CN108409906B - 一种可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶及其制备方法，其制备方法是：分别将模板分子牛血清蛋白、丙烯酰胺等溶解在一定量的去离子水中，然后加入甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵和2‑丙烯酰氨基‑2‑甲基‑1‑丙烷磺酸搅拌得到预聚液，通入氮气除氧，加入四甲基乙二胺和过硫酸铵作为加速剂和氧化剂，然后迅速倒入到模具中，在15‑35℃下反应2‑12 h制备水凝胶材料，用去离子水洗去未反应的单体和模板，然后再用洗脱液十二烷基硫酸钠与乙酸的混合溶液洗脱模板分子，得到一种新型的离子型水凝胶。本发明制备的印迹水凝胶材料为毫米级凝胶薄膜，对牛血清蛋白具有良好的选择吸附能力，具有一定的再生使用性能。
Description
技术领域
本发明属于功能高分子材料领域，具体涉及一种可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶及其制备方法。
背景技术
蛋白质是组成人体一切细胞、组织的重要成分，机体所有重要的组成部分都需要有蛋白质的参与，是生命活动的主要承担者。近年来，医学界普遍认为疾病不单单是由某个基因或染色体的病变造成的，而是与血清中的一些蛋白质有着密切的关系。因此蛋白的分离和检测也成为了蛋白质研究的一项重要课题。分子印迹技术能够制备具有对目标分子具有专一识别的聚合物，其优点是成本低、材料合成方便、稳定性好，能够满足蛋白质分离的需求。分子印迹对于小分子的研究较为成熟，然而对于生物大分子如蛋白质、核酸等的研究远不如小分子印迹研究的深入，这主要取决于生物大分子的理化性质，因此对于像蛋白质这样的生物大分子的研究主要还处于探索阶段。蛋白质表面官能团和电荷分布复杂，研究电荷密度对蛋白质印迹吸附和识别的影响具有重要理论意义。聚丙烯酰胺水凝胶作为一种具有潜在生物特性的材料，被广泛应用于蛋白质印迹的基材。本申请以丙烯类带正负电荷单体为功能单体合成聚丙烯酰胺水凝胶材料，这种水凝胶对蛋白质具有良好的识别能力，同时利用分子印迹技术，产生记忆孔穴，从而更有利于蛋白质印迹材料与目标蛋白的结合，达到目标蛋白的识别和分离。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶及其制备方法。本发明制备的可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶具有多孔网状结构，并且分子链上带有正负电荷基团，能够解决蛋白质在凝胶内部的传质问题以及提供多印迹识别位点，提高目标蛋白的识别能力。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
（1）预聚液的制备：以牛血清蛋白为模板分子，将其溶于去离子水中，然后加入丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N, N′-亚甲基双丙烯酰胺、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液和2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸溶液，搅拌溶解，制得预聚液；
（2）水凝胶材料的制备：往步骤（1）得到的预聚液中通氮气2-15 min，然后再加入四甲基乙二胺、过硫酸铵溶液，然后迅速倒入自制的模具中，进行聚合反应，制得水凝胶材料；
（3）将步骤（2）制得的凝胶取下，切块，然后用蒸馏水反复冲洗，除去未反应的单体和模板；
（4）然后往凝胶块中加入洗脱液，进行搅拌洗脱12-48 h，最后用大量的去离子水冲洗，得到印迹水凝胶材料。
步骤（1）中，牛血清蛋白的用量为：10-70mg，去离子水的用量为：0.8-4mL，丙烯酰胺的用量为：100-400mg，N-异丙基丙烯酰胺的用量为0-50mg，N, N′-亚甲基双丙烯酰胺的用量为：21-133mg，甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液的加入量为0-40μL，溶液浓度0.1-0.6 g/mL；2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸溶液的加入量为0-40μL，溶液浓度为0.1-0.6g/mL。
步骤（2）中，四甲基乙二胺的用量为5-20 μL；过硫酸铵溶液的加入量为40-120μL，该溶液的浓度为5-20wt%。
步骤（2）中的聚合反应温度为15-35 ℃，反应时间为2-12 h。
步骤（3）中，所述的切块为将凝胶切成2-10 mm×2-10 mm×0.75-2 mm块状。
步骤（4）中的洗脱液是含有十二烷基硫酸钠和乙酸的水溶液，洗脱液用量为20-100 mL，洗脱液中的十二烷基硫酸钠质量分数为1-20%，乙酸的体积分数为1-20%。
一种如上所述的制备方法制得的可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶，其对牛血清蛋白的吸附容量为0.5-5 mg/g，分离因子1-4。
