CN108752524B - 一种溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法，以氯化1‑羧甲基‑3‑乙烯基咪唑离子液体作为功能单体、N‑异丙基丙烯酰胺(NIPAm)作为支撑单体，N、N‑亚甲基双丙烯酰胺(BIS)作为交联剂，过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)作为氧化还原引发剂，三羟甲基氨基甲烷与盐酸(Tris‑HCl)的缓冲溶液(pH＝7，10mM，25℃)为溶剂，溶菌酶(Lyz)作为印迹分子的分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法，获得的水凝胶对Lyz均具有较高的印迹效率和良好的识别效果。

Description

一种溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法
技术领域
本发明属于分子印迹技术领域，涉及一种溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法。
背景技术
分子印迹技术是指制备对某一特定的目标分子具有特异选择性的聚合物过程。印迹技术的实现，一般是先通过功能单体与目标分子（即印迹分子）预组装，随后在交联剂的存在下聚合，获得能够与印迹分子产生作用的聚合物，随着印迹分子被洗脱，剩下的聚合物对印迹分子同时具有吸附作用和特异性空穴，可以实现对印迹分子单一性识别的过程。其中，蛋白质分子印迹技术由于可以广泛应用于在色谱分析、蛋白质、多肽纯化与分离、临床医学等领域，受到了许多国内外研究人员的关注。然而，在目前的研究中蛋白质分子印迹聚合物的分离效果并不尽如人意，究其原因，主要是由于蛋白质分子印迹聚合物难以洗脱，并且用于合成分子印迹聚合物的功能单体与蛋白质分子之间的作用力较弱，因此，为了获得对蛋白质具有良好识别作用的分子印迹聚合物，功能单体的选择与分子印迹聚合物的形态十分重要。
离子液体作为新兴的绿色材料，与传统的分子材料相比具有其独特的优势，它几乎没有蒸汽压，可以作为绿色反应物与溶剂应用于化学过程；它具有阴、阳离子可调性，研究者可以按照自己的需求，设计阴、阳离子的结构，获得他们所需性质的离子液体。近些年来，离子液体作为功能单体应用于分子印迹技术逐渐成为研究的热点。与传统的丙烯酸类、4-乙烯基吡啶类氢键作用方式的功能单体相比，离子液体功能单体是以静电作用吸引印迹分子，在水相体系中具有十分明显的优势。Guo Lu等人于2011年首次报道了以氯化1-乙烯基-3-丁基咪唑离子液体（VBIM+Cl-）为功能单体制备氯磺隆分子印迹聚合物的研究工作，所制备印迹聚合物具有较好的识别效果。随后，该研究小组又于2012年以VBIM+Cl-为功能单体，制备出对溶菌酶、牛血红蛋白、细胞色素C等蛋白质具有良好吸附作用的聚合物。
水凝胶是一类在水中显著溶胀而不溶解的亲水性高分子网络，由于具有与生物组织类似的含水量与结构，水凝胶有很好的生物相容性。温度敏感性水凝胶是指那些水含量会随外界温度的微小变化而产生突变的水凝胶，它们可以广泛的应用于生物物质的分离提纯、药物控制释放等领域。
发明内容
为了解决溶菌酶分子印迹聚合物的识别效率低、洗脱难的问题，本发明提供一种溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法，将分子印迹技术与温度敏感性水凝胶相结合，获得的水凝胶对溶菌酶均具有较高的印迹效率和良好的识别效果。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法，包括以下操作：
1）按照1～5：100：100质量比，将功能单体氯化1-羧甲基-3-乙烯基咪唑、支撑单体N-异丙基丙烯酰胺和印迹分子溶菌酶溶解在pH=7的Tris-HCl缓冲溶液中得到预聚体系；
所述的Tris-HCl缓冲溶液与N-异丙基丙烯酰胺质量比为10：1；
2）向所得的预聚体系中加入交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺，其加入量为N-异丙基丙烯酰胺质量的1～5%；
然后加入引发剂过硫酸铵，其加入量为N-异丙基丙烯酰胺质量的1～2%，充分混合得到反应混合溶液；
3）将反应混合溶液在25～30℃下超声除氧20～30min后，通入氮气30～50min，然后迅速加入四甲基乙二胺，密封；四甲基乙二胺加入量为N-异丙基丙烯酰胺质量的1～2% ；
4）25～30℃下反应3～6h，制得温度敏感性水凝胶；
5）将得到的温度敏感性水凝胶进行洗脱：
将温度敏感性水凝胶放入到Tris-HCl缓冲溶液中25～30℃下洗脱24～48h，随后再放入到去离子水中浸泡24h，取出后在 40～50℃下真空干燥12～24h，得到溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶。
