CN108369229A - 用于处理基底表面的连接分子 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于处理基底表面的连接分子和方法，其包括具有能够抵抗蛋白质的非特异性结合同时允许靶生物分子或目标生物分子(包括抗体)的特异性结合的多个部分的连接分子。

Description

用于处理基底表面的连接分子
技术领域
本公开主要涉及在生物分子检测中使用的用于处理基底表面的连接分子。更具体地说，本公开涉及具有能够抵抗或抑制蛋白质的非特异性结合并允许包括抗体的生物分子的特异性结合的多个部分的连接分子。
相关申请
本申请要求于2015年7月17日提交的标题为“用于处理基底表面的连接分子”的美国临时申请第62/194,186号的权益，其主题通过引用整体并入本文。
背景技术
用于不同医疗目的的包括假体装置、侵入装置和诊断测试套件的医疗装置通常与诸如血液或尿液之类的体液样本接触。在化学上，体液非常复杂，具有大量溶解的蛋白质和盐类，这会由于溶解物质沉积在固体支持物或基底表面上而导致严重问题。例如，在医疗装置上沉积大片蛋白质和/或盐可能导致所述装置故障。在另一个例子中，人工心瓣上的厚膜涂层损害其弯曲能力，从而损害流体流量控制。类似地，沉积在传感器上的涂层防止其他溶解的分子到达传感器，由此降低了传感器的准确性。
通常，生物分子从溶液到在表面上的沉积经由两条路径发生。首先，可以使用特异性结合途径，其中表面用与一种特定类型或家族的生物分子结合的活性基团官能化。特异性结合可以通过生物学相互作用(例如，抗体-抗原配对或DNA杂交)或化学相互作用(例如，锁钥氢键合或配体-金属配对)。其次，可以使用非特异性结合途径，其中生物分子沉积在表面上而不管这些分子的性质如何。非特异性结合可引起疏水性(范德华力)相互作用和静电(电荷-电荷)相互作用。设计医疗装置时面临的主要挑战是在这两种途径之间取得平衡。在许多装置中，所述装置的正确操作需要特异性结合，而非特异性结合会降低装置的效率。因此，需要修饰装置表面，使其免于非特异性结合(“钝化”)，同时仍允许靶生物分子的特异性结合(“活化”)。
在涉及基于乙二醇的涂层的蛋白质抗性能力的文献中有参考文献。例如，Lee和Laibinis(Biomater.,1998,19(18):1669)报道了形成2-3nm厚的单层的低聚[乙二醇]封端的烷基三氯硅烷以提供几乎完美的对胰岛素、溶菌酶、白蛋白和己糖激酶的抗性。美国专利公开号2001/0031309描述了具有连续的烷基和低聚[乙二醇]链的硅烷分子。具有4个乙二醇单元的低聚[乙二醇]链可提供对抗蛋白质的非特异性结合的保护。美国专利公开号2009/0286435描述了用n-取代的葡萄糖酸衍生物钝化表面的方法。上述文献教导，该葡萄糖酸衍生物涂层的图案化产生了既是蛋白质抗性的又是蛋白质结合的表面，但这仅在宏观尺度上是准确的，而在微观尺度上(μm/nm)，该表面的任何区域不是蛋白质抗性的就是蛋白质结合的。此外，该文献没有采取任何措施积极促进蛋白质与表面的结合，放任蛋白质结合为不可控制的非特异性结合。
美国专利公开号2009/0175765描述了用混合自组装单层修饰玻璃或硅表面的方法，其中一种组分是蛋白质抗性的并且第二种组分允许蛋白质结合。然而，该方法显示仅很少一部分的第二组分起作用，产生的表面每7-10μm2上附着一个蛋白质，这对于表面结合测定来说太少。美国专利公开号2010/0041127描述了用携带数个结合部分的水凝胶涂布表面的方法。该水凝胶用蛋白质抗性化合物(甲氧基-聚[乙二醇]胺)和靶标结合配体官能化以活化表面以选择性靶捕获，同时抵抗所有其他蛋白质。但是，目前还不清楚如何控制水凝胶上的蛋白质抗性和靶标结合化合物的分数。此外，已知水凝胶在结构上是柔性的并且能够响应外部介质的变化而重新排列它们的表面；未证实当与高离子强度液体(如血清)一起存在时，水凝胶将继续以目标比例在其表面上提供所述化合物。