通过紫外-可见分光光度计测定所述水凝胶材料对蛋白质的吸附量及吸附选择性，具体测量方法为：
（1）吸附量：称取1.0 g湿凝胶加入到50 mL锥形瓶中，加入10 mL 1 mg/mL的BSA吸附液，在室温下吸附12 h，用紫外-可见分光光度计测定吸附前后的BSA浓度，由下式计算BSA吸附量和印迹效率：
其中，C 0 （mg/mL）和C t （mg/mL）是BSA吸附液的初始浓度和t时刻的浓度，V（mL）是BSA吸附液的体积，m（g）是湿凝胶的质量，Q MIP 是印迹凝胶的吸附量，Q NIP 是非印迹凝胶的吸附量，IE是凝胶的印迹效率。
（2）吸附选择性：配置牛血清蛋白、卵清蛋白或溶菌酶的浓度均为1 mg/mL的混合溶液，称取1.0 g湿凝胶于10 ml混合溶液中，在室温下吸附12 h，对BSA的吸附选择性计算如下：
其中，K D 是静态分配系数；Q e （mg/g）和C e （mg/mL）分别代表聚合物吸附平衡时的吸附量和吸附液的浓度大小；SF是分离因子；K D1 和K D2 分别为模板分子的静态分配系数和竞争蛋白分子的静态分配系数。
本发明具有以下优点：
（1）本发明以丙烯类带正负电荷的单体合成的聚丙烯酰胺水凝胶具有无毒、生物相容性的优点，同时合成的聚合物具有多孔材料的性质，能够降低蛋白质在凝胶内部的传质阻力；
（2）本发明合成的聚合物高分子链上具有正负电荷基团，在印迹过程中，可以构造大量的可逆静电结合位点，有利于蛋白质的重结合，从而提高印迹水凝胶材料对目标蛋白的吸附能力；
（3）本发明研究带有阴阳离子识别基团的水凝胶对目标分子的识别性质，有利于掌握生物大分子与吸附剂之间静电作用的机理；本发明制备的水凝胶材料为厚度均匀的毫米级凝胶膜，对BSA具有良好的选择吸附能力，可再生重复利用，而且制备工艺简单，成本低，稳定性好，无毒和潜在的生物特性，可广泛用于蛋白质的吸附分离，具有广阔的生物医药前景。
附图说明
图1和图2为实施例1与对比例1所制水凝胶材料的扫描电镜图；
图3为实施例1与对比例1所制水凝胶材料的电荷密度对BSA吸附的影响。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，以下实施例将对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于这些实施例。
实施例1
一种可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶的制备方法，具体步骤为：
（1）将50 mg 牛血清蛋白（BSA）模板溶于1.33 mL去离子水中，然后加入400 mg丙烯酰胺（Am）、5 mg N-异丙基丙烯酰胺（NIPAm）、N, N′-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）、20 μL 0.3mg/mL甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵（DMC）和20 μL 0.3 mg/mL 2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸（AMPS），搅拌溶解；
（2）将（1）得到的预聚液通氮气5 min进行脱氧，然后再加入10 μL TEMED和80 μL10 wt % APS，然后迅速倒入自制的模具中，在25 ℃下反应12 h制备水凝胶材料；
（3）将（2）获得的凝胶取下，然后用刀片切成4 mm×4 mm×1 mm的凝胶块然后用蒸馏水冲洗，除去未反应的单体和模板；
（4）加入50 mL 1% (w/v)十二烷基硫酸钠（SDS）-10% (v/v)乙酸（HAc）混合液进行搅拌洗脱24 h，最后用大量的去离子水冲洗，得到印迹水凝胶材料。
对比例1
一种离子型非印迹水凝胶材料的制备方法，具体步骤为：
（1）将400 mg 丙烯酰胺（Am）、5 mg N-异丙基丙烯酰胺（NIPAm）、N, N′-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）、20 μL 0.3 mg/mL甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵（DMC）和20 μL 0.3 mg/mL 2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸（AMPS）加入到1.33 mL去离子水中，搅拌溶解；
（2）将（1）得到的预聚液通氮气5 min进行脱氧，然后再加入10 μL TEMED和80 μL10 wt % APS，然后迅速倒入自制的模具中，在25 ℃下反应12 h制备水凝胶材料；
（3）将（2）获得的凝胶取下，然后用刀片切成4 mm×4 mm×1 mm的凝胶块然后用蒸馏水冲洗，除去未反应的单体；
（4）加入50 mL 1% (w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)-10% (v/v)乙酸（HAc）混合液进行搅拌洗脱24 h，最后用大量的去离子水冲洗，得到印迹水凝胶材料。
