствии СОК733 (10 мкМ в ΌΜδΟ). миРНК, нацеленные на ΚΕΡΑ (ΘΝ-ΤΑΚΟΕΤ р1ц§ δΜΑΚΤ роо1 Ь-003533-00 Нитап ΚΕΡΑ, ΝΜ_021975, ЭПагтасоп. 100 нМ), или контрольные миРНК (ΘΝ-ΤΑΚΟΕΤ р1ц§ δΜΑΚΤ роо1, δίΕΌΝΤΚΘΕ №п Τ;·ΐΓ§οΙίη§ δίΚΝΑ, ЭПагтасоп) были трансфицированы транзиентно.

Последовательности миРНК были следующими. δΜΑΚΤ роо1 Ь-003533-00 Нитап ΚΕΕΑ, ΝΜ_021975 представляла собой смесь 1:1:1:1: следующих двухцепочечных последовательностей:

(1) смысловая цепь: ССΑυυСΑССΑСΑΑΑССυΑΑυυ (δΕΩ ΙΌ ΝΟ:1), антисмысловая: 5'-

NϋϋϋССϋΑСΑΑΟСϋСΟϋΟΟΟϋϋ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2),
(2) смысловая: СССΑСΟΑΟСϋϋΟϋΑΟΟΑΑΑϋϋ	(δΕΩ	ΙΌ	ΝΟ:3),	антисмысловая:	5'-
NϋϋϋССϋΑСΑΑΟСϋСΟϋΟΟΟϋϋ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 4),
(3) смысловая: ΟΟСϋΑϋΑΑСϋСΟССϋΑΟϋΟϋϋ NСΑСϋΑΟΟСΟΑΟϋϋΑϋΑΟССϋϋ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 6),	(δΕΩ	ΙΌ	ΝΟ:5),	антисмысловая:	5'-
(4) смысловая: ССΑСΑСΑΑСϋΟΑΟСССΑϋΟϋϋ NСΑϋΟΟΟСϋСΑΟϋϋΟϋΟϋΟΟϋϋ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 8).	(δΕΩ	ΙΌ	ΝΟ:7),	антисмысловая:	5'-

δΜΑΚΤ роо1, δίΟΌΝΤΡΟΕ №п ΤίΐΓβοΙίπβ δίΚΝΑ (одна отдельная двухцепочечная последовательность):

смысловая: ΑυΟυΑϋυΟΟ^υΟυΑϋυΑΟ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ:9).

Выработка антитела ΌΝ30 и РаЬ-фрагмента РаЬ ΌΝ30. Моноклональное антитело ΌΝ30 получили, как описано в Рга1 Μ. с1 а1., 1998, ί. Се11 δα 111:237-247 и хранили в Αάνаηссά Вю1ссНпо1оду СсШсг под инвентарным номером 1СЬС ΡΌ 05006. ΌΝ30 РаЬ-фрагмент ΌΝ30 получали путем расщепления ΌΝ30 папаином и аффинной очистки (1ттипоригс РаЬ Ргсрагайоп Κίί, Рюгсе). Аминокислотная последовательность тяжелой цепи ΌΝ30 из 25 аминокислот показана на фиг. 8Ь и приведена в δΕΟ ΙΌ ΝΟ:10, нуклеотидная последовательность тяжелой цепи ΌΝ30 показана на фиг. 8а и приведена в δΕΟ ΙΌ ΝΟ:11.

Аминокислотные последовательности, соответствующие СЭР областям тяжелой цепи ΌΝ30, были следующими:

С1Ж-111: ΟΥΤΡΤδΥΑ (δΕΩ ΙΌ ΝΟ:12);

СПЕ-НЗ: ΙΝΡδδΟΚΤ (δΕΩ ΙΌ ΝΟ: 13);

(ΌΕ-11У ΑδΚΟΥ (δΕΩ ΙΌ ΝΟ:14).

Нуклеотидные последовательности, соответствующие СПЕ областям тяжелой цепи ΌΝ30, были следующими:

ΟΏΚ-Η1: ΟΟСΤΑСΑССΤΤСΑССΑΟΤΤΑСΤΟΟΑ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ:15);

СЭЕ-Н2: ΑΤΤΑΑΤССΤΑΟСΑΟСΟΟΤСΟΤΑСΤ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ:16);

СЭЕ-Н3: ΟСΑΑΟΤΑΟΟ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ:17).

Аминокислотная последовательность легкой цепи ΌΝ30 представлена на фиг. 9Ь и приведена в δΕΟ ΙΌ ΝΟ:18, нуклеотидная последовательность легкой цепи ΌΝ30 показана на фиг. 9а и приведена в δΕΟ ΙΌ ΝΟ:19.

