CN103923263B

CN103923263B - 一种快流速温敏型超大孔生物分离介质的制备方法

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Publication number: CN103923263B
Application number: CN201410142858.1A
Authority: CN
Inventors: 曲剑波; 陈艳丽; 宦关生; 张晓云; 黄方
Original assignee: China University of Petroleum East China
Current assignee: China University of Petroleum East China
Priority date: 2014-04-10
Filing date: 2014-04-10
Publication date: 2016-01-13
Anticipated expiration: 2034-04-10
Also published as: CN103923263A

Abstract

本发明涉及功能高分子材料与生物分离领域，特别涉及一种快流速温敏型超大孔生物分离介质的制备方法，首先通过Friedel–Crafts反应在超大孔聚苯乙烯（PS）微球表面引入原子转移自由基聚合反应（ATRP）引发剂，然后利用非均相ATRP反应在超大孔PS微球表面接枝温敏性聚合物刷，得到温敏型超大孔生物分离介质。通过选择疏水性单体、pH敏感性单体与温敏单体混合，还可以制得兼具疏水作用与离子交换作用的温敏型超大孔生物分离介质。在优化的反应条件下接枝的温敏聚合物刷不仅温度响应性好，而且能保持PS微球的超大孔结构。初步的分离实验结果表明，仅通过改变温度该温敏型超大孔生物分离介质就能在1806？cm/h下将两种蛋白混合物分开，说明制备的快流速温敏型超大孔生物分离介质在规模化蛋白分离纯化领域很有潜力。

Description

一种快流速温敏型超大孔生物分离介质的制备方法

技术领域

本发明属于功能高分子材料与生物分离领域，特别涉及一种快流速温敏型超大孔生物分离介质及其制备方法。

背景技术

多肽和蛋白质等生物分子目前主要通过反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱等模式中的一种或它们的组合来得到分离。其中反相色谱是分离、纯化和研究多肽中应用最广的色谱技术之一，然而有机溶剂的使用可能会导致多肽生物活性的损失以及进一步应用。疏水色谱虽然无有机溶剂的加入，但蛋白质和多肽与固定相的疏水作用，是靠流动相中高盐浓度制造的“盐析”效应来促进的，这个过程容易引起蛋白质结构的变化，导致产品收率和生物活性降低。与疏水色谱相反，在离子交换色谱中通过静电力结合到固定相上的蛋白质和多肽是通过提高流动相中的盐浓度来洗脱的，盐浓度梯度的变化同样容易导致生物分子活性损失。上述传统色谱技术在分离生物大分子方面的局限性促进了科研人员对新型色谱分离模式的开发热情。

温敏性聚合物由于能对外界微小的刺激（温度）产生明显的物理化学性质改变（亲水疏水，溶胀收缩），已经在药物控释、生物偶联、传感器、微流控、细胞培养基等领域得到了广泛应用（Adv.Funct.Mater.,2006,16:1865-1872）。利用温敏聚合物制备的温敏型固定相是近年来出现的一种新型分离介质，与常规介质的小分子配基不同，其配基是聚合物高分子链。由于高分子链能在低临界溶解温度（LCST）附近发生明显的聚合物链伸展收缩变化（即在不改变流动相组成的情况下固定相表面发生亲水疏水性质转变），在分离结构复杂、稳定性差、具有生物活性的昂贵生物分子和药物时同样具有很大潜力，近年来受到极大关注（Anal.Methods,2012,4:34-43）。除了温度梯度，在温敏聚合物中添加修饰组分以增强疏水力或引入静电力也可以有效提高分离效果。利用温敏型/pH敏感型聚合物固定相分离类固醇（Langmuir,2011,27,10830-10839）、蛋白质（I&ECRes.,2012,51:3015-3022）、多肽（J.Chromatogr.A,2011,1218:2079-2084）、寡核苷酸（LabChip,2006,6:526-533）在最近的文献中都有报道。温敏型介质分离生物活性物质的主要优势在于生物分子活性损失少、分离成本低、环境友好毒性低（不需要有机溶剂）、易于操作，被称为“绿色”固定相，有望成为新一代生物分离介质。