实施例1和对比例1所制水凝胶材料扫描电镜图如图1和2所示，由图可以看出，实施例1和实施例2合成的水凝胶材料都呈现一种多孔网络结构，并且实施例1网络结构孔更大，而且孔的空间呈现杂乱无章，这说明印迹模板具有一定的致孔能力。水凝胶网络结构所带的电荷对蛋白质吸附和识别性能如图3所示，从图3 可以看出，引入过量的负电荷有利于蛋白质的非特异性吸附，相反引入过多的正电荷不利于蛋白质的吸附，当正负电荷密度为50%/50%时，实施例1的吸附量高达1.97 mg/g，对比例1为0.68 mg/g，很明显实施例1高于对比例1，其印迹效率高达2.91。可见本发明由于高分子链引入了阴阳离子识别基团，有效地提高了水凝胶材料的特异性识别能力，一定程度上也提高了蛋白质的吸附，由此可知，该水凝胶材料可以作为蛋白质分离和识别的优良材料。
实施例2
一种可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶的制备方法，具体步骤为：
（1）将40 mg 牛血清蛋白（BSA）模板溶于2 mL去离子水中，然后加入400 mg 丙烯酰胺（Am）、10 mg N-异丙基丙烯酰胺（NIPAm）、44 mg N, N′-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）、10 μL 0.3 mg/mL甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵（DMC）和30 μL 0.3 mg/mL 2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸（AMPS），搅拌溶解；
（2）将（1）得到的预聚液通氮气5 min进行脱氧，然后再加入10 μL四甲基乙二胺（TEMED）和80 μL 10wt%过硫酸铵（APS），然后迅速倒入自制的模具中，在25 ℃下反应12 h制备水凝胶材料；
（3）将（2）获得的凝胶取下，然后用刀片切成4 mm×4 mm×1 mm的凝胶块然后用蒸馏水冲洗，除去未反应的单体和模板；
（4）加入50 mL 1% (w/v)十二烷基硫酸钠（SDS）-10% (v/v)乙酸（HAc）混合液进行搅拌洗脱24 h，最后用大量的去离子水冲洗，得到印迹水凝胶材料。
实施例3
一种可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶的制备方法，具体步骤为：
（1）将60 mg 牛血清蛋白（BSA）模板溶于4 mL去离子水中，然后加入400 mg 丙烯酰胺（Am）、20 mg N-异丙基丙烯酰胺（NIPAm）、21 mg N, N′-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）、13 μL 0.3 mg/mL甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵（DMC）和26 μL 0.3 mg/mL 2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸（AMPS），搅拌溶解；
（2）将（1）得到的预聚液通氮气5 min进行脱氧，然后再加入10 μL四甲基乙二胺（TEMED）和80 μL 10wt%过硫酸铵（APS），然后迅速倒入自制的模具中，在25 ℃下反应12 h制备水凝胶材料；
（3）将（2）获得的凝胶取下，然后用刀片切成4 mm×4 mm×1 mm的凝胶块然后用蒸馏水冲洗，除去未反应的单体和模板；
（4）加入50 mL 1% (w/v)十二烷基硫酸钠（SDS）-10% (v/v)乙酸（HAc）混合液进行搅拌洗脱24 h，最后用大量的去离子水冲洗，得到印迹水凝胶材料。
实施例4
一种可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶的制备方法，具体步骤为：
（1）将30 mg 牛血清蛋白（BSA）模板溶于1 mL去离子水中，然后加入400 mg 丙烯酰胺（Am）、5 mg N-异丙基丙烯酰胺（NIPAm）、100 mg N, N′-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）、30 μL 0.3 mg/mL甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵（DMC）和10 μL 0.3 mg/mL 2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸（AMPS），搅拌溶解；
（2）将（1）得到的预聚液通氮气5 min进行脱氧，然后再加入10 μL四甲基乙二胺（TEMED）和80 μL 10wt%过硫酸铵（APS），然后迅速倒入自制的模具中，在25 ℃下反应12 h制备水凝胶材料；
（3）将（2）获得的凝胶取下，然后用刀片切成4 mm×4 mm×1 mm的凝胶块然后用蒸馏水冲洗，除去未反应的单体和模板；
