CN105148883A

CN105148883A - 一种从鸡蛋清中分离纯化高纯度溶菌酶的新方法

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Publication number: CN105148883A
Application number: CN201510638756.3A
Authority: CN
Inventors: 王骊丽; 杨毅聪; 高栋; 谭福春; 李维敏
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2015-12-16

Abstract

本发明公开一种从鸡蛋清中分离纯化高纯度溶菌酶的新方法。包括(1)以色氨酸分子作为填料的配基，将其修饰于硅胶基质表面合成了一种静电基团调控的新型高效疏水相互作用色谱(HPHIC)填料；(2)该HPHIC填料装填的色谱柱具有混合模式色谱的保留特征，对天然蛋白质分离具有高的选择性和负载量；(3)该填料应用于鸡蛋清样品的分离，可以得到纯度为99％，质量回收率为97.8％的高纯活性蛋白质溶菌酶。本发明分离纯化过程采用盐-水洗脱体系，安全，环保，易于放大规模制备溶菌酶。

Description

一种从鸡蛋清中分离纯化高纯度溶菌酶的新方法

发明领域

本发明涉及一种以色氨酸为配基，静电基团调控的高效疏水相互作用色谱填料制备及其应用于鸡蛋清中分离纯化溶菌酶的新方法，属于活性蛋白质制备技术和高效液相色谱技术交叉领域。

背景技术

鸡蛋清是一种重要的天然蛋白质来源样品，含有丰富的功能和活性蛋白。鸡蛋清蛋白中最主要的四种成分为54％卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)，13％卵传铁蛋白(ovotransferrin，ovo)，3.5％溶菌酶(Lysozyme，Lys)以及3.5％卵黏蛋白(ovomucin，ovm)[Li-ChanE.，NakaiS.Criticalreviewsinpoultrybiology，1989，2(1)：21-58]。其中，Lys是一种杀菌剂、抗病毒剂、镇痛剂，为了从鸡蛋清中获得纯度和质量回收率高的溶菌酶，目前主要制备方法有传统的结晶法、沉淀法和液相色谱法[AldertonG.，FevoldH.L.JournalofBiologicalChemistry，1946，164：1-5；Cegielska-RadziejewskaR.，LesnierowskiG.，KijowskiJ.PolishJournalofFoodandNutritionScience，2008，58(1)：5-10]。

通常传统结晶法、沉淀法如果操作不当，往往会引起蛋白质表面变性而失活，并且难于实现规模制备。高效液相色谱法的特点是快速、易于达到规模化放大制备。在已报道的文献中，利用液相色谱法从鸡蛋清中分离纯化蛋白质最常用的方法是离子交换色谱(IEC)法[(1)Guérin-DubiardC.，PascoM.，HietanenA.，etal.JournalofChromatographyA，2005，1090：58-67；(2)YangG.，BaiL.，YanC.，etal.Talanta，2011，85：2666-2672；(3)GengF.，HuangQ.，WuX.，etal.SeparaionandPurificationTechnology，2012，96：75-80；(4)ZhaoK.L.，SongC.，WangF.，etal.ChineseChemicalLetters，2012，23：305-308]。这些方法都是基于离子交换基团带有正电荷或者负电荷的基团和蛋白质的等电点不同进行活性蛋白质分离，分别用于酸性蛋白或碱性蛋白的分离。两性离子交换色谱法也被用于从鸡蛋清中分离纯化蛋白质[QuQ.，YuX.J.，WuX.，etal.ChineseChemicalLetters，2012，23：1389-1392]。

疏水相互作用色谱法(HIC)由于其流动相采用了蛋白质在高盐浓度时被固定相吸附，在低盐浓度时被洗脱下来的分离机理。其固定相的构成是在基质的表面上修饰一些疏水基团，但是，传统HIC模式存在着疏水相互作用过强而易造成蛋白不可逆吸附的缺陷。因此，以HIC和IEC组成的混合模式色谱(Mixed-modechromatography，MMC)显示出极大优势[YangY，GengXD，JournalofChromatographyA，2011，1218：8813-8825]。

发明内容

本发明目的在于克服已有离子交换色谱和疏水相互作用色谱方法的不足，设计合成一种新型静电基团调控的高效疏水相互作用色谱填料。在疏水相互作用色谱模式下，该填料可同时提供合适的疏水和静电基团调控作用，非常有利于从鸡蛋清样品分离纯化得到高纯度、高回收率的活性蛋白溶菌酶。