目前温敏功能层主要通过以下三种方法结合到分离基质表面：原位聚合法(J.Chromatogr.A,2011,1218:2079-2084)、化学接枝法(J.Chromatogr.A,2009,1216:8722-8729)和原子转移自由基聚合方法（ATRP）(Langmuir,2011,27:10830-10839)。前两种方法，聚合物链长度、接枝密度都无法有效控制，温度敏感性不强，并且均用于分析色谱模式，分离时间长，处理量低。ATRP反应是一种有效、便捷的制备活性高分子聚合物和设计高分子的方法，反应条件温和，适用单体范围广泛，聚合物分子量和结构可控，利用其接枝温敏聚合物刷可以有效提高分离效率（Langmuir,2011,27,10830-10839）。

虽然温敏型聚合物在生物分离领域展现了良好的前景，但大多用于分析模式，随着人们对食品医药领域生物活性产品需求的增加（2012年市场份额大于1000亿美元），亟需一种成本低、效率高的制备性分离介质的诞生，温敏型分离介质在这方面具有很大的潜力。但温敏型分离介质作为一种有效的工业分离手段还有待时日，主要存在以下问题：1）大多数温敏型介质孔径小（<30nm），传质速率慢，处理量低，只能用于分析模式，并且在分离蛋白等生物大分子方面的报道较少；2）文献中温敏型介质的基质主要以硅胶和多糖软凝胶为主。前者化学稳定性差，不耐酸碱，工业应用时清洗困难；后者机械强度低，只能在低压下使用，分离速度慢，很难工业放大。

发明内容

本发明针对现有温敏型生物分离介质存在的问题，采用超大孔聚苯乙烯微球为基质，通过选择温敏性单体或温敏性单体与其它功能单体复合，利用ATRP反应在其表面接枝温敏功能聚合物刷，得到一种快流速温敏型超大孔生物分离介质，该介质机械强度高，生物相容性好，介质的超大孔道有效克服了现有层析介质由于孔道狭窄很难进行蛋白质快速分离的问题，能够实现蛋白质等生物大分子的快速分离和规模化制备，可广泛用于生物分离及医药食品领域，在生物大分子分离工程领域具有很大的潜力和优势。

本发明提出了一种快流速温敏型超大孔生物分离介质的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：参考文献方法（离子交换与吸附,2005,21(4):289-296），在酸性催化剂作用下，利用Friedel-Crafts反应将超大孔聚苯乙烯微球的苯环卤烷基酰化或卤甲基化，得到具备下述通式的物质A：

其中R可为H₂CC=O，CH₂，(CH₃)₂CC=O，X可为Cl，Br。A的功能基团RX为卤乙酰基，卤甲基或卤异丁酰基，优选氯乙酰基或卤异丁酰基。所述的PS微球为实验室参考文献方法（Polymer48(2007)1981-1988）自制，粒径范围35-300μm。孔径为100-700nm，孔隙率为45-85%，比表面积25-200m²/g。

步骤2：采用ATRP方法在A上接枝温敏性聚合物刷。将步骤1中物质A置于反应瓶1中，抽真空除氧，待用；接着将催化剂（catalyst）、功能单体﹑配体（ligand）﹑醇水混合物在反应瓶2中溶解混匀，液氮冷冻抽真空除氧三次；然后用双针将反应瓶2中的液体引入反应瓶1；最后将反应瓶1置于恒温水浴振荡器中反应一段时间后得到温敏型超大孔聚苯乙烯微球。反应式如下：

其中X为Cl，Br；W为功能单体；

步骤2中所述功能单体（W）为温敏性单体、温敏性单体与疏水性单体的混合物、温敏性单体与pH敏感性单体的混合物或温敏性单体、疏水性单体和pH敏感性单体的混合物中的任一种；反应温度为10-90℃，反应时间1-30h，功能单体浓度0.1-5M，功能单体与引发剂（步骤1中物质A）的摩尔比范围10:1-100:1，引发剂与催化剂的摩尔比范围10:1-1:2，配体的加入量为催化剂的0.5-3倍，反应溶剂为醇水混合物。

