CN114014913B - 醋酸曲普瑞林的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供醋酸曲普瑞林的纯化方法，属于药物化学领域，包括将曲普瑞林粗肽溶液加载到以反相聚合物为固定相的色谱柱进行一次分离纯化，收集主峰样品1，加载到以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱进行二次分离纯化，收集主峰样品2，经过自制PGMA‑PEI‑GTA阴离子交换介质进行洗脱转盐，收集主峰样品3，经冷冻干燥得到醋酸曲普瑞林纯品；PGMA‑PEI‑GTA的基质为PGMA‑EDMA，在制备PGMA‑EDMA时，在水相中加入三醋酸甘油酯和吡哆醇。本发明提供的醋酸曲普瑞林的纯化方法具有成本较低，生产周期较短，收率较高的优点。

Description

醋酸曲普瑞林的纯化方法
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及醋酸曲普瑞林的纯化方法。
背景技术
曲普瑞林，分子式C64H82N18O13，分子量1311.45，英文名：Triptorelin，商品名为色氨瑞林、达必佳、Decapeptyl等。曲普瑞林，以其醋酸盐或者巴莫酸盐的形式应用于临床，临床适应症包括前列腺癌、性早熟、辅助生殖技术，例如体外授精术、子宫内膜异位症和子宫肌瘤等。曲普瑞林是一种促性腺激素释放激素（GnRH）的类似物，主要作用于垂体前叶，大剂量应用初期可以引起一过性黄体生成素（LH）和卵泡雌激素（FSH）释放增多，后期则导致垂体敏感性降低，使LH、FSH和性激素分泌减少。
现有技术如授权公告号为CN 103012564 B的中国发明专利，公开了一种高纯度的曲普瑞林及其纯化方法。该高纯度的曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸小于0.2%；D-Arg相对于全部精氨酸小于0.2%；乙腈含量低于0.03%；甘氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸及丝氨酸经氨基酸组成检测，各氨基酸的相对比值在0.9-1.1之间。纯化方法包括步骤：（a）将待纯化的曲普瑞林用溶剂溶解，过滤得滤液；（b）将步骤（a）所得滤液加载到离子交换柱上，用流动相洗脱并使曲普瑞林转化成其盐，收集主峰流出液；（c）将步骤（b）所得流出液加载到硅胶柱上，用流动相洗脱，收集主峰洗脱液，除去溶剂，即得。该发明方法收率高，产品质量稳定，生产成本低，操作简单，适合大生产。为控制曲普瑞林原料杂质限量，提高纯度及收率，需要进一步研究分离纯化方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种醋酸曲普瑞林的纯化方法，该方法能够提高PGMA-PEI-GTA的动态载量，提高醋酸曲普瑞林的纯化收率和总收率，降低生产成本，缩短生产周期。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
提供一种醋酸曲普瑞林的纯化方法，包括以下步骤：
a、将曲普瑞林粗肽用溶剂溶解，过滤得滤液；
b、将步骤a所得滤液加载到以反相聚合物为固定相的色谱柱进行一次分离纯化，收集主峰样品1；其中，流动相A为0.15-0.40 wt%磷酸二氢钠水溶液，pH2.0-3.0；流动相B为乙腈，B相的洗脱梯度为20-40 v/v%，洗脱时间50-70 min；
c、将主峰样品1加载到以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱进行二次分离纯化，收集主峰样品2；其中，流动相A为0.1-0.15 v/v%三氟乙酸水溶液，pH2.0-3.0；流动相B为乙腈；B相的洗脱梯度为20-25 v/v%，洗脱时间50-70 min；
d、将主峰样品2经过PGMA-PEI-GTA阴离子交换介质进行洗脱转盐，收集主峰样品3，经冷冻干燥得到醋酸曲普瑞林纯品；其中，流动相为0.01-0.05 v/v%醋酸水溶液；上述阴离子交换介质的基质为PGMA-EDMA，采用原子自由基悬浮聚合法制备，制备过程中所配制的水相中还包括三醋酸甘油酯和吡哆醇。相对于无机基质填料，有机基质填料的基质微球大多是选择各种天然的多糖为原料来制备，它们对于被分离样品具有很强的负载能力及较高的色谱容量，除此之外，还具有良好的耐酸、耐碱和耐溶剂处理的化学稳定性，在生物大分子的分离方面具有比较明显的优势。制备PGMA-PEI-GTA阴离子交换介质的PGMA-EDMA基质时，在水相中加入一定的三醋酸甘油酯和吡哆醇，可以降低PGMA-EDMA微球的平均孔径并增加孔隙率，使得PGMA-EDMA微球具有较高的比表面积，使得PGMA-PEI-GTA阴离子交换介质在具有更高的离子交换容量的同时还具有较好的流通性，进而具有较高的动态载量，从而提高醋酸曲普瑞林的转盐率和纯化收率，降低生产成本，缩短生产周期。
