CN111298779B - 一种用于抗体分离纯化的高容量温敏仿生亲和色谱分离介质及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于抗体分离纯化的高容量温敏仿生亲和色谱分离介质及其制备方法。该方法以硅胶、有机高分子聚合物或多糖聚合物微球为基质，以温敏型树枝聚合物PAMAM‑PNIPAM为间隔臂，以廉价、安全、稳定、对抗体具有选择性吸附的功能小分子为仿生配体，制备以温敏树枝状聚合物为间隔臂的温敏仿生亲和色谱介质，建立一种用于抗体分离纯化的高效、安全、低成本、高容量、绿色环保的温敏型仿生亲和色谱，大大提高配体的固载量，改善吸附性能，提高吸附容量；而温敏固定相在纯水条件下，仅通过温度的改变来实现对抗体的分离，洗脱条件温和，绿色环保，解决了当前混合模式色谱和仿生亲和色谱常采用酸性洗脱条件使抗体变性失活的难题。该制备方法简单，易于放大，使用寿命长，对抗体的分离纯化及工业化生产具有重要的应用价值。

Description

一种用于抗体分离纯化的高容量温敏仿生亲和色谱分离介质及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种用于抗体分离纯化的高容量温敏仿生亲和色谱分离介质及其制备方法和应用。
背景技术
抗体药物因其特异性高，靶向性强，毒副作用小，广泛应用于免疫诊断、癌症、免疫系统疾病的治疗，是近年来医药产业发展最快的领域之一。现已有47种上市单抗，2013年，单抗的全球销售额接近750亿美元，几乎占到全球生物药物总销售额的一半，预计到2020年销售的单抗约70种，全球销售额接近1250亿美元。抗体在医药领域的日益重要性亟需有更高效、稳定和低廉的生产工艺。由于抗体表达的复杂性以及对医用抗体的高品质要求，抗体纯化已成为整个生产过程的关键步骤。
亲和色谱因其对目标分子的高特异性纯化已成为抗体纯化后期最常用的色谱方法。蛋白A( Protein A)亲和层析是现行公认的抗体分离平台，对抗体具有良好的选择性，可一步得到高纯度的抗体，已经被广泛应用到工业化的抗体制备中(USPatent4230685)。但是，该方法存在一些缺陷，如蛋白A亲和层析介质的价格昂贵、成本高、使用寿命短、缺乏有效的清洗方法；在酸性洗脱条件以及反复使用易导致其丧失生物活性；由于配基属于蛋白质，易被存在原料液中的蛋白酶水解，从而降低分离效果，而配基的脱落易造成抗体产品的污染等。这些不足之处限制了其在大规模抗体纯化领域中的应用。而且蛋白质A配基所具有的缺点，蛋白质G和蛋白质L同样具有，此外蛋白质G的价格比蛋白质A还要昂贵，同样面临着大规模应用困难的问题。
典型的抗体分离纯化过程除了通过蛋白A亲和层析捕获外，为了进一步去除HCP、聚集体、抗体片段、宿主DNA以及脱落的蛋白A配基等，还需要两步精制过程。精制步骤所采用的层析方法主要包括离子交换层析[FahrnerR L, Biotechnology&GeneticEngineering Reviews, 2001, 18 (1): 301-328]、疏水相互作用层析[GhoseS, etal.Mabs, 2013, 5 (5):795-800]和羟基磷灰石层析等传统技术。
在传统层析的基础上，混合模式层析（Mixed-mode chromatography, MMC）对功能配基的结构进行优化设计，组合两种或两种以上的相互作用模式，加强对目标抗体的亲和性和选择性，从而提高纯化效率。相比与传统的IEC 和HIC，新型层析模式MMC 具有高载量、高选择性和高效率等优势。