步骤3：将步骤2中得到的聚合物微球依次用无水甲醇、无水乙醇、一定浓度的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液、丙酮、去离子水充分洗涤，再进行索氏抽提，真空干燥后即得温敏型超大孔生物分离介质。

在以上方案的基础上，优选的，当步骤1完成时，将反应液在无水状态下抽滤，分离得到的固体物质迅速倒入冰盐酸中搅拌，再次过滤并用去离子水洗至中性，最后再用无水乙醇洗涤过滤，在真空烘箱中干燥后进行步骤2反应；步骤2中所述的反应液在负压下由双针引入反应瓶1，并保证反应瓶1在无氧条件下至反应结束。

优选的，步骤1所述的卤烷基酰化试剂为氯乙酰氯、溴乙酰溴、2-氯异丁基酰氯或2-溴异丁基酰溴的任一种，卤甲基化试剂优选氯甲醚或溴甲醚。

优选的，步骤2所述的温敏性单体与疏水性单体的混合物按照温敏性单体：疏水性单体摩尔比为85:15-97:3混合；所述的温敏性单体与pH敏感性单体的混合物按照温敏性单体：pH敏感单体摩尔比为80:20-98:2混合；所述的温敏性单体、疏水性和pH敏感性单体的混合物按照温敏性单体：疏水性单体：pH敏感单体摩尔比80:10:10-95:3:2混合。

优选的，步骤2中的所述的温敏性单体为N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）或者2-(2-甲氧乙氧基)甲基丙烯酸酯（MEO₂MA）与寡聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯（OEGMA）的混合物（MEO₂MA:OEGMA摩尔比范围95:0.5-85:15）；所述疏水性单体为甲基丙烯酸丁酯（BMA）、甲基丙烯酸丙酯（PMA）、丙烯酸丁酯（BAA）或N-叔丁基丙烯酰胺（BAAm）等；所述pH敏感性单体为甲基丙烯酸（MAA）、丙烯酸（AA）、甲基丙烯酸N,N-二甲胺乙酯（DMAEMA）或二甲氨基丙基丙烯酰胺（DMAPAAM）等。

步骤2中催化剂为CuCl、CuBr、FeBr₂、FeCl₂等还原态过渡金属盐。配体（Ligand）为ATRP中常用的配体，如三[(2-二甲基氨基)乙基]胺（Me₆TREN，实验室根据文献自制，高等学校化学学报,2005,8:1574-1578）、N,N,N’,N’,N’’-五甲基二亚乙基三胺，(PMDETA)、2,2-联吡啶（bipy）。

优选的，步骤2中，所述醇水混合溶液为甲醇/水混合溶液、乙醇/水混合溶液或异丙醇/水混合溶液，按照体积比例为6:1-1:1混合；

优选的，在步骤2中，该步骤所述的ATRP反应体系，功能单体：物质A：配体：催化剂摩尔比为80:4:2:0.5-100:2:4:1，反应时水浴震荡器温度为25-50℃，振荡频率为120-170rpm，反应时间为12-24h。

优选的，步骤3中所述EDTA溶液的浓度为0.1-3M；所述索氏抽提中选择无水甲醇、无水乙醇或者丙酮中的任意一种进行抽提。

本发明中步骤（2）是关键步骤，其特点是非均相ATRP反应：在反应瓶2中使催化剂、配体、功能单体、醇水混合溶液混合溶解，冷冻除氧后引入预先抽真空除氧且含有物质A的反应瓶1中。该方法避免了一锅法的两个弊端：1）将作为引发剂的物质A与催化剂、配体、功能单体、醇水混合溶液一起混合再冷冻抽真空除氧会导致体系最初产生的自由基发生双基终止反应，大大降低温敏聚合物刷的接枝效率；2）将作为引发剂的物质A冷冻抽真空除氧，反复的冻融过程会降低超大孔聚苯乙烯微球的机械强度，影响后续使用。该步骤中温敏聚合物刷接枝量过高会堵塞PS微球的超大孔，导致分离过程中流速下降，分离速度慢；过低则不能充分掩盖PS疏水表面，并且温度响应性差，理想的温敏聚合物刷接枝量为2-25mg/m²。本发明的有益效果是：