美国专利公开号2005/0255514描述了将蛋白质抗性与用于结合特定生物分子(如DNA或蛋白质)的活化结合的单个分子。该分子具有A-(CH2)n-(O[CH2CH2]x)m-(CH2)v-Y的通式，其中“A”是能够键合到硅、玻璃或类似表面的硅烷；“Y”是蛋白质结合部分；-(OCH2CH2)m-提供蛋白质抗性，-(CH2)n-是无活性的间隔基。该公开承认-(CH2)n-间隔基降低蛋白质抗性并描述第二实施方式A-(CH2)n-(OCH2CH2)m-Z，其中“Z”为亲水性封端基团。欧洲专利号0701697采用一种不同的方法来沉积钝化剂和结合剂，使用A-B-c嵌段共聚物，其中“A”是附着于表面的疏水性嵌段(聚[环氧丙烷])；“B”是蛋白质抗性嵌段(聚[乙二醇])；和“c”是允许与选择的蛋白质共价连接的反应性基团，其中“c”可以包含酰肼(-NH-NH2)基团。
因此，现有技术限于用赋予蛋白质抗性的分子和允许生物分子的特异性结合而不提供蛋白质抗性的连接分子涂覆基底表面的方法。因此，本技术领域仍存在一定的差距，本发明解决了这个问题。
应该理解的是，此处提到的“优选的”或“优选地”仅仅是示例性的。
发明内容
本公开涉及用于提供生物分子抗性(例如，蛋白质抗性)并允许生物分子的特异性结合的用于处理基底表面的连接分子。以宽泛的形式而言，所述连接分子阻止蛋白质的非特异性结合并且允许期望的生物分子(优选地，蛋白质)或分析物的特异性结合。所述连接分子包含羟基结合部分，其能够与基底表面或固体支持物上的活化羟基形成共价键。所述连接分子还包含具有至少三个重复单元的环氧乙烷或乙二醇的链段的生物分子抗性部分。所述连接分子还包含具有酰肼基团的抗体结合部分，其能够与所述抗体的抗体Fc区(也称为茎区)上的醛基反应。优选地，所述生物分子抗性部分是蛋白质抗性部分。
所述抗体结合部分能够结合至抗体，而不干扰所述抗体的生物学功能。优选地，所述抗体的生物学功能是抗原结合功能。在一个实施方式中，所述抗体结合部分包含在温和氧化处理后能够与抗体的Fc区或茎区上的醛基反应的脱保护的酰肼基团。如本领域已知的，Fc区在温和的氧化条件下被氧化。
在一个实施方式中，本公开涉及用于向基底表面沉积提供生物分子抗性(例如，蛋白质抗性)并允许生物分子特异性结合的连接分子的方法，所述方法包括以下步骤：i)通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)活化的偶联将所述连接分子共价连接至所述基底表面；和ii)在弱酸性条件下，使所述连接分子的酰肼基团脱保护，以使所述酰肼基团能够用于与抗体反应。
在另一个实施方式中，本公开涉及用于制备阻止蛋白质的非特异性结合并允许期望的生物分子或分析物的特异性结合的连接分子的合成路线或合成途径。在另一个实施方式中，公开了用于将抗体偶联至所述连接分子的合成途径。在所述连接分子的合成过程中，抗体结合部分的酰肼基团被保护免于副反应，例如，与可裂解的tBOC-基团反应。
在此使用的冠词“一种”和“一个”是指冠词的语法对象的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，“一个要素”是指一个要素或多于一个要素，并且不应该被视为“一个”或“单个”要素或特征的意义或定义。如本文所用，除非另有特别说明，否则单数的使用包括复数(反之亦然)。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”、“包含”和“含有”将被理解为意图包括所陈述的步骤或要素或者步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素或者步骤或要素的组。因此，使用术语“包括”等表示列出的要素是必需的或强制性的，但其他要素是可选的并且可以存在也可以不存在。“由...组成”意味着包括并限于在“由......组成”之后的任何事物。因此，短语“由...组成”表示列出的要素是必需的或强制的，并且不存在其他要素。“基本上由...组成”是指包括在该短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰所列举的要素的公开内容中指定的活动或行动的其他要素或者有助于所列举的要素的公开内容中指定的活动或行动的其他要素。