将温度敏感性水凝胶用打孔器打成圆片，然后放入到Tris-HCl缓冲溶液中进行洗脱。
所述溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的印迹因子的测定为：
将10mg的溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶和10mg的空白温度敏感性水凝胶分别放入Tris-HCl缓冲溶液中，25℃下充分溶胀24h；再将它们取出，分别放入到10mL的含5mg/mL 溶菌酶的Tris-HCl缓冲液中，25℃下静置24h；用紫外分光光度计分别测量两种缓冲液中溶菌酶浓度，其中放有溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的，其溶菌酶浓度记为x，放有空白温度敏感性水凝胶的，其溶菌酶浓度记为y，得到印迹因子F=5-x/ 5-y。
所制备的溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶印迹因子为1.94～2.33。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明提供的溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法，将分子印迹技术与温度敏感性水凝胶相结合，不仅可以提高对水溶性印迹分子，特别是对于像蛋白质这样的生物大分子的吸附与洗脱，还可以通过改变外界温度实现对对分子印迹水凝胶识别、分离过程的控制，如升高温度可使水凝胶收缩加快洗脱，降低温度可使水凝胶充分溶胀提高印迹空穴对溶菌酶分子的吸附。
本发明以氯化1-羧甲基-3-乙烯基咪唑离子液体同时具有静电和氢键双重作用方式，可以对印迹分子产生更强的吸附作用，得到最大的印迹因子为2.33；以氯化1-羧甲基-3-乙烯基咪唑离子液体为功能单体所制备的温度敏感性水凝胶可通过改变温度控制印迹分子的洗脱、识别、分离过程，提高识别效率；以氯化1-羧甲基-3-乙烯基咪唑离子液体为功能单体的溶菌酶温度敏感性分子印迹水凝胶，将对蛋白质分子印迹技术的发展提供新的思路。
本发明以氯化1-羧甲基-3-乙烯基咪唑离子液体作为功能单体、NIPAm作为支撑单体，N、N-亚甲基双丙烯酰胺（BIS）作为交联剂，过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）作为氧化还原引发剂，三羟甲基氨基甲烷与盐酸（Tris-HCl）的缓冲溶液（pH=7，10mM，25℃）为溶剂，溶菌酶（Lyz）作为印迹分子的分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法，获得的水凝胶对Lyz均具有较高的印迹效率和良好的识别效果。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
为了解决溶菌酶分子印迹聚合物的识别效率低、洗脱难的问题，本发明提供了一种以氯化1-羧甲基-3-乙烯基咪唑离子液体作为功能单体、N-异丙基丙烯酰胺（NIPAm）作为支撑单体，N、N-亚甲基双丙烯酰胺（BIS）作为交联剂，过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）作为氧化还原引发剂，三羟甲基氨基甲烷与盐酸（Tris-HCl）的缓冲溶液（pH=7，10mM，25℃）为溶剂，溶菌酶（Lyz）作为印迹分子的分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法，获得的水凝胶对Lyz均具有较高的印迹效率和良好的识别效果，Lyz分子印迹水凝胶印迹因子可高达2.33。
一种溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
（1）按照质量比1～5：100：100，将氯化1-羧甲基-3-乙烯基咪唑、NIPAm和Lyz溶解在Tris-HCl缓冲溶液中（pH=7，10mM，25℃），得到预聚体系。Tris-HCl缓冲溶液与NIPAm质量比为10：1。
（2）向步骤（1） 所得预聚体系中加入交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺（BIS），加入量为NIPAM质量的1～5%。
（3）向步骤（2）中加入引发剂过硫酸铵（APS），加入量为NIPAm质量的1～2%。
（4）将步骤（3）所得混合溶液在25℃下超声除氧20min后，通入氮气30min，然后迅速加入四甲基乙二胺（TEMED），密封。TEMED 加入量为NIPAm质量的1～2% 。25～30℃下反应3～6h，制得Lyz温度敏感性水凝胶。