本发明通过ATRP反应在超大孔聚苯乙烯微球的表面及孔道内接枝温敏型聚合物刷，得到一种快流速超大孔生物分离介质。超大孔聚苯乙烯微球，既可以购买（国家生化工程技术研究中心（北京）），也可实验室自制，具有超大孔结构、机械强度高、耐酸碱，且制备的过程中，分离介质的接枝密度和链长可通过改变反应条件来控制，重复性好，制备方法简单，效率高，成本低。介质装柱后通过调节流动相温度就可以快速将蛋白等生物大分子分离，在生物医药、生物工程、蛋白质分离领域具有很大应有潜力。

附图说明

图1为实施例6中快流速温敏型超大孔生物分离介质制备前后的扫描电镜（SEM）照片

其中，（a）是微球未接枝温敏性聚合物刷之前的形貌

（b）是微球接枝温敏性聚合物刷之后的形貌；

图2为实施例3中超大孔PS微球接枝温敏聚合物刷前后的红外光谱图其中，a线为PS微球的红外光谱；

b线为溴乙酰化的PS微球（PS-Br）的红外光谱；

c线为接枝温敏聚合物刷后PS微球的红外光谱；

图3为实施例4中快流速温敏型超大孔生物分离介质制备前后在不同温度（25℃和40℃）下的蛋白吸附量对比；

图4为实施例7中快流速温敏型超大孔生物分离介质制备前后的压力流速曲线对比；

图5为实施例6制备的快流速温敏型超大孔生物分离介质对两种蛋白（胰蛋白酶和牛血清白蛋白）单独及混合后的分离效果；

图6为实施例6制备的快流速温敏型超大孔分离介质在不同流速下对混合蛋白（胰蛋白酶和牛血清白蛋白）的初步分离效果。

具体实施方式

本发明的具体实施方式如下：

实施例1

取超大孔聚苯乙烯微球（PS）2g加入50mlCS₂浸泡，依次加入无水AlCl₃3.7g和氯乙酰氯3.02g，40℃搅拌反应3h，产物依次用无水乙醇、3%HCl、去离子水充分洗涤，25℃下真空干燥3h，即制备得到PS-Cl。

称取0.25gPS-Cl置于梨形Schlenk瓶1中，充入氩气除氧三次，待用；接着把催化剂CuCl（20.54mg）配体PMDETA（143.54mg）﹑功能单体MEO2MA（2.164g）和OEGMA（0.475g）﹑溶剂甲醇/水（4:1,15ml）在梨形Schlenk瓶2中混合均匀，液氮冷冻抽真空除氧三次；然后用双针将梨形Schlenk瓶2中的液体引入梨形Schlenk瓶1中；后，最后将梨形Schlenk瓶1转至水浴振荡器水浴振荡反应18h（转速为140r/min），水温为30℃。反应结束后，依次用丙酮﹑0.2M的EDTA溶液﹑无水甲醇和纯水进行洗涤，真空烘箱35℃干燥5h。为了保持其孔内无堵塞，用丙酮进行索氏抽提4h，即得到温敏型超大孔分离介质，温敏聚合物刷偶联量3.8mg/m²。

实施例2

取超大孔聚苯乙烯微球（PS）2g加入30ml二氯甲烷浸泡，依次加入无水AlCl₃4.2g和2-氯异丁基酰氯3.89g，50℃搅拌反应5h，产物依次用无水乙醇、3%HCl、去离子水充分洗涤，40℃下真空干燥2h，即制备得到PS-Cl。

称取0.25gPS-Cl置于梨形Schlenk1瓶中，充入氩气除氧三次，待用；接着把催化剂CuCl（20.46mg）、配体Me₆TREN（190.5mg）﹑功能单体MEO₂MA（3.576g）和OEGMA（0.475g）﹑溶剂异丙醇/水（4:1,17ml）置于梨形Schlenk瓶2中混合均匀，液氮冷冻抽真空除氧三次；然后用双针将梨形Schlenk瓶2中的液体引入梨形Schlenk瓶1中；，最后将梨形Schlenk瓶1转至水浴振荡器水浴振荡反应12h（转速为160r/min），水温为50℃。反应结束后，依次用丙酮﹑0.4M的EDTA溶液﹑甲醇和纯水进行洗涤，真空烘箱40℃干燥4h。为了保持其孔内无堵塞，用无水甲醇抽提3h，即得到温敏型超大孔分离介质，温敏聚合物刷偶联量4.2mg/m²。