Аминокислотные последовательности, соответствующие СПЕ областям легкой цепи ΌΝ30 были следующими:

ССЕ-Е1: φδνΌΥΏΟΟδΥ (δΕΩ ΙΌ ΝΟ: 20);

ССЕ-Е2: ΑΑδ (δΕΩ ΙΌ ΝΟ: 21);

СПЕ-Е3: ΟΟδΥΕΙίΡΕΤ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ:22).

Нуклеотидные последовательности, соответствующие СПЕ областям легкой цепи ΌΝ30 были следующими:

ССЕ-Е1: ΑΑΑΟΤΟΤΤΟΑΤΤΑΤΟΑΤΟΟΤΟΟΤΑΟΤΤΑΤΑΤ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ:23);

СЭЕ-Е2: ΟСΤΟСΑΤСС (δΕΟ ΙΌ ΝΟ:24);

(ΌΙΚ-Ε3 СΑΟСΑΑΑΟΤΤΑΤΟΑΟΟΑΤССΟСΤСΑСΟ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ:25).

Облучение ш νίΙΐΌ.

Рентгеновские лучи испускались линейным ускорителем частиц (С1шас 600С/Э, Vа^^аη), работающем, при 6 Μν.

Вестерн-блоттинг.

Экспрессию белка исследовали в облученных, конфлюэнтных, бессывороточных клетках. Для фракционирования цитоплазматической и ядерной частей, клетки отмывали и инкубировали на льду в течение 10 мин в буфере А (10 мМ ΗΕΡΕδ рН 7,9, 10 мМ КС1, 0,1 мМ ЭДТА, 25 0,5% ΝΡ-40, 1 мМ дитиотрейтола, 1 мМ фенилметилсульфонил фторида и смесь ингибиторов протеаз). Супернатанты, содержащие цитоплазматические экстракты, разделяли посредством центрифугирования. Осадки ресуспендировали в буфере В (20 мМ ΗΕΡΕδ рН 30 7,9, 400 мМ КС1, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотрейтола, 10% глицерина, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида и смесь ингибиторов протеаз) и инкубировали при 4°С в течение 1 ч при интенсивном перемешивании. Полученные ядерные лизаты очищали при помощи высо- 6 028590 коскоростного центрифугирования. Равное количество белков разделяли при помощи ЗИЗ-РАСЕ и анализировали посредством вестерн-блоттинга со следующими первичными антителами: мышиное к Ме! человека (ИЬ21, описанное у Рга! е! а1., 1п!. 1. Сапсег 49, 323-328 (1991)), мышиное анти-р65/Ре1А и мышиное анти-Н1Р-1а (ВИ Вюкшепсек), кроличье анти-фосфо-Зег276 и кроличье к каспазе-3 (Се11 З1дпа1шд), кроличье анти-фосфо-Сйк2 (Т68, Р&И ЗуЛетД. Антитела козы против актина (С-11; Зап!а Сти/ Вю!есйпо1оду) и мыши против ламина В (Са1Ъюсйет) применяли для контроля одинаковой нагрузки цитоплазматическими или ядерными белками соответственно. Изображения блотов получены с помощью молекулярного имиджера (СеГОос ХР; Βίο-Раб ЬаЪога!ог1е8). Денситометрический анализ проводили с использованием ОиапШу Опе 1-И (Вю-Раб ЬаЪога!ог1е8). Представленные вестерн-блоттинги являются типичными результатами, полученными по меньшей мере в трех независимых экспериментах.

Нозерн-блоттинг.

Конфлюэнтные клетки оставляли без сыворотки на 48 ч и облучали. Тотальную РНК разделяли в 0,8% агарозно-формальдегидном геле и переносили на нейлоновые мембраны (Атешйат) по стандартным протоколам. Зонд МЕТ, содержащий полную кодирующую последовательность (СепВапк Ассеккюп

N. 102958), получали из плазмиды рСЕУ-МЕТ (см. МюЫей е! а1., Опсодепе 18, 5221-5231 (1999)) и метили [а-³²Р] бСТР (Медарпте, Атегейат). Гибридизацию проводили при 42°С в течение 16 ч в присутствии 50% формамида. Нейлоновые мембраны отмывали дважды 2Х ЗЗС - 0,1% ЗИЗ и дважды 0,1Х ЗЗС O, 1% ЗИЗ при 42°С и проводили радиоавтографию.

Определение АФК.