在一些实施方式中，上述配制的水相中含有0.0005-0.001 g/mL三醋酸甘油酯。更进一步地，三醋酸甘油酯与吡哆醇的质量比为7.4-10∶1。
在一些实施方式中，上述步骤a所用溶剂为5-10 v/v%乙腈水溶液。进一步地，上述步骤a中溶剂按照0.08-0.12 g/mL的浓度溶解曲普瑞林粗肽。
在一些实施方式中，上述十八烷基硅烷键合硅胶的平均孔径为7-9 μm，特征孔径为110-150 Å。
在一些实施方式中，上述曲普瑞林粗肽采用固相逐步合成法或固相片段缩合法或液相合成法制得。进一步地，上述曲普瑞林粗肽采用固相逐步合成法制得。
在一些实施方式中，上述基质PGMA-EDMA的制备步骤包括：将PVA（聚乙烯醇）、三醋酸甘油酯、吡哆醇、SDS（十二烷基硫酸钠）溶解于去离子水中配成水相；将单体GMA（甲基丙烯酸缩水甘油酯）、交联剂EDMA（乙二醇二甲基丙烯酸酯）、致孔剂、CuBr（溴化亚铜）和BPY（联二吡啶）混合，最后加入EPB（溴代丙烯酸乙酯），对溶液充分搅拌，组成油相；在机械搅拌的条件下，边向水相中通N2排除O2边将配制的油相缓缓加入，升高温度至38-60℃，反应6-10h，用去离子水和乙醇分别洗涤2-4次，自然风干，制得PGMA-EDMA微球。进一步地，水相中含有0.03g/mL PVA。进一步地，GMA与致孔剂的体积比为1∶1-3。进一步地，上述致孔剂包括二氯甲烷和正辛醇，且二氯甲烷和正辛醇的体积比为1∶1-3。进一步地，GMA与EDMA的体积比为1-1.8∶1。
在一些实施方式中，上述PGMA-PEI-GTA阴离子交换介质的制备方法包括：取PGMA-EDMA微球4.2-5.0 g，加入40-60 mL二氧六环溶液，加入8-12 g PEI液体，在58-62℃水浴条件下振荡反应18-26 h，转速120-140 rpm，反应结束后冷却至18-28℃，然后用蒸馏水洗涤3-5次，得到PGMA-PEI微球；向PGMA-PEI微球中，加入4-6 g GTA（2,3环氧丙基三甲基氯化铵），再加入50-80 mL 0.1 M NaOH，在58-62℃水浴条件下振荡反应18-26 h，转速120-140rpm，反应结束后，蒸馏水洗涤3-5次。
本发明还提供一种醋酸曲普瑞林的制备方法，包括以下步骤：
S1、采用固相逐步合成法制得曲普瑞林粗品；
S2、采用上述一种醋酸曲普瑞林的纯化方法对曲普瑞林粗品纯化，得到醋酸曲普瑞林。
在一些实施方式中，上述步骤S1具体包括：
1）将Rink Amide AM树脂用DCM（二氯甲烷）浸泡30-60 min，抽除溶剂，得到活化的树脂；
2）向活化的树脂中加入18-22 v/v%哌啶的DMF（二甲基甲酰胺）溶液在18-28℃下振荡反应10-60 min，抽滤、洗涤树脂，得到脱帽的树脂，然后加入溶解于DMF的Fmoc-Gly-OH、HBTU（O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯）、HOBT（1-羟基苯并三唑）和DIEA（二异丙基乙胺）的混合物在18-60℃下振荡反应0.5-1.5 h后，抽滤、洗涤树脂，得到Fmoc-Gly-树脂；
3）向Fmoc-Gly-树脂中加入18-22 v/v%哌啶的DMF（二甲基甲酰胺）溶液在18-28℃下振荡反应10-60 min，抽滤、洗涤树脂，然后加入溶解于DMF的Fmoc-Pro-OH、HBTU、HOBT和DIEA的混合物在18-60℃下振荡反应0.5-1.5 h后，抽滤、洗涤树脂，得到Fmoc-Pro-Gly-树脂；
4）循环重复步骤2），并且在循环顺序中偶联反应依次用下列被保护氨基酸替换Fmoc-Pro-OH：Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH和H-Pyr-OH，得到H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂；
5）用切割液切割H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂，得到曲普瑞林粗肽。
在一些实施方式中，上述洗涤树脂的具体步骤包含：取反应溶剂已经被抽干的树脂，依次用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别洗涤2-3次，每次不少于5min。
在一些实施方式中，上述步骤2）中Fmoc-Gly-OH、DIEA、HBTU、HOBT的摩尔比为1∶2-5∶1-3∶1-3。
在一些实施方式中，上述Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、H-Pyr-OH与树脂的摩尔比均为2-6∶1。