实施例3

取超大孔聚苯乙烯微球（PS）2.5g加入35ml二氯乙烷浸泡，依次加入无水AlCl₃4.4g和溴乙酰溴4.52g，50℃搅拌反应5h，产物依次用无水乙醇、3%HCl、去离子水充分洗涤，35℃下真空干燥3h，即制备得到PS-Br。

称取0.26gPS-Br置于梨形Schlenk瓶1中，充入氩气除氧三次，待用；接着把催化剂CuCl(18.3mg)/CuCl₂(3.0mg)、配体Bipy（130.73mg）﹑功能单体N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）/甲基丙烯酸丁酯（BMA）（90:10,2.46g）﹑溶剂甲醇/水（3:1，22ml）置于梨形Schlenk瓶2混合均匀，液氮冷冻抽真空除氧三次；然后用双针将梨形Schlenk瓶2中的液体引入梨形Schlenk瓶1中；最后将梨形Schlenk瓶1转至水浴振荡器水浴振荡反应21h（转速为150r/min），水温为45℃。反应结束后，依次用丙酮﹑0.6M的EDTA溶液﹑甲醇和纯水进行洗涤，真空烘箱25℃干燥5小时。为了保持其孔内无堵塞，用丙酮抽提，即得到温敏型超大孔分离介质，温敏聚合物刷偶联量5.3mg/m²。

实施例4

取超大孔聚苯乙烯微球（PS）2g加入40mlCS₂浸泡，依次加入无水AlCl₃3.8g和2-溴异丁基酰溴4.69g，45℃搅拌反应4h，产物依次无水乙醇、3%HCl、去离子水充分洗涤，25℃下真空干燥3h，即制备得到PS-Br。

称取0.25gPS-Br置于梨形Schlenk瓶1中，充入氩气除氧三次，待用；接着把催化剂CuCl(19.8mg)、配体PMDETA（155.18mg）﹑功能单体N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）/甲基丙烯酸丁酯（BMA）（93:7,2.63g）﹑溶剂甲醇/水（1:1,12ml）置于梨形Schlenk瓶2混合均匀，液氮冷冻抽真空除氧三次；然后用双针将梨形Schlenk瓶2中的液体引入梨形Schlenk瓶1中；最后将梨形Schlenk瓶1转至水浴振荡器水浴振荡反应23h（转速为160r/min），水温为40℃。反应结束后，依次用丙酮﹑0.5M的EDTA溶液﹑甲醇和纯水进行洗涤，真空烘箱35℃干燥4h。为了保持其孔内无堵塞，用无水乙醇索氏抽提5h，即得到温敏型超大孔分离介质，温敏聚合物刷偶联量8.5mg/m²。

实施例5

取超大孔聚苯乙烯微球（PS）2g加入35mlCS₂浸泡，依次加入无水AlCl₃3.7g和溴乙酰溴4.52g，45℃搅拌反应3h，产物依次用无水乙醇、3%HCl、去离子水充分洗涤，25℃下真空干燥4h，即制备得到PS-Br。

称取0.25gPS-Br置于梨形瓶Schlenk1中，充入氩气除氧三次，待用；接着把催化剂CuBr（21.1mg)、配体Me₆TREN（188.9mg）﹑功能单体N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）/甲基丙烯酸丁酯（BMA）（95:5，2.92g）﹑溶剂乙醇/水（3:1,16ml）置于梨形Schlenk瓶2混合均匀，液氮冷冻抽真空除氧三次；然后用双针将梨形Schlenk瓶2中的液体引入梨形Schlenk瓶1中；最后将梨形Schlenk瓶1转至水浴振荡器水浴振荡反应23h（转速为160r/min），水温为40℃。反应结束后，依次用丙酮﹑0.9M的EDTA溶液﹑甲醇和纯水进行洗涤，真空烘箱40℃干燥2h。为了保持其孔内无堵塞，用丙酮抽提，即得到温敏型超大孔分离介质，温敏聚合物刷偶联量8.9mg/m²。