为了解决蛋白质A亲和分离介质存在的上述问题，采用对抗体具有特异亲和作用的小分子和短肽配体来取代昂贵的蛋白质A亲和配体。一些含有硫原子、可结合质子的杂环小分子配体以及短肽仿生配体作为蛋白A配体的替代，对抗体有很好的选择性，在分离抗体方面显示出良好的应用潜力。如将含有砜基和巯基乙醇为配基的亲硫色谱(Porath et al.FEBS Letters, 1985, 185:306)用于抗体的分离纯化。疏水电荷诱导色谱（hydrophobiccharge induction chromatography, HCIC）是一种分离纯化抗体的新技术(Tong H F, Lin D Q, Gao D, et al. J Chromatogr A, 2013, 1285: 88-96)，HCIC主要通过增加疏水基团的键合密度，同时选择合适的离子化配基，使其在较高pH时不带电荷，使蛋白在吸附时只依靠疏水相互作用。解吸附时通过调节洗脱液pH值，使固定相表面带上与蛋白表面相同的电荷，从而依靠静电斥力将蛋白质洗脱下来。美国专利(USPatent 5,652,348; 5, 719, 269; 7, 144, 743)报道了利用杂环配体进行抗体的疏水相互作用进行吸附分离的新型分离介质及其制备方法。其中以巯基乙基吡啶为配基的层析介质已经有PallBiosepara公司商品化生产。中国专利(CN101284224)报道了一种以巯基吡啶和砜基为配基、以纤维素/无机增重剂复合微球为基质的分离抗体的扩张床吸附介质及制备方法。中国专利(CN201210202165.8)报道了一种以亲水性凝胶微球为基质，在均三嗪活化剂中制成活化基质，然后键合4-(2-羟基乙基)-吡啶等两个小分子配体，用于分离抗体的扩张床分离介质及制备方法。目前，Pall公司开发的MEP Hypercel，以4-巯乙基吡啶为功能配基，是比较经典的MMC介质。GE Healthcare公司开发的Capto adhere也是典型的MMC介质，以N-苄基-N-甲基乙醇胺（N-Benzyl-N-methylethanolamine）作为功能配基，兼具疏水、离子交换和氢键等多种基团，属混合模式阴离子交换介质。此外，Bio-Rad公司推出的NuviacPrime介质，以对氨基马尿酸（ρ-aminohippuricacid，PAH）为功能配基，属于混合模式阳离子交换介质。但是，目前上游细胞表达已实现5g/L以上的抗体浓度，培养规模逐步扩大，而基于功能小分子的仿生亲和色谱介质仍存在吸附容量低、洗脱条件苛刻，酸性洗脱易使抗体变性失活等问题，无法满足上游产能提升对下游抗体分离纯化的要求。
发明内容
本发明的目的在于选择廉价、安全、稳定、对抗体具有选择性吸附的功能小分子为仿生配体，以硅胶、有机高分子聚合物或多糖聚合物微球为基质，以温敏型树枝聚合物PAMAM- PNIPAM为间隔臂，制备以温敏树枝状聚合物为间隔臂的温敏仿生亲和色谱介质，建立一种用于抗体分离纯化的高效、安全、低成本、高容量、绿色环保的温敏型仿生亲和色谱，以克服线型间隔臂活性位点少、吸附容量低、构象不够稳定、再生性能差的缺点，大大提高配体的固载量，改善吸附性能，提高吸附容量；而温敏固定相在纯水条件下，仅通过温度的改变来实现对抗体的分离，洗脱条件温和，绿色环保，以解决当前混合模式色谱和仿生亲和色谱常采用酸性洗脱条件使抗体变性失活的难题。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
结构式（I）所示的色谱分离介质，
其中，基质为硅胶、有机高分子聚合物或多糖聚合物微球；
m=0～5，n=8～90；
R为对抗体具有选择性吸附的功能小分子，结构如下：
。
上述树枝状聚合物聚酞胺-胺(PAMAM)的代数从G1.0至G6.0, 对应m=0～5。
上述线性温敏聚合物PNIPAM的n=8～90，分子量范围为1000-10000。
上述色谱分离介质的制备方法，包括以下步骤：
（1）通过Micheal加成反应和胺化反应，将树枝状聚合物PAMAM接枝到氨基化基质的表面；
（2）利用接枝到基质表面树枝状聚合物PAMAM上的氨基，对温敏聚合物PNIPAM进行偶联。
上述步骤（2）包括以下步骤：
（1）线性温敏聚合物PNIPAM的制备；利用可逆加成断裂链转移聚合技术，以N-异丙基丙烯酰胺为单体，S-1-十二烷基-S’-(a,a’-二甲基-a’’-乙酸)三硫代碳酸酯为链转移剂，以偶氮二异丁氰为引发剂，在溶液中可控聚合制备端基为羧基的线性温敏聚合物PNIPAM；
（2）温敏聚合物PNIPAM与树枝状聚合物PAMAM的偶联；利用PAMAM上的氨基与温敏聚合物PNIPAM的羧基在1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺催化下通过酰胺化反应进行接枝；