在本发明中提及的Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、H-Pyr-OH与树脂的摩尔比，指的是Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、H-Pyr-OH与制备曲普瑞林时所使用的Rink Amide AM树脂的总取代度的比值。
在一些实施方式中，上述切割液包括三氟乙酸、对甲苯磺酸乙酯、4-氨基苯乙醚、水，对应的体积比为90-95∶2-4∶1-3∶1-3。切割液中一定量对甲苯磺酸乙酯、4-氨基苯乙醚的加入，能够促进多肽从树脂上切割下来，并减少切割过程中副产物的生成，从而提高醋酸曲普瑞林的产率。
在一些实施方式中，上述步骤5）具体包括：向H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂中加入预冷至0-10℃的切割液，18-28℃搅拌反应1-2h后，抽滤，将滤液减压浓缩至体积不再减少，加入无水乙醚沉淀，离心，弃去上清，沉淀冷冻干燥，得到曲普瑞林粗肽。进一步地，上述无水乙醚与滤液的体积比为25-45∶1。
本发明由于在制备PGMA-PEI-GTA阴离子交换介质的PGMA-EDMA基质时，在水相中加入一定的三醋酸甘油酯和与吡哆醇，因而具有如下有益效果：可以降低PGMA-EDMA微球的平均孔径并增加孔隙率，使得PGMA-EDMA微球具有较高的比表面积，使得PGMA-PEI-GTA阴离子交换介质在具有更高的离子交换容量的同时还具有较好的流通性，进而具有较高的动态载量，从而提高醋酸曲普瑞林的转盐率和纯化收率。
本发明由于切割液中包括体积比为90-95∶2-4∶1-3∶1-3的三氟乙酸、对甲苯磺酸乙酯、4-氨基苯乙醚、水，因而具有如下有益效果：能够促进多肽及多肽的侧链保护基从树脂上切割下来，减少切割过程中副产物的生成，从而提高醋酸曲普瑞林的产率。
因而，本发明是一种成本较低，生产周期较短，收率较高的醋酸曲普瑞林的纯化方法。
附图说明
图1为本发明试验例1中残留树脂百分比的测定结果；
图2为本发明试验例1中微球平均孔径的测试结果；
图3为本发明试验例1中PGMA-EDMA微球孔隙率的测试结果；
图4为本发明试验例1中PGMA-EDMA微球比表面积的测试结果；
图5为本发明试验例1中压力-流速曲线的测定结果；
图6为本发明试验例1中离子交换容量的测定结果；
图7为本发明试验例1中动态载量的测定结果；
图8为本发明试验例1中醋酸曲普瑞林的总产率的测定结果；
图9为本发明试验例1中转盐收率的测定结果；
图10为本发明试验例1中纯化收率的测定结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
1.一种曲普瑞林粗肽的制备方法，制备的具体步骤包括：
1.1将15 g Rink Amide AM树脂（交联1 m/m%二乙烯基苯，取代度0.8 mmol/g，200目，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）用180 mL DCM浸泡40 min，抽干，得到活化的树脂。
1.2向活化的树脂中加入200 mL 20 v/v%哌啶的DMF溶液在25℃下振荡反应40min，抽滤，依次用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别洗涤3次，每次6min，得到脱帽的树脂；然后将50 mmol Fmoc-Gly-OH、70 mmol HBTU、70 mmol HOBT溶解于200 mL DMF，再加入0.12 mol DIEA搅拌混匀后，加入树脂中，在50℃下振荡反应1 h后，抽滤，依次用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别洗涤3次，每次6 min，得到Fmoc-Gly-树脂。
1.3向Fmoc-Gly-树脂中加入200 mL 20v/v%哌啶的DMF溶液在25℃下振荡反应40min，抽滤，依次用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别洗涤3次，每次6 min，然后将50 mmolFmoc-Pro-OH、70 mmol HBTU、70 mmol HOBT溶解于200 mL DMF，再加入0.12 mol DIEA搅拌混匀后，加入树脂中，在50℃下振荡反应1 h后，抽滤，依次用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别洗涤3次，每次6 min，得到Fmoc-Pro-Gly-树脂。
1.4循环重复步骤1.3，并且在循环顺序中偶联反应依次用下列被保护氨基酸替换Fmoc-Pro-OH：Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH和H-Pyr-OH，得到H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。