为了实现上述任务，本发明采取解决技术方案如下：

1.以空白基质为原材料，以色氨酸为配基，制备结构式(I)所示硅胶基质的新型静电基团调控的高效疏水相互作用色谱填料。

2.所述静电基团调控的高效疏水相互作用色谱填料结构式(I)中的色谱配基为色氨酸，其分子结构中带有阴离子羧基、阳离子氨基和咪唑基。

3、所述结构式(I)的色谱填料制备方法，包括以下步骤：

(1)将硅烷偶联剂与活化硅胶反应得到环氧基硅胶；

(2)将环氧基硅胶与色氨酸反应得到具有静电基团调控的高效疏水相互作用色谱填料；

4、所述静电基团调控的高效疏水相互作用色谱填料制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)硅胶活化：将所用硅胶经15～20％盐酸以1∶10～1∶20(g/mL，m/v)比例活化2～6小时，用蒸馏水反复清洗直至中性，110～150℃真空干燥12～24小时，以形成孔径在之间，粒径为5～10μm的球状多孔硅胶。

(2)硅胶环氧化：将干燥的活化硅胶与硅烷偶联剂以1∶1～1∶2(g/mL，m/v)比例加入装有NaAc缓冲液(45～55mmol/L，pH4.5～6.5)的三颈圆底烧瓶中均匀混合，调节反应温度80～90℃，机械搅拌反应3～5h，然后依次用NaAc缓冲液、甲醇、水依次洗涤干净，真空干燥。

(3)配基键合：将干燥的环氧基硅胶和色氨酸按照1∶0.5～1∶1(g/g，m/m)比例分别加入到干燥三颈瓶中，再加入1∶30(g/mL，m/v)的二甲亚砜，在45～55℃条件下机械搅拌反应22～24h。反应结束之后分别用甲醇、水清洗，真空干燥得到色谱填料。

5、所述静电基团调控作用的高效疏水相互作用色谱填料是以疏水相互作用色谱为主，弱阳离子交换色谱为辅的混合模式色谱；

6、所述色氨酸配基色谱填料应用于鸡蛋清中蛋白分离纯化，其特征在于：

(1)将该色谱填料应用标准蛋白的分离，可快速分离六种蛋白。

(2)将该色谱填料应用于鸡蛋清样品的分离，可快速得到高纯度Lys，纯度为99％，质量回收率为97.8％。

(3)所述的流动相A为3.0mol/L(NH₄)₂SO₄，20.0mmol/LKH₂PO₄，pH7.0～8.0；流动相B为20.0mmol/LKH₂PO₄，pH7.0～8.0；

本发明的优点在于：(1)利用静电基团的作用调节蛋白质在疏水相互作用色谱模式下的保留，从而高效分离纯化样品；(2)该填料装填的色谱柱对蛋白质一步色谱分离，以及实际鸡蛋清样品纯化具有很好的选择性和负载量，易于规模化；(3)该填料制备工艺简单成熟，条件温和，易于控制和放大，适用于医药、食品行业使用。

附图说明

图1静电基团调控的高效疏水相互作用色谱填料对标准蛋白分离的色谱图。

图中：横坐标为保留时间(time)，纵坐标为波长280nm处紫外吸收值(mAU)；色谱峰顺序为1，细胞色素-C(Cyt-C)；2，核糖核酸酶A(RNase-A)；3，溶菌酶(Lys)；4，α-糜蛋白酶原(α-ChyA)；5，α-淀粉酶(α-Amy)；6，胰岛素(Ins)；色谱条件为：流动相A：3.0mol/L(NH₄)₂SO₄，20.0mmol/LKH₂PO₄，pH7.0；流动相B：20.0mmol/LKH₂PO₄，pH7.0；流速1.0ml/min。0-100％B线性梯度洗脱30min，延长100％B10min；检测波长280nm。

图2静电基团调控的高效疏水相互作用色谱填料对鸡蛋清分离纯化色谱图。

色谱条件为：流动相A：3.0mol/L(NH₄)₂SO₄，20.0mmol/LKH₂PO₄，pH8.0；流动相B：20.0mmol/LKH₂PO₄，pH8.0；流速1.0ml/min，0-100％B线性梯度洗脱30min，延长100％B10min；检测波长280nm。横坐标为保留时间(time)，纵坐标为波长280nm处紫外吸收值(mAU)；标记“1，2，3，4”分别为色谱馏分。

图3目标色谱馏分的SDS-15％PAGE分析。

Lane1：鸡蛋清样品；Lane2：馏分1；Lane3：馏分2；Lane4：馏分3；Lane5：馏分4；Lane6：标准卵转铁蛋白；Lane7：标准溶菌酶；Lane8：标准卵清蛋白