（3）线性温敏聚合物PNIPAM与配基的偶联；将所合成的线性温敏聚合物PNIPAM通过迈克尔加成与N,N -二异丙烯酰胺反应得到PNIPAM-BA；
（4）将对抗体具有特异性作用的小分子功能配体R偶联到温敏聚合物PNIPAM-DDTTC端基上，制备出以温敏树枝状聚合物PAMAM-PNIPAM为间隔臂，以对抗体具有选择性作用的功能小分子为配体的温敏型仿生亲和色谱介质。
上述树枝状聚合物聚酞胺-胺是利用丙烯酸甲酯和乙二胺通过迈克尔加成和酰胺化反应，通过发散法合成得到。
上述将PNIPAM-MEP与PAMAM进行偶联的过程中所使用的催化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺。
上述的分离介质在抗体分离纯化中的应用。
（1）使用的固定相为结构式（I）所示的温敏型仿生亲和色谱固定相，其间隔臂为温敏聚合物或温敏树枝状聚合物PAMAM-PNIPAM，其配基为对抗体具有选择性吸附的功能小分子；
（2）所使用的流动相为磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液，pH为4～10，浓度为5～100mmol/L；
（3）以缓冲液为流动相，通过调节温度来实现对抗体的分离；在30～50°C时将样品上样至色谱柱，在1～5°C时洗脱抗体蛋白。
一种抗体分离纯化的方法，包括以下步骤：
（1）将结构式（I）所示的温敏型仿生亲和色谱填料装填于色谱柱中，流动相采用5～100 mmol/L 磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液；将流动相贮液瓶和色谱柱浸入30-50°C恒温水浴中，用相同温度的流动相平衡色谱柱，保持恒温30分钟；
（2）样品上样至色谱柱中后，停泵，继续在30～50°C的恒温水浴中恒温10分钟；
（3）然后将色谱柱转移到另一个1～5°C的恒温水浴中，恒温10分钟；
（4）最后用1～5°C的流动相5～100 mmol/L的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗脱抗体蛋白。
本发明的有益效果体现在：
1、以树枝状聚合物为间隔臂，可以克服线型间隔臂活性位点少、吸附容量低、构象不够稳定、再生性能差的缺点，大大提高配体的固载量，改善吸附性能，提高吸附容量；
2、可通过调节树枝状聚合物的枝化代数调控间隔臂的长短和活性位点数目，从而调控固定相的吸附容量；
3、所制备的以温敏树枝状聚合物为间隔臂的温敏型仿生亲和色谱固定相可通过调节温敏聚合物分子量的大小调控线性温敏聚合物的长度；
4、所制备的以温敏树枝状聚合物为间隔臂的温敏型仿生亲和色谱固定相，在纯水条件下，仅通过温度的改变来实现对抗体的分离。洗脱条件温和，绿色环保，可解决当前混合模式色谱和仿生亲和色谱常采用酸性洗脱条件使抗体变性失活的难题；
5、所制备的以温敏树枝状聚合物为间隔臂的温敏型仿生亲和色谱固定相在高温20-40℃时吸附蛋白，在5℃时解吸附蛋白；
6、利用所制备的温敏型聚合物为间隔臂的温敏仿生亲和色谱介质，可建立一种用于抗体分离纯化的高效、安全、低成本、高容量、绿色环保的温敏型仿生亲和色谱，该发明对抗体的分离纯化及工业化生产具有重要的应用价值。
附图说明
图1是本发明所制备的以温敏树枝状聚合物为间隔臂的温敏型仿生亲和色谱固定相结构示意图；
图2是本发明所制备的以温敏树枝状聚合物为间隔臂的温敏型仿生亲和色谱固定相结构图；
图3是本发明所制备的以温敏树枝状聚合物为间隔臂的温敏型仿生亲和色谱固定相结构的FTIR图；
图4是本发明所制备的以温敏树枝状聚合物为间隔臂的温敏型仿生亲和色谱固定相对γ-球蛋白和BSA的色谱分离图和SDS-PAGE电泳图；
色谱条件：色谱柱规格：4.6×50 mmID，流动相：50 mMTris-HCl, pH 8.0；40 ℃条件下平衡30 min；上样后停泵，色谱柱40 ℃水浴保温10 min后，将色谱柱移至5℃水浴保温10 min；最后5℃洗脱。流速：1.0 mL/min，检测波长：280 nm。