1.5向H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂中加入预冷至4℃的切割液（95 v/v%三氟乙酸、2 v/v%对甲苯磺酸乙酯、2 v/v% 4-氨基苯乙醚、1 v/v%水），20℃搅拌反应1 h后，抽滤，将滤液减压浓缩至体积不再减少，加入40倍滤液体积的无水乙醚沉淀，4000 r/min离心3 min，弃去上清，沉淀冷冻干燥，得到曲普瑞林粗肽。
实施例2：
1.一种阴离子交换介质的制备方法，包括：
1.1称取15 g聚乙烯醇、0.25 g三醋酸甘油酯、0.028 g吡哆醇和0.5 g十二烷基硫酸钠溶于500 mL去离子水中，待完全溶解后倒入1L反应烧瓶内，即得水相备用；将15 mLGMA单体、10 mL EDMA混合，然后加入11.45 mL二氯甲烷和23.33 mL正辛醇，再加入0.5 gCuBr和5 g BPY，最后加入1 mL EPB并用磁力搅拌装置对溶液充分搅拌，得到油相；边向水相中通N2排除烧瓶中的O2边将配制的油相缓缓加入反应烧瓶内，分别设定搅拌速度和温度为170r/min、48℃，反应8 h后关闭搅拌仪器和加热设备，即得PGMA-EDMA微球，然后用去离子水和乙醇分别洗涤3次，自然风干后密封储存备用。
1.2取PGMA-EDMA微球5 g，加入50 mL二氧六环溶液，加入10 g PEI液体，在60℃水浴条件下振荡反应22 h，转速140 rpm，反应结束后冷却至25℃，然后用蒸馏水洗涤3次，得到PGMA-PEI微球。
1.3向得到的PGMA-PEI微球中，加入5 g GTA，再加入50 mL 0.1 M NaOH，在60℃水浴条件下振荡反应22 h，转速140 rpm，反应结束后，蒸馏水洗涤3次，得到PGMA-PEI-GTA阴离子交换介质。
2.一种醋酸曲普瑞林的纯化方法，包括以下步骤：
2.1粗肽的溶解：取实施例1制得的曲普瑞林粗肽加入到5 v/v%乙腈水溶液中溶解，配制得到0.1 g/mL的曲普瑞林粗肽溶液，用0.45 μm膜过滤，得到滤液。
2.2一次纯化：色谱柱：以反相聚合物（UniPS10-100，购自苏州纳微生物科技有限公司）为固定相，柱子：15 cm×25 cm；流动相A：0.2 wt%磷酸二氢钠水溶液，用磷酸调节pH至2.5；流动相B：乙腈；流速：500 mL/min；检测波长：230 nm；进样量：22 g滤液；梯度：B%：20-40 v/v%；线性洗脱60 min。
纯化过程：将色谱柱用80 v/v%乙腈+20 v/v%流动相A冲洗干净后平衡上样，线性梯度洗脱60 min，收集目标峰，收集纯度大于94%，单杂小于1%的样品，将纯度小于94%大于70%的样品再次纯化后合并，减压旋蒸浓缩至50 mg/mL，得到样品溶液1。
2.3二次纯化：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶（平均孔径为8 μm，特征孔径为120 Å，购自北京科益恒达科技有限公司）为固定相；柱子：15 cm×25 cm；流动相A：0.12 v/v%三氟乙酸水溶液，用三乙胺调节pH至2.8；流动相B：乙腈；流速：500 mL/min；检测波长：230 nm；进样量：400 mL样品溶液1；梯度：B%：20-25 v/v%，线性洗脱60 min。
纯化过程：将色谱柱用80 v/v%乙腈+20 v/v%流动相A冲洗干净后平衡上样，线性梯度洗脱60 min，收集目标峰，收集纯度大于99.9%，单杂小于0.02%的样品，将不合格样品合并按上述步骤再次纯化后合并，最后减压旋蒸浓缩至50 mg/mL，得到样品溶液2。
2.4转盐、冻干：色谱柱：以上述1中自制PGMA-PEI-GTA阴离子交换介质为固定相；柱子：150 mm×250 mm；流动相：0.05 v/v%醋酸水溶液；流速：450 mL/min；检测波长：230nm；进样量：200 mL样品溶液2。
转盐过程：将色谱柱用去离子水平衡后上样，上样量为200 mL样品溶液2。0.05 v/v%醋酸水溶液洗脱60 min，收集目标峰，将收集的目标肽溶液合并，减压旋蒸浓缩至90 mg/mL，冷冻干燥后得到醋酸曲普瑞林纯品。利用高效液相色谱检测（HPLC）醋酸曲普瑞林纯品：色谱条件：色谱柱：XTERRA®RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.068 mol/L磷酸盐缓冲液（0.034 mol/L KH2PO4和0.034 mol/L Na2HPO4的水溶液，调节pH值至6.85）为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱程序见表1；检测波长：220 nm；柱温：35℃；流速：1.5 mL/min；进样量：10 μL。HPLC检测醋酸曲普瑞林的纯度为99.96%，最大单杂0.015%，纯化收率94.3%。