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的描述：

实施例1

(1)静电基团调控的高效疏水相互作用色谱填料制备

以高纯球状硅胶作为空白基质，首先进行酸处理，将硅胶用1∶1盐酸120度回流3-4小时，冷却，然后用蒸馏水反复洗涤，直到溶液显中性，真空干燥过夜，使硅胶表面的硅羟基维持在一个合适的水平。然后将酸处理好的硅胶用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(TM-560)进行活化，即在50mmol/L的醋酸钠溶液中，90℃条件下缓慢滴加TM-560适量，与硅胶反应4h，然后依次用水、甲醇、水洗涤干净，真空干燥。色氨酸与环氧化硅胶的反应在用钠丝干燥的二甲亚砜溶液中进行，加入反应物后超声10分钟，在50℃搅拌下反应22h，然后用丙酮、水反复洗涤，真空干燥，过夜即可。

(2)静电基团调控的高效疏水相互作用色谱填料分离性能考察

在疏水相互作用模式下，以细胞色素-C(Cyt-C)、核糖核酸酶A(RNase-A)、溶菌酶(Lys)、α-糜蛋白酶原(α-ChyA)、α-淀粉酶(α-Amy)和胰岛素(Ins)六种蛋白作为模型蛋白，考察该填料的分离性能和选择性。将装填的色谱柱(100×4.6mmI.D.)用流动相A(3.0mol/L(NH₄)₂SO₄，20.0mmol/LKH₂PO₄，pH7.0)平衡，将上述六种标准蛋白混合液50μL直接进样，然后线性梯度0-100％B(20.0mmol/LKH₂PO₄，pH7.0)洗脱30min，流速1.0ml/min，并延长100％B10min，检测波长为280nm，见图1。

实施例2

(1)静电基团调控的高效疏水相互作用色谱填料制备

以高纯球状硅胶作为空白基质，首先进行酸处理，将硅胶用1∶1盐酸120℃回流3-4小时，冷却，然后用蒸馏水反复洗涤，直到溶液显中性，真空干燥过夜，使硅胶表面的硅羟基维持在一个合适的水平。然后将酸处理好的硅胶用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(TM-560)进行活化，即在50mmol/L的醋酸钠溶液中，90℃条件下缓慢滴加TM-560适量，与硅胶反应4h，然后依次用水、甲醇、水洗涤干净，真空干燥。色氨酸与环氧化硅胶的反应在用钠丝干燥的二甲亚砜溶液中进行，加入反应物后超声10分钟，在50℃搅拌下反应22h，然后用丙酮、水反复洗涤，真空干燥，过夜。

(3)静电基团调控的高效疏水相互作用色谱填料对鸡蛋清样品分离纯化

将装填的色谱柱(100×4.6mmI.D.)用平衡缓冲液(3.0mol/L(NH₄)₂SO₄，20.0mmol/LKH₂PO₄，pH8.0)平衡，将鸡蛋清样品稀释五倍处理(20.0mmol/LKH₂PO₄，pH8.0)，上样50μL，采用0-100％B(20.0mmol/LKH₂PO₄，pH8.0)线性梯度30min，延长100％B10min，流速为1ml/min，收集色谱馏分。色谱图见图2，图3为色谱馏分电泳分析。

Claims

1.结构式(I)所示，静电基团调控的高效疏水相互作用色谱填料

2.权利要求1静电基团调控的高效疏水相互作用色谱填料结构式(I)中的色谱配基为色氨酸，其分子结构中带有阴离子羧基、阳离子氨基和咪唑基。

3.权利要求1所述静电基团调控的高效疏水相互作用色谱填料制备方法，包括以下步骤：

(1)将硅烷偶联剂与活化硅胶反应得到环氧基硅胶；

(2)将环氧基硅胶与色氨酸反应得到具有静电基团调控作用的高效疏水相互作用色谱填料。

4.根据权利要求3所述高效疏水相互作用色谱填料制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)硅胶活化：将所用硅胶经15～20％盐酸以1∶10～1∶20(g/mL，m/v)比例活化2～6小时，用蒸馏水反复清洗直至中性，110～150℃真空干燥12～24小时，以形成孔径在之间，粒径为5～10μm的球状多孔硅胶。

5.权利要求1所述静电基团调控作用的高效疏水相互作用色谱填料是以疏水相互作用色谱为主，弱阳离子交换色谱为辅的混合模式色谱。

6.权利要求1在标准蛋白分离与鸡蛋清样品纯化过程中，其特征在于

(1)将该色谱填料用于标准蛋白的分离中，可使细胞色素-C、核糖核酸酶A、溶菌酶、α-糜蛋白酶原、α-淀粉酶和胰岛素六种标准蛋白得到完全快速分离；

(2)将该色谱填料用于鸡蛋清样品的分离纯化，可得到高纯度、高质量回收率活性溶菌酶；

(3)所述的分离过程采用盐-水洗脱体系，流动相A为3.0mol/L(NH₄)₂SO₄，20.0mmol/LKH₂PO₄，pH7.0～8.0；流动相B为20.0mmol/LKH₂PO₄，pH7.0～8.0。