图5本发明所制备的以温敏树枝状聚合物为间隔臂的温敏型仿生亲和色谱固定相对人血清中IgG的色谱分离图和SDS-PAGE电泳图；
色谱条件：色谱柱规格：4.6×50 mmID，流动相：50 mMTris-HCl, pH 8.0；40 ℃条件下平衡30 min；上样后停泵，色谱柱40 ℃水浴保温10 min后，将色谱柱移至5℃水浴保温10 min；最后5℃洗脱。流速：1.0 mL/min，检测波长：280 nm。
图6本发明所制备的以温敏树枝状聚合物为间隔臂的温敏型仿生亲和色谱固定相对鸡蛋黄中IgY的色谱分离图和SDS-PAGE电泳图；
色谱条件：色谱柱规格：4.6×50 mmID，流动相：50 mMTris-HCl, pH 8.0；40℃条件下平衡30 min；上样后停泵，色谱柱40 ℃水浴保温10 min后，将色谱柱移至5℃水浴保温10 min；最后5℃洗脱。流速：1.0 mL/min，检测波长：280 nm。
图7本发明所制备的以MMI为配体，温敏树枝状聚合物为间隔臂的温敏型仿生亲和色谱固定相对鸡蛋黄中IgY的色谱分离图；
色谱条件：色谱柱规格：4.6×50 mmID，流动相：50 mMTris-HCl, pH 8.0；40℃条件下平衡30 min；上样后停泵，色谱柱40℃水浴保温10 min后，将色谱柱移至5℃水浴保温10 min；最后5℃洗脱。流速：1.0 mL/min，检测波长：280 nm。
具体实施方式
以下通过实例对本发明作进一步的描述：
实施例1：以温敏树枝状聚合物PAMAM-PNIPAM为间隔臂的温敏型仿生亲和色谱固定相的制备
1）RAFT法制备线性PNIPAM
7.8865 g的NIPAM、0.2726g的DDTTC和0.013 g的AIBN加入到含有12.44 mL 1 4-二恶烷的圆底烧瓶中,磁性搅拌反应溶液直到所有的反应物都完全溶解。然后用橡胶塞封住烧瓶，釆用冷冻-解冻-抽真空脱气三次以上，氮气保护下在60℃油浴中反应在给定的时间内进行聚合。当达到聚合时间时，反应溶液在冰浴中冷却，以终止聚合反应。用截留分子量1 kDa的透析袋对反应产物透析4天，然后通过冷冻干燥除去产物中的水分得到温敏聚合物PNIPAM。
2）配体与温敏型聚合物的偶联（PNIPAM-MEP）
1.3767 g PNIPAM和6.2mg的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)加入到圆底烧瓶中，加入4mL四氢呋喃溶解得黄色溶液，通入氮气除氧30分钟。然后，在反应液中加入0.3832 g的1丁胺，再继续氮气除氧20分钟。进行反应直到黄色溶液变成无色。接下来，在氮保护下加入1.8092 gN,N'-亚甲基双丙烯酰胺，混合物在室温下被搅拌反应16 h。反应完成后，真空除去四氢呋喃，将聚合物溶解于水中，然后在截留分子量1 kDa的透析袋中透析两天，再用冷冻干燥仪将样品冻干，得到产品PNIPAM-BA。
1.0594 g MEP 加入到含20 mL去离子水的烧瓶中，用NaOH调pH为10-11。将0.9269g的PNIPAM-BA 加入到另一个圆底烧瓶中，加入MEP溶液，再加入34.9 mg的己胺，搅拌，反应16 h。然后将反应溶液加入到截留分子量为1 kDa的透析袋中透析两天，再冷冻干燥机除去水分，得到PNIPAM-MEP。
3）硅胶的活化
取一500mL三颈烧瓶依次加入10.0g全多孔型硅胶，300mL 6.0mol/L的HCl溶液，120 ℃搅拌回流6h，然后停止加热，冷却至室温，过滤，用大量三次水洗涤硅胶至无氯离子存在，120℃下真空干燥8 h，获活化硅胶。
4）硅胶表面接枝树枝状聚合物PAMAM（SiO2-PAMAM）
2.0 g 活化后的硅胶加入到含100 mL无水甲苯溶液的圆底烧瓶中，超声使硅胶分散均匀，加入1 mL 3- 氨丙基三乙氧基硅烷，油浴中110℃搅拌反应12 h。反应完成后冷却至室温。所得到的氨基化硅胶(SiO2-NH2)分别用甲苯、甲醇和丙酮洗涤三次后，放置在真空干燥箱中60℃干燥12 h，备用。。