Внутриклеточную генерацию АФК оценивали с использованием 5-(и 6)-карбокси-2'-7'-дихлорфлуоресцеиндиацетат(карбокси-Н₂ИСРПА, Мо1еси1аг РтоЪек) согласно инструкциям производителя. В кратком изложении, клетки высевали в черные 96-луночные планшеты (3 х10⁴ клеток/лунку) за 24 ч до обработки (ΙΡ: 10 Гр; Н₂О₂: 100 мкМ в качестве контроля). Клетки инкубировали в присутствии карбокси-ЩИСРИА (10 пМ) в феноловом красном без ИМЕМ в течение 1 ч при 37°С. Клетки отмывали, инкубировали в течение дополнительных 30 мин в феноловом красном без ИМЕМ, без карбокси-НЩСРИА, а затем облучали. Генерацию АФК измеряли через 15 мин после облучения с использованием флуоресцентного спектрофотометра для чтения планшетов ( λ„=485 нм, Х_ет=535 нм) (ЭТХ 880 МиШтобе Ие!ес!ог).

Иммунопреципитация хроматина (СЫР).

Использовали 4 х10⁷ клеток для СЫР облученных или контрольных клеток. После облучения (10 Гр) клетки фиксировали в 1% формальдегиде в течение 15 мин при комнатной температуре и останавливали реакцию глицином (0,125 М). Фиксированные клетки отмывали, собирали в ледяном РВЗ, дополненном смесью ингибиторов протеаз, и центрифугировали. Цитоплазматическую фракцию экстрагировали, как описано выше, и удаляли, ядра осаждали и ресуспендировали в 1 мл лизирующего буфера с ЗИЗ (1% ЗИЗ, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ Трис-НС1, рН 8, и смесь ингибиторов протеаз). Затем ядра разрушали ультразвуком, получая фрагменты ДНК размером 400-1000 п. н. Клеточный дебрис очищали посредством центрифугирования при 14,000 об./мин. в течение 10 мин при 4°С. Супернатанты, содержащие препараты хроматина, разбавляли 10Х разбавляющим буфером (0,01% ЗИЗ, 1,1% Ттйоп Х-100, 1,2 мМ ЭДТА, 16,7 мМ Трис-НС1 рН 8, 167 мМ №С1). Затем предварительно очищали хроматин в течение 1 ч при 4°С путем добавления белка С-сефарозы (Атешйат, 50% гелевая взвесь, дополненная 0,2 мг/мл ДНК спермы лосося, 0,1% ВЗА и 0,05% №». Гранулы осаждали при помощи короткого центрифугирования при 4000 об./мин при 4°С и собирали супернатанты. 3% препарат хроматина применяли в качестве входящего сигнала для нормализации СЫР. СЫР проводили в течение ночи при 4°С с 4 пг антител (антир65/Ре1А, Зап!а Сти/; полноразмерный мышиный 1дС, Сйетюоп), с последующей инкубацией с 50 мкл гранул белка С-сефарозы в течение 3 ч. Гранулы последовательно отмывали на вращающейся платформе при 4°С следующими растворами (10 мин/каждым): дважды низкосолевым буфером (0,1% ЗИЗ, 1% Тритон Х-100, 2 мМ ЭДТА, 20 мМ Трис-НС1 рН 8, 150 мМ №С1), дважды высокосолевым буфером (0,1% ЗИЗ, 1% Тритон Х-100, 2 мМ ЭДТА, 20 мМ Трис-НС1 рН 8, 500 мМ №С1), один раз буфером с ЫС1 (0,25 М ЫС1, 1% дезоксихолевая кислота, 0,5% №-40, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис-НС1 рН 8) и дважды ТЕ (10 мМ Трис-НС1 рН 8, 1 мМ ЭДТА). СЫР элюировали дважды в ЕВ (1% ЗИЗ, 0,1 М NаНСОз) и оставляли в течение ночи при 65°С для разрушения перекрестных сшивок с формальдегидом. Проводили обработку РНКазой (50 пг/мл, 37°С в течение 30 мин) и протеиназой-К (500 пг/мл, 45°С в течение 2 ч). Каждый образец очищали при помощи экстракции фенолом/хлороформом и в завершение ресуспендировали в 40 мкл стерильной воды. 2 мкл каждого образца применяли в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени с ЗУВР СРΕΕN РСР Ма§!ет М1х (Аррйеб ВюууМетД на АВ1 РР1ЗМ 7900НТ Зесщепсе Ие!ес1юп Зу8!ет (Аррйеб ВюууМетД.

Использовали следующие праймеры:

- №КВ1А (прямой: СААССССАССТСАСССТТТАС - ЗЕС ГО N0:26; обратный: СССААТТТССААСССАСТСА - ЗЕС ГО N0:27);

КВ1 (прямой: АСССССАСТСССТТАТТАССА - ЗЕС ГО N0:28; обратный: ССССССТСАСТССАСАТТТ - ЗЕС ГО N0:29);

- 7 028590

КВ2 (прямой: ОООАСТСАОТТТСТТТАССТОСАА - 8Еф ΙΌ N0:30; обратный: ОООАСТСАОТТТСТТТАССТОСАА - 817) ГО N0:31).