表1 梯度洗脱程序
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
实施例3：
1.5向H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂中加入预冷至4℃的切割液（95 v/v%三氟乙酸、3 v/v%对甲苯磺酸乙酯、1 v/v% 4-氨基苯乙醚、1v/v%水），20℃搅拌反应1 h后，抽滤，将滤液减压浓缩至体积不再减少，加入40倍滤液体积的无水乙醚沉淀，4000 r/min离心3 min，弃去上清，沉淀冷冻干燥，得到曲普瑞林粗肽。其余部分和实施例1完全一致。
实施例4：
1.5向H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂中加入预冷至4℃的切割液（95 v/v%三氟乙酸、2.5 v/v%对甲苯磺酸乙酯、1.5 v/v% 4-氨基苯乙醚、1 v/v%水），20℃搅拌反应1 h后，抽滤，将滤液减压浓缩至体积不再减少，加入40倍滤液体积的无水乙醚沉淀，4000 r/min离心3 min，弃去上清，沉淀冷冻干燥，得到曲普瑞林粗肽。其余部分和实施例1完全一致。
实施例5：
1.5向H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂中加入预冷至4℃的切割液（95 v/v%三氟乙酸、4 v/v% 4-氨基苯乙醚、1 v/v%水），20℃搅拌反应1 h后，抽滤，将滤液减压浓缩至体积不再减少，加入40倍滤液体积的无水乙醚沉淀，4000 r/min离心3 min，弃去上清，沉淀冷冻干燥，得到曲普瑞林粗肽。其余部分和实施例1完全一致。
实施例6：
1.5向H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂中加入预冷至4℃的切割液（95 v/v%三氟乙酸、4 v/v%对甲苯磺酸乙酯、1 v/v%水），20℃搅拌反应1 h后，抽滤，将滤液减压浓缩至体积不再减少，加入40倍滤液体积的无水乙醚沉淀，4000 r/min离心3 min，弃去上清，沉淀冷冻干燥，得到曲普瑞林粗肽。其余部分和实施例1完全一致。
实施例7：
1.5向H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂中加入预冷至4℃的切割液（95 v/v%三氟乙酸、5 v/v%水），20℃搅拌反应1 h后，抽滤，将滤液减压浓缩至体积不再减少，加入40倍滤液体积的无水乙醚沉淀，4000 r/min离心3 min，弃去上清，沉淀冷冻干燥，得到曲普瑞林粗肽。其余部分和实施例1完全一致。
实施例8：
1.5向H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂中加入预冷至4℃的切割液（95 v/v%三氟乙酸、2 v/v%苯甲硫醚、2 v/v%乙二硫醇、1 v/v%水），20℃搅拌反应1h后，抽滤，将滤液减压浓缩至体积不再减少，加入40倍滤液体积的无水乙醚沉淀，4000r/min离心3min，弃去上清，沉淀冷冻干燥，得到曲普瑞林粗肽。其余部分和实施例1完全一致。
实施例9：
1.1称取15 g聚乙烯醇、0.25 g三醋酸甘油酯、0.031 g吡哆醇和0.5 g十二烷基硫酸钠溶于500 mL去离子水中，待完全溶解后倒入1L反应烧瓶内，即得水相备用；将15 mLGMA单体、10 mL EDMA混合，然后加入11.45 mL二氯甲烷和23.33 mL正辛醇，再加入0.5 gCuBr和5 g BPY，最后加入1 mL EPB并用磁力搅拌装置对溶液充分搅拌，得到油相；边向水相中通N2排除烧瓶中的O2边将配制的油相缓缓加入反应烧瓶内，分别设定搅拌速度和温度为170 r/min、48℃，反应8 h后关闭搅拌仪器和加热设备，即得PGMA-EDMA微球，然后用去离子水和乙醇分别洗涤3次，自然风干后密封储存备用。其余部分和实施例2完全一致。
实施例10：
1.1称取15 g聚乙烯醇、0.25 g三醋酸甘油酯、0.025 g吡哆醇和0.5 g十二烷基硫酸钠溶于500 mL去离子水中，待完全溶解后倒入1L反应烧瓶内，即得水相备用；将15 mLGMA单体、10 mL EDMA混合，然后加入11.45 mL二氯甲烷和23.33 mL正辛醇，再加入0.5 gCuBr和5g BPY，最后加入1 mL EPB并用磁力搅拌装置对溶液充分搅拌，得到油相；边向水相中通N2排除烧瓶中的O2边将配制的油相缓缓加入反应烧瓶内，分别设定搅拌速度和温度为170 r/min、48℃，反应8 h后关闭搅拌仪器和加热设备，即得PGMA-EDMA微球，然后用去离子水和乙醇分别洗涤3次，自然风干后密封储存备用。其余部分和实施例2完全一致。