1.8 g氨基化硅胶和100 mL甲醇分别加入三颈瓶中，超声是硅胶完全分散，搅拌15分钟，滴加3.6 mL的丙烯酸甲酯(MA)于反应液中，搅拌下反应50℃回流24 h。反应完成后，抽滤，产物SiO2-G0.5用甲醇洗涤三次后，放置在真空干燥箱中60℃干燥12 h，备用。
1.8 g SiO2-G0.5和100 mL甲醇分别加入三颈瓶中，超声是分散完全，滴加20 mL的乙二胺(EDA)于反应液中，搅拌下反应50℃回流24 h。反应完成后，抽滤，产物SiO2-G1.0用甲醇洗涤三次后，放置在真空干燥箱中60℃干燥12 h，备用。
重复进行上述步骤2和3，进行多次Micheal加成反应和胺化反应，则能够相应地制备出SiO2-G1.5和SiO2-G2.5等末端为甲酯基的半代PAMAM接枝的中间产物，以及SiO2-G2.0和SiO2-G3.0等末端为氨基的整代PAMAM接枝的产物。
5）温敏型树枝状聚合物为间隔臂的温敏型仿生亲和色谱固定相的制备
将0.92 g的PNIPAM-MEP和80 mL去离子水加入到圆底烧瓶中，氮气保护，冰浴搅拌15分钟，然后加入1.380 g1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）和1.380 gN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）于反应液中，搅拌反应3 h。最后加入2.0 g PAMAM接枝的SiO2-G2.0，继续搅拌反应24 h。反应停止后了，抽滤，产物用水和甲醇洗涤了三次，放置在真空干燥箱中60℃干燥12 h。即可制备得到以硅胶为基质，温敏树枝状聚合物PAMAM-PNIPAM为间隔臂，以对抗体具有选择性作用的功能小分子MEP为配体的温敏型仿生亲和色谱介质。
实施例2：双接枝温敏聚合物的温敏型仿生亲和色谱固定相的制备
0.92 g PNIPAM-MEP加入到含有80 mL去离子水的圆底烧瓶中，混合均匀，氮气保护，冰浴搅拌15分钟，然后加入1.380 g1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）和1.380 gN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）于反应液中，搅拌反应3 h。最后加入2.0 g PAMAM接枝硅胶SiO2-G1.0，继续搅拌反应24 h。反应停止后了，抽滤，产物用水和甲醇洗涤了三次，放置在真空干燥箱中60℃干燥12 h。即可制备得到以硅胶为基质，温敏树枝状聚合物PNIPAM为间隔臂，以对抗体具有选择性作用的功能小分子MEP为配体的温敏型仿生亲和色谱介质，其结构如下所示。
实施例3：以MMI为配基的双接枝温敏聚合物的温敏型仿生亲和色谱固定相的制备
1）PNIPAM-MMI的制备
1.0594 g 2-巯基-1-甲基咪唑(MMI)加入到含20 mL去离子水的烧瓶中，用NaOH调pH为10-11。将0.9269 g的PNIPAM-BA 加入到另一个圆底烧瓶中，加入MMI溶液，再加入34.9mg的己胺，搅拌，反应16 h。然后将反应溶液加入到截留分子量为1 k Da的透析袋中透析两天，再冷冻干燥机除去水分，得到PNIPAM-MMI。
2）以MMI为配基的双接枝温敏聚合物的温敏型仿生亲和色谱固定相的制备
0.92 g PNIPAM-MMI加入到含有80 mL去离子水的圆底烧瓶中，混合均匀，氮气保护，冰浴搅拌15分钟，然后加入1.380 g1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）和1.380 gN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）于反应液中，搅拌反应3 h。最后加入2.0 g PAMAM接枝硅胶SiO2-G1.0，继续搅拌反应24 h。反应停止后了，抽滤，产物用水和甲醇洗涤了三次，放置在真空干燥箱中60℃干燥12 h。即可制备得到以硅胶为基质，温敏树枝状聚合物PNIPAM为间隔臂，以对抗体具有选择性作用的功能小分子MMI为配体的温敏型仿生亲和色谱介质，其结构如下所示。