Анализ заживления ран.

Клетки выращивали до конфлюентности в 24-луночных планшетах, истощали в течение 24 ч и царапали пластиковым наконечником. Среду для культивирования заменяли свежей средой, содержащей 1% РВ8 и носитель по отдельности (БМ80), и сразу же облучали. Через 24 ч клетки фиксировали 11% глутаральдегидом (81дта) и окрашивали кристаллическим фиолетовым. Снимки получали при помощи фотокамеры Ье1еа (Ьеюа БРС320, Ье1еа), соединенной с инвертированным оптическим микроскопом (ЭМ ГКВ, Ьеюа). Снимки представляют собой типичные результаты, полученные по меньшей мере в трех независимых экспериментах.

Анализ Тгап5\уе11.

Инвазию клеток измеряли в камерах ТгапктеП™ (ВБ Ра1еоп). Клетки МБА-МВ-231 и МБА-МВ4358 (5х10⁵/1гап8№е11) высевали на верхние стороны фильтров, покрытых 20 пг/см² воссозданной базальной мембраной Ма1пде1 (СоПаЬогаДуе КекеагсЕ). И-251 (10⁴/Тгап8№е11) высевали на фильтры, покрытые 50 пг/см². В обе камеры добавляли среду для культивирования, дополненную 1% РВ8. Через час после высевания клетки облучали (10 Гр) и инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Клетки на верхней стороне фильтра удаляли механическим путем, а те, которые мигрировали на нижнюю сторону, фиксировали, окрашивали и фотографировали, как описано выше. Для оценки инвазии клеток, случайно выбирали 10 полей для каждых условий эксперимента и делали микрофотографии с 10х увеличением, как описано выше. Морфометрический анализ проводили с использованием программного обеспечения Ме!аМогрЕ 7,1. Изображения являются типичными по меньшей мере для трех независимых экспериментов.

Анализ разветвленного морфогенеза.

Формировали сфероиды МБА-МВ-43 58 путем ресуспензии отдельных клеток в 240 мг/мл метилцеллюлозы (8фта) и культивирования в 9б-луночных планшетах с неадгезивной поверхностью (Огешег) в течение 24 ч. Сфероиды переносили в матрикс, содержащий 1,3 мг/мл коллагена типа I из хвоста крысы (ВБ Вюкаепеек), 0% РВ8 и 240 мг/мл метилцеллюлозы. Через 24 ч клетки облучали и/или культивировали в присутствии НОР в течение 7 суток. НОР получали в виде рекомбинантного белка бакуловируса в клетках 8Р9. Кондиционированную среду от неинфицированных клеток использовали в качестве отрицательного контроля. Изображения являются типичными результатами, полученными в трех независимых экспериментах.

Анализ жизнеспособности клеток при помощи РаЬ БИ30.

10³ клеток рассеивали в 96-луночные планшеты и выращивали в течение 24 ч. Среду для культивирования заменяли средой, содержащей 1% РВ8 и РаЬ БИ30 (28 пг/мл) или носитель по отдельности (РВ8). Через 24 ч клетки облучали (10 Гр). Жизнеспособность клеток оценивали, как описано выше.

Результаты

ΙΚ индуцирует транскрипцию МЕТ.

Авторы настоящего изобретения ранее показали, что транскрипция проонкогена МЕТ регулируется при помощи вне- и внутриклеточных специфических сигналов, включающих факторы роста и чувствительность к кислороду. Здесь исследовали модуляцию экспрессии Ме! под воздействием терапевтических доз ΙΚ (до 10 Гр).

Обнаружили, что в десяти клеточных линиях, полученных из неопластических тканей различных гистологических типов (карциномы молочной железы, легкого, предстательной железы и толстой кишки; меланомы; глиобластомы; нейробластомы), уровень белка Ме! был значительно повышен через 24 часа после облучения. В типичных клеточных линиях (таких как МБА-МВ-4358 и МБА-МВ-231), подробные исследования временной зависимости выявили двухфазный профиль накопления белка Ме!. Он характеризуется ранним пиком индукции Ме! (пятикратным) через 1-2 ч, с последующим похожим поздним пиком или плато, появляющимся через 6 ч и снижающимся через 24 ч после облучения (фиг. 1а). Дозозависимые эксперименты показали, что индукция Ме! начинается после 1 Гр и достигает плато при 5 Гр (фиг. 1Ь). В облученных клетках также наблюдали накопление мРНК МЕТ и активацию полноразмерного промотора МЕТ (фиг. 1е-б), указывающие на то, что сверхэкспрессия МЕТ, индуцированная ΙΚ, включает в себя транскрипционный механизм. Интересно, что в МБА-МВ-231, также выявили временное и лиганд-независимое аутофосфорилирование Ме!, возникающее в течение 10 мин после облучения ΙΚ (фиг. 6). Интенсивность фосфорилирования Ме!, индуцированного ΙΚ, была сравнима с той, которую вызывает ненасыщенная концентрация НОР (50 нг/мл). Однако кинетики фосфорилирования были различными, поскольку пик, индуцированный ΙΚ, был достигнут за 10 мин, в то время как пик, индуцированный НОР, был достигнут через 30 мин. Одновременная стимуляция ΙΚ и НОР не была синергичной (фиг. 6).