实施例11：
1.1称取15 g聚乙烯醇、0.25 g三醋酸甘油酯、0.02 g吡哆醇和0.5 g十二烷基硫酸钠溶于500mL去离子水中，待完全溶解后倒入1 L反应烧瓶内，即得水相备用；将15 mLGMA单体、10 mL EDMA混合，然后加入11.45 mL二氯甲烷和23.33 mL正辛醇，再加入0.5 gCuBr和5 g BPY，最后加入1 mL EPB并用磁力搅拌装置对溶液充分搅拌，得到油相；边向水相中通N2排除烧瓶中的O2边将配制的油相缓缓加入反应烧瓶内，分别设定搅拌速度和温度为170 r/min、48℃，反应8 h后关闭搅拌仪器和加热设备，即得PGMA-EDMA微球，然后用去离子水和乙醇分别洗涤3次，自然风干后密封储存备用。其余部分和实施例2完全一致。
实施例12：
1.1称取15 g聚乙烯醇、0.25 g三醋酸甘油酯、0.038 g吡哆醇和0.5 g十二烷基硫酸钠溶于500 mL去离子水中，待完全溶解后倒入1 L反应烧瓶内，即得水相备用；将15 mLGMA单体、10 mL EDMA混合，然后加入11.45 mL二氯甲烷和23.33 mL正辛醇，再加入0.5 gCuBr和5 g BPY，最后加入1 mL EPB并用磁力搅拌装置对溶液充分搅拌，得到油相；边向水相中通N2排除烧瓶中的O2边将配制的油相缓缓加入反应烧瓶内，分别设定搅拌速度和温度为170 r/min、48℃，反应8 h后关闭搅拌仪器和加热设备，即得PGMA-EDMA微球，然后用去离子水和乙醇分别洗涤3次，自然风干后密封储存备用。其余部分和实施例2完全一致。
实施例13：
1.1称取15 g聚乙烯醇、0.25 g三醋酸甘油酯和0.5 g十二烷基硫酸钠溶于500 mL去离子水中，待完全溶解后倒入1L反应烧瓶内，即得水相备用；将15 mL GMA单体、10 mLEDMA混合，然后加入11.45 mL二氯甲烷和23.33 mL正辛醇，再加入0.5 g CuBr和5 g BPY，最后加入1 mL EPB并用磁力搅拌装置对溶液充分搅拌，得到油相；边向水相中通N2排除烧瓶中的O2边将配制的油相缓缓加入反应烧瓶内，分别设定搅拌速度和温度为170 r/min、48℃，反应8 h后关闭搅拌仪器和加热设备，即得PGMA-EDMA微球，然后用去离子水和乙醇分别洗涤3次，自然风干后密封储存备用。其余部分和实施例2完全一致。
实施例14：
1.1称取15 g聚乙烯醇、0.028 g吡哆醇和0.5 g十二烷基硫酸钠溶于500 mL去离子水中，待完全溶解后倒入1 L反应烧瓶内，即得水相备用；将15 mL GMA单体、10 mL EDMA混合，然后加入11.45 mL二氯甲烷和23.33 mL正辛醇，再加入0.5 g CuBr和5 g BPY，最后加入1 mL EPB并用磁力搅拌装置对溶液充分搅拌，得到油相；边向水相中通N2排除烧瓶中的O2边将配制的油相缓缓加入反应烧瓶内，分别设定搅拌速度和温度为170 r/min、48℃，反应8 h后关闭搅拌仪器和加热设备，即得PGMA-EDMA微球，然后用去离子水和乙醇分别洗涤3次，自然风干后密封储存备用。其余部分和实施例2完全一致。
实施例15：
1.1称取15 g聚乙烯醇、0.5 g十二烷基硫酸钠溶于500 mL去离子水中，待完全溶解后倒入1L反应烧瓶内，即得水相备用；将15 mL GMA单体、10 mL EDMA混合，然后加入11.45 mL二氯甲烷和23.33 mL正辛醇，再加入0.5 g CuBr和5 g BPY，最后加入1 mL EPB并用磁力搅拌装置对溶液充分搅拌，得到油相；边向水相中通N2排除烧瓶中的O2边将配制的油相缓缓加入反应烧瓶内，分别设定搅拌速度和温度为170 r/min、48℃，反应8 h后关闭搅拌仪器和加热设备，即得PGMA-EDMA微球，然后用去离子水和乙醇分别洗涤3次，自然风干后密封储存备用。其余部分和实施例2完全一致。
试验例1：
1.1切割效果的测定：分别称量实施例1，实施例3-8中H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂切割前后的树脂的质量，按照下式计算残留树脂百分比：
残留树脂百分比=（切割后的树脂的质量/切割前的树脂的质量）×100%。残留树脂百分比的测定结果见图1，其中，A为实施例1，C为实施例3，D为实施例4，E为实施例5，F为实施例6，G为实施例7，H为实施例8。
1.2微球比表面积及孔径测定：