实施例6

取超大孔聚苯乙烯微球（PS）1.8g加入30ml二氯甲烷浸泡，依次加入无水AlCl₃3.3g和2-溴异丁基酰溴4.72g，50℃搅拌反应6h，产物依次用无水乙醇、3%HCl、去离子水充分洗涤，25℃下真空干燥3h，即制备得到PS-Br。

称取0.25gPS-Br置于梨形Schlenk瓶1中，充入氩气除氧三次，待用；把催化剂CuCl(19.2mg)/CuCl₂(2.7mg)、配体PMDETA（144.5mg）﹑功能单体N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）/甲基丙烯酸丁酯（95:5，2.42g）﹑溶剂甲醇/水（2:1，18ml）置于梨形Schlenk瓶2混合均匀，液氮冷冻抽真空除氧三次；然后用双针将梨形Schlenk瓶2中的液体引入梨形Schlenk瓶1中；最后将梨形Schlenk瓶1转至水浴振荡器水浴振荡反应24h（转速为160r/min），水温为40℃。反应结束后，依次用丙酮﹑0.2M的EDTA溶液﹑甲醇和纯水进行洗涤，真空烘箱30℃干燥5小时。为了保持其孔内无堵塞，用无水甲醇索氏抽提5h，即得到温敏型超大孔分离介质，温敏聚合物刷偶联量10.1mg/m²。

实施例7

取超大孔聚苯乙烯微球（PS）2g加入30mlCS₂浸泡，依次加入无水AlCl₃4.2g和溴乙酰溴4.52g，50搅拌反应3h，产物依次用无水乙醇、3%HCl、去离子水充分洗涤，25℃下真空干燥5h，即制备得到PS-Br。

称取0.25gPS-Br置于梨形Schlenk瓶中，充入氩气除氧三次，待用；接着把催化剂CuCl₂(21.9mg)、配体Me₆TREN（189.7mg）﹑功能单体N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）/甲基丙烯酸丁酯(BMA)/二甲氨基丙级丙烯酰胺(DMAPAA)/（90:5:5,3.65g）﹑溶剂甲醇/水（2:1,15ml）置于梨形Schlenk瓶2混合均匀，液氮冷冻抽真空除氧三次；然后用双针将梨形Schlenk瓶2中的液体引入梨形Schlenk瓶1中；最后将梨形Schlenk瓶1转至水浴振荡器水浴振荡反应23h（转速为160r/min），水温为40℃。反应结束后，依次用丙酮﹑0.4M的EDTA溶液﹑甲醇和纯水进行洗涤，真空烘箱35℃干燥4小时。为了保持其孔内无堵塞，用无水乙醇索氏抽提5h，即得到温敏型超大孔分离介质,，温敏聚合物刷偶联量10.5mg/m²。

实验例：

为了观察本发明制备的快流速温敏型超大孔生物分离介质的形貌，我们采用扫描电镜（SEM）观察形貌，附图1是实施例6中制备的快流速温敏型超大孔生物分离介质的SEM图，（a）是超大孔PS微球未接枝温敏性聚合物刷之前的形貌，与之对比的是图（b）中是接枝温敏性聚合物刷之后的形貌，我们发现接枝之后的微球表面出现一层水凝胶状物质覆盖在骨架上，且接枝后球形度和骨架完好，局部放大之后，我们发现保持着原有的超大孔结构，并没有出现聚合物刷堵塞孔道的现象，这一点对于改性微球作为快流速色谱介质是至关重要的。