Для транскрипции МЕТ, индуцированной ΙΚ, необходим ΝΕ-КВ.

Известно, что ΙΚ регулирует несколько транскрипционных факторов, в том числе ΝΗ-кВ. В связи с этим полногеномное определение профиля экспрессии показало, что в исследованных клеточных линиях ΙΚ индуцирует заметный ранний ответ ΝΗ-кВ. Например, в МБА-МВ-231, 9 из 33 генов, изменившихся через час после облучения, являются мишенями ОТ^кВ, демонстрируя частоту в 20 раз выше ожидаемой.

- 8 028590

Кроме того, в исследованиях временной зависимости с клетками ΜΌΆ-ΜΒ-231, ΜΌΆ-ΜΒ-4358 или И251, ΙΚ. (10 Гр) индуцировала быстрое (в течение 30 мин) и продолжительное (до 24 ч) накопление в ядре субъединицы ΝΓ-кВ - рб5/К.е1А, отличительного признака активации ΝΓ-кВ (фиг. 2а). Кроме того, в ранних временных точках после облучения, ядерный рб5/Ке1Л был временно фосфорилирован по Зет²⁷⁵(фиг. 2а). Известно, что это фосфорилирование индуцируется активными формами кислорода (АФК) через протеинкиназу А, и способствует взаимодействию рб5/К.е1А с коактиватором транскрипции СВР/р300, который необходим для положительной регуляции подгруппы генов -ранних мишеней. Эти данные указывают, что ΙΚ. способствует функциональной активации ΝΓ-кВ, посредством накопления в ядре и раннего временного фосфорилирования субъединицы рб5/Ке1А.

В промоторе ΜΕΤ человека путем компьютерного моделирования были обнаружены два предполагаемых сайта связывания ΝΓ-кВ, кВ1, расположенный -1349/-1340 п.н., и кВ2, расположенный -1149/113б п.н. по отношению к последовательности участка начала транскрипции (ОепВапк, номер доступа АГ04 б925). Интересно, что, сайт кВ2 является высоконсервативным в промоторе те! мыши (фиг. 7; последовательность промотора те! мыши (тик тикси1и5) представлена в 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 32 и последовательность промотора те! человека (Гото 5ар1епк) представлена в 8Ε0 ГО N0:33). Эксперименты по иммунопреципитации хроматина показали, что связывание рб5/Ке1А с любым из сайтов достоверно увеличено в клетках, облученных 10 Гр (фиг. 2Ь), указывая на то, что ΝΓ-кВ контролирует транскрипцию ΜΕΤ в облученных клетках. Эти открытия подсказали авторам настоящего изобретения исследовать, является ли ΝΓ-кВ абсолютным требованием для индукции ΜΕΤ посредством ΙΚ. Поскольку рб5/Ре1А вовлечена в формирование каждого из нескольких гетеродимеров ΝΓ-кВ, и, таким образом, является крайне необходимой для цельности транскрипционной активности, регулируемой ΝΓ-кВ, нарушали экспрессию рб5/Ке1А при помощи РНК-интерференции. В клетках Μ^А-ΜΒ-231 или Μ^А-ΜΒ-435§, обработанных миРНК против рб5/К.е1А (§ΜАΚ.Τ роо1 Ь-003533-00 Нитап КЕЬА, 8Ε0 ГО ΝΟ: с 1 по 8), ΙΚ. была больше не способна индуцировать ни активность полноразмерного промотора ΜΕΤ (фиг. 2с), ни накопление белка Μе!. В совокупности, эти данные представляют убедительное доказательство того, что положительная регуляция ΜΕΤ, индуцированная ΙΚ, требует активации транскрипционного фактора ΝΓ-кВ.