用Brunauer-Emmett-Teller (BET)氮吸附/解吸量子吸附测量仪（美国）在60℃下测量上述实施例2，实施例9-15的PGMA-EDMA微球孔径分布。样品在数据收集之前先在真空脱气24h。PGMA-EDMA微球平均孔径的测试结果见图2，其中，B为实施例2，I为实施例9，J为实施例10，K为实施例11，L为实施例12，M为实施例13，N为实施例14，O为实施例15。PGMA-EDMA微球孔隙率的测试结果见图3，其中，B为实施例2，I为实施例9，J为实施例10，K为实施例11，L为实施例12，M为实施例13，N为实施例14，O为实施例15。PGMA-EDMA微球比表面积的测试结果见图4，其中，B为实施例2，I为实施例9，J为实施例10，K为实施例11，L为实施例12，M为实施例13，N为实施例14，O为实施例15。
1.3压力-流速曲线测定：将制备的PGMA-PEI-GTA微球以20 v/v%乙醇为匀浆液进行超声匀浆20 min，让后把匀浆液倒入体积为50 mL的匀浆罐中，用装柱机将匀浆液加入10mm×4.6 mm不锈钢柱中，以10 MPa压力装柱45 min。然后以20 v/v%乙醇为流动相测试不同流速下其背压。压力-流速曲线的测定结果见图5，其中，B为实施例2，I为实施例9，J为实施例10，K为实施例11，L为实施例12，M为实施例13，N为实施例14，O为实施例15。
1.4离子交换容量的测定：取一定体积（V6）PGMA-PEI-GTA微球装入层析柱中。用30mL 0.5 mol/L NaOH溶液清洗转型。再用去离子水洗至中性。用酸式滴定管量取25 mL 0.1mol/L盐酸标准溶液加入，流速控制在0.65 mL/min，收集淋洗液。用50 mL的中性NaCl溶液（浓度1.0 mol/L）清洗没有反应的酸，包括清洗残存在各玻璃管壁上的盐酸，收集清洗液，与原先盐酸的淋洗液混合在一起。向混合液滴加1滴酚酞，用浓度为0.1 mol/L NaOH进行酸碱滴定至混合液由透明变为粉色。测定的离子交换容量的公式如下：
C 6=（C HCl×V HCl-C NaOH×V NaOH）/V 6
其中，C6为离子交换容量（mol/L）；
CHCl为标准盐酸的浓度（mol/L）；
VHCl为用去的标准盐酸的体积（mL）；
CNaOH为氢氧化钠滴定溶液的浓度（mol/L）；
VNaOH为氢氧化钠溶液滴定时用掉的体积（mL）；
V6为测定用的微球的体积（mL）。离子交换容量的测定结果见图6，其中，B为实施例2，I为实施例9，J为实施例10，K为实施例11，L为实施例12，M为实施例13，N为实施例14，O为实施例15。
1.5动态载量测定：在进行分离纯化时，其介质的性能主要受动态载量影响。在测定离子交换介质的动态载量时常用的方法是迎头法，首先把1mL装填阴离子交换介质的预装柱接到ÄKTA Purifier 10层析系统上，用缓冲液A（0.05 mol/L Tris-HCl，pH=7.5）平衡预装柱，平衡完预装柱后，通过泵头进样的方式，用一定浓度的BSA进样。进完样后，再用缓冲液A冲洗预装柱，冲洗到紫外吸收曲线稳定后，用洗脱液B（0.05 mol/L Tris-HCl+1 mol/L NaCl，pH=7.5）冲洗预装柱，对预装柱进行洗脱。动态载量结果用穿透曲线50%时的体积进行计算，阴离子交换介质的动态载量的结果如下：
Q=[CR(V50-V0)]/V介质
Q为介质的动态载量（mg/mL）；
CR为上样蛋白的浓度（mg/mL）；
V50为蛋白出口浓度达到初始浓度 50%的体积（mL）；
V0为层析系统管路的死体积（mL）；
V介质为所用层析介质的体积（mL）。动态载量的测定结果见图7，其中，B为实施例2，I为实施例9，J为实施例10，K为实施例11，L为实施例12，M为实施例13，N为实施例14，O为实施例15。
1.6产率的测定：将实施例1、实施例3-8制得的曲普瑞林粗肽按照实施例2的方法进行纯化后，采用HPLC进行定量检测，计算醋酸曲普瑞林的总产率。醋酸曲普瑞林的总产率的测定结果见图8，其中，A为实施例1，C为实施例3，D为实施例4，E为实施例5，F为实施例6，G为实施例7，H为实施例8。
利用HPLC分别将实施例2、实施例9-15中二次纯化后及转盐后的样品进行定量检测，计算转盐收率及纯化收率。转盐收率的测定结果见图9，其中，B为实施例2，I为实施例9，J为实施例10，K为实施例11，L为实施例12，M为实施例13，N为实施例14，O为实施例15。纯化收率的测定结果见图10，其中，B为实施例2，I为实施例9，J为实施例10，K为实施例11，L为实施例12，M为实施例13，N为实施例14，O为实施例15。
由图1，图8可以看出，与实施例5、实施例6、实施例7、实施例8相比，实施例1、实施例3、实施例4的残留树脂百分比明显较小，醋酸曲普瑞林的总产率明显较高，这说明：切割液中加入一定量对甲苯磺酸乙酯、4-氨基苯乙醚，能够促进多肽从树脂上切割下来，并减少切割过程中副产物的生成，进而提高醋酸曲普瑞林的产率。