作为对比例：空白温度敏感性水凝胶的制备，除在步骤（1）中不加入印迹分子Lyz外，其它步骤与步骤（1）～（4）一致。
将得到的Lyz温度敏感性水凝胶和空白温度敏感性水凝胶用打孔器打成大小均一的圆片，分别放入到含1M NaCl的Tris-HCl缓冲溶液中（pH=7，25℃），25℃下洗脱24～48h，随后再分别放入到去离子水中浸泡24h，分别取出并在 40℃下真空干燥24h，制得的Lyz温度敏感性分子印迹水凝胶和空白温度敏感性水凝胶。
将得到的Lyz温度敏感性印迹水凝胶和空白温度敏感性水凝胶称重，每片凝胶质量大约10mg。
Lyz印迹水凝胶印迹因子的测定，是将10mg的Lyz温度敏感性印迹水凝胶和10mg的空白温度敏感性水凝胶分别放入Tri-HCl缓冲溶液中（pH=7，10mM，25℃），25℃下充分溶胀24h。再将它们取出，分别放入到10mL的含5mg/mL Lyz的Tris-HCl缓冲液（pH=7，10mM，25℃）中，25℃下静置24h，用紫外分光光度计分别测量两种缓冲液中Lyz浓度，其中放有Lyz温度敏感性印迹水凝胶的，其Lyz浓度记为x，放有空白水凝胶的记为y，得到印迹因子F=5-x/ 5-y。
下面给出具体实施例。
实施例1
溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将5mg的氯化1-羧甲基-3-乙烯基咪唑、500mg的NIPAm、500mg的Lyz加入到5g的Tris-HCl缓冲溶液中（pH=7，10mM，25℃）；随后放入5mg的BIS与5mg的APS，得到的混合物溶液在25℃下，超声除氧20min后，通入氮气30min，迅速加入TEMED 5mg，密封。在25℃下反应6h，获得Lyz温度敏感性水凝胶。
空白温度敏感性水凝胶的制备不加入Lyz，其它步骤与上述一致。
将反应得到的Lyz温度敏感性水凝胶和空白温度敏感性水凝胶在25℃下，用打孔器打成大小均一的圆形片，然后分别放入到含1M NaCl的Tris-HCl缓冲溶液中（pH=7，25℃）浸泡，25℃下洗脱24h，再将它们分别放入到去离子水中浸泡24h。随后分别取出，并在40℃下真空干燥24h，制得Lyz温度敏感性分子印迹水凝胶和空白温度敏感性水凝胶。
经测定本实施例制得的Lyz分子印迹水凝胶印迹因子达1.87。
实施例2
溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将10mg的氯化1-羧甲基-3-乙烯基咪唑、500mg的NIPAm、500mg的Lyz加入到5g的Tris-HCl缓冲溶液中（pH=7，10mM，25℃），随后放入15mg的BIS与10mg的APS，得到的混合物溶液在25℃下，超声除氧20min后，通入氮气30min，迅速加入TEMED 10mg，密封。在25℃下反应6h，获得Lyz温度敏感性水凝胶。
空白温度敏感性水凝胶的制备不加入Lyz，其它步骤与上述一致。
将反应得到的Lyz温度敏感性水凝胶和空白温度敏感性水凝胶在25℃下，用打孔器打成大小均一的圆形片，然后分别放入到含1M NaCl的Tris-HCl缓冲溶液中（pH=7，25℃）浸泡，25℃下洗脱48h，再将它们分别放入到去离子水中浸泡24h。随后分别取出，并在40℃下真空干燥24h，制得Lyz温度敏感性分子印迹水凝胶和空白温度敏感性水凝胶。
经测定本实施例制得的Lyz分子印迹水凝胶印迹因子达2.33。
实施例3
溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将25mg的氯化1-羧甲基-3-乙烯基咪唑、500mg的NIPAm、500mg的Lyz加入到5g的Tris-HCl缓冲溶液中（pH=7，10mM，25℃），随后放入25mg的BIS与5mg的APS，得到的混合物溶液在25℃下，超声除氧20min后，通入氮气30min，迅速加入TEMED 5mg，密封。在25℃下反应6h，获得Lyz温度敏感性水凝胶。
空白温度敏感性水凝胶的制备不加入Lyz，其它步骤与上述一致。
将反应得到的Lyz温度敏感性水凝胶和空白温度敏感性水凝胶在25℃下，用打孔器打成大小均一的圆形片，然后分别放入到含1M NaCl的Tris-HCl缓冲溶液中（pH=7，25℃）浸泡，25℃下洗脱24h，再将它们分别放入到去离子水中浸泡24h。随后分别取出，并在40℃下真空干燥24h，制得Lyz温度敏感性分子印迹水凝胶和空白温度敏感性水凝胶。
经测定本实施例制得的Lyz分子印迹水凝胶印迹因子达2.27。
实施例4
溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将10mg的氯化1-羧甲基-3-乙烯基咪唑、500mg的NIPAm、500mg的Lyz加入到5g的Tris-HCl缓冲溶液中（pH=7，10mM，25℃），随后放入15mg的BIS与10mg的APS，得到的混合物溶液在25℃下，超声除氧20min后，通入氮气30min，迅速加入TEMED 10mg，密封。在30℃下反应3h，获得Lyz温度敏感性水凝胶。
空白温度敏感性水凝胶的制备不加入Lyz，其它步骤与上述一致。
将反应得到的Lyz温度敏感性水凝胶和空白温度敏感性水凝胶在25℃下，用打孔器打成大小均一的圆形片，然后分别放入到含1M NaCl的Tris-HCl缓冲溶液中（pH=7，25℃）浸泡，25℃下洗脱48h，再将它们分别放入到去离子水中浸泡24h。随后分别取出，并在40℃下真空干燥24h，制得Lyz温度敏感性分子印迹水凝胶和空白温度敏感性水凝胶。
经测定本实施例制得的Lyz分子印迹水凝胶印迹因子达2.11。
实施例5
溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将5mg的氯化1-羧甲基-3-乙烯基咪唑、500mg的NIPAm、500mg的Lyz加入到5g的Tris-HCl缓冲溶液中（pH=7，10mM，25℃），随后放入20mg的BIS与5mg的APS，得到的混合物溶液在25℃下，超声除氧20min后，通入氮气30min，迅速加入TEMED 5mg，密封。在25℃下反应6h，获得Lyz温度敏感性水凝胶。
空白温度敏感性水凝胶的制备不加入Lyz，其它步骤与上述一致。
将反应得到的Lyz温度敏感性水凝胶和空白温度敏感性水凝胶在25℃下，用打孔器打成大小均一的圆形片，然后分别放入到含1M NaCl的Tris-HCl缓冲溶液中（pH=7，25℃）浸泡，25℃下洗脱24h，再将它们分别放入到去离子水中浸泡24h。随后分别取出，并在40℃下真空干燥24h，制得Lyz温度敏感性分子印迹水凝胶和空白温度敏感性水凝胶。
经测定本实施例制得的Lyz分子印迹水凝胶印迹因子达1.94。
以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下操作：
1）按照1～5：100：100质量比，将功能单体氯化1-羧甲基-3-乙烯基咪唑、支撑单体N-异丙基丙烯酰胺和印迹分子溶菌酶溶解在pH=7的Tris-HCl缓冲溶液中得到预聚体系；
所述的Tris-HCl缓冲溶液与N-异丙基丙烯酰胺质量比为10：1；
2）向所得的预聚体系中加入交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺，其加入量为N-异丙基丙烯酰胺质量的1～5%；
然后加入引发剂过硫酸铵，其加入量为N-异丙基丙烯酰胺质量的1～2%，充分混合得到反应混合溶液；
3）将反应混合溶液在25～30℃下超声除氧20～30min后，通入氮气30～50min，然后迅速加入四甲基乙二胺，密封；四甲基乙二胺加入量为N-异丙基丙烯酰胺质量的1～2% ；
4）25～30℃下反应3～6h，制得温度敏感性水凝胶；
5）将得到的温度敏感性水凝胶进行洗脱：
将温度敏感性水凝胶用打孔器打成圆片，然后放入到Tris-HCl缓冲溶液中25～30℃下洗脱24～48h，随后再放入到去离子水中浸泡24h，取出后在 40～50℃下真空干燥12～24h，得到溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶。
2.如权利要求1所述的溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法，其特征在于，溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的印迹因子的测定为：
将10mg的溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶和10mg的空白温度敏感性水凝胶分别放入Tris-HCl缓冲溶液中，25℃下充分溶胀24h；再将它们取出，分别放入到10mL的含5mg/mL溶菌酶的Tris-HCl缓冲液中，25℃下静置24h；用紫外分光光度计分别测量两种缓冲液中溶菌酶浓度，其中放有溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的，其溶菌酶浓度记为x，放有空白温度敏感性水凝胶的，其溶菌酶浓度记为y，得到印迹因子F=5-x/ 5-y。
3.如权利要求1或2所述的溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶的制备方法，其特征在于，所制备的溶菌酶分子印迹温度敏感性水凝胶印迹因子为1.94～2.33。
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