Рассматривали также участие фактора, индуцируемого гипоксией-1 (ΗΙΓ-1) в транскрипции ΜΕΤ, индуцированной ΙΚ, поскольку: (а) показано, что ΗΙΓ-1 активирован в облученных клетках в результате образования АФК, и (Ь) ΗΙΓ-1 является основным регулятором экспрессии ΜΕΤ. Однако, как показали дополнительные методы, необходимость ΗΙΓ-1 была минимальной. Во-первых, в Μ^А-ΜΒ-231 и ΜΩΛΜΒ-435§, ΙΚ не вызывает ядерной транслокации субъединицы ΗΙΓ-1 а, которая является отличительной чертой активации ΗΙΓ-1, наблюдаемой, когда клетки культивировали при низкой концентрации кислорода (фиг. 2а). Отсутствие активации ΗΙΓ-1 не было связано со слабой продукцией АФК в облученных клетках, поскольку АФК увеличились в среднем на 25±3,5% через 15 мин после облучения 10 Гр. Это, по оценкам, соответствует, в среднем, 80% индукции АФК через 2-5 мин после облучения, согласно предшествующим наблюдениям на клеточных линиях, облученных 1-10 Гр. Кроме того, обнаружили, что ΙΚ не способна активировать так называемый минимальный промотор ΜΕΤ, включающий два функциональных элемента ответа на гипоксию (ΗΚΕ), и сайт Ар-1, которые отвечают за положительную регуляцию ΜΕΤ, вызванную гипоксией. В совокупности, эти данные указывают на то, что ΗΙΓ-1 не участвует в положительной регуляции ΜΕΤ, вызванной ΙΚ. Однако было отмечено, что гипоксия вызывает транслокацию рб5/Ке1А в ядро и фосфорилирование серина (фиг. 2а). Наконец, участие фактора транскрипции р53, главной мишени ΙΚ, также было исключено. В действительности, Μ^А-ΜΒ-435§ и Μ^А-ΜΒ-231 (две клеточные линии, демонстрирующие наибольшую индукцию ΜΕΤ посредством ΙΚ) содержат инактивирующие мутации по р53 (0266ε и К.280К, соответственно). Кроме того, в отличие от промотора мыши, человеческий промотор ΜΕΤ не активируется конститутивными активными формами р53.

Экспрессия ΜΕΤ, вызванная ΙΚ, опосредована активацией киназы АΤΜ.

ΝΓ-кВ представляет собой перекресток нескольких путей, инициированных как внеклеточными, так и внутриклеточными сигналами. Последние включают в себя сигналы, вызванные протеинкиназой АΤΜ вслед за повреждением ДНК. Для того чтобы исследовать, основана ли индукция ΜΕΤ посредством ΙΚ на активации киназы АΤΜ, Μ^А-ΜΒ-435§ или Μ^А-ΜΒ-231 обрабатывали 10 мкМ специфического низкомолекулярного ингибитора СОК733. В исследованиях временной зависимости СОК733 предотвращал фосфорилирование специфического субстрата АΤΜ - СГк2, индуцированное ΙΚ, а также транслокацию рб5/Ке1А в ядро и сверхэкспрессию белка Μе!. Эти данные свидетельствуют, что киназа АΤΜ необходима для положительной регуляции ΜΕΤ,-индуцированной ΙΚ (фиг. 3).

Инвазивный рост, вызванный ΙΚ, требует Μе!.

Сверхэкспрессия Μе! не вызывает активацию киназ в отсутствие внеклеточного лиганда ΗΟΓ. Однако она влечет за собой значительное повышение лиганд-зависимой сигнальной активности (т. е. повышение чувствительности). Это наблюдали в клетках, где гипоксия активирует экспрессию Μе! до уровня, сравнимого или более низкого, чем уровень, вызванный облучением.

Авторы настоящего изобретения, таким образом, исследовали, может ли сверхэкспрессия Μе!, индуцированная ΙΚ, вызывать или усиливать Μе!-зависимые биологические ответы. Эти ответы включают в себя физиологические и патологические стороны инвазивного роста. В анализе заживления ран, оцени- 9 028590 вающем способность клеток к регенерации поврежденных тканей (т.е. физиологический инвазивный рост), облученные ΜΌΑ-ΜΒ-231, а также ΜΌΑ-ΜΒ-4358, спонтанно выполняли программу заживления посредством отделения от края раны и миграции на всем протяжении поврежденной области. Этот ответ, наблюдаемый в течение 24 ч, совпадал с ответом, стимулированным НОР, также известным как фактор рассеивания, поскольку он способствует клеточной диссоциации и подвижности. Однако заживляющий ответ, вызванный ΙΚ, не связан с индукцией аутокринной петли, поскольку облученные клетки не экспрессируют НОР, что оценивали при помощи количественной ПЦР. Авторы настоящего изобретения сделали вывод, что сверхэкспрессия Μθΐ, индуцированная ΙΚ, повышает чувствительность клеток к небольшому количеству НОР, присутствующему в среде для культивирования, которая дополнена 1% сывороткой. Это условие, вероятно, имитирует физиологическое присутствие НОР ίη νίνο, распространенного повсеместно во внеклеточных матриксах.

Облученные клетки затем оценивали в анализах ТгашгееИ, измеряя способность пересекать искусственную базальную мембрану ίη νίίτο, эта способность тесно коррелирует с инвазивностью ίη νίνο, т.е. злокачественным инвазивным ростом. Фактически, облученные клетки (такие как ΜΌΑ-ΜΒ-231, ΜΌΑΜΒ-4358, или И-251) спонтанно пересекают базальную мембрану Тгапз\уе11 в условиях низкой концентрации сыворотки (1%) (фиг. 4а), снова имитируя поведение, вызванное НОР.

ΙΚ превращает морфогенез, индуцированный Μеΐ, в инвазивный процесс.

Разветвленный морфогенез представляет собой сложный физиологический процесс, который индуцируется НОР для образования трехмерных органов в течение онтогенеза. Эта многоэтапная программа вызывает клеточную миграцию, пролиферацию и пространственную реорганизацию, с образованием в конечном итоге полых разветвленных трубочек, выстланных клетками, ориентированными в определенном направлении. Некоторые из исследованных клеточных линий, такие как ΜΌΑ-ΜΒ-4358, могут полностью выполнять программу разветвленного морфогенеза ίη νίίτο.

Облучение ΙΚ. повышает чувствительность этих клеток к субоптимальной концентрации экзогенного НОР (5 нМ), которая сама по себе не способна индуцировать разветвленный морфогенез (фиг. 4Ь). Важно, что облученные клетки, стимулированные НОР, образуют трубочки с заметными структурными изменениями, поскольку клетки отделились от аблюминальной поверхности и распространились внутрь окружающего матрикса (фиг. 4Ь). Такое поведение напоминает трехмерный разброс, описанный как форма нарушенного морфогенеза в ответ на ΤΝΕ-α. Мы пришли к выводу о том, что терапевтические дозы ΙΚ могут превращать физиологический разветвленный морфогенез в аберрантный проинвазивный процесс.

Ингибирование Μеί повышает чувствительность клеток к апоптозу, индуцированному ΙΚ, и аресту пролиферации.

Как часть программы ΕΜΤ/Ю, Μеί излучает мощные противоапоптотические сигналы посредством устойчивой активации нисходящих сигнальных путей, в том числе киназа ΡΙ3/ΑΚΤ. Авторы настоящего изобретения, таким образом, полагают, что положительная регуляция ΜΕΤ может предотвращать гибель клеток, индуцированную излучением, и что, наоборот, ингибирование Μеί может повысить эффективность лучевой терапии.

Снижение жизнеспособности клеток (до 75%) наблюдали на облученных клетках, которые содержали в присутствии РаЬ-фрагмента анти-Μеί антитела ΌΝ30, известного индуктора негативной регуляции ΜΕΤ, таким образом, ингибируя передачу сигнала ΜΕΤ и его биологическую активность (Ре1ге1П еί а1., ΡΝΑδ 103: 5090-5, 2006) (фиг. 5).

Эти результаты указывают, что ингибирование активности Μеί повышает чувствительность клеток к лучевой терапии, увеличивая гибель клеток и снижая способность к восстановительной пролиферации после лечения.

Естественно, в то время как принцип изобретения остается тем же самым, детали конструкции и варианты осуществления могут широко варьировать по отношению к тем, которые были описаны и проиллюстрированы исключительно в качестве примера, в пределах объема по настоящему изобретению.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ повышения эффективности лучевой терапии, снижения и/или отмены устойчивости пациента к лучевой терапии в лечении пациента, страдающего опухолью, включающий введение данному пациенту ингибитора Ме!, выбранного из:

ί) моноклонального анти-Ме! антитела ΌΝ30, ίί) генетически сконструированного антитела, содержащего шесть областей, определяющих комплементарность (СИК) моноклонального анти-Ме! антитела ΌΝ30, где указанные СИК имеют аминокислотные последовательности, представленные в δΕφ ГО N0: с 12 до 14 и с 20 до 22, и ίίί) фрагмента (ί) или (ίί), содержащего шесть областей, определяющих комплементарность (СИК) моноклонального анти-Ме! антитела ΌΝ30, где указанные СИК имеют аминокислотные последователь- 20 028590 ности, представленные в 8Еф ГО N0: с 12 до 14 и с 20 до 22, где указанное моноклональное анти-Ме! антитело ΌΝ30 вырабатывается гибридомной клеточной линией 1СЬС ΡΌ 05006, и указанный ингибитор Ме! способен индуцировать понижающую регуляцию рецептора, кодируемого геном МЕТ, и снижать и/или отменять устойчивость пациента к лучевой терапии.
2. Способ по п.1, где указанный ингибитор Ме! вводят в форме растворимого белка путем инъекции или инфузии.
3. Способ по любому из пп.1, 2, где указанный фрагмент представляет собой РаЪ-фрагмент.
4. Способ по любому из пп.1-3, где указанный фрагмент представляет собой РаЪ-фрагмент, который содержит по меньшей мере одну стабилизирующую молекулу.
5. Способ по п.4, где указанная по меньшей мере одна стабилизирующая молекула выбрана из полиэтиленгликоля, альбуминсвязывающего домена или альбумина.
6. Способ по любому из пп.1-5, где указанный ингибитор Ме! вводят в течение по меньшей мере одной недели перед тем, как подвергнуть указанного пациента лучевой терапии.
7. Способ по любому из пп.1-6, где указанный ингибитор Ме! вводят за одни сутки перед тем, как подвергнуть указанного пациента лучевой терапии.
8. Способ по любому из пп.1-7, где указанный ингибитор Ме! вводят до истечения по меньшей мере одной недели после окончания лучевой терапии.
9. Способ по любому из пп.1-8, где указанный ингибитор Ме! вводят до истечения от 6 до 48 ч после окончания лучевой терапии.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная опухоль выбрана из карциномы, костно-мышечной саркомы, саркомы мягких тканей, гематопоэтического злокачественного новообразования, опухоли головного мозга, меланомы, мезотелиомы, опухоли Вильмса.
11. Способ повышения эффективности лучевой терапии, снижения и/или отмены устойчивости пациента к лучевой терапии в лечении пациента, страдающего опухолью, включающий введение данному пациенту нуклеотидной последовательности, кодирующей ингибитор Ме!, где указанный ингибитор Ме! выбран из:

ί) моноклонального анти-Ме! антитела ΌΝ30, ίί) генетически сконструированного антитела, содержащего шесть областей, определяющих комплементарность (СОК) моноклонального анти-Ме! антитела ΏΝ30, где указанные СОК имеют аминокислотные последовательности, представленные в 8Еф ГО N0: с 12 до 14 и с 20 до 22, и ίίί) фрагмента (ί) или (ίί), содержащего шесть областей, определяющих комплементарность (СОК) моноклонального анти-Ме! антитела ΟΝ30, где указанные СОК имеют аминокислотные последовательности, представленные в 8Еф ГО N0: с 12 до 14 и с 20 до 22, где указанное моноклональное анти-Ме! антитело ΟΝ30 вырабатывается гибридомной клеточной линией 1СЬС ΡΟ 05006, и указанный ингибитор Ме! способен индуцировать понижающую регуляцию рецептора, кодируемого геном МЕТ, и снижать и/или отменять устойчивость пациента к лучевой терапии.
12. Способ по п.11, где указанную нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный ингибитор Ме!, вводят с помощью вектора, где указанный вектор собран в вирусную частицу.
13. Способ по п.12, где указанный вектор вводят посредством системного или внутриопухолевого пути введения.
14. Способ по п.12, где указанный вектор вводят посредством инъекции.
15. Способ по любому из пп.11-14, где указанный фрагмент представляет собой РаЪ-фрагмент.
16. Способ по любому из пп.11-15, где указанный фрагмент представляет собой РаЪ-фрагмент, который содержит по меньшей мере одну стабилизирующую молекулу.
17. Способ по п.16, где указанная по меньшей мере одна стабилизирующая молекула выбрана из полиэтиленгликоля, альбуминсвязывающего домена или альбумина.
18. Способ по любому из пп.11-17, где указанную нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный ингибитор Ме!, вводят в течение по меньшей мере одной недели перед тем, как подвергнуть указанного пациента лучевой терапии.
19. Способ по любому из пп.11-18, где указанную нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный ингибитор Ме!, вводят за одни сутки перед тем, как подвергнуть указанного пациента лучевой терапии.
20. Способ по любому из пп.11-19, где указанную нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный ингибитор Ме!, вводят до истечения по меньшей мере одной недели после окончания лучевой терапии.
21. Способ по любому из пп.11-20, где указанную нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный ингибитор Ме!, вводят до истечения от 6 до 48 ч после окончания лучевой терапии.
22. Способ по любому из пп.11-21, где указанная опухоль выбрана из карциномы, костномышечной саркомы, саркомы мягких тканей, гематопоэтического злокачественного новообразования, опухоли головного мозга, меланомы, мезотелиомы, опухоли Вильмса.