由图2、图3、图4可以看出，与实施例11、实施例12、实施例13、实施例14、实施例15相比，实施例2、实施例9、实施例10的平均孔径较小，孔隙率和比表面积较大；由图5可以看出，随着流速的增大，实施例2、实施例9-15的阴离子介质都能保持良好的线性关系，说明都具有良好的机械强度，实施例2、实施例9、实施例10的压力-流速曲线较为接近，实施例11、实施例12、实施例13、实施例14、实施例15的压力-流速曲线较为接近，在流速达到3000 cm/h时，实施例2的背压最大，为0.305 MPa，实施例15的背压最小，为0.251 MPa，两者相差较小，都具有良好的通透性；由图6、图7、图9、图10可以看出，与实施例11、实施例12、实施例13、实施例14、实施例15相比，实施例2、实施例9、实施例10的离子交换容量、动态载量、转盐收率、纯化收率均明显较大，这说明：制备PGMA-PEI-GTA阴离子交换介质的PGMA-EDMA基质时，在水相中质量比为7.4-10∶1的三醋酸甘油酯和吡哆醇，可以降低PGMA-EDMA微球的平均孔径并增加孔隙率，使得PGMA-EDMA微球具有较高的比表面积，使得PGMA-PEI-GTA阴离子交换介质在具有更高的离子交换容量的同时还具有较好的流通性，进而具有较高的动态载量，从而提高醋酸曲普瑞林的转盐率和纯化收率。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (5)

1.一种醋酸曲普瑞林的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将曲普瑞林粗肽用溶剂溶解，过滤得滤液；
b、将步骤a所得滤液加载到以反相聚合物为固定相的色谱柱进行一次分离纯化，收集主峰样品1；其中，流动相A为0.15-0.40 wt%磷酸二氢钠水溶液，pH2.0-3.0；流动相B为乙腈，B相的洗脱梯度为20-40 v/v%，洗脱时间50-70 min；
c、将主峰样品1加载到以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱进行二次分离纯化，收集主峰样品2；其中，流动相A为0.1-0.15 v/v%三氟乙酸水溶液，pH2.0-3.0；流动相B为乙腈；B相的洗脱梯度为20-25 v/v%，洗脱时间50-70 min；
d、将主峰样品2经过PGMA-PEI-GTA阴离子交换介质进行洗脱转盐，收集主峰样品3，经冷冻干燥得到醋酸曲普瑞林纯品；其中，流动相为0.01-0.05 v/v%醋酸水溶液；所述阴离子交换介质的基质为PGMA-EDMA，采用原子自由基悬浮聚合法制备，制备过程中所配制的水相中还包括三醋酸甘油酯和吡哆醇；所述水相中三醋酸甘油酯的含量为0.0005-0.001 g/mL；所述三醋酸甘油酯与吡哆醇的质量比为7.4-10∶1；
基质PGMA-EDMA的制备步骤包括：将PVA、三醋酸甘油酯、吡哆醇、SDS溶解于去离子水中配成水相；将单体GMA、交联剂EDMA、致孔剂、CuBr和BPY混合，最后加入EPB，对溶液充分搅拌，组成油相；在机械搅拌的条件下，边向水相中通N2排除O2边将配制的油相缓缓加入，升高温度至38-60℃，反应6-10 h，用去离子水和乙醇分别洗涤2-4次，自然风干，制得PGMA-EDMA微球；所述水相中含有0.03g/mL PVA；所述GMA与致孔剂的体积比为1∶1-3；所述致孔剂包括二氯甲烷和正辛醇，且二氯甲烷和正辛醇的体积比为1∶1-3；所述GMA与EDMA的体积比为1-1.8∶1；
所述PGMA-PEI-GTA阴离子交换介质的制备方法包括：取PGMA-EDMA微球4.2-5.0 g，加入40-60 mL二氧六环溶液，加入8-12 g PEI液体，在58-62℃水浴条件下振荡反应18-26 h，转速120-140 rpm，反应结束后冷却至18-28℃，然后用蒸馏水洗涤3-5次，得到PGMA-PEI微球；向PGMA-PEI微球中，加入4-6 g GTA，再加入50-80 mL 0.1 M NaOH，在58-62℃水浴条件下振荡反应18-26 h，转速120-140 rpm，反应结束后，蒸馏水洗涤3-5次。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述步骤a所用溶剂为5-10 v/v%乙腈水溶液。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述曲普瑞林粗肽采用固相逐步合成法或固相片段缩合法或液相合成法制得。
4.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：所述步骤a中溶剂按照0.08-0.12 g/mL的浓度溶解曲普瑞林粗肽。
5.一种醋酸曲普瑞林的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采用固相逐步合成法制得曲普瑞林粗品；
S2、采用权利要求1-4任一项中所述的纯化方法对曲普瑞林粗品纯化，得到醋酸曲普瑞林。
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