为了验证温敏聚合物刷已经通过ATRP反应成功地接枝到PS微球上，做实施例3中超大孔PS微球接枝温敏聚合物刷前后的红外光谱图，由附图2可得，与PS微球相比，PS-Br在1679cm^-1处出现强的与苯环相连的C=O伸缩振动吸收峰；在1569cm^-1处出现苯环与溴乙酰基共轭时骨架伸缩振动峰；在1282cm^-1出现与Br相邻的-CH₂-面外摇摆振动峰；在608cm^-1处出现了一个很强的C-Br伸缩振动峰。表明溴乙酰基已偶联到PS微球上。与PS-Br微球相比，PS-PNIPAM-BMA微球的光谱中出现了几处明显变化：在3299cm^-1处出现仲胺N-H伸缩振动峰；1750cm^-1处出现了酯基C=O伸缩振动峰，1646cm^-1处出现了仲酰胺C=O伸缩振动吸收峰；在1534cm^-1处出现N-H面内弯曲振动峰；同时在1386cm^-1和1366cm^-1处出现了异丙基的两个强度几乎相等的吸收峰。上述变化表明温敏聚合物刷已通过ATRP反应成功地接枝到PS微球上。

为了验证本发明的快流速温敏型超大孔生物分离介质的温度敏感性，将实施例4中所制备的快流速温敏型超大孔生物分离介质及超大孔PS微球在不同温度下对牛血清白蛋白（BSA）的吸附作用进行了对比。结果如附图3所示，结果表明，在pH7.0，温度为25℃和40℃时，超大孔PS微球对20mg/ml的BSA的平衡吸附量达到90mg/g，这主要是因为PS表面疏水性强会对蛋白产生非特异性吸附。而本发明制备的快流速温敏型超大孔生物分离介质由于表面接枝的温敏聚合物刷覆盖了PS疏水表面，在25℃及40℃时对蛋白的吸附量都要低于PS微球，且在25℃时对20mg/ml的BSA的平衡吸附量为17.34mg/g，小于在40℃时对20mg/ml的BSA的平衡吸附量40.16mg/g。说明温度高于温敏聚合物刷最低临界相转变温度32℃时其分子链收缩，与蛋白之间的疏水作用力增强，从而吸附量增大，这也为混合蛋白的分离提供了依据。

微球装柱后，将超大孔PS微球的压力流速曲线与本发明制备的快流速温敏型超大孔生物分离介质的压力流速曲线对比。如附图4可知，在流速为3612cm/h时，反压分别为1.61MPa和2.23MPa，相差不大，且在0-3612cm/h范围内都呈现出了良好的线性关系，这也说明了本发明制备的温敏型超大孔分离介质机械强度好，通透性好，可用于分离生物大分子。

微球装柱后，选取疏水性不同的模型蛋白胰蛋白酶（Trypsin）和牛血清白蛋白（BSA）进行分离，流动相为pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，流速1ml/min，进样溶度胰蛋白酶：0.5mg/ml，BSA：1mg/ml，结果如附图5可知，本发明作为固定相选取了35℃为进样温度，混合蛋白胰蛋白酶和BSA，我们可以看到的是进样初始出现一个穿透峰，当温度降为25℃时，则出现另一个洗脱峰。为了验证峰的归属，我们单独进胰蛋白酶和BSA，发现胰蛋白酶在进样初始出现一个穿透峰，而温度转变为25℃时，则不再有峰出现，而对于BSA来说，在进样初始几乎没有峰出现，而温度转变为25℃时，则因为与固定相之间的疏水作用力减弱而被洗脱下来，得到较好的分离效果。

为了验证本发明的快流速超大孔生物分离介质的快速分离性能，我们选取了在不同的流速下（181-1806cm/h）分离混合蛋白（胰蛋白酶和BSA），流动相为pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，进样溶度胰蛋白酶：0.5mg/ml，BSA：1mg/ml，结果如附图6可知，选取35℃为进样温度，在进样初始依然有峰形较好的胰蛋白酶峰，在温度降为25℃时，BSA被洗脱下来，得到较好的分离效果，随着流速的增加，依然能得到较好的分离效果，证明其在较大的流速下机械性能保持良好，孔内的对流传质使得分离时间变短，分离速度快，证明了本发明制备的快流速温敏型超大孔生物分离介质的快速分离性能。