因此，短语“基本上由...组成”表示所列出的要素是必需的或强制性的，但其他要素是可选的并且可以存在或可以不存在，这取决于它们是否影响所列要素的活动或行动。在一些实施方式中，在所述亚单元序列的上下文中，短语“基本上由...组成”表示所述序列可以包含至少一个附加的上游亚单元(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个上游亚单元)和/或至少一个附加的下游亚单元(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个下游亚单元)，其中上游亚单元的数量和下游亚单元的数量是可独立选择的。
其他目的、优点和新颖特征将在下面的详细描述中部分阐述，并且对于本领域技术人员在研究以下详细描述和附图时将部分地变得显而易见，或者可以通过实施例的实施方式的生产或操作来学习。概念的目的和优点可以通过所附权利要求中特别指出的方法、手段和组合来实现和获得。
附图说明
图1A显示了根据本公开的一个实施方式的连接分子的图示，其不一定按比例绘制。
图1B显示了根据本公开的一个实施方式的包含多个部分的连接分子的示例性结构。
图2显示了根据本公开的一个实施方式的具有最短可接受的蛋白质抗性部分的示例性连接分子的合成路线。
图3说明了根据本公开的一个实施方式，将连接分子沉积到带羟基的支持物上，随后将酰肼部分脱保护的示例性方法。
具体实施方式
以下详细描述包括对形成详细描述的一部分的附图的引用。附图根据示例性实施方式示出了图示。这些在本文中也被称为“实施例”的示例性实施方式被足够详细地描述以使得本领域技术人员能够实践本主题。
可以组合实施方式，可以使用其他实施方式，或者可以在不脱离所要求保护的范围的情况下进行结构、逻辑和操作的改变。因此，以下详细描述不应被视为具有限制意义，并且范围由所附权利要求及其等同物来限定。
经表面处理的基底可用于在例如蛋白质组学、基因组学、药物研究、药物发现和诊断研究领域中特异性结合目标化学或生物分子，如蛋白质(或其片段)、肽、多肽、核苷酸、多核苷酸、小分子、小有机分子、生物素、细胞、分级细胞、细胞提取物、细胞级分、细胞部分以及其他化学或生物分子。
如本文所用，术语“基底”是指固体支持物或医疗装置表面或无机或有机基底材料。基底可以包括，但不限于，硬工程表面，诸如硅，玻璃，硅石，石英，金属氧化物，氧化铟锡(ITO)，云母等。有机基底可以包括，但不限于，氧化的聚合物表面，如聚乙烯醇聚合物，丙烯酸聚合物，聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)，聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚氯乙烯(PVC)和选定的大分子，如溶解的带羟基的聚合物，例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)或P[OEGMA-OH])或带羟基的蛋白质。所述基底可以是光纤、导线、晶片、圆盘、平面表面、显微镜载玻片或珠子的形式。所述基底还可以是传感器、生物传感器、DNA芯片、蛋白质芯片、微阵列、显微镜载玻片、硅晶片或微电子表面。
如本文所用，术语“靶分子”、“化学或生物分子”、“生物分子”和“期望的生物分子”是指可以连接至官能化的基底表面或基底表面的任何特异性结合物质。
如本文所用，术语“醛”是指具有式-CHO的分子。特别地，在抗体的Fc区中发现的醛基参与偶联至连接分子的抗体结合部分。
如本文所用，术语“表面”是指能够直接或间接结合特异性结合物质的任何固体支持物表面。
如本文所用，术语“蛋白质”是指任何蛋白质，包括，但不限于肽，酶，糖蛋白，蛋白质激素，受体，抗原，抗体，生长因子等。
化学或生物分子可选自例如，蛋白质，肽，多肽，核苷酸，多核苷酸，小分子，生物素，细胞，分级细胞，细胞提取物，细胞级分和细胞部分，及其任何组合。