实施例4 温敏型仿生亲和色谱对抗体的分离纯化
以温敏树枝状聚合物为间隔臂的温敏型仿生亲和色谱固定相对γ-球蛋白和BSA的色谱分离。
色谱条件：色谱柱规格：4.6×50 mmID，流动相：50 mMTris-HCl, pH 8.0；40℃条件下平衡30 min；上样后停泵，色谱柱40 ℃水浴保温10 min后，将色谱柱移至5℃水浴保温10 min；最后5℃洗脱。流速：1.0 mL/min，检测波长：280 nm。色谱分离图和SDS-PAGE电泳图见图4。
实施例5 温敏型仿生亲和色谱对抗体的分离纯化
以温敏树枝状聚合物为间隔臂的温敏型仿生亲和色谱固定相对人血清中IgG的色谱分离。
色谱条件：色谱柱规格：4.6×50 mmID，流动相：50 mMTris-HCl, pH 8.0；40 ℃条件下平衡30 min；上样后停泵，色谱柱40 ℃水浴保温10 min后，将色谱柱移至5℃水浴保温10 min；最后5℃洗脱。流速：1.0 mL/min，检测波长：280nm。色谱分离图和SDS-PAGE电泳图见图5。
实施例6 温敏型仿生亲和色谱对抗体的分离纯化
以温敏树枝状聚合物为间隔臂的温敏型仿生亲和色谱固定相对鸡蛋黄中IgY的色谱分离。
色谱条件：色谱柱规格：4.6×50 mmID，流动相：50 mMTris-HCl, pH 8.0；40℃条件下平衡30 min；上样后停泵，色谱柱40℃水浴保温10 min后，将色谱柱移至5℃水浴保温10 min；最后5℃洗脱。流速：1.0 mL/min，检测波长：280 nm。色谱分离图和SDS-PAGE电泳图见图6。
实施例7 温敏型仿生亲和色谱对抗体的分离纯化
以MMI为配基的双接枝温敏聚合物的温敏型仿生亲和色谱固定相对鸡蛋黄中IgY的色谱分离。
色谱条件：色谱柱规格：4.6×50 mmID，流动相：50 mMTris-HCl, pH 8.0；40 ℃条件下平衡30 min；上样后停泵，色谱柱40 ℃水浴保温10 min后，将色谱柱移至5℃水浴保温10 min；最后5℃洗脱。流速：1.0 mL/min，检测波长：280 nm。色谱分离图和SDS-PAGE电泳图见图7。

Claims (4)

1.以温敏树枝状聚合物PAMAM-PNIPAM为间隔臂的温敏型仿生亲和色谱固定相的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）RAFT法制备线性PNIPAM
7.8865 g的NIPAM、0.2726 g的DDTTC和0.013 g的AIBN加入到含有12.44 mL 1,4-二恶烷的圆底烧瓶中，磁性搅拌反应溶液直到所有的反应物都完全溶解；然后用橡胶塞封住烧瓶，釆用冷冻-解冻-抽真空脱气三次以上，氮气保护下在60 ℃油浴中反应在给定的时间内进行聚合；当达到聚合时间时，反应溶液在冰浴中冷却，以终止聚合反应；用截留分子量1kDa的透析袋对反应产物透析4天，然后通过冷冻干燥除去产物中的水分得到温敏聚合物PNIPAM；
2）配体与温敏型聚合物的偶联PNIPAM-MEP
1.3767 g PNIPAM和6.2 mg的三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP加入到圆底烧瓶中，加入4mL四氢呋喃溶解得黄色溶液，通入氮气除氧30分钟；然后，在反应液中加入0.3832 g的1-丁胺，再继续氮气除氧20分钟；进行反应直到黄色溶液变成无色；接下来，在氮气保护下加入1.8092 g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，混合物在室温下被搅拌反应16 h；反应完成后，真空除去四氢呋喃，将聚合物溶解于水中，然后在截留分子量1 kDa的透析袋中透析两天，再用冷冻干燥仪将样品冻干，得到产品PNIPAM-BA；
1.0594 g MEP 加入到含20 mL去离子水的烧瓶中，用NaOH调pH值为10-11；将0.9269 g的PNIPAM-BA 加入到另一个圆底烧瓶中，加入MEP溶液，再加入34.9 mg的己胺，搅拌，反应16 h；然后将反应溶液加入到截留分子量为1 kDa的透析袋中透析两天，再用冷冻干燥机除去水分，得到PNIPAM-MEP；