Claims

1.一种快流速温敏型超大孔生物分离介质的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

步骤1：在酸性催化剂作用下，利用Friedel-Crafts反应将超大孔聚苯乙烯微球的苯环卤烷基酰化或卤甲基化，得到具备下述通式的物质A：

R为H₂CC＝O，CH₂或(CH₃)₂CC＝O，X可为Cl，Br

步骤2：采用原子转移自由基聚合(ATRP)反应在物质A上接枝温敏性聚合物刷，将步骤1中物质A置于反应瓶1中，抽真空除氧，待用；接着将催化剂(catalyst)、功能单体﹑配体(ligand)﹑醇水混合物在反应瓶2中溶解混匀，液氮冷冻抽真空除氧三次；然后用双针将反应瓶2中的液体引入反应瓶1；最后将反应瓶1置于恒温水浴振荡器中反应一段时间后得到温敏型超大孔聚苯乙烯微球；反应式如下：

W为功能单体；X为Cl，Br

步骤3：将步骤2中得到的温敏型超大孔聚苯乙烯微球依次用无水甲醇、无水乙醇、0.1-3M的乙二胺四乙酸(EDTA)、丙酮、去离子水充分洗涤，再进行索氏抽提，真空干燥后即得温敏型超大孔生物分离介质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1所述的卤烷基酰化的试剂为氯乙酰氯、溴乙酰溴、2-氯异丁基酰氯或2-溴异丁基酰溴的任一种，卤甲基化的试剂为氯甲醚、溴甲醚的任一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2中所述的功能单体为温敏性单体、温敏性单体与疏水性单体的混合物、温敏性单体与pH敏感性单体的混合物或温敏性单体、疏水性和pH敏感性单体的混合物中的任一种；步骤2的反应温度为10-90℃，反应时间1-30h，功能单体浓度0.1-5M，功能单体与物质A的摩尔比范围10:1-100:1，物质A与催化剂的摩尔比范围10:1-1:2，配体的加入量为催化剂的0.5-3倍。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤2中所述的温敏性单体与疏水性单体的混合物按照温敏性单体：疏水性单体摩尔比为85:15-97:3混合；所述的温敏性单体与pH敏感性单体的混合物按照温敏性单体：pH敏感单体摩尔比为80:20-98:2混合；所述的温敏性单体、疏水性和pH敏感性单体的混合物按照温敏性单体：疏水性单体：pH敏感单体摩尔比80:10:10-95:3:2混合。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于步骤2中的所述的温敏性单体为N-异丙基丙烯酰胺或者2-(2-甲氧基乙氧基)甲基丙烯酸乙酯与寡聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯的混合物；所述疏水性单体为甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸丙酯或N-叔丁基丙烯酰胺；所述pH敏感性单体为甲基丙烯酸、丙烯酸、甲基丙烯酸N,N-二甲胺乙酯或二甲氨基丙基丙烯酰胺。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的2-(2-甲氧基乙氧基)甲基丙烯酸乙酯与寡聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯的混合物按照2-(2-甲氧基乙氧基)甲基丙烯酸乙酯:寡聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯摩尔比范围为95:0.5-85:15。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2中所述的催化剂为还原态过渡金属或还原态过渡金属与氧化态过渡金属混合物；所述醇水混合溶液为甲醇/水混合溶液、乙醇/水混合溶液或异丙醇/水混合溶液，所述混合液均按照体积比为6:1-1:1混合。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2中所述的功能单体：物质A：配体：催化剂摩尔比为80:4:2:0.5-100:2:4:1；反应时水浴震荡器温度为25-50℃，振荡频率为120-170rpm，反应时间为12-24h。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1完成时，将反应液在无水状态下抽滤，分离得到的固体物质迅速倒入冰盐酸中搅拌，再次过滤并用去离子水洗至中性，最后再用无水乙醇洗涤过滤，在真空烘箱中干燥后再进行步骤2反应；步骤2中所述的反应液在负压下由双针引入反应瓶1，并保证反应瓶1在无氧条件下至反应结束。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3中所述索氏抽提中选择无水甲醇、无水乙醇或者丙酮中的任意一种进行抽提。