本技术涉及用于处理基底表面的连接分子。所述连接分子构造成提供生物分子抗性(例如，蛋白质抗性)和生物分子的特异性结合。特别地，所述连接分子能够抵抗生物分子(优选地，所述生物分子是蛋白质)的非特异性结合并且允许靶生物分子或目标生物分子的特异性结合。优选地，所述靶生物分子或目标生物分子为蛋白质，更优选为抗体。
在一个实施方式中，如图1A和图1B所示，所述连接分子包含多个部分，包括：i)羟基结合部分，其能够与基底表面或固体支持物上的活化羟基形成共价键；ii)包含具有至少3个重复单元的环氧乙烷或乙二醇的链段的蛋白质抗性部分；和iii)包含酰肼基团的抗体结合部分，其中脱保护形式的酰肼基团能够与抗体非功能区(特别是Fc区)上的醛基团反应。预期在本技术的某些实施方式中，所述连接分子由以下组成或者基本上由以下组成：能够与基底表面上的活化羟基形成共价键的羟基结合部分；包含具有至少三个重复单元的环氧乙烷或乙二醇的链段的生物分子抗性部分；和包含酰肼基团且能够与抗体非功能区上的醛基反应的抗体结合部分。在一个实施方式中，所述结合区包含抗体的Fc区。优选地，所述非功能区是不结合抗原或不与抗原相互作用的抗体区。更优选地，不结合抗原或不与抗原相互作用的区域是抗体的茎区或Fc区。
所述羟基结合部分被配置为与游离分子或基底表面上的活化羟基形成共价键。所述基底表面可以包含结合配偶体，包括硬工程表面，氧化的聚合物表面，纳米颗粒，微粒，带羟基的聚合物或带羟基的蛋白质。
在一个实施方式中，所述蛋白质抗性部分被配置为阻断蛋白质与基底表面的非特异性结合。图2显示了用于制备具有最短可接受的蛋白质抗性部分的示例性连接分子的合成路线。合成路线是蛋白质抗性部分的长度的不变量，并且仅需要对方案进行微小调整，主要在纯化步骤中，以产生具有较大蛋白质抗性部分的连接分子。在分子合成过程中，所述抗体结合部分中的高反应性酰肼基团被可切割的tBOC基团保护免于副反应。
所述连接分子已被设计为提供在包含羟基(-OH)基团的任何基材上的简单沉积，包括但不限于氧化的硅，氧化的玻璃，ITO，聚合物基底和游离聚合物。如图1A和1B所示，所述连接分子可以包含具有至少三个部分(即，羟基结合部分，生物分子抗性部分(并且优选地，所述生物分子抗性部分是蛋白质抗性部分)和抗体结合部分)的线性分子。
参照图3，其显示了根据本公开的一个实施方式的将连接分子沉积到带羟基的支持物上，接着将酰肼部分脱保护的示例性方法。该方法包括两个独立的步骤：i)通过EDC-活化的偶联将连接分子共价连接至带羟基的基底表面；和ii)在弱酸性条件下，对酰肼基团进行脱保护，从而使酰肼基团可用于与抗体反应。该反应中的上述两个步骤都与有机和无机基底相容，保留了改性基底的结构性质和/或架构。
一旦所述连接分子已经沉积到基底表面上并且酰肼基团被脱保护，则其可以通过与抗体的“茎”或“尾”(如抗体的Fc区)相互作用而偶联至任何抗体。抗体的Fc区在温和的氧化条件下被氧化以允许该偶联，用于温和氧化的条件如本领域普通技术人员将理解的。此外，已显示抗体的Fc区不干扰抗体功能或抗原-抗体相互作用。对抗体Fc区氧化的这种要求通过防止与天然抗体或生物样品中正常存在的抗体的不希望的结合而提供了另一种控制措施。
通常，Fc区在不同抗体之间显示低水平的变异。因此，连接分子可以以等同地容易和效率与不同类型的抗体偶联。此外，Fc区不参与抗原结合，使得抗体Fc区与连接分子和基底的偶联不影响功能性质，特别是抗体的抗原结合功能。在一个实施方式中，在温和氧化后，脱保护的酰肼基团能够与存在于抗体的Fc区中的醛基反应。
在一个实施方式中，本公开涉及构造成提供对蛋白质的非特异性结合的抗性或抑制并允许特异性结合目标抗体的线性分子。所述线性分子包含被配置为特异性结合抗体的第一活性基团，被配置为结合固体支持物或基底的第二活性基团，以及被配置为阻止蛋白质的非特异性结合的第三活性基团。所述第一活性基团和所述第二活性基团彼此相容且正交，允许单独活化所述反应基团。在一个实施方式中，三个活性基团中的每一个都被保护免于不需要的反应或副反应。
在另一个实施方式中，本公开涉及用于制备阻止蛋白质的非特异性结合并允许所需生物分子或分析物的特异性结合的连接分子的合成路线或合成途径。在另一个实施方式中，公开了用于将抗体偶联至连接分子的合成途径。