3）硅胶的活化
取一500 mL三颈烧瓶依次加入10.0 g全多孔型硅胶, 300 mL 6.0 mol/L的HCl溶液,120 ℃搅拌回流6h，然后停止加热，冷却至室温，过滤，用大量水洗涤硅胶至无氯离子存在，120 ℃下真空干燥8 h，获得活化硅胶；
4）硅胶表面接枝树枝状聚合物PAMAM
步骤1：2.0 g 活化后的硅胶加入到含100 mL无水甲苯溶液的圆底烧瓶中，超声使硅胶分散均匀，加入1 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，油浴中110 ℃搅拌反应12 h；反应完成后冷却至室温；所得到的氨基化硅胶SiO2-NH2分别用甲苯、甲醇和丙酮洗涤三次后，放置在真空干燥箱中60 ℃干燥12 h，备用；
步骤2：1.8 g氨基化硅胶和100 mL甲醇分别加入三颈瓶中，超声使硅胶完全分散，搅拌15分钟，滴加3.6 mL的丙烯酸甲酯MA于反应液中，搅拌下反应50℃回流24 h；反应完成后，抽滤，产物SiO2-G0.5用甲醇洗涤三次后，放置在真空干燥箱中60℃干燥12 h，备用；
步骤3：1.8 g SiO2-G0.5和100 mL甲醇分别加入三颈瓶中，超声使分散完全，滴加20 mL的乙二胺EDA于反应液中，搅拌下反应50℃回流24 h；反应完成后，抽滤，产物SiO2-G1.0用甲醇洗涤三次后，放置在真空干燥箱中60℃干燥12 h，备用；
步骤4：重复进行上述步骤2和3，进行多次Micheal加成反应和胺化反应，制备出SiO2-G1.5和SiO2-G2.5末端为甲酯基的半代PAMAM接枝的中间产物，以及SiO2-G2.0和SiO2-G3.0末端为氨基的整代PAMAM接枝的产物；
5）温敏型树枝状聚合物为间隔臂的温敏型仿生亲和色谱固定相的制备
将0.92 g的PNIPAM-MEP和80 mL去离子水加入到圆底烧瓶中，氮气保护，冰浴搅拌15分钟，然后加入1.380 g 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC和1.380 g N-羟基琥珀酰亚胺NHS于反应液中，搅拌反应3 h；最后加入2.0 g PAMAM接枝的SiO2-G2.0，继续搅拌反应24 h；反应停止后，抽滤，产物用水和甲醇洗涤三次，放置在真空干燥箱中60 ℃干燥12h；制备得到以硅胶为基质，温敏树枝状聚合物PAMAM-PNIPAM为间隔臂，以对抗体具有选择性作用的功能小分子MEP为配体的温敏型仿生亲和色谱介质。
2.权利要求1制备得到的温敏型仿生亲和色谱固定相在抗体分离纯化中的应用，其特征在于：
1) 使用的固定相为权利要求1所述方法制备得到；
2) 所使用的流动相为磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液，pH值为4～10，浓度为5～100mmol/L；
3) 以缓冲液为流动相，通过调节温度来实现对抗体的分离；在30～50 ℃时将样品上样至色谱柱，在1～5 ℃时洗脱抗体蛋白。
3.一种抗体分离纯化的方法，其特征在于包括以下步骤：
1) 将权利要求1制备得到的温敏型仿生亲和色谱固定相装填于色谱柱中，流动相采用5～100 mmol/L 磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液；将流动相贮液瓶和色谱柱浸入30-50 ℃恒温水浴中，用相同温度的流动相平衡色谱柱，保持恒温30分钟；
2) 样品上样至色谱柱中后，停泵，继续在30～50 ℃的恒温水浴中恒温10分钟；
3) 然后将色谱柱转移到另一个1～5 ℃的恒温水浴中，恒温10分钟；
4) 最后用1～5 ℃的流动相5～100 mmol/L的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗脱抗体蛋白。
4.根据权利要求3所述的抗体分离纯化的方法，其特征在于：所用流动相的pH为4～10。
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