（4）加入50 mL 1% (w/v)十二烷基硫酸钠（SDS）-10% (v/v)乙酸（HAc）混合液进行搅拌洗脱24 h，最后用大量的去离子水冲洗，得到印迹水凝胶材料。
实施例5
一种可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶的制备方法，具体步骤为：
（1）将10 mg 牛血清蛋白（BSA）模板溶于2 mL去离子水中，然后加入400 mg 丙烯酰胺（Am）、50 mg N-异丙基丙烯酰胺（NIPAm）、133 mg N, N′-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）、26μL 0.3 mg/mL甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵（DMC）和13 μL 0.3 mg/mL 2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸（AMPS），搅拌溶解；
（2）将（1）得到的预聚液通氮气5 min进行脱氧，然后再加入10 μL四甲基乙二胺（TEMED）和80 μL 10% wt过硫酸铵（APS），然后迅速倒入自制的模具中，在25 ℃下反应12 h制备水凝胶材料；
（3）将（2）获得的凝胶取下，然后用刀片切成4 mm×4 mm×1 mm的凝胶块然后用蒸馏水冲洗，除去未反应的单体和模板；
（4）加入50 mL 1% (w/v)十二烷基硫酸钠（SDS）-10% (v/v)乙酸（HAc）混合液进行搅拌洗脱24 h，最后用大量的去离子水冲洗，得到印迹水凝胶材料。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (7)
1.一种可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）预聚液的制备：以牛血清蛋白为模板分子，将其溶于去离子水中，然后加入丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N, N′-亚甲基双丙烯酰胺、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液和2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸溶液，搅拌溶解，制得预聚液；
（2）水凝胶材料的制备：往步骤（1）得到的预聚液中通氮气2-15 min，然后再加入四甲基乙二胺、过硫酸铵溶液，然后迅速倒入自制的模具中，进行聚合反应，制得水凝胶材料；
（3）将步骤（2）制得的凝胶取下，切块，然后用蒸馏水反复冲洗，除去未反应的单体和模板；
（4）然后往凝胶块中加入洗脱液，进行搅拌洗脱12-48 h，最后用大量的去离子水冲洗，得到印迹水凝胶材料。
2.根据权利要求1所述的一种可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，牛血清蛋白的用量为：10-70 mg，去离子水的用量为：0.8-4 mL，丙烯酰胺的用量为：100-400 mg，N-异丙基丙烯酰胺的用量为0-50 mg，N, N′-亚甲基双丙烯酰胺的用量为：21-133 mg，甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液的加入量为0-40 μL，溶液浓度0.1-0.6 g/mL；2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸溶液的加入量为0-40 μL，溶液浓度为0.1-0.6 g/mL。
3.根据权利要求1所述的一种可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，四甲基乙二胺的用量为5-20 μL；过硫酸铵溶液的加入量为40-120μL，该溶液的浓度为5-20 wt%。
4.根据权利要求1所述的一种可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（2）中的聚合反应温度为15-35 ℃，反应时间为2-12 h。
5.根据权利要求1所述的一种可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述的切块为将凝胶切成2-10 mm×2-10 mm×0.75-2 mm块状。
6.根据权利要求1所述的一种可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（4）中的洗脱液是含有十二烷基硫酸钠和乙酸的水溶液，洗脱液用量为20-100 mL，洗脱液中的十二烷基硫酸钠质量分数为1-20%，乙酸的体积分数为1-20%。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的可选择性吸附牛血清蛋白的离子型水凝胶，其特征在于：所述的离子型水凝胶对牛血清蛋白的吸附容量为0.5-5 mg/g，分离因子为1-4。
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