存在于生物样品中的溶解物质(例如样品溶液中的蛋白质)倾向于非特异性地结合至基底表面并干扰所期望的生物分子(如抗体)的特异性结合。例如，蛋白质的非特异性结合可以通过形成范德华键和/或静电相互作用而发生。另一方面，特异性结合可以是通过生物相互作用(例如，抗体-抗原配对或DNA杂交)或化学相互作用(例如，锁钥氢键合或配体-金属配对)。因此，基底表面需要以阻断蛋白质的非特异性结合同时允许或促进靶生物分子或分析物的特异性结合的方式处理。
基底表面需要被保护免于非特异性结合(钝化的基底)，并且应该允许特异性结合目标分子(活化的基底)。本公开的连接分子被配置为结合至任何带羟基的基底表面，并且还包含用于特异性结合抗体的非功能区的活性位点和包含重复的环氧乙烷或乙二醇单元的链段，该链段阻断蛋白质的非特异性结合。
已经在此适当地说明性描述的本公开能够在缺少在此没有具体公开的一个或多个要素、一个或多个限制的情况下实施。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包括”，“基本上由...组成”和“由...组成”中的任何一个可以用其余两个术语中的任一个替换，而不改变它们的普通含义。已经使用的术语和表达被用作描述的术语而不是限制，并且无意使用这些术语和表达来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是认识到的是在本公开的范围内可以进行各种修改。
虽然已经参考具体示例性实施方式描述了实施方式，但显而易见的是，可以在不脱离本申请的更广泛的精神和范围的情况下对这些示例性实施方式进行各种修改和改变。例如，这种变化可以包括，但不限于，用于致动阀膜的力的变化，刚性和软质材料的变化以及其他流体层或控制层的变化和/或添加。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而不是限制性的。

Claims (10)

1.用于提供生物分子抗性并允许生物分子结合的连接分子，所述连接分子包含：
能够与基底表面上的活化羟基形成共价键的羟基结合部分；
包含具有至少三个重复单元的环氧乙烷或乙二醇的链段的生物分子抗性部分；和
包含酰肼基团且能够与抗体的Fc区上的醛基反应的抗体结合部分。
2.如权利要求1所述的连接分子，其中，所述生物分子抗性部分是蛋白质抗性部分。
3.如权利要求1或权利要求2所述的连接分子，其中，所述酰肼基团是能够与所述抗体的Fc区反应的脱保护的酰肼基团。
4.如前述权利要求中任一项所述的连接分子，其中，所述羟基结合部分和所述抗体结合部分相互相容且正交。
5.如前述权利要求中任一项所述的连接分子，其中，所述基底表面包括以下中的一种或多种：硅，玻璃，云母，氧化铟锡(ITO)，氧化的聚合物基底，游离聚合物，纳米粒子，微粒，带羟基的支持物，带羟基的聚合物和带羟基的蛋白质，以及它们的任何组合。
6.一种向基底沉积提供生物分子抗性并允许生物分子结合的连接分子的方法，所述方法包括以下步骤：
通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)活化的偶联将所述连接分子共价连接至所述基底；和
在弱酸性条件下，使所述连接分子的酰肼基团脱保护，以使所述酰肼基团能够用于与抗体反应。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述脱保护的酰肼基团被配置成偶联至所述抗体的Fc区。
8.如权利要求6或权利要求7所述的方法，其中，所述连接分子包含羟基结合部分、蛋白质结合部分和抗体结合部分。
9.如权利要求6至8中任一项所述的方法，其中，所述连接分子是根据权利要求1至5中任一项所述的连接分子。
10.如权利要求6至9中任一项所述的方法，其中，所述基底包括以下中的一种或多种：硅，玻璃，云母，ITO，氧化的聚合物基底，游离聚合物，纳米粒子，微粒，带羟基的支持物和带羟基的聚合物，以及带羟基的蛋白质，以及它们